Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Разработка и стандартизация многокомпонентного сбора "Гепафит"

V I О ч'' На правах рукописи

О 3 ФВ

МИНАЗОВА Гульнара Ильдусовна

РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ МНОГОКОМПОНЕНТНОГО СБОРА "ГЕПАФИТ"

15.00.02. Фармацевтическая химия и фармакогнозия.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в Башкирском государственном медицинском уш всрситете, институте Органической химии Уфимского научного центр РАН.

Научные руководители: доктор медицинских паук,

профессор Насыров Х.М.

кандидат фармацевтических наук, старшин научный сотрудник Лякнна М.Н.

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук,

профессор Самылина И.А.

/

кандидат фармацевтических наук, старший научный сотрудник Российская Г.И.

Ведущая организация: Научно-производственное объединение

"Всероссийский институт лекарственных I ароматических растении"

со

Защита состоится " " с/и^-Ж /ьси^*. 1997 г. в часов на заседании Диссертационного 'Совета Д.074.28.01. при Научно-исследовательском институте Фармации МЗ РФ по адресу 117418, г. Москва, Нахимовский проспект, 34.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан "_ 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д.074.28.01: кандидат фармацевтических наук,

старший научный сотрудник Боброва Л.М.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В настоящее время заболевания геиатобпли-ариой системы приобрели мсднко-соцналыюе значение. Это обусловлено увеличением числа заболевании печени и желчевыводящих путей, особенно в плане их токсических поражений. В этом отношении создание гешпо-протекторов на основе лекарственного растительного сырья является актуальной проблемой здравоохранения. Актуальность исследований по поиску и разработке новых фитопрепаратов неизмеримо возросла в последние десятилетие в связи с возникновением "лекарственной болезни".

Преимуществом лекарственных растений и препаратов из них является их малая токсичность, возможность длительного применения без побочных явлений, широкий спектр фармакологического действия. Однако в терапии заболеваний печени и желчевыводящих путей применяется ограниченный набор гепатозащитных и желчегонных средств растительного происхождения и их терапевтическая эффективность не всегда оказывается достаточной. Так, широко известный фитопрепарат легалон не эффективен при хо-лестатическом гепатите и синдроме мезенхимально-имму иного воспаления. Лив52 уступает легалону по антиоксидантной активности.

Для профилактики и комплексного лечения заболеваний гепатобили-арной системы целесообразно создание комплексных фитопрепаратов, обеспечивающих адекватность терапии в соответсвии с поливалетным механизмом поражений гепатобилиарной системы, способствующих нормализации и стимуляции обменных процесов, повышению адаптивных возможностей организма.

Таким образом, поиск и разработка новых лекарственных препаратов растительного происхождения и внедрение их в практику здравоохранения является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилась разработка и стандартизация многокомпонентного сбора, предназначенного для профилактики и лечения заболевании гепатобилиарной системы. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

- разработать с помощью фармакологического скрининга рациональную пропись сбора;

- установить острую токсичность сбора;

- изучить специфическую фармакологическую активность сбора на различных моделях гепатита;

- определить товароведческие показатели лекарственного растительного сырья, входящего в состав сбора и самого сбора;

- определить макро- и микродиагностические признаки сбора, позволяющие идентифицировать его составные части;

- провести фитохимическии анализ сбора;

- разработать метод стандартизации сбора;

-разработать нормативно-техническую документацию на сбор и реке мендапин по его применению.

Научная новизна работы. С помощью метода фармакологпческог скрининга с учетом специфической фармакологической активности каждог компонента, учитывая особенности регуляции функциональной ciictcmi пищеварения и поливалентный патогенез заболеваний геиатобнлиарной си стемы разработан состав новой растительной композиции, обладающий гс иато.шщптной, желчегонной, противовоспалительной активностью.

С использованием комплекса физико-химических методов: хромате масс-снектроскопин, спектроскопии, ТСХ выявлено наличие в сбор "Гепафнт" веществ флавоноидной природы, аскорбиновой, бензойной кис лоты, антраценпронзводных.

Методом ВЭЖХ в системе растворителей (ацетонитрил -вода - уксус пая кислота 75:25:1), подобранной экспериментально идентифицировано веществ флавоноидной природы: рутин, кверцетин, днгидрокверцетнн, п перозид, лютеолин-7-гликозпд, авикулярин.

На основе реакции комплексообразования флавоноидов с алюминие; хлоридом методом дифференциальной спектрофотометрии разработана мс тодика количественного определения суммы флавоноидов сбора в пересчет на ГСО рутина.

Методом дифференциальной спектрофотометрии определены услови экстракции суммы флавоноидов из растительного сырья ( измельченное! сырья-1мм, экстрагент - 70% этанол, соотношения сырье-экстрагент-1:3( длительность экстракции-30 минут и кратность экстракции-3), обеспеч! вающие наиболее полное извлечение флавоноидов из растительного сырь ( не менее 2%).

Приоритет исследований потвержден авторским свидетельством "Сбо лекарственных растений, обладающий гепатозащитным, желчегонныг. противовоспалительным действием" на которое получена приоритетна справка №95113221 от 01.09.95.

Практическая значимость. На основании проведенных исследовани разработано и внедрено:

- состав сбора "Гепафит"/решением Номенклатурной комисси утверждено название сбора, протокол №3 от 31.10.96. Государственног института доклинической и клинической экспертизы лекарственны средств МЗ РФ; авторское свидетельство "Сбор лекарственных растеши обладающий гепатозащитным, желчегонным, противовоспалительным де( ствием" на которое получена приоритетная справка №95113221 с 01.09.95.; проект ВФС на сбор "Гепафит" рассмотрен Фармакопейны комитетом МЗ РФ, протокол № 9 от 16.05.96. Фармакопейного комитс та/;

- показатели качества сбора "Гепафит" и методика количественно! определения суммы флавоноидов сбора в пересчете на ГСО рутина /' прс екг ВФС на сбор "Гепафит", протокол № 9 от 16.05.96. Фармакопейног комитета МЗ РФ/;

- технологическая инструкция производства сбора "Гепафит" и фильтр-пакетах, Акт внедрения от 01.06.95. АОЗТ "Теастан" г. Уфа, по которой наработана опытная партия сбора "Гепафпт".

