Исследование на доклиническом уровне иммуносупрессивных эффектов флавоноидов корня солодки.

Албегова, Диана Заурбековна

Диссертации по медицине → Фармакология, клиническая фармакология

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Исследование на доклиническом уровне иммуносупрессивных эффектов флавоноидов корня солодки.

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Албегова, Диана Заурбековна Москва 2011 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.03.06

Автореферат диссертации по медицине на тему Исследование на доклиническом уровне иммуносупрессивных эффектов флавоноидов корня солодки.

Албегова Диана Заурбековна

ИССЛЕДОВАНИЕ ИА ДОКЛИНИЧЕСКОМ УРОВНЕ ИММУНОСУПРЕССИВНЫХ ЭФФЕКТОВ ФЛАВОНОИДОВ КОРНЯ СОЛОДКИ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 О АПР 2011

Москва-2011

4844778

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

кандидат медицинских наук, с.н.с.

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, профессор Николай Львович Шимановский

доктор медицинских наук,

профессор Александр Александрович Ярилин

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава»

Защита состоится «_» мая 2011 года в 14:00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.01 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1.

Автореферат разослан «_» апреля 2011 г.

Иван Генрихович Козлов Светлана Ивановна Павлова

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Потешкина Н.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Переход исследований в медицине на молекулярный уровень привел к накоплению в последние десятилетия многочисленных данных, позволивших детально описать патогенез целого ряда заболеваний. Важнейшим достижением данного этапа исследований стало выявление и характеристика молекул, появление которых либо сопутствует патологическому процессу, либо играет ведущую роль в его возникновении (молекулярные маркеры заболевания и/или «патологические молекулы»). Принципиальное изменение ситуации произошло в связи с завершением интенсивных исследований в иммунологии, биотехнологии и молекулярной биологии. В результате развития этих областей сформировалась унифицированная идеология, так называемой, прицельной или мишень-направленной терапии. В связи с этим поиск новых таргетных лекарственных средств, способных селективно корригировать ключевые звенья патогенеза того или иного заболевания приобретает все большую актуальность.

Одним из перспективных направлений в этой области является разработка менее токсичных и более специфичных иммуносупрес-сивных лекарственных средств. В настоящее время в качестве имму-носупрессантов широко используются цитостатики, глюкокортикосте-роиды и ингибиторы кальциневрина. Цитотоксические противоопухолевые препараты (иммуносупрессанты первого поколения) неизбирательно воздействуют на любые клетки, находящиеся в процессе деления. Этим объясняется наличие у этого класса лекарственных препаратов большого числа побочных эффектов. Внедрение ингибиторов кальциневрина (циклоспорин А, такролимус) явилось важным шагом в направлении создания более избирательных препаратов, однако побочные эффекты этого класса лекарственных средств все еще значительны. В тоже время идеальный иммуносупрессант должен обладать избирательным действием на отдельные субпопуляции лимфоцитов, не вызывая повреждения как других клеток организма, так и клонов лимфоцитов, осуществляющих реакции противоинфекционно-го и противоопухолевого иммунитета. Иначе говоря, действие препарата должно быть направлено преимущественно на антиген-специфические клетки, принимающие участие в патологических реакциях приобретенного иммунитета. В настоящее время на роль идеального иммуносупрессанта претендуют моноклональные антитела (МАТ), ингибиторы внутриклеточных сигнальных молекул и так называемые «переключатели иммунного ответа».

Вещества растительного происхождения всегда являлись интересным источником для создания новых лекарственных средств. Пристальное внимание исследователей в последнее время уделяется изучению флавоноидов - большой группы полифенольных соединений, присутствующих практически во всех высших растениях. Результаты многочисленных исследований демонстрируют, что эти вещества обладают широким диапазоном фармакологических активностей, проявляя противовоспалительные, иммунотропные, антиканцерогенные и другие эффекты [Евстропов А.Н., 2004, Cavani А., 2010, Chang C.L., 2010, Jin S., 2010, Lamoke F., 2011, Singh R.P., 2006]. Изучение механизмов действия флавоноидов на молекулярном уровне показывает, что некоторые их классы (изофлавоны, халконы) способны эффективно ингибировать фосфорилирование, а как следствие и активацию, ключевых молекул сигнальных путей в животных клетках. Ряд работ свидетельствуют об иммуностимулирующем действии некоторых флавоноидов в моделях in vivo [Nworu C.S., 2010, Sakai Т., 2010]. Несмотря на многочисленные исследования иммунотропных эффектов флавоноидов, на сегодняшний день отсутствует единая концепция, объясняющая их механизмы действия.

В связи с этим актуальным является изучение механизмов имму-нотропной активности флавоноидов и экспериментальное обоснование их фармакологической эффективности в моделях на животных.

Цель исследования: изучение на доклиническом уровне имму-носупрессивных эффектов флавоноидов корня солодки (ФКС).

Задачи исследования:

1. Изучить влияние ФКС на индуцированную пролиферацию и оценить проапоптогенный эффект данного препарата по отношению к мито-ген-активированным человеческим и мышиным мононуклеарным клеткам.

2. Оценить влияние ФКС на продукцию цитокинов активированными мононуклеарными клетками мышей.

3. Изучить эффективность ФКС в реакции контактной чувствительности, индуцированной 2,4-динитрофторбензолом у мышей.

4. Исследовать влияние ФКС на пролиферативный ответ и функциональную активность иммунокомпетентных клеток на ранних сроках после сенсибилизации 2,4-динитрофторбензолом.

5. Изучить влияние ФКС на функциональную активность лимфоцитов-эффекторов в реакции контактной чувствительности.

Научная новизна исследования

Впервые было проведено исследование фармакодинамических эффектов флавоноидной фракции экстракта корня солодки в моделях, рекомендованных для доклинического изучения новых фармакологических веществ с иммунотропной активностью.

Впервые был продемонстрирован антипролиферативный эффект ФКС in vitro в отношении митоген-активированных человеческих и мышиных Т-лимфоцитов. Было доказано, что антипролиферативный эффект ФКС не связан с индукцией апоптоза, но обусловлен модулирующим действием на продукцию цитокинов: наблюдается подавление секреции ИЛ-2 и ИФНу, и повышение уровня ИЛ-6 и ИЛ-17.

Впервые было показано, что ФКС ингибирует развитие реакции контактной чувствительности, индуцированной 2,4-динитрофторбен-золом у мышей.

Впервые было показано, что внутривенное введение ФКС на ранних сроках после сенсибилизации 2,4-динитрофторбензолом приводит к снижению, как абсолютного числа клеток регионарных лимфоузлов, так и к подавлению их пролиферативного ответа в системе in vitro. Это коррелирует с изменением цитокинового баланса: наблюдается уменьшение секреции ИЛ-2, ИФНу и ИЛ-4 и увеличение продукции ИЛ-10 и ИЛ-17 клетками регионарных лимфоузлов, что может свидетельствовать о способности флавоноидов солодки переключать ThirTh2 иммунные ответы в процессе развития контактной чувствительности на формирование ТМ7-лимфоцитов.

Впервые показано, что на поздних сроках после ДНФБ-сенсиби-лизации, обработка ФКС суммарной фракции спленоцитов, а также выделенных из нее с помощью иммуномагнитной сепарации Т-клеток, приводит к блокаде адоптивного переноса реакции контактной чувствительности несенсибилизированным сингенным мышам-реципиентам.

Впервые было показано, что блокирующий эффект ФКС не наблюдается в случае обработки CD8* лимфоцитов-эффекторов, выделенных из спленоцитов сенсибилизированных животных. Воспроизведение блокирующего эффекта ФКС, происходит только после обработки С04+-популяции и последующего ее адоптивного переноса совместно с С08-эффекторами несенсибилизированным мышам-реципиентам.

Практическая значимость работы

Совокупность полученных в работе данных углубляет фундаментальные представления о механизмах развития иммунного ответа.

Растительное происхождение, большое количество ранее установленных биологических эффектов, а также выявленные принципи-

ально новые механизмы действия флавоноидов корня солодки открывают перспективу их дальнейшего изучения в качестве иммуносупрес-сивных лекарственных препаратов.

В работе подобран комплекс методов, позволяющих оценивать иммунотропную активность и эффективность новых фармакологических агентов.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и патологии» (Новосибирск, 2010), Национальной конференции: «Аллергология и клиническая иммунология - практическому здравоохранению» (Москва, 2010), 2nd European Congress of Immunology: "Immunity for Life, Immunology for Health" (Berlin, Germany, 2009), V World Congress of Immunopathology and Respiratory Allergy (Tel Aviv, Israel, 2009), VI Georgian Congress of Allergology and Immunology, VI International Congress "Health and Drug" (Tbilisi -Tskhaltubo, Georgia, 2010), III World Asthma & COPD Forum, World Forum of Pediatrics (Dubai, UAE, 2010).

Работа апробирована на совместном заседании кафедры фармакологии педиатрического факультета, кафедры иммунологии МВФ и отдела иммунологии ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Росздрава». По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе в изданиях рекомендованных ВАК РФ - 8.

Внедрение результатов исследования

Результаты диссертации внедрены в учебный процесс на кафедре фармакологии ГОУ ВПО «Севоро-Осетинская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития».

Разработанные в диссертации модели и методы используются в экспериментальной работе кафедры и отдела иммунологии ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Росздрава» и отдела молекулярной и экспериментальной гематологии, онкологии и иммунологии ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава.

Структура и объем диссертации

татов, выводов и списка литературы, включающего работы отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 25 рисунками и содержит 9 таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В экспериментах были использованы мыши линий СБА, BDF, BALB/c (самцы весом 18-20 г., возраст 8-10 недель), полученные из питомника РАМН (Крюково, Московская область). Всего в исследованиях было задействовано 560 мышей. Животные содержались на стандартном пищевом рационе вивария при свободном доступе к воде и пище.

Тестируемый агент и его стандартизация. В опытах использован экспериментальный образец ФКС, выделенный из экстракта корня солодки методом колоночной хроматографии на полиамидном сорбенте (Fluka, Германия) с использованием высокоочищенного этанола в качестве экстрагента. Полученный экспериментальный образец раствора ФКС в этаноле стандартизировали фотометрическим методом Folin-Ciocalteu с использованием в качестве стандарта галловой кислоты (Acros Organics, Германия) и хранили при температуре -20°С.

Биологическая стандартизация исследуемого агента (ФКС) проводилась по угнетению пролиферации клеток человеческой гистиоцитарной лимфомы линии U937 (CRL-1593.2™, АТСС). В работе использовали партии препарата ФКС, при внесении которых в культуру опухолевых клеток в концентрации 10 мкг/мл в пересчете на галловую кислоту пролиферация соответствовала 40±2% от контрольного уровня.

В экспериментах in vivo ФКС вводили внутривенно или внутри-брюшинно в дозе 10 мг/кг в изотоническом растворе хлорида натрия с 5% содержанием этанола. Мышам контрольной группы вводили соответствующие объемы растворителя. В опытах in vitro в культуру клеток вносили ФКС в диапазоне концентраций 0,1-20 мкг/мл, так, чтобы финальная концентрация этанола не превышала 1%. В контрольные лунки добавляли соответствующие объемы высокоочищенного этанола.

