Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Иммуносупрессивные и противоопухолевые фармