Автореферат и диссертация по медицине (14.02.02) на тему:Эпидемиологическое и клиническое значение генетической гетерогенности вирусов гепатита А и В

На правах рукописи

ЧУЛАНОВ Владимир Петрович

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ И КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ГЕТЕРОГЕННОСТИ ВИРУСОВ ГЕПАТИТА А И В

14.02.02 - эпидемиология 14.01.09 - инфекционные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

14 ноя ¿шз

Москва-2013

005538137

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

доктор медицинских наук, академик РАМН, профессор

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора по научной работе ФБУН «Научно-исследовательский институт дезинфектологии» Роспотребнадзора

доктор медицинских наук, профессор, руководитель отдела эпидемиологии ГУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РФ

доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры инфекционных болезней с курсом эпидемиологии ГБОУ ВПО «Российский университет Дружбы народов» Минобразования РФ

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава РФ

Защита состоится 06 декабря 2013 г. в 10 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д.208.114.01 в ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора по адресу: 111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, Д. За

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, д. За)

Автореферат разослан 29 октября 2013 г.

Покровский Валентин Иванович

Акимкин

Василий Геннадиевич

Семененко

Татьяна Анатольевна

Токмалаев Анатолий Карпович

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Горелов

Александр Васильевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Вирусные гепатиты (ВГ) до настоящего времени остаются весьма актуальной роблемой здравоохранения как в России, так и в мире. Несмотря на то что в течение оследних 10 лет в России наблюдается неуклонное снижение заболеваемости гепатитом (ГА), ее показатель в 2012 г. оставался достаточно высоким - 5,5 на 100 ООО населения, ледует отметить, что, по данным Роспотребнадзора, заболеваемость ГА в субъектах РФ меет выраженные различия, и в ряде территорий превышает среднероссийский оказатель (Астраханская область - 22,5, Республика Дагестан - 50,6, Республика Тыва -6,8 на 100 000 населения). Особенностью ГА является его способность вызывать ассовые заболевания населения с большим количеством пострадавших. За последние 5 ет в России было зарегистрировано более 300 вспышек ГА, в том числе в относительно лагополучных регионах, таких как г. Москва и Московская область (вспышка в 2010 г. с оличеством пострадавших более 800 человек). Гепатит В (ГВ) сохраняет свою высокую ктуальность в связи со значительной частотой развития хронических форм болезни, аболеваемость хроническим вирусным гепатитом В (ХГВ) в РФ в 2012 г. составила 12,6, впервые выявленные носители вируса гепатита В (ВГВ) регистрировались с частотой 1,1 на 100 000 населения. В целом, заболеваемость хроническими формами инфекции, ызванной ВГВ, в 2012 г. в 23,7 раза превышала заболеваемость острым вирусным епатитом В (1,42 на 100 000 населения). Особое внимание к себе привлекает ХГВ в связи высокой частотой развития таких неблагоприятных исходов, как цирроз печении и епатоцеллюлярная карцинома [Perz J.F. et al., 2006; Хазанов А.И. с соавт., 2007; Kew М.С., 010; Кучерявый Ю.А. с соавт., 2012; Слепцова С.С. с соавт., 2012]. Согласно данным ОЗ, ВГВ является причиной 60-80% случаев гепатоцеллюлярной карциномы в мире, от оторой ежегодно погибает более 320 000 человек [WHO, Fact sheet No. 204, 2012].

Успехи молекулярной биологии привели к появлению новых данных о иологических особенностях возбудителей ГА и ГВ. В течение последних 20 лет был ыделен целый ряд генетических вариантов (генотипов и субтипов) данных вирусов. Так, ыло описано 6 генотипов вируса ГА (ВГА) и 10 - ВГВ, каждый из которых одразделяется на целый ряд субтипов и имеет характерные особенности географического аспространения [Okamoto H. et al., 1988; Norder H. et al., 1993, 2004; Olinger .M. et al., 008; Tatematsu K. et al. 2009]. Для некоторых возбудителей инфекций, например, вируса риппа, изучение циркуляции генетических вариантов и использование этой информации ри осуществлении эпидемиологического надзора уже вошло в рутинную практику. О аспространенности генетических вариантов вирусов ГА и ГВ в России имеются лишь трывочные сведения в отдельных публикациях [Flotgren Е. et al., 2000; Мукомолов C.JI. с оавт., 2001; Tallo T. et al., 2004]. Клиническое значение генотипов некоторых вирусов, апример, вируса гепатита С, уже достаточно хорошо изучено. Известно, что течение и ффективность лечения хронического гепатита С зависит от генотипа и даже от субтипа ируса. О клиническом значении генотипов ВГА и ВГВ сведений в литературе мало и они асто носят противоречивый характер [Chu С-J. et al., 2002; Fung S. et al., 2004; Hussain Z. t al., 2005; Lin C-L. et al., 2011; Yoon Y.K. et al., 2011; Yun H., 2011]. Систематических сследований, касающихся генетической гетерогенности данных вирусов на территории Ф, значения их генетических вариантов для целей эпидемиологического надзора и инической практики, не проводилось.

Цель работы: разработать научные основы молекулярно-генетического компонента истемы эпидемиологического надзора за ГА и ГВ; оценить клиническое значение енетической гетерогенности ВГА и ВГВ.

Задачи исследования

1. Провести анализ проявлений эпидемического процесса ГА и ГВ в РФ за период 2001 по 2011 гг. и современного состояния системы эпидемиологического надзор за данными инфекциями;

2. Определить распространенность генотипов и субтипов ВГА, циркулирующего н территории РФ и ряда стран СНГ с различной интенсивностью эпидемическог процесса;

3. Определить распространенность генотипов и субгенотипов ВГВ, циркулирующег на территории РФ и ряда стран СНГ с различной интенсивностью эпидемическог процесса;

4. Установить связь между филогенетическими характеристиками ВГА и ВГ относящихся к различным генотипам, с особенностями их географическо распространенности;

5. Разработать подходы к анализу эпидемиологической связи случаев заболевания Г и ГВ на основе изучения генетической гетерогенности вирусной популяции;

6. Усовершенствовать систему эпидемиологического надзора за ГА и ГВ на основ внедрения системы молекулярно-генетического мониторинга за возбудителям1 данных инфекций;

7. Оценить взаимосвязь между генетическими характеристиками ВГА и ВГВ клинико-лабораторными особенностями течения ГА и ХГВ.

Научная новизна

Проведен анализ проявлений эпидемического процесса ГА и ГВ на территории РФ свидетельствующий о выраженном снижении его интенсивности, изменении возрастно структуры заболевших с увеличением доли взрослого населения, выраженно территориальной неравномерности показателя заболеваемости ГА, значительно преобладании хронических форм инфекции в структуре заболеваемости ГВ.

Впервые дана характеристика территориальной распространенности генотипов субтипов ВГА во всех федеральных округах (ФО) РФ и ряде стран СНГ. Установлен циркуляция двух субтипов, 1А и ША, и их неравномерное распространение на территори страны. Показано доминирование субтипа 1А в большинстве субъектов РФ. Установлено что распространенность генотипов ВГА в Украине сходна с таковой в европейской час РФ, тогда как в странах Средней Азии (Таджикистан, Кыргызстан) наблюдаете характерные ее особенности. Изучена генетическая гетерогенность каждого из субтипо вируса и выделены географические кластеры ВГА в пределах субтипов 1А и ША характерные для территории РФ и некоторых стран СНГ.

Впервые предложены оптимальные маркерные области генома ВГА дл использования при расследовании вспышек ГА. Доказано, что ВГА субтипа ША являете причиной возникновения многих очагов групповых заболеваний в РФ. Впервые выявлень особенности генетического разнообразия ВГВ на территории всех ФО РФ и ряда стра СНГ. Определены эндемичные для РФ генотипы и субгенотипы вируса, их географическ. распространенность. Доказано отсутствие филогеографических кластеров в предел, генотипов А и В, позволяющих различать штаммы ВГВ из различных регионов РФ Выявлен новый, ранее не описанный, рекомбинантный вариант ВГВ.

Разработаны научные основы использования молекулярно-генетических методов филогенетической реконструкции эволюционных взаимоотношений между изолятам вируса в качестве дополнительных объективных инструментов в эпидемиологическо диагностике при обследовании эпидемических очагов ГА и ГВ.

Впервые изучены особенности клинико-лабораторных характеристик ГА, вызванного вирусами субтипов IA и IIIA, и ХГВ, вызванного вирусами генотипов А и D, в РФ.

Практическая значимость

Разработанные положения позволят создать систему молекулярно-генетического мониторинга за ГА и ГВ в РФ.

Для оптимизации информационной подсистемы эпидемиологического надзора предложено внедрить молекулярно-генетический мониторинг с целью слежения за циркулирующими генетическими вариантами ВГА и ВГВ и динамикой изменения генетических характеристик вирусной популяции.

Для повышения качества эпидемиологической диагностики в рамках диагностической подсистемы эпидемиологического надзора рекомендовано использовать данные молекулярно-генетического мониторинга, а также проводить анализ маркерных последовательностей генома вирусов при работе в очагах вирусных гепатитов для установления источника возбудителя инфекции, путей и факторов передачи, а также временных и пространственных границ очагов.

Разработана методика и алгоритм анализа эпидемиологической связи случаев ГА и ГВ на основе филогенетической реконструкции эволюционных взаимоотношений между изолятами вируса. Рекомендованы оптимальные маркерные области генома ВГА для использования с целью идентификации штаммов.

Выявлены клинико-лабораторные особенности ГА и ХГВ, вызванных различными генотипами вирусов, позволяющие рекомендовать их определение при обследовании больных с целью уточнения прогноза течения заболевания.

Апробация результатов исследования

Результаты диссертационной работы представлены на 13 международных и 17 российских съездах, конгрессах, конференциях, симпозиумах и семинарах: Российская научно-практическая конференция «Генодиагностика инфекционных болезней» (Новосибирск, 2005), Всероссийская научная конференция «Эпидемиология, лабораторная диагностика и профилактика вирусных инфекций» (Санкт-Петербург, 2005), научно-практическая конференция «Проблемы клиники, диагностики и лечения гепатитов» (Украина, Харьков, 2005), научно-практическая конференция «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск, 2005), X Республиканская научно-практическая конференция «Актуальные вопросы гепатологии: новое в диагностике и терапии» (Махачкала, 2005), VII Российский съезд врачей-инфекционистов «Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней» (Нижний Новгород, 2006), Российская научно-практическая конференция «Эпидемиология, диагностика и профилактика вирусных гепатитов. Современное состояние» (Санкт-Петербург, 2006), 13lh,14th International Congress on Circumpolar Health (Russia, Novosibirsk, 2006; Cañada, Yellowknife, 2009), международная научно-практическая конференция «Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков» (Казахстан, Алматы, 2006), IX съезд Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения РФ» (Москва, 2007), заседание научно-практического общества врачей-инфекционистов г. Москвы (Москва, 2007), международная научно-практическая конференция «Молекулярная диагностика инфекционных болезней» (Республика Беларусь, Минск, 2007), VII Российская научно-практическая конференция с международным участием «Вирусные гепатиты - эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика» (Москва, 2007), научно-практический семинар «Современные достижения в диагностике и лечении инфекционных болезней» (Азербайджан, Баку, 2007),

VI Всероссийская научно-практическая конференция «Молекулярная диагностика-2007» (Москва, 2007), Circumpolar Viral Hepatitis Working Group Meeting (Denmark, Copenhagen, 2007, 2008, 2010, 2011; USA, Anchorage, 2012), XXIV Российская гастроэнтерологическая неделя (Москва, 2008), Российская научно-практическая конференция «Гепатит В - новое в этиологии, диагностике, профилактике и лечении» (Москва, 2008), VIII Российская научно-практическая конференция с международным участием «Вирусные гепатиты -эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика» (Москва, 2009), I-V Ежегодный Всероссийский конгресс по инфекционным болезням (Москва, 2009-2013), научно-практическая конференция «Молекулярная диагностика инфекционных болезней» (Москва, 2010), The 8th Japanese Society of Hepatology Single Topic Conference "HBV Now in Asia" (Japan, Tokyo, 2009), научно-практическая конференция «Молекулярная диагностика 2010» (Москва, 2010), The 20th Conference of the APASL (China, Beijing, 2010).

Диссертация апробирована на заседании апробационной комиссии ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора 16 мая 2013 года.

Внедрение результатов работы

Результаты внедрены в практическую работу Референс-центра по мониторингу за вирусными гепатитами Роспотребнадзора, Научно-консультативного клинико-диагностического центра ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, вошли в лекционные материалы курсов повышения квалификации «ПЦР-диагностика инфекционных болезней» ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, а также были использованы при создании информационно-методических документов: методические указания МУ 3.1.2837-11 «Эпидемиологический надзор и профилактика вирусного гепатита А», методические указания МУ 3.1.2792-10 «Эпидемиологический надзор за гепатитом В».

Публикации

Основные научные результаты по теме диссертации опубликованы в 57 научных работах, из них 14 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад автора

Все представленные в диссертационной работе научные результаты получены автором как лично, так и под его руководством коллективами лаборатории вирусных гепатитов и Научно-консультативного клинико-диагностического центра ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. Автору принадлежит идея работы, им определены цели, задачи и методология, разработана часть лабораторных методик и проведены исследования. Автор лично принимал участие в расследовании наиболее крупных вспышек ГА, описанных в работе. Самостоятельно проведено обобщение эпидемиологических данных и клинических наблюдений, статистическая обработка материалов, анализ и интерпретация полученных результатов.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 380 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 7 глав собственных исследований и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 95 рисунками и 32 таблицами, список литературы включает 415 источников, в том числе 361 - зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Исследование выполнялось с 1999 по 2012 гг. на базе Федерального бюджетного учреждения науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора.

Анализ проявлений эпидемического процесса ГА и ГВ в РФ за период с 2001 по 2011 гг. проводился по данным форм федерального и отраслевого статистического наблюдения № 2 "Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях", Ks 5 "Сведения о профилактических прививках", № 6 "Сведения о контингентах детей и взрослых, привитых против инфекционных заболеваний", № 23-09 "Сведения о вспышках инфекционных заболеваний

Современное состояние системы эпидемиологического надзора за ГА и ГВ в РФ оценивалось на основании изучения положений действующих нормативно-правовых и информационно-методических документов по эпидемиологическому надзору и профилактике данных инфекций.

С целью изучения распространенности генотипов и субтипов ВГА в РФ было исследовано 2422 образца сыворотки крови от больных ГА и контактных лиц, в 1637 из которых была выявлена РНК ВГА. Проведено субтипирование 527 изолятов ВГА, выделенных от пациентов из различных регионов РФ (таблица 1). Для оценки структуры генотипов ВГА в отдельных странах СНГ было исследовано 899 образцов сыворотки крови от больных ГА и больных острым вирусным гепатитом неуточненной этиологии из Кыргызстана - 138 образцов, из Таджикистана - 511 образцов, из Украины - 250 образцов. В 544 (22, 354 и 168 - Кыргызстан, Таджикистан и Украина, соответственно) из них выявлена РНК ВГА, и данные образцы были субтипированы.

Таблица 1

Географическое распределение изолятов ВГА, отобранных для изучения распространенности генотипов и субтипов вируса в РФ

Федеральный округ Субъекты РФ Количество изолятов ВГА

Дальнево сточный Приморский край, Хабаровский край, Сахалинская обл., Республика Саха (Якутия) 123

Сибирский Республика Тыва, Республика Бурятия, Кемеровская, Омская обл., Красноярский край 95

Уральский Ханты-Мансийский АО, Свердловская, Тюменская, Челябинская обл. 17

Приволжский Республика Марий Эл, Республика Башкортостан, Нижегородская обл. 25

Южный и СевероКавказский Волгоградская, Ростовская обл., Чеченская Республика, Республика Дагестан 58

Северо-Западный Архангельская, Новгородская, Калининградская, Мурманская обл. 27

Центральный г. Москва, Московская, Рязанская, Липецкая, Воронежская, Тверская обл. 182

Итого 30 527

Для проведения филогенетического анализа штаммов ВГА и изучения особенностей их географической кластеризации, было секвенировано 375 изолятов ВГА из РФ и 260 изолятов из Украины, Таджикистана и Кыргызстана.