Выделение лимфоцитов из периферической крови человека. Клетки выделяли в стерильных условиях градиентным методом. Для получения фракции мононуклеаров (МНК) использовали раствор фи-колп-урографина плотностью 1,077 г/см3 [Boyum А., 1968]. Количество выделенных МНК подсчитывали в камере Горяева по стандартной методике. Для проведения опытов in vitro клетки культивировали в среде RPMI-1640 с 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 10 мМ Хепес-буфера (рН 7,2) и антибиотиками: 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (далее - полная среда RPMI-1640).

Приготовление суспензии клеток лимфоидных органов. Суспензии спленоцитов и клеток лимфоузлов готовили методом

щадящей гомогенизации. При выделении спленоцитов эритроциты лизировали охлажденным раствором Бройля (0,84% хлорида аммония в 10 мМ Хепес-буфере). Посчет и культивирование клеток проводили аналогично МНК человека.

Иммуномагнитная сепарация. Для получения отдельных популяций спленоцитов использовали метод негативной селекции и набор реактивов Dynal Mouse Negative Isolation Kit (Invitrogen Dynal AS, Норвегия). Сепарацию проводили в магнитном поле штатива DynalMag-2 (Invitrogen Dynal AS, Норвегия). Контроль чистоты популяции осуществляли методом проточной цитометрии на цитофлуориметре Cytomics FC500 (Beckman-Coulter, США) с использованием флюорохром-меченых моно-клональных антител к CD3, CD4, CD8 мышей (Invitrogen, США).

Оценка пролиферации лимфоцитов, индуцированной различными митогенами. Исследование пролиферации клеток производили радиоизотопным методом, оценивая включение 3Н-тимидина в ДНК делящихся клеток. Клеточную суспензию разводили до конечной концентрации 0,2*10® (МНК человека) или 10® (МНК мыши) кл/лунку в полной среде RPMI-1640. Через 24 ч преинкубации МНК с агентами, индуцирующими пролиферацию Т-лимфоцитов (митогены: конканава-лин А (КонА) - для МНК мышей, фитогемаглютинин (ФГА) или моно-клональные анти-СОЗ антитела - для МНК человека) в опытные лунки вносили ФКС и продолжали инкубацию еще 48 ч. При оценке действия препарата сравнивали значения включений 3Н-тимидина в образцах с добавлением ФКС и в контроле. Результаты выражали в процентах.

Оценка «раннего» апоптоза и некроза. Количественные исследования жизнеспособности выделенных клеток проводили методом проточной цитофлуориметрии, используя Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Beckman Coulter, США). Для анализа использовали апикво-ты, содержащие 10® клеток.

Оценка «позднего» апоптоза. Исследование апоптоза МНК проводилось методом цитофлуориметрического определения количества ДНК с использованием дифференциального красителя пропиди-ум йодида.

Модель контактной чувствительности. Инициацию реакции контактной чувствительности (КЧ) к ДНФБ у мышей линии СБА проводили согласно общепринятому экспериментальному подходу с незначительными модификациями [Kim Т.Y., 1990]. Животных сенсибилизировали путем аппликации на кожу брюшка 50 мкл 0,3% раствора ДНФБ в ацетоне на 0 день. Для экспериментов с клетками на 4-е сутки часть мышей забивали, выделяли паховые лимфоузлы. Клетки инкубировали 6-8 ч при 37°С, 5% С02 с добавлением ФКС в концентрации 20 мкг/мл in vitro. Оставшимся мышам через 6 суток после сенсибилизации на внут-

реннюю поверхность правого уха наносили разрешающую дозу ДНФБ (5 мкл 0,2% раствора). На левое ухо наносили аналогичный объем растворителя (ацетона). Отрицательным контролем (К) служила группа интактных (несенсибипизированных) мышей, получивших только аппликацию разрешающей дозы ДНФБ. Через 24 ч после повторного нанесения ДНФБ оценивали интенсивность реакции КЧ по разнице отека правого и левого ушей (специфическое локальное воспаление). Толщину ушей измеряли в миллиметрах специальным микрометром, снабженным световым индикатором (Россия). Интенсивность супрессии реакции КЧ в процентах рассчитывали по формуле:

%супрессии =

\ Е-К

к+-к~

'100%

где Е, 1С, К" - отек уха у мышей в опытной группе (ФКС), группе положительного и отрицательного контроля, соответственно.

Адоптивный перенос контактной чувствительности. У мышей-доноров через 6 суток после сенсибилизации ДНФБ выделяли клетки селезенки. Суспензию спленоцитов (3*107-108 кп/мышь, 0,5 мл) или их отдельные популяции (CD3+, CD4+, CD8+), очищенные из того же количества спленоцитов, вводили в хвостовую вену интакгным мышам-реципиентам. В опытной группе клетки инкубировали с ФКС в течение 30 мин. при 37°С и 5% С02, в контрольной - с соответствующим объемом растворителя. Через 1 ч после переноса клеточной суспензии мышам-реципиентам, включая интактных мышей (К - отрицательный контроль), наносили разрешающую дозу ДНФБ на внутреннюю поверхность уха. На внутреннюю поверхность другого уха в качестве контроля наносили такой же объем ацетона. Еще через 24 ч регистрировали интенсивность реакции КЧ мышей-реципиентов выше описанным методом.

Оценка уровня секреторных цитокинов. Паховые лимфатические узлы выделяли на 4 день после двукратной (с интервалом 24 ч) сенсибилизации мышей ДНФБ. Выделенные лимфоциты культивировали 24 и 48 ч в полной среде RPMI-1640 при 37°С и 5% С02 в присутствии 15 мкг/мл КонА. Концентрации цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-17, ИФНу, ГМ-КСФ, ФНОа) определяли цитофлуо-риметрическим методом, используя набор реактивов Mouse Th1/Th2 FlowCytomix Multiplex и программное обеспечение FlowCytomix Pro (Bender MedSystems, Австрия).

Статистическая обработка результатов. Для статистического анализа результатов использовалась программа Excel для Windows ХР. Все результаты выражались как значения среднего ± стандартное

отклонение. Полученные в ходе экспериментов данные распределялись по нормальному закону, поэтому для оценки достоверности различий применяли критерий Стьюдента, вычисляя коэффицент достоверности. Различие средних показателей считалось достоверным, если величина коэффицента достоверности соответствовала уровню значимости Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оценка влияния ФКС на пролиферацию митоген-активированных МНК

Для решения первой задачи работы оценивали влияние ФКС на пролиферативный ответ активированных Т-клеточными митогенами мышиных и человеческих МНК in vitro.

Уже в концентрации 1 мкг/мл исследуемый агент достоверно (р<0,05) подавлял индуцированную митогеном КонА пролиферацию мышиных МНК более чем на 40% {до 57,5+6,0%), а в дозе 20 мкг/мл практически полностью блокировал пролиферативный ответ этих клеток (до 7,8±1,5% от контрольных значений). Аналогичные результаты были получены при инкубации ФКС с ФГА- и анти-СйЗ-стимулиро-ванными МНК человека (рис. 1).

—•—ФГА » Ahth-CD3 КонА

SS 120

U 80

га о &f

f I 40

с; о

£ о

0 5 10 15 20 25

Концентрация ФКС, мкг/мл

Рисунок 1. Влияние ФКС на пролиферацию ФГА и анти-СОЗ-активированных МНК человека и КонА-активированных МНК мышей. Уровень пролиферации клеток, не «обработанных» ФКС (контроль), соответствует 100%.

Следующим шагом в изучении антипролиферативных эффектов стало использование экспериментальной модели, в которой ФКС вводили животным внутрибрюшинно, с последующей эксплантацией спленоцитов и активацией их КонА в условиях клеточной культуры in vitro. Данные, представленные на рис. 2, показывают достоверное

снижение пролиферации МНК мышей в зависимости от вводимой дозы ФКС. Так, при однократном внутрибрюшинном введении ФКС уровень пролиферативного ответа, индуцированного митогеном in vitro составил 86,2±6,1%, при двух- и трехкратном - 77,4±3,2% и 49,5±3,1% соответственно.

Рисунок 2. Влияние внутрибрюшинного введения ФКС на пролиферацию эксплантированных митоген-активированных спленоцитов in vitro. Уровень пролиферации клеток, не «обработанных» ФКС (контроль), соответствует 100%.

Таким образом, ФКС обладают выраженным дозозависимым антипролиферативным эффектом в отношении митоген-активированных МНК, который не зависит от линейной (мыши линий СБА, BDF, BALB/c) и видовой (мышь - человек) принадлежности этих клеток, а также от способа их обработки (in vitro или in vivo) исследуемым агентом.

2. Влияние ФКС на «поздний» апоптоз митоген-активированных МНК и секрецию этими клетками цитокинов

Исследование механизмов антипролиферативного действия ФКС показало, что даже в максимально эффективной дозе они не проявляют проапоптогенных свойств как в отношении мышиных спленоцитов, активированных КонА, так и человеческих МНК, активированных анти-СОЗ-антителами. Это позволяет заключить, что индукция апоптоза не является механизмом выявленного ранее антипролиферативного эффекта ФКС.

Следующим шагом в изучении механизмов антипролиферативного действия ФКС стала оценка их влияния на спектр синтезируемых МНК цитокинов, регулирующие начальные этапы адаптивного иммунного ответа и через которые опосредуется пролиферативный эффект Т-клеточных митогенов.

Культивирование КонА-активированных МНК мыши в присутствии 20 мкг/мл ФКС приводило к достоверному (р<0,05) увеличению продук-

ции ИЛ-6 (на 33%) при параллельном резком снижении ИЛ-2 до уровня неопределяемых значений. В более низких концентрациях (10 мкг/мл) эффект ФКС на секрецию ИЛ-2 и ИЛ-6 был недостоверным. При этом ФКС дозозависимо достоверно снижали секрецию ИФНу (контроль -6687,0±235,1 пг/мл; ФКС 10 мкг/мл - 2933,2±211,5 пг/мл; ФКС 20 мкг/мл -2006,4±190,4 пг/мл; р<0,05) и повышали уровень ИЛ-17 (контроль -6727,5±526,3 пг/мл; ФКС 10 мкг/мл - 8845,5±430,7 пг/мл; ФКС 20 мкг/мл -9006,6±356,7 пг/мл; р<0,05) (рис. 3). Ни в контрольных, ни в опытных пробах секреция ИЛ-1, -4, -5, -10, ГМ-КСФ, ФНОа не обнаруживалась.

Полученные в этом разделе данные свидетельствуют, что анти-пролиферативный эффект ФКС не связан с индукцией программируемой гибели митоген-активированных МНК, а опосредуется через изменение баланса основных Т-хелперных цитокинов. Характер изменения уровня цитокинов под влиянием ФКС (ингибирование ИЛ-2 и ИФНу при возрастании ИЛ-6 и ИЛ-17) позволяет предположить, что данный агент инициирует переключение стимулированного КонА иммунного ответа с ТИ1 на ТМ7.