Основные результаты работы доложены на научной конференции студентов и молодых ученых Башкирского государственного медицинского университета (Уфа, 1994 г.), на Российской национальной конференции "Формирование приоритетов лекарственной политики" (Москва, 1995 г.), на Научном семинаре отделения физической химии института Органической химии УНЦ РАН (г. Уфа, 1996 г.), на заседании общества фармакологов БГМУ (г. Уфа, 1996 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 5 печатных работ.

Связь задач исследования с проблемным планом развития фармацевтических наук. Диссертация выполнена по плану НИР Башкирского государственного медицинского университета в рамках проблемы "Изыскание и изучение новых лекарственных средств", номер государственной регистрации 01950002540 и соответствует тематике Межведомственного Совета по фармации № 47 РАМН.

Основные положения, выносимые на защиту:

-результаты фармакологического скрининга- разработка рецептуры сбора "Гепафпт";

-результаты фитохимического исследования сбора и его лекарственной формы-настоя;

- методика спектрофотометрического определения суммы флавоноидов сбора в пересчете на ГСО рутин;

-показатели качества сбора "Гепафит".

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, общих выводов, библиографии, приложения. Диссертация илюстрировапа 33 таблицами, 24 рисунками, 4 микрофотографиями. Библиографический указатель включает 228 источников, из них 29 зарубежных авторов.

В 1 главе (обзор литературы) дана общая характеристика гепатоза-щитных, желчегонных средств растительного происхождения, краткие сведения о лекарственных растениях, входящих в состав исследуемых сборов, основные подходы к составлению сборов и стандартизации фитопрепаратов.

Во 2 главе "Материал и методы исследовании "описаны материалы и методы токсико-фармакологическнх и фитохимических исследований.

В 3 главе приведены данные по разработке рациональной рецептуры сбора "Гепафит" и изучению его фармакологической активности и токсичности.

4 глапа посвящена изучению химического состава сбора, стандартизации сбора по основным биологически активным веществам сбора- сумме флавоноидов в пересчете на ГСО рутина, разработке показателей качества п установлению срока годности сбора, которые вошли в проект ВФС на сбор "Генафит".

Приложение содержит таблицы с химическим составом лекарственных растений, входящих в состав исследуемых сборов, проект инструкции по применению сбора "Гепафит", проект ВФС на сбор "Гепафит", технологический регламент на производство сбора "Гепафит" в фильтр-пакетах, наработанных на АОЗТ "ТЕАСТАН" г.Уфа.

Содержание работы Материал и методы исследований

Материал и методы токсико-фар.чакологических исследований

Эксперименты выполнены на 721 беспородной белой мыши обоего пола массой 16 - 25 г, 290 беспородных белых крысах обоего пола массой 160 - 250 г и 181 золотистом хомячке обоего пола массой 90-100 г.

Гепатоиротекторное действие сборов и силибора изучалось на моделях тетрахлорметанового, алкогольного и тетрациклинового гепатита. (Венгеровский А.Н., 1993 г., Дроговоз С.М, 1990 г., Николаев С.Н., 1992 г.,]. Для вызывания ССЬ4 гепатита 50 % масляный раствор ССЬ4 вводили крысам подкожно 1 раз в сутки в течении 4-х дней из расчета 0,4 мл на 100 г массы тела. Затем в течении 7 дней животные получали внут-рижелудочно исследуемые препараты. Тетрациклиновое поражение печени вызывали введением крысам в желудок тетрациклина в дозе 0,5 г/кг 1 раз в сутки в течении 5 дней, одновременно вводили внутрижелудочно исследуемые препараты в течении 7 дней. Алкогольный гепатит вызывали введение 48 % - го водного раствора этилового спирта в желудок в объеме 1,0 мл на 100,0 г массы 1 раз в сутки в течении 4 дней. Исследуемые препараты вводили внутрижелудочно, начиная со 2 - го дня дачи этилового спирта.

Изучалась также морфология печени. Гистологические исследования печени проводили по общепринятой методике с окраской срезов гематоксилин-эозином, Суданом III, методом Ван -Гизона.

Желчесекреторную и желчевыделительную функцию у крыс оценивали по общепринятой методике [Скакун Н.П., Олейник А.И., 1967 г.]. В сыворотке крови фотометрически определяли активность ферментов-маркеров синдрома цитолиза - аланинаминотрансферазы (АлТ) и аспарта-таминотрансферазы ( АсТ ), содержание общего и прямого билирубина с помощью набора "ЬасЬета". Спазмолитическая активность изучалась на препарате гладких мышц изолированной кишки крысы.

Противовоспалительная активность изучалась у хомячков на модели воспаления ланок, вызванных субплантарным введением каррагенина. Изучаемые препараты вводили внутрь за 2 часа до введения каррагенина. Противовоспалительное действие оценивали в динамике через 1, 3, 6, 24, 48, 72 часа после введения флогогена.

При изучении гепатопротекторного действия препаратом сравнения служил силибор, а противовоспалительный эффект сравнивался с действием ортофеиа. Силибор вводили животным виутрижелудочно в виде сусиеп-зии на 1% крахмальной слизи в дозе 50 мг/'кг [Скакун Н.П., 1988 г.]. Ортофен вводили в дозе 10 мг/кг, что составляет ЕД 50 [Шварц Г.Я., Сюбаев Р.Д., 1981 г.].

