Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение рапса обыкновенного

СЪЕДИН АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РАПСА ОБЫКНОВЕННОГО (BRASSICA NAPUS L.)

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

СЪЕДИН АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РАПСА ОБЫКНОВЕННОГО (BRASSICA NAPUS L.)

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена в Пятигорском медико-фармацевтическом институте - филиале государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: кандидат фармацевтических наук

Сенченко Сергей Петрович

Официальные оппоненты: Авдеева Елена Владимировна

Доктор фармацевтических наук, доцент, ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии Зилфикаров Ифрат Назимович Доктор фармацевтических наук, ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений, главный научный сотрудник отдела фитохимии

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «24» декабря 2014 г. в I О00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.008.09 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, И).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11 и на сайте http://pmedpharm.ru. Автореферат разослан «03» ноября 2014 г.

Учёный секретарь /у Ремезова Ирина Петровна

диссертационного совета (г*

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Одним из важных направлений медицинской и фармацевтической науки является поиск новых источников биологически активных соединений (БАС) с целью дальнейшего расширения производства фитопрепаратов различного спектра действия. Это связано с тем, что лекарственные средства, получаемые исключительно из растительного сырья, характеризуются эффективностью и малой токсичностью, что позволяет использовать их длительное время для профилактики и лечения многих заболеваний без риска возникновения побочных явлений. Не менее важно и то, что некоторые природные БАС пока не могут найти синтетических аналогов. Кроме того, потребность населения в препаратах природного происхождения удовлетворяется не полностью, в частности, это происходит из-за дефицита лекарственного растительного сырья (ЛРС).

В настоящее время для России и других стран характерен рост различных форм онкопатологий. Несмотря на широкое внедрение высокотехнологичных видов медицинской помощи, одним из путей решения этой проблемы может служить применение средств профилактики среди лиц, относящихся к группе риска. К числу средств профилактики относят различные растительные БАС: флавоноиды (кверцетин, лютеолин, кемпферол, апигенин и др.), катехины и проантоцианидины, оказывающие антиоксидантное действие, а также природные индолы, среди которых следует особо выделить индол-3-карбинол (ИЗК). В настоящее время способность ИЗК оказывать противоопухолевое действие доказана не только в лабораторных экспериментах, но и в клинике.

В качестве природного источника ИЗК рекомендуется капуста брокколи, однако ввиду высокой себестоимости культивирования этого растения целесообразным является поиск других растений, содержащих как ИЗК, так и значительное количество флавоноидов.

В этой связи представляло интерес провести изучение рапса обыкновенного (Brassica napus L.) семейства капустные (Brassicaceae), издавна использу-

емого в народной медицине и культивируемого в больших объемах на территории России.

Однако, несмотря на широкое распространение в культуре, в фитохими-ческом отношении рапс обыкновенный остается недостаточно изученным. Отсутствуют нормативные документы, регламентирующие подлинность и качество сырья. В частности остается открытой проблема морфолого-анатомической диагностики растительного сырья для объективной оценки его подлинности, отличия от примесей. Нет утвержденных методик качественного и количественного определения основных действующих веществ рапса обыкновенного.

Поэтому, проведение фармакогностического изучения рапса обыкновенного, как нового источника природных биологически активных соединений, обладающих антиоксидантной и противоопухолевой активностью, является актуальной задачей.

Степень разработанности темы исследования. В результате исследований ученых, в основном зарубежных, хорошо изучены такие классы соединений рапса обыкновенного как флавоноидные гликозиды и стероиды. Изучена фармакологическая активность некоторых индивидуальных компонентов, характерных для рапса обыкновенного. Однако, литературные данные носят разнонаправленный характер, нет обобщенных сведений по качественному и количественному составу БАС рапса с антиоксидантной и противоопухолевой активностью. Отсутствуют нормативные документы, регламентирующие качество сырья.

Наиболее близкой по фармакологической активности к рапсу обыкновенному является биологически активная добавка к пище Индигал (ЗАО «МираксБиоФарма», Россия). Данная добавка содержит не менее 90 мг индол-3-карбинола и не менее 15 мг эпигалокатехин-3-галлата. Индигал предназначен для использования в качестве средства химиопрофилактики рака предстательной железы.

Цель н задачи. Целью настоящей работы явилось фармакогностическое

4

изучение рапса обыкновенного, качественный и количественный анализ его биологически активных соединений, определение показателей подлинности и качества сырья.

Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Установить морфолого-анатомические диагностические признаки и числовые показатели качества травы рапса обыкновенного.

