Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.01) на тему:Создание трансгенных растений, синтезирующих поверхностный антиген вируса гепатита B

На правах рукописи

ШУЛЬГА НАТАЛЬЯ ЯРОСЛАВОВНА

СОЗДАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ, СИНТЕЗИРУЮЩИХ ПОВЕРХНОСТНЫЙ АНТИГЕН ВИРУСА ГЕПАТИТА В

15.00.01 - технология лекарств, организация фармацевтического дела

I

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

МОСКВА 2004

Работа выполнена в Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова и в Филиале Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Научный руководитель:

Доктор технических наук, академик РАМН, профессор Быков Валерий Алексеевич

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, профессор Краснюк Иван Иванович Доктор фармацевтических наук Громакова Алла Ивановна

Ведущая организация:

Всероссийский Научный Центр Молекулярной Диагностики и Лечения

Защита диссертации состоится "_"_2004 года в_часов на

заседании Диссертацсонного совета (Д.208.040.09) при Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова по адресу : 121019, Москва, Никитский б-р, д. 13

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ММА им. И.М. Сеченова. (117998, Москва, Нахимовский пр-т, д.49)

Автореферат разослан

2004 года

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.208.040.09, Доктор фармацевтических наук

Садчикова Наталья Петровна

оЬО е*У ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вакцинация является одним из наиболее эффективных лечебных и профилактических средств борьбы с инфекционными заболеваниями.

В настоящее время в мире ведется разработка нового поколения дешевых и безопасных вакцин, основанных на новых продуцентах, в том числе и трансгенных растениях

В начале девяностых годов были опубликованы результаты первых экспериментов по созданию трансгенных растений, продуцирующих белки-антигенные детерминанты патогенных бактерий или вирусов. Полученные в растениях очищенные иммуногены после инъекции животным стимулировали образование иммуноглобулинов против соответствующих патогенов. Трансгенные растения имеют перспективы стать эффективной альтернативой традиционным продуцентам вакцин. Во многих странах, включая Россию, вакцины используются не так широко, как это необходимо. Вакцинные препараты, получаемые традиционными способами, дороги и требуют особых способов хранения, большинство вакцин вводятся парентерально, а это не всегда удобно при массовых иммунизациях. Кроме того, при получении вакцин с использованием культур клеток животных существует вероятность загрязнения вакцинных препаратов вирусами животных (так, культура клеток почки макаки, используемая в 1960-х годах для производства вакцины против вируса полиомиелита, была заражена вирусом 8У40). Растения являются безопасными системами для получения терапевтических белков, поскольку не содержат вирусов, патогенных для млекопитающих. Следует отметить, что растительные клетки обладают энзиматическими системами постгрансляционных модификаций, необходимых для сборки синтезируемых мономерных белков в иммуногенные мультимерные формы. С этой точки зрения растения как потенциальные продуценты вакцин имеют преимущество перед бактериями, не имеющими систем эукариотической постсинтетической модификации белков.

Исходя из вышесказанного, растения могут быть перспективными объектами для разработки новых безопасных технологий производства вакцин, в том числе, против гепатита В.

Вирусный гепатит В - одна из широко распространенных инфекций человека, которая приводит к тяжелым последствиям, в том числе к хроническим поражениям печени, переходящим в цирроз и рак печени. В настоящее время в мире официально зарегистрировано около 400 миллионов человек. Эффективных средств лечения гепатита В пока не существует. До сих пор наилучшим способом защиты от данной болезни является вакцинация. В России работы по получению трансгенных растений-продуцентов вакцины против гепатита В проводятся совместно лабораторией биотехнологии растений Филиала Института биоорганической химии РАН (ФИБХ РАН) и НПК "Комбиотех".

Цель и задачи диссертационной работы - разработать научно-методические основы создания трансгенного картофеля, экспрессирующего поверхностный антиген вируса гепатита В, д тя|оур прпдргтп Яияуимичррупр и молекулярно-

БИЬ' ч.иекА С. Петербург

иебск _

генетическое исследование этих растений и трансгенных растений табака, полученных ранее в лаборатории биотехнологии растений ФИБХ РАН. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Разработать научно-методические основы трансгенеза высших растений на примере картофеля и табака, экспрессирующих поверхностный антиген вируса гепатита В.

2. Получить векторные конструкции, содержащие рекомбинантный ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) под контролем промотора тканеспецифического гена пататина клубней картофеля;

3. Получить трансгенный картофель, трансформированный агробактериальными векторными системами, содержащими ген HBsAg под контролем промотора 35Б РНК вируса мозаики цветной капусты и гена пататина клубней картофеля.

4. Провести и молекулярно-генетическое исследование трансгенных растений табака и картофеля, экспрессирующих поверхностный антиген вируса гепатита В под различными промоторами.

5. Провести биохимическое исследование растений и НВв-антигена, синтезированного трансгенными растениями.