Полученные результаты обработаны статистически с использованием дисперсионного анализа (F-критерий Фишера) с помощью программы "ANOVA", основанной на алгоритме М.Л.Плохннского на IBM, по t критерию Стыодента и по Генесу B.C.

Материал и методы фатохимических исследова)шй

Объектами исследования служило воздушно-сухое сырье (цветки ноготков,столбики с рыльцами кукурузы,трава зверобоя,трава горца птичьего,листья подорожника большого,плоды шиповника,корни одуванчика) и составленный из него в соответствии со статьей ГФ XI издания, Вып.1 "Сборы" растительный сбор. Лекарственное растительное сырье, заготовленное в июне-октябре 1992-1993 г. было получено из Шафрановского лесхоза, аптеки № 291 и отвечало требованиям ГФ XI издания, Вып.2.

Определение влаги, золы общей и золы, нерастворимой в 10 % растворе HCL, измельченное™ проводили по методикам ГФ XI (вып. 1.2). Настои и отвары готовили в соответствии со статьей ГФ XI, вып.2 "Настои и отвары" при соотношении сырья и растворителя 1:10., 1:20. Для выделения и разделения фенольных соединений сбора 100 г растительной композиции исчерпывающе экстрагировали 1000,0 мл 70° спирта. Полученный спирто-вый экстракт упаривали в вакууме при t - 40°С до водного остатка. Полученное водное извлечение очищали от хлорофилла и липофильных веществ хлороформом. Из очищенного фильтрата последовательно этилацетатом и Н-бутанолом извлекали фенольные соединения. Хроматографическое исследование качественного состава проводили методом бумажной (БХ), тонкослойной (ТСХ) и высокоэффективной (ВЭЖХ) хроматографии. Для бумажной хроматографии использовали бумагу марки FN-6 и FN-17 (Германия). Для метода ТСХ использовали пластинки "Silufol" УФ254 (с закрепленным слоем силикагеля) размером 15X15 фирмы "Merck", "Sorbfil" (Россия). Длина пробега растворителя составила 12-13 см.

Разделение методом ВЭЖХ проводили в обращенно-фазном варианте на микроколоночном хроматографе "Милихром-2" с применением стальной колонки размером 2 х 64 мм, заполненный сорбентом Сепарон С-18 (размер частиц 5 мкм).

Детекцию осуществляли с помощью ультрафиолетового детектора при длине волны 254 нм. В качестве подвижной фазы была использована смесь ацетонитрил-вода-кислота (25:75:1), подобранная экспериментально. Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки, используя в качестве внешнего стандарта ГСО гиперазида.

Изучение элементного состава сбора и водного извлечения из него проведено на базе АО "УфаВита" методом атомной - абсорбционной спектроскопии на приборе ААС - 115.

Спектры сняты на приборе "Specord М-40" Carl Zess Jena, используя в качестве растворителя 70°, 95° спирт. Определение оптической плотности в методе количественного анализа проводили на спектрофотометре "Specord М-40" в кювете с толщиной слоя 1 см.

Масс-спектральпый анализ водной фракции сбора "Гепафнт" проведен на базе Государственного инженерного центра (ГИЦ) "Реактив" (г.Уфа) с использованием прибора системы HP - 5890 масс- селективна детектор HP 5972 А (США). Для повышения летучести БАВ с целыо получения качественных масс-спектров было проведено силнлироваиие водной фракции сбора.

Содержание дубильных веществ определяли титриметрическим методом Левенталя в модификации А.Л. Курсапова, основанным на способности тапидов быстро окисляться перманганатом калия (ГФХ1-изд.,вып.1, C.28G-287). Содержание аскорбиновой кислоты определяли титриметрическим методом(ГФ XI- изд., вып.2, С.295-296). Содержание полисахаридов определяли гравиметрическим методом (ГФ XI- изд., вып.2, С.266)

Статистическая обработка экспериментальных данных (Р = 95 %) проводилась при помощи критерия Стыодента (t) с вычислением граничных значений доверительного интервала среднего результата (X +£<) по методике ГФ XI - издания (вып.1) "Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний".

Разработка рациональной рецептуры сбора "Гепафит" и изучение его специфической активности и токсичности.

Многокомпонентный сбор "Гепафит" обладает гепатопротекторной, желчегонной активностью сочетающейся с противовоспалительными свойствам. Сбор представляет из себя смесь измельченного лекарственного сырья следующего состава: цветки ноготков 3 ч. (20 %), столбики с рыльцами кукурузы 3 ч. (20 %), трава горца птичьего 2 ч (13,33 %), трава зверобоя 2 ч. (13,33 %), листья подорожника большого 2 ч. (13,33 %), плоды шиповника 2 ч. (13,33 %), корни одуванчика 1 ч. (6,67 %). Состав сбора разработан на основании фармакологических скрининговых экспериментов, с учетом многофакторных механизмов развития заболеваний гепатобилиар-ной системы.

Учитывая патогенез заболеваний гепатобилиарной системы, литературные данные, научные подходы к составлению сборов, принципы фито-терапии[НиколаевС.М. и др.1988, Пашинский В.Г. 1995] и сырьевые возможности были отобраны для фармакологического исследования 11 лекарственных растений, произрастающих или культивируемых в Российской Федерации, в том числе Башкортостане и на их основе составлена композиция - сбор №1. Состав прописи и соотношение компонентов разработаны на основании литературных данных о химическом составе лекарственных растений, с учетом особенностей патогенеза повреждений печени, причастности к ним заинтересованных органов и в соответствии с принципами фармакологической регуляции пищеварительной функции. В рецептуру

сбора № 1 отобраны лекарственные растхтия оказывающие гепатозащитное (ноготки, зверобой, горец птичий, ш'иповник), желчегонное (ноготки, зверобой, шиповник, кукурузные рыльца, мята, одуванчик, валериана, ромашка), противовоспалительное (ноготки, зверобой, горец птичий, подорожник, ромашка), антитоксическое (зверобой, горец птичий, шиповник, одуванчик, подорожник, ромашка), спазмолитическое (валериана, ромашка, укроп) действие.