2. С использованием ВЭЖХ разработать методику качественного и количественного анализа флавоноидов в траве рапса обыкновенного.

3. Провести исследования по использованию капиллярного зонного электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии для установления подлинности и количественного определения индол-3-карбинола в траве рапса обыкновенного.

4. Изучить возможность использования ИК спектроскопии с Фурье преобразованием для экспресс-оценки подлинности травы рапса обыкновенного.

5. Провести исследования по стандартизации травы рапса обыкновенного и установить сроки ее годности.

6. Определить острую токсичность и провести предварительное изучение специфической биологической активности водного и водно-спиртового извлечений из травы рапса обыкновенного.

Научная новизна. Проведено морфолого-анатомическое изучение травы рапса обыкновенного с учетом современных требований и установлены диагностические признаки сырья.

Разработаны методики оценки качества травы рапса обыкновенного, позволяющие достоверно установить методом ВЭЖХ содержание производных кемпферола и методом капиллярного электрофореза содержание индол-3-карбинола в сырье. В анализе индол-3-карбинола показана целесообразность использования мицеллярной электрокинетической хроматографии, как метода

анализа нейтральных соединений в условиях капиллярного электрофореза.

5

Впервые предложено проводить экспресс-оценку подлинности сырья рапса обыкновенного по содержанию гликозинолатов методом ИК спектроскопии с Фурье преобразованием. В сравнении с представителями других семейств, подтверждено для образцов растений семейства бгош'сасеае наличие полосы поглощения в области 1420-1400 см"1, характерной для серосодержащих соединений.

В опытах на животных изучена фармакологическая активность извлечений из травы рапса обыкновенного. Полученные данные свидетельствовали о проявлении им защитного действия в условиях острой токсической нефропа-тии: уменьшении или полном устранении проявления гиперазотемии, снижении интенсивности перекисного окисления липидов, нормализации уровня белкового обмена в почках.

Теоретическая и практическая значимость. Теоретическая значимость исследования заключается в расширении знаний о химическом составе травы рапса обыкновенного. Полученные данные в ходе фармакологического скрининга могут служить первым экспериментальным доклиническим обоснованием перспективности использования сырья рапса обыкновенного для разработки лечебно-профилактических средстве.

Практическая значимость исследования заключается в том, что в результате химического и фармакологического изучения показана возможность использования рапса обыкновенного в качестве источника флавоноидов и ин-дол-3-карбинола.

Исследования по экспресс-оценке подлинности травы рапса обыкновенного могут быть использованы для быстрой идентификации растений данного семейства, что свидетельствует о перспективности данного метода в анализе растительного сырья. Разработан проект фармакопейной статьи (ФС) «Рапса обыкновенного трава». Результаты диссертационных исследований апробированы в ООО «НПО АЛЬФАРМ» (г. Ростов-на-Дону) и ГУП РО «Фармацевтический центр» (г. Ростов-на-Дону).

Методология и методы исследования. Методологической основой ра-

6

боты послужили методические рекомендации по расширению номенклатуры отечественных официнальных лекарственных растений, основанные на современных информационных ресурсосберегающих технологиях [Киселева Т.Л., 2009].

Фитохимические исследования проводились с использованием комплекса различных физико-химических методов: бумажная (БХ) и газожидкостная хроматография (ГЖХ) использовались в анализе полисахаридов; высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) - в анализе флавоноидов; мицеллярная электрокинетическая хроматография - при разработке методики определения индол-3-карбинола; спектроскопия в ИК области применялась для разработки экспресс-оценки подлинности сырья рапса обыкновенного.

Для выявления фармакологической активности использованы биологические методы анализа.

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты морфолого-анатомического изучения травы рапса обыкновенного.

2. Результаты изучения химического состава травы рапса обыкновенного физико-химическими методами.

3. Результаты проведения процедуры стандартизации травы рапса обыкновенного.

4. Результаты изучения фармакологической активности водного и водно-спиртового извлечений из травы рапса обыкновенного.

Степень достоверности и апробация результатов. Оценка степени достоверности научных результатов определяется большим объемом проанализированной информационной базы, использованием современных физико-химических, биологических методов анализа, позволяющих получать воспроизводимые и однозначные результаты с их математико-статистической обработкой. Разработанные методики количественного определения валидированы.

Материалы исследования доложены и обсуждены на региональных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической

7

продукции» (Пятигорск, 2010 и 2013 гг.) и «Материалы IV Всероссийской Бур-денковской студенческой научной конференции» (Воронеж 2010), на Всероссийской конференции по аналитической хроматографии (Туапсе, 2010), на региональной научно-практической конференции «Инновационные идеи молодёжи Северного Кавказа - развитию экономики России» (23-24 октября 2012 г., г. Ставрополь).