-♦-ИФНу -А—ИЛ-17

Концентрация ФКС, мкг/мл

Рисунок 3. Влияние ФКС на секрецию ИЛ-17 и ИФНу КонА-активированными клетками лимфоузлов интактных мышей.

3. Влияние ФКС на развитие реакции контактной чувствительности (КЧ) к 2,4-динитрофторбензолу (ДНФБ) у мышей

Основываясь на результатах предыдущих разделов работы, касающихся антипролиферативного эффекта ФКС, и для проверки возможности использования данного агента в качестве иммуносупрессив-ного лекарственного препарата на следующем этапе были проведены исследования по оценке эффективности ФКС in vivo в реакции КЧ к

ДНФБ у экспериментальных животных. Как известно, КЧ является моделью Т-клеточного иммунного ответа, воспроизводящей у человека заболевание - контактный дерматит. В иммунопатогенезе КЧ выделяют две фазы: сенсибилизации (первичный контакт с сенсибилизирующим веществом) и реализации иммунного воспаления (при повторном контакте с тем же веществом). У мышей реакцию КЧ индуцируют аппликацией ДНФБ на кожу и регистрируют по отеку уха при повторном нанесении этого вещества после завершения фазы сенсибилизации.

Внутривенное введение мышам ФКС в дозе 10 мг/кг через 24-3648 ч после сенсибилизации дозозависимо подавляло развитие отека уха мыши (рис. 4). При этом однократное введение ФКС через любой из исследуемых промежутков времени от начала сенсибилизации не давало достоверного угнетения реакции (24 ч - на 21,0±17,0; 36 ч - на 24,0±15,0; 48 ч - на 41,0±31,0%; р>0,05). Напротив, двух- или трехкратное введение ФКС вызывало почти полное подавление реакции КЧ (24-36 ч - на 91,0+13,0%; 24-36-48 ч - 9Э,0±6,0%; р<0,05).

Таким образом, результаты этой серии экспериментов продемонстрировали способность ФКС угнетать in vivo связанные с индукцией иммунного ответа иммунопатологические процессы и, в частности реакцию КЧ, индуцированную ДНФБ.

0,25

S 0,2

га" 0,15

>■

(6 0,1

О 0,05

\С

к+

ФКС 24ч

ФКС 36ч

ФКС 48ч

ФКС 24, 36ч

ФКС 24, 36, 48ч

0,022

0,196

0,16

0,155

0,125

0,037

Рисунок 4. Влияние ФКС на выраженность отека уха мышей в реакции КЧ, индуцированной ДНФБ. К--отрицательный контроль (провокация без сенсибилизации). К* - положительный контроль (сенсибилизация + провокация).

4. Влияние ФКС на пролиферацию клеток регионарных лимфоузлов и продукцию ими цитокинов в модели КЧ

Для проверки является ли антипролиферативная активность ФКС ключевым фактором в подавлении реакции КЧ к ДНФБ у мышей, была проведена дополнительная серия экспериментов по оценке пролифера-

ции и абсолютного количества клеток (клеточность) ближайших к нанесению ДНФБ регионарных лимфатических узлов во временной период, соответствующий максимальному развитию фазы сенсибилизации.

Как показали результаты этой серии, внутривенное введение ФКС (10-20 мг/кг) эффективно дозозависимо ингибировало оба исследуемых показателя. При введении 10 мг/кг ФКС снижали пролиферацию до 42,0±4,0%, а клеточность - до 60,0±4,0% (р<0,05) по отношению к группе положительного контроля); 20 мг/кг ФКС приводило к ин-гибированию пролиферации и клеточности более чем на 70% (рис. 5).

□ Пролиферация ■ Клеточность 100 т-

10 мг/кг 20 мг/кг

Рисунок 5. Изменение пролиферации МНК и клеточности паховых лимфоузлов при внутривенном введении мышам ФКС через 24 и 48 ч после сенсибилизации ДНФБ. Уровень 100% соответствует контрольным значениям.

Параллельный с оценкой пролиферации анализ секреции цито-кинов клетками паховых лимфоузлов показал, что внутривенное введение ФКС в дозе 10 мг/кг приводило к статистически значимому (р<0,05) уменьшению концентрации ИЛ-2, ИЛ-4 и ИФНу соответственно на 51%, 48% и 58% по сравнению с клетками сенсибилизированного контроля. Напротив, уровни ИЛ-17 и ИЛ-10 повышались на 54% и 17% соответственно (р<0,05). Секреция ФНОа достоверно не отличалась в контрольных и опытных пробах. Под влиянием ФКС концентрации ИЛ-6 и ГМ-КСФ были подвержены значительным колебаниям в различных сериях экспериментов от значений, сравнимых с контролем, до уровней, превышающих их значения (рис. 6; табл. 1).

Таким образом, как и в ранее проведенных экспериментах in vitro (см. разд. 1 и 2), ФКС при введении in vivo в фазу сенсибилизации КЧ ингибировали пролиферацию ДНФБ-активированных МНК, что сопровождалось изменением спектра секретируемых Т-клеточных цитоки-нов. Характер изменения продукции цитокинов (снижение ИЛ-2, ИФНу, ИЛ-4 при повышении ИЛ-10 и ИЛ-17) позволяет предположить, что уг-

нетение КЧ при введении ФКС направлено на угнетение активности ТЫ- и ТЬ2-субпопуляций лимфоцитов за счет активации ТИ17- и, возможно, Тгед-клеток.

Рисунок 6. Статистически значимые изменения уровня секреторных цитокинов в супернатантах клеток регионарных лимфоузлов на фоне внутривенного введения ФКС через 24 и 48 ч после сенсибилизации ДНФБ.

Таблица 1. Влияние внутривенного введения ФКС (10 мг/кг) через 24-48 ч после сенсибилизации ДНФБ на секрецию цитокинов (пкг/мл) клетками регионарных лимфоузлов.

ИЛ-2 ИЛ-10 ИЛ-4 ИФНу ИЛ-17 ФНОа ИЛ-6 гм- КСФ

Контроль 1926,5 ±55,6 807,5 ±0,3 302,0 ±0,1 42000,0 ±2364,0 5378,5 ±101,8 160,0 ±7,5 2100,5 ±212,0 826,5 ±174,6

ФКС 919,0 ±26,5 947,5 ±0,3 157,5 ±0,1 16828,0 ±947,0 7972,0 ±67,2 182,0 ±15,0 2910,5 ±964,0 1153,0 ±164,5

5. Влияния ФКС на способность ДНФБ-сенсибилизированных спленоцитов и их Т-популяции адоптивно переносить КЧ у мышей

Целью данного этапа работы явилось исследование возможного влияния ФКС на функциональную активность зрелых (после завершения пролиферативных процессов, необходимых для реализации данной реакции) клеток-эффекторов и их субпопуляций, участвующих в КЧ. Для достижения поставленной цели был использован традиционный метод адоптивного переноса, в основе которого лежит индукция КЧ при введении несенсибилизированному животному (рис. 7, столбец К") спленоцитов от сенсибилизированного сингенного донора (рис. 7, столбец К'1*).

Как демонстрируют результаты, представленные на рис. 7, предварительная (до введения мышам-реципиентам) инкубация спленоцитов ДНФБ-сенсибилизированных доноров в течение 30 мин. с ФКС

(20 мкг/мл) приводила к снижению отека уха у реципиентов при повторном нанесении ДНФБ до 0,016±0,006 мм, что достоверно не различалось с таковыми значениями в группе отрицательного контроля (0,010±0,004 мм, р<0,05), и было на 84% ниже в сравнении с группой

К"" (0,099±0,008 мм; р<0,05).

0,16 0,12

® 0,08 5 0,04

■ IT □ К+ OK /+ С1ФКС

Рисунок 7. Интенсивность реакции при адоптивном переносе КЧ спленоцитами сенсибилизированных мышей-доноров интактным мышам-реципиентам. (К-) -отрицательный контроль, (К*) - положительный контроль без адоптивного переноса, (К-/+) - адоптивный перенос КЧ спленоцитами, (ФКС) - адоптивный перенос спленоцитов, инкубированных с ФКС.

Учитывая литературные данные о принадлежности эффекторов КЧ к Т-клеточной популяции, на следующем этапе исследований были проведены эксперименты по иммуномагнитной сепарации Т-лимфоцитов из суммарной фракции спленоцитов сенсибилизированных ДНФБ мышей и обработке их ФКС перед адоптивным переносом животным-реципиентам. Результаты этой серии представлены на рис. 8. Как и предполагалось, Т-лимфоциты сенсибилизированных мышей эффективно переносили КЧ несенсибилизированным реципиентам Выраженность реакции (0,107±0,006 мм) статистически не отличалась от группы с адоптивным переносом суммарной фракции спленоцитов (0,099±0,008 мм). Инкубация in vitro сепарированных Т-лимфоцитов с ФКС (20 мкг/мл) блокировала способность этих клеток адоптивно переносить КЧ интактным мышам: отек уха составил 0,017±0,007 мм, что практически совпадало с аналогичным показателем в группе отрицательного контроля.

В результате этого этапа исследований можно сделать вывод, что ФКС обладают не только антипролиферативным эффектом на стадии формирования ДНФБ-специфичных лимфоцитов, но и способны блокировать функциональную активность зрелых клеток-эффекторов, ответ-

ственных за адоптивный перенос реакции КЧ. При этом дополнительные эксперименты свидетельствуют, что блокирующий эффект ФКС в отношении клеток-эффекторов КЧ не был связан с их гибелью вследствие индукции апоптоза или прямой цитотоксичности.

Рисунок 8. Интенсивность реакции КЧ при адоптивном переносе спленоцитов и Т-лимфоцитов сенсибилизированных мышей-доноров интактным мышам-реципиентам. (К-) - отрицательный контроль, (К_/+) - адоптивный перенос КЧ спленоцитами, (CD3) - адоптивный перенос КЧ T-лимфоцитами, (CD3 + ФКС) -адоптивный перенос Т-лимфоцитов, культивированных в присутствии ФКС.

6. Влияние ФКС на способность субпопуляций Т-лимфоцитов адоптивно переносить КЧ

Следующим шагом стала оценка субпопуляционной селективности действия ФКС. CD4+ и CD8+ лимфоциты выделяли иммуномагнит-ной сепарацией из спленоцитов мышей, сенсибилизированных ДНФБ; чистота выделенных субпопуляций составляла 90,0±1,0%.

Как видно на гистограмме (рис. 9) перенос чистой популяции CD8+ вызывал адоптивный перенос КЧ интактным мышам-реципиентам. Среднее значение отека уха составило 0,086±0,014 мм, что статистически не различалось с интенсивностью отека при переносе суммарной фракции спленоцитов или Т-лимфоцитов. У мышей, которым перенесли сепарированные CD4+, выраженность отека была значительно меньше (0,034+0,008 мм; р<0,05).

Выяснив то, что в условиях нашего эксперимента реакция КЧ переносилась CD8* лимфоцитами, в следующие серии экспериментов было решено ввести еще одну опытную группу: (С08+ФКС) - адоптивный перенос КЧ интактным мышам CD8+ лимфоцитами, преинкубиро-ванными с ФКС в концентрации 20 мкг/мл в течение 30 мин. (рис. 9).

Однако, преинкубация выделенных CD8+ лимфоцитов с ФКС не вызвала подавления развития отека ушей (0,080±0,020 мм), т.е. реакция КЧ была «успешно» адоптивно перенесена. Это может свидетель-

ствовать об отсутствии прямого подавляющего эффекта флавоноидов на CD8+ клетки-эффекторы КЧ.

0,12 -

S- 0,08--П ----

го I I

х I ......

| 0.04---j=j-

0 -^-------

■ IT MCD8 OCD4 ПС08+ФКС

Рисунок 9. Интенсивность реакции при адоптивном переносе КЧ популяциями спленоцитов сенсибилизированных мышей-доноров интактным мышам-рецили-ентам. (К-) - отрицательный контроль, (CD8) - адоптивный перенос КЧ CD8* лимфоцитами, (CD4) - адоптивный перенос КЧ CD4+ лимфоцитами, (С08+ФКС) -адоптивный перенос КЧ CD8* лимфоцитами, «обработанными» ФКС.

Таким образом, в результате данного этапа исследования можно сделать следующие выводы: в условиях проводимого эксперимента CD8+ субпопуляция Т-лимфоцитов проявляет свойства клеток-эффекторов КЧ; антиген-специфические CD4+ лимфоциты не способны в достаточной степени переносить КЧ в условиях приводимой модели КЧ; обработка in vitro ФКС в концентрации 20 мкг/мл CD8+ лимфоцитов-эффекторов с последующим адоптивным переносом их интактным мышам не вызывает ингибирования реакции КЧ.

7. Влияние ФКС на адоптивный перенос КЧ комбинацией CD4+ и CD8+ лимфоцитов

После обсуждения полученных результатов было решено провести модифицированный эксперимент с выделением тех же популяций спленоцитов от сенсибилизированных ДНФБ мышей. Культивированию в присутствии ФКС теперь подвергали CD4+ лимфоциты, которые вводили мышам-реципиентам совместно с неинкубированными CD8* лимфоцитами. На рис. 10 видно, что инкубация CD4+ с ФКС, с последующим добавлением CD8+ привела к супрессии реакции КЧ на 83% по сравнению с соответствующим контролем (р<0,05). Отек уха в этой группе мышей составил 0,020±0,010 мм, что достоверно не отличалось от значений отека ушей в группе отрицательного контроля (ин-тактные мыши).

0,12

I 0,08

i 0,04

U\C

0K/+

ED CD8+CD4 О CD4 (0KC)+CD8

Рисунок 10. Интенсивность реакции при адоптивном переносе КЧ различными популяциями спленоцитов сенсибилизированных мышей-доноров интактным мышам-реципиентам. (К-) - отрицательный контроль, (К-'*) - адоптивный перенос КЧ спленоцитами, (CD8+CD4) - адоптивный перенос КЧ смесью CD8* и CD4* лимфоцитов, (CD4 (ФКС) + CD8) - адоптивный перенос CD4* лимфоцитов, инкубированных с ФКС, с последующим добавлением CD8* лимфоцитов.

В результате проведенного эксперимента можно сделать следующий вывод: преинкубация CD4+ субпопуляции спленоцитов сенсибилизированных мышей с ФКС в концентрации 20 мкг/мл и смешивание ее с CD8+ лимфоцитами эффекторами приводила при адоптивном переносе к угнетению КЧ. Данный факт позволил сделать предположение, что именно CD4+ лимфоциты приобретают в процессе обработки флавоноидами регуляторную функцию: возможно ФКС индуцируют их супрессорный потенциал и опосредованно инактивируют CD8+ клетки-эффекторы КЧ.

Ввиду того, что исследуемый препарат ФКС содержит сумму по-лифенольных соединений, выявленные механизмы его иммуносупрес-сорного действия могут быть обусловлены разными компонентами. Возможно, что среди флавоноидов корня солодки одни соединения обладают выраженным антипролиферативным эффектом по отношению к активированным лимфоцитам, а другие способны супрессиро-вать активность зрелых адаптивно сформированных лимфоцитов-эффекторов КЧ посредством отрицательной регуляции их эффектор-ной функции.

выводы

1. Флавоноиды корня солодки in vitro дозозависимо угнетают пролиферацию мононуклеарных клеток человека и мышей, индуцированную Т-клеточными митогенами.

2. Исследование механизмов антипролиферативного действия фла-воноидов солодки на модели КонА-стимулированных лимфоцитов мышей, показывает, что они не связаны с индукцией апоптоза, но сопровождаются изменением баланса Т-хелперных цитокинов: флавоноиды корня солодки подавляют секрецию ИЛ-2 и ИФНу, и увеличивают уровень ИЛ-6 и ИЛ-17, что может свидетельствовать о переключении Th1 иммунного ответа в направлении Th17.

3. Парентеральное введение флавоноидов корня солодки на ранних сроках после сенсибилизации 2,4-динитрофторбензолом, подавляет реакцию контактной чувствительности у мышей, что сопровождается дозозависимым уменьшением абсолютного числа клеток регионарных лимфоузлов за счет снижения их пролиферативного ответа.

4. Снижение пролиферативного ответа клеток регионарных лимфоузлов, как и в случае митоген-стимулированной пролиферации in vitro, сопровождается изменением цитокинового баланса: наблюдается уменьшение секреции ИЛ-2, ИФНу и ИЛ-4 и увеличение продукции ИЛ-10 и ИЛ-17 клетками регионарных лимфоузлов, что может свидетельствовать о переключении Th1 и Th2 иммунных ответов в процессе развития контактной чувствительности на формирование ТМ7-лимфоцитов.

5. На поздних сроках от начала сенсибилизации 2,4-динитрофторбен-золом, после завершения фазы пролиферации и миграции зрелых эффекторов из регионарных лимфоузлов, обработка флавоноида-ми корня солодки суммарной фракции спленоцитов, а также выделенных из нее с помощью иммуномагнитной сепарации Т-клеток, приводит к блокаде адоптивного переноса реакции контактной чувствительности несенсибилизированным мышам-реципиентам.

6. Блокирующий эффект флавоноидов солодки не наблюдается в случае обработки основной эффекторной популяции, отвечающей за адоптивный перенос контактной чувствительности - CD8+ клеток. Воспроизведение блокирующего эффекта флавоноидов корня солодки, происходит только после обработки CD4* популяции и последующего ее адоптивного переноса совместно с CD8* эффекторами несенсибилизированным мышам-реципиентам.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Павлова С.И., Албегова Д.З., Кягова A.A., Козлов И.Г. Механизмы имму-носупрессивной активности флавоноидов корня солодки при контактной чувствительности у мышей. // Российский иммунологический журнал. -2010. - т. 4(13). - № 3. - С. 248-254.

2. Павлова С.И., Албегова Д.З., Кягова A.A., Козлов И.Г. Механизмы имму-носупрессивного действия флавоноидов корня солодки при контактной чувствительности у мышей: угнетение функции Т-лимфоцитов-эффекторов опосредуется неэффекгорными клетками. // Медицинская иммунология - 2010. -т. 12. - № 6. - С. 503-510.

3. Албегова Д.З., Малышев П.Ю., Цицуашвили М.Д., Дибирова Г.О. Флаво-ноиды корня солодки увеличивают выживаемость мышей при септическом шоке. // Вестник уральской медицинской академической науки. -2010. - № 2/1(29). - С. 239.

4. Албегова Д.З., Павлова С.И., Малышев П.Ю., Цицуашвили М.Д., Дибирова Г.О., Демина М.В., Козлов И.Г. Флавоноиды - ингибиторы сигнальных путей. II Российский аллергологический журнал. - 2010. - № 1. - вып. 1. - С. 7-8.

5. Павлова С.И., Шкопоров А.Н., Албегова Д.З., Дмитриева Н.Б., Жукова И.Б., Козлов И.Г. Оценка фагоцитоза с использованием GFP-экспрессирующих Е. coli. II Российский аллергологический журнал. -2010. - № 1. - вып. 1. - С. 142-143.

6. Малышев П.Ю., Павлова С.И., Албегова Д.З., Дмитриева Н.Б., Жукова И.Б., Дибирова Г.О., Козлов И.Г. Флавоноиды - потенциальные источники для создания противоопухолевых препаратов. II Российский аллергологический журнал. -2010. - № 1.- вып. 1. - С. 115-116.

7. Цицуашвили М.Д., Павлова С.И., Степанов Г.О., Албегова Д.З., Демина М.В., Козлов И.Г. Возможность оптимизации фармакокинетики и повышение эффективности препаратов флавоноидов. // Российский аллергологический журнал. - 2010. - № 1. - вып. 1. - С. 199-200.

8. Цицуашвили М.Д., Павлова С.И., Албегова Д.З., Маркина Е.В., Жукова И.Б. Сравнение антипролиферативного эффекта различных экспериментальных лекарственных форм флавоноидов корня солодки. II Вестник уральской медицинской академической науки. - 2010. - № 2/1(29). -С. 276-277.

9. Павлова С.И., Албегова Д.З., Кягова A.A., Демина М.В., Козлов И.Г. Влияние флавоноидов корня солодки на цитокиновый профиль лимфоцитов в модели контактной чувствительности. // Цитокины и воспаление. - 2010. -т. 9. - № 3. - С. 50.

10. Цицуашвили М.Д., Павлова С.И., Албегова Д.З., Козлов И.Г. Перспектива создания наносомальных форм препаратов флавоноидов. Н Международный журнал по иммунореабилитации. - 2010. -т. 12. - № 2. - С. 105.

11. Албегова Д.З., Павлова С.И., Цицуашвили М.Д., Малышев П.Ю., Козлов И.Г. Флавоноиды снижают клеточность и пролиферацию лимфоцитов в реакции контактной чувствительности. // Международный журнал по иммунореабилитации.-2010.-т. 12.-№2.-С. 105.

12. Tsitsuashvili M.D., Pavlova S.I., Albegova D.Z., Kozlov I.G. The prospect of a nanosomal forms of drugs flavonoids. // International Journal on Immunorea-habilitation. - 2010. - Vol. 12. - № 1. - P. 86.

13. Albegova D.Z., Pavlova S.I., Tsitsuashvili M.D., Malyshev P.Yu., Kozlov I.G.

Flavonoids decrease cellularity and lymphocyte proliferation in mice contact sensitivity. // International Journal on Immunoreahabilitation. - 2010. - Vol. 12. - № 1. - P. 86.

14. Albegova D.Z., Pavlova S.I., Kyagova A.A., Tsitsuashvili M.D., Malyshev P.Yu., Kozlov I.G. Licorice root flavonoids and contact sensitivity in mice. // Proceedings of the III World Asthma & COPD Forum and World Forum of Pediatrics. -2010.-P. 147-152.

