Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Исследование противовоспалительных, противокашлевых, муколитических свойств новых металлокомплексных производных ацетилцистеина и кумарина

Фролов Виктор Геннадьевич

Исследование противовоспалительных, противокашлевых, муколитических свойств новых металлокомплексных производных ацетилцистеина и кумарина

14.00.25 - Фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Фролов Виктор Геннадьевич

Исследование противовоспалительных, противокашлевых, муколитических свойств новых металлокомплексных производных ацетилцистеина и кумарина

14.00.25 - Фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена в ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Ковалева Виолетта Леонидовна

Научный консультант:

доктор медицинских наук, доцент Утешев Даниил Борисович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Кинзирский Александр Сергеевич

доктор медицинских наук, профессор Филиппенко Николай Григорьевич

Ведущая организация: Московский государственный медицинский стоматологический университет им. Н.А.Семашко

Защита состоится «25» февраля 2005 _г. в 15_часов на

заседании диссертационного совета К. 208.039.01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 305041, г. Курск, ул. КМаркса, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУВПО КГМУ Минздрава России

Автореферат разослан «23» января_2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук, доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. По современным представлениям, хронические обструктивные болезни легких (ХОБЛ) включают гетерогенную по своей природе группу легочных заболеваний (эмфизема, хронический обструктивный бронхит,

бронхоэктатическая болезнь, муковисцидоз и др.), которые объединяет расстройство функции внешнего дыхания легких по обструктивному типу (Чучалин А.Г., 1998; Barnes P.J., 2001; Izumi Т., 2002; Pride N., 2002). В настоящее время ХОБЛ относится к числу наиболее распространенных заболеваний в промышленно развитых странах и занимает 4-е место среди ведущих причин летальных исходов. Постоянное увеличение смертности от ХОБЛ особенно характерно для последнего десятилетия (Чучалин А.Г., 2004). В России эта группа заболеваний находится на первом месте по распространенности среди хронических болезней органов дыхания и составляет 15073 случаев на 100 тыс. населения (Чучалин А.Г.,2000). Этому способствует не только широкое распространение курения и глобальная неблагоприятная экологическая обстановка, но и трудность диагносцирования и резистентность во многих случаях к традиционной терапии. В основе патогенеза ХОБЛ лежит развитие воспаления стенок бронхов, эмфизема, поражение легочной паренхимы, что находит свое выражение в клинической картине формирования бронхообструктивного синдрома, проявляющегося кашлем, одышкой и нарушением отхождения мокроты (Barnes P., 2003; Vestbo 1, 2001; Ward S.A., Casaburi К., 2001; Wilkens H., Sybrecht G.W., 2001).Современный арсенал лекарственных средств для лечения ХОБЛ включает в себя, в основном, противовоспалительные (фенспирид, глюкокортикостероиды),

бронхолитические (формотерол, сальметерол) и муколитические препараты (ацетилцистеин, карбоцистеин) (Чучалин А.Г., 2002; Шмелев Е.И., 2003; Jeffery P.K, 2001; Maestrelli P. et al., 2001; Roche N. et al, 2001). Однако плохая переносимость во многих случаях указанных препаратов и их низкая эффективность при средних и тяжелых вариантах течения ХОБЛ диктует необходимость разработки новых лекарственных средств, обладающих иными механизмами действия.

Ранее было показано (Ковалева В.Л., 1997; Ковалева В.Л., Алейникова Т.Ю. 2002), что некоторые комплексные соединения переходных металлов (Си, Zn, Mn, Со) на основе кумариновых и родственных лигандов обладают выраженными

противовоспалительными и бронхолитическими свойствами. Это обстоятельство побудило нас к изучению новых представителей этого класса химических соединений, имеющих в своем составе другие металлы-комплексообразователи (например, титан) и различные лиганды на основе ацетилцистеина и природного кумарина - эскулетина.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось изучение фармакодинамических свойств новых комплексных производных ацетилцистеина и природного кумарина эскулетина на экспериментальных моделях острого и подострого воспаления, кашля и бронхоспазма. Для достижения цели были поставлены следующие основные задачи: 1. Оценить острую токсичность новых металлокомплексных соединений, имеющих в качестве комплексообразователя металлы переходной группы: титан, кобальт, медь, цинк.

2. Изучить противовоспалительную эффективность исследуемых соединений на моделях острого воспаления in vivo.

3. Оценить активность новых металлокомплексных соединений на модели сефадекс-индуцированного воспаления легких у крыс Вистар и определить их антиоксидантные свойства.

4. Исследовать противокашлевые свойства' наиболее активных соединений на моделях кашля, индуцированного лимонной кислотой и капсаицином.

5. Исследовать муколитические свойства новых металлокомплексных соединений

6. Изучить протективные свойства выявленных активных металлокомплексных соединений на модели бронхоконстрикции in vivo.

Научная новизна и теоретическая ценность. В представленной работе впервые продемонстрирована противовоспалительная активность новых оригинальных металлокомплексов с ацетилцистеином и природным кумарином - эскулетином. Показано, что острая токсичность комплексов зависит от того, какой металл входит в состав комплекса. Наименее токсичными оказались комплексы эскулетина с титаном, наиболее токсичными — комплексы ацетилцистеина с медью и кобальтом. В результате проведенного анализа зависимости "структура - активность" в ряду комплексных соединений ацетилцистеина и эскулетина с титаном было установлено, что наиболее значительную противовоспалительную активность проявляют титановые комплексы с эскулетином. Однако для проявления муколитической активности необходимо наличие в лигандной части комплекса молекулы ацетилцистеина. Впервые показано, что в условиях активной иммунизации животных титан-

содержащие комплексы с эскулетином и ацетилцистеином проявляют протективную активность в отношении антиген-индуцированной бронхоспастической реакции.

Научно-практическая значимость работы. Проведенные исследования выявили у оригинальных металлокомплексных соединений ацетилцистеина и эскулетина с титаном (PQ-910, PQ-908, PQ-911, PQ-915) высокую противовоспалительную и противокашлевую активность, что дает возможность рассматривать полученные результаты экспериментов как основу для дальнейших (фармакодинамических,токсикологических, фармакокинетических) исследований ХС с целью разработки в перспективе лекарственных препаратов. Новые металлокомплексные соединения (PQ-910, PQ-908, PQ-911) выгодно отличаются от препаратов сравнения рядом свойств: большой широтой терапевтического действия, проявлением эффективности в условиях активной иммунизации, а также сочетанием муколитических, антиоксидантных и

противовоспалительных свойств, являющихся наиболее важными при лечении хронических бронхообструктивных заболеваний.

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы были представлены на XI Национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2004), ХШ Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (г. Санкт-Петербург, 2003), II Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2004), докладывались и обсуждались на межлабораторных конференциях отдела фармакологии ВНЦ БАВ и кафедре фармакологии РГМУ (Купавна и Москва, 2003 - 2004 гг.).

Публикация результатов исследования

По материалам исследования опубликовано 6 печатных работ. Основные положения, выносимые на защиту:

• Металлокомплексные соединения с титаном и цинком на основе К-ацетилцистеина и кумарина являются низкотоксичными веществами и обладают выраженной биологической активностью.

• Металлокомплексные соединения с титаном на основе указанных лигандов в условиях моделирования воспаления проявляют противовоспалительную и антиоксидантную активность.