Работа была представлена на Международной научной конференции «Фундаментальные исследования» (Иордания, Акаба, 8-15 июня 2014 г.), Международной научной конференции «Фундаментальные исследования» (Хорватия, Истрия, 23-30 июля 2014 г.), Международной научной конференции «Фундаментальные исследования» (Израиль, Тель-Авив, 16-23 октября 2014 г.), Международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии» (ОАЭ, Дубай, 16-23 октября 2014 г.).

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 4 - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Личный вклад автора. Автор принимал активное участие в постановке задач, осуществлении сбора и анализе литературных данных. Участвовал в постановке научных экспериментов (разработка методик анализа, изучение фармакологического действия), а также сборе и обработке первичных данных. Принимал участие в статистической обработке результатов эксперимента и подготовке основных публикаций по выполненной работе.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 143 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, заключения, списка литературы и приложения. В тексте содержится 45 таблиц, 36 рисунков. Список цитируемой литературы включает 147 источников, из них - 53 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Современное состояние фармакогностических исследований

растений рода Brassica L.

В данной главе приводятся обобщенные литературные сведения, касающиеся ботанической характеристики рода Brassica, ареала распространения и хозяйственного значения рапса обыкновенного (Brassica napus L.). Рассмотрены сведения о химическом составе рапса обыкновенного и использовании в медицине БАС, содержащихся в нем (флавоноидов, индол-3-карбинола). Рассмотрены характеристики основных методов, используемых в работе: ВЭЖХ, капиллярный электрофорез, ИК-Фурье спектроскопия.

Глава 2. Морфолого-анатомическая характеристика травы рапса обыкновенного. Определение числовых показателей

В работе использовали образцы травы рапса - надземная часть растения, заготовленная на высоте 10-15 см от земли (рапс яровой, сорт Ратник). Образцы собраны в Петровском (образец 1), Георгиевском районах (образец 2) Ставропольского края и Новокубанском районе Краснодарского края (образец 3), в мае-июне 2011 г. в фазу цветения и плодоношения.

Рапс - однолетнее растение. Стебель прямостоячий, округлый, разветвленный первого и последующего порядков. Высота стебля 60-190 см, толщина 0,8-3,5 см. Окраска стебля зелёная, темно-зелёная, сизо-зелёная, покрыт восковым налетом. Листья очередные, черешковые, в нижней части стебля лировид-но-перистонадрезанные с овальной или округлой тупой верхней долей, иногда слабоволнистой образуют компактную прикорневую розетку; средние листья -удлиненно-копьевидные; верхние - удлиненно-ланцетные, сидячие, цельно-крайные с расширенным основанием, на 1/3. Поэтому рапс легко отличить от других представителей рода Brassica. Листья сине-зеленые или фиолетовые, не-опушенные или слегка волосистые с восковым налетом. Цветки собраны в кистевидные (щитковидные) рыхлые соцветия. Цветок с четырьмя жёлтыми лепестками и эллиптически - яйцевидными чашелистиками, цветоножкой, ше-

стью тычинками (из которых две наружные короче внутренних) и одним пестиком с головчатым рыльцем.

При проведении микроскопического анализа использовали общепринятые методики. Растительный материал фиксировали в системе спирт этиловый 96%-глицерин-вода в соотношении (1:1:1). Срезы, полученные вручную, с помощью лезвий, окрашивали следующими реактивами: спиртовый раствор флороглюцина и 50%-ный раствор кислоты серной (одревесневшие элементы). Поверхностные препараты листовых пластинок готовили путем просветления кипячением в 3%-ном растворе натрия гидроксида с последующим промыванием водой. В ходе эксперимента использовали временные препараты, которые помещали в раствор хлоралгидрата или глицерина.

Анатомические исследования проводили при помощи микроскопа БИОЛАР с увеличением объективов х40; xi20; *240; ><1000; микропрепараты фотографировали при помощи цифрового фотоаппарата SONY DSC-T3.

Проведено морфолого-анатомическое изучение надземной части Brassica napus L. и установлены следующие диагностические признаки: клетки верхнего эпидермиса слабо извилистые; нижний эпидермис представлен клетками с более выраженной угловатой извилистостью клеточных стенок; устьица анизо-цитного типа, многочисленные на обеих сторонах листа; на поперечном срезе стебля отмечены проводящие коллатеральные пучки открытого типа, пыльца округлая, шиповатая, трехпоровая.