Для изучения молекулярно-генетических особенностей вспышек ГА были проанализированы материалы расследования 20 вспышек, имевших место на территории 7 ФО РФ (охватывающих 15 субъектов РФ) с 2005 по 2010 гг. Исследовано 783 образца сыворотки крови больных ГА, 1279 образцов сыворотки крови контактных лиц, 13 образцов фекалий больных и контактных лиц, 369 образцов концентратов водных проб и 82 образца пищевых продуктов, собранных в рамках расследования вышеуказанных вспышек.

Образцы сыворотки крови больных ГА и контактных лиц исследовались на наличие антител к ВГА (ап1!-НАУ и/или апй-НАУ ^М) с использованием ИФА-тест-систем «Вектор-Бест» (Россия). Все пациенты с апП-НАУ ^М и контактные лица без маркеров ВГА обследовались на наличие РНК ВГА в сыворотке крови.

Образцы проб воды из объема 20 л концентрировались на фильтровальном модуле МПНроге с мембранами с усиленным положительным зарядом (до 40 мв/см2). Образцы концентратов водных проб и смывов с продуктов питания исследовались на наличие РНК ВГА, энтеровирусов, ротавирусов, астровирусов и норовирусов.

Выделение вирусной РНК проводили из 100 мкл сыворотки крови и 1000 мкл образцов концентратов водных проб и смывов с продуктов питания с помощью автоматической станции «МисПЗЕ^ еазуМАО» («ВюМёпеих», Франция) или комплекта реагентов «МАГНО-сорб» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Выявление РНК вирусов осуществлялось с помощью комплектов реагентов «АмплиСенс» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Определение наиболее распространенных субтипов ВГА (1А, 1В, ША и ШВ) проводилось с помощью методики собственной разработки на основе сайт-специфичной мультиплексной ПЦР. Для последующего филогенетического анализа проводилось секвенирование двух вариабельных фрагментов генома ВГА УР1/2А длиной 410 нт и 2С длиной 648 нт.

С целью оценки особенностей течения ГА, вызванного различными генотипами вируса, были проведены клинические наблюдения и проанализированы истории болезни 195 больных, госпитализированных в специализированные стационары инфекционного профиля, среди которых у 124 (63,6%) бьи выявлен ВГА генотипа 1А и у 71 (36,4%) - ВГА генотипа ША. Всем больным в динамике наблюдения от 2 до 9 раз проводились общеклинические лабораторные исследования (клинический анализ крови и мочи, биохимический анализ крови). По клиническим показаниям проводилось ультразвуковое исследование органов брюшной полости.

Для оценки распространенности генотипов и субгенотипов ВГВ в РФ было исследовано 3609 образцов сыворотки крови больных острым гепатитом В (ОГВ), ХГВ и носителей ВГВ, содержащих ДНК ВГВ, из различных регионов РФ (таблица 2).

С целью определения распространенности генотипов ВГВ на территории ряда сопредельных государств было исследовано 719 образцов плазмы крови от больных острой и хроническими формами инфекции, вызванными ВГВ, из следующих стран СНГ: Республика Армения - 75 образцов, Кыргызстан - 27 образцов, Таджикистан - 80 образцов, Украина - 537 образцов. С целью проведения филогенетического анализа штаммов ВГВ, был секвенирован 291 изолят ВГВ из 26 субъектов РФ и 24 изолята из стран СНГ. Для анализа использовался фрагмент генома длиной 887 нт, покрывающий область Б-гена ВГВ (позиция в геноме ВГВ 83-969 по референс-последовательности АР280817).

С целью углубленного изучения молекулярно-эпидемиологических особенностей циркулирующих генотипов и субгенотипов ВГВ на территории Чукотского АО было дополнительно исследовано 769 образцов плазмы крови, из которых 306 принадлежало больным ХГВ и 463 - условно здоровым лицам, ранее не обследовавшимся на наличие маркеров вирусных гепатитов.

Таблица 2

Географическое распределение изолятов ВГВ, включенных в исследование по изучению распространенности генотипов вируса в РФ

Федеральный округ Субъекты РФ Количество изолятов ВГВ

Дальневосточный Приморский край, Хабаровский край, Сахалинская обл., Республика Саха (Якутия), Чукотский АО 451

Сибирский Республика Тыва, Республика Бурятия, Иркутская, Омская обл. 366

Уральский Ханты-Мансийский АО, Свердловская, Ямало-Ненецкий АО, Челябинская обл. 96

Приволжский Республика Марий Эл, Республика Татарстан, Ульяновская обл. 235

Южный Астраханская, Волгоградская, Ростовская обл., Краснодарский край, Республика Калмыкия 43

СевероКавказский Республика Дагестан, Ингушетия, Северная Осетия-Алания, Карачаево-Черкесия, Кабардино-Балкарская, Чеченская Республики, Ставропольский край 360

Северо-Западный Архангельская, Новгородская, г. Санкт-Петербург 91

Центральный г. Москва, Московская, Рязанская, Липецкая, Воронежская, Смоленская, Брянская обл. 1967

Итого 36 3609

Для разработки молекулярно-генетических подходов к анализу эпидемиологической связи случаев ГВ был исследован 41 случай ХГВ из 18 семейных очагов (13 очагов по 2 случая и 5 очагов по 3 случая). Контрольную группу составили 47 больных ХГВ, проживающих в тех же населенных пунктах, заболевание которых не имело эпидемиологической связи с семейными очагами.

Выделение ДНК из плазмы крови и выявление ДНК ВГВ проводили с использованием комплектов реагентов «АмплиСенс» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Генотипирование ВГВ осуществлялось с помощью методик собственной разработки на основе рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента S-гена длиной 470 нт с использованием эндонуклеаз Bst4CI и Sse9I и ПЦР в реальном времени, а также прямого секвенирования. Для рекомбинантного штамма ВГВ было выполнено секвенирование полного генома вируса по Gunter S. et al. (1995). Для части изолятов ВГВ перед секвенированием было проведено клонирование фрагмента С-гена в вектор pGEM-T (Promega).

Секвенирование изолятов ВГА и ВГВ проводилось на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems). Филогенетический анализ проводили с использованием программ MEGA 5.0 и Geneious 6.0 методами минимальной эволюции (ME), максимального правдоподобия (ML) и Монте-Карло Марковских цепей (МСМС), достоверность кластеризации определяли методом bootstrap (1000 повторов). Положение точки рекомбинации определялось с помощью программы SimPlot, bootscan анализом.

С целью изучения клинико-лабораторных особенностей хронических форм инфекции, вызванных различными генотипами ВГВ, были проведены клинические наблюдения и проанализированы амбулаторные карты 231 больного, наблюдавшихся с диагнозами «Хронический гепатит В» или «Неактивное носительство ВГВ», среди которых у 98 (42,4%) был выявлен ВГВ генотипа А и у 133 (57,6%) - ВГВ генотипа D. В исследование не включались больные, у которых имела место коинфекция другими

гепатотропными вирусами и ВИЧ, а также те, у которых основным этиологическим фактором поражения печени было злоупотребление алкоголем. Использовались общепринятые методы клинико-лабораторного обследования, включая биохимический анализ крови в динамике заболевания. Концентрация ДНК ВГВ в плазме крови определялась методом ПЦР в реальном времени с помощью наборов реагентов «АмлиСенс» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Оценка стадии фиброза печени по шкале МЕТА VIR была проведена методом ультразвуковой эластометрии на аппарате «Фиброскан» (Эхосенс, Франция) в 203 наблюдениях.

Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакета программ SPSS 19.0. Достоверность различий оценивалась с помощью U-критерия Манна-Уитни или критерия Краскела-Уоллиса для независимых выборок. Для количественных признаков, имеющих распределение, близкое к нормальному, данные представлены в виде среднего (М) ± стандартное отклонение (s). Для признаков, имеющих ненормальное распределение, данные представлены в виде медианы (интерквартильного интервала). Статистическая значимость различий качественных признаков в сравниваемых группах оценивалась при помощи критерия и точного критерия Фишера. Уровень значимости был принят как р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

1. Современные особенности эпидемического процесса вирусных гепатитов А и В и система эпидемиологического надзора за данными инфекциями в РФ

В период с 2001 по 2011 гг. наблюдались значительные изменения в проявлениях эпидемического процесса ГА и ГВ, которые наиболее ярко выразились в снижении показателей заболеваемости острыми формами инфекций. С 2001 по 2011 гг. заболеваемость ГА в стране в целом снизилась в 18 раз (с 79,4 до 4,3 на 100 тыс. населения), причем тенденция к снижению наблюдалась как среди детей, так и среди взрослого населения (рис. 1). В возрастной структуре заболевших в 2011 г. наибольшая доля случаев ГА (22,5%) приходилась на лиц 20-29 лет, которая почти в 2 раза превышала число случаев заболевания в классической индикаторной группе по кишечным инфекциям (дети 3-6 лет). Однако показатель заболеваемости ГА в том же году у лиц 20-29 лет (6,0 на 100 тыс. населения) был в 2 раза ниже аналогичного показателя среди детей 3-6 лет (12,6 на 100 тыс. населения), что обусловлено различиями в численности сравниваемых возрастных групп.

а заболеваемость ГА ^(—заболеваемость ОГВ —чь— заболеваемость ХГВ —носительство ВГВ

Рисунок 1. Многолетняя динамика заболеваемости ГА и ГВ (2001-2011 гг.).

Характерная для ГА неравномерность территориального распределения уровней заболеваемости наблюдалась как между территориями ФО, так и между территориями

субъектов РФ, входящих в состав каждого округа. С 2006 г. наиболее неблагополучным по ГА ФО является Северо-Кавказский, а самым благополучным - Дальневосточный ФО.

Эпидемиологическое благополучие по ГА различных субъектов РФ в значительной степени определяется количеством вспышек данной инфекции на территории и числом пострадавших в них лиц. В период с 2005 по 2011 гг. в стране зарегистрировано 494 вспышки ГА с общим числом заболевших 11 458 человек.

Эффективным профилактическим мероприятием при ГА является вакцинация, регламентированная календарем профилактических прививок по эпидемическим показаниям, а также включенная в региональные календари профилактических прививок некоторых субъектов РФ. Всего по данным формы №5 федерального статистического наблюдения в стране с 2005 по 2011 гг. против ГА вакцинировано более 2,5 млн человек.

Благодаря реализации в РФ национального календаря профилактических прививок и вакцинации населения в рамках приоритетного национального проекта в сфере здравоохранения с 2006 г. по 2011 гг. против ГВ было привито более 57 млн детей, подростков и взрослых. Массовая иммунизация населения позволила в 5 раз снизить заболеваемость ОГВ (с 8,6 в 2005 г. до 1,71 на 100 тыс. населения в 2011 г.) и к началу 2012 г. достигнуть самого низкого за все годы наблюдения уровня заболеваемости (рис. 1).

Показатели заболеваемости ОГВ в возрастных группах детей до 1 года, 1-2 лет, 3-6 лет впервые к началу 2012 г. составили менее 1 на 100 тыс. каждой возрастной группы, а показатель заболеваемости ОГВ детей до 14 лет снизился в 16,5 раз: с 1,98 в 2005 г. до 0,12 на 100 тыс. детей до 14 лет в 2011 г.

Увеличение иммунной прослойки способствовало более чем двукратному (в 2,3 раза) снижению в стране уровня носительства ВГВ (с 50,5 в 2005 г. до 21,9 на 100 тыс. в 2011 г.), в том числе у детей до года - в 5,4 раза (с 42,5 в 2005 г. до 7,9 на 100 тыс. в 2011г.) (рис. 1). В то же время, выраженное эпидемиологическое неблагополучие по вирусным гепатитам, в том числе по ГВ, которое имело место в стране в предыдущие 15 лет, стало причиной ежегодной регистрации относительно высоких показателей заболеваемости хроническими формами ГВ среди населения страны - на уровне около 13-14 на 100 тыс. При этом заболеваемость хроническими формами ГВ детей до 14 лет снизилась в 2,9 раза (с 2,3 в 2005 г. до 0,78 на 100 тыс. в 2011 г.).

Существенные изменения произошли в возрастной структуре заболеваемости ОГВ. Если до начала массовой иммунизации эпидемиологическое неблагополучие по ГВ определялось двумя возрастными группами - 15-19 лет (показатель 141,9 на 100 тыс.) и 2029 лет (102,5 на 100 тыс.), то в последние годы на фоне общего снижения заболеваемости доля заболевших ОГВ подростков 15-19 лет значительно уменьшилась, а доля лиц 20-29 лет и 30-39 лет возросла.

Анализ действующих нормативно-правовых и информационно-методических документов позволил установить, что функциональная структура системы эпидемиологического надзора за инфекционными болезнями включает подсистему сбора, учета и хранения информации, подсистему обмена информацией, подсистему обработки и анализа информации, подсистему эпидемиологического диагноза, подсистему эпидемиологического прогноза и подсистему управляющих решений.

Действующая в РФ информационная подсистема эпидемиологического надзора за ГА и ГВ включает четыре общих информационных блока: статистический (анализ заболеваемости, смертности и других показателей); слежение за состоянием привитости населения (число вакцинированных против ГА и ГВ и охват контингентов детей и взрослых законченной вакцинацией против ГВ); слежение за санитарно-техническим состоянием и санитарно-гигиеническим содержанием эпидемиологически значимых объектов; выборочное исследование уровня коллективного иммунитета в отдельных возрастных группах населения (серомониторинг).

Информационная подсистема эпидемиологического надзора за ГА также включает в себя сведения о результатах мониторинга за объектами окружающей среды с применением санитарно-бактериологических, санитарно-вирусологических исследований (определение колифагов, энтеровирусов, антигена ВГА) и молекулярно-генетических методов (включая определение РНК ВГА, энтеровирусов). Кроме того, существуют содержательные различия между перечисленными информационными блоками, обусловленные эпидемиологическими особенностями данных болезней. Так, в системе надзора за ГА ведущее эпидемиологическое значение имеют объекты системы водообеспечения населения, объекты пищевой промышленности и детские образовательные организации, а целью выборочных исследований коллективного иммунитета к ВГА является определение оптимального возраста для проведения вакцинопрофилакгики. В системе надзора за ГВ наиболее значимыми объектами надзора являются медицинские организации и организации коммунально-бытового назначения, оказывающие парикмахерские и косметические услуги, а выборочные исследования коллективного иммунитета проводятся с целью оценки уровня фактической защищенности от инфекций отдельных лиц, коллективов и населения в целом и оценки качества прививочной работы на конкретной территории и в конкретной организации здравоохранения. Указаний на необходимость определения генетических характеристик возбудителей ГА и ГВ в документах, регламентирующих эпидемиологический надзор за данными инфекциями, нет.

Таким образом, анализ особенностей эпидемического процесса ГА за последние десять лет показал, что на фоне значительного снижения заболеваемости в стране в целом наблюдается выраженная неравномерность территориального распределения ее уровней, изменение возрастной структуры заболевших, а также сохраняется высокий уровень вспышечной заболеваемости. Для ГВ характерно еще более значительное снижение заболеваемости ОГВ, особенно среди детей, которое сегодня позволяет поднимать вопрос о ликвидации данной нозологической формы на отдельных территориях. Однако заболеваемость хроническими формами ГВ продолжает оставаться высокой. Анализ систем эпидемиологического надзора за вирусными ГА и ГВ в РФ показал, что сведения о молекулярно-генетической характеристике циркулирующих штаммов ВГА и ВГВ не входят в их информационную базу. Важность использования информации о генетических характеристиках возбудителя в эпидемиологическом надзоре неоднократно подтверждалась в исследованиях [Robetson В., 2000; Costa-Matiolli М., 2001; Nainan О., 2006; Mukomolov S., 2012]. Особое значение это имеет для инфекций, управляемых средствами иммунопрофилактики, к которым относятся ГА и ГВ [Otto W., 2010; Mankertz А., 2011]. Отсутствие данных сведений не позволяет проводить полноценную эпидемиологическую диагностику по ГА и ГВ, затрудняет разработку эпидемиологического прогноза и рекомендаций по оптимизации системы профилактических и противоэпидемических мероприятий.

2. Распространенность генотипов и субтипов ВГА на территории РФ и ряда стран СНГ

2.1. Распространенность генотипов и субтипов ВГА в РФ

По данным субтипирования, большинство из 527 исследованных изолятов ВГА (384, 73%) относились к субтипу IA, 27 % изолятов (136 из 527) были представлены субтипом IIIA, единичные изоляты (7 из 527) - субтипом IB. Распространенность генотипов ВГА в ФО РФ представлена на рис. 2.