Проведенное исследование специфической фармакологической активности сбора №1 на модели СС14-гепатита в оптимальной дозе- 300 мг/кг показало, что сбор №1 оказывает выраженное гепатозащитное, желчегонное действие.

Следующим этапом исследований явилось выявление компонентов растительного сбора №1, обеспечивающих его фармакологическую активность для создания рациональной рецептуры сбора. В связи с этим был проведен фармакологический скрининг лекарственных растений, входящих в состав сбора №1 по трем видам активности: а) гепатозащитной; б) противовоспалительной; в) спазмолитической.

Фармакологическое действие компонентов сбора № 1 изучалось в двух дозах: в дозе, в которой они входят в сбор № 1 и дозе 300 мг/кг. Для разработки рациональной рецептуры сбора были использованы результаты опытов, в которых исследуемые лекарственные растения вводили в дозе в который входят в сбор№1. Результаты скрининга предствлены в таблице 1.

Как показали результаты скрининга (табл.1) сбор №1 проявляет гепа-тозащитную, противовоспалительную, спазмолитическую активность. Скрининг по гепатозащитной активности выявил, что 7 из 11 лекарственных растений проявляют гепатопротекторные свойства (ноготки, кукурузные рыльца, зверобой, горец птичий, шиповник, подорожник, одуванчик) на основании чего был составлен сбор №2. Кроме того, вышеперечисленные растения проявляют и другие свойства, в частности противовоспалительное, спазмолитическое.

Три лекарственные растения проявляют гепатозащитное, противовоспалительное и спазмолитическое действие (ноготки, зверобой, горец птичий) - сбор №3; 5 лекарственных растений проявляют гепатозащитные и спазмолитические свойства (ноготки, зверобой, шиповник, горец птичий, одуванчик) - сбор №4; 5 лекарственных растений проявляют противовоспалительные п гепатозащитные свойства (ноготки, горец птичий, кукурузные рыльца, зверобой, подорожник) - сбор №5.

Таблица

Результаты фармакологического скрининга

_компонентов сбора № 1_

Наименование ле- Виды активности

карственных _

растений Гепатозащитная Противовоспали- Спазмолнтичес-

_тельная_кая_

Сбор №1 1 1 1

Календула 1 1 1

Столбики с рыль- 1 1 0

нами кукурузы

Зверобой 1 1 1

Горец птичий 111

Шиповник 1 0

Подорожник 1 1

Ромашка 0 0

Валериана 0 0

Укроп 0 0

Мята 0 0

Одуванчик 1 0

Таким образом, па основании результатов скрининга был предложе! для сравнительного фармакологического исследования ряд композицш растительных сборов.

Сбор №2

Цветки ноготков Кукурузные рыльца Листья подорожника Трава зверобоя Трава горца птичьего Корень одуванчика Плоды шиповника

Сбор №4 Цветки ноготков Трава горца птичьего Трава зверобоя Плоды шиповника Корень одуванчика

3 ч

3 ч

2 ч

2 ч

2 ч

1 ч

2 ч

3 ч

2 ч

2 ч

2 ч

1 ч

Сбор №3

Цветки ноготков 3 ч Трава горца птичьего 2 ч Трава зверобоя 2 ч

Сбор №5

Цветки ноготков 3 ч

Трава горца птичьего 2 ч

Трава зверобоя 2 ч

Столбики с рыльцами кукурузы 3 ч Листья подорожника большого 2 ч

Далее проводилось экспериментальное изучение гепатопротекторной активности растительных сборов № 1, №2, №3, №4, №5 на модели острого СС1.4-генатита. Гепатозащи гиую активность исследуемых сборов оценивалась по выживаемости мышеи в опытных и контрольных группах после однократного подкожного введения 50% масляного раствора ССЦ в дозе 0, 075 мл на 10 г животного. Опыты проведены на 220 белых мышах обоего иола массой 16-25г. Исследуемые сборы вводили в виде настоев в отношении 1:10 в дозах 200, 300 мг/кг в течение 7 дней после затравки четыреххлористым углеродом. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2

Изучение гепатопротекторной активности растительных сборов №1, №2, №3, №4, №5 иа модели острого СС^-гепатита

Выжило/

Препарат Доза мг/кг число животных в группе Выживаемость % р ДЛЯ х 2

гепатит контроль крахмал 10/20 50

сбор №1 300 20/20 100 р<0, 01

сбор №2 200 17/20 85 р.<0, 01

сбор №2 300 19/20 95 р<0, 01

сбор №3 200 15/20 75 р>0, 025

сбор №3 300 16/20 80 р<0, 025

сбор №4 200 16/20 80 р<0, 025

сбор №4 300 17/20 85 р^0, 01

сбор №5 200 16/20 80 р<0, 025

сбор №5 300 17/20 85 р<0, 01

силибор 50 20/20 100 р<0, 01

Как показали проведенные эксперименты (табл.2) лечебное введение кивотным настоев сбора №№1-5 статистически достоверно в дозе ЮОмг/кг повышает выживаемость мышей при ССЦ-гепатите. Однако 1аиболее выраженный гепатозащитный эффект проявляют сборы №1 и 4.-2.