Определены основные числовые показатели травы рапса обыкновенного: влажность; содержание золы общей; золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной; содержание экстрактивных веществ. Показано, что наибольшее количество экстрактивных веществ извлекается спиртом этиловым 70%. Проведена оценка микробиологической чистоты сырья, а так же установлено содержание тяжелых металлов и радионуклидов в нем.

Глава 3. Изучение химического состава травы рапса обыкновенного

Флавоноиды. С целью выяснения природы этих соединений была предпринята попытка ВЭЖХ-изучения агликонов флавоноидов после проведения

10

процедуры гидролиза. По литературным данным гликозидная фракция флаво-ноидов травы рапса обыкновенного представлена производными кверцетина, кемпферола и изорамнетина. Поэтому предварительно была проанализирована модельная смесь стандартных образцов в приведённых условиях. В качестве стандартных образцов использовали кверцетин (Sigma-AIdrich, CAS Number: 117-39-5, содержание действующего вещества не менее 98%), кемпферол (Phy-toPlan, CAS Number: 1750/1, содержание действующего вещества не менее 98,29%), изорамнетин (Sigma-AIdrich, CAS Number: 480-19-3, содержание действующего вещества не менее 99%).

Растворы веществ готовили в 70% спирте этиловом. Хроматографирова-ние проводили с использованием системы для ВЭЖХ Стайер фирмы «Аквилон», с колонкой Luna С 18 «Phenomenex, USA», с содержанием углерода около 16%. Размер колонки 150x4,6 мм. Ввод пробы осуществлялся с помощью петлевого дозатора. Объём пробы 20 мкл. Элюирование проводили в градиентном режиме. Элюент А - ацетонитрил, элюент В - 2% раствор кислоты муравьиной. Содержание ацетонитрила увеличивалось от 20% до 60% за 40 мин, при расходе подвижной фазы 1 мл/мин. Детектирование осуществляли при 365 нм.

При этом установлено, что эффективность полученных пиков составляет более 55000 теоретических тарелок, а разрешение более 1,2 (Рисунок 1), что позволяет проводить не только идентификацию, но и количественное опреде-

Рисунок 1 - Хроматограмма модельной смеси стандартных образцов кверцетина, кемпферола и изорамнетина

Далее для каждого из образцов сырья рапса обыкновенного проводили экстракцию из стеблей, листьев и цветков смесью спирта этилового 70% и кислоты хлористоводородной разведенной (в соотношении 7:3). Было установлено, что для всех частей растения характерен одинаковый набор агликонов, но имеют место существенные различия в относительном содержании кверцетина, кемпферола и изорамнетина. Поэтому для дальнейших исследований целесообразно было использовать всю надземную часть (траву) рапса обыкновенного, собранного в фазу цветения.

Для определения производных кемпферола в траве рапса обыкновенного около 0,5 г (точная навеска), измельченного до размера частиц не более 3 мм, сырья переносили в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляли 50 мл смеси спирта этилового 70% и кислоты хлористоводородной разведенной (в соотношении 7:3), присоединяли обратный холодильник и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин, после охлаждения раствор фильтровали в мерную колбу вместимостью 100 мл. Процедуру повторяли, объединяя полученные извлечения в той же мерной колбе. Объём объединённого раствора доводили 70% спиртом этиловым до метки и тщательно перемешивали. Полученный раствор после центрифугирования использовали для анализа (рисунок 2).

ту 2011

Рисунок 2 - Хроматограмма извлечения из трапы рапса обыкновенного

Результаты количественного определения производных кемпферола в различных образцах травы рапса обыкновенного приведены в таблице 1.

Таблица 1 Результаты количественного определения производных кемпферола в различных образцах травы рапса обыкновенного

№ образца Содержание производных кемпферола, %, ±SD

1 0,326±0,007

2 0,092±0,002

3 0,050±0,001

Как следует из представленных данных, накопление производных кемпферола достаточно вариабельно в зависимости от места сбора, что необходимо учитывать при определении норм качества данного вида сырья.

Индол-З-карбинол. Семейство капустных содержит природные противоопухолевые веществ, являющихся производными индола. В этой связи на следующем этапе исследований необходимо было идентифицировать и количественно определить основное соединение из данной группы веществ — индол-3-карбинол.