Во всех ФО доминирующим субтипом ВГА был субтип IA, доля которого составляла от 62% (Дальневосточный ФО) до 94% (Уральский ФО). В отдельных субъектах РФ, таких как Сахалинская обл., Республика Тыва, Республика Бурятия, Тюменская обл., Чеченская Республика, Республика Дагестан, Новгородская обл., доля данного субтипа достигала 100% (таблица 3).

Таблица 3

Распространенность субтипов ВГА в федеральных округах ___и отдельных субъектах РФ_

Федеральный округ Субъект РФ Количество и доля изолятов ВГА различных субтипов*

1А 1А,% 1В 1В,% ША ША,%

Дальневосточный Приморский край 2 1

Хабаровский край 43 90% 5 10%

Республика Саха (Якутия) 25 38% 40 62%

Сахалинская область 6

Всего по округу 76 62% 47 38%

Сибирский Республика Тыва 15 100%

Кемеровская область 3

Омская область 50 72% 19 28%

Республика Бурятия 7

Красноярский край 1

Всего по округу 73 77% 22 23%

Уральский Ханты-Мансийский АО 2

Свердловская область 2 1

Тюменская область 10 100%

Челябинская область 2

Всего по округу 16 94% 1 6%

Приволжский Республика Марий Эл 5 2 1

Нижегородская область 12 92% 1 8%

Республика Башкортостан 1 3

Всего по округу 18 72% 2 8% 5 20%

Южный Волгоградская область 11 79% 3 21%

Ростовская область 1 1 1

Чеченская Республика 27 100%

Республика Дагестан 14 100%

Всего по округу 53 91% 1 2% 4 7%

Северо-Западный Архангельская область 3

Новгородская область 19 100%

Калининградская область 4

Мурманская область 1

Всего по округу 23 85% 4 15%

Центральный Москва и Московская обл. 86 65% 4 3% 43 32%

Рязанская область 2

Липецкая область 3 6

Воронежская область 24 83% 5 17%

Тверская область 9

Всего по округу 124 68% 4 2% 54 30%

ВСЕГО 383 73% 7 1% 137 26%

* доля изолятов каждого из субтипов рассчитана только для субъектов РФ, число изолятов из которых равно десяти и более.

■ ША

Рисунок 2. Распространенность субтипов ВГА в федеральных округах РФ.

В ряде регионов значительную долю среди выявленных изолятов ВГА составлял субтип ША. Так, более четверти всех случаев ГА было вызвано данным субтипом вируса в Центральном ФО (30%) и Дальневосточном ФО (38%). Среди субъектов РФ, количество изученных изолятов ВГА из которых превышает 10, наибольшая доля субтипа IIIA выявлялась в Республике Саха (62%), г. Москве и Московской обл. (32%), Омской обл. (28%), Волгоградской обл. (21%), Воронежской обл. (17%). Единственным субъектом РФ, в котором субтип IIIA оказался доминирующим, была Республика Саха (Якутия). Случаи ГА, вызванные субтипом IB, были выявлены в Центральном ФО (г. Москва, 4 случая), Приволжском ФО (Республика Марий Эл, 2 случая) и в Южном ФО (Ростовская обл., 1 случай). В пяти из семи вышеописанных случаев больные указывали на факт выезда за пределы РФ (Египет, Турция) в период, предшествовавший заболеванию.

2.2. Распространенность генотипов и субтипов ВГА на территории Украины, Таджикистана и Кыргызстана

В Таджикистане и Кыргызстане доминирующим был субтип ША ВГА, который составил соответственно 82% и 68% всех изолятов вируса, однако статистически достоверной разницы в распределении субтипов ВГА между этими странами Средней Азии не наблюдалось (критерий Манна-Уитни, р=0.12). В Украине, напротив, доминирующим субтипом ВГА был субтип IA, доля которого составляла 86%. Распределение субтипов в Украине достоверно отличалось от такового в Таджикистане и Кыргызстане (критерий Манна-Уитни, р<0.0001) и было близко к распределению, наблюдающемуся в регионах европейской части России. При этом субтип ША ВГА встречался только среди образцов, полученных из Восточной Украины (п=91) с частотой 26%. Все изоляты ВГА из Западной Украины (п=78) принадлежали субтипу IA ВГА (различия достоверны при р<0.0001, критерий Манна-Уитни).

3. Закономерности географической кластеризации штаммов ВГА, циркулирующих на территории РФ и ряда стран СНГ

3.1. Оптимизация методического подхода к идентификации штаммов ВГА

С целью выбора оптимальной области генома ВГА для проведения филогенетического анализа и идентификации штаммов было изучено 69 полногеномных последовательностей ВГА и более 500 последовательностей, покрывающих отдельные фрагменты генома вируса, из базы данных ОепВапк (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Анализ последовательностей показал, что одним из вариабельных и наиболее часто используемых в мире регионов генома ВГА для генотипирования вируса является область УР1/2А (положение на полногеномной референс-последовательности ВГА М14707 - 2950-3430). Учитывая, что ВГА является одним из наименее вариабельных РНК-содержащих вирусов, для повышения надежности молекулярно-эпидемиологических исследований была 1 выбрана вторая маркерная последовательность генома ВГА. Для выбора оптимальной области генома была рассчитана энтропия генома вируса. Анализ показал, что для ВГА область генома 2С (положение 3750-4500) обладает наибольшей энтропией и является оптимальной для использования в качестве маркерной последовательности с целью идентификации штаммов и молекулярно-эпидемиологических исследований (рис.3).

0 SM 1000 1500 2000 2500 ЭООО 3500 4000 4500 5000 5500 60Ю 6500 7000 7500 Позиция генома ЕГА

Рисунок 3. Вариабельность генома ВГА. А - Схема генома ВГА с указанием областей VP1/2A и 2С. Б - Энтропия генома ВГА. Прямоугольниками выделены области генома ВГА, выбранные в качестве маркерных последовательностей.

Использование двух маркерных последовательностей позволило в ряде случаев идентифицировать штаммы, которые совпадали по одной из маркерных последовательностей. Так, при расследовании вспышек ГА в Тверской области (2005 г.) и г. Северодвинске (2006 г.) выявленные изоляты ГА были идентичны по области VP1/2A и могли быть квалифицированы как один штамм (U2-VP1). Однако определение нуклеотидной последовательности области 2С (вторая маркерная последовательность) позволило идентифицировать 2 штамма, один из которых циркулировал во время вспышки в Тверской области (U2-VP1U3-2C), другой - в г. Северодвинске (U2-VP1U4-2C). В противном случае, было бы сделано ошибочной заключение о том, что причиной обеих вспышек явился один и тот же штамм вируса.

3.2. Филогенетический анализ штаммов ВГА, циркулирующих на территории РФ

Филогенетический анализ изолятов ВГА субтипа IA, выявленных в России (375 изолятов) и странах СНГ (260 изолятов), совместно с генетическими последовательностями ВГА генотипа I из других стран, доступными в GeneBank, показал, что большинство изолятов из России и стран СНГ формируют единые кластеры (рис. 4).

I I 1

SillUH \

Рисунок 4. Филогенетическое дерево изолятов ВГА (область генома BFA - VP1/2A, длина 300 нт, алгоритм - Minimum Evolution, двухпараметрическая модель Кимура). IA, IB -кластеры соответствующих субтипов ВГА; 1,2- кластеры штаммов из РФ и стран СНГ; 3 - средиземноморский кластер; 4, 5 — американские кластеры; 6, 7 — азиатско-тихоокеанские кластеры. (■ - РФ, Украина, Таджикистан, Кыргызстан; Е - Испания, IT-Италия, Nor - Норвегия, Tun - Тунис, BR - Бразилия, US - США, TJ- Китай, JP - Япония).

Штаммы ВГА из РФ и стран СНГ статистически достоверно группируются в два отдельных кластера (кластеры 1, 2; рис. 4), отличных от средиземноморского (кластер 3 -Испания, Италия, Тунис), американских (кластеры 4, 5 - Бразилия, США) и азиатско-тихоокеанских (кластеры 6, 7 - Китай, Япония). Лишь отдельные российские изоляты ВГА попадают в кластер средиземноморских штаммов, так же как и отдельные изоляты из Норвегии, Италии и Японии попадают в кластер штаммов, характерных для РФ и стран СНГ, и, вероятно, относятся к спорадическим завозным случаям ГА. Выявленные особенности кластеризации штаммов ВГА субтипа IA, циркулирующих в РФ, странах СНГ и других странах мира, доказывают возможность использования филогенетического анализа области генома ВГА VP1/2A длиной 300 нт или более для подтверждения фактов завозных случаев ГА из стран дальнего зарубежья.

3.3. Особенности географической кластеризации штаммов ВГА, относящихся

к субтипам IA и IIIA

С целью детального анализа филогенетических взаимоотношений штаммов субтипа IA, выявленных на территории РФ и стран СНГ, а также установления их возможной географической кластеризации, было построено филогенетическое дерево, включающее только данные штаммы с использованием байесовского статистического метода (рис. 5).

Рисунок 5. Географическая кластеризация штаммов субтипа 1А ВГА, выявленных на территории РФ и стран СНГ (область генома УР1/2А, длина 411 нуклеотидов, байесовский статистический метод, модель ОТЯ+1). Кластер штаммов европейской части РФ — 1; южные кластеры - 2, 3; среднеазиатские кластеры - 4, 5; тувинский кластер - 6; дальневосточный кластер - 7.

На данном дереве можно было выделить ряд статистически достоверных кластеров, соответствующих отдельным географическим регионам РФ и стран СНГ. Так, в единый кластер попали изоляты ВГА, выявлявшиеся у больных ГА из регионов европейской части РФ (кластер 1). Два кластера соответствовали изолятам ВГА, выявленным на территории Южного и Северо-Кавказского ФО и в Украине (кластеры 2, 3). Большинство изолятов 1А субтипа, выявленных в Таджикистане и Кыргызстане, группируются также в два кластера (кластеры 4, 5). Отдельную ветвь на филогенетическом дереве формировали изоляты, выявлявшиеся в Республике Тыва (кластер 6). Изоляты ВГА 1А субтипа, выявленные в Сахалинской области и Хабаровском крае, также формировали отдельный кластер (кластер 7). Таким образом, анализ позволил выявить семь кластеров 1А субтипа ВГА, характерных для регионов России и стран СНГ: кластер европейской части РФ, два южных кластера, два средне-азиатских кластера, тувинский кластер и дальневосточный кластер.

Следует отметить, что штаммы, попавшие в кластер европейской части РФ, являются наиболее распространенными на территории РФ и обусловливали большинство вспышек ГА. Штаммы тувинского кластера 1А субтипа были обнаружены только в данном регионе, что, вероятно, связано с его значительной географической изоляцией. Штаммы, формирующие дальневосточный кластер, филогенетически близки к средиземноморским штаммам, выявлявшимся в Тунисе, Италии и Испании. Анализ пейзажа штаммов ВГА в Сахалинской области и Хабаровском крае на протяжении 2006-2007 гг. показал, что генетические варианты, формирующие дальневосточный кластер, циркулируют на данной территории на протяжении длительного времени и не являются генетически идентичными. Это свидетельствует о длительной эволюции описанных штаммов ВГА на данной территории, и случаи ГА, ими вызванные, не могут считаться завозными.

Филогенетический анализ штаммов III генотипа ВГА, включающих штаммы из России и стран СНГ, а также последовательности из других стран, полученные из ОепВапк, выявил наличие трех кластеров для штаммов субтипа ША, один из которых (основной кластер) содержал абсолютное большинство российских штаммов и штаммов стран СНГ (рис. 6). Лишь один из штаммов, выявленных в Кыргызстане, относился к кластеру штаммов, характерных для стран Юго-Восточной Азии, что, возможно, говорит о завозном характере данного случая ГА и требует дальнейшего изучения. Абсолютное большинство штаммов из стран Средней Азии, выявленных в данной работе, образовывали единый кластер (кластер 4, рис. 6). Штаммы субтипа ША, выявленные на территории Республики Саха (Якутия), где данный субтип является доминирующим, образовывали целую группу кластеров, филогенетически отличных от среднеазиатских (кластеры 5-9, рис. 6). Отдельным кластером, достоверно отличающимся от других, были представлены штаммы, выявленные в Кемеровской области (кластер 10, рис. 6).

Таким образом, филогенетический анализ штаммов ВГА 1А и ША субтипов, циркулирующих в РФ, Украине, Таджикистане и Кыргызстане, позволил выявить ряд географических кластеров, характерных для стран Средней Азии и отдельных регионов РФ. Это демонстрирует возможность использования данного подхода при эпидемиологической диагностике не только для установления факта завоза случаев ГА из стран дальнего зарубежья, но и выявления завозных случаев заболевания из отдельных регионов РФ и СНГ.

3.4. Оценка степени генетической гетерогенности штаммов ВГА, циркулирующих на территории РФ и ряда стран СНГ

Для оценки степени генетической гетерогенности штаммов ВГА, циркулирующих на территории РФ и стран СНГ, было рассчитано среднее попарное филогенетическое расстояние между ними. Для сравнения были выбраны штаммы субтипа 1А, встречающиеся на территории европейской части России, и три группы штаммов субтипа ША: штаммы, выявленные в Республике Саха (Якутия) (как наиболее многочисленная группа штаммов данного субтипа на территории России), штаммы, встречавшиеся на территории европейской части РФ, и штаммы, характерные для стран Средней Азии. Результаты расчета попарных филогенетических расстояний между штаммами в каждой из групп представлены в таблице 4. Генетическая вариабельность популяции ВГА субтипа ША, циркулирующего на территории Республики Саха (Якутия), значительно выше, чем вариабельность популяции ВГА того же субтипа, циркулирующего на территории стран Средней Азии и европейской части России, а также популяции ВГА субтипа 1А, циркулирующего на территории европейской части РФ. При этом последняя обладает наименьшей вариабельностью.

ПЕВ

111

А«:

Оишж Л n«'MW » -S i

« Oïiiss <.кю

Owa,

AVIH

фуяШЖ* AVPt t

^ÎÎLT 1 «fcVi**

10

Рисунок 6. Филогенетическое дерево изолятов ВГА субтипа ША (область генома ВГА - VP1/2A, длина 300 нуклеотидов, алгоритм - Minimum Evolution, двухпараметрическая модель Кимура). ША, ШВ - кластеры соответствующих субтипов ВГА; 1 -основной кластер субтипа ША, включающий штаммы из РФ и стран СНГ; 2, 3 - кластеры субтипа IIIA, включающие штаммы, не характерные для РФ и СНГ; 4 - кластер среднеазиатских штаммов; 5-9 - кластеры штаммов из Республики Саха (Якутия); 10 - кластер штаммов из Кемеровской обл.; 11 - кластер субтипа 1IIB.

о - Япония

V - Индонезия и Филиппины

д - Мадагаскар

о - Индия

<э - Испания

о - Норвегия

□ - Европейская часть РФ

• - Республика Саха (Якутия)

* - Кемеровская обл.

▲ - Таджикистан, Кыргызстан

Таблица 4

Нуклеотидная вариабельность популяций ВГА субтипов 1А и ША в РФ и странах Средней Азии (Кыргызстан, Таджикистан)

IIIA субтип ВГА IA субтип ВГА

Штаммы из Республики Саха (Якутия) п=24 Среднеазиатские штаммы п=21 Штаммы европейской части России п=24 Штаммы европейской части России п=36

Попарное филогенетическое расстояние (Mis) п - число попарных сравнений 0,03±0,01 п=276 0,02±0,01 п=213 0,02±0,01 п=276 0,014±0,007 п=630

Достоверность различий (критерий Колмогорова- Смирнова) р<0,001

р<0,001

р<0,001

Выявленные характеристики генетической вариабельности популяций ВГА в РФ и странах Средней Азии, наряду с описанными ранее особенностями кластеризации штаммов, позволяют сделать вывод, что штаммы ША субтипа, циркулирующие в Республике Саха (Якутия), не являются завозными из стран Средней Азии, эволюционируют на данной территории длительное время и эндемичны для нее. Высокая генетическая гетерогенность популяции ВГА в Республике Саха (Якутия) может быть следствием низкой плотности населения и большой территориальной разобщенности населенных пунктов, что приводит к низкой интенсивности циркуляции (перемешивания) штаммов и их длительной раздельной эволюции. Напротив, относительно низкая генетическая гетерогенность штаммов 1А субтипа ВГА в европейской части РФ является следствием более активной их циркуляции на данной территории и косвенно свидетельствует о высокой интенсивности скрытого эпидемического процесса. Большое число регистрируемых на европейской части РФ вспышек ВГА также является подтверждением данной гипотезы.

4. Молекулярно-генетические особенности вспышек ГА на территории РФ

За период с 2005 по 2010 гг. были изучены молекулярно-генетические характеристики 20 вспышек ГА на территории РФ. Вспышки, включенные в анализ, охватывали 7 ФО РФ: Центральный ФО - 4, Северо-Западный ФО - 3, Приволжский ФО -2, Северо-Кавказский ФО - 1, Уральский ФО - 3, Сибирский ФО - 4 и Дальневосточный ФО - 3 (таблица 5).

Из 20 изученных вспышек в 5 (25%) ведущим был водный путь передачи, и зарегистрировано наибольшее количество заболевших - 4235 (64%). В 4 вспышках (20%), где основным являлся пищевой путь передачи, был зарегистрирован 1681 заболевший (25,6%). Наибольшее число вспышек (9; 45%) характеризовалось превалированием контактно-бытового пути передачи и относительно небольшим общим количеством заболевших (446; 7%). Две вспышки (10%) с количеством заболевших 193 (3%) имели смешанный характер, при которых отмечались как контактно-бытовой, так и водный пути передачи.

Определение субтипов изолятов ВГА, выявлявшихся во время вспышек, показало, что 15 из 20 вспышек (75%) были вызваны субтипом 1А вируса, тогда как остальные 5 -субтипом ША. При филогенетическом анализе была выявлена значительная генетическая гетерогенность как среди изолятов 1А, так и ША субтипов (рис. 7, 8).

Рисунок 7. Филогенетическое дерево штаммов ВГА субтипа 1А, выделенных при вспышках ГА в РФ (2005-2010 гг.) (Область генома ВГА - УР1/2А, длина 411 нт, байесовский статистический метод, модель НКУ85). Номера штаммов соответствуют номерам вспышек (таблица 5).

В 6 из 15 вспышек, вызванных вирусом 1А субтипа, выявлялись штаммы, характерные для европейской части РФ (Тверская обл., 2005 г.; г. Нижний Новгород, 2005 г.; г. Северодвинск, 2006 г.; Рязанская обл., 2009 г.; г. Москва, 2010 г.), в 2 вспышках -штаммы из тувинского кластера (Республика Тыва 2008, 2010 гг.), в 2 - из дальневосточного кластера (Сахалинская обл., 2006, 2007 гг.), в 2 - из среднеазиатского кластера (Ханты-Мансийский АО, 2008 г., Красноярский край, 2009 г.), в 1 - из южного кластера (1) (Республика Дагестан, 2008 г.) и в 1 - из южного кластера (2) (г. Коряжма Архангельской обл., 2006 г.).

В одной из вспышек наблюдалась циркуляция как штаммов кластера европейской части РФ, так и штаммов среднеазиатского кластера (г. Екатеринбург, 2006 г.) (рис. 7). Следует отметить, что в большинстве случаев (11 из 15; 73%) для вспышек ГА, вызванных субтипом 1А ВГА, была характерна циркуляция штаммов, типичных для данной территории. Из 5 вспышек, вызванных субтипом ША ВГА, в 3 выявлялись штаммы из среднеазиатского кластера, не характерные для регионов возникновения данных вспышек (г. Калининград, 2009 г.; г. Уфа, 2009 г.; г. Екатеринбург, 2010 г.). В двух остальных случаях вспышки были вызваны штаммами, входящими в кластер штаммов, ранее встречавшихся на этих территориях (Кемеровская обл., 2006 г.; Республика Саха (Якутия), 2007 г.) (рис. 8).

Анализ спектра штаммов ВГА, циркулировавших в пределах каждой из изученных вспышек, позволил в ряде случаев установить не только характер вспышки (завоз или распространение локального штамма), но также выдвинуть гипотезы о механизме развития

Кластер европейской части РФ

вспышки, доказать единство фактора передачи возбудителя, подтвердить или опровергнуть связь как отдельных случаев заболевания, так и отдельных вспышек, между собой. Так, выявление двух доминантных штаммов ВГА в пределах одной водной вспышки (U15 и U16, рис. 7) и характера их распространения по районам города (г. Нижний Новгород, 2005 г.) позволило выдвинуть гипотезу о двух источниках возбудителя инфекции.

Рисунок 8. Филогенетическое дерево штаммов ВГА субтипа IIIA, выделенных при вспышках ГА в РФ (2005-2010 гг.), а также штаммов, входящих в основной кластер субтипа IIIA ВГА (область генома ВГА - VP1/2A, длина 411 нуклеотидов, байесовский статистический метод, модель HKY85). Номера штаммов соответствуют номерам вспышек (таблица 5).

Идентичность штамма ВГА у лиц, проживающих в разных населенных пунктах, но объединенных общим фактором передачи возбудителя и имеющих сходные сроки развития заболевания, позволили доказать эпидемиологическую связь случаев ГА (Ржевский район, 2005 г.). Генетические различия штаммов, вызвавших вспышки в г. Осинники и гт. Междуреченск и Новокузнецк (2006 г.) (штаммы U50 и U51, рис. 8) позволили опровергнуть связь первой с двумя другими, и доказать связь последних между собой. Расследование пищевой вспышки в крупном мегаполисе (г. Москва, 2010 г.) позволило выявить параллельно протекавшую вспышку ГА в образовательном учреждении с контактно-бытовым путем передачи возбудителя (штаммы U97, рис. 7, и U99, рис. 8). Оценка степени гетерогенности циркулирующих во время вспышки штаммов (наличие пула минорных штаммов) позволила выдвигать гипотезу об их эндемичности для данной территории и длительности существования неблагоприятной эпидемиологической ситуации (г. Нижний Новгород, 2006 г.; Сахалинская обл., 2006, 2007 гг.)

Таким образом, анализ молекулярно-генетических характеристик штаммов ВГА, циркулирующих во время вспышки, дает ценную дополнительную информацию для установления источника возбудителя инфекции, путей и факторов передачи, а также временных и пространственных границ очага.

Характеристика вспышек ВГА, включенных в исследование

Таблица 5

№ Год Субъект РФ Район, населенный пункт Число пострадав. Основной пут^. передачи Субтип ВГА, Штамм*

1 2005 Тверская обл. г. Ржев, г. Зубцов, п. Оленино 672 Пищевой IA, ЕВР

2 2005 Нижегородская обл. г. Нижний Новгород 2992 Водный IA, ЕВР

3 2006 Архангельская обл. г. Северодвинск 24 Контактно-бытовой IA, ЕВР

4 2006 Архангельская обл. г. Коряжма 22 Контактно-бытовой IA, Ю(2)

5 2006 Кемеровская обл. г. Междуреченск, г. Новокузнецк г. Осинники 1055 Водный IIIA**

6 2006 Сахалинская обл. г. Углегорск 65 Водный с присоединением контактно-бытового и пищевого 1А,ДВ

7 2006 Свердловская обл. г. Екатеринбург 43 Водный IA, ЕВР+СА

8 2007 Республика Саха (Якутия) г. Нерюнгри 26 Контактно-бытовой IIIA* *

9 2007 Сахалинская обл. г. Южно-Сахалинск, г. Анива 25 Контактно-ботовой 1А.ДВ

10 2008 Республика Дагестан г. Махачкала 80 Водный IA, Ю(1)

11 2008 Республика Тыва Тоджинский район 66 Контактно-бытовой IA, ТУВ

12 2008 Ханты-Мансийский АО г. Радужный 15 Контактно-бытовой IA, СА

13 2009 Рязанская обл. г. Рязань, Рыбновский район 37 Контактно-бытовой IA, ЕВР

14 2009 Калининградская обл. г. Калининград 9 Контактно-бытовой ША, СА

15 2009 Республика Башкортостан г. Уфа 168 Пище вой IIIA, СА

16 2009 Рязанская обл. Рыбновский район, с. Костино 127 Контактно-бытовой с присоединением водного IA, ЕВР

17 2009 Красноярский край г. Ужур, с. Тургужан 19 Контактно-бытовой IA, СА

18 2010 г. Москва г. Москва 828 Пищевой IA, ЕВР

19 2010 Свердловская обл. г. Екатеринбург 13 Пищевой IIIA, СА

20 2010 Республика Тыва Барун-Хемчикский район, Улуг-Хемский район, Монгун-Тайгинский район 269 Контактно-бытовой IA, ТУВ

* ЕВР - кластер штаммов европейской части РФ; ДВ - Дальневосточный кластер; СА - Среднеазиатский кластер; Ю(1), (2) - Южные кластеры;

ТУВ - Тувинский кластер; ** - штаммы, не входящие в среднеазиатский кластер; в РФ выявляются в регионах Сибири и Дальнего Востока.

5. Особенности клинического течения ГА, вызванного ВГА субтипов 1А и ША

5.1. Клинико-эпидемиологическая характеристика групп больных ГА, вызванным вирусами различных субтипов

Группа больных ГА, вызванным вирусом субтипа 1А, составляла 124 человека, 80 из которых (64,5%) были мужчины и 44 (35,5%) - женщины. Группа больных с вирусом субтипа ША включала 71 человека и была сопоставима по соотношению мужчин и женщин с группой с субтипом вируса 1А (69,4% и 30,6%, соответственно). Как в группе больных с субтипом ВГА 1А, так в группе с субтипом ША большинство составляли лица в возрасте от 15 до 24 лет - 58,9% и 59,1%, соответственно. Доля больных в возрасте от 25 до 34 лет составляла 20% (22,6% и 15,5% в группах с субтипами 1А и ША, соответственно), от 35 до 44 лет - 15,4% (12,9% и 19,7% в группах с субтипами 1А и ША, соответственно).

При оценке формы ГА по степени тяжести было установлено, что наиболее часто встречались среднетяжелые формы - 73,3% (75,8% и 69,0% в группах больных с субтипами ВГА 1А и ША, соответственно). Легкие формы ГА составляли 24,1% (21,8% и 28,2% в группах с генотипами ВГА 1А и ША, соответственно) и тяжелые формы - 2,6% (2,4% и 2,8% в группах с генотипами ВГА 1А и ША, соответственно). Статистически достоверной разницы в частоте регистрации легких, среднетяжелых и тяжелых форм ГА в группах больных с генотипами ВГА 1А и ША выявлено не было (р>0,05; критерий Манна-Уитни).

Большинство пациентов поступало в стационар в первые 10 дней болезни. Так, на 110-й день болезни было госпитализировано 79,2% больных (73,3% и 86,8% в группах больных с генотипами ВГА 1А и ША, соответственно), на 11-20-й день - 17,5% (20,1% и 11,8% в группах больных с генотипами ВГА 1А и ША, соответственно) и на 21-й день и позднее — 3,2% (4,7% и 1,5% в группах больных с генотипами ВГА 1А и ША, 1 соответственно). По срокам госпитализации группы больных с генотипом ВГА 1А и ША также статистически достоверно не отличались (р>0,05; критерий Манна-Уитни). Частота различных вариантов преджелтушного периода у больных ГА в группах с субтипами вируса 1А и ША достоверно не отличалась (рис. 9). Длительность преджелтушного периода в этих группах составляла 5,6±2,4 и 6,0±1,9 дней, соответственно, и статистически достоверно также не отличалась.

Вариант течения гтреджелтушмаго периода )

Астено-аегетагтзный"

Дяспепсичеекин' Грнплоподобмыб-Ар1рэппместй~ Смешанный"

0% 10% 30% 30% 40% 60%

Процент

Рисунок 9. Частота различных вариантов преджелтушного периода у больных ГА в группах с субтипами ВГА 1А и ША.

У всех больных заболевание протекало с синдромом желтухи, выраженность которого коррелировала с тяжестью заболевания. Длительность желтушного периода у больных с легкой формой ГА составляла 8,2±4,6 дней (10,6±4,8 у больных с генотипом

ВГА IA и 6,2±3,4 у больных с генотипом I1IA), со среднетяжелой формой - 13,7±7,0 дней (13,0±5,7 у больных с генотипом ВГА IA и 14,8±8,7 у больных с генотипом IIIA) и с тяжелой формой - 19,2±6,8 дней (17,0±1,0 у больных с генотипом ВГА IA и 22,5±12,0 у больных с генотипом IIIA). Различия в длительности желтушного периода в зависимости от степени тяжести заболевания были статистически достоверны (р<0,001; критерий Краскела-Уоллиса). Однако между группами больных с генотипами ВГА IA и IIIA статистически достоверных различий в длительности сохранения истеричности кожи и склер выявлено не было (р>0,05; критерий Манна-Уитни). При оценке длительности желтухи в зависимости от возраста больных была выявлена прямая корреляционная связь средней силы (коэффициент корреляции Спирмена г=0,3; р=0,002). При раздельном анализе в группах больных с различными генотипами ВГА данная связь сохранялась лишь в группе больных с генотипом IIIA (г=0,4; р=0,003). В группе больных с генотипом ВГА IA статистически достоверной связи между длительностью желтухи и возрастом выявлено не было.

При анализе сроков исчезновения симптомов интоксикации в группах больных ГА с генотипами ВГА IA и ША с легким (10,0±4,0 и 8,8±3,6 дней, соответственно), среднетяжелым (12,2±4,2 и 13,1±4,6 дней, соответственно) и тяжелым (19,5±5,6 и 20,7±5,8 дней, соответственно) течением заболевания достоверных различий выявлено не было.

5.2. Динамика лабораторных показателей у больных ГА, вызванным вирусами различных субтипов

Биохимические исследования крови (концентрация общего и прямого билирубина, активность AJIT) проводили в динамике заболевания от 2 до 9 раз (в зависимости от тяжести заболевания и длительности пребывания пациента в стационаре). Данные анализировались отдельно для больных с легким, среднетяжелым и тяжелым течением болезни. С целью оценки динамики показателей все результаты исследований были разбиты на три периода в зависимости от дня болезни. К первому периоду были отнесены исследования, проведенные с 1-го по 10-й день болезни, ко второму - с 11-го по 20-й день болезни, к третьему - с 21-го дня болезни и позднее.

При анализе уровня общего билирубина было установлено, что в первом периоде значения были достоверно выше при более тяжелых формах ГА как в группе больных с генотипом ВГА IA, так и в группе с генотипом IIIA (критерий Краскела-Уоллиса, р<0.001). При среднетяжелых формах уровень общего билирубина был приблизительно вдвое выше, чем при легких формах, и в 1,5 раза ниже, чем при тяжелых формах ГА (таблица 6). Статистически достоверных отличий между группами больных с генотипами ВГА IA и ША не наблюдалось (критерий Манна-Уитни, р>0,05). Уровни общего билирубина во втором и третьем периодах были достоверно ниже как в группе больных с генотипом ВГА IA, так и с генотипом ВГА III А (критерий Краскела-Уолиса, р<0.001). Значимых отличий данного показателя между группами больных с генотипами ВГА IA и ША ни во втором, ни в третьем периодах не наблюдалось (критерий Манна-Уитни, р>0.05). Динамика уровня прямого билирубина имела те же закономерности, которые были выявлены для общего билирубина.

Следует отметить, что среди 195 больных ГА, включенных в исследование, у троих (1,5%) (двоих мужчин в возрасте 33 и 49 лет и одной женщины в возрасте 31 года) наблюдалась холестатическая форма заболевания. У двоих из них ГА протекал в среднетяжелой форме и у одного имел тяжелое течение. Длительность желтухи у больных с холестатической формой ГА была значительно больше, чем у сравнимых по тяжести течения больных не осложненной формой ГА (38±7 и 14±5 дней, соответственно; р<0.001; критерий Манна-Уитни). Динамика уровней общего и прямого билирубина в течение заболевания также достоверно отличалась. Значения данных показателей были существенно выше у больных холестатической формой ГА во все периоды заболевания. Все трое больных с холестатической формой ГА имели генотип IIIA ВГА.

Таблица 6.