Таким образом, на основании проведенных исследований для более тлубленного фармакологического изучения спектра гепатопротекторной наивности были взяты сбор №1 и сбор №2.

В связи с чем было проведено сравнительное изучение специфической фармакологической активности сборов № 1, № 2 на моделях СС14-, тетра-ИИКЛИН01ЮГО, алкогольного гепатита.

В первой серии опытов на белых крысах изучено влияние сборов №1, №2 в сравнении с сплибором на биохимические показатели при ССЦ -гепатите. Проведенные эксперименты показали, что острая дистрофия печени сопровождается цитолитическим синдромом гепатоцитов: активность АлТ возрастает в 7 раз (р < 0, 001), АсТ - в 4, 5 раза(р < 0, 001). Увеличивается содержание билирубина в сыворотке крови: содержание общего билирубина возрастает в 3 раза (р<0,01), а прямого в 3,8 раза (р<0,01). Лечебное введение сборов №1, №2, енлибора нормализовало функциональное состояние печени: активность трансаминаз, содержание билирубина приближались к уровню интактных крыс.

Параллельно проведенные исследования на 30 белых крысах обоего пола массой 180-230 г по оценке желчевыделительной функции печени свидетельствовали о подавлении секреции желчи на фоне отравления тет-рахлоридом углерода (рис 1).

Влияние сборов №1,2 и силибора на общий объем выделенной за 4 часа желчи при СС14.

Общий вес желчи за 4ч мг/ЮОг

□ Интактные ■ ССЬ4-гепатнт ОСбор №1

□ Силибор ПСбор №2

Рис.1

Как видно из рис.1 у крыс с токсическим гепатитом наблюдается статистически достоверное уменьшение секреции желчи во все сроки наблюдения (р < 0,01). Общий объем выделенной за 4 часа желчи в 2 раза ниже уровня интакных крыс (р < 0,01). Введение исследуемых сборов №1, №2 статистически достоверно повышало секрецию желчи (р<0,01). Препарат сравнения силибор оказал менее выраженное холеретическое действие. Патоморфологическими исследованиями на 24 белых крысах было подтверждено фармакотерапевтпческое влияние сборов №1, №2, при поражении печени СС!^.

1000 900 >00 700 600 500 400 300 200 100 0

И

Во второй серии опытов изучено влияние сборов № 1, № 2 на течение экспериментального гепатита, вызванного введением тетрациклина. Результаты опытов представлены и таблице 3.

Таблица 3

Влияние сборов №1, №2, силибора на биохимические показатели при тетрациклинопом гепатите

Условия опыта доза мг/кг Кол. жив. в гр. Активность ферментов мккат/л Содержание билирубина мкм/л

АлТ АсТ общий прямой

Интактные крахмал

гепатит крах-

контроль мал

Силибор 50 +гепатит

Сбор 300 N1 +гепатит

Сбор 300 Ш+гепатит

6 0.21+0.02* 0.45+0.04* 5.33+1.26* 1.50+0.22*

5 0.56+0.08** 1.02+0.10** 18,00+0.89** 11.60+1.72**

6 0.51+0.47** 0.89+0.02*** 6.20+1.32* 4.80+0.86* 6 0.41+0.02*** 0.80+0.03 *** 6.17+1.08* 2.50+0.43*

0.43+0.02*** 0.80+0.05 *** 6.67+0.88*

2.33+0.42*

Примечание: знаком * отмечены статистически достоверные различия с гепатитом, ** - с интактными животными.

Как показали проведенные эксперименты лечебно-профилактическое действие сборов №1, №2, силибора сопровождалось статистически достоверным снижением АсТ; АлТ оказалось статистически достоверно снижена (р<0,01) только в группе животных получавших сбор №1, №2. Таким образом, сборы №1, №2 оказали более выраженное гепатозащитное действие, чем силибор. В параллельно проведенных экспериментах на 30 белых крысах изучено влияние сборов №1 и №2 в сравнении с силибором на желче-выделительную функцию печени. Опыты свидетельствовали, что у животных с тетрациклиновым гепатитом затруднен отток желчи. Лечебно-профилактическое введение сборов №1, №2, силибора статистически достоверно повышало желчевыделительную функцию печени (р<0,01). Общий объем выделенной за 4 часа желчи под влиянием сборов №1, №2 и силибора соответственно в 1,8, 1,7 и 1,6 раза был выше показателя животных с гепатитом.

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что при тетра-циклиновом поражении печени сбор №1, №2 оказывает более выраженное гепатозащитное действие, чем силибор при аналогичном холерегическом эффекте.

В третьей серии опытов изучено влияние растительных сборов №1, №2 на течение экспериментального гепатита, вызванного алкоголем. В

опытах на белых крысах исследовано влияние растительных сборов №1, №2 на биохимические показатели при алкогольной интоксикации печени.

Установлено, что развитие гепатита характеризуется цитолизом и изменениями других биохимических показателей: активность АлТ возрастает и 3,5 раза (р <0,01), АсТ- в 1,9 раза (р<0,05), в 2,5 раза увеличивается содержание общего билирубина (р<0,01). Введение с лечебно-профилактической целью сборов №1, №2, силибора приводит к статистически достоверному снижению активности АсТ (р<0,05); содержание общего билирубина достоверно (р< 0,01) снизилось в группе животных, получавших сбор №1, №2.

В параллельно проведенных экспериментах на 30 крысах было изучено влияние сборов №1, №2 в сравнении с силибором па желчевыдели-тельную функцию печени при алкогольном гепатите. Исследования показали, что при алкогольном гепатите наблюдается угнетение желчевыдели-телыюй функции печени по сравнению с интакными животными (р<0,01). Лечебно-профилактическое введение сборов №1, №2 статистически достоверно повышало желчевыделительную функцию печени до уровня интак-ных крыс (р < 0,01). Препарат сравнения - силибор оказал менее выраженное холеретическое действие.