Для определения индол-3-карбинола (ИЗК) был использован метод капиллярного электрофореза. Работу проводили на приборе «Капель 103Р» (ОАО «НПФ Люмэкс», Россия) с кварцевым капилляром диаметром 50 мкм, общей длинной 75 см и эффективной длинной 65 см. Детектирование осуществляли спектрофотометрически при 254 нм в катодной области капилляра. Работу проводили при комнатной температуре. В качестве ведущего электролита использовали раствор натрия тетрабората (10 мг/мл), ввод пробы осуществляли давлением - 150 мБар*с. Перед анализом все пробы центрифугировали при 8000 мин"1 в течение 10 мин. Анализ проводили при напряжении 25 кВ.

Предварительно изучали электрофоретическую подвижность стандартного образца ИЗК (рисунок 3) (Sigma-Aldrich, CAS Number: 700-06-1, содержание действующего вещества не менее 99%). Для этого использовали свежеприготовленные растворы ИЗК в диметилформамиде. Установлено, что в данных условиях пик ИЗК фиксируется на электрофореграмме сразу после системного пика. Такую высокую электрофоретическую подвижность можно объяснить отсутствием ионизации ИЗК в среде боратного электролита, что приводит к необходимости использовать режим мицеллярной электрокинетической хромато-

13

графии. В качестве оптимальных условий были выбраны следующие: концентрация натрия тетрабората декагидграта 10 мг/мл, натрия додецилсульфата 10

образца индол-3-карбинола

Для определения содержания ИЗ К в траве рапса обыкновенного около 0,5г (точная навеска) сырья, измельчённого до частиц размером не более 3 мм, заливали 50 мл смеси диметилформамида и спирта этилового в соотношении 4:1 и кипятили в течение 1 часа. После чего извлечение охлаждали, фильтровали и доводили в мерной колбе до объёма в 50 мл. Полученный раствор после центрифугирования использовали для анализа (рисунок 4).

рапса обыкновенного

При этом установлено, что в траве рапса обыкновенного ИЗ К присутствует в свободном виде, причем разрешение с ближайшим пиком составляет более 1,2, что позволяет использовать данные условия и для его количественной

оценки. В этой связи, далее проводили расчет содержания ИЗК в различных об-образцах сырья по раствору стандартного образца.

Полученные результаты количественной оценки представлены в таблице2. Таблица 2 - Результаты количественного определения индол-3-

карбинола в надземной части рапса, п=6

№ Образца Содержание ИЗК,%, ±SD

1 1,02±0,06

2 1,90±0,01

3 1,26±0,10

Как следует из представленных данных, индол-3-карбинол в значительной

степени накапливается во всех изучаемых образцах. Это свидетельствует о перспективности данного растительного объекта, для разработки высокоактивного средства профилактики онкологических заболеваний.

Использование метода ИК-спектроскопии для экспресс-идентификации растительного сырья

В качестве объектов исследования использовали образцы сырья растений, как относящихся к сем. Вгая^чкасвае, так и представителей других семейств. Объекты исследования приведены в таблице 3.

Таблица 3 - Объекты исследования методом Фурье-ИК спектроскопии

№ п/н Растительный образец (рястепнс-сырьс) сем. Brassicaceae, содержащий тиогликозилы Растительный образец (растение-сырье) сравпепна

1 Горчица сарептская - семена (Brassica juncea L.) Вахта трёхлистная - трава (Menvanthes trifbliala L)

2 Желтушник левкойпый - трава (Eiysimum cheiranthoides L.) Ива трехгычннковая - кора (Salix Iriandra L.)

3 Клоповник посевной — семена (Lepidium sativum L.) Крапива двудомная — листья (Unica dioica L.)

4 Пастушья сумка обыкновенная — трава (Capsella bursa-pasloris L.) Липа сердцелистпая - листья (Tilia cordata L.)

5 Рапс обыкновенный - трава (Brassica napus L.) Мать и мачеха обыкновенная -листья (Tussilago farfaro L.)

6 Редька огородная - семена (Raphanus sativus L) Золототысячник обыкновенный - трава (Centawium erylliraea Rafn.)

7 Редька посевная чёрная - корень (Raphanus sativus L. rar niger (Mill.) Kerner)

8 Редька белая - трава (Raphanus Candidus Worosch.)

Для ИК-спектросколии использовали ИК-Фурье-спектрометр с приставкой неполного поверхностного отражения (НПВО). Для этого отдельные части растений измельчали в вибромельнице. Далее полученный порошок (0,1 г) в течение 30 минут экстрагировали в колбе с обратным холодильником ДМФА (10 мл). Извлечение центрифугировали при 7000 мин"1, в течение 5 мин, затем проводили регистрацию спектра суммарного извлечения. С этой целью на призму приставки НПВО помещали 200 мкл ДМФА извлечения и регистрировали спектр поглощения в ИК области.