Динамика концентрации билирубина и активности AJIT у больных ГА различной степени тяжести в группах с

генотипами ВГА IA и ША (M±s)

Параметр День болезни Генотип ВГА

IA (п=124) ША (п=71)

Форма ГА по тяжести течения Форма ГА по тяжести течения

Легкая (п=27) Среднетяжелая (п=94) Тяжелая (п=3) Легкая (п=20) Среднетяжелая (п=49) Тяжелая (п=2)

Билирубин общий, мкмоль/л 1-10 68,5 ±28,6 125,9 ±46,1 187,2 ±43,1 68,6 ± 18,3 119,7 ±39,5 171,6 ±64,5

11-20 46,8 ±21,2 78,0 ± 65,5 100,5 ±40,6 50,7 ± 20,8 95,9 ±88,1 136,0 ±52,6

21 и более 24,3 ± 7,5 40,2 ± 38,4 38,2 ±11,8 23,5 ±5,7 61,6 ±57,6 54,6 ± 48,7

Билирубин прямой, мкмоль/л 1-10 46,1 ±27,1 84,6 ± 38,0 118,6 ±25,1 48,7 ± 16,9 84,0 ±31,6 105,5 ±31,5

11-20 31,2 ± 18,7 50,4 ±45,4 67,9 ±34,3 33,2 ±16,5 64,2 ±71,0 85,9 ±34,1

21 и более 12,8 ± 7,6 20,8 ± 19,5 22,1 ± 6,0 11,2 ±4,3 41,3 ±44,5 33,3 ± 27,3

АЛТ, Ед/л 1-10 347,7 ± 118,4 1234,2 ± 706,6 3382,4 ± 2059,2 368,2 ± 106,3 1337,5 ±585,6 2576,6 ± 1508,3

11-20 161,5 ±108,4 380,3 ±301,0 570,2 ± 154,0 145,8 ±36,1 330,3 ± 259,4 682,2 ± 455,7

21 и более 52,8 ± 9,7 130,4 ±141,5 112,1 ±76,4 46,3 ± 7,7 110,6 ±62,7 146,8 ± 65,8

Среди больных с генотипом 1А такой формы заболевания выявлено не было. Различия в частоте выявления холестатической формы ГА среди больных с 1А и ША генотипами ВГА были статистически достоверны (критерий Манна-Уитни, р=0,024), однако поправка на регион постоянного проживания больных нивелировала данные статистические различия (критерий Мантеля-Хенселя, р>0,05).

Показатели активности АЛТ в группе больных с легким течением ГА в период с 1-го по 10-й день болезни были повышены в 7-9 раз в сравнении с референсными значениями. К 21-му дню болезни в данной группе наблюдалась практически полная их нормализация.

Среди больных со среднетяжелым и тяжелым течением болезни в период с 1-го по 10-й день болезни активность АЛТ была в 3,5-10 раз выше по сравнению с группой больных с легким течением ГА. В последующем показатели активности АЛТ достаточно динамично снижались, превышая, однако, референсные значения к 21-му дню болезни в 2,5-5 раз (таблица 6). Данные закономерности наблюдались как в группе больных с генотипом 1А ВГА, так и с генотипом ША. Однако достоверных отличий в динамике показателей АЛТ в течение заболевания между больными с разными генотипами вируса выявлено не было.

Таким образом, по тяжести течения заболевания, срокам госпитализации, вариантам течения и длительности преджелтушного периода, длительности синдромов интоксикации и желтухи, а также уровню билирубина, активности АЛТ и динамике этих показателей значимых различий между группами больных с генотипами ВГА 1А и ША выявлено не было. В группе больных с ГА, вызванным ВГА генотипа ША, наблюдалась прямая корреляция длительности синдрома желтухи с возрастом пациентов. Кроме того, у троих пациентов из данной группы наблюдалась холестатическая форма ГА со средней длительностью синдрома желтухи 38 дней. Все трое больных относились к возрастной группе старше 30 лет. Это наблюдение может свидетельствовать о наличии тенденции к развитию холестатической формы ГА у больных с генотипом ВГА ША в старших возрастных группах.

6. Распространенность генотипов и субгенотипов ВГВ на территории РФ и ряда стран СНГ

6.1. Особенности распространенности генотипов ВГВ на территории РФ

По данным генотипирования, большинство изолятов ВГВ (3069, 85,0%) относились к генотипу Б, 10,7 % изолятов (385 из 3609) были представлены генотипом А, 3,2% (115 из 3609) принадлежали к генотипу С. Сорок из 3609 изолятов (1,1%) относились к другим генотипам, сочетанным генотипам и рекомбинантным штаммам вируса: 14 - к генотипу В, 1 - к генотипу Е, 22 - к сочетанным генотипам (12 - А+Б, 8 - А+С, 1 - В+О, 1 - С+Э) и 3 -к рекомбинантным штаммам вируса (генотип С/О). Распространенность генотипов ВГВ в ФО РФ представлена на рис. 10.

Во всех ФО доминирующим генотипом ВГВ был И, доля которого варьировала от 70% (Дальневосточный ФО), до 97,9% (Уральский ФО). В отдельных субъектах РФ, таких как Чукотский АО, Республика Саха (Якутия) и Кабардино-Балкарская Республика, распределение генотипов ВГВ имело ярко выраженные особенности. Доля генотипа С ВГВ в Чукотском АО была значительно больше, чем в других субъектах РФ, и составляла почти четверть всех случаев (67 из 451; 24,3%). В Республике Саха (Якутия) около половины изученных изолятов ВГВ принадлежало доминирующему в этом субъекте генотипу А (49 из 99; 49,5%). В Кабардино-Балкарской Республике доля генотипа А также была значительно больше, чем в других регионах, и составляла 39,4% (37 из 94).

Рисунок 10. Распространенность генотипов ВГВ в федеральных округах РФ.

При анализе возрастных особенностей распределения генотипов ВГВ в РФ было выявлено, что наибольшая доля больных с генотипом А ВГВ (17,7%) наблюдалась в возрастной группе 21-30 лет, несколько меньшая - в возрастных группах 15-20 и 31-40 лет (14,5% и 9,3%, соответственно). Наименьшая доля больных с генотипом А ВГВ была в возрастных группах 0-14, 41-50 лет и 51 год и старше (4,4%, 7,2% и 3,2%, соответственно). Выявленные отличия распределения генотипов ВГВ в различных возрастных группах были статистически достоверны (критерий Краскела-Уоллиса, р<0,001). Среди мужчин и женщин генотипы ВГВ были распространены с приблизительно одинаковой частотой: генотип А - 12,1% и 10,8%, соответственно, генотип Э - 84,1% и 83,2%, генотип С - 2,7% и 4,9%, другие генотипы - по 1,1%. Наблюдаемые отличия в группах мужчин и женщин были статистически недостоверны.

6.2. Распространенность генотипов ВГВ на территории Украины, Республики Армения, Кыргызстана и Таджикистана

По результатам генотипирования изолятов ВГВ, выделенных от больных из Таджикистана, Кыргызстана, Украины и Армении, в подавляющем большинстве случаев выявлялись генотипы О и А. В Таджикистане все выявленные изоляты ВГВ принадлежали к генотипу Б. В Армении, Украине и Кыргызстане доминирующим также был генотип О, который выявлялся в 93%, 83% и 81% случаев, соответственно. Вторым по частоте встречаемости был генотип А, который был обнаружен в 7% образцов от больных из Республики Армения, 17% - из Украины и 19% - из Кыргызстана. В 4 образцах из Украины были обнаружены другие генотипы ВГВ: В, С, А+С и А+Э. Распространенность генотипов ВГВ в Таджикистане и Украине достоверно отличалась от таковой в России (критерий Манна-Уитни, р=0,001 и р=0,006, соответственно). Отличия в распространенности генотипов в Армении и Кыргызстане от распространенности генотипов ВГВ в России не достигли уровня статистически достоверных отличий (критерий Манна-Уитни, р>0,05). Генотип А ВГВ встречался достоверно чаще среди

больных из Западной Украины, где его доля составляла 34,3% (46 из 134). В Восточной Украине распространенность данного генотипа была значительно меньше и составляла 9,1% (10 из 110) (критерий Манна-Уитни, р<0.0001).

6.3. Филогенетический анализ штаммов ВГВ, циркулирующих на территории

РФ и ряда стран СНГ

При филогенетическом анализе было установлено, что генотипы А и С ВГВ в России представлены только одним субгенотипом каждый, А2 и С1, соответственно. Доминирующий на территории России генотип В ВГВ характеризуется большим генетическим разнообразием и представлен тремя субгенотипами - й1, 02 и ЭЗ (рис. 11).

■ - Россия, страны СНГ

О - Страны Европы (Польша, Испания, Швеция, Германия, Италия, Великобритания) А - Страны Азии (Турция, Индия, Иран) О - Страны Дальнего Востока (Япония, Китай, Корея) □ - Страны Африки (Египет, ЮАР) V - Страны Северной Америки (США, Канада)

Рисунок 11. Филогенетическое дерево изолятов ВГВ (область генома ВГВ - S-ген, длина 887 пар нуклеотидов, алгоритм - Maximum Likelihood). Dl, D2, D3, А2, CI - кластеры соответствующих субгенотипов ВГВ.

Российские штаммы ВГВ субгенотипа А2 не формируют отдельных кластеров и распределены в пределах филогенетической ветви, соответствующей этому субгенотипу, равномерно между штаммами, выявляющимися в Европе, Северной Америке, Африке и на Дальнем Востоке. Напротив, российские штаммы, принадлежащие субгенотипу С1, имеют тенденцию к формированию отдельного кластера. Штаммы субтипа D1, также как и штаммы субтипа А2, не формируют отдельных филогенетических ветвей в пределах

своего кластера. Наблюдается равномерное их распределение по большей части между штаммами ВГВ из Турции, Ирана и Индии, хотя штаммы ВГВ из стран Европы также присутствуют в данном кластере. Субгенотип D2 на филогенетическом дереве представлен в абсолютном большинстве штаммами из России и стран Европы. Выделить какие-либо значимые филогенетические ветви, отражающие географическую кластеризацию для штаммов данного субтипа, не представляется возможным. На ветви филогенетического дерева, соответствующей субгенотипу D3, можно выделить два кластера, один из которых является очень гетерогенным и включает штаммы ВГВ из стран Европы, Северной Америки, Африки, Азии и России, тогда как другой представлен только российскими штаммами вируса. Три российских штамма, выявленные у больных ХГВ из Чукотского АО, не попали ни в одну из ветвей, соответствующих известным субгенотипам ВГВ (рис. 11, штамм s_ch97_08). Анализ генетических характеристик данных штаммов представлен в разделе 6.4.

Филогенетический анализ штаммов ВГВ из различных регионов РФ не выявил значимых географических кластеров ни для одного из субгенотипов вируса. Наблюдалась тенденция к формированию отдельной ветви частью штаммов ВГВ от больных из Чукотского АО в пределах субгенотипа D3. Однако отсутствие статистической достоверности этого кластера не позволяет говорить о наличии устойчивой закономерности.

Анализ количественного соотношения штаммов различных субгенотипов генотипа D позволил выявить различия в частоте их встречаемости в европейской части России, Сибири и на Дальнем Востоке. Всего было проанализировано 146 изолятов, среди которых 29 принадлежали субгенотипу D1, 40 - субгенотипу D2 и 77 - субгенотипу D3. Все изоляты были объединены по географическому принципу в 3 группы: европейская часть России, Урал и Сибирь, Дальний Восток. Результаты анализа показали, что частота выявления субгенотипа D1 убывает с Запада на Восток с 45% до 12%, тогда как частота выявления субгенотипа D3, напротив, возрастает с 15% до 63%. Выявленные различия в частоте встречаемости субгенотипов имели высокую степень статистической достоверности (критерий Краскела-Уоллиса, р<0,001).

6.4. Анализ генетических характеристик рекомбинантного штамма ВГВ

При филогенетическом анализе российских штаммов ВГВ были выявлены три штамма из Чукотского АО, которые не образовывали кластера ни с одним из известных субгенотипов ВГВ (рис. 11, штамм s_ch97_08). Исследование полногеномной последовательности данного штамма с помощью программы SimPlot (анализ Bootscan) позволило установить, что он является рекомбинантом вирусов двух генотипов - D и С. Положение точек рекомбинации было определено как позиции 593 и 2402 относительно геномной последовательности ВГВ. До точки рекомбинации 593 секвенированная последовательность имела более высокую гомологию с субтипом Cl, после точки рекомбинации 593 - с субтипом D3 до точки рекомбинации 2402, после этой точки рекомбинации - с субтипом Cl. Гомология была подтверждена филогенетическим анализом фрагментов последовательностей до и после точек рекомбинации. Ранее сообщалось о выявлении C/D рекомбинантов ВГВ в Китае [Cui С., 2002; Wang Z., 2005], однако штамм, обнаруженный в Чукотском АО, имеет другое положение точек рекомбинации и является гибридом субгенотипов ВГВ, характерных для данной территории. Эпидемиологическое и клиническое значение выявленного рекомбинантного штамма ВГВ требует дальнейшего изучения.

6.5. Анализ серотипов ВГВ, циркулирующих на территории РФ

С целью изучения распространенности различных серотипов ВГВ на территории РФ было исследовано 85 изолятов вируса, принадлежащих различным субгенотипам: А2 — 20 изолятов, Cl - 3 изолята, D1 - 18 изолятов, D2 - 26 изолятов, D3 - 18 изолятов. Для всех

изолятов была определена аминокислотная последовательность, кодируемая S-геном вируса, на основании имеющейся нуклеотидной последовательности. В зависимости от наличия тех или иных аминокислот в позициях 122, 127, 134, 159 и 160 S-белка, штаммы были отнесены к четырем основным серотипам: ay\V2, ayw3, adw2 и adr [Magnius L., 1995]. Результаты показали, что все штаммы субгенотипа А2 принадлежат серотипу adw2, все штаммы субгенотипа С1 принадлежат серотипу adr, все штаммы генотипа D принадлежат серотипу ау, при этом штаммы субгенотипов D1 и D3 относятся к серотипу ayw2, а все штаммы субгенотипа D2 относятся к серотипу ayw3. Учет информации о циркулирующих серотипах ВГВ может иметь важное значение для выбора вакцинных препаратов при совершенствовании программ иммунопрофилактики в РФ.

6.6. Особенности проявлений эпидемического процесса ГВ на территории

Чукотского АО

В ходе исследования распространенности генотипов ВГВ на территории различных субъектов РФ было выявлено, что в Чукотском АО, единственном из 36 изученных субъектов, наблюдается уникальная структура генотипов вируса с высокой, более 24%, долей генотипа С ВГВ. С целью углубленного изучения молекулярно-

эпидемиологических особенностей циркулирующих генотипов и субгенотипов ВГВ на территории Чукотского АО было дополнительно исследовано 769 образцов плазмы крови, из которых 616 составляли коренное население (74,8% чукчи), 144 - пришлое население. Среди 463 условно здоровых лиц в 9,6% случаев был выявлен HBsAg, причем доля этих случаев была достоверно выше среди коренного населения (11,2%) по сравнению с пришлым (1,3%). Частота выявления anti-HCV IgG в этой же группе составила 2,8%. Среди коренных жителей она была несколько ниже (2,3%) в сравнении с данными о пришлом населении (5,3%).

Генотип ВГВ удалось определить у 190 больных ХГВ. Генотип А был выявлен у 5 больных (2,6%), генотип С - у 49 больных (25,8%) и генотип D - у 136 больных (71,6%). Все изоляты генотипа А принадлежали субгенотипу А2, генотипа С - субгенотипу С1. Из 45 изолятов генотипа D 7(15,6%) принадлежали субгенотипу D1, 14(31,1%) - субгенотипу D2 и 25(55,6) — субгенотипу D3.

Среди чукчей наблюдалась достоверно большая по сравнению с пришлым населением доля генотипа С ВГВ (32,3% и 8,8%, соответственно) и несколько меньшая доля генотипа D (66,2% и 85,3%, соответственно) (критерий Манна-Уитни, р=0,05).

При анализе распределения субгенотипов DI, D2 и D3 было установлено, что среди коренных жителей, больных ХГВ, значительно реже, чем у пришлого населения, выявляется субгенотип D1 (6,3% и 38,5%, соответственно), несколько реже выявляется субгенотип D2 (28,1% и 38,5%, соответственно), но значительно чаще обнаруживается субгенотип D3 (65,6% и 23,1%, соответственно) (критерий Манна-Уитни, р=0,003).

7. Молекулярно-гепетические подходы к анализу эпидемиологической связи случаев ГВ

7.1. Общая характеристика эпидемических очагов ГВ

Среди 18 семейных очагов выявлено 13 семей, в которых инфицированными являлись матери и дети (очаги Fl, F3, F4, F6-F9, F11-F16), и 5 семей с инфицированными братьями или сестрами (очаги F2, F5, FIO, F17, F18). Один из внутрисемейных очагов (F13) был представлен случаями ХГВ у матери, ее сына и племянника. Изучение эпидемиологического анамнеза и истории заболевания каждого пациента позволило для 9 семейных очагов предполагать, что заражение детей произошло от матери в первый год жизни ребенка. В одном из семейных очагов заражение старшего ребенка, наиболее вероятно, произошло от матери, больной ОГВ, в условиях тесного бытового контакта, и младшего ребенка - при реализации перинатального пути передачи.