• Титан - и цинксодержагцие производные ацетилцистеина проявляют муколитические свойства

• Титансодержащие производные ацетилцистеина и эскулетина вызывают протективный эффект в отношении бронхоспазма у сенсибилизированных морских свинок

Объем и структура работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, излагающей методические аспекты исследования, главы результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, изложена на 117 страницах машинописи, иллюстрирована 6 рисунками и 27 таблицами. Библиографический указатель содержит 213 источников, из них 86 отечественных и 127 — зарубежных.

Материалы и методы исследования

Химические соединения. Объектом исследования явились новые металлокомплексные производные ^ацетилцистеина и эскулетина. синтезированные д. х. н. Э.А. Парфеновым, Характеристика исследуемых соединений представлена в таблице 1. Строение вновь синтезированных соединений подтверждено элементарным анализом и спектральными данными (ЯМР - и ИК-спектрами), индивидуальность - данными тонкослойной хроматографии.

Табл. 1. Характеристика и острая токсичность исследуемых комплексных соединений_

№ Лиганд Металл LD50 в/бр Мг/кг мг/кг в/жел**

PQ 898 N-ac Со (III) 10* -

PQ899 N-ac Cu(I) 10* -

PQ 902 N-ac Со (II) 120 >1000

PQ903 N-ac Co(II 151 >1000

PQ 886 N-ac Zn(II 152 >1000

PQ901 N-ac Zn(II 240 >1500

PQ 908 N-ac+Esc Ti(IV) 240 >1500

PQ 897 N-ac Со (II) 380 >1500

PQ907 N-ac+Esc+Epy Ti(IV) 2240 >5000

PQ 915 Esc Ti(IV) 1950 >5000

PQ910 Esc Ti(IV) >5000 >5000

PQ911 Esc Ti(IV) >5000 >5000

* в этой дозе мгновенная гибель всех животных ** в указанной дозе не отмечена гибель животных Примечание: N - ас - ацетилцистеин; Esc -эскулетин

Животные. В экспериментах были использованы 126 морских свинок Ç S массой 400 - 700 г., 208 аутбредных белых крыс и 86 крыс породы Вистар самцы массой 250 -350 г., 193 аутбредных белых мышей самцов массой 20 - 25 г. Животных содержали в

стандартных условиях вивария ВНЦ БАВ при 12-часовом режиме освещения и свободном доступе к воде и корму.

В качестве препаратов сравнения использовались следующие лекарственные вещества: N-ацетилцистеин (АСС) (субстанция), Сальбутамола сульфат - субстанция (Leiras), Теофиллин -субстанция (KRKA), Кромогликат натрия - (Fisons)- лекарственная форма в виде порошка, Индометацин - субстанция (Taicang Foreign Trade corporation, China), Преднизолон, гидрокортизон (коммерческие препараты Gedeon Richter, Венгрия), Будесонид (Пульмомед, Россия)

Экспериментальные модели. Экспериментальные

исследования новых ХС проведены в соответствии с Методическими указаниями по изучению бронхолитических, муколитических и противовоспалительных средств, разработанными проф. Ковалевой В.Л. (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, М., 2002). В работе использовались следующие модели и методы:

• Метод определения острой токсичности (ЛД50) (Прозоровский В.Б, Прозоровская М.П., 1980)

• Модели каррагенин - , гистамин - , ПАФ - индуцированных отеков лап крыс ((Winter E.T et al., 1962)

• Модель бронхоальвеолита у крыс (Ковалева В.Л, 1995; Макарова, Ковалева и др., 1996).

• Модели кашля у морских свинок, индуцированного лимонной кислотой и капсаицином - селективным кашель-индуцирующим агентом (Ucelay., 1991)

• Модель бронхоспазма у активно иммунизированных ненаркотизированных морских свинок с аэрозольным введением бронхоконстриктора (Ковалева В.Л. и соавт.,

9

2002). Морских свинок обоего пола массой 250-300 г активно иммунизировали по Andersson P (1980) однократным введением 10 мкг овальбумина ^A) (Sigma, grade III) и 100 мг гидроокиси алюминия (А1(ОН)3) на свинку в объеме 1мл физиологического раствора. Это количество антигена вводили по 0,2мл однократно внутримышечно (в оба бедра морской свинки) и 0,6 мл - внутрибрюшинно. Разрешающую дозу антигена - ОА - вводили в виде аэрозоли с помощью небуляйзера (Pari, Германия) через 4 недели после иммунизации.

При изучении противовоспалительных свойств ХС на модели бронхоальвеолита их эффективность оценивали по следующим критериям:

^ Гистологическое исследование легких;

^ Морфометрическая характеристика легочной ткани крыс;

^ Цитологическое исследование бронхоальвеолярного смыва (определение цитоза и эндопульмональная цитограмма); Морфометрическое исследование бронхоассоциированной лимфоидной ткани.

Антиоксидантный статус в цельной крови крыс оценивали по уровню восстановленного глутатиона (GSH) и по активности супероксиддисмутазы (SOD) и каталазы. Содержание GSH определяли спектрофотометрически по методу Ellman G.L. (1959) с использованием 5,5-дитиобис-2-нитробензойной кислоты. Активность SOD оценивали спектрофотометрически по ингибированию восстановления окисленного цитохрома С в ходе генерации супероксидного анион-радикала в системе ксантиноксидаза-ксантин (McCord J.M. et al., 1969). Перекисное

10

окисление липидов определяли по уровню МДА в цельной крови крыс по методу Ishihara M. (1978) в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой.

Муколитическую активность изучаемых ХС оценивали по объему и составу мокроты у морских свинок по методу Ucelay M. et al. (1991)

Статистическая обработка полученных данных. Полученные результаты обрабатывали методами вариационной статистики с применением стандартного пакета программ "Ms Excel' 2000" на ЭВМ IBM Pentium Н-300 и оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оценка острой токсичности новыхметаллокомплексных производных N- ацетилцистеина и эскулетина

Определение острой токсичности (LD5o) является первым и важным компонентом фармакологического исследования, т.к. низкая токсичность новых веществ - это одно из основных требований, предъявляемых к синтетическим соединениям, которые могут быть потенциальными лекарственными средствами. Острую токсичность новых соединений определяли по методу, описанному Прозоровским В.Б. и Прозоровской М.П. (1980). Как видно из табл. 1, исследуемые соединения можно отнести к IV-V классам токсичности, за исключением [Со (III)]- и [Си (I)] - содержащих комплексов с ацетилцистеином - PQ 898 и PQ 899, которые оказались высокотоксичными (Сидоров К.К., 1973; Саноцкий И.В., Уланова И.П. 1975).

При определении острой токсичности мы обнаружили следующую закономерность: LD50 комплексных соединений с

титаном [Ti(IV)] существенно выше, чем LD50 комплексов с кобальтом (Со (Ш)). Наименьшая LD5o оказалась у комплексов, имеющих в своем составе медь [Си (I)] и кобальт [Со (III)]. Для проявления острой токсичности структура лиганда не играла принципиальной роли, но тем не менее обращает на себя внимание тот факт, что у комплексов с титаном, содержащих в качестве лиганда только эскулетин (PQ915, PQ91O, PQ911) LD 50 B целом выше, чем у титан-содержащих комплексов с ацетилцистеином и эскулетином (PQ 907, PQ 908). Таким образом, десять из двенадцати исследованных соединений являются низкотоксичными веществами. Кроме того, сравнительная оценка острой токсичности показала, что титан-содержащие комплексы являются в целом менее токсичными, чем комплексы с кобальтом, медью и цинком.

