Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Исследование процессов выделения поверхностного антигена вируса гепатита В из штамма-продуцента дрожжей и изучение его иммунологических свойств

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ССОР ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

■ На правах рукописи Для служебного пользования Экз. N

Курбатова Ирина Юрьевна „

ИССЛЕДОВАШЕ ПРОЦЕССОВ щдклешш поверхностного АНТГТЕНА ЕШУСА ГЕПАТИТА 3 КЗ ШГ^'^-ПРОДУЦЕГГЛ ДРОЖЕи

I! шчешз ш> кэтожи'ГХЕак скйсзв.

Г4.00.36. - аллерголошя и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

мост, 1991 г;

Работа выполнена в Институте иммунологии Минздрава СССР

Научные руководители:

профессор, член-корреспондент АМН СССР Р.М.Хаитов кандидат биологических наук И.В.Красильников

Официальные оппоненты:

доктор биологически наук В.Н.Федосеева

доктор медицинских наук М.И.Михайлов

Ведущее учерэвдение: 2-ой Московский ордена Ленина государственный медицинский институт имени Н.И.Пирогова

Защита диссертации состоится 1991г.

в "/?" часов на заседании специализированного Совета Д 074.09.01 при Институте иммунологии ЫЗ СССР по адресу: Москва, Каширское шоссе, 24, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

Автореферат разослан 1991 г,

Ученый секретарь Совета

д.б.н. А.В.Нолобов

- I -ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы. В настоящее время вирусный ге--патит В остается одним из наиболее распространенных заболеваний в мире. По данным ВОЗ этой инфекцией охвачено около 300 млн. человек, т.е. евшие 55 населения планета, в том числе более 5 млн. приходится на СССР. Это заболевание является причиной тяталых осложнений, таких как . гепатоклеточная карцинома и цирроз печени.

" Известно, что успешная профилактика гепатита В возможна пут«-." активной шяунизации здорового населения препаратом поверхностного антигена вируса гепатита В (НВаА§). Использование о этой цэльа природного НВз.^, выделецного из плазмы крови хронических носителей вируса, имеет ряд ограничений (потенциальная опасность инфэкционноста вакцины, -дефицит сырья, высокая стоимость н др.). Кроне того, в последнее время безопасность плазменной вакцины подвергнута сомнениям из-за потенциального риска возмокносгл переноса синдрома приобретенного, пнцунпого дефицита (СПИД),. Более перспективным является пр:з.!енэш!9 вакцина, содержащей НЕвАд, полученный гвшо-пнненвршш способом из рекомбинантного штамма дрокгай. Одним из наиболео слоетых и ответственных ' этапов на пути создания такой вакцины является выделение НВзАё из клеток-продуцентов дроззвй и его очистка. Для достижения этой цели необходимы. • эффективнее,л технологичные методы концентрирования а очистки 'дрогамвбго НВзАд. -

Поиск оптимальных условий получения очищенного для

применения - в' ' качестве вакцины и исследование его иммунологических свойств является задачей, имеющей вахное научное и прикладное значение.

Цель и задачи-работы. Основной целью данной диссертационной работы является разработка методов выделения и очистки рекомбинантного НВзА& из штамма-продуцента дрогоюй для дальнейшего его применения в качестве вакцины, а также изучения физико-химических и иммунологических свойств.

В связи с этим основными задачами явились:

1. Изучение сорбщш-де сорбции рвкомбинантного дрозокаво-го НВзАц на макропористых кремнеземах.

2. 01 имизация процесса адсорбционной хроматографии для концентрирования и частичной очистки дрозакевого гШа1£.

3. Изучение процесса очистки-гНВезА^ с помощью гель-хрома тографм.

4- Изучение процесса ультрацентрифугирования гНВаАв в градиенте плотности.

•5. Исследование физико-химических свойств препаратов гНВоАв.

6. Определение иммунологических свойств очищенных препаратов рекомбинантного дрожжевого ЕВвАг.

Научная новизна. Найдены оптимальные условия .проведена адсорбционной хроматографии на МПС. Установленные закономерности процессов сорбции-десорбции гНВвА£ на пористых стеклах позволили получить концентрированные и частично очищенные его препараты. '

Впервые для дрожжевого Шва«, синтезируемого продуцентом, • полученным в Советском Союзе, изучен процесс гель-хроматографии на модифицированных макропористых кремнеземах. Найден модифицированный носитель, на котором очистка препаратов проходит фактически без потерь.

Проведен сравнительный анализ некоторых физико-хямпческих характеристик дрожжевого и плазменного HBsAg.