7.2. Реконструкция филогенетических взаимоотношений генетических последовательностей ВГВ, выделенных в эпидемических очагах

Для филогенетического анализа были выбраны 2 области генома ВГВ, представленные единственной рамкой считывания, что определяет их высокую генетическую вариабельность: фрагмент гена С (Core), длиной 501 пара нуклеотидов (положение в геноме ВГВ 1894-2389 по референс-последовательности AF280817), и фрагмент гена Р, длиной 213 пар нуклеотидов (положение в геноме ВГВ 1207-1419). Филогенетический анализ эволюционных отношений между изолятами ВГВ был проведен с помощью методов ME и МСМС.

Из 88 исследованных изолятов вируса (41 из семейных очагов и 47 из контрольной группы) 10 относились к генотипу А ВГВ, остальные 78 - к генотипу D. Все больные из семейного очага F4 (К11, К28 и К148) были инфицированы ВГВ генотипа А. Принимая во внимание, что генотип А не является доминирующим на территории РФ, данный факт с высокой долей вероятности подтверждает наличие эпидемиологической связи случаев в очаге. У больного К26 из семейного очага F18 выявлялся ВГВ генотипа А, тогда как у другого члена семьи (К 14) из того же очага — ВГВ генотипа D. Это свидетельствует о различных источниках инфицирования данных пациентов и опровергает гипотезу о наличии эпидемиологической связи случаев. Изоляты ВГВ от больных К26 и К14 были исключены из дальнейшего анализа и использовались как контрольные. Все остальные случаи ХГВ были вызваны вирусом генотипа D, который является доминирующим на территории РФ.

При раздельном филогенетическом анализе фрагментов С- и Р-генов ВГВ для большинства семейных очагов последовательности ВГВ сохраняли филогенетическое сходство (группировались в одном узле) относительно последовательностей контролен и последовательностей из других очагов. Однако для ряда семейных очагов при анализе по фрагменту С-гена последовательности ВГВ не группировались (очаги F5, F16, F11). Из трех последовательностей ВГВ для очага F10 только 2, принадлежащие детям, кластеризовались вместе, тогда как третья последовательность, принадлежащая их матери, находилась в другой ветви общего для них крупного филогенетического кластера. Для семейного очага F13 последовательность С-фрагмента одного из членов семьи (племянника матери) также не группировалась с двумя другими последовательностями ВГВ (от матери и ребенка) из того же очага. Анализ по фрагменту Р-гена выявил высокую достоверность кластеризации (более 0,7) только для трех семейных очагов (F4, F5, F7). Реконструкция филогенетических взаимоотношений объединенных последовательностей ВГВ (CP-последовательность) представлена на рис. 12.

На представленном филогенетическом дереве последовательности ВГВ, относящиеся к одноименным семейным очагам, группируются вместе. Исключения составляют очаги F11 и F13. Для очага F11 последовательности ВГВ от матери (К77) и ребенка (К66) находятся далеко друг от друга на филогенетическом дереве, не попадая даже в общую крупную ветвь. В данном случае факт отсутствия генетической связи между данными изолятами ВГВ является очевидным. Из эпидемиологического анамнеза известно, что ВГВ у обоих пациентов был выявлен одновременно в 2002 г. До выявления вируса как у пациента К77 (матери, 1976 г.р.), так и у пациента К66 (ребенка, 1993 г.р.) были неоднократные хирургические вмешательства.

Кроме того, известно, что у первого мужа К77 (отца К66) и ее дочери от второго брака выявлялись маркеры ВГВ (anti-HBc IgG). Данные факты позволяют сделать предположение о возможности разных источников инфекции для пациентов К77 и К66. В пределах очага F13 кластеризация генетических последовательностей ВГВ наблюдается только для пациентов К91 (матери) и К90 (ребенка).

Рисунок 12. Филогенетическое дерево изолятов ВГВ от больных из семейных очагов ХГВ (гибридный фрагмент генов С и Р ВГВ, 714 пар нуклеотидов, метод ME, модель JC69, bootstrap 1000 повторов).

Последовательность ВГВ, выделенного от пациента К92 (племянника К91), не имеет филогенетического родства с таковыми от К91 и К90, и находится в другой крупной ветви дерева. Из эпидемиологического анамнеза пациента К92 известно, что его мать перенесла ОГВ на последнем месяце беременности. ВГВ был выявлен у данного пациента на первом году его жизни, в 1995 г. ВГВ у его тети (К91, 1970 г.р.) и двоюродного брата (К90, 1989 г.р.) был выявлен только в 2001 и 2002 гг., соответственно. Данные филогенетического анализа последовательностей ВГВ из очага F13 однозначно доказывают, что пациент К92

не является источником инфекции по отношению к пациентам К91 и К90. С другой стороны, случаи ХГВ у последних двоих пациентов, очевидно, эпидемиологически связаны. Для большинства семейных очагов наблюдалась высокая вероятность (более 0,7) кластеризации генетических последовательностей, их составляющих (рис. 12).

7.3. Филогенетический анализ изолятов ВГВ, выделенных от больных из семейного очага F1

В результате анализа геномной последовательности ВГВ, выделенного от больного К79, относящегося к семейному очагу F1, была обнаружена значительная вырожденность последовательности С-фрагмента вирусного генома. С целью анализа структуры квазивида ВГВ у пациента К79 из семейного очага Fl, а также реконструкции филогенетических взаимоотношений между последовательностями ВГВ от больных из данного очага, было проведено клонирование фрагмента С-гена вируса с последующим секвенированием и филогенетическим анализом методом МСМС.

Филогенетический анализ показал, что квазивиды ВГВ пациента К79 образуют две, приблизительно одинаковые по числу клонов филогенетические группы (рис. 13). Первая группа клонов К79 группируется с высокой значимостью (Р = 0,99) с клонами матери К4 и клонами второго ребенка К80. Вторая группа клонов изолята К79 наиболее сильно разошлась по генетическому расстоянию как с клонами матери и сестры, так и с первой группой клонов того же изолята. Наблюдаемая филогенетическая картина свидетельствует о том, что первоначально произошло заражение старшего ребенка (К79), который явился источником инфекции в семейном очаге. Об этом свидетельствует наибольшая генетическая гетерогенность популяции ВГВ у данного пациента. В последующем произошло заражение младшего ребенка (К80) от старшей сестры, по-видимому, в условиях тесного бытового контакта. В последнюю очередь заразилась мать (К4), также от старшего ребенка. Такая последовательность событий следует из особенностей эволюционных взаимоотношений изолятов ВГВ, выделенных от больных из данного очага (рис. 13). Наиболее короткое эволюционное расстояние от общего предка (узел 1) наблюдается до узла 2, объединяющего последовательности от пациента К80 (младшего ребенка) (0,00589). Это свидетельствует о том, что событие, связанное с началом эволюции изолятов ВГВ у данного пациента (по сути, момент инфицирования), произошло первым. Наибольшее эволюционное расстояние от узла 1 наблюдается до узла 4, объединяющего последовательности от пациента К4 (матери) (0,03176). Это подтверждает гипотезу о том, что инфицирование матери в цепочке событий произошло в последнюю очередь. Кроме того, филогенетические взаимоотношения последовательностей от пациентов однозначно свидетельствуют о том, что заражение матери произошло именно от старшего ребенка (К79), а не от младшего (К80). Так, филогенетический анализ позволил установить последовательность событий инфицирования в семейном очаге F1. На основании имеющегося анамнеза этих пациентов невозможно определить цепь передачи инфекции, так как у всех членов семьи вирус был выявлен единовременно.

Таким образом, проведенное исследование случаев ХГВ в 18 семейных очагах позволило разработать подходы к анализу эпидемиологической связи случаев заболевания на основе молекулярно-генетических методов. Результаты показали, что на первом этапе анализа необходимо провести определение генотипа ВГВ у всех больных из исследуемого очага инфекции. Уже на этом этапе в некоторых ситуациях гипотеза о наличии эпидемиологической связи случаев может быть опровергнута. Так, в семейном очаге F18 у больных были выявлены разные генотипы ВГВ, что однозначно исключает единый источник инфекции. Если больные из очага инфицированы ВГВ одного и того же генотипа, следует переходить ко второму этапу, включающему секвенирование фрагментов генома вируса и их филогенетический анализ.

92_ О.ООЗф

► К4

Ьд203

kzn4 с2с1 - ♦ kzn4 СЗ

0.00606

• kzn79 с9 0.03595

• kzn79 сб

0.01004

и-S kznSO c1

¿00400

1-Ш kzn&O еЗ

> kzn79c2c10 » kz п79 сЗ

-0.01007

O.OOSO9 I-K91

0.0060]

K55

97 J— ^ —4Ш0202 С .00396- K68 0.00204

-K77

С.00398 L K87 0.00200

0.00601

• kzn79 c7 0.Ô0198

I-• kzn79

0.00598

Семейный очаг FI

Ш - младший ребенок. 1987 г.р.

# - старшин ребенок. 1984 г.р.

♦ - мать. 1961 г.р.

Q - узлы ветвей очага F1

Рисунок 13. Филогенетическое дерево изолятов ВГВ от больных ХГВ из семейного очага Fl (фрагмент С-гена ВГВ, 501 пара нуклеотидов, метод МСМС).

Было показано, что филогенетический анализ необходимо проводить с применением как минимум двух вариабельных областей генома ВГВ, содержащих единственную рамку считывания (фрагментов С- и Р-генов). Использование только одной области генома, как ранее предлагалось рядом авторов (Dumpis U., 2001; Bracho M., 2006; Datta S., 2006), может быть недостаточно для выявления и доказательства достоверности филогенетической связи изолятов ВГВ. С помощью такого подхода удалось выявить два семейных очага (F11 и F13), в пределах которых эпидемиологическая связь случаев была сомнительна. Недостаток или неоднозначность данных эпидемиологического анализа здесь была компенсирована результатами филогенетического исследования. Особую важность исследование по нескольким областям генома ВГВ приобретает при необходимости доказать или опровергнуть гипотезу о связи случаев в очагах, в которых с момента предполагаемого инфицирования прошел большой срок (более 10 лет) (Osiowy С., 2006; Lim S., 2007). При оценке результатов филогенетического анализа необходимо учитывать факторы, которые могут оказывать влияние на скорость эволюции вируса и,

следовательно, снижать вероятность кластеризации. К таким факторам относятся особенности течения ХГВ (сероконверсия по HBeAg) (Hannoun С., 2000; Osiowy С., 2006; Desmond С., 2012), особенности иммунного статуса пациента (Bertoletti А., 1994; Carman W., 1997; Maini М., 2000) и противовирусное лечение (Zolim F., 2004; Buti М, 2005). В нашем исследовании примером такого очага, в котором один из пациентов получал противовирусное лечение, является семейный очаг Fl6. Несмотря на наличие общего кластера для случаев инфекции из данного очага, вероятность кластеризации была ниже 0,7.

Важно отметить, что в исследованиях такого рода необходимо использовать контрольную группу пациентов, предположительно не связанных с анализируемым очагом и проживающих в том же населенном пункте или районе. В этом случае уровень доказательности выявленной связи случаев из очага будет значительно выше. В некоторых ситуациях для решения вопроса о связи случаев в очаге может быть недостаточно популяционного секвенирования и возникнет необходимость предварительного клонирования исследуемых фрагментов генома изолятов ВГВ. В нашей работе при популяционном секвенировании фрагмента С-гена ВГВ, выделенного у больного К79 из семейного очага Fl, была выявлена высокая вырожденность последовательности. Такой результат свидетельствует о высокой гетерогенности вирусной популяции у больного и не позволяет выявить филогенетические связи с другими изолятами ВГВ. Клонирование и последующее секвенирование ряда клонов позволило решить эту проблему и выявить группу клонов, филогенетически связанную с изолятами ВГВ от других случаев из данного очага. Кроме того, детальная реконструкция филогенетических взаимоотношений изолятов ВГВ в пределах данного очага позволила предположить наиболее вероятную цепочку передачи инфекции.

8. Клинико-лабораторные особенности ХГВ, вызванного вирусами генотипов А и D

Группа больных ХГВ, вызванным вирусом генотипа А, составляла 98 человек, 47 из которых (48%) были мужчины и 51 (52%) - женщины. Группа больных с вирусом генотипа D включала 133 человека и была сопоставима по соотношению мужчин и женщин с группой с генотипом А (43,6% и 56,4%, соответственно). Медиана возраста в когорте больных с генотипом А ВГВ составляла 31 год (интерквартильный интервал 2742), тогда как в когорте с генотипом D - 39 лет (интерквартильный интервал 30-54) (р<0,01; критерий Манна-Уитни).

При анализе длительности заболевания с момента выявления HBsAg было установлено, что в группе больных с генотипом А ВГВ она составляет 7 лет (интерквартильный интервал 2-15), и при этом несколько больше, чем в группе больных с генотипом D (5 лет; интерквартильный интервал 2-12). Однако выявленные различия по длительности заболевания в сравниваемых группах больных не имели статистической достоверности (р>0,05; критерий Манна-Уитни).

По частоте выявления HBeAg в сравниваемых группах больных также не было выявлено статистически значимых различий. В группе больных с генотипом A HBeAg-позитивный ХГВ был диагностирован у 12 из 98 человек (12,2%), а в группе больных с генотипомО-у 18из 133 (13,5%) (р>0,05; критерий Манна-Уитни).

При анализе активности АЛТ было выявлено, что как в группе с генотипом А, так и с генотипом D ВГВ большинство составляли больные с нормальной активностью фермента. Аналогичная закономерность наблюдалась и при анализе активности ACT. Статистически значимых отличий по активности как АЛТ, так и ACT между сравниваемыми группами выявлено не было (рис. 14).

У 220 больных (88 с генотипом А и 132 с генотипом D) была прослежена динамика активности трансаминаз при естественном течении заболевания с 2-3-кратным исследованием на протяжении 9-12 месяцев. В зависимости от динамики активности АЛТ,

все больные были разделены на две группы: с постоянно нормальной активностью АЛТ и с повышенной активностью фермента (если хотя бы в одном из исследований наблюдалось повышение его активности). Постоянно нормальная активность АЛТ выявлялась у 67% больных с генотипом А и у 60% больных с генотипом О ВГВ. Повышенный уровень активности АЛТ наблюдался соответственно в 33% и 40% случаев. Различия между группами не имели статистической достоверности.

Рисунок 14. Распределение больных ХГВ, вызванным вирусами генотипов А и D, в зависимости от активности АЛТ и ACT.

В зависимости от уровня вирусной нагрузки, все больные были разделены на четыре группы: с показателем менее 100 МЕ/мл, в диапазонах от 100 до 2000 МЕ/мл, от 2000 до 20000 МЕ/мл, и более 20000 МЕ/мл. Анализ распределения больных в зависимости от уровня вирусной нагрузки показал, что среди пациентов с генотипом А доля тех, чей показатель находится в диапазоне от 100 до 2000 МЕ/мл, составляет 34,2%, а в диапазоне от 2000 до 20000 - 41,8%, тогда как среди пациентов с генотипом D соотношение обратное: доля больных с вирусной нагрузкой от 100 до 2000 МЕ/мл составляет 44,4%, а от 2000 до 20000 МЕ/мл - 24,6% (рис. 15). Отдельный анализ наиболее многочисленной группы больных с HBeAg-негативным ХГВ выявил еще более значимый уровень различий между когортами пациентов с генотипами А и D (рис. 15).

Все больные ХГВ fn-231 )* IIBeAg-негативный ХГВ (п -201)**

Вирусная нагрузке, МЕ/мл Вирусная нагрузка, МЕ/мл

Рисунок 15. Распределение больных ХГВ, вызванным вирусами генотипов А и О, в зависимости от уровня вирусной нагрузки (* р=0,01; ** р=0,008; критерий Краскела-Уоллиса).

Принимая во внимание, что в международных рекомендациях по диагностике и лечению больных ХГВ пороговым уровнем вирусной нагрузки для разграничения ХГВ и неактивного носительства вируса принято считать 2000 МЕ/мл, было проанализировано распределение больных с HBeAg-пoзитивным и НВеА£-негативным ХГВ в группах с генотипами А и О относительно данного порогового значения. Было установлено, что в группе с HBeAg-пoзитивньш ХГВ доля больных с вирусной нагрузкой менее 2000 МЕ/мл значительно меньше, чем таковая с вирусной нагрузкой более 2000 МЕ/мл, однако различия между группами с генотипами А и О были незначимы (25% и 75% для генотипа А и 34,2% и 65,5% для генотипа Б) (рис. 16).

HBeAg-no'íHTHBHblü ХГВ (11=30)

IIBeAg-негативный ХГВ (п =20] )*

Генотип ВГВ

«2 ООО >2 000

Вирусми нагрузка. Ш/т Вирусная шгруяа, МЕЛш

Рисунок 16. Распределение больных ХГВ, вызванным вирусами генотипов А и D, в группах с вирусной нагрузкой ниже и выше 2000 МЕ/мл (* р=0,018; критерий Манна-Уитни).

В группе больных с HBeAg-негативным ХГВ наблюдалась иная закономерность: среди больных с генотипом А уровень вирусной нагрузки меньше 2000 МЕ/мл был у 42%, а выше 2000 МЕ/мл - у 58% пациентов, тогда как среди больных с генотипом D, напротив, преобладали пациенты с низкой вирусной нагрузкой (63%), а вирусная нагрузка более 2000 МЕ/мл выявлялась лишь у 37% пациентов (рис. 16).

Учитывая, что пациенты с постоянно нормальной активностью AJIT и вирусной нагрузкой в диапазоне от 2000 до 20000 МЕ/мл требуют особого режима наблюдения (Papatheodoridis G., 2012; EASL Clinical Practice Guidelines: Management of chronic hepatitis В virus infection, 2012; Liaw Y-F., 2012), было проанализировано распределение больных с генотипами А и D с постоянно нормальной активностью AJIT в группах с вирусной нагрузкой менее 2000 МЕ/мл, в диапазоне от 2000 до 20000 МЕ/мл и выше 20000 МЕ/мл. Результаты показали, что среди больных с генотипом А и постоянно нормальной активностью AJ1T доля имеющих вирусную нагрузку в диапазоне 2000-20000 МЕ/мл значительно больше, чем среди больных с генотипом вируса D (55,6% и 27,8%, соответственно) (р<0,05; критерий Краскела-Уоллиса).

Анализ распределения 203 больных по стадиям фиброза в группах с генотипами А (77 больных) и D (126 больных) позволил выявить статистически значимые различия. Доля пациентов с клинически значимым фиброзом (F2-F4 по шкале METAVIR) была несколько выше в группе с генотипом D ВГВ (25,4%) по сравнению с таковой в группе больных с генотипом А ВГВ (13%) (р<0,05; критерий Манна-Уитни). Достоверных отличий в распределении больных с клинически значимым фиброзом в зависимости от формы заболевания (HBeAg-позитивный и HBeAg-негативный ХГВ), уровня вирусной нагрузки, активности трансаминаз в группах с генотипами А и D выявлено не было.

Таким образом, при изучении клинико-лабораторных особенностей ХГВ, вызванного вирусами наиболее распространенных в РФ генотипов А и D, не было

выявлено значимых отличий между сравниваемыми группами по частоте различных форм ХГВ (НВеА§-позитивного и HBeAg-нeгaтивнoгo), активности сывороточных трансаминаз и ее динамике. Однако анализ уровня вирусной нагрузки позволил установить, что при ХГВ, вызванном вирусом генотипа А, доля больных с вирусной нагрузкой более 2000 МЕ/мл значительно выше, чем при ХГВ, вызванном вирусом генотипа Б. Учитывая, что данный уровень является одним из ключевых критериев при дифференциальной диагностике ХГВ и неактивного носительства вируса (Martinot-Peignoux М., 2002; Мапез^ Е., 2003), можно предполагать, что доля ХГВ среди хронических форм заболевания, вызванного вирусом генотипа А, и, как следствие, потребность в противовирусном лечении, будут выше. Важно отметить, что наиболее выраженные отличия в распределении пациентов в зависимости от вирусной нагрузки были выявлены в группе с HBeAg-нeгaтивнoй формой ХГВ, которая является преобладающей в РФ. Среди больных с НВеА§-негативным ХГВ, вызванным вирусом генотипа А, и постоянно нормальным уровнем трансаминаз доля имеющих вирусную нагрузку в диапазоне 2000-20000 МЕ/мл составляет более 55%. Об этом важно помнить, принимая во внимание, что описанная группа пациентов, согласно современным рекомендациям, требует прицельного наблюдения каждые 3 месяца на протяжении не менее 3 лет, для уточнения диагноза и определения показаний к назначению противовирусного лечения. Представленные в работе результаты, выявившие большую долю пациентов с клинически значимым фиброзом в группе с генотипом И, согласуются с данными ряда авторов [5апсЬег-Тар1а5 ГМ., 2002; ТЬикаг V., 2002], показавших, что для ХГВ, вызванного вирусом данного генотипа, характерно агрессивное течение с более ранним формированием неблагоприятных исходов, по сравнению с ХГВ, вызванным вирусом генотипа А. Различия в частоте выявления клинически значимого фиброза в сравниваемых группах могут быть отчасти связаны с более молодым возрастом пациентов группы с генотипом А. С другой стороны, длительность заболевания на момент исследования в этой же когорте пациентов была выше, чем таковая среди больных с генотипом О. Таким образом, полученные результаты исследования позволяют сделать вывод о связи генотипа О ВГВ с большей частотой формирования клинически значимого фиброза печени.

ВЫВОДЫ

1. Эпидемический процесс ГА в РФ в период с 2001 по 2011 гг. характеризовался значительным снижением интенсивности, выраженной неравномерностью территориального распределения показателя заболеваемости, большим количеством вспышек и снижением удельного веса детей в структуре заболевших. Для эпидемического процесса ГВ характерным являлось значительное снижение заболеваемости ОГВ, наиболее выраженное в возрастной группе детей до 14 лет, снижение удельного веса подростков 1519 лет и возрастание удельного веса взрослых 20-39 лет в структуре заболевших ОГВ, сохранение высокого уровня заболеваемости хроническими формами инфекции.

2. Развитие эпидемического процесса ГА на территории РФ обусловлено преимущественно циркуляцией двух субтипов вируса: 1А, выявляющегося с частотой 73%, и ША, выявляющегося в 27% случаев. Субтипы ВГА распространены по территории страны неравномерно: доминирующим субтипом в большинстве регионов является субтип 1А. Единственным из изученных регионов, где доминирует субтип ША (62% случаев), является Республика Саха (Якутия). В Украине распределение субтипов ВГА аналогично таковому на территории Европейской части РФ (86% - субтип 1А, 14% - субтип ША), тогда как в странах Средней Азии (Таджикистан, Кыргызстан) доминирующим является субтип ША, который встречается в 68-82% случаев.

3. ВГА субтипа 1А генетически гетерогенен и формирует как минимум 7 филогеографических кластеров: кластер европейской части РФ, два южных, два среднеазиатских, тувинский и дальневосточный. Среднеазиатские штаммы субтипа ША

генетически значительно отличаются от штаммов этого субтипа, циркулирующих на территории РФ. Генетическая характеристика штаммов ВГА на основе филогенетического анализа позволяет идентифицировать завозные случаи инфекции.

4. Очаги групповых заболеваний ГА в РФ могут быть вызваны как ВГА субтипа 1А, так и субтипа ША. Как правило, вспышку обусловливает штамм вируса, характерный для данной территории. При завозных вспышках, вызванных ВГА субтипа ША, в РФ в большинстве случаев обнаруживаются штаммы, входящие в среднеазиатский кластер данного субтипа вируса.

5. Развитие эпидемического процесса ГВ на территории РФ обусловлено циркуляцией вируса трех генотипов: Б (85% случаев), А (10,7% случаев) и С (3,2% случаев). Доминирующий генотип О представлен тремя субгенотипами с неравномерным распространением на территории РФ - 01, 02 и ОЗ. Генотипы А и С представлены в РФ каждый единственным субгенотипом - А2 и С1, соответственно. На отдельных территориях значительную долю в структуре составляют генотипы А (Республика Саха (Якутия) - 49,5%, Кабардино-Балкарская Республика - 39%) и С (Чукотский АО - 24,3%). В Украине, Республике Армения и Кыргызстане развитие эпидемического процесса обусловлено циркуляцией ВГВ двух генотипов: О (от 81 до 93% случаев) и А (от 7 до 19%), а в Таджикистане - только вируса генотипа О.

6. Для коренного населения Чукотского АО по сравнению с пришлым характерны значительно большая распространенность ГВ (HBsAg выявляется в 11,2% и 1,3% случаев, соответственно), большая доля генотипа С (32,3% и 8,8%, соответственно) и преобладание субгенотипа ОЗ (65,6% и 23,1%, соответственно) в структуре циркулирующих генетических вариантов ВГВ.

7. Использование молекулярно-генетических методов исследования и филогенетического анализа для изучения биологического фактора эпидемического процесса в системе эпидемиологического надзора за ГА и ГВ позволяет повысить качество эпидемиологической диагностики при обследовании эпидемических очагов за счет более точного установления связи случаев заболевания, идентификации источника возбудителя инфекции, определения путей и факторов передачи.

8. По тяжести течения заболевания, срокам госпитализации, вариантам течения и длительности преджелтушного периода, длительности синдромов интоксикации и желтухи, а также динамике уровня билирубина и активности АЛТ ГА, вызванный вирусами 1А и ША субтипов, значимо не отличается. При ГА, вызванном вирусом субтипа ША, наблюдается прямая корреляция длительности синдрома желтухи с возрастом больных.

9. При ХГВ, вызванном вирусом генотипа А, доля больных с вирусной нагрузкой более 2000 МЕ/мл значительно выше, чем при ХГВ, вызванном вирусом генотипа О. Данные различия наиболее выражены в группе больных с HBeAg-нeгaтивнoй формой ХГВ. Среди HBeAg-нeгaтивныx больных с генотипом А и постоянно нормальной активностью АЛТ доля имеющих вирусную нагрузку в диапазоне 2000-20000 МЕ/мл значительно больше, чем среди больных с генотипом О ВГВ (55,6% и 27,8%, соответственно).

10. У больных ХГВ, вызванным вирусом генотипа О, чаще выявляется клинически значимый фиброз печени (Р2 и выше по шкале МЕТАУЖ), по сравнению с ХГВ, вызванным вирусом генотипа А (25,4% и 13%, соответственно). Различий в распределении больных с клинически значимым фиброзом в зависимости от формы заболевания (HBeAg-позитивный и НВеА§-негативный ХГВ), уровня вирусной нагрузки, активности трансаминаз в группах с генотипами А и О не наблюдается.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью обеспечения точности и полноты эпидемиологической диагностики, эпидемиологического прогноза и совершенствования рекомендаций по оптимизации

системы профилактических и противоэпидемических мероприятий при ГА и ГВ, рекомендовано внедрить молекулярно-генетический мониторинг за циркулирующими генетическими вариантами (субтипами, генотипами, субгенотипами) ВГА и ВГВ и динамикой изменения генетических характеристик вирусной популяции.

2. При расследовании эпидемических очагов ГА, с целью идентификации штамма ВГА, анализа эпидемиологической связи случаев, установления источника возбудителя инфекции, путей и факторов передачи, в дополнение к традиционному алгоритму эпидемиологической диагностики рекомендовано:

а) определять генотип и субтип изолятов ВГА, выявленных у больных, контактных лиц, в образцах воды или смывов с объектов внешней среды;

б) проводить секвенирование двух маркерных последовательностей генома (VP1/2A и 2С) исследуемых изолятов вируса;

в) проводить филогенетический анализ секвенированных маркерных последовательностей с целью определения их идентичности друг другу и ранее выявлявшимся штаммам ВГА, принадлежности к филогеографическим кластерам, характерным для РФ и стран СНГ.

3. Для доказательства или опровержения гипотезы об эпидемиологической связи случаев ГВ целесообразно:

а) определять генотип изолятов ВГВ, выделенных от больных исследуемой группы и больных контрольной группы (больных ГВ, предположительно эпидемиологически не связанных с больными исследуемой группы);

б) в случае совпадения генотипов ВГВ в образцах исследуемой группы, проводить секвенирование двух маркерных последовательностей генома (С и Р) изолятов вируса соответствующего генотипа;

в) проводить филогенетический анализ секвенированных маркерных последовательностей с целью определения их эволюционных взаимоотношений;

г) при выявлении значительной генетической вырожденности маркерной последовательности целесообразно провести ее клонирование, после чего -секвенирование необходимого количества клонов и повторить филогенетический анализ.

4. При ГА у взрослых больных старше 30 лет определение субтипа ВГА может оказаться целесообразным с целью прогнозирования длительности желтушного периода заболевания.

5. Для прогнозирования течения ХГВ и вероятности развития неблагоприятных исходов заболевания (цирроза печени, ГЦК) рекомендовано определение генотипа вируса в комплексном обследовании больных в практике лечебно-профилактических организаций инфекционного и гастроэнтерологического профиля.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Симонова И.А., Волчкова Е.В., Чуланов В.П., Пак С.Г., Ольшанский А.Я. Алгоритм специфической лабораторной диагностики вирусных гепатитов в условиях стационара (лекция) // Клиническая лабораторная диагностика. 2000. № 8. С. 21-33.*

2. Подколзин А.Т., Чуланов В.П., Шипулин Г.А., Бударина H.A., Юрчикова A.M. Оценка распространенности 3 генотипа вируса гепатита А с использованием праймерспецифичной ПЦР // Материалы IV Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний», М., 2002. С. 161-163.

3. Малый В.П., Чуланов В.П., Подколзин А.Т., Лядова Т.И., Лавелин С.Б. Изучение генотипов вирусов гепатита В и D в Харьковском регионе // Bích. Харк. нац. ун-та. 2002. №546. С. 58-60.

4. Chulanov V.P., Podkolzin А.Т., Nedachin А.Е., Zamyatina N.A., Shipulin G.A. Molecular epidemiology of hepatitis A vims in Russian Federation // Abstracts of the Eighth European

Workshop on Virus Evolution and Molecular Epidemiology / Infection, Genetics and Evolution. 2003. V.2.P.216.

5. Чуланов В.П., Шипулина О.Ю., Шипулин Г.А., Волчкова Е.В., Пак С.Г. Вирусные гепатиты сочетанной этиологии // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2003. № 4. С. 81-86.*

6. Чуланов В.П., Шипулин Г.А., Шипулина О.Ю., Волчкова Е.В., Пак С.Г., Покровский В.И. Полимеразная цепная реакция в диагностике вирусных гепатитов // Инфекционные болезни. 2003. № 1. С. 43-48.*

7. Потекаева С.А., Волчкова Е.В., Лопаткина Т.Н., Яздовский В.В., Чуланов В.П. Прогностическое значение системы гистосовместимости 1 класса при хронической HBV-инфекции // Инфекционные болезни. 2004. № 2. С. 5-8.*

8. Потекаева С.А., Волчкова Е.В., Лопаткина Т.Н., Яздовский В.В., Чуланов В.П, Пак С.Г. Распределение HLA-антигенов класса I у больных гепатитом В с подтвержденным генотипом HBV // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2004. N 5. С. 26-29.*

9. Потекаева С.А., Яздовский В.А., Чуланов В.П. Прогностическое значение изучения системы гистосовместимости I класса у больных гепатитом В с подтвержденным генотипом HBV // Врач. 2004. № 12. С. 26-28.*

10. Орлов С.Г., Мязин А.Е., Чуланов В.П. Распространенность генотипов вируса гепатита В в г. Москве и Московской области // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний», Новосибирск, 2005. С. 56-58.

11. Карандашова И.В., Неверов А.Д., Самсонова В.К., Рафаилова М.А., Браславская С.И., Алексеева М.Н., Чуланов В.П. Генотипы вируса гепатита А в Якутии: распространенность и клиническое значение // Материалы 13-го Международного конгресса по приполярной медицине, г. Новосибирск. 2006. С. 126.

12. Неверов А.Д., Карандашова И.В., Рафаилова М.А., Браславская С.И., Алексеева М.Н., Чуланов В.П. Генетическая гетерогенность вирусов гепатита В и D в Якутии (Россия) // Там же,- С. 190.

13. Орлов С.Г., Тимкович М.А., Лядова Т.И., Мязин А.Е., Малый В.П., Чуланов В.П. Распространенность генотипов вируса гепатита В (HBV) у пациентов с острым гепатитом в Харьковской и Закарпатской областях Украины // Материалы Международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков», г. Алматы. 2006. С. 210-211.

14. Орлов С.Г., Тимкович М.А., Мязин А.Е., Малый В.П., Чуланов В.П. Распределение генотипов вируса гепатита В (HBV) у больных острым и хроническим гепатитом В Закарпатской области Украины // Материалы 11-й Российской конференции «Гепатология сегодня». / Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2006. Т. XVI. № 1.С. 39.

15. Малый В.П., Лядова Т.И., Чуланов В.П., Тимкович М.А. Особенности циркуляции генотипов НВ V в различных регионах Украины // Там же.-С. 29.

16. Карандашова И.В., Неверов А.Д., Браславская С.И., Мельникова А.А., Петров Е.Ю., Княгина О.Н., Окунь И.Н., Елисеева С.М., Маттошкова В.В., Чуланов В.П. Молекулярная эпидемиология двух крупных вспышек вирусного гепатита А (ВГА) на территории Центральной России в 2005 году // Эпидемиология, диагностика и профилактика вирусных гепатитов. Современное состояние: Труды конференции, СПб. 2006. С. 38-39.

17. Карандашова И.В., Неверов А.Д., Камолов Б.Д., Орлов С.Г., Браславская С.И., Малеев В.В., Чуланов В.П. Этиологическая структура вирусных гепатитов в Республике Таджикистан по результатам молекулярно-биологических исследований // Там же.- С. 104105.

18. Карандашова И.В., Неверов А.Д., Орлов С.Г., Рафаилова М.А., Браславская С.И., Мязин А.Е., Алексеева М.Н., Чуланов В.П. Молекулярная эпидемиология вирусных гепатитов в Якутии // Там же.- С.. 106.

19. Tulisov A., McMahon B.J., Koch A., Minuk G„ Chulanov V.P., Bruce M.G., Uhanova J., Borresen M., Williams J., Osiowy C., Gelvan A., Alexeeva M., Larke В., Watt K. Viral hepatitis in the Arctic. A review from a Circumpolar Workshop on Viral hepatitis, ICCH13 // Alaska Med. 2007.V. 49. N 2 Suppl. C. 193-203.

20. Онищенко Г.Г., Шахгильдян И.В., Петров Е.Ю., Княгина О.Н., Осипова Т.В., Мельникова А.А., Окунь И.Н., Дерябина О.И., Ефимов Е.И., Быстрова Т.Н., Малышев В.В., Чуланов В.П., Гильденскиольд О.А., Калашникова Н.А., Погодина Л.В. Водная вспышка гепатита А в Нижнем Новгороде // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2007. № 3. С. 4-9.*

21. Неверов А.Д., Карандашова И.В., Орлов С.Г., Самсонова В.К., Рафаилова М.А., Браславская С.И., Мязин А.Е., Алексеева М.Н., Чуланов В.П. Молекулярная эпидемиология вирусных гепатитов в Якутии // Сб. трудов VI Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика-2007», М., 2007. Т. 1 С. 315-317.

22. Неверов А.Д., Карандашова И.В., Браславская С.И., Чуланов В.П. Филогенетическая структура популяции вируса гепатита А в России // Там же.- С. 318-319.

23. Неверов А.Д., Карандашова И.В., Браславская С.И., Чуланов В.П. Идентификация штаммов вируса гепатита А для эпидемиологических расследований // Там же.- С. 313-314.

24. Карандашова И.В., Неверов А.Д., Камолов Б.Д., Лебедева Е.Б., Орлов С.Г., Браславская С.И., Мязин А.Е., Малеев В.В., Чуланов В.П. Этиологическая структура вирусных гепатитов в Республике Таджикистан по результатам молекулярно-биологических исследований // Там же.- С. 303-305.

25. Карандашова И.В., Неверов А.Д., Браславская С.И., Орлов С.Г., Михайловская Г.В., Лебедева Е.Б., Самсонова В.К., Алексеева М.Н., Мельникова А.А., Чуланов В.П. Молекулярная эпидемиология вспышек вирусного гепатита А (ВГА), имевших место на территории России в 2005-2007 годах // Там же.-С. 300-302.

26. Карандашова И.В., Неверов А.Д., Браславская С.И., Орлов С.Г., Михайловская Г.В., Петров Е.Ю., Княгина О.Н., Окунь И.Н., Чуланов В.П. Молекулярная эпидемиология вспышки вирусного гепатита А (ВГА) в г. Нижний Новгород (2005 г.) // Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, М., 2007. Т.1 С. 344-345.

27. Неверов А.Д., Карандашова И.В., Браславская С.И., Чуланов В.П. Идентификация штаммов вируса гепатита А для решения задач эпидемиологии // Там же.- С. 360-361.

28. Deterding К., Constantinescu I., Nedelcu F.D., Gervain J., Nemecek V., Srtunecky O., Vince A., Grgurevic I., Bielawski K.P., Zalewska M., Воск Т., Ambrozaitis A., Stanczak J., Takacs M., Chulanov V.P., Slusarczyk J., Drazd'akova M., Wiegand J., Cornberg M., Manns MP., Wedemeyer H. Prevalence of HBV genotypes in Central and Eastern Europe // J Med Virol. 2008. V. 80. N10. C. 1707-1711.

29. Иванова M.P., Чуланов В.П., Жемухова P.X. Сравнительное генотипирование вирусов у больных с парентеральными гепатитами на территории //Материалы Российской научно-практической конференции «Инфекционные болезни: современные проблемы диагностики и лечения», СПб., 2008. С. 95.

30. Иванова М.Р., Чуланов В.П., Жемухова Р.Х. Клинико-эпидемиологическая характеристика и показатели апоптоза у больных хроническими вирусными гепатитами // Инфекционные болезни. 2009. № 3. С. 5-7.*

31. Чуланов В.П. Роль и практическое использование молекулярно-биологических методов при гепатите В // Материалы VII научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства», М., 2009. С. 57.

32. Неверов А.Д., Карандашова И.В., Рыкалина В.Н., Чуланов В.П. Разработка и апробация метода определения генотипа вируса гепатита В на основе ПЦР в реальном времени // Материалы I Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням Москва, 2009 г. / Инфекционные болезни. 2009. приложение № 1. С. 152.

33. Карандашова И.В., Неверов А.Д., Фаст Е.В., Долгин В.А., Браславская С.И., Чуланов

B.П. Молекулярная эпидемиология вирусных гепатитов В, С и Дельта на территории Чукотского автономного округа // Там же,- С. 86-87.

34. Самсонова В.К., Алексеева М.Н., Чуланов В.П. Вирусный гепатит А в Республике Саха (Якутия) //Там же,- С. 191.

35. Вознесенский С.Л., Чуланов В.П., Кожевникова Г.М. Серологические и молекулярно-генетические показатели у HBsAg-позитивных лиц // Там же,- С. 44.

36. Шевченко A.A., Иванова М.Р., Хараева З.Ф., Чуланов В.П., Баразбиева С.М., Жемухова Р.Х. Клинико-патогенгетические аспекты апоптоза у больных хроническими вирусными инфекциями высокого онкогенного риска// Инфекционные болезни. 2010. № 3. С. 13-18.*

37. Вознесенский С.Л., Чуланов В.П., Кожевникова Г.М. Зависимость активности аланинаминотрансферазы от вирусной нагрузки при хроническом вирусном гепатите В // Материалы II Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням Москва, 2010 г. / Инфекционные болезни. 2010. приложение №1. С. 64.

38. Михайловская Г.В., Карандашова И.В., Неверов А.Д., Долгин В.А, Браславская С.И., Чуланов В.П. Молекулярная эпидемиология вирусных гепатитов В и D на территории Чукотского АО // Там же,- С. 206.

39. Неверов А.Д., Орлов С.Г., Карандашова И.В., Чуланов В.П. Выбор олигонуклеотидов на основании множественного выравнивания для определения генотипа методом ДНК-ДНК гибридизации // Там же,- С. 224.

40. Чуланов В.П. Резистентность к противовирусным препаратам при хроническом гепатите В // Фарматека. 2010. № 4. С. 20-26.*

41. Карандашова И.В., Неверов А.Д., Хабибуллина В.Е., Долгин В.А., Пименов H.H., Браславская С.И., Чуланов В.П. Молекулярная эпидемиология парентеральных вирусных гепатитов на территории Чукотского автономного округа (ЧАО) // Материалы VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2010». М„ 2010. Т. 1. С. 216-220.

42. Неверов А.Д., Карандашова И.В., Долгин В.А., Михайловская Г.В., Пименов H.H., Браславская С.И., Чуланов В.П. Генетическое разнообразие вируса гепатита В на территории Российской Федерации // Там же.- С. 269-273.

43. Неверов А.Д., Миронов П.В., Иванов П.С., Чуланов В.П. Формирование паттернов мутаций устойчивости к препаратам группы L-нуклеозидов зависит от генотипа вируса гепатита В // Там же,- С. 260-263.

44. Неверов А.Д., Карандашова И.В., Долгин В.А., Михайловская Г.В., Пименов H.H., Комарова C.B., Чуланов В.П. Молекулярно-эпидемиологическая характеристика групповой и спорадической заболеваемости гепатитом А в России и странах СНГ в 2005-2010 гг. // Там же.-С. 265-268.

45. Неверов А.Д., Карандашова И.В., Лебедева Е.Б., Браславская С.И., Якупова Ф.М., Чуланов В.П. Разработка алгоритма анализа эпидемиологической связи случаев вирусного гепатита В (ВГВ) с использованием молекулярно-биологических методов // Там же.- С. 257-260.

46. Карандашова И.В., Неверов А.Д., Долгин В.Н., Михайловская Г.В., Рыкалина В.Н., Войцеховская Я.Н., Чуланов В.П. Разработка набора реагентов для определения генотипов А, В, С и D вируса гепатита В (HBV) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс НВУ-генотип-ИЪ>" // Там же,-

C. 224-227.

47. Неверов А.Д., Карандашова И.В., Долгин В.А., Браславская С.И., Хабибуллин В.Е., Чуланов В.П. Изучение рекомбинанта генотипов С и D вируса гепатита В, выявленного на территории Чукотского автономного округа (ЧАО) // Там же.-С. 263-264.

48. Карандашова И.В., Пименов H.H., Неверов А.Д., Михайловская Г.В., Долгин В.А., Браславская С.И., Комарова C.B., Чуланов В.П. Молекулярно-эпидемиологическая

характеристика вспышки ВГА, имеющей место на территории Москвы и Московской области в 2010 году // Там же,- С. 230-234.

49. Чуланов В.П. Проблемы лекарственной резистентности при противовирусной терапии хронического гепатита В // Клиническая гастроэнтерология и гепатология,- 2011,- N 3, с. 167-172.*

50. Воробьев П.А., Чуланов В.П., Телегина И.В., Борисенко О.В. Анализ воспринимаемой ценности при реализации стратегии лечения больных хроническим гепатитом В препаратом энтекавир // Инфекционные болезни. 2011. Т 9. № 3. С. 5-12.*

51. Мукомолов C.JI., Железнова Н.В., Левакова И.А., Сталевская A.B., Синайская Е.В., Сулягина Л.Г., Трифонова Г.Ф., Чуланов В.П., Пименов H.H., Комарова C.B. Вирусные гепатиты в РФ в 2010 г. / Аналитический обзор. Восьмой выпуск. Под ред. В.И. Покровского, А.Б. Жибруна. СПб.: ФБУН НИИЭМ им. Пастера, 2011. 116 с.

52. Вознесенский С.Л, Чуланов В.П., Кожевникова Г.М., Голуб В.П., Половинкина H.A., Барышева И.В. Клинико-лабораторные и демографические критерии активной HBV-инфекции. // Материалы второго конгресса Евро-Азиатского общества по инфекционным болезням. Г Астана, 2012. С.33-34.

53. Вознесенский С.Л., Чуланов В.П., Кожевникова Г.М., Голуб В.П., Половинкина H.A., Барышева И.В. Распространенность активных форм ХГВ в Московском регионе. // Материалы докладов X научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства». М., 2012. С. 20.

54. Chulanov V., Neverov A., Karandashova I., Dolgin V., Mikhailovskaya G., Lebedeva E, Braslavskaya S, Pimenov N., Komarova S. Molecular Epidemiology of HBV in Russia / Abstracts of the 14th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease». China, Shanghai, 2012. C. 222

55. Карандашова И.В., Долгин B.A., Неверов А.Д., Михайловская Г.В., Чуланов В.П. Распространенность генотипов вируса гепатита В в Москве в 2004-2011 гг. // Материалы X Съезда эпидемиологов, микробиологов паразитологов. Москва, 2012 г. / Инфекция и иммунитет. 2012, Т. 2. №1-2. С. 467.

56. Карандашова И.В., Пименов H.H., Неверов А.Д., Михайловская Г.В., Долгин В.А., Браславская С.И., Комарова C.B., Лыткина И.Н., Шулакова Н.И., Шипулин Г.А, Чуланов В.П. Молекулярно-эпидемиологические особенности вспышки гепатита А в Москве // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2012. № 3. С. 9-14*

57. Чуланов В.П., Пименов H.H., Карандашова И.В., Комарова C.B. Современные особенности эпидемического процесса гепатита А в России и странах Европы, определяющие стратегии его профилактики // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2012. № 3. С. 28-34*

*- В журналах, поименованных в перечне ВАК

ОТ АВТОРА

Выражаю сердечную благодарность и признательность научному консультанту, директору ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, академику РАМН, профессору Валентину Ивановичу Покровскому за постоянное руководство и внимание к работе, ценные советы, всестороннюю помощь и поддержку.

Искренне благодарю заведующего отделом молекулярной диагностики и эпидемиологии ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии, к.м.н. Г.А Шипулина и заведующую лабораторией молекулярных методов, к.м.н. О.Ю. Шипулину за многолетнюю совместную работу, всестороннюю помощь и дружескую поддержку.

Отдельную благодарность хочу выразить сотрудникам лаборатории вирусных гепатитов ОМДиЭ: к.б.н. И.В. Карандашовой, к.б.н. А.Д. Неверову, H.H. Пименову, C.B. Комаровой, В.А. Долгину, Е.Б. Лебедевой, Г.В. Михайловской, С.Г. Орлову, а также сотруднику научной группы генной инженерии и биотехнологии ОМДиЭ, к.б.н. С.И. Браславской за совместную научную работу и неоценимую помощь.

Сердечно благодарен члену-корреспонденту РАМН, профессору С.Г. Паку и д.м.н, профессору Е.В. Волчковой (кафедра инфекционных болезней Первого московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова) за совместную работу, под держку и вдохновление на протяжении многих лет.

Выражаю искреннюю признательность за плодотворное сотрудничество: д.м.н., проф. В.П. Малому, к.м.н. Т.И. Лядовой, [к.м.н. М.А. Тимкович|, В.В. Бойко (кафедра инфекционных болезней Харьковской медицинской академии последипломного образования, Украина), [д.м.н., проф. М.Н. Алексеевой], к.м.н. С.С. Слепцовой, В.В. Самсоновой (кафедра инфекционных болезней, фтизиатрии и дерматовенерологии медицинского института Северо-Восточного федерального университета им. М.К. Аммосова), д.м.н., проф. М.Р. Ивановой (кафедра инфекционных болезней медицинского факультета Кабардино-Балкарского государственного университета им. Х.М. Бербекова), д.м.н., проф. В.Х. Фазылову, к.м.н. Ф.М. Якуповой (кафедра инфекционных болезней Казанского государственного медицинского университета), д.м.н., проф. В.П. Молочному (кафедра детских инфекционных болезней Дальневосточного государственного медицинского университета), К.Т. Касымбековой (Центр микробиологических и молекулярно-генетических исследований Департамента государственного санитарно-эпидемиологического надзора Минздрава Республики Кыргызстан), Б.Д. Камолову (ГБУЗ Городская поликлиника №220 Департамента здравоохранения г. Москвы), Е.В. Фаст, В.Е. Хабибуллиной (ГУЗ Чукотская окружная больница Департамента здравоохранения ЧАО). Глубокую признательность выражаю учёному секретарю диссертационного совета ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, д.м.н, профессору A.B. Горелову.

Бесконечно благодарен родным и близким за терпение, понимание и поддержку.

Заказ № 103-Р/10/2013 Подписано в печать 25.10.13 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 www.cfr.ru; е-тай:info@cfr.ru