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что сбор №2 подобно сбору №1 оказывает генатозащитное, желчегонное действие на моделях CCL4, тетрациклинового, алкогольного гепатитов.

В следующей серии опытов было изучено противовоспалительное действие сбора №2 на каррагениновой модели воспаления в сравнении со сбором №1, ортофеном и силибором.

Как показали опыты в контрольной группе хомяков после введения каррагенина развивался прогрессирующий отек задних лап, при этом максимальный прирост объема наблюдался через 3 часа. Введение сбора №2 статистически достоверно (р<0,001), подобно сбору №1, ортофену уменьшало развитие каррагенинового отека. Силибор оказал менее выраженное противовоспалительное действие.

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что сбор №2 подобно сбору №1 оказывает гепатозащитное, желчегонное действие на моделях гепатитов, вызванных CCL4, тетрациклином и алкоголем. Сбор №2 не уступает сбору №1 по противовоспалительной активности. Поскольку в состав сбора №2 входит меньше лекарственных растений для разработки проекта ВФС и внедрения в практику здравоохранения предлаложен сбор №2, названный "Гепафит". Проведенные исследования показали, что сбор "Гепафпт" является практически нетоксичным.

Стандартизация сбора "Гепафит".

С целыо изучения химического состава сбора и иотверждения перехода основных биологически активных веществ при экстрагировании исходного лекарственного сырья в препарат : проведено фитохимическое изучение сбора п его лекарственной формы-настоя. В результате фитохи-

мических исследований и сборе "Генафнт" и настое, полученным из него установлено наличие в них : антрацеппронзводных, аскорбиновой кислоты, флавопоидов, дубильных веществ, полисахаридов,феполкарбопоиых кислот.

Качественными реакциями со специфическими реактивами в сборе н настое обнаружены антраценпротг.одные, дубильные вещества, полисахариды.

Обнаружение аскорбипоь.п. кислоты проводили методом тонкослойной хроматографии на пластинах Silufol в системе растворителей этилаце-тат-уксусная кислота [80:20/после проявления 2,6- днхлорфенолиндофено-лятом натрия. В качестве свидетеля использовали PCO аскорбиновой кислоты. Аскорбиновая кислота обнаруживается в виде белого пятна па рши-вом фоне на уровне свидетеля с Rf около 0,45-0,46. Методом титриметрн-ческого анализа определено содержание аскорбиновой кислоты в водном извлечении из сбора. Содержание аскорбиновой кислоты составнло-пе менее 0,17 %.

Методом перманганатометрического титрования было определено содержание дубильных веществ в сборе. Содержание суммы дубильных веществ в пересчете на танин составнло-не менее 3%.

Одним из компонентов сбора является подорожник большой, препараты которого применяются при заболеваниях желудочно-кишечного тракта, бропхо-легочной системы. Основными биологически активными соединениями подорожника являются полисахариды. Гравиметрическим методом определено содержание полисахаридов в сборе (не менее 6%).

Проведенный обзор литературных источников показал, что состав ЛРС, входящего в исследуемый сбор широко представлен соединениями полифеиолыюй природы, а в большинстве своем флавонондами.

Исследование сбора на содержание флавопоидных соединений проводили методами бумажной, тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Для подтверждения наличия основных соединений флаво-ноидной природы проведено качественное исследование водного из-

влечения из сбора (настоя 1:10), этилацетатной и бутанольнои фракции. В настое - лекарственной форме сбора при помощи метода бумажной хроматографии было обнаружено от 4 до 6 пятен флавопоидных соединений; при помощи метода ТСХ в различных системах было обнаружено не менее 8 фепольпых соединений. По окраске пятен развивающейся после обрабо|-ки хроматограмм 2% спиртовым раствором алюминия хлорида и парами аммиака 6 зон были отнесены к флавонопдпым соединениям. Обработка реактивом 2% спиртным раствором AICI3 и использование достоверных образцов показало, чм • ■> окраске пятен и значению Rf в водном настое сбора присутствуют руиш и кверцетин. В б\танольной и этилацетатной фракциях методами бумажной и тонкослойной хроматографии обнаружены рутин и кверцетин.

Методом ВЭЖХ в системе растворителей: ацетонитрил-вода-уксусиая кислота ледяная (25:75:1), подобранной экспериментально были идентифицированы: в спиртоводпом извлечении из сбора: рутин, кверцетин, гн-

перознд, авикулярип, лютсолш1-7-гликозид, в этилацстатпой: днгидр всрнстии, кверцетин, пшерозид, авикулярип, бутанолъной фракции: тип, днгндрокиерцстин, лютеолин-7-глпкозид, пшерозид, кверцетин, а кулярии.

С использованием метода ВЭЖХ определено содержание суммы ф воиондных соединений сбора с использованием ГСО гнперозида доминирующего компонента флавоноидиых соединений сниртоводпого влечения сбора. Ошибка количественного определения не превышает 1 Содержание суммы флавонопдов в пересчете на ГСО пшерозид - состави не менее 1%.

В водной фракции сбора "Гепафит" методом хромато-ма^ спектрометрии была идентифицирована бензойная кислота. В Mai спектрах образца и стандарта бензойной кислоты регистрируются пи т/г соответственно 122 (76), 105 (100), 77(76), 51 (34) ( рис. 2).