Научная новизна и практическая ценность работы. Сконструирована векторная плазмида, содержащая синтетический ген поверхностного антигена вируса гепатита В под контролем тканеспецифического промотора гена пататина клубней картофеля. Эта конструкция и плазмида, содержащая ген HBsAg под двойным промотором 35Б РНК вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК) были использованы для получения трансгенных растений картофеля, синтезирующих НВв-антиген. Методом иммуноферментного анализа с применением антител против нативного НВз-антигена установлено присутствие HBsAg в экстрактах трансгенных растений картофеля. Установлено, что у трансгенных растений картофеля, экспрессирующих ген HBsAg под контролем двойного промотора 35Б РНК ВМЦК, содержание НВз-антигена в листьях и клубнях составляет 0,008%-0,035% от суммарного растворимого белка, а у растений с геном HBsAg под контролем промотора гена пататина НВв-антиген присутствует только в клубнях в количестве 0,005%-0,018% от суммарного растворимого белка. Методом иммуноферментного блот-анализа с применением поликлональных антител к мономеру НВз-антигена установлено, что молекулярная масса мономерной формы НВз-антигена из экстрактов трансгенных растений соответствовала молекулярной массе мономера НВз-антигена дрожжевой вакцины против гепатита В и равна 24 кД. Методом гельфильтрации определено, что трансгенные растения синтезируют НВв-антиген в форме высокомолекулярного мультимерного комплекса. Элюция НВз-антигена на колонке Бирегозе-б (НЯ10/30) происходит в зоне, практически свободной от присутствия других белков, что позволяет рассматривать препаративный вариант гельфильтрации на этом носителе как эффективную стадию очистки в технологии промышленного получения вакцины против гепатита В на основе трансгенных растений-продуцентов. Достигнутый уровень экспрессии гена HBsAg в трансгенных растениях позволяет перейти к доклиническим

испытаниям выделенных из них препаратов HBs-антигена. Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на конкурсе на лучшую научную работу студентов 2000 года по разделу "Медицинские науки" (Москва, 2000), V и VI чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2000, 2001), II конференции молодых ученых России "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" (Москва, 2001), XIV международной молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2002), III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Положения, выносимые на защиту:

конструирование векторной плазмиды, содержащей ген HBsAg под контролем промотора гена пататина клубней картофеля; получение трансгенного картофеля, экспрессирующего ген HBsAg-, результаты молекулярно-биологического анализа трансгенных растений; результаты биохимического анализа трансгенных растений и синтезируемых ими HBs-антигена;

разработка методических подходов к выделению и очистке HBs-антигена. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 11 таблиц. Список цитируемой литературы включает 172 наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В настоящей работе использовали бактериальные штаммы Escherichia coli TG2 (Sambrook et al., 1989) и Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pAL4404) (Hoekema et al., 1983), а также бинарную векторную плазмиду B33-Bin (Rocha-Sosa et al., 1989). В работе использовали синтетический ген поверхностного антигена вируса гепатита В серотипа mayw (Друца и др., 1997), который заново синтезировали при помощи ПЦР с целью получения на фланкирующих концах гена удобных последовательностей для его клонирования в вектор B33-Bin. Для культивирования клеток Е. coli и A. tumefaciens использовали питательные среды LB и YEB.

В работе использовали стерильно выращенные растения картофеля Solanum tuberosum cv. и Nicotiana tabacum cv. samsun. Растения выращивали на среде MS (Murashige and Skoog, 1962).

Клонирование ДНК в плазмидных векторах проводили по стандартным методам (Маниатис и др., 1984). Перенос плазмидых бинарных векторов в клетки A. tumefaciens осуществляли методом прямой трансформации (Ап et al., 1988). Анализ рекомбинантных плазмидных ДНК проводили методом гибридизации на фильтрах по Саузерну (Southern, 1975). Генетическую трансформацию эксплантов картофеля проводили, как описано (Draper et al., 1988). Для ПЦР-анализа трансгенных растений ДНК выделяли из листьев растений упрощенным методом (Edwards et al., 1991). Выделение суммарной

растительной РНК проводили как описано (Pawlowski et al., 1994). Электрофорез РНК проводили в 4-% ПААГ, содержащем 6 М мочевину (Stoeckle and Guan, 1993). РНК переносили из геля на нейлоновый фильтр Hybond N+ (Amersham, Англия) электроблоттингом с помощью прибора MiniTransblot® (Bio-Rad, США). Гибридизацию РНК с меченным [а-32Р]-АТР ДНК-зондом проводили, как описано (Nagy et al., 1988). Содержание антигена HBsAg в экстрактах трансгенных растений определяли при помощи иммуноферментной тест-системы "Рекоматгеп В" ("ЭКОлаб", г. Электрогорск, Моск. обл) или аналогичной высокочувствительной тест-системы (Abbot, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение трансгенных растений картофеля, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) под контролем промотора гена пататина

В качестве источника гена использовали рекомбинантную плазмиду pDES20, содержащую синтетический ген полипептида HBsAg/mayw, используемый в клетках дрожжей для получения рекомбинантной вакцины против гепатита В (Друцаидр., 1997).

Ген HBsAg был заново синтезирован на рекомбинантной плазмиде pDES20 при помощи ПЦР с целью получения на фланкирующих концах гена удобных последовательностей для клонирования в векторы для трансформации растений. Анализ нуклеотидной последовательности полученного гена показал, что она не отличалась от последовательности исходного гена. Для удобства встраивания гена HBsAg под промотор гена пататина клубней картофеля были использованы синтетические праймеры, содержащие на 5'-концах сайты рестрикции BamHl и BglII. Ген HBsAg (ПЦР-продукг) был встроен по уникальному сайту рестрикции BamHI в плазмиду для трансформации растений B33-Bin (Rocha-Sosa et al., 1989). Схема клонирования гена HBsAg под промотором гена пататина ВЗЗ в векторе B33-Bin показана на рисунке 1.

Полученными конструкциями трансформировали штамм E.coli TG-2. Отбор клонов E.coli, содержащих ген HBsAg, осуществляли гибридизацией колоний на нейлоновых мембранах.

Ориентацию вставки относительно промотора гена пататина ВЗЗ определяли с помощью двойного гидролиза плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции EcoRI и Ваш HI . Анализ длин фрагментов был проведен электрофорезом продуктов гидролиза плазмиды в 1% агарозном геле. Из проверенных восьми клонов 4 содержали плазмиду с прямой ориентацией гена HBsAg по отношению к промотору ВЗЗ.