15. Tsitsuashvili M.D., Pavlova S.I., Stepanov G.O., Albegova D.Z., Kozlov I.G. The prospect of a nanosomal forms of flavonoids drugs. // Proceedings of the III World Asthma & COPD Forum and World Forum of Pediatrics. - 2010. - P. 153-156.

СПИСОК СОРАЩЕНИЙ

АГ-антиген

ДНК-дезоксирибонуклеиновая кислота

ДНФБ - 2,4-динитрофторбензол

ИК-ингибирующая концентрация

ИЛ - интерлейкин

ИФН - интерферон

КонА- конканавапин А

КЧ - контактная чувствительность

МНК- мононуклеарные клетки

ФГА - фитогемагглютинин

ФКС - флавоноиды корня солодки

ФНО - фактор некроза опухоли

Подписано в печать: 05.04.11

Объем: 1,5 усл.пл. Тираж: 100 экз. Заказ № 782 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Оглавление диссертации Албегова, Диана Заурбековна :: 2011 :: Москва

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л' Иммуносупрессивнаятерапия: перспективы-развития

I -2. Флавоноиды как потенциальный источник для изыскания но- 15 вых лекарственных средств

1.2.1. Флавоноиды - структурно-разнообразные полифенолы расте- 15 ний

1.2.2. Флавоноиды ре1улируют транскрипцию генов, влияя на ак- 18 тивность внутриклеточных сигнальных молекул

1.2.3. Фармакология флавоноидов: существующие лекарственные 23 препараты, проблемная фармакокинетика

•2.4. Единство и борьба противоположных фактов: флавоноиды иммуностимуляторы или иммуносупрессанты? 1 -2.4.1. Флавоноиды и механизмы врожденного иммунитета

1.2.4.2. Флавоноиды и адаптивный иммунный ответ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Поэтапная схема постановки экспериментов

2.2. Лабораторные животные

2.3. Тестируемый агент и его стандартизация

2.4. Выделение лимфоцитов из периферической крови человека 39 -.5. Приготовление суспензии клеток лимфоидных органов

2.6. Иммуномагнитная сепарация

2.7. Определение действующих концентраций активирующих агентов (митогенов) "

2.8. Оценка пролиферации лимфоцитов, индуцированной различными митогенами

2.9: Оценка «раннего» апоптоза и некроза

2.10. Оценка «позднего» апотоза

2.11. Модель контактной чувствительности

2.12.^ Адоптивный перенос контактной чувствительности

2.13. ' Оценка уровня секреторных цитокинов

2.14. Статистическая обработка результатов

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Влияние ФКС на ростовые характеристики (пролиферация, апоптоз) активированных лимфоцитов

3.1.1. Оценка .влияния- ФКС на пролиферацию митоген-активированных МНК in vitro

3.1.2. Влияние предобработки ФКС in vivo на митоген-стимулированную пролиферациию МНК мышей ex vivo

3.1.3. Влияния ФКС на «поздний» апоптоз митоген-активированных МНК

3.1.4. Изучение влияния ФКС ни секрецию цитокинов активированными МНК

3.2. Изучение эффективности ФКС в реакции КЧ

3-2.1. Влияние ФКС на развитие отека уха у мышей в реакции КЧ

3.2.2. Влияние ФКС на пролиферативную активность и абсолютное количество МНК регионарных лимфоузлов в модели КЧ

3.2.3. Влияние введения ФКС на ранних сроках после ДНФБ-сенсибилизации на секрецию цитокинов МНК регионарных лимфоузлов

3.3. Изучение механизмов иммуносупрессивного эффекта ФКС в реакции контактной чувствительности

3.3.1. Влияние ФКС на функциональную активность лимфоцитов-эффекторов в реакции КЧ

3.3.1.1. Оценка проапоптогенного эффекта ФКС по отношению к лимфоцитам-эффекторам КЧ

3.3.1.2. Влияния ФКС на способность спленоцитов, сенсибилизированных ДНФБ мышей, адоптивно переносить КЧ

3.3.1.3. Влияние ФКС на способность Т- лимфоцитов ДНФБ-сенсибилизированных мышей адоптивнопереносить КЧ

3.3.1.4. Влияние ФКС на способность субпопуляций Т-лимфоцитов адоптивно переносить КЧ

3.3.1.5. Влияние ФКС на адоптивный перенос КЧ комбинацией CD4+-и CD8+-лимфоцитов.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации по теме "Фармакология, клиническая фармакология", Албегова, Диана Заурбековна, автореферат

Актуальность темы исследования

Переходисследований^; медицине намолекулярный* уровень» привел к; накоплению? в последние: десятилетия? многочисленных данных, позволивших детально описать патогенез целого ряда заболеваний. Важнейшим достижением данного; этапа исследований; стало выявление и характеристика молекул, появление которых либо1 сопутствует патологическому процессу, либо" играет ведущую роль в его возникновении (молекулярные маркеры заболевания и/или «патологические молекулы»). Принципиальное изменение ситуации произошло в связи с завершением интенсивных исследований в иммунологии, биотехнологии и молекулярной биологии. В результате развития^ этих областей сформировалась унифицированная; идеология, так называемой, прицельной или мишень-направленной терапии. В связи с этим поиск новых таргетных; лекарственных средств, способных селективно корригировать ключевые звеньям патогенеза того или иного заболевания приобретает все болыиуюактуальность.

Одним из перспективных направлений1 в этой области являетсяфаз-работка менее токсичных и более специфичных иммуносупрессивных лекарственных средств. В настоящее время в качестве иммуносупрессантов г широко используются цитостатики, глюкокортикостероиды и ингибиторы, кальциневрина. Цитотоксические противоопухолевые препараты (иммуно-, супрессанты первого поколения) неизбирательно воздействуют на любые клетки, находящиеся в процессе деления. Этим объясняется наличие у этого класса лекарственных препаратов большого числа побочных эффектов;. Внедрение ингибиторов кальциневрина; (циклоспорин А, такролимус) явилось, важным шагом в направлении создания; более избирательных: препаратов, однако побочные эффекты этого класса лекарственных средств все еще значительны. В-тоже время идеальный иммуносупрессант должен обладать избирательным действием на отдельные субпопуляции лимфоцитов, не вызывая повреждения как других клеток организма, так и клонов? лимфоцитов, осуществляющих реакции противоинфекционного и противоопухолевого иммунитета. Иначе говоря, действие препарата должно быть направлено преимущественно на АГ-специфические клетки, принимающие участие в реакциях приобретенного иммунитета. В настоящее время на роль идеального иммуносупрессанта< претендуют моноклональ-ные антитела (МАТ), ингибиторы внутриклеточных сигнальных молекул и так называемые «переключатели иммунного ответа».

Вещества растительного происхождения всегда являлись интересным источником для создания новых лекарственных средств. Пристальное внимание исследователей в последнее время уделяется изучению флаво-ноидов — большой группы полифенольных соединений, присутствующих практически во всех высших растениях. Результаты многочисленных исследований демонстрируют, что эти вещества обладают широким диапазоном активностей, проявляя противовоспалительные, иммунотропные, антиканцерогенные и другие эффекты [3, 27, 28, 68, 77, 121]. Изучение механизмов действия флавоноидов на молекулярном уровне показывает, что некоторые их классы (изофлавоны, халконы) способны эффективно инги-бировать фосфорилирование, а как следствие и активацию, ключевых молекул сигнальных путей в животных клетках. Ряд работ свидетельствуют об иммуностимулирующем действии некоторых флавоноидов в моделях ш vivo [101, 116]. Несмотря на многочисленные исследования иммунотроп-ных эффектов флавоноидов, на сегодняшний день отсутствует единая концепция, объясняющая их механизмы действия.

В связи с этим актуальным является изучение механизмов иммуно-тропной активности флавоноидов и экспериментальное обоснование их фармакологической эффективности в моделях на животных.

Цель и задачи исследования

Целью исследования являлось, изучение на доклиническом уровне иммунооупрессивных эффектов флавоноидов корня солодкй (ФКС).

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи::

2. Оценить влияние ФКС на продукцию цитокинов активированными мононуклеарными клетками мышей.

3. Изучить эффективность ФКС в реакции контактной чувствительности^ индуцированной 2,4-динитрофторбензолом у мышей.

Научная новизна

Впервые был продемонстрирован антипролиферативный эффект ФКС in vitro в отношении митоген-активированных человеческих и мышиных I

Т-лимфоцитов. Было доказано, что антипролиферативный эффект ФКС не связан с индукцией апоптоза, но обусловлен модулирующим действием на продукцию цитокинов: наблюдается подавление секреции ИЛ-2 и ИФНу, и повышение уровня ИЛ-6 и ИЛ-17.

Впервые было показано, что ФКС ингибируют развитие реакции контактной чувствительности, индуцированной 2,4-динитрофторбензолом у мышей.

Впервые было показано, что внутривенное введение ФКС нафанних сроках после сенсибилизации 2,4-динитрофторбензолом приводит к снижению, как абсолютного числа клеток регионарных лимфоузлов, так и подавлению пролиферативного ответа их в системе in vitro. Это коррелирует с изменением цитокинового баланса: наблюдается уменьшение секреции ИЛ-2, ИФНу и ИЛ-4 и увеличение продукции ИЛ-10 и ИЛ-17 клетками регионарных лимфоузлов, что может свидетельствовать о способности фла-воноидов солодки переключать Thl/Th2 иммунные ответы в процессе развития контактной чувствительности на формирование Th 17-лимфоцитов.

Впервые показано, что на поздних сроках после ДНФБ-сенси-билизации, обработка ФКС суммарной фракции спленоцитов, а также выделенных из нее с помощью иммуномагнитной сепарации Т-клеток, приводит к блокаде адоптивного переноса реакции контактной чувствительности несенсибилизированным сингенным мышам-реципиентам.

Впервые было показано, что блокирующий эффект ФКС не наблюдается в случае обработки CD8+ лимфоцитов-эффекторов, выделенных из спленоцитов сенсибилизированных животных. Воспроизведение блокирующего эффекта ФКС, происходит только после обработки CD4+-популяции и последующего ее адоптивного переноса совместно с CD8-эффекторами несенсибилизированным мышам-реципиентам.

Практическая значимость

Растительное происхождение, большое количество ранее установленных биологических эффектов, а также выявленные принципиально новые механизмы действия флавоноидов корня солодки открывают перспективу их дальнейшего изучения в качестве иммуносупрессивных лекарственных препаратов.

В работе подобран, комплекс методов, позволяющих оценивать им-мунотропную активность и эффективность новых фармакологических агентов.

Публикация и апробация работы

Материалы диссертации были представлены на Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и патологии» (Новосибирск, 2010), Национальной конференции: «Аллергология и клиническая иммунология -практическому здравоохранению» (Москва, 2010), 2nd European Congress of Immunology: "Immunity for Life, Immunology for Health" (Berlin, Germany, 2009), V World Congress of Immunopathology and Respiratory Allergy (Tel Aviv, Israel, 2009), VI Georgian Congress of Allergology and Immunology, VI International Congress "Health and Drug" (Tbilisi - Tskhaltubo, Georgia, 2010), III World Asthma & COPD Forum, World Forum of Pediatrics (Dubai, UAE, 2010).