При сравнении спектров образцов некоторых представителей семейства капустных обнаружено их значительное сходство в области валентных и деформационных колебаний: — 1021, -1236, -1411, -1640 см"1 (Рисунок 5), что указывает на определенную устойчивость химического состава данного семейства.

Рисунок 5 - Общий вид спектров извлечений из растительных

образцов, содержащих тиогликозиды (нумерация в соответствии с

таблицей 3)

Во всех спектрах исследованных образцов обнаружены полосы поглощения, отражающие общий химический состав. Однако особое внимание привлекает область деформационных колебаний (1700 - 1000 см"1), поскольку именно в этой области для ряда характеристических полос поглощения установлены основные сходства. Обнаружено закономерное появление ряда характеристических полос сульфоносодержащих групп (Таблица 4).

№п/п Класс соединения Частота см"1

I Сульфиды -1439-1410

2 Сульфоксиды -1420-1400

3 Тиокарбонильные соединения -1420-740

4 Тиоамиды -1640

При сравнении спектров образцов извлечений из некоторых представителей семейства капустных обнаружено их значительное сходство в области 1400-1420 см"1, что указывает на определенную повторяемость в спектрах и отличительную черту химического состава данного семейства, от других объектов сравнения (рисунок 6).

Рисунок б - Общий вид спектров извлечений из растительных образцов сравнения (нумерация в соответствии с таблицей 3)

Как следует из представленных данных, на спектрах поглощения растворов извлечений из растительного сырья, являющихся образцами сравнения отсутствуют полосы, характерные для представителей сем. Вга.ыюасеае, и характер спектров достаточно разнородный.

На следующем этапе исследований была предпринята попытка использования метода НПВО для регистрации ИК спектров порошка растительного сырья без предварительной обработки. Методика получения порошка описана ранее. Полученные результаты представлены на рисунке 7.

Рисунок 7 - Общий вид спектров порошков растительных образцов содержащих тиогликозиды методом НПВО (нумерация « соответствии с

таблицей 3)

Анализ полученных спектральных кривых подтверждает наличие полосы поглощения в области 1400-1420 см"', интенсивность которой менее выражена, чем для извлечений, но она, тем не менее, может быть отнесена к полосе валентных колебаний сульфонов и сульфоксидов.

Далее проведен сравнительный анализ спектров образцов некоторых представителей семейства крестоцветных с другими растительными объектами, не содержащими тиогликозиды (Рисунок 8), что подтвердило ранее сделанные выводы.

Рисунок 8 - Общий вид спектров порошков растительных образцов сравнения методом НПВО (нумерация в соответствии с таблицей 3)

Таким образом, методом ИК спектроскопии с использованием варианта НПВО подтверждено, что для изученных образцов растений сем. Дггш/'шсеве характерно наличие полосы поглощения в области 1400-1420 см'1, которая может свидетельствовать о наличии тиогликозидов в изучаемом сырье и тем самым служить для быстрой идентификации растений данного семейства.

Глава 4. Стандартизация травы рапса обыкновенного

Для стандартизации данного сырья согласно ОСТ 42-91500.05.001 - 00 были выбраны следующие показатели: испытание на подлинность для цельного и измельченного сырья, числовые показатели, микробиологическая чистота, срок годности.

Разработанные методики количественного определения производных кемпферола и ИЗК были подвергнуты процедуре валидации. При этом была доказана их валидность по критериям: линейность, прецизионность и правильность.

На шести сериях сырья осуществлен анализ по всем выбранным показателям, в результате чего были обоснованы нормы качества сырья по всем выбранным показателям.

Таблица 5 - Нормы качества травы рапса обыкновенного

Показатели Методы Нормы

1 2 3

Внешние признаки Цельное сырье. Измельченное сырье. Biny;un.iio Олиственнме стебли и их кусочки, цельные или измельченные листья и цветочные корзинки Листья очередные, черешковые, в нижней части стебля лировилно-псристонадрезалные с овальной или округлой тупой верхней долей. иногда слабоволнистоп образуют компактную прикорневую розетку; средине листья - удлиненно-копьевидные; верхние - удлиненно-ланцетные, сидячие, целыюкрайные с расширенным основанием, на 1/3. Листья сине-зеленые или фиолетовые, неопушенные или слегка волосистые с восковым налетом. Цветки собраны в кистевидные (щитковидные) рыхлые соцветия. Цветок с четырьмя жёлтыми лепестками и эллиптически - яйцевидными чашелистиками, цветоножкой, шестью тычинками (из которых две наружные короче внутренних) и одним пестиком с головчатым рмльцем. Кусочки листьев, стеблей и цветков, проходящие сквозь cirro с отверстиями диаметром 7 мм Цвет зеленый или буровато - зеленый с желтыми вкраплениями. Запах характерный. Вкус горькопатый

Микроскопия Визуально Клетки верхнего эпидермиса слабо извилистые; нижний эпидермис представлен клетками с более выраженной угловатой извилистостью клеточных стенок; устьица анизоцитного типа многочисленные на обеих сторонах листа, на поперечном срезе стебля отмечены проводящие коллатеральные пучки открытого типа, пыльца округлая, шиповатая, трехпоровая.

Подлинность: Флавопоиды Цианидиповая проба Образование розового окрашивания

Производные кемпферола Индол-З-карбииол ВЭЖХ Капиллярный электрофорез Время удерживания пика кемпферола на хромагограмме испытуемого раствора должно соответствовать времени удерживания пика па хроматограмме СО кемпферола. Время удерживания пика индол-З-карбинола на электрофореграмме испытуемого раствора должно соответствовать времени удерживания пика на электрофореграмме СО индол-3-карбинола.

Количественное определение:

Сумма производных кемпферола ВЭЖХ Не менее 0,05 %

Индол-З-карбинол Капиллярный электрофоре! Не менее 0,9 %

Потеря в массе при высушивании ГФ XI, вып.2, стр.160 Не более 13 %.

Общая зола ГФ XII, часть 1, с. 115 Не более 10 %.

Зола нерастворимая в 10% растворе кислоты хлористоводородной ГФ XI, вып.2, стр.160 Не более 3 %.

Минеральные примеси Весовой Не более 1 %.

Органические примеси Весовой Не более 1 %.

Микробиологическая чистота ГФ XII, часть 1, с. 160 соответствует категории 4 А

Содержания радионуклидов ОФС 42-0011-03 соответствует группе 1

Упаковка В соответствии с ГОСТ 6077-80 и ГОС Т 17768-90. Апгро - по ГОСТ 2226-88 и ГОСТ 30090-93 не более 20 кг нетто. По 100 г и 50 г по ГОСТ 12303-80. Транспортная тара в соответствии с ГОСТ 17768-90.

Маркировка В соответствии с ГОСТ 17768-90 и ГОСТ 6077-80 со следующим дополнением: указывают массу, условия хранения, регистрационный номер, штрих-код, соответствие продукции по содержанию радионуклидов. Маркировка транспортной тары в соответствии с ГОСТ 14192-96.

Храпение В сухом, защищенном от света и недоступном для детей месте.

Срок годности 2 года

Глава 5. Первичная фармакологическая оценка извлечения, полученного из травы рапса

Нефропротекторное действие полученного водно-спиртового извлечения травы рапса обыкновенного изучали на крысах линии Wistar массой 170-210 г на модели острой токсической нефропатии.

Проведенные исследования свидетельствуют, что водно-спиртовое извлечение травы рапса обладает защитным действием в условиях острой токсической нефропатии. Уменьшает или полностью устраняет проявления гиперазотемии, снижает интенсивность перекисного окисления липидов, нормализует уровень белкового обмена в почках. Нефропротекторное действие извлечения травы рапса обыкновенного по некоторым показателям превосходит эффект препарата сравнения (леспефлана).

Водное и водно-спиртовое извлечение, полученное из травы рапса обыкновенного, относится по классификации токсичности Н.С. Hodge и L.H. Sterner к 5 классу соединений, т.е. является практически нетоксичным.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в ходе проведенных исследований расширены знания о химическом составе рапса обыкновенного, экспериментально обоснованы нормы качества и разработан проект фармакопейной статьи «Рапса обыкновенного трава».

1. Установлены морфолого-анатомические диагностические признаки, травы рапса обыкновенного. Определены основные числовые показатели травы рапса обыкновенного: влажность, содержание золы общей; золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной, содержание экстрактивных веществ, а также содержание тяжелых металлов, радионуклидов, микробиологическая чистота.

2. Разработана методика качественного и количественного определения производных кемпферола в траве рапса обыкновенного с помощью ВЭЖХ. Валидационная оценка методики показала возможность ее использования для контроля содержания производных кемпферола в сырье.

3. Показана целесообразность использования метода мицеллярной электрокинетической хроматографии для определения ИЗК в траве рапса обыкновенного в сравнении с капиллярным зонным электрофорезом. Валидационная оценка методики показала возможность ее применения для контроля содержания ИЗК в траве рапса обыкновенного.