2. Изучение влияния металлсодержащих комплексных соединений на основе N-аиетилиистеина и эскулетина на острое воспаление ( каррагенин-, гистамин- и ПАФ- индуцированные отеки лапы крысы)

Поскольку воспалительный процесс является основным звеном патогенеза ХОБЛ (Busse W.W., 1993; Чучалин А.Г., 1997, Федосеев Г.Б., 1998; Holgate S.T. et al., 1991), нам представлялось важным выяснить, могут ли изучаемые ХС влиять на развитие острого и хронического воспаления. Так как обязательной составной частью воспалительного процесса является экссудация, нами были выбраны традиционные модели острого воспаления - модели отеков, индуцируемых каррагенином, гистамином и ПАФ

Изучаемые ХС вводили внутрижелудочно за 1 час до введения флагогена в дозе 10 мг/кг, эквимолярной терапевтической дозе индометацина - традиционного нестероидного противовоспалительного средства, который был использован в качестве препарата сравнения. Как показывают результаты экспериментов, представленные на рис. 1,

исследуемые ХС в разной степени тормозят развитие каррагенин-индуцированного отека лап крыс при внутрижелудочном введении. Наиболее высокую активность проявили производные эскулетина, содержащие титан - PQ 910, PQ 911 и PQ 908, PQ 907: торможение отека лапы составило 69%, 59%, 58% и 50%. Они не уступали по эффективности индометацину и диклофенаку натрия (торможение отека последними составило 65%, и 56%, соответственно). Комплексные производные ацетилцистеина, содержащие цинк и титан, проявили слабую активность: PQ 903, PQ 902^ 901, PQ 886, PQ 897 незначительно тормозили (на 15-25%) развитие каррагенин -индуцированного отека. Надо отметить, что указанные выше титан-содержащие производные эскулетина превосходили по степени влияния на каррагениновый отек комплексные соединения - PQ901 и PQ886, содержащие другой металл (цинк) и иной лиганд (ацетилцистеин). С другой стороны, не отмечено какого -либо статистически значимого различия в эффектах среди PQ 910, PQ 911 и PQ 908, PQ 907. Хотя у данных комплексов лиганды не идентичны, тем не менее в отношении отека они проявили одинаковый уровень активности.

Рис.1 Влияние новых комплексных производных ацетилцистеина и эскулетина в сравнении с индометацином (внутрижелудочное введение в дозе, эквимолярной 10 мг/кг индометацина за 1 час до и 1 час после флогогена) на каррагенин-индуцированный отек лап крыс (М+м). Примечание: * - р<0,01 по отношению к контролю (5% раствор крахмала)

Как известно, гистамин играет важную роль в развитии воспалительной реакции. В связи с этим нам представлялось целесообразным исследование влияния PQ 910, PQ 911, PQ 908, PQ 907, PQ 903, PQ 902^ 901, PQ 886, PQ 897 на развитие гистамин-индуцированного отека лап крыс. Исследуемые соединения вводили в дозе 10мг/кг за 30 мин. до индукции отека гистамином. Результаты измерения объема лап до и после введения веществ показали, что изучаемые соединения не влияли на развитие отека лап крыс, индуцированного гистамином. Такой результат может быть обусловлен либо особенностями механизма действия веществ (в частности, отсутствием способности тормозить выброс гистамина) либо особенностями их фармакокинетики.

В патогенезе острого отека важную роль играют не только биогенные амины, но и другие медиаторы воспаления. К ним следует отнести, в первую очередь, метаболиты циклооксигеназного и липоксигеназного путей метаболизма арахидоновой кислоты. Их участие и степень влияния новых веществ на данный тип медиаторов позволяет оценить такая модель, как ПАФ-индуцированный отек лапы крыс. Результаты эксперимента, представленные на рис. 2, позволяют сделать вывод об эффективности испытанных соединений в условиях данной модели. PQ-911, PQ-907 и PQ-910 существенно тормозят развитие отека (на 38%, 48% и 45%, соответственно), но уступают PQ510 (взятому для сравнения с PQ-911, PQ-907 и PQ-910), проявившему наибольшую эффективность (торможение отека составило 65%, что соответствовало эффекту индометацина). Поскольку PQ510 тоже представляет собой титан-и магний содержащий комплекс, но имеющий в качестве лиганда аскорбиновую кислоту (титанил-аскорбат магний), то этот результат представляет особенный интерес, так как позволяет предположить связь противовоспалительного эффекта веществ данного химического ряда с определенной молекулярной структурой. Полученный нами результат находится в соответствии с данными другого исследования, в котором была продемонстрирована высокая противовоспалительная активность указанного вещества (Ковалева В.Л., Алейникова Т.Ю. Парфенов Э.А., .2002). В условиях данной модели титан-содержащие производные ^ацетилцистеина уступают по своей активности титан-содержащим производным аскорбиновой кислоты ^510).

Рис. 2. Торможение ПАФ-индуцированного отека лап крыс соединениями, PQ-907, PQ-910, PQ-911 в сравнении с PQ-510 и индометацином (М±т) * - р<0,01 по отношению к контролю; ** - р<0,01 по отношению к другим ХС

Таким образом, в серии проведенных опытов установлено, что некоторые из исследуемых соединений значительно тормозят развитие острого отека лап крыс при внутрижелудочном введении. Причем на модели каррагенин-индуцированного отека лап крыс PQ 910, PQ 911, PQ 907 и индометацин, проявляли одинаковую эффективность, a PQ 901, PQ 902 и 903 были менее активными в условиях данной модели. На модели ПАФ-индуцированного отека лап крыс наиболее активными оказались PQ 910, PQ 911. При сравнении эффективности этих соединений в условиях моделирования двух вариантов острого воспаления можно видеть, что более значительно активность ХС проявляется на модели каррагенин-индуцированного отека лап крыс, что свидетельствует о

более избирательном торможении простагландиновой фазы каррагеннинового отека данными соединениями. Высокая эффективность Рр 910, Рр 911 на двух моделях острых отеков -ПАФ-индуцированного и каррагенинового - возможно, связана с особенностями их фармакодинамики, что предстоит изучить в дальнейшем.

Важно подчеркнуть, что индометацин, взятый в эквимолярной концентрации с исследуемыми веществами -10 мг/кг, вызвал желудочно-кишечное кровотечение через 24 часа после внутрижелудочного введения, а спустя 72 часа привел к гибели всех животных этой группы (100%). В случае использования изучаемых комплексных производных ацетилцистеина и эскулетина каких-либо токсических эффектов веществ не было отмечено.