Найдена и экспериментально обоснована рациональная схема концентрирования и очистки препаративных количеств дрожжевого экстракта поверхностного антигена вируса гепатита В.

Проведена оценка иммунологической активности дрожжевого рекомбинантного HBeAg по сравнению с плазменным HBsAg.

Ш§ктическое__значение__работы. Материалы проведенных

исследований по получению очищенного препарата rHBsAg вошли в описание изобретения "Способ получения рекомбинантаой вакцины к гепатиту В", на которое получено авторское свидетельство И 1389060. . ■

Полученные результаты использованы при написании "Инструкции по изготовлению И контролю Vaooinum hepatitis В геоо-mbinantum eaoaharomycetioum adeorptum liquidum; вакцины против гепатита В,рекомбинантаой, дрожжевой, адсорбированной, жидкой" и "Отчета о результатах доклинических испытаний ре-комбинантной дрожжевой вакцины против гепатита В".

Основные..положения, выносимые на защиту:

1. Исследованы условия сорбции-десорбции рекомбинантного дрожжевого HBsAg из экстракта разрушения клеток-продуцентов на различных макропористых кремнеземах.

2. Впервые изучен процесс адсорбционной хроматографии на МПС для препаратов рекомбинантного дрожжевого HBsAg, найден оптимальный носитель и условия концентрирования и очистки рекомбинантного НВзАд.

3. Изучен процесс очистка.!!'проведен сравнительный анализ поведения дрояжэйоГо и.11лазмешого,НВвА§ ¿.различных условиях

на макропористом кремнезема «одафз&ровшшом полйишьшдзроладоши при проведении гель-хроматографии.

4. Изучена и экспериментально обоснована технологическая схема концентрирования и очистки с применением хрсматографш на МПС и ульгрзцэнтрифугаровашя рзкомбингнтного ОВа&г, которая была иогодьзована для получения зкспердаенталызух серий генно-шдзнерюй вшсцины против гепатита В.

■5. Проведен анализ физико-хш-йпесхих к , иммунологических характеристик полученных дроиових препаратов НВеА^.

Аггробшщя диссертации. Доклад по результатам дассертацш был обсузден на кзглабораторпой кснфэрокшш Института иммунологии МЗ СССР 28 декабря 1230 года.' Материала по теме диссертации бит довохэш на иаргикх конференциях молодых ученых Института иммунология ЫЗ СССР ( Москва, 1986, 1987 ) л .на П Цаздународном симпозиуме по биотехнологии (Пекин, 1939)

Публикация материалов,иссла дований. Основные даннж диссертации представлены в пяти публикациях, из которых ] авторское свидетельство, 3 статьи и I тезисы .доклада.

Объем и структура работа. Диссертация изложена на /3 страницах кааияописного текста и состоит из введения', обзор литературы (три главы), собственных исследования (пять глав) "обсукденият выводов и "списка литературы. Диссертация содержи 13 таблиц и 19 рисунков. Библиографический указатель включав 214 источников литературы, из которых 176 иностранных.

- 5 -МАТЕРИАЛЫ VI МЕТОДЫ.

Штамм рвкомбтаантннх дроажей.

В работе использована дроязи Saccharomyces cersvisiae (штаммы DBT 746 к ДАН 2), содержащие рекомбинантную плазмиду prava 20-54. Штаммы содержат в шгазмиде ген поверхностного антигена BIB (подшп ar:i), способный экспреосировать белок внутри клетки. Оба штамма любезно предоставлены Грановским H.H. ( Институт вирусологии АШ ССОР ).

экспериментальное культавироЕашш птаммов-продуцйнтоп осуществлялось на базе Института вирусологии АМН СССР и Научно-производственного б:ют<шгслопгче cicoro центра Бко-ВГИ при Институте Сяооргвшггасксй шш АН СССР. •

Плазменный поверхностный антиген вируса гепатита В.

Природный антиген, выделенный из плазмы крова доворов-антигеноносителзй по технологической схеме производства экспериментального, вакцинного, плазменного препарата, получали пз Горьковского НИИЭМ, от Зубова C.B."

Макропористые кремнеземы.

Адсорбционную' и гель-хроматографии препаратов дрожжевого рекомбинантного HBsAg проводили на макропористых кремнеземах с нешдафщированной и модифицированной различными способами шверхностьюГТГаржтерисипш кре'шеззмов представлены в табл.1.

Лабораторные животные.

В экспериментах попользовала мышей лиши С57В1 и гибридов первого поколения PI ( СВА х С57В1 } обоего пола,-вэсом I2.-I6 г, а также морских- свинок пестрых весом 450-500 г.

Фабявда I.

Характеристики макропористых кремнеземов (МПК).

1 N I 1п/п!

Марка МПК

! Мода£и-1 катор I

Средний ¡Пористость! Удельная

I диаметр I (объем I I пор.мкм |пор),см3/г1

--1. I

-I-

1 IМПС—2000 ВГХ!

2 IМПС-2000 ВГХ!капролактам

3 ¡ШС-2000 ВГХ! бензойная I I кислота |ЫПС-2Ь00 ВГХ1 п-оксибен-

Iзойная к-та I

I 4

I I . I 5 I I € |

5 €

7

8

МПС-60-5 0-80 С-80 С-80

пвп н-ш

¡0,18-0,26! ¡0,18-0,261 ¡0,18-0,261 I I

10,18-0,261 I I

I 0,186 I !0,06-0,08( ¡0,06-0,081 ¡0.06-0,081 I I

1,7-2,5 I 1,7-2,5 I 1,7-2,5 I 1

повергн. ур/г

25-26 25-26 25-26

1,7-2,5 I 25-26 I

2,15 I 0,7-1,3 I 0,7-1,3 I 0,7-1,3 I I

46 70-90 70-90 70-90

- поверхность кремнезема немодафицирована.

}

йшотвдэ получены из питомника АМН СССР "Столбовая".

Равновесное ультрвцентрифугирование проводили в горизовгадьном ротора 6 х 36 мл или 6 х 18 мл, АН-627, 22-25 исов ups 22-24 тыс. об./мин. при f4°C на центрифуге OTD 7БВ Sorvall Ultraosntrifuga { Dupont, США ).

Антигенную активность в /«розжевом экстракте, во фракциях юсле хроматографии и ультрацентрпфугирования определяли в реакции пассивной гемагглютинащш ( FITA ) с эритроцитарным ¡щагностикумом Горьковского НИИЭМ, Шшгчзственноа содержание c-HBßAs в препаратах определяли, сравнивая полученный ,титр с пиром коммерческого референс-препарата.

Антигенную активность в очищенных препаратах определяли о помощью коммерческих наборов 'для рэдиоиммунологич&ского анализа AUSRIA ( Abbott, сша ) и иммунофарментного анализа aüszyme ( Abbott, сша ), согласно инструкции к наборам.

При определении иммунологической активности препаратов наличие антител к HBsAg в полученных сыворотках определяли методами РПГА (эритроцитаршй диагностику« Горьковского НИИЭМ), иммуноферментннм анализом ( AUS AB EIA, Abbott, США ) и радиоиммунологическим анализом ( AUS AB, Abbott, США ).

Белковый анализ дрожжевых препаратов проводили, используя метод электрофореза в полиакриламидном гелэ с додецилсульфатом натрия, предложенный LaemmH { 1979 ) и метод иммуноблоттинга (Pittner M. et al, 1980).

Концентрацию белка определяли по методу Lo wry ( 1951 ), предварительно построив калибровочную кривую по растворам 'ЕСА различной концентрации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСКЩЦЭШЕ.

I. Изучение процесса__сорбции-десорбции , гКВеА^ я подбо

условий для проведения адсорбционной хроматографии на КПС.

Первой задачей нашей работы было исследование сорбции ■ десорбции гНВзАд из штамма-продуцента дрожжей на различны: пористых кремнеземах, используемых для очистки вирусных белков

В результате проведенных исследований было установлено, что наиболее полная адсорбция гНВаА^ из осветленного дрожжевой экстракта наблюдалась на недадафицированном. стекле ВДС-200С ВГХ. Рекомбивантный антиген сорбировался на нем щ® перемешивании в течение 1-2 часов при +4° С на 90-982. После чего набивали колонку и проводили алвдию бикарбонатныы буферным раствором с повышением рН до Э и выше. Это позволило проводить предварительную отмывку сорбента буферными растворами с рК до 8, что способствовало удалении большого количества примесных белков и существенно влияло яа чистоту получаемого препарата.

Средний выход антигена при адсорбционной хроматографии на немодафицарованноы МПС-2000 ВТХ составлял 80-9056. Сорбция на немодифицированном МПС-60-Б проходила на 90-95%. Однако, несмотря на использование для элюции различных, . буферов, увеличение рН до II (при использовании 255 ш4он ) и увеличение ионной силы (при использовании 1М НаС1^ выход антигена не превышал 40-50Ж.

На ЫИи-2000 ВГХ модифицированном капролактамом сорбировалось до 803!, а на ШС-2000 обработанном бензойной кислотой - до. 9058 антигена. Элвдго проводили бикарбонатным буферным раствором, с повышением рН до 9. Для увеличения ионной силы раствора в буфер с рН 9,1 добавляли Ш иаС1, но и в таких условиях не удалось получить выход на М1С-2000 ВГХ модифицированном

Рис.1 Адсорбционная хроматография дрокяевого • экстракта рэиомбинангного НВ5А5. Колонка : 26x280 г.?л Сорбент : МШ-2000 БГХ

. .........Начальный тигр - образца-: 1:25б------------------

По оси ординат слэва-отяческая плотность злгата, л единицах шкалы (кривая I ), справа-обратная величина титра в РИГА (кривая 2).

Яо оси абсцисс - объем элтата в. ш. - -

капролактамом выше Максимальный выход на ШС-200

модифицированном бензойной кислотой /даже при увеличении р; элшруюцего буферного раствора до II, не превышал 0,5% Полученные результаты (табл.2.) позволяют сделать заключение что наиболее полная сорбция-десорбция рекомбинантного НВзА, происходит на немодифицированном МПС-2000 ВГХ ( рис Л ).

Таким, образом, адсорбционная хроматография на МП< оказалась высокоспецифичным и эффективным способом очистки ] концентрирования рекомбинантного дрожжевого НВвА^. С ее помощь) получили концентрированный препарат, . содержащий' около ,85 1 рекомбинантного антигена от исходного количества и очищенный о-примесных болков в 50-60 раз ( с учетом коэффициент! концентрирования).

2• Подбор условий для проведения__гель-хроматогрзфм

гНВвАк, сравнительное изучение поведения гНВзАя и рНВвА/г;.

Кэмодифицированные МПК практически не применяются • I препаративном разделении белков методом гель-хроматографш (Коликов В.Ы. и др., 1986). Наилучшие результаты дл« дрожжевого НВаАв были получены на силохроме С-8С модифицированном паливинилпирролвдоном или и-винилпирролидоноь ( рис.2.).; Элицшо проводили 0,05 М бикарбонатным буферы» раствором рН 9,1 или 0,05 М Трис-НС1 рН 9,1, в том и в другои —- случаях—наблюдали практически полный выход рекомбинантногс НВвА« (более 90»).

Провели сравнительное изучение поведения рекомбинантного I плазменного НВвАа в условиях гель-хроматографии. Результата экспериментов представлены в таблице 3.

Использование элшрущего буферного . раствора сс слабощелочными значениями рН ( 7,5-7,8 ) приводило к уменьшеник

Таблица 2. Результаты адсорбционной хроматографии на макропористых кремнеземах.

! Марка i Модами- i Средний 1фемнезема i катор i диаметр I ^ i ! пор, нм

I МПС-2000 ВГХ 1капролак-| 210 i ! там i

i ! ' i ШС-2000 ВГХ (бензойная! 210 î t кислота i

i i i f МПС-2000 ВГХ » п-окси- i 210 I (бензойная!

I ' i кислота i

i ) i I ШС-2000 ВГХ ! нет i 210 i i • г

I МПС-60-5 » нет I I8S

I !

' Таблица 3.

Выход рекомбинантного и плазменного HBsAg на С-80 модифицированном ПВП.

1 Вид I 1 HBsAg I! 1 Среднее значение выхода в % при 1

. рН 7,8 • , рН 8,8 I рН 9,1 |

i Рекомбинантный 1 !------------ —+- I Î 13 ± 5 60 + 8 i 95 + 5 !

! Плазменный 1 I 1 ______ 60 + 8 81 +- 9 1 1 95 + 5 !

иредшш выход в %

при рН 7,8 при рН 9,1

I + 0,5 7 + 2

0 0

2+0,7 II + 2

1+0,5 : 85 + 10

3 + а,8 45 + 8

Рис.2 Гадь-хроматография рекомбшалтного НВзА^. Колонка : 26x225 ми Сорбент : С-80 модифицированный ПВП Объаи образца : 12 ид

По ооя ординат слева - оптическая плотность элюата в единицах шкапы (кривая I ), справа - тагр НВ$А^ в РИГА ( кривая 2 ). По оси абсцисс объем элюата, ш.

■ выхода дрожжевого поверхностного антигена до 13+5%, в то время, как выхрд плазменного составлял 60+8Ж. При увеличении рН буфера до 8,8 выход рекомбинантного НВвА^ возрастал до 60+8%, а плазменного - до 81+9%. Разницу в хроматографическом поведении антигенов можно объяснить различным составом липидов или ковформациэй белковой цепи (Остерман Л.А., 1985).

Полученные результаты позволили сделать вывод о необходимости использования в гель-хроматографии рокомбинантного НВпА^ элшрущего буферного раствора с рН больше 9 (9,1-9,3 )- Как показали дальнейшие опыты, дрожиевой НВвАз практически не теряет своей активности в этих условиях.

Гель-хроматографию использовали, как заключительную стадию очистки, поскольку она позволяет быстрее и эффективнее, чем диализ, осуществить обессоливание препаратов, необходимое после ультрацентрифугзрования, и удаляет оставшиеся низкомолекулярные -примеси.

Таким образом, гель-хроматография на ШК оказалась эффективной процедурой очистки • рекомбинантного ГОвА^. В условиях полного сохранения антигенной активности гНВзА^ очищается от примесных белков н компонентов градиента с минимальными потерями.

3. Оптимизация процесса изошютностного__ХШШШШ1ЁШ£!£Ш~

роватя ^вкомбжаятадго__ЩзА£.

Для проведения, эффективной очистки рекомбинантного дрожжевого НВаА^ методом ультрацентрифугирования необходимо было выбрать составляющие для создания нужного соотношения плотностей. Использовали градиент, образуемый растворами 25Я глицерина (У/У) и 50% к-ыа тартрата (т/у).При использовании этих компонентов удалось создать нужный градиент плотностей при

относительно небольшой вязкости среда. Кроме : того, как обнаружено, глицерин оказывает на , рекомбинантный HBsAg стабилизирующее воздействие, что благоприятно сказывается на проведении ультрацентрифугирования.

Процесс центрифугирования довольно длительный, так как при подходе к положению равной плотности ( изопикначвскому положению ) движение частиц замедляется. Эмпирическим путем было установлено, что для получения хорошего разделения рекомбинантного HBsAg на роторе АН-627 ультрацентрифуги OTD 75В Sorvall Ultraoentrifuge (■ Dupont, США ) при скорости 22-24 тыс-об./мин. требовалось 22-24 часа.

При очистке дрожжевого HBeAg хорошие результаты получили, когда объем градиента в 2-2,6 раза превосходил объем разделяемого препарата, т.е. эффективного разделения удавалось добиться при высокой емкости загрузка препарата.

Из-за лабильности рекомбинантного антигена при нейтральных рН, для приготовления градиентных растворов использовали 0,05 М бикарбонатный буферный раствор рй 9,1,

После проведения ультргщентрифугирования полученный материал фракционировали я анализировали на содержание рекомбинантного HBeAg"в РИГА.

В результате уяьтрацэнтрифугаровачия удавалось избавиться от большого количества, как низкомолекулярных,, так и высокомолекулярных примесей. £то наглядно видно' при электрофореза (рис.3.). Таким образом, ультрацентркфугирование в градиенте плотности является эффектившм способом очистки рекомбинантного поверхностного антигена BIB.

4. Описание технологической схемы очистки rHBsAg.

В результате проведенной работы была разработана схема

Ряс. 3 Элекгрсфоратичэскяй контроль за препаратор

рекомбиналтного НВзА^ в процессе его очистка-. 1,2 - препарат до удьтрацентрифугирования 3,4 - препарат после ультрацентрифугирования я диализа

5 - плазменный ЯВзА^ (5 мкг/дорояку)

6 - маркерные белки (I мкг/дорожку)

выделения и очистки рекомбинантного НВвА& из штамма-продуцента дрожжей (рис.4). Для каадого метода найдены оптимальные условия. <-

Изучение технологической схемы очистки препаративных количеств рекомбинантного НВвА® показало, что препаративная адсорбционная и гель-хроматографии ' на пористых стеклах и ультрацентрифугирование в градиенте плотности являются достаточно технологичными, эффективными и производительными методами, о чем свидетельствуют представленные в таблице 4 результаты очистки 3-х партий препарата. Средний выход очищенного антигена составил более 40%.

Результаты концентрирования и очистки больших объемов дрожжевого экстракта на препаративных колонках свидетельствуют о сохранении общих закономерностей хроматограЗического процесса -■на препаративном оборудовании.

Серии вакцины, полученные из материала, очищенного по этой технологии, были проверены на шмувогенность на морских свинках по схеме, рекомендованной ВОЗ. Сыворотки исследовались методами * РИА и РПГА. Как видно из результатов, представланых в табл. 5', все три серии оказались иммуногенными. Они соответствовали требованиям, предъявляемым к вакцинам по всем исследованным биологическим показателям, что свидетельствует об их безопасности .и ©озмокносги применения для профилактики гепатита В у людей.

Таким образом* разработанная технологическая- схема моЁёт" быть использована для производства вакцины в коммерческих количествах., ,

5. Исследование физико-химических свойств гНВвД^.

В результате изучения физико-химических свойств

ФЕРМЕНТАЦИЯ

I

--ЙЕЗЩТИ'РАШ______

,_______________1_________________,

ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ 8

АДСОРБЦИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

I

УЛЪТРАЦЫ1ТРИФУГИРОВЛ1ШЕ 1

!__ _ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФ11Я__ _!

,________________I__________________

I СТЕРЙЛИЗУЩАЯ ФИЛЬТРАЦИЯ !

Г » |

I СОРБЦИЯ НА АДЬЮВАНТ \

I 4 |

I _.Р03|№_В_СТЕР1№ПШ..ШУЛЫ___!

Рис.4. Технологическая схема получения очщеного рекомбшшнтного дрожжевого

Таблица 4..

Результаты оштов по препаративной очистке трех экспериментальных серий рекомбинаятного НВэА§.

I I | I Израсходовано! Выход

1 N I Наименование | И I---|---—:----------

1п/п| |сер.1коли-1 в ед. |колк-| в ед. |в % к

•са,-

I I стадии I I чест. IАе акт. I част.!А^ акт. I исход-

II I |в мг 1в РПГА 1в мг ¡в РПГА 1..ному

I I I Адсорбционная! 12 I 6,4 I 2048001 5,0 I 1614001 78,8

I Iхроматография I 13 I 6,4 I 2048001 5,5 I 1760001 86,0

II I 14 | 6,8 I 2176001 6,4 I 2048001 94,0 II -II 1.1 I I

I 2 I Ультрацент- .1 Г2 I 5,0 I 1614001 2,7 I 871Б01 42,2

I Iрифугироааяиэ I 13 I 5,5 I 1760001 3,3 I 1056001 51,6

II I 14 I 6,4 ! 2048001 5,9 I 1888001 86,7 II I III К I ■

I 3 Г Гель- Г 12 I 2,7 I 871501 2,2 Г 710001 35,0

I Iхроматография I 13 I 3,3 I 1056001 2,7 I 864001 42,3

II I 14 I 5,9 I 1888001 5,0 1 1605001 73,5 II ,1.11 1.1 I

* Таблица 5.

Результата определения иммрслогической активности экспериментальных серий рекомбинангной вакцины против гепатита В для морских свинок.

1 Серия 1 вакцины 1 Наличие антител 1 в тесте лизав . 1 Средний титр 1 1 антител в рпга 1

1 N 12 1 N 13 1 Я 14 1 | + - + + 4- ' ! + + + + + ! 4- + + + ■+ 1 1 I: 16 400 1 1 I: 52 Г00 1 1 I: 25 600 1 1 !

-

рекойбгнаитного ЙВз% были выявлены некоторые его отличия от плазменного поверхностного антигена. Дрожжевой НВзАе менее устойчив, из-за чего требуется соблюдение определенных условий его хранения ( рН 9,1-9,3; -18° С ). Найдены условия, при которых стабилизируются антигенные и шмуногенные свойства рекомбинантного НВзА§ - это обработка мочевиной ( 1-4 М ), роданистыми солями (1-3 М ), глицерином ( 10-20% ).

Такой параметр, как плавучая плотность, у плазменного и рекомбинантного НВзАя совпадают, оба антигена имеют подобные УФ-спектры.

Для оценки чистоты рекомбинантных препаратов кроме электрофореза и иммуноблотпшга применили метод высокоэффективной явдкостной хроматографии, который наглядно демонстрирует степень очистки полученных препаратов.

Электронная и иммуноэлектронная микроскопии гак же свидетельствуют , о близости морфологической и иммуноспецифической характеристик частиц рекомбинантного и плазменного НБвА^.

С помощью электронной микроскопии обнаружено, что очищенный рекомбинантный ИВаАе представляет собой частицы со' средним диаметром 18-21 ям. По морфологическим характеристикам частицы эти подобны частицам поверхностного антигена ВГВ из плазмы крови, которые используются для производства плазменной вакцины против гепатита В (рис.5).

6 • Исследование иммуногенности препаратов,_содержащих

дрожевой^томбшантный_НВзАа.

Исследование иммуногенности препаратов, содержагах ■ дрожжевой рекомбинантный НВвАе, имее'т огромное значенго .при создании на его основе рекомбинантной ванцины против гепатита В.

Pac.5 Электронная микроскопия поверхностного антигена НТВ к- очвдешшй,рзкоабинантиый НВгАс^ Б- очищенный слазкенннй UBíAg , ,

¡йЕвстао, что протективкаЗ иггупатот сСусховлвн аптптэлакн к поверхностному антигену вируса гепатита В (гиоквгиад л. </., 1985), -поэтому основным гсрэтарнбм оценки ооЕфтивности 'препаратов являлось наличие аята-НБв антител в сыворотках крови посла вакцинации.

Была проведана ■ сравнительная сцэшса иммулогошюстп рэпомбиншшгаго а плаз'лэщюго. НЗе.% на морских свншсах без применения у с применение« адъюванта. Полученные результаты представлены в табл. 6. Опыты показали, . что одинаковые дозы плазменного л рэкомйшаатпого НВз-А/? ¡отзывают образование лрк;эрпо одинакового количества ппти-НЕз, то ость, что сам Р'зкомбпзантний Шала проявляет-нэ «анызую к.?лувогенность, чо.ч гмагцэивый антиген. Вакцшация морских свивок препаратами, содвраецпми в качестве адаозанта гпдросксвд алюлшля, показала • значительное повшенса уровня специфических антител угэ посла первой лздунизанип. Таким образом, была показана целесообразность добавления адъюванта для - увеличения знтпгвтюста п кимуногепностн рекомбинантного НВзАд. Зарубежные флртд! такте используют п • качество адъшанта гадрооксид алюминия. ' ' •

Были проведены опыты для определения зависимости уровня аитителогонеза от дозы вводимого препарата. Установлено, что пра увеличении дозы количество антител возрастает.

Для изучения динамики наработки антител в ответ на введение поверхностного антигена ВГВ проведены эксперименты на пестрых морских свинках и мылах Р1 (СБА х С57В1). Опыты на морских свинках показали, что устойчивый рост титров анти-НВа происходит в течение довольно длительного периода (5-6 кесягов) посла чего наступает их снижение. 100% сероконверсию наблюдали через две недели после введения рэксмбютантного и плазменного

Таблица 6.

Результаты сравнительного изучения иммуногенности рекомбинантного и плазменного НВбА^ и адьювантного эффекта гидрооксида алюминия на морских свинках.

Доза в 1 Обратный титр специфичн.

препарате анти-НВв в РИГА

1 Образец

1" препарата анти- адью- 1 после 1вакц.| после 2вакц.

ген вант I----- ---:---------

мкг мг I 7девь 14денъ!14день бОдень

1 Рек.НВаАз I - 1 10,6 1 ±2,9 ---1----:---—— 17,1 I 137,2 294,1 ±6,8 1 ±43,6 ±94,7

1 Шшз.ЩвА^ I — ' 1 9,8 1 ±2,8 12,1 1 84,4 194,0 +5,9 1+28,9 ±56,8

1 Рек.НВеАв I ' 0,25 1 £8,6 78,8 Т 477,7 2702,3

1 с адьга. 1+27,5 ±27,8 1+151,6 ±898,9

1 Плаз.НВвАз I .0,25 1 24,3 ' 59,7 Г 315,2 2195,0

1 с адъюв. 1±НД ±25,8 1±108,5 ±704,6

Морских свинок (пестрых) иммунизировали дважды, годкояно, с интервалом 14 дней. Груша для каждого препарата -, 10 животных. Забор крови проводили из сердца.

HBsAg. В случае введения рекомбинантного антигена с добавлением адыованта титры анти-НВв значительно повышались, хотя основные закономерности оставались прежними.

Исследование динамики антителогенеза на мышах выявило некоторое запаздывание появления антител у животных иммунизированных рвкомбинантным HBsAg по сравнению с животными вакцинированными плазменным антигеном. Анти-Ша у. первых появлялись лишь через четыре недели после введения препарата, тогда как у вторых - уже в конце первой недели.

7. Испытание вакцинных препаратов на добровольцах.

Проведены испытания экспериментальных серий вакцины на добровольцах (Хухловяч ША. и др., 1987). В опыте участвовали 32 человека, в крови которых не были обнаружены маркеры гепатита В. После трехкратного внутримышечного введения вакцины по общепринятой схема О, I и S месяцев была отмечена 92% свроконверсия (рис.6). Концентрация анти-HBs в сыворотках крови по данным ИФА составила от 351 до 754 МЕ/л (необходимая для защиты концентрация - не менее 10 МЕ/л). Полученные данные свидетельствуют о достаточной • иммуногенности испытанного' препарата и согласуются с опубликованными сообщениями других авторов о клинических испытаниях аналогичных вакцин (Howard P.A. et al., 1988; Kuwert S.E.N., 1987; Wiedemann G., 1987).

В опыте такая участвовали 8 человек, имевшие до вакцинации' в крови анти-HBa. После однократной иммунизации у 7 из них было установлено существенное увеличение уровня антител, то есть наблюдали ярко выраженный бустерный эффект.

Результаты проведенных экспериментов показыврит иммуногешость рекомбинантного HBsAg и сравнимость его свойств со свойствами плазменного. Слабая реакго!ашшсть, отсутствие

постваюЬшальных ослокнедай, безопасность применения позволяют, сделать вывод о возможности использования рекомбинантного дрожжевого НВвА® в качестве эффективной вакцины против гепатита Б.

Уровень серокон-версш, X

100 ••

50 ••

---,--

4 5 6 * 7 8 месяцы Т

III инъекции

0 1 -2 3

-г Т

1 II

Рис.6 Схема иммунизации и уровень сероконверсии при

испытаниях вакцинных препарктов на добровольцах.

I

- ¿D -

вывода.

1. Показана возможность получения вакцины на осноье rHBsAg в субъедшшчной форма из штаммов дрожаей Saooharomyoes ' oerevisiae ДАН 2 и DBY 746, содержащих плазмиду pHMVG ¿0-54.

2. Установлено, что оптимальным сорбентом для проведения адсорбционной хроматографии rHBsAg является немодифцироЕанннЛ макропористый кремнезем с диаметром пор около 200 нм и макс.'лшльной площадью поверхности,

3. Установлена возможность гель-хроматографической очистки. rHBsAg на МПК, модифицированном ПВГТ или Н-ВП.

4. Найдены составляющие градиента плотностей для проведения ультрацентрифугирования обеспечивающие эффективную очистку препарата с минимальной его инактивацией.

5. Впервые для отечественных штаммов-продуцентов дрожжей разработана- и экспериментально обоснована оригинальная технологическая схема выделения и очистки препаративных количеств rHBsAg.

6. Получены экспериментальное серии рекомбинантной дрожжевой вакцина против гепатита В,'показавшие высокую иммуногенность при испытаниях на добровольцах.

Список работ, опубликованных по теме диссерташм.

1. Курбатова И.Ю., Красильников И.В., Борисова В.Н., Зубов О Хроматография дрожжевого рекомбинантного HBsAg на порисп кремнеземах // Вопр. вирусологии,- 19Э0.- Т. 35,- й 4 С. 308-309.

2. Красильников И.В., Грановский H.H., Кокова И.Ю., Хотлуб< Л.И., Буданов М.В., Петров Р.В. Разработка эффективной м< лекулярной вакцины лротив гепатита В // Иммуно-биологиче< "кие препараты нового'поколения и метода их контроля: С( науч. тр.- М., 1988.- С. 66-70._

: 3. Красильников И.В., Грановский H.H., Жданов В.М., Петров Р Гнрдо Б.М., Коткова И.Ю. Способ получения рекомбинантной i цины к гепатиту В. Авторское свидетельство N 1389060 Ш'т А 61 К 39/29. !

4. Хйанов В.М., Иванов С.В., Грановский H.H., Зубов С.В, Красильников И.В., Коткова И.Ю., Успенский М.В., Энгеда гардт В,А. Сравнительная характеристика свойств ракомбшш тного и плазменного HBs-антигена // Межвузовский сборш Горьковского государственного университета: Иммунология биотехнология.- Горький, 1989.- С. 13-17. "

5. Krasilnikov I.v., Khotlubey L.I., Granovskiy N.N., Kotkc va I.Y., Khaitov R.M. Biochemical and irar.uno logical pre pertis of recombinant HBs-antigens from the yeast // 2-i Peking biochemical symposium.- Peking, 1989.- И 169.- P. £

УЧАСТОК: МНОЖИТЕЛЬНОЙ ТЕХНИКИ -ВОНИ АМН СССР

подгт. к печ ати 26.5.91 л - - зак.2. \:'тираж]у