Масс-спектры образца и стандарта бензойной кислоты

Abudance 8000

6000 -

tn/z-->

20 40

Hcpapliyt

2S1

60

1Ó0 120 140 160 180 200 220 240 260 280

Abudance

6000 -

2000-

m/z—>

»64647: Ber.ioic Acid (•) 1' s

120 140 160 180 200 220 240 260 280

Puc. 2

во

В последние годы все большее значение приобретает установлена химических элементов - техногенных загрязнителей в составе лекарствен пого растительного сырья (ЛРС), в т.ч. сборов. Это обусловлено н< только важной биологической ролью многих незаменимых микроэлементов по и экологическими факторами [Листов С.Л. и др., 1991,1992 ].

Методом атомпо-абсорбциоиной хроматографии исследовано содержание следующих химических элементов в сборе "Генафит" и его лекарственной форме - настое: Бе, Си, Zn, Сс1, РЬ, №, Сг, Со. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что содержание тяжелых металлов (РЬ, Сс1) в растительном сборе не превышает ПДК, установленные для продуктов питания (овощной), чая. В лекарственную форму- настои переходит незначительное количество техногенных загрязнителей, а РЬ и Сс1 отсутствуют.

При разработке критериев доброкачественности сбора "Генафит" были учтены современные требования, предъявляемые к нормативно-техническом документации иа сборы в соответствии с ГФ XI издания. Исходя из данными полученных при оценки внешнего вида образцов сбора, сбор охарактеризован как смесь неоднородных частиц от серо-зеленого до буровато-зеленого цвета с вкраплениями серебристо-белого, серовато-белого, светло-желтого, желтого, оранжевого, буровато-красного, коричневого цветов, проходящая сквозь сито по ТУ 23.2.2068-89 диаметром 5 мм.

При микроскопическом исследовании сбора были установлены диагностические признаки, присущие всем компонентам сбора.

В раздел ВФС "Качественные реакции" включены методы определения наличия в сборе флавоноидов ( по реакции с 2% спиртовым раствором алюминия хлорида) и полисахаридов ( по реакции с а-нафтолом в среде концентрированной серной кислоты). Для идентификации рутина разработан метод хроматографии в тонком слое сорбента на пластинах "Сорбфил", "Силуфол" с использованием системы растворителей: этилацетат-уксусная кислота-вода в соотношении (10:4:1) и последующим обнаружением по ярко-желтому свечению пятна в УФ-свете после проявления 2% спиртовым раствором хлорида алюминия.

Сложный химический состав растительного сбора, представленного смесью семи видов лекарственного сырья, делает целесообразным постановку вопроса о проведении стандартизации по комплексу биологически активных веществ, в частности но сумме флавоноидных соединений -действующих биологически активных веществ лекарственного сбора "Гепафит".

Определение содержания суммы флавоноидов проводили спектрофо-тометрическим методом с использованием реакции комплексообразования флавоноидов с хлоридом алюминия. В качестве стандартного образца взят рутин дифференциальный спектр поглощения которого с хлоридом аллю-миния совпадает с дифференциальным спектром поглощения суммы флавоноидов сбора "Гепафит" (рис.3).

Дифференциальные спектры поглощения ГСО рутина(1) и сум-

Рис.З

В процессе разработки методики анализа суммы флавонопдон в 1 ходком сборе были изучены п подобраны оптимальные условия извлечен флавоноидов из растительного сырья: степень измельченностп сырья-1м экстрагент-70% этанол, соотношение сырья и экстрагента 1:30, время э| тракции 30 минут, кратность экстракции 3. Для проверки воспроизводим сти методики было проведено определение суммы флавоноидов н одт образце сбора в 8 независимых новгорностях (табл.4). Относптельн ошибка методики количественного определения суммы флавоноидов с 9' вероятностью составляет 6,08%.

Таблица

Метрологические характеристики методики количественного определ ния суммы флавоноидов в сборе "Гепафит" в пересчете на рутнп

f х Б Р Цр,0 Дх Е,+ %

7 2,4855 0,1814 0,0641 95 2,36 0,1513 6,08

Метрологические данные, приведенные в таблице 4. свидетельству об удовлетворительной ее воспроизводимости. Для проверки отсутств систематической ошибки были проведены опыты с добавками рутина сииртоводное извлечение из сбора. Результаты определения приведены таблице 5.

19 Таблица 5.

Результаты опытов с добавками рутина

№ Содержание Добавле- Должно Найдено фла-

п суммы флаво- но рути- быть фла- воноидов с до- Ошиб

/ ноидов в мг на, мг воноидов с бавкой, мг ка

п добавкой, мг Х%

1 0,8962 0,2000 1,0962 1,0487 +4,33

2 0,8219 0,4000 1,2219 1,2617 -3,27

3 0,9315 0,6000 1,5315 1,5667 -2,30

Метрологические данные, приведенные в табл.4, свидетельствуют об удовлетворительной ее воспроизводимости, а результаты опытов с добавками рутина (табл. 5.) об отсутствии систематической ошибки в процессе анализа.

С помощью данной методики проанализировано 5 серий сбора. Исходя из полученных данных, содержание суммы флавоноидов в сборе в пересчете на рутин-стандарт регламентируется не менее 2%. Методика количественного определения суммы флавоноидов в сборе включена в проект ВФС на сбор "Гепафит" для оценки качества препарата.

На основании экспериментальных исследований 5 серий сбора разработаны нормативы показателей качества растительного сбора: потеря в массе при высушивании, содержание общей золы, золы, нерастворимой в 10% растворе HCL, измельченность, которые включены в проект ВФС на "Сбор Гепафит".

Исследования по установлению сроков годности проводились в обычных условиях на 5 образцах сбора. Найденный первоначальный срок годности сбора в естественных условиях, равен 2 годам.

В связи интенсивным антропогенным воздействием на окружающую среду актуальны также исследования растительного сырья и препаратов на* его основе на микробиологическую и радиационную чистоту.