Таким образом, результаты данных экспериментов показывают, что новые металло-комплексные производные ацетилцистеина и эскулетина являются малотоксичными соединениями со значительной противовоспалительной активностью. У исследуемых соединений имеется определенная специфичность в выраженности противовоспалительных эффектов, выявленных на различных моделях острого воспаления. Они, очевидно, воздействуют на определенный спектр медиаторов воспаления: простагландины (каррагениновый отек) и лейкотриены (ПАФ - индуцированный отек), но не гистамин. 3. Исследование влияния РО на сефадекс-индуиированное воспалениелегкихкрыс

В данном разделе работы мы исследовали влияние некоторых

активных Рр (титансодержащих соединения с разными лигандами -

Рр 910 (лиганд: эскулетин и Рр908 (лиганд:

ацетилцистеин+эскулетин) на сефадекс-индуцированное воспаление

17

легких у крыс Вистар. Основанием для этих исследований явились результаты предыдущих опытов, полученные на моделях острого воспаления, и предположение, что металлсодержащие комплексы с ацетилцистеином и эскулетином могут тормозить воспалительный процесс в легких. Для этих исследований была выбрана модель 7-дневного нейтрофильного сефадекс-индуцированного воспаления легких у крыс Вистар, поскольку она адекватна тем патологическим изменениям в легких, которые наблюдаются на определенной стадии развития болезни при хроничесом бронхите и ХОБЛ ( Ковалева В.Л. и др 1995; Ковалева В.Л. 2001).

Результаты показали, что у интактных крыс межальвеолярные перегородки были тонкие, легочная паренхима равномерно воздушная, эпителий бронхов без дистрофических изменений; в бронхоальвеолярном смыве (БАС) преобладали макрофаги. Модель. При морфометрической оценке показатель объемной плотности эмфиземы (острой обструктивной) у крыс, которым ингалировали сефадекс, был в 4,3 раза выше, чем у интактных животных. Относительная объемная плотность альвеолита составила -19,6±2,5% от общей площади легкого (рис.3). Выявлены отек паренхимы легкого и выраженная диффузная инфильтрация её нейтрофилами. Количество нейтрофилов в межальвеолярных перегородках было в 9,6 раза выше, чем в интактном контроле (р<0,01). При цитологическом исследовании БАС отмечены достоверное нарастание цитоза, количества лимфоцитов и резко повышенное содержание нейтрофилов (рис.4). Реакция бронхоассоциированной лимфоидной ткани на введение сефадекса также динамично нарастала (рис.5). Таким образом, через 7 суток после ингаляции сефадекса (модель) в легких выявлялись острый бронхит, нейтрофильный альвеолит, множественные мелкие очаги

18

дистелектазов, эмфизема, гиперплазия бронхоассоциированной лимфоидной ткани.

PQ908 при ингаляционном способе введения с помощью небуляйзера в дозах 5 и 10 мг/кг (в течение 6 суток, однократно в сутки) вызывал значительное уменьшение распространенности альвеолита и эмфиземы по сравнению с нелечеными животными: объемная плотность альвеолита и эмфиземы при воздействии PQ908 в дозе 10 мг/кг снизились в более, чем в 3 и 6 раз, соответственно (р<0,01). Этот эффект был дозозависим,: показатели объемной плотности уменьшились в 2,2 и в 4 раза по сравнению с контролем (модель) (р<0,01). По данным исследования БАС у контрольных и леченых PQ908 крыс, выявлено снижение в 2 раза процентного содержания лимфоцитов и нейтрофилов при использовании дозы вещества 10 мг/кг (р<0,05). Морфометрический анализ показал, что достоверно снижалось количество нейтрофилов не только в БАС, но и в паренхиме легкого (р<0,05). Ингаляционное введение PQ908 вызывало снижение показателей объемной плотности бронхоассоциированной лимфоидной ткани, более выраженное для дозы 10 мг/кг, то есть подавляло гиперреактивное состояние БАЛТ-ткани, вызванное ингаляцией сефадекса.

Титан-содержащее комплексное соединение PQ -910 в дозах 5 и 10 мг/кг (в течение 6 суток ежедневно 1 раз в сутки) также оказывал противовоспалительное действие, но менее выраженное при сравнении с предыдущими результатами. Показатель объемной плотности альвеолита был на уровне аналогичного показателя, полученного при ингаляционном введении PQ-910 : 8% в случае использования дозы 5 мг/кг и 5,7 % - дозы 10 мг/кг против 14,6% в контроле (р<0,01). Что касается показателя эмфиземы, то он изменился в меньшей степени. Те же закономерности выявлены и

при цитологическом изучении БАС: достоверно снижалось лишь содержание лимфоцитов (13 и 10% против 20% в контроле), а количество нейтрофилов практически не отличалось от контрольных значений (17,3 и 16,4% в опыте и 16% в контроле). Уменьшению содержания лимфоцитов в БАС под воздействием Рр 910 соответствовало снижение показателя объемной плотности бронхоассоциированной лимфоидной ткани, отмеченное при использовании вещества в обеих дозах.

В отдельном эксперименте было проведено сравнение морфологической характеристики легких крыс Вистар после аэрозольного воздействия Рр908 в дозе 10 мг/кг, ацетилцистеина 10 мг/кг и будесонида 200 мкг/кг, который был выбран в качестве препарата сравнения как типичный ингаляционный кортикостероид.

Будесонид (50 и 200 мкг/кг). В легких крыс, леченных будесонидом, по сравнению с контролем выявлены значительно менее выраженные проявления острого альвеолита с гранулематозным компонентом и очаговой компенсаторной эмфиземы. Морфометрическая оценка выявила выраженное снижение объемной плотности альвеолита и эмфиземы. В БАС отмечено снижение цитоза в 2,9 и в 3,4 раза, соответственно; дозозависимое снижение содержание нейтрофилов и лимфоцитов. Объемная плотность лимфоидных фолликулов в стенке бронхов составила: 33 ±2,0 и 25± 1,2 против 39,2± 1,6 (р<0,05) в интактном контроле.

Ацетилцистеин (10 и 25 мг/кг) При ингаляционном пути введения препарата объемная плотность альвеолита снизилась в 1,2 раза, а эмфиземы в 1,3 раза ; при пероральном пути - в 1,5 и 1,4 раза, соответственно (р<0,05). В отличие от Рр908 и будесонида АСС не уменьшал цитоз и лишь несколько снижал процентное и абсолютное

20

содержание нейтрофилов в БАС. Кроме того, не отмечено статистически значимого снижения показателя объемной плотности лимфоидных фолликулов. Следовательно, будесонид условиях модели бронхоальвеолита, проявлял типичный для ингаляционного кортикостероида мощный противовоспалительный эффект, а ацетилцистеин оказывал слабое противовоспалительное действие, уменьшая, в основном, экссудативный компонент воспалительной реакции.

контроль сефадеке Р0 908 5шэТ(д РО 90в Юпфкв Р09Ю5тдЛсд Р091010тд/кд

Примечание * р<0 01 отноемтельноконтроля (сефадекс)

РисЗ. Морфометрические данные легочной паренхимы крыс Вистар после аэрозольного введения исследуемых препаратов (М-тА

Рис 4 Показатели цигозв БАЛ после аэрозольного введения исследуемых препаратов на модели бронхоальвеолита (М+м)

ГОвЯЪДО №Ю<«пдч К>*еяя»Ч *0«101в«фф

Рис 5 Морфометрическая характеристика броихоассоциирбваннои лимфоиднои ткани крыс Вистар после аэрозольного введения исследуемых показателей (М±м)

Таким образом, на основании полученных результатов морфологического, морфометрического и цитологического исследований можно сделать вывод, что Рр908 при аэрозольном способе введения (курсовое введение в течение 6 дней) вызывает значительное подавление активности и распространенности подострого воспалительного процесса в легких с выраженным нейтрофильным компонентом. Противовоспалительная активность Рр910 при аналогичном введении в условиях данной модели тоже проявляется, но выражена в меньшей степени. В отличие от Рр908 и Рр910 ацетилцистеин оказывал небольшое противовоспалительное действие.