Работа апробирована на совместном заседании кафедры фармакологии педиатрического факультета, кафедры иммунологии МБФ и отдела I иммунологии ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе в изданиях рекомендованных ВАК РФ - 8.

Внедрение результатов исследования

Результаты диссертации внедрены, в учебный процесс на кафедре фармакологии ГОУ ВПО Севоро-Осетинской государственной медицинской академии Минздравсоцразвития.

Разработанные в диссертации модели и методы используются в экспериментальной работе кафедры и отдела иммунологии ГОУ ВПО Российского государственного медицинского университета Росздрава и отдела молекулярной и экспериментальной гематологии, онкологии и иммунологии ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, раздела собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего работы отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 25 рисунками и содержит 9 таблиц.

Заключение диссертационного исследования на тему "Исследование на доклиническом уровне иммуносупрессивных эффектов флавоноидов корня солодки."

выводы

1. Флавоноиды корня солодки in vitro дозозависимо угнетают пролиферацию мононуклеарных клеток человека и мышей, индуцированную I

Т-клеточными митогенами.

2. Исследование механизмов антипролиферативного действия» флаво-ноидов солодки на модели КонА-стимулированных лимфоцитов мышей, показывает, что они не связаны с индукцией апоптоза, но сопровождаются изменением баланса Т-хелперных цитокинов: флавоноиды корня солодки подавляют секрецию ИЛ-2 и ИФНу, и увеличивают уровень ИЛ-6 и ИЛ-17, что может свидетельствовать о переключении Thl иммунного ответа в направлении Thl7.

3. Парентеральное введение флавоноидов корня солодки на ранних сроках после сенсибилизации 2,4-динитрофторбензолом, подавляет реакцию контактной чувствительности у мышей, что сопровождается до-зозависимым уменьшением абсолютного числа клеток регионарных лимфоузлов за счет снижения их пролиферативного ответа.

4. Снижение пролиферативного ответа клеток регионарных лимфоузлов, как и в случае митоген-стимулированной пролиферации in vitro, сопровождается изменением цитокинового баланса: наблюдается уменьшение секреции ИЛ-2, ИФНу и ИЛ-4 и увеличение продукции ИЛ-10' и ИЛ-17 клетками регионарных лимфоузлов, что может свидетельствовать о переключении Thl и Th2 иммунных ответов в процессе развития контактной чувствительности на формирование ТЫ7-лимфоцитов.

5. На поздних сроках от начала сенсибилизации 2,4-динитрофторбензолом, после завершения фазы пролиферации и миграции зрелых эффект оров из регионарных лимфоузлов, обработка флавоноидами корня солодки суммарной фракции спленоцитов, а также выделенных из нее с помощью иммуномагнитной сепарации Т-клеток, приводит к блокаде адоптивного переноса реакции контактной чувствительности несенсибилизированным мышам-реципиентам.

6. Блокирующий эффект флавоноидов солодки не наблюдается в случае обработки основной эффекторной популяции, отвечающей за адоптивный перенос контактной чувствительности - СВ8+ клеток. Воспроизведение блокирующего эффекта флавоноидов корня солодки, происходит только после обработки СВ4+ популяции и последующего ее адоптивного переноса совместно с СБ8+ эффекторами несенсибилизированным мышам-реципиентам.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Албегова, Диана Заурбековна

1. Батурин А.К., Тутельян В .А., Мартинчик Э.А. Флавоноиды: содержание в пищевых продуктах, уровень потребления, биодоступность // Вопросы питания 2004. - №4. - С. 43-48.

2. Денисова С.Б., Карачурина Л.Т., Муринов Ю.И., Хайруллина В.Р. Антиоксидантное и гепатозащитное действие флавоноидов корня солодки. II Всероссийская конференция Химия и технология растительных веществ: Сборник материалов. 2002. - С. 67-68.

3. Зенков К.Н., Меньщикова Е.Б., Ткачев В.О. Некоторые принципы и механизмы редокс-регуляции // Кислород и антиоксиданты. 2009. -Vol. 1.-Р. 3-64.I

4. Корулькин Д.Ю., Абилов Ж.А., Музычкина P.A., Толстиков Г.А. Рос. акад. наук, Сиб. отд, Новосиб. ин-т органической химии. — Новосибирск: Академическое издательство «Гео». 2007. - 232с.

5. Кравченко JI.B., Морозов C.B., Авреньева Л.И., и др. Оценка антиокIсндантной и антитоксической эффективности природного флавонои-да дигидрокверцетина // Токсикол. вестн. 2005. - №1. - С. 14-20.1

6. Кренски А., Штром Т., Блюстоун Дж. Иммуномодуляторы: иммуно-депрессанты, иммуностимуляторы и средства, вызывающие иммунологическую толерантность // Клиническая фармакология по Гудману и Гилману. Москва. - 2006. - С. 1126-1143.

7. Лазарева Д.Н., Плечев В.В., Моругова Т.В., Самигуллина Л.И. Растения, стимулирующие иммунитет // Уфа: Изд. «Башкортостан» -2005.-96с.

8. Ларина H.A., Неклюкова М.Б., Потапенко А .Я. и др. Успехи клйни^еской иммунологии и аллергологии. 2001. - 2. - С. 277-286.

9. Меджитов Р., Джаневей Ч. Врожденный иммунитет // Казанский медицинский журнал. 2004. - Т. 85. - №3. - С. 161-167.

10. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Основные принципы иммуномодулирую-щей терапии // Аллергия, астма и клин, иммун. 2000. - № 1. - С. 9-16.

11. Шульпекова Ю.О. Флавоноиды расторопши пятнистой в лечении заболеваний печени // Русск. мед. журн. 2004. - Т. 12, №5. - С. 248-250.

12. Akiyama T., Ishida J., Nakawaga S., et al. Genistein, a specific inhibitir of tyrosine-specific protein kinases // J. Biol. Chem. 1987. - Vol. 262. - P. 5592-5595.

13. Aktas O., Prozorovski T., Smorodchenko A et al. Green tea epigallocate-chin-3-gallate mediates T cellular NF-kB inhibition and exerts neuroprotection in autoimmune encephalomyelitis // J. Immunol. 2004. - Vol. 173(9).-P. 5794-5800.

14. Atluru D., Jackson T.M., Atluru S. Genistein, a selective protein tyrosine kinase inhibitor, inhibits interleukin-2 and leukotriene B4 production from human mononuclear cells // Clin. Immunol. Immunopathol. 1991. -Vol.59.-P. 379-387.

15. Atluru S., Atluru D. Evidence that genistein, a protein-tyrosine kinase inhibitor, inhibits CD 28 monoclonal-antibody-stimulated human T cell proliferation // Transplantation. 1991. - Vol.51. - P. 448-450.

16. Beecher G.R. 'Overview of Dietary Flavonoids: Nomenclature, Occurrence and Intake' // J. Nutr. 2003. - Vol. 133. - P. 3248-3254.

17. Beretz A., Anton R., Cazenave J.P. The effects of flavonoids on cyclic nucleotide phosphodiesterases // Plant Flavonoids in Biology and Medicine: Biochemical, Pharmacological and Structure-Activity Relationships. 1986.-P. 281-296.

18. Boege F., Straub T., Kehr A. et al. Selected novel flavones inhibit the DNA binding or the DNA religation step of eukaryotic topoisomerase I // J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271(4). P. 2262-2270.

19. Boyum A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow // Stand. J. Clin. Lab. Invest. Vol. 21 (Supp. 97). - 1968.

20. Campbell M-A., Sefton C.M. Protein tyrosine phosphorylation is inducedtin murine B lymphocytes in response to stimulation with antiimmunoglobulin // EMBO J. 1990. - Vol. 9. - P. 2125-2131.

21. Cavani A. Immune regulatory mechanisms in allergic contact dermatitis and contact sensitization // Chem. Immunol. Allergy. 2008. - Vol. 94. — P. 93-100.

22. Cavani A., De Luca A. Allergic contact dermatitis: novel mechanisms and therapeutic perspectives // Curr. Drug. Metab. 2010. - Vol. 11(3). - P. 228-233.

23. Chang C.L., Zhang L.J., Chen R.Y., et al. Antioxidant and antiinflammatory phenylpropanoid derivatives from Calamus quiquesetiner-viiis // J. Nat. Prod.-2010.-Vol. 73(9).-P. 1227-1231.

24. Chauhan PS, Satti NK, Suri KA, et al. Stimulatory effects of Cuminum cyminum and flavonoid glycoside on Cyclosporine-A and restraint stress induced immune-suppression in Swiss albino mice // Chem. Biol. Interact. 2010. - Vol. 185(1). - P. 66-72.

25. Chen M., Gu H., Ye Y., et al. Protective effécts of hesperidin against oxidative stress of tert-butyl hydroperoxide in human hepatocytes // Food Chem. Toxicol. 2010. -Vol. 48(10). - P. 2980-2987.

26. Chen S.R., Xu X.Z., Wang Y.Hi,, et all Icariin;derivative inhibits inflammation, through suppression of p38 mitogen-activatedi protein kinase and nuclear factor-kappaB pathways // Biol: Pharm: Bull: — 2010. Vol. 33(8).-P. 1307-1313.

27. Cockcroft S. Phosphatidylinositol metabolism in mast cells and neutro^ phils // Cell Calcium. 1982. - Vol. 3. - P. 337-349.

28. Cumella J.C., Faden H., Middleton E. Selective activity of plant flavono-ids on neutrophil chemiluminescence. (CL) // J. Allergy Clin. Immunol. -1987.-Vol. 77.-P. 131.

29. Dangles O., Dufour C., Flavonoid-protein binging processes and their potential impact on human health. P. 67-83. In: Recent advances in polyphenol research. - Vol. 1. - ed. F. Daayf, V. Lattanzio, Wiléy-Blackwell: - 2008.

30. DáValos A, de la Peña G, Sánchez-Martín CC, et al. Effects of red grape juice polyphenols in NADPH oxidase subunit expression* in human neutrophils and mononuclear blood cells // Br. J. Nutr. 2009. - Vol. 102(8). P. 1125-1135.

31. De Whalley C.V., Rankin S.M. Flavonoids inhibit the oxidative modification of low density lipoproteins by macrophages // Biochem. Pharmacol. -1990.-Vol. 39 (11).-P. 1743-1750.

32. Dijsselbloem N, Goriely S, Albarani V. et al. A critical.role for p-53 in the control of NF-KB-dependent gene expression in TNF-a-stimulated dendritic cells exposed to genistein // J. Immunol. 2007. Vol. 178. — P. 5048-5057.

33. Donfack J.H., Simo C.C., Ngameni B., et al. Antihepatotoxic and antioxidant activities of methanol extract and isolated compounds from Ficus chla-mydocarpa // Nat. Prod. Commun.-2010.-Vol. 5(10).-P. 1607-1612.

34. Egger M., Beer A.G., Theurl M. et al. Monocyte migration: a novel effect and signaling pathways of catestatin // Eur. J. Pharmacol. 2008. - Vol. 598(1-3).-P. 104-111.