Исследована микробиологическая чистота 5 опытных серий сбора и 5 водных извлечений из него В ходе исследований определялось количество жизнеспособных бактерий и грибов, кроме того устанавливалось присут-:твие микроорганизмов, наличие которых недопустимо (бактерии семейства Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus aureus, Pseudomonas leruginosa) .

В результате исследований установлено, что в анализируемых сериях :бора и водных извлечениях отсутствуют недопустимые бактерии. Микроб-сая контаминация образцов сбора и свежеприготовленных настоев сбора 'Гепафит" отвечает требованиям ГФ XI и Изменениям к статье ГФ XI, 1ЫП.2., С. 187. "Методы микробиологического контроля лекарственных редств.

Проведенный анализ 5 опытных серий сбора па радиационную чист ту показал, что содержание радионуклидов не превышает уровня устап влепного требованиями ВДУ ГН.2.6.005.-93. Образцы сбора не содерж; а-р-у-загрязнителей.

Выводы

1.С помощью метода фармакологического скрининга разработан состг нового фитопрепарата - сбора "Гепафит", включающего 7 видов лека] ственного растительного сырья, разрешенных к применению в мед! цинской практике: цветки ноготков 3 ч (20%), столбики с рыльцам кукурузы 3 ч (20%), трава горца птичьего 2 ч (13, 33%), плоды ил повнпка 2 ч (13, 33%), листья подорожника большого 2 ч(13, 33%! трава зверобоя 2 ч (13, 33%), корень одуванчика 1 ч (6, 67%).

2.Установлено,что сбор "Гепафит" по сравнению с известным гепатопр( тектором - силибором, обладает выраженными гепатозащитными, же.1 чегонными, противовоспалительными свойствами и может быть рек( мендован для медицинского применения в качестве гепатозащитног средства.

3. Определено, что сбор "Гепафит" относится к группе практически ш токсичных веществ, 1Л350 сбора при пероралыюм введении составил 8800(5500-14080) мг/кг.

4. С использованием физико-химических методов проведено изучени биологически активных соединений сбора "Гепафит" и установлен наличие в нем: антраценироизводных, аскорбиновой кислоты, флавс ноидов, дубильных веществ, полисахаридов. Методом ВЭЖХ в состг ве флавоноидного комплекса идентифицированы : дигидрокверцетин рутин, лютеолин-7- глюкозид, кверцетин, авикулярин, гиперозид 1 определено содержание суммы флавоноидов с использованием ГСС гиперозида ( не менее 1%). Методом хромато-масс-спектроскопии в со ставе сбора "Гепафит" идентифицирована бензойная кислота(3.26%).

5. Изучен элементный состав (2п,Си,РЬ,Сс1,Ре,№,Сг,Со) сбора и его карственной формы - настоя. Установлено , что содержание техног ных загрязнителей (РЬ и Сй) не превышает ПДК принятые для овоиц продукции, чая, а в лек. форме - настое отсутствует РЬ, Сс1.

6.Проведена стандартизация сбора по основному комплексу БАВ флавоноидам и разработана методика определения суммы флавоноидо] в пересчете на ГСО рутина, основанная на реакции комплексообразо вания флавоноидов с алюминия хлоридом методом спектрометрии, ко торая включена в проект ВФС для оценки качества готовой продук ции.

7.Разработаны характеристики подлинности (макроскопические, микро скоппческие ) и числовые нормативы показателей качества сбора суммы флавоноидов сбора в пересчете на рутин не менее 2 % ; влаж пость не более 10 %, зола общая - не более 10 %; зола , не растворима5 в 10 % растворе НС1 - не более 1,5 %; частиц, не проходящих сквоз! сито по ТУ-23.2.2068 89 с отверстием диаметром 5 мм не более 3%

частиц, проходящих сквозь сито по ГОСТ 4403-91 с отверстием диаметром 0,18 мм не более 5%, установлен срок годности сбора-2 года, которые включены в проект ВФС "Сбор Гепафпт" (Species Hepaphytum).

8.Наработана опытная партия сбора "Гепафпт" в фильтр-пакетах на АОЗТ "Теастан" (г. Уфа). Материалы по всестороннему изучению сбора "Гепафит" находятся на рассмотрении в ГИДКЭЛ МЗ РФ.

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах

1. Миназова Г.И. Токспко-фармакологическое обоснование гепатопротек-торного желчегонного сбора // Материалы 59-й науч. конф. студентов и молодых ученых БГМИ.- Уфа, 1994. - Часть 1. - С. 85-86.

2. Миназова Г.И., Насыров Х.М., Никитина Г.И. Гепатоиротекторная активность многокомпонентного сбора "Гепафит" при токсических поражениях печени // Мат. докл. Российской национальной конференции "Формирование приоритетов лекарственной политики". Москва, 1995 -С. 211-212.

3. Миназова Г.И., Насыров Х.М., Никитина Г.И., Кондратенко P.M., Га-лимов Ш.Н. Гепатопротекторные и противовоспалительные свойства многокомпонентного сбора "Гепафит" // Здравоохранение Башкортостана. - 1995. - № 4-5.- С. 42-45.

л. Миназова Г.И., Насыров Х.М., Лякина М.Н. Разработка и стандартизация гепатопротекториого, желчегонного сбора "Гепафит"//Мат. докл. Первой Всероссийской конференции по ботаническому ресурсоведению.-С.-Петербург,1996.-С.216-217.

5. Миназова Г.И., Денисова С.Б., Данилов В.Т., Муринов Ю.И. Спектро-фотометрическое определение суммы флавоноидов в сборе "Гепафит"//Фармация. - 1997. -Т.46, №1 . - С.19-20.