Сравнение противовоспалительной активности в условиях данной модели Рр908 и Рр910 представляет большой интерес, так как эти вещества содержат одинаковый металл - титан (IV), но различаются по химическому составу лиганда: у Рр908 в молекуле лиганда содержится кроме ацетилцистеина эскулетин (кумарин), а лиганд Рр910 представлен только ацетилцистеином. Следовательно, можно сделать вывод, что наличие эскулетина в лиганде титансодержащего комплекса усиливает его противовоспалительные свойства. Хотя по выраженности противовоспалительного действия Рр уступает референтному препарату будесониду, тем не менее этот эффект Рр908 и Рр910 следует расценивать как значительный.

Изучение антиоксидантных свойств PQ на модели бронхоалъвеолита у крыс.

Хорошо известно, что аминотиолы являются сильными антиоксидантами (РагТепоу й а1 2003), поэтому представляло интерес изучить влияние Рр908 и Рр910 на некоторые показатели антиокислительной системы (СОД и в8И) в условиях модели бронхоальвеолита. О состоянии ПОЛ судили по уровню малонового

диальдегида (МДА). Кроме того, использовали такой показатель функциональной активности нейтрофилов, как содержание в крови миелопероксидазы.

Как следует из рис.6, оба вещества - PQ 908 и PQ 910 - как и препарат сравнения АСС, нормализовали уровни FSH и МАД. Кроме того, они подавляли гиперпродукцию МПО нейтрофилами и увеличивали содержание супероксиддисмутазы. Эти результаты свидетельствуют о значительной антиоксидантной активности обоих PQ, проявляющейся на уровне референтного препарата. Следует отметить, что данный вид активности был сильнее выражен у PQ 908, чем у PQ 910, что свидетельствует, по-видимому, о значительной антиоксидантной активности не только ацетилцистеина, но и эскулетина.

4. Исследование противокашлевой активности РО на моделях кашля, индуиированного лимонной кислотой и капсаицином

По результатам тестирования были выделены высокореактивные животные (количество кашлевых толчков 28,9+2,26). В предварительных экспериментах было показано, что терапевтические дозы Рр, в которых препараты способны оказывать противокашлевое действие при ингаляционном пути введения, находятся в диапазоне 10- 25-50-100 мг/кг. Результаты влияния Рр 911, Рр 908, Рр 903, Рр 907, Рр 897 на кашлевую реакцию морских свинок показали что изучаемые ХС обладают способностью, выраженной в разной степени, подавлять кашель у морских свинок, индуцированный лимонной кислотой. Так, Рр 911 в дозе 25 мг/кг тормозил данную кашлевую реакцию на 11 - 24% (в разных опытах). Более значительным оказался противокашлевой эффект у Рр 903, Рр 897, Рр 908, Рр 907, которые в одной и той же дозе 25 мг/кг подавляли кашель у морских свинок на 20,8%,. 37%, 46 и 57,8%, соответственно. У тестированных веществ противокашлевой эффект, как правило, носил дозозависимый характер и достигал с повышением дозы до 100 мг/кг значительной величины (торможение кашля 76-80%). При сравнительном исследовании с референтным препаратом (фенспиридом) Рр 908 уступает препарату сравнения -фенспириду.Торможение кашлевой реакции (%) в ряду Рр 911, Рр 908, АСС, фенспирид составило: 11,2 ± 0,1; 58,3 ± 7,3; 42,15 ± 8,3; 76,1 ± 9,2, соответственно (рис.7).

Влияние металлокомплексных соединений на показатели кашлевой реакции морских свинок, индуцированной капгаицииом в сравнении с морфином гидрохлоридом в дом ЮмкЛкг

Как следует из представленного рисунка, исследованные вещества также существенно ослабляют кашель, вызванный капсаицином. После воздействия PQ 911 и PQ910 количество кашлевых толчков снижалось с 11,3±0,93 и 11,63+1,0 до лечения до 6,3±0,63 и 6,13+0,81 после лечения, соответственно. (р<0,001) .Следовательно, торможение кашля под влиянием PQ составило 42,96±4,77% и 46,78±5,11%. Следует отметить, что PQ тормозил кашель, вызванный капсаицином, менее значительно, чем кашель, вызванный лимонной кислотой (рис.8).

Рис 8.

Сравнение торможения кашлевой реакции, вызванной у морских свинок лимонной кислотой и капсаицином под влиянием PQ 911 (М+т)

Очевидно, необходимо учитывать тот факт, что при ингаляции капсаицина отмечается развитие каскада реакций с участием ряда провоспалительных нейропептидов, и прежде всего, субстанции Р, что в свою очередь способствует развитию нейрогенного воспаления и включению дополнительных путей реализации кашлевого рефлекса. По-видимому, в этом случае применение противокашлевых препаратов с центральным механизмом действия, оказывается неэффективным, что подтверждается также и литературными данными (Schroeder К., 2002. Eccles R, et ai. 1992). Таким образом, некоторые металлокомплексные производные вызывали отчетливый противокашлевой эффект. Можно предположить, что их способность подавлять кашель обусловлена модифицирующим влиянием на центральные и периферические рецепторы.

5. Исследование_муколитических_свойств_новых

металлокомплексных препаратов.

Хорошо известно, что АСС является сильным муколитиком, средством со значительным влиянием на мукоцилиарную систему. В связи с этим предстояло выяснить, каким образом модификация молекулы АСС с помощью титана может изменить муколитическую активность препарата. Результаты исследования показали, что изучаемые соединения в равной степени проявляют муколитическую активность, однако степень ее выраженности статистически значимо не отличается от препарата сравнения - АСС. Так, PQ 897, PQ 907, PQ 908, содержащие в качестве лиганда N-ацетилцистеин, увеличивают объем бронхиальной слизи и снижают ее вязкость, в то время как PQ 910 PQ 911 PQ 915, содержащие в качестве лиганда эскулетин, не влияли на объем и качество бронхиальной слизи. На основании этих данных можно сделать вывод, что муколитические свойства АСС обеспечиваются ацетилцистеином и что модификация молекулы ионом титана не изменяет этих свойств.

б.Исследование протективных свойств РО 908. PQ. 910, РО 911 на модели антиген-индуцированного бронхоспазма у морской свинки

В необходимости проведения данных исследований мы исходили из более ранних наблюдений, показавших, что металлокомплексные соединения, в состав которых входили такие лиганды, как кумарины, а в качестве металлов медь, цинк, титан и ванадий, в модельных системах in vitro способны предупреждать развитие антиген-индуцированной контрактуры изолированной трахеи сенсибилизированной морской свинки в ответ на антиген (Ковалева В.Л. 1997; Алейникова Т.В., 2002).

Исследуемые нами ХС являются водорастворимыми, что позволяет ингалировать их при помощи небуляйзера в различных дозах от 1 до 25 мг/кг. минут. Представленные на рис данные свидетельствуют, что PQ 908 , PQ 910, PQ 911 при введении через небуляйзер в дозах 1-5-10-25 мг/кг дозозависимо ингибировали развитие бронхоспастической реакции у сенсибилизированных морских свинок. Максимальное торможение бронхоконстрикторной реакции (65-80%) по отношению к контролю вызывала ингаляция ХС в дозе 25 мг/кг. Следует отметить, что эффект PQ 908 был более выражен, чем PQ 910 и PQ 911, что позволяет предположить участие в реализации протективного эффекта природного кумарина -эскулетина. По выраженности этого эффекта металлокомплексные соединения уступали ингаляционному кортикостероиду будесониду, который проявлял эффект в низких дозах 30-40 мкг/мл (рис.9).