Полученную плазмиду B33-HBsAg-Bin, содержащую ген HBsAg в прямой ориентации относительно промотора ВЗЗ, перенесли в штамм A. tumefaciens LBA4404(pAL4404) методом прямой трансформации. Клоны агробактерий,

содержащие плазмиды ВЗЗ-НВзА§-Вт, были отобраны на селективной среде с канамицином.

Таким образом, был получен предназначенный для трансформации растений картофеля штамм агробактерий, содержащий ген HBsAg в бинарном рекомбинантном векторе BЗЗ-HBsAg-Bin под контролем промотора гена пататина клубней картофеля.

ВатШ

-LB-ЬН^—№

Ггшивзз HSíAí jA«. лг,[[ р«<

Рис.1 Схема клонирования гена HBsAg в бинарный вектор ВЗЗ-Вт.

PpatatinB33 - промотор гена пататина pat-ВЗЗ; Pnos - промотор гена нопалинсинтазы; pAocs -сигналы полиаденилирования гена октопинсинтазы, HbsAg - ген поверхностного антигена вируса гепатита В; nptll - ген неомицинфосфотрансферазы II, LB, RB - левая и правая границы Т-ДНК.

2. Генетическая трансформация растений картофеля, регенерация трансформантов и их культивирование in vitro

Суспензию агробактериальных клеток, содержащих рекомбинантныё бинарные векторы с геном HBsAg под контролем двойного 35S промотора > РНК вируса мозаики цветной капусты (pSS-HBsAg) или промотора гена

пататина клубней картофеля (pB33-HBsAg), использовали для трансформации картофеля методом инокуляции листовых или стеблевых эксплантов. Трансформацию эксплантов проводили, как описано (Rocha-Sosa et al., 1989; Draper et al., 1988) с некоторыми модификациями. Экспланты получали в стерильных условиях из культивируемых in vitro растений картофеля, вырезая скальпелем из листовой пластинки или стебля сегменты размером 0,5-1 см. Экспланты помещали на чашки Петри с агаризованной средой MS, содержащей 2 мг/мл 2,4D и 0,8 мг/мл зеатинрибозида, и инкубировали двое суток при 24°С. Затем проводили ко культивирование листовых дисков с агробактериями. Для этого экспланты помещали в бактериальную суспензию (10* клеток/мл) в течение 1 минуты. После кокультивирования остатки жидкости с листовых дисков удаляли стерильной фильтровальной бумагой. Затем листовые диски размещали на чашках Петри с безгормональной агаризованной средой МС и инкубировали при 24°С в течение 2 суток. Через двое суток экспланты отмывали от агробактерий средой МС, содержащей 250

мг/л цефотаксима и 25 мг/л сульфата канамицина и перекладывали на чашки Петри с агаризованной селективной средой для регенерации побегов, содержащей 250 мг/л цефотаксима, 20 мг/л сульфата канамицина, 0.3 мг/л 6-БАП и 0.2 мг/л ГК и культивировали при 24°С. Использование цефотаксима необходимо для освобождения эксплантов от агробактерий. Примерно через две-три недели культивирования на этой среде на эксплантах наблюдали образование и увеличение каллусных центров и образование побегов. Культивирование на чашках Петри продолжали до тех пор, пока побеги не достигали в длину 1 см, затем их отделяли от эксплантов и пересаживали в пробирки на среду МС, содержащую 0,1 мг/л индолилмасляной кислоты и 0,1 мг/л феруловой кислоты, для укоренения и дальнейшего роста. Индукцию образования микроклубней проводили на среде МС с добавлением сахарозы до 8% (Romanov et al., 1998).

Растения, размножаемые черенкованием от полученных таким образом индивидуальных побегов представляли собой растения отдельных трансформированных линий. В результате трансформации и последующей селекции было отобрано 12 и 23 линии растений-регенерантов картофеля, соответственно трансформированные рекомбинантными векторами, содержащими ген HBsAg под контролем промоторов pSS и рВЗЗ. Такие полученные трансформанты в дальнейшем отбирали по ростовым физиологическим показателям и анализировали методами молекулярно-генетического и биохимического анализа.

3. Молекулярно-генетический анализ трансгенных растений картофеля

Среди регенерированных линий трансформированного картофеля, отобранных на среде с канамицином, для дальнейшего исследования были взяты по четыре линии, трансформированные геном HBsAg под двойным промотором 35S РНК ВМЦК и под пататиновым промоторм, отличающиеся наилучшими ростовыми физиологическими характеристиками.

Во всех исследованных линиях трансформированных растений картофеля методом ПЦР-анализа показан синтез ДНК, соответствующий по размерам детерминированной специфическими праймерами области гена nptll величиной 700 п.н. (рис. 2), и размерам 690 п.н. гена поверхностного антигена вируса гепатита В (рис. 3).

Рис 2 ПЦР-анализ ДНК картофеля с использованием праймера к гену npt II

1 - ДНК плазмиды pSS-HBsAg (контроль+) 2-5 - ДНК трансгенных линий картофеля 6 - ДНК картофеля, трансформированного плазмидой pSS (контроль-)

1 2 3 4 Б 6

Одной из задач исследования явилось четкое установление трансгенной природы полученных трансформированных растений табака, что требовало детектирования гена HBsAg в растительном

геноме независимым высокоспецифическим методом гибридизационного анализа ДНК.

Анализ ДНК трансформированных растений блот-гибридизацией по Саузерну подтвердил встраивание гена HBsAg в растительный геном (рис. 4). Сравнение интенсивности сигналов гибридизации ДНК трансформированных растений с

- 690 п.н.

1 2 3

интенсивностью

* 5 6

сигналов

Рис 3 ПЦР-анализ ДИК картофеля с использованием праймера к гену

1 - ДНК плазмиды рБЗ-НВзАв (контроль+)

2-5 -ДНК трансгенных линий картофеля 6- ДНК картофеля, трансформированного плазмидой рЭБ (контроль-)

одной и десяти копий гена HBsAg

свидетельствовало о наличии в геноме анализируемых растений 1-3 копий этого гена.

ЩщшШШш

Рис 4 Блот-гибридизация по Саузерну ДНК трансгенных растений Solarium tuberosum, гидролизованной эндонуклеазой рестрикции £coRI, использованным в качестве зонда меченным 32Р-геном HBsAg 1 - ДНК, содержащая ген HBsAg в количестве 20 копий, 2 - ДНК, содержащая ген HBsAg в количестве 10 копий; 3 - ДНК нетрансформированных растений Solarium tuberosum-, 4-7 - ДНК трансгенных растений, содержащих ген HBsAg под контролем двойного промотора CaMV35S, 8 -ДНК, содержащая ген HBsAg в количестве 1 копии Стрелкой обозначен фрагмент, соответствующий гену HBsAg.

Экспрессия гена HBsAg в трансгенных растениях была показана с помощью РНК-ДНК-гибридизации. Для этого выделяли тотальную РНК из листьев картофеля и гибридизовали ее с меченным 32Р геном HBsAg в качестве зонда. Транскрипция гена HBsAg и присутствие мРНК этого гена установлена во всех линиях исследованных трансгенных растениях картофеля (рис. 5). Таким образом, все отобранные линии трансформированных растений картофеля содержали экспрессируемый ген поверхностного антигена вируса гепатита В.

— 690 п.н.

2-5- РНК трансгенных растений

Рис 5 Лишни м-РНК НВзЛё в трансгеппых растениях картофеля с помощью РНК-ДНК гибридизации В качестве зонда использовали меченный 32Р-геи НВьА% 1 - РНК нетрансформированного растения,

1 2 3 4 5

4. Иммуноферментное определение количественного содержания поверхностного антигена вируса гепатита В в трансгенных растениях картофеля и табака, выращенных в лабораторных условиях in vitro

Результаты иммуноферментного анализа содержания поверхностного антигена в трансгенных растениях табака представлены на рисунке 6. Количество антигена в трансгенных растениях табака, содержащих ген HBsAg под двойным промотором ВМЦК 35SS (столбцы 7-12), составляло от 0,002% до 0.02% от общего количества растворимого белка листьев растений и в среднем составляло 500 нг/г растительной ткани, что было значительно выше продуктивности трансгенных растений, содержащих ген HBsAg под одинарным промотором ВМЦК 35S. Это количество соответствует описанной продуктивности трансгенных растений табака, экспрессирующих ген HBsAg под двойным промотором 35SS вируса мозаики цветной капусты (Kong et al.,

Таким образом, экспрессия гена HBsAg под двойным промотором ВМЦК 35SS позволила увеличить синтез поверхностного антигена HBsAg в трансгенных растениях табака по крайней мере в десять раз по сравнению с трансгенными растениями, содержащими ген HBsAg под одинарным промотором ВМЦК 35S (Золова и др., 1999). Полученные нами результаты находятся в соответствии с данными, представленными другими лабораториями (Mason et al., 1992; Ehsani et al., 1996; Kapusta et al.,1999).

Различный количественный уровень экспрессии гена HBsAg под двойным промотором ВМЦК 35SS наблюдаются также для различных тканей трансгенных растений картофеля (таблица 1). Количество антигена в листьях и микроклубнях трансгенных растений картофеля, содержащих ген HBsAg под контролем двойного промотора 35S вируса мозаики цветной капусты и выращенных в культуре in vitro, составляло 0,008 - 0,035 % от общего количества растворимого белка.

2001).

HBsAg, % от

растворимого

белка

Рис. 6. Определение количества HBsAg в листьях трансгенных растений табака. 1 - контроль - нетрансформированное растение;

2-6 - различные линии трансгенных растений, экспрессирующих ген HBsAg под контролем одинарного промотора 35S;

7-12 - различные линии трансгенных растений экспрессирующих ген HBsAg под контролем двойного промотора 35SS.

Таблица 1.

Количество HBs-антигена в листьях и микроклубнях трансгенных растений картофеля с геном HBsAg под двойным промотором 35S РНК ВМЦК, растущих в условиях in vitro'

Количество HBs-антигена, нг/г Отношение

Линия Сырого веса ткани HBs-антигена

картофеля к суммарному растворимому белку, %

Листья клубни листья клубни

2-1 1504.0 ±93.8 330.0 ±42.9 0.032 0.011

2-4 640.1 ±33.5 697.0 ± 65.4 0.008 0.023

2-5 747.3 ± 84.8 751.0 ±55.1 0.009 0.025

2-7 700.5 ±63.1 1036.0 ± 100.5 0.009 0.035

Интересно отметить, что микроклубни трансгенных растений картофеля содержат НВз-антиген на том же уровне, что и листья этих растений. Этот факт не является неожиданным, так как известно, что 35Б промотор вируса

мозаики цветной капусты является конститутивным и не проявляет заметной тканевой и органной специфичности.

Одинаковый уровень синтеза HBs-антигена в тканях картофеля и табака можно объяснить близким родственным положением этих растений, принадлежащих к одному семейству Solanaceae.

Таким образом, использование двойного промотора 35S позволяет значительно увеличивать экспрессию гена HBsAg в трансгенных растениях по сравнению с растениями, содержащими этот ген под контроем одинарного промотора 35S (Золова и др., 1999). В то же время, синтез HBs-антигена в растениях различных линий был неодинаков, что может быть связано как с количеством копий гена HBsAg, так и с особенностями хромосомных локусов, в которые встраивался ген HBsAg.

Следует отметить, что продолжение исследований трансгенных растений табака поколения F1, экспрессирующих ген HBsAg под двойным промотором 35S ВМЦК показало сохранение и даже увеличение их антигенной продуктивности (Рукавцова и др., 2003). Возможно, это связано с уменьшением в растениях поколения F1 количества копий гена HBsAg, приводящее к оптимизации уровня его экспрессии.

Данные анализа содержания HBs-антигена в трансгенных растениях картофеля, экспрессирующих ген HBsAg под пататиновым промотором, преставлены в таблице 2.

Таблица 2.

Количество ftBs-антигена в листьях и микроклубнях трансгенных растений картофеля с геном HBsAg под пататиновым промотором, растущих в условиях

in vitro'

Линия картофеля Количество HBs-антигена, нг/г сырого веса ткани Отношение HBs-антигена к суммарному растворимому белку, %

Листья клубни листья клубни

2-1-2 0 243.3 + 23.8 0 0.009

2-1-3 0 215.5 ± 18.5 0 0.006

3-1-6 0 180.7121.3 0 0.005

3-1-8 0 201.2 ±25.8 0 0.010

В соответствии со специфичностью генетической экспрессии под этим промотором, HBs-антиген был обнаружен исключительно в микроклубнях и отсутствовал в листьях трансгенных растений картофея. Количество антигена в микроклубнях различных линий трансгенного картофеля составляло от 0.004 до 0.008% от общего содержания растворимого белка клубней растений и в среднем соствляло более 200 нг/г клубня. Это количество соответствует сообщениям о продуктивности HBs-антигена трансгенных растений картофеля, экспрессирующих ген HBsAg под клубнеспецифическим пататиновым промотором (Rocha-Sosa).

5. Количественное содержание HBs-антигена в трансгенных растениях табака и картофеля, растущих в условиях закрытого грунта

Следует отметить, что полученные и исследованные в данной работе трансгенные растения табака и картофеля не представляют биологической опасности для окружающей среды. Это связано с тем, что в таких трансгенных растениях не используются целевые гены устойчивости к гербицидам и гены устойчивости к фитопатогенным микроорганизмам, вирусам, насекомым, нематодам и другим беспозвоночным-вредителям. Таким образом, снимается риск неконтролируемой передачи этих генов через опыление диких форм родственных растений и образования на их основе "супер-сорняков", а также отсутствует опасность гибели полезных насекомых-опылителей растений. В связи с защитой окружающей среды, использование трансгенных растений табака и картофеля может иметь дополнительные преимущества. Трансгенные растения табака, продуценты поверхностного антигена HBs вируса гепатита В, можно выращивать в зоне Подмосковья в простых пленочных теплицах или через рассаду в открытом грунте, начиная со второй декады июня. Сбор зеленой массы - в течение августа. Уборка таких трансгенных растений перед фазой их цветения вообще снимает проблему передачи другим растениям любых элементов чужеродной искусственной генетической конструкции, включая ген HBsAg вируса гепатита В. Следует отметить, что в большинстве районов Нечерноземья России у табака и картофеля отсутствуют дикие родственные виды растений для переопыления, а картофель размножают вегетативно через клубни.

Экономическая выгода может существенно повыситься за счет упрощения технологии переработки растительного сырья в случае использования трансгенного картофеля, специфически накапливающего в своих клубнях поверхностный антиген HBs вируса гепатита В.

Нами была произведена оценка продукции HBs-антигена трансгенными растениями табака и картофеля в условиях его культивирования в закрытом фунте.

Рассада линии трансгенных растений табака с наиболее высоким уровнем синтеза HBs-антигена была в середине июня 2001 года высажена в закрытый грунт оранжереи станции искусственного климата "Биотрон" Филиала Института биоорганической химии РАН г. Пущино.

В конце августа растения достигали высоты 1,7-1,9 м и имели 15-17 ярусов листьев. Исследования показали, что содержание поверхностного антигена вируса гепатита В в листьях разных ярусов для каждого растения существенно не различалось и было сходно с количеством HBs-антигена в листьях этих же линий трансгенных растений, растущих in vitro.

Таким образом, проведенные эксперимены показали принципиальную возможность культивирования трансгенных растений табака в закрытом грунте в условиях средней полосы России без заметного снижения накопления HBs-антигена в своих листьях.

Аналогичное отсутствие падения продуктивности HBs-антигена можно было

ожидать также и для трансгенных растений культивируемого в закрытом грунте картофеля. Исследование различных линий трансгенного картофеля, содержащего ген HBsAg под двойным промотором 35S ВМЦК и клубнеспецифическим пататиновым промотором В-33 были проведены в 2003 году. Рассаду трансгенного картофеля, полученного из проросших микроклубней, высаживали в закрытый грунт оранжереи станции искусственного климата "Биотрон" в начале июня и проводили сбор материала в конце августа. Следует отметить, что опытные растения картофеля не отличались по своим ростовым параметрам от контрольных образцов и зацветали в начале июля с образованием плодов. Данные количественного анализа содержания HBs-антигена в трансгенных растениях картофеля с геном HBsAg под двойным промотором 35S ВМЦК представлены в таблице 3. По накоплению HBs-антигена в листьях и клубнях исследованные растения существенно не отличались от соответствующих линий растений, растущих в условиях in vitro.

Таблица 3.

Количество НВв-антигена в листьях и микроклубнях трансгенных растений картофеля с геном HBsAg под двойным промотором 358 РНК ВМЦК, растущих в условиях закрытого грунта*

Линия Количество HBs-антигена, Отношение HBs-антигена

Картофел я нг/г сырого веса ткани к суммарному растворимому белку,%

Листья клубни листья клубни

2-1 668.7 ±64.8 301.6 ±42.9 0.010 0.009

2-4 1516.1 ±87.5 371.0 ±38.4 0.031 0.012

2-5 423.3 ±43.8 665.0 ±67.1 0.008 0.022

2-7 382.5 ±33.1 776.0 ± 69.5 0.006 0.025

Таблица 4.

Количество НВв-антигена в листьях и микроклубнях трансгенных растений картофеля с геном HBsAg под пататиновым промотором, растущих в условиях

закрытого фунта*

Линия Количество HBs-антигена, Отношение HBs-антигена

картофеля нг/г сырого веса ткани К суммарному растворимому белку, %

Листья клубни Листья клубни

2-1-2 0 341.3 ±33.8 0 0.011

2-1-3 0 455.5 ± 58.5 0 0.018

3-1-6 0 325.7 ±31.3 0 0.010

3-1-8 0 439.2 ±45.8 0 0.014

Аналогичные свойства показали также траисгсниыс растения картофеля, экспрессирующие ген HBsAg под пататнновым промотором (таблица 4). Для этих растений можно даже отмстить тенденцию повышенного содержания HBs-антигена в клубнях по сравнению с его содержанием в микроклубнях культивируемых in vitro растений.

Проведенные эксперименты показывают также реальную возможность культивирования трансгенных растений табака и картофеля в открытом грунте в условиях средней полосы России с целью продукции ими поверхостного антигена вируса гепатита В.

6. Выделение и очистка HBs-антигена из экстрактов трансгснных растений табака и картофеля и иммуноферментный блот-анализ HBs-антигена

Получение очищенного концентрированного препарата HBs-антигена было достигнуто с помощью его иммуносорбции.

Экстракт из трансгенных растений готовили следующим образом. Листья растений табака и картофеля растирали в жидком азоте до получения пудры, затем смешивали с холодным буфером для экстракции (1:2) и растирали до однородного состояния. Полученный гомогенат центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин в микроцентрифуге Eppendorf при комнатной температуре. Осветленный экстракт осаждали реакцией иммунопреципитации на сорбенте белокА-Сефароза. В пробирки Eppendorf добавляли 50 мкл суспензии белокА-Сефароза, 1 мл осветленного экстракта и 2 мкл мыщиных моноклональных антител к нативному HBs-антигену (получены в АОЗТ "Комбиотех" ЛТД, Москва). Реакцию иммунопреципитации проводили при легком перемешивании на качалке при 4°С в течение ночи. Иммунопреципитированные фракции центрифугировали 2 мин при 12000 об/мин в микроцентрифуге Eppendorf. Супернатант удаляли и осадок HBs-антиген-белокА-Сефарозы промывали пять раз буфером для отмывки, каждый раз осаждая его центрифугированием в тех же условиях. Затем к осадку HBs-антиген-белокА-Сефарозы добавляли 40 мкл буфера для образцов (62,5 шМ Трис-HCl, pH 6,8; 10% глицерин; 2 % ДСН; 2% DTT; 0,05% БФС). Образцы кипятили 5 мин и супернатант анализировали электрофорезом в 15%-ном ПААГ с ДСН по Лэммли (Laemmli, 1970).

Из геля белки переносили при комнатной температуре на поливинилидин-дифторидную мембрану Immobilon™ PVDF (Millipore, США) электроблоттингом с помощью прибора MiniTrans-blot® (Bio-Rad, США) в буфере, содержащем 0,025 М Трис-HCi, 0,193 М глицин и 20% этанола, в течение 2 ч при 100 В. Обработку мембраны с последующим иммунным выявлением HBs-антигена осуществляли, как описано (Михайлов, Симирский, 1991). Все операции проводили при комнатной температуре при легком перемешивании на качалке, кроме инкубации мембраны с первичными антителами, проведенной при 4°С. Поливинилидин-дифторидную мембрану после переноса инкубировали 45 мин в буфере TBS-T (0,01 М Трис-HCl, pH 7,5; 9% NaCl; 0,1% Твин-20 (Sigma)), содержащем 5% сухого обезжиренного

молока. Затем мембрану обрабатывали кроличьими поликлональными антителами к мономеру HBsAg (получены в АОЗТ "Комбиотех" ЛТД, Москва), (разведение 1:5000) в буфере TBS-T, в течение 1,5 ч. Раствор антител удаляли и мембрану отмывали по 10 мин в пяти сменах буфера TBS-T. Обработку раствором конъюгата (вторичных антител) проводили в течение 60 мин в буфере TBS-T, содержащем 5% сухого обезжиренного молока. В качестве конъюгата использовали козлинные антитела против кроличьих иммуноглобулинов, меченые пероксидазой хрена GAR - HRP (Pierce, США), (разведение 1:10000). Раствор конъюгата удаляли и мембрану отмывали по 10 мин в пяти сменах буфера TBS-T. Для визуализации связывания антител с HBS-антигеном использовали улучшенный хемилюминесцентный субстрат ECL (Pierce, США) для детекции пероксидазы хрена. Детекцию проводили согласно инструкции к коммерческому набору ECL. Картина иммуноблотинга HBs-антигена из трансгенных растений картофеля и табака, экспрессирующих ген HBsAg под контролем двойного 35S промотора вируса мозаики цветной капусты представлены на рисунках 7-8.

Рис 7 Вестерн-блот анализ поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) растений табака с геном HBsAg под двойным промотором гена 35S РНК ВМЦК, осажденного из белковых экстрактов с помощью реакции иммунопреципитации на сорбенте белокА-Сефароза CL-4B

1 - белковый экстракт из листьев ^трансформированного табака, 2 - экстракт из листьев трансгенного табака, 3 - экстракт из рекомбинантных дрожжей-продуцентов HBsAg, 4 - огрицательный конгроль (белокА-Сефароза CL-4B); 5 - положительный контроль (антиген без иммунопреципитации)

тЯШШШЙ^т^ ' —белокА

Щ ЩтЩШт ♦ 48 кДа

Ж

ЩШКЯ^ШШ Ш — 24 кДа

''Чрр

12 345 6 78

Рис 8 Вестерн-блот анализ поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) растений картофеля под пататиновым промотором, осажденного из белковых экстрактов с помощью реакции иммунопреципитации на сорбенте белокА-сефароза CL-4B 1,2- белковый экстракт из листьев нетрансформированного картофеля; 3,4- экстракт из листьев трансгенного картофеля, 5, 6 - экстракт из рекомбинантных дрожжей-продуцентов HBsAg, 7 -отрицательный контроль (белокА-сефароза CL-4B), 8 - положительный контроль (антиген без иммунопреципитации)

В этом анализе помимо мономерных форм HBs-антигена выявляются также его димерные формы, что может быть связано с неполной деградацией мультимерного комплекса HBs-антигена в условиях наших эксперименов. Применение поликлональных антител к мономерному HBs-антигену и

г А

Ц Щ Щ0 Ж — белок А WW • 48 кДа

|Щ ф 24 кДа 1 2 3 4 5

повышенная чувствительность метода за счет хемилюминесцентного субстрата ECL позволяет детектировать при иммуноферментном анализе неспецифические маркерные белки молекулярных масс. В этом анализе молекулярная масса мономерной формы HBs-антигена из экстрактов трансгенных растений соответствовала молекулярной массе мономера HBs-антигена, продуцируемого дрожжевыми клетками, и определена равной 24 кД. Таким образом, результаты этого иммуноферментного анализа вместе с данными прямого иммуноферментного анализа бесклеточных экстрактов трансгенных растений позволяли предположить, что синтезируемый в растениях табака и картофеля HBs-антиген способен агрегировать в олйгомеры, которые обладают существенно большей иммуногенной и антигенной активностью, чем отдельные HBs-полипептиды. На это указывала и стабильность продуктов гена HBsAg в трансгенных растениях: в растительных экстрактах эти продукты сохраняют антигенную активность до семи дней при 4°С без ее заметного падения. Эти предположения были проверены в экспериментах по аналитической гельфильтрации продукта экспрессии гена HBsAg и его иммуноферментному анализу.

7. Гельфильтрация продукта экспресии гена HBsAg в трансгенных

растениях

Для экспериментов по аналитической гельфильтрации продукта экспрессии гена HBsAg в трансгенных растениях использовали фракцию гомогената из листьев табака и листьев и микроклубней трансгенных растений картофеля, очищенную от пигментов и низкомолекулярных белковых веществ. Для этого 3 мл стандартно полученного бесклеточного экстракта наносили на колонку 1,5x20 см с Сефадексом G-25 (Pharmacia, Швеция), уравновешенную 0,05 М буфером фосфата натрия (рН 7,5), содержащим 0,15 М NaCl, и проводили элюцию этим же буфером. Фракцию "проскока", сконцентрированную в три раза в вакуумном лиофилизаторе, использовали для высокоэффективной гельфильтрации. Для этого 100 мкл полученной фракции наносили на HPLC-колонку Superose-6 (HR10/30) (Pharmacia Biotech, Швеция), уравновешенную 0,05 М буфером фосфата натрия (рН 7,5), содержащим 0,15 М NaCl, и проводили элюцию этим же буфером 60 минут со скоростью 0,4 мл/мин. Регистрацию элюированного материала вели по оптическому поглощению при 280 нм. Фракции собирали по 0,8 мл элюата в пробирки и проводили определение количественного содержания в них HBs-антигена методом иммуноферменного анализа. В качестве стандартов молекулярного веса на этой же колонке в тех же условиях предварительно была проведена гельфильтрация декстрана голубого (Dextran blue D 2000, Pharmacia, Швеция) - молекулярная масса 2000 кД; тироглобулина - молекулярная масса 669 кД и ферритина - молекулярная масса 443 кД. HBs-антиген обнаружен в зоне элюции высокомолекулярных соединений с молекулярной массой около 2000 кД (рис. 9).

Учитывая молекулярную массу мономерной формы HBs-антигена равной 24

кД (без гликозилирования), можно сделать вывод, что в клетках трансгенных растений продукт экспрессии гена HBsAg образует мультимерные формы и что в агрегации HBs-мономеров в мультимерные формы участвует не менее 70-80 мономеров. Наши данные по аналитической гельфильтрации синтезированного трансгенными клетками табака и картофеля HBs-антигена соответствуют седиментационной и электронно-микроскопической характеристике HBs-антигена, выделенного другими авторами из трансгенных клеток табака (Mason et al., 1992). Наблюдаемая в наших экспериментах по гельфильтрации HBs-антигена несколько асимметричная форма его элюции может быть следствием некоторой протеолитической деградации его

ГЕЛЬФИЛЬТРАЦИЯ НВэ-АНТИГЕНА

^280

Фракции

Рис 9 Высокоэффективная гельфильтрация HBs-антигена на колонке Superose-6 (HR10/30)

Элюция 0,05 М буфером фосфата натрия (рН 7,5), содержащим 0,15 М NaCl, 60 минут со скоростью 0,4 мл/мин

Черная линия - оптическая плотность, серая линия - детекция HBs-антигена D2000 -декстран голубой (мол вес 2000000), TG - тироглобулин (мол вес 669000),F - ферритин (мол вес 443000)

вирусоподобных частиц или присутствием в клетках трансгенных растений продуктов его незавершенной сборки. Это предположение не противоречит данным физико-химического анализа HBs-антигена, полученного из трансгенных растений табака, где наблюдали широкий разброс агрегированных частиц HBs-антигена по их величине (Mason et al., 1992). Таким образом, в клетках трансгенных растений, как и в клетках гепатоцитов человека и в клетках рекомбинантных штаммов дрожжей, идет сборка мономерных форм HBs-антигена в крупные молекулярные агрегаты, обладающие значительно повышенной иммуногенной и антигенной активностью по сравнению с исходной мономерной формой Элюция HBs-антигена на колонке Superose-6 (HR10/30) происходит в зоне,

практически свободной от присутствия других белков, что позволяет рассматривать препаративный вариант гельфильтрации на этом носителе как эффективную стадию очистки в технологии промышленного получения вакцины против гепатита В на основе трансгенных растений-продуцентов.

ВЫВОДЫ

1. Создана генетическая конструкция для агробактериальной трансформации растений, содержащая ген HBsAg под контролем промотора гена пататина клубней картофеля.

2. Проведена генетическая трансформация растений картофеля агробактериальной рекомбинантной векторной системой, содержащей ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) под контролем промотора кпубнеспецифического гена пататина и промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. Отобраны регенерированные трансформанты картофеля для их молекулярно- генетического и биохимического анализа.

3. Методами блот-гибридизации ДНК и ПЦР установлена трансгенная природа полученных трансформантов картофеля. В трансгенных растениях установлена экспрессия гена HBsAg.

4. С помощью иммуноферментных методов ELISA и блот-анализа установлен синтез HBs-антигена в листьях табака и в листьях и клубнях трансгенных растений картофеля, экспрессирующих ген HBsAg под промотором 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. Содержание HBs-антигена в тканях этих растений находится на уровне 0,008-0,035% от общего растворимого белка.

5. HBs-антиген в трансгенных растений картофеля, экспрессирующих ген HBsAg под пататиновым промотором, обнаружен только в клубнях, где его содержание находится на уровне 0.005-0.018% от общего растворимого белка.

6. Установлено, что трансгенные растения картофеля синтезируют HBs-антиген в форме высокомолекулярного мультимерного комплекса.

7. Показана принципиальная возможность культивирования трансгенных растений табака и картофеля в условиях средней полосы России без заметного снижения накопления HBs-антигена в их тканях.

8. Полученные результаты и апробированные методы могут быть использованы для создания технологических регламентов получения вакцин на основе трансгенных растений.

ПУБЛИКАЦИИ

1. Золова О.Э., Рукавцова Е.Б., Бурьянова Н.Я., Борисова В.Н., Мельников В.А., Бурьянов Я.И. Получение трансгенных растений, синтезирующих поверхностный антиген НВзА§ вируса гепатита В // Тезисы докладов V чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова "Биоорганика - 2000". Москва - Пущино, 2000. С.94.

2. Бурьянова Н.Я. Биохимический анализ трансгенных растений Мсойапа шЬасит, синтезирующих поверхностный антиген вируса гепатита В // Работы лауреатов конкурса конференции молодых ученых России "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины". Москва, 2001, С.26.

То же // Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины : Материалы II конференции молодых ученых России с международным участием. Москва, 2001. Т1. С.69.

3. Рукавцова Е.Б., Шульга Н.Я., Борисова В.Н., Быков В.А., Бурьянов Я.И. Получение и биохимический анализ трансгенных растений картофеля с геном поверхностного антигена вируса гепатита В // Тезисы докладов VI чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова. Москва -Пущино, 2002. С.84.

4. Шульга Н.Я., Рукавцова Е.Б., Борисова В.Н., Бурьянов Я.И., Быков В.А. Конструирование и анализ трансгенных растений картофеля, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В // Тезисы научных докладов III съезда биохимического общества. Санкт-Петербург, 2002.

5. Бурьянова Н.Я., Рукавцова Е.Б., Быков В.А. Получение трансгенных растений Solatium tuberosum L., экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В // Тезисы докладов IX Российского национального конгресса "Человек и лекарство". Москва, 2002. С.560.

6. Бурьянова Н.Я., Рукавцова Е.Б., Быков В.А. Конструирование и анализ трансгеннх растений картофеля, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В // XIV зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии":Тезисы докладов и стендовых сообщений. Москва, 2002. С.118.

7. Рукавцова Е.Б., Золова О.Э., Бурьянова Н.Я., Борисова В.Н., Быков В.А., Бурьянов Я.И. Анализ трансгенных растений табака, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В // Генетика. 2003. Т.39. № 1.

С.57-58.

С.51-56.

«

*

л

А

I'

Гарнитура Times. Формат 60V90/16. Бумага офсетная 80 г. Печать офсетная. Уч .-изд. л 1,0 Усл.печ.л 1,5. Тираж 100 экз. Отпечатано с готового Оригинал-макета в ООО "Знаменка"

РНБ Русский фонд

2006-4 20654

i

«

О 5 АПР 2004