4. Продемонстрирована возможность использования ИК спектроскопии с Фурье преобразованием для экспресс-оценки подлинности травы рапса обыкновенного. Установлено, что для этой цели целесообразно использование характеристические полосы поглощения серосодержащих соединений (гликозинолатов).

5. Проведена стандартизация травы рапса обыкновенного. В соответствии с требованиями ОСТа 91500.05.001-00 установлены нормы качества сырья. Методом естественного хранения изучена стабильность травы рапса обыкновенного. Срок годности сырья составил не менее двух лет.

6. В опытах на животных установлено, что водное извлечение, полученное из травы рапса обыкновенного, относится по классификации токсичности Н.С. Hodge и L.H. Sterner к 5 классу соединений, т.е. является практически нетоксичным. Изучение нефропротекторной активности водно-спиртового извлечения из травы рапса обыкновенного свидетельствует о его защитном действии в условиях острой токсической нефропатии: уменьшении или полном устранении проявлений гиперазотемии, снижении интенсивности перекисного окисления липидов, нормализации уровня белкового обмена в почках.

Полученные результаты могут служить предварительным экспериментальным обоснованием перспективности использования данного вида сырья для разработки лечебно-профилактического средства.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Изучение химического состава некоторых пищевых растений, культивируемых в Ставропольском крае / В.А. Челомбитько, Т.В. Орловская, Е.Ф. Лозовицкая-Щербинина, С.Я. Овчинникова, A.B. Съедин [и др.] // Вопросы биол., мед. и фармац. химии. - 2012. — № 4. — С. 44-47.

2. Гаврилин, М.В. Количественное определение веществ антиканцерогенного действия в надземной части некоторых растений семейства Brassicaceae / M.B. Гаврилин, A.B. Съедин, С.П. Сенченко // Химико-фармацевтический журнал. - 2012. - Т. 46. - № 6. - С. 32-35.

3. Орловская, Т.В. Изучение углеводов семян Raphanus sativus и Brassica napus / Т.В. Орловская, A.B. Съедин, M.X. Маликова // Химия природных соединений.-2013.-№ 2-С. 277-278.

4. Съедин, A.B. Использование метода ИК-спектроскопии для экспресс-идентификации тиогликозидов в растительном сырье / A.B. Съедин, Т.В. Орловская, М.В. Гаврилин // Современные проблемы науки и образования. - 2014. - № 1. - Режим доступа: http://www.science-education.ru/115-11953.

5. Гаврилин, М.В. Количественное определение флавоноидов в надземной части рапса обыкновенного / М.В. Гаврилин, A.B. Съедин // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2010. - Вып. 65. - С. 298-300.

6. Гаврилин, М.В. Изучение химического состава надземной части рапса обыкновенного с использованием методов ВЭЖХ и капиллярного электрофореза / М.В. Гаврилин, A.B. Съедин, С.П. Сенченко // Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез: матер. Всероссийской конференции. - Краснодар, 2010. - С. 160.

7. Гаврилин, М.В. Количественное определение индол-3-карбинола в

надземной части некоторых растений семейства Brassicaceae / М.В.

Гаврилин, A.B. Съедин, С.П. Сенченко // Разработка, исследование и

23

маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2011. - Вып. 66. - С. 373-375.

8. Съедин, A.B. Товароведческие показатели сырья рапса обыкновенного / A.B. Съедин // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2013. - Вып. 68. -С. 104-106.

9. Съедин, A.B. Изучение углеводов травы рапса обыкновенного / A.B. Съедин, Т.В. Орловская // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2014.-№ 8 (ч. I). — С. 146-147.

10. Съедин, A.B. Изучение острой токсичности сухих экстрактов из рапса обыкновенного / A.B. Съедин, С.П. Сенченко // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. — 2014. — № 8 (ч. 4). — С. 147-148.

11. Съедин, A.B. Изучение оптимальных параметров получения экстрактов из рапса обыкновенного / A.B. Съедин, Т.В. Орловская // Международный журнал экспериментального образования. - 2014. — № 8 (ч. 2). - С. 93-94.

12. Съедин, A.B. Изучение морфолого-анатомических признаков травы рапса обыкновенного / A.B. Съедин, Т.В. Орловская // Международный журнал экспериментального образования. - 2014. - № 8 (ч. 3). - С. 122-123.

СЪЕДИН АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РАПСА ОБЫКНОВЕННОГО (BRASSICA NAPUS L.)

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати « 27» октября 2014 г. Формат 60x84/16 Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № 1349 ПМФИ - филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России 357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11

/,. '1 ~

г.1

2014158302

2014158302