1 контроль ■ РО 908

□ РО 911

□ РО 910

■будесонид 30 мкг/мл

Примечание: * - р<0,01 по сравнению С контролем

Рис.9. Влияние металлокомплексных соединений (различные дозы) при ингаляционном способе введения на развитие антиген-индуцированного бронхоспазма V актиюго имшиягжтоваииых шикжих аяинвж

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основанием для целенаправленного изучения нового класса химических веществ — металлокомплексных соединений, синтезированных на основе N ацетилцистеина и природного кумарина -эскулетина, где в качестве металлов-комплексообразователей использованы металлы переходной группы (титан, цинк, медь, кобальт), явилась недостаточная эффективность традиционных фармакологических средств, используемых при лечении хронических обструктивных заболеваний легких. Ранее в работах В.Л. Ковалевой (1996-2001 гг.) были исследованы комплексные (на основе кумарина) соединения с медью, кобальтом, цинком и марганцем, часть которых показали значительную противовоспалительную активность. В связи с этим мы провели поиск среди новых металлокомплексных соединений с другими металлами-комплексообразователями и другими лигандами (ацетилцистеина и эскулетина) на экспериментальных моделях воспаления, кашля и бронхоконстрикции т лето.

Анализ экспериментальных данных показал, что все исследуемые металлокомплексные соединения, в той или иной степени обладают противовоспалительными свойствами (на моделях острых отеков), особенно комплексы с титаном, содержащие в своей структуре в качестве лиганда эскулетин, оказавшиеся к тому же наименее токсичными веществами. В дальнейшем нами было показано, что титан-содержащие комплексы Рр-910, Рр-908 при аэрозольном введении в дозах 5-10 мг/кг существенно ингибируют нейтрофильное воспаление в стадии хронизации в легких крыс

Одним из предполагаемых механизмов противовоспалительного действия металлокомплексов может быть ингибирование окислительного стресса в тканях. Кроме того, нельзя исключить и

30

влияние исследуемых ХС на ФДА цАМФ, Са2+- и СГ-каналы гладкомышечных клеток, их антагонизм с другими видами рецепторов (Ковалева В.Л., 1997). Нами показано, что PQ-910, PQ-908, PQ-915 проявляют существенную антиоксидантную активность, так как снижают уровень МДА и миелопероксидазы и повышают содержание СОД.

В условиях модели цитрат - и капсаицин-индуцированного кашля у морских свинок исследуемые PQ проявляют противокашлевую активность, выраженную в разной степени, оказывая больший эффект на кашлевую реакцию морских свинок, индуцированную лимонной кислотой, чем капсаицином, но уступая по эффективности фенспириду. По выраженности муколитической активности исследованные PQ существенно не отличаются от препарата сравнения АСС. Это свидетельствует о том, что муколитические свойства PQ 910 PQ 911 PQ 915 обеспечиваются ацетилцистеином и что модификация молекулы ацетилцистеина ионом титана не изменяет этих свойств.

Нами установлено, что металлокомплексные соединения способны эффективно предупреждать индуцированное овальбумином сокращение гладкой мускулатуры бронхов морской свинки in vivo, уступая однако по эффективности препарату сравнения - будесониду, который проявлял эффект в низких дозах 30-40 мкг/мл. В условиях использованной нами модели - антиген-зависимой бронхоконстрикции - эффект PQ 908 был более выражен, чем PQ 910 и PQ 911, что позволяет предположить участие в реализации протективного эффекта природного кумарина - эскулетина.

Таким образом, в результате проведенного поиска среди металлокомплексных соединений, содержащий титан, цинк кобальт выявлены фармакологически активные соединения PQ-908, PQ 910 и

31

Рр 911, обладающее выраженными противовоспалительными, муколитическими и бронхопротективными свойствами. Исследование особенностей действия новых металлокомплексных соединений показало, что их терапевтические эффекты реализуются через различные механизмы и проявляются в условиях патологически измененных дыхательных путей, вызванных повреждением респираторного эпителия и активной иммунизации животных, что позволяет рассматривать титан- и цинк-содержащие комплексные соединения, в первую очередь Рр-908, Рр 910 и Рр 911 в качестве перспективных химических соединений для разработки на их основе новых лекарственных средств для лечения ХОБЛ.

выводы

1. Впервые показано, что изученные металлокомплексные соединения с титаном и цинком на основе К-ацетилцистеина и природного кумарина-эскулетина обладают выраженной биологической активностью. По параметрам острой токсичности 10 из 12 соединений (Рр-902, Рр-903, Рр-886, Рр-901, Рр-908, Рр-897, Рр-907, Рр-915, Рр-910, Рр-911) следует отнести к веществам 1У-У классов опасности.

2. Впервые продемонстрировано, что металлокомплексные соединения с титаном на основе К-ацетилцистеина и эскулетина (Рр-908, Рр-910) при ингаляционном введении в условиях моделирования нейтрофильного воспаления легких проявляют значительную противовоспалительную и антиоксидантную активность, превосходящую эффективность самого N ацетилцистеина, но менее выраженную, чем у будесонида.

3. Показано, что металлокомплексные соединения с титаном на основе К-ацетилцистеина и эскулетина в условиях моделирования экссудативного воспаления ингибируют острофазовый ответ тканей.

4. Установлено, что металлокомплексные соединения с титаном и цинком на основе К-ацетилцистеина и эскулетина на моделях кашля, индуцированного лимонной кислотой и капсаицином, при ингаляционном введении проявляют существенную противокашлевую активность, менее выраженную, чем у препарата сравнения фенспирида. По муколитической активности

изучаемые соединения сопоставимы с препаратом сравнения -ацетил цистеином.

5. Металлокомплексные соединения с титаном на основе N-ацетилцистеина и эскулетина оказывают значительное протективное действие на модели антиген-индуцированной бронхоконстрикции у иммунизированных морских свинок in vivo.

6. Проведенные исследования позволяют расценивать химический класс - титан и цинк-содержащих комплексных соединений на основе N-ацетилцистеина и природного кумарина-эскулетина как перспективный для дальнейшего поиска химических веществ с противовоспалительной, антиоксидантной и муколитической активностью. Наиболее активные соединения эскулетина (PQ-908, PQ-910, PQ-911) могут служить основой для разработки в качестве потенциальных лекарственных средств для лечения хронических бронхообструктивных заболеваний.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

• Фролов В.Г. Исследование противовоспалительной и антиастматической активности новых металлокомплексных производных N-ацетилцистеина и кумарина на моделях воспаления и бронхоспазма in vivo/ В.Г.Фролов,

B.Л.Ковалева, Э.А.Парфенов и др.// Аллергология и иммунология. -2ОО4.-т.5.-№. 1.-С79 -80.

• Ковалева В.Л. Исследование эффективности новых производных ацетилцистеина на моделях кашля/ ВЛ.Ковалева, В.Г.Фролов, Д. Б.Утешев, Л.Д.Смирнов: тез. докл. XIII национального конгресса по болезням органов дыхания (2003, г, Санкт-Петербург). Пульмонология. -Сборник резюме- С.329.

• Ковалева В. Л. Влияние ингаляционного воздействия оригинальных производных холина и ацетилцистеина на неиинфекционнное воспаление легких в эксперименте/ В.Л Ковалева, В.Г.Фролов Е.М. Носейкина: тез. докл. XI национального конгресса «Человек и лекарство» (2004, Москва)- С.797.

• Ковалева В.Л. Патогенетические механизмы кашля/ В.Л. Ковалева, Д. Б.Утешев, В.Г.Фролов // Курский Научно-практический вестник «Человек и его здоровье» -2004 -№1 -

C.ЗО-33.

• Ковалева В.Л.Фармакологический контроль непродуктивного упорного кашля / В.Л.Ковалева, Д. Б.Утешев, В.Г.Фролов // Курский Научно-практический вестник «Человек и его здоровье» -2004-№1-С.34-37.

• Утешев Д.Б. Особенности состояния холинергического рецепторного аппарата при ХОБЛ и возможность фармакологической коррекции / Д. Б.Утешев, В.Л.Ковалева, В.Г.Фролов// Лечебное дело-2004-№4- С.36-41.

Усл. печ.л. 1,5, Гарнитура "Таймс" Тираж 100 экз. Заказ 35. Отпечатано в Раменской типографии с готового оригинал-макета. Тел.(095)517-55-15

' ■■-и ¿.л

1737

Актуальность исследования. По современным представлениям, хронические обструктивные болезни легких (ХОБЛ) включают гетерогенную по своей природе группу легочных заболеваний (эмфизема, хронический обструктивный бронхит, бронхоэктатическая болезнь, муковисцидоз и др.), которые объединяет расстройство функции внешнего дыхания легких по обструктивному типу (Чучалин А.Г., 1998; Barnes P.J., 2001; Izumi Т., 2002; Pride N., 2002).]. ХОБЛ в настоящее время относится к числу наиболее распространенных заболеваний в промышленно развитых странах и занимает 4-е место среди ведущих причин летальных исходов. Постоянное увеличение смертности от ХОБЛ особенно характерно для последнего десятилетия [Чучалин А.Г., 2004].

В России эта группа заболеваний находится на первом месте по распространенности среди хронических болезней органов дыхания и составляет 15073 случаев на 100 тыс. населения (Чучалин А.Г.,2000). Этому способствует не только широкое распространение курения и глобальная неблагоприятная экологическая обстановка, но и трудность диагносцирования и резистентность во многих случаях к традиционной терапии. В основе патогенеза ХОБЛ лежит развитие воспаления стенок бронхов, эмфизема, поражение легочной паренхимы, что находит свое выражение в клинической картине формирования бронхообструктивного синдрома, проявляющегося кашлем, одышкой и нарушением отхождения мокроты (Barnes Р., 2003; Vestbo J., 2001; Ward S.A., Casaburi К., 2001; Wilkens H., Sybrecht G.W., 2001).

Современный арсенал лекарственных средств для лечения ХОБЛ включает в себя, в основном, противовоспалительные (фенспирид, глюкокортикостероиды), бронхолитические (формотерол, сальметерол) и муколитические препараты (ацетилцистеин, карбоцистеин) (Чучалин А.Г., 2002; Шмелев Е.И., 2003; Jeffery Р.К, 2001; Maestrelli P. et al., 2001; Roche N. et al, 2001). Однако плохая переносимость во многих случаях указанных препаратов и их низкая эффективность при средних и тяжелых вариантах течения ХОБЛ диктует необходимость разработки новых лекарственных средств, обладающих иными механизмами действия.

Ранее было показано (Ковалева В.Л., 1997; Ковалева В.Л., Алейникова Т.Ю. 2002), что некоторые комплексные соединения переходных металлов (Си, Zn, Мп, Со) на основе кумариновых и родственных лигандов обладают выраженными противовоспалительными и бронхолитическими свойствами. Это обстоятельство побудило нас к изучению новых представителей этого класса химических соединений, имеющих в своем составе другие металлы-комплексообразователи (например, титан) и различные лиганды на основе ацетилцистеина и природного кумарина -эскулетина.

Целью данной работы явилось изучение фармакодинамических свойств новых комплексных производных ацетилцистеина и природного кумарина эскулетина на экспериментальных моделях острого и подострого воспаления, кашля и бронхоспазма. Для достижения цели были поставлены следующие основные задачи:

1. Изучить противовоспалительную эффективность исследуемых соединений на моделях острого воспаления in vivo.

2. Оценить активность новых металлокомплексных соединений на модели сефадекс-индуцированного воспаления легких у крыс Вистар и определить их антиоксидантные свойства.

3. Исследовать противокашлевые свойства наиболее активных соединений на моделях кашля, индуцированного лимонной кислотой и капсаицином.

4. Исследовать муколитические свойства новых металлокомплексных соединений

5. Изучить протективные свойства выявленных активных металлокомплексных соединений на модели бронхоконстрикции in vivo.

Научная новизна и теоретическая ценность

В представленной работе впервые продемонстрирована противовоспалительная активность новых оригинальных металлокомплексов с ацетилцистеином и природным кумарином - эскулетином. Показано, что острая токсичность комплексов зависит от того, какой металл входит в состав комплекса. Наименее токсичными оказались комплексы эскулетина с титаном, наиболее токсичными - комплексы ацетилцистеина с медью и кобальтом.

В результате проведенного анализа зависимости "структура - активность" в ряду комплексных соединений ацетилцистеина и эскулетина с титаном было установлено, что наиболее значительную противовоспалительную активность проявляют титановые комплексы с эскулетином. Однако для проявления противокашлевой и муколитической активности необходимо наличие в лигандной части комплекса молекулы ацетилцистеина.

Впервые показано, что в условиях активной иммунизации животных титан-содержащие комплексы с эскулетином и ацетилцистеином проявляют протективную активность в отношении антиген-индуцированной бронхоспастической реакции.

Научно-практическая значимость

Проведенные исследования выявили у оригинальных металлокомплексных соединений ацетилцистеина и эскулетина с титаном (PQ-910, PQ-908, PQ-911, PQ-915) высокую противовоспалительную и противокашлевую активность, что дает возможность рассматривать полученные результаты экспериментов как основу для дальнейших (фармакодинамических, токсикологических, фармакокинетических) исследований ХС с целью разработки в перспективе лекарственных препаратов. Новые металлокомплексные соединения (PQ-910, PQ-908, PQ-911) выгодно отличаются от препаратов сравнения рядом свойств: большой широтой терапевтического действия, проявлением эффективности в условиях активной иммунизации, а также сочетанием противовоспалительных, антиоксидантных, муколитических противокашлевых свойств, являющихся наиболее важными при лечении хронических бронхообструктивных заболеваний.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что изученные металлокомплексные соединения с титаном и цинком на основе N-ацетилцистеина и природного кумарина-эскулетина обладают выраженной биологической активностью. По параметрам острой токсичности 10 из 12 соединений (PQ-902, PQ-903, PQ-886, PQ-901, PQ-908, PQ-897, PQ-907, PQ-915, PQ-910, PQ-911) следует отнести к веществам IV-V классов опасности.

2. Впервые продемонстрировано, что металлокомплексные соединения с титаном на основе N-ацетилцистеина и эскулетина (PQ-908, PQ-910) при ингаляционном введении в условиях моделирования нейтрофильного воспаления легких проявляют значительную противовоспалительную и антиоксидантную активность, превосходящую эффективность самого N-ацетилцистеина, но менее выраженную, чем у будесонида.

3. Показано, что металлокомплексные соединения с титаном на основе N-ацетилцистеина и эскулетина в условиях моделирования экссудативного воспаления ингибируют острофазовый ответ тканей.

4. Установлено, что металлокомплексные соединения с титаном на основе N-ацетилцистеина и эскулетина на моделях кашля, индуцированного лимонной кислотой и капсаицином, при ингаляционном введении проявляют существенную противокашлевую и муколитическую активность, уровень которой одноко не выше, чем у препаратов сравнения.

5. Металлокомплексные соединения с титаном на основе N-ацетилцистеина и эскулетина оказывают значительное протективное действие на модели антиген-индуцированной бронхоконстрикции у иммунизированных морских свинок in vivo.

6. Проведенные исследования позволяют расценивать химический класс - титан и цинк-содержащих комплексных соединений на основе N-ацетилцистеина и природного кумарина-эскулетина как перспективный для дальнейшего поиска химических веществ с противовоспалительной, антиоксидантной и противокашлевой активностью. Наиболее активные соединения эскулетина (PQ-908, PQ-910, PQ-911) могут служить основой для разработки в качестве потенциальных лекарственных средств для лечения хронических бронхообструктивных заболеваний.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основанием для целенаправленного изучения нового класса химических веществ - металлокомплексных соединений, синтезированных на основе N ацетилцистеина и природного кумарина - эскулетина , где в качестве металлов-комплексообразователей использованы металлы переходной группы (титан, цинк, медь, кобальт), явилась недостаточная эффективность традиционных фармакологических средств, используемых при лечении хронических обструктивных заболеваний легких. Об этом свидетельствует тенденция к распространению бронхообструктивных заболеваний легких, утяжеление их течения и появление случаев с летальным исходом (Pedersen S., 1997; Laitinen L.A., 1997). Кроме того, использующиеся бронходилятирующие средства ([З-агонисты, М-холинолитики, спазмолитики миотропного действия) не лишены побочных эффектов, которые часто ограничивают их применение. Так, одним из самых серьезных недостатков р2-адреномиметиков считается то, что они не только не останавливают прогрессирование ХОБЛ, но и становятся в ряде случаев на далеко зашедшем этапе заболевания причиной летальных исходов. Поэтому нам представлялся актуальным поиск новых соединений, обладающих выраженными противовоспалительными и антиоксидантными свойствами. Ранее в работах В. Л. Ковалевой (1996-2001 гг.) были исследованы комплексные (на основе кумарина) соединения с медью, кобальтом, цинком и марганцем, часть которых показали значительную противовоспалительную активность. Однако у этих соединений прогнозировалась высокая токсичность, особенно у комплексов с медью и марганцем. В связи с этим мы провели поиск среди новых металлокомплексных соединений с другими металлами-комплексообразователями и другими лигандами (ацетилцистеина и эскулетина) на экспериментальных моделях воспаления, кашля и бронхоконстрикции in vivo.

Анализ экспериментальных данных показал, что все исследуемые металлокомплексные соединения в той или иной степени обладают противовоспалительными свойствами. Однако комплексы ацетилцистеина с медью и кобальтом проявили высокую токсичность при внутрибрюшинном введении, поэтому в дальнейшей работе были использованы комплексы с титаном и цинком. Причем среди комплексов с титаном самыми активными оказались соединения, содержащие в своей структуре в качестве лиганда эскулетин. С учетом полученных данных для углубленного исследования были выбраны наиболее эффективные и наименее токсичные комплексные соединения с титаном - PQ-910, PQ-908, PQ-911, PQ-915- и цинком. Задачей работы было не только найти вещества с новой химической структурой, эффективно воздействующих на острую фазу воспаления, но и попытаться исследовать их терапевтическую активность при ингаляционном введении на модели неинфекционного 7-14-дневного (сефадекс-индуцированного) воспаления легких у крыс. Нами установлено, что комплексные соединения с титаном - PQ-910, PQ-908, PQ-911, PQ-915-при аэрозольном введении в дозах 5-10 мг.кг существенно ингибируют нейтрофильное воспаление в легких крыс. Наиболее значительный эффект оказали комплексы с титаном, лигандная часть которых представлена либо эскулетином (PQ-910, PQ-911) либо N-ацетилцистеином и эскулетином вместе (PQ-908).

Одним из предполагаемых механизмов противовоспалительного действия металлокомплексов может быть ингибирование окислительного стресса в тканях. Кроме того, нельзя исключить и влияние исследуемых ХС на ФДА цАМФ, Са~ - и СГ-каналы гладкомышечных клеток, их антагонизм с другими видами рецепторов (Ковалева В.Л., 1997). Нами показано, что PQ-910, PQ-908, PQ-911, PQ-915 проявляют существенную антиоксидантную активность, так как снижают уровень МДА и миелопероксидазы и повышают содержание одного из важнейших ферментов антиокислительной системы защиты организма, как СОД .

При изучении влияния новых металлокомплексных соединений на кашель в условиях модели цитрат- и капсаицин-индуцированного кашля у морских свинок оказалось, что исследуемые комплексные соединения проявляют значительную противокашлевую активность. При этом PQ 908 более значительно тормозит кашлевую реакцию морских свинок, индуцированную лимонной кислотой, чем PQ 911. По выраженности противокашлевого эффекта PQ 908 уступает препарату сравнения -фенспириду, однако его активность выше , чем у АСС. Важно отметить, что лиганд в PQ 908 представлен и ацетилцистеином и эскулетином. Возможно, именно этим обстоятельством можно объяснить более выраженную противокашлевую активность PQ 908 по сравнению с PQ 911 и АСС. Аналогичные результаты получны и на модели кашля, индуцированного капсаицином. Исследование муколитической активности указанных PQ показало, что по данному виду фармакологической активности они существенно не отличаются от препарата сравнения АСС. Это свидетельствует о том, что муколитические свойства PQ 910 PQ 911 PQ 915 обеспечиваются ацетилцистеином и что модификация молекулы ацетилцистеина ионом титана не изменяет этих свойств.

Нами установлено, что металлокомплексные соединения способны эффективно предупреждать индуцированное овальбумином сокращение гладкой мускулатуры бронхов морской свинки in vivo, уступая однако по эффективности препарату сравнения - будесониду, который проявлял эффект в низких дозах 30-40 мкг/мл. В условиях использованной нами модели - антиген-зависимой бронхоконстрикции - эффект PQ 908 был более выражен, чем PQ 910 и PQ 911, что позволяет предположить участие в реализации протективного эффекта природного кумарина - эскулетина.

Таким образом, в результате проведенного поиска среди металлокомплексных соединений, содержащий титан, цинк кобальт выявлены фармакологически активные соединения PQ-908, PQ 910 и PQ 911, обладающее выраженными противовоспалительными, противокашлевыми и бронхопротективными свойствами. Исследование особенностей действия новых металлокомплексных соединений показало, что их терапевтические эффекты реализуются через различные механизмы и проявляются в условиях патологически измененных дыхательных путей, вызванных повреждением респираторного эпителия и активной иммунизации животных, что позволяет рассматривать титан- и цинк-содержащие комплексные соединения, в первую очередь PQ-908, PQ 910 и PQ 911 в качестве перспективных химических соединений для разработки на их основе новых лекарственных средств для лечения ХОБЛ.