35. Felle H.H., Kondorosi E., Kondorosi A., Schultze M. How alfalfa root hairs discriminate between Nod factors and oligochitin elicitors // Plant Physiol. 2000. - Vol. 124(3).-P. 1373-1380.

36. Ferrandiz M.L., Alcaraz M.J. Anti-inflammatory activity and inhibition of arachidonic acid metabolism by flavonoids // Agents Actions 1991. Vol. 32.-P. 283-288.

37. Ferrandiz M.L., Nair A.G., Alcaraz M.J. Inhibition of sheep platelet ara-chjdonate metabolism by flavonoids from Spanish and Indian medicinal herbs // Pharmazie. 1990. - Vol. 45. - P. 206-208.

38. Fisher R.F., Long S.R. Rhizobium-plant signal exchange // Nature. -1992. -Vol. 357.-P. 655-660.

39. Formica J.V., Regelson W. Review of the biology of quercetin and related bioflavonoids // Food Chem. Toxicol. 1995. - Vol. 33. - P. 1061 -1080.

40. Fuleihan R., Spertini R., Geha R.S., Chatila T. Role of protein kinase activation in the induction of B cell adhesion by MHC class II ligands // J. Immunol.- 1992.-Vol. 149.-P. 1853-1858.

41. Funakoshi-Tago M., Tago K., Nishizawa C., et al. Licovhalcone A is a potent inhibitir of TEL-Jac2-mediated transformation through the specific inhibition of Stat3 activation // Biochem. Pharmacol. 2008. - Vol. 76(12).-P. 1681-1693.

42. Gamet-Payrastre L., Manenti S., Gratacap M.P., et al. Flavonoids and the inhibition of PKC and PI» 3-kinase // Gen. Pharmacol. 1999. - Vol. 32(3).-P. 279-286.

43. Gober M.D., Gaspari A.A. Allergic contact dermatitis // Curr. Dir. Autoimmun. 2008. - Vol. 10. - P. 1-26.

44. Gold M.R., Law D.A., DeFranco A.L. Stimulation of protein tyrosine phosphorylation by the B-lymphocyte antigen receptor // Nature (London). 1990. - Vol. 345. - P. 810-813.

45. Gorbachev A.V., Fairchild R.L. Regulatory role of CD4+ T cells during the development of contact hypersensitivity responses // Immunol. Res. — 2001. Vol. 24.-P. 69-77.

46. Grabbe S., Schwarz T. Immunoregulatory mechanisms involved in elicita-tion of allergic contact hypersensitivity // Immunol. Today. 1998. - Vol. 19.-P. 37-44.

47. Gschwendt M., Horn F., Kittstein W., Marks F. Inhibition of the calcium-and phospholipid-dependent protein kinase activity from mouse brain cy-tosol by quercetin // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1983. - Vol. 117.-P. 444-447.

48. Harada T., Arii M., Tsuji R.F. et al. Soy isoflavone aglycone modulates expression of cell surface antigens in vitro and in vivo. Biosci. Biotech-nol. Biochem. 2007. - Vol. 71(7). - P. 1769-1772.

49. Henkels K.M., Frondorf K., Gonzalez-Mejia M.E., et al. IL-8-induced neutrophil chemotaxis is mediated by Janus kinase 3 (JAK3) // FEBS Lett.-2011.-Vol. 585(1).-P. 159-166.

50. Hirao K., Yumoto H., Nakanishi T. et al. Tea catechins reduce inflammatory reactions via mitogen-activated protein kinase pathways in toll-likeireceptor 2 ligand-stimulated dental pulp cells // Life Sci. 2010. — Vol. 86(17-18).-P. 654-660.

51. Hollman P.C., Katan M.B. Absorption, metabolism and health effects of dietary flavonoids in man // Biomed. Pharmother. 1997. - Vol. 51. — P. 305-310.

52. Homung R.L., Young H.A., Urba W.J., Wiltrout R.N. Immunomodulation of natural killer cell activity by flavone acetic acid: Occurrence via induction of interferon alpha/beta // J. Natl. Cancer Inst. 1988b. - Vol. 80. -P. 1226-1231.

53. Hu H, Liu S, Yang Y, et al. In Rhizobium leguminosarum NodD represses its own transcription by competing with RNA polymerase for binding sites //Nucleic Acids Res. 2000. - Vol. 28(14). - P. 2784-2793.

54. Iwamura C., Shinoda K., Yoshimura M, et al. Naringenin chalcone suppresses allergic asthma by inhibiting the type-2 function of CD4 T cells // Allergology international. 2010. - Vol. 59. - P. 67-73.

55. Jin S., Zhang Q.Y., Kang X.M., et al. Daidzein induces MCF-7 breast cancer cell apoptosis via the mitochondrial pathway // Ann Oncol. 2010. -Vol. 21(2).-P. 263-268.

56. Kanazawa M., Satomi Y., Mizutani Y., et al. Isoliquiritigenin inhibits thegrowth of prostate cancer // Eur. Urol. 2003. - Vol. 43(5). - P. 580-586.i

57. Kang H.K., Ecklung D., Liu M., Datta S.K. Apigenin, a non-mutagenic dietary flavonoid, suppresses lupus by inhibiting autoantigen presentationfor expansion of autoreactive Thl and Thl7 cells // Arthritis Res. Ther. -2009.-Vol. 11(2).-P. 59.

58. Kehren J., Desvignes C., Krasteva M., et al: Cytotoxicity is mandatory for CD8(+) T cell-mediated contact hypersensitivity // J. Exp. Med. 1999. -Vol.1 89,-№5.-P. 779-786.

59. Kim Y., Narayanan S., Chang K.O. Inhibition of influenza virus replication by plant-derived isoquercetin // Antiviral Res. 2010. - Vol. 88(2). -P. 227-235.

60. Kim Y.J., Ко H., Park J.S., et al. Dimethyl cardamonin inhibits lipopolysac-charide-induced inflammatory factors through blocking NF-kappaB p65* activation // Int. Immunopharmacol. 2010. - Vol. 10(9). - P. 1127-1134.

61. Koretzky G.A., Picus I., Thomas M.L., Weiss A. Tyrosine phosphatase CI}45 is essential for coupling T-cell antigen receptor to the phosphatidyl inositol pathway // Nature (London). 1990. - Vol. 346. - P. 63-66.

62. Kwon H.J., Kim H.H., Ryu Y.B., et al. In vitro anti-rotavirus activity of polyphenol compounds isolated from the roots of Glycyrrhiza uralensis // Bioorg. Med. Chem. 2010. - Vol. 18(21). -P. 7668-7674.

63. Lamoke F., Labazi M., Montemari A. Trans-Chalcone prevents VEGF expression and retinal neovascularization in the ischemic retina // Exp. Eye Res.-2011.

64. Landolfi R., Nower R.L., Steiner M. Modification of platelet function and arachidonic acid metabolism by bioflavonoids. Structure-activity relationships // Biochem. Pharmacol. 1984. - Vol. 33. - P. 1525-1530.i

65. Lang D.R., Racker E. Effects of quercetin on Fl inhibitor or mitochondrial ATPase and energy-linked reactions in submitochondrial particles // Bio-chim. Biophys. Acta. 1974. - Vol. 333. - P. 180-186.

66. Lang I., Deak G.Y., Nekam K., et al. Hepatoprotective and immunomodulatory effects of antioxidant therapy // Acta. Med. Hung. 1988. - Vol.45.-P. 287-295.i

67. Lanni C., Becker E.L. Inhibition of neutrophil phospholipase A2 by p-bromophenylacyl bromide, nordihydroguaiaretic acid, 5,8,11,14-eicosatetrayenoic acid and quercetin // Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 1985. - Vol. 76. - P. 214-217.

68. Ledbetter J.A., Schieven G.L., Uckun G.M., Imboden J.B. CD45 cross-linking regulates phospholipase C activation and tyrosine phosphorylation of specific substrates in CD3/Ti stimulated T cells // J. Immunol. 1991. -Vol. 146.-P. 1577-1583.

69. Lee J.K., Kim S.Y., Kim Y.S., et al. Suppression of the TRIF-dependent signaling pathway of Toll-like receptors by luteolin // Biochem. Pharmacol 2009. - Vol. 77(8). - P. 1391-1400.

70. Lee K.M., Lee K.W., Jung S.K. et al. Kaempferol inhibits UVB-induced CQX-2 expression by suppressing Src kinase activity // Biochem. Pharmacol. 2010. - Vol. 80(12). - P. 2042-2049.

71. Lee T-P., Matteliano M.L., Middleton E. Effect of quercetin on human polymorphonuclear leucocyte lysosomal enzyme release and phospholipids metabolism // Life Sei. 1982. - Vol. 31. - P. 2765-2774.

72. Li R.R., Pang L.L., Du Q., et al. Apigenin inhibits allergen-induced airway inflammation and switches immune response in a murine model of asthma // Immunopharmacol. Immunotoxicol. 2010. - Vol. 32(3). - P. 364-370.

73. Long G.D., DeChatelet L.R., O'Flaherty J.T., et al. Effects of quercetin on magnesium-dependent adenosine triphosphatase and the metabolism ofhuman polymorphonuckear leucocytes // Blood. 1981. - Vol. 57. - P.561.566.

74. Lu J., Wang J.S., Kong L.Y. Anti-inflammatory effects of Huang-Lian-Jie-Du decoction, its two fractions and four typical compounds // J. Eth-nopharmacol. 2011.

75. Maggiolini M., Statti G., Vivacqua A., et al. Estrogenic and antiproliferative activities of isoliquiritigenin in MCF7 breast cancer cells // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2002. - Vol. 82 (4-5). - P. 315-322.

76. Manach C., Morand C., Demigne C., et al. Bioavailability of rutin and quercetin in rats // FEBS Lett. 1997. - Vol. 409. - P. 12-16.

77. McGeachy M.J., Bak-Jensen K.S., Chen Y., Tato C.M., et al. TGF-betatand IL-6 drive the production of IL-17 and IL-10 by T cells and restrain T(H)-17 cell-mediated pathology. Nat. Immunol. 2007. - Vol. 8(12). -P. 1390-1397.

78. Melgarejo E., Medina M.A., Sanchez-Jimenez F., Urdiales J.L. Epigallo-catechin gallat reduces human monocyte mobility and adhesion in vitro // Br. J. Pharmacol. 2009. - Vol. 158(7).-P. 1705-1712.

79. Milencovich M:, Arsenovic-Ranin N., Stojic-Vukanic Z., et al. Quercetinameliorates experimental autoimmune myocarditis in rats // J Pharmi

80. Pharmaceut Sei. 2010. - Vol. 13(3). - P. 311-319.

81. Morishima C., Shuhart M.C., Wang C.C. et al. Silymarin inhibits in vitro T-cell proliferation and cytokine production in hepatitis C virus infection // Gastroenterology. Vol. 138(2). - P. 671-681.

82. Namgoong S.Y., Son K.H., Chang H.W., et al. Effects of naturally occurring flavonoids on mitogen-induced lymphocyte proliferation and mixed lymphocyte culture // Life Sei. 1993. - Vol. 54. - P. 313-320.

83. Nishizuka Y. Protein kinase and lipid signaling for sustained cellular responses // FASEB J. 1995. - Vol. 9. - P. 484-496.

84. Notoya M, Tsukamoto Y, Nishimura H, et al. Quercetin, a flavonoid, inhibits the proliferation, differentiation, and mineralization of osteoblasts in vitro // Eur. J. Pharmacol. 2004. Vol. 485(1-3). - P. 89-96.

85. Nworu C.S., Esimone C.O., Tenbusch M., et al. Adjuvant properties of AcFl, an immunostimulant fraction of Alchornea cordifolia extract // Immunol. Invest. 2010. - Vol. 39(2). - P. 132-158.

86. Okamoto I, Iwaki K, Koya-Miyata S. The flavonoid Kaempferol suptpresses the graft-versus-host reaction by inhibiting type 1 cytokine production and CD8+ T cell engraftment // Clinical Immunol. 2002. -Vol. 103(2).-P. 132-144.

87. Ono K., Nakane H. Mechanisms of inhibition of various cellular DNA and RNA polymerases by several flavonoids // J. Biochem. 1990. - Vol. 108.-P. 609-613.

88. Park J.H., Lim H.J., Lee K.S., et al. Anti-proliferative effect of licochal-cone A on vascular smooth muscle cells // Biol. Pharm. Bull. 2008.

89. Vol. 31(11).-P. 1996-2000.

90. Park S.J., Youn H.S. Suppression of homodimerization of toll-like receptor 4 by isoliquiritigenin // Phytochemistry. 2010. - Vol. 71(14-15). - P. 1736-1740.

91. Patel M.D., Samelson L.E., Klausner R.D. Multiple kinases and signal transduction: Phosphorylation of the T cell antigen receptor complex // J. Biol. Chem.- 1987. -Vol. 262.-P. 5831-5838.

92. Paust S., Lu L., McCarty N., Cantor H. Engagement of B7 on effector T cells by regulatory T cells prevents autoimmune disease. // Proc. Nat. Acad. Sci.-2004.-Vol. 101.-№28.-P. 10398-10403.

93. Perret X., Staehelin C., Broughton W.J. Molecular basis of symbioticipromiscuity // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. - Vol. 64. - P. 180-201.

94. Polster J., Dithmar H., Walter F. Are histones the targets for flavan-3-ols (catechins) in nuclei? // Biol. Chem. 2003. - Vol. 384(7). - P. 997-1006.

95. Rao YK, Fang SH, Tzeng JM. Inhibitory effects of the flavonoids isolated from Waltheria indica on the production of NO, TNF-a and IL-12 in activated macrophages // Biol. Pharm. Bull. 2005. - Vol. 28(5). - P. 912-915.

96. Rogers J.C., Williams D.L. Kaempferol inhibits myosin light chain kinase //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. - Vol. 164. - P. 419-425.

97. Roy C.K., Das A.K. Comparative evaluation of different extracts of leaves of Psidium guajava Linn, for hepatoprotective activity // Pak. J. Pharm. Sci. 2010. - Vol. 23(1). - P. 15-20.

98. Ruckstuhl M., Landry Y. Inhibition of lung cyclic AMP- and cyclic GMP-phosphodiesterases by flavonoids and other chromone-like compounds // Biochem. Pharmacol. 1981. - Vol. 30. - P. 697-702.i

99. Sakagami H, Takeda M., Sugaya K., et al. Stimulation by epigallocate-chin gallate of interleukin-1 production by human peripheral blood mononuclear cells // Anticancer Res. 1995. - Vol. 15. - P. 971-974.

100. Sakai T., Furoku S., Nakamoto M., et al. The soy isoflavone equol enhances antigen-specific IgE production in ovalbumin-immunized BALB/c mice // J. Nutr. Sci. Vitaminol. 2010. - Vol. 56. - P. 72-76.

101. Samelson L.E., Patel M.D., Weissman A.M., et al. Antigen activation of murine T cells Induces tyrosine phosphorylation of a polypeptide associated with the cell antigen receptor // Cell. 1986. - Vol. 46. - P. 1083-1090.

102. Saslowslcy D.E., Warek U., Winkel B.S. Nuclear localization of flavonoid enzymes in Arabidopsis // J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280(25) - P. 23735-23740.

103. Schlutze M., Kondorosi A. Regulation of symbiotic root nodule development // Ann. Rev. Genet. 1998. - Vol. 32. - P. 33-57.

104. Schroeter H., Boyd C., Spencer J.P., Williams R.J., et al. MAPK signaling in neurodegeneration: influences of flavonoids and of nitric oxide // Neurobiol. Aging.-2002.-Vol. 23(5).-P. 861-880.t

105. Singh R.P., Deep G., Chittezhath M., et al. Effect of silibinin on;the growth and progression of primary lung tumors in mice // J. Natl. Cancer Inst. 2006. - Vol. 98 (12). - P. 846-855.

106. Sookkongwaree K, Geitmann M, Roengsumran S, et al. Inhibition of viral proteases by Zingiberaceae extracts and flavones isolated from Kaempfe-ria parviflora // Pharmazie. 2006. - Vol. 61(8). - P. 717-721.

107. Tamir S., Eizenberg M., Somjen D., et al. Estrogenic and antiproliferative properties of glabridin from licorice in human breast cancer cells // Cancer Res. 2000. - Vol. 60(20). - P. 5704-5709.

108. Taylor A., Verhagen J., Blaser K., et al. Mechanisms of immune suppression by interleukin-10 and transforming growth factor-(3: the role of T regulatory cells // Immunology. 2006. - Vol. 117. - №4. - P. 443-442.

109. Trevillyan J.M., Lu Y., Atluru D., et al. Differential inhibition of T cell receptor signal transduction and early activation events by a selective inhibitor of protein-tyrosine kinase // J. Immunol. 1990. - Vol. 145. - P. 3223-3230.

110. Tripathi Y.B., Pandey N., Tripathi D., Tripathi P. Oily fraction of Seme-carpus anacardium Linn nuts involves protein kinase C activation for its pro-inflammatory response // Indian J. Exp. Biol. 2010. - Vol. 48(12). -P. 1204-1209.

111. Vcrmerris W., Nicholson R. Isolation and identification of phenolic compounds. In: Phenolic Compound Biochemistry. Springer, the Netherlands. -2006.-P. 152-153.

112. Vicentini F.T., He T., Shao Y., et al. Quercetin inhibits UV irradiation-induced inflammatory cytokine production in primary human keratino-cytes by supressing NF-kB pathway // J. Dermatol. Sci. 2011. - Vol. 61(3).-P. 162-168.

113. Vocanson M, Hennino A., Rozieres A., et al. Effector and regulatory mechanisms in allergic contact dermatitis // Allergy. 2009. -Vol. 64.t12.-P. 1699-1714.

114. Waldmann T.A. Immunotherapy: past, present and future // Nat. Med. -2003. Vol. 9(3). - P. 269-277.

115. Wang J., Zhang Q., Jin S., et al. Genistein modulates immune responses in collagen-induced rheumatoid arthritis model // Maturitas. 2008. -Vol. 59(4).-P. 405-412.

116. Wang J.F., Yin G.F., Zhou X.J., et al. Anti-inflammatory flavonolignans from Hydrocarpus anthelminthica seeds // J. Asian Nat. Prod. Res. -2011.-Vol. 13(1).-P. 80-83.

117. Wang Y., Raffoul J.J., Che M., et al. Prostate cancer treatment is enihanced by genistein in vitro and in vivo in a syngeneic orthotopic tumor model // Radiat. Res. 2006. - Vol. 89(9). - P. 950-954.

118. Watanabe H., Unger M., Tuvel B. et al. Contact hypersensitivity: The mechanism of immune responses and T cell balance // J. Interferon Cytokine Res. 2002. - Vol. 22. - P. 407-412.

119. Wu J-H, Wang Y-R, Huang W-Y, Tan R-X. Anti-priliferative and pro-apoptotic effects of tectorigenin on hepatic stellate cells // World J. Gastroenterol. 2010. - Vol. 16(31). - P. 3911-3918.

120. Xavier C.R., Silva A.C., Schwingel L.C. Improvement of genistein content in solid genistein/ß-cyclodextrin complexes // Quirn. Nova. 2010. — Vol. 33(3). -P. 587-590.

121. Xie Y.C., Dong X.W., Wu X.M., et al. Inhibitory effects of flavonoids extracted from licorice on lipopolysaccharide-induced acute pulmonary inflammation in mice // Int. Immunopharmacol. 2009. — Vol. 9(2). - P. 194-200.

122. Xue X., Qu X.J., Yang Y., et al. Baicalin attenuates focal cerebral ischemic reperfusion injury through inhibition of nuclear factor kB p65 activation // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010. - Vol. 403(3-4). - P. 398-404.

123. Yamanashi Y., Kakiuchi T., Milizuguchi J., et al. Association of B cell antigen receptor with protein tyrosine kinase // Lyn. -Science (Wash.

124. DC).- 1991.-Vol. 251.-P. 192-194.i

125. Yang F., Villiers W.J., McClain C.J., Varilek G.W. Green tea polyphenols block endotoxin-induced tumor necrosis factor production and lethality in a murine model // J. Nutri. - 1998. - Vol. 128. - P. 2334-2340.

126. Yang X., Zhao X., Phelps M.A. et al. A novel liposomal formulation of flavopiridol // Int. J. Pharm. 2009. - Vol. 365(1-2). - P. 170-174.

127. Yook H.S., Kim K.H., Park J.E., Shin H.J. Antioxidative and antiviral properties of flowering cherry fruit (Prunus serrulata L. var. spontanea) // Am J. Clin. Med. 2010. - Vol. 38(5). - P. 937-948.

128. Yu C.S., Lai K.C., Yang J.S. Quercetin inhibited murine leukemia WEHI-3 cells in vivo and promoted immune response // Phytother. Res. 2010. -Vol. 24(2).-P. 163-168.

129. Zen K., Reaves T.A., Soto I., Liu Y. Response to genistein: assaying the activation status and Chemotaxis efficacy of isolated neutrophils // J. Immunol. Methods. 2006. - Vol. 309(1-2). - P. 86-98.

130. Zeng S., Luo G.Q., Liu D.Y. The Chemotaxis effect of ampelopsin on the immunocytes // Zhong Yao Cai. 2006. - Vol. 29(3). - P. 260-262.

131. Zhou P., Gross S., Liu J.PI., et al. Flavokawain B, the hepatotoxic constituent from kava root, induces GSH-sensitive oxidative stress through modulation of IKK/NF-kappaB and MAPK signaling pathways // FASEB

132. J. 2010. - Vol. 24(12). - P. 4722-4732.i

133. Zunino S.J., Storms D.H. Resveratrol alters proliferative responses and apoptosis in human activated B lymphocytes in vitro // J. Nutr. 2009.1. Vol. 139.-P. 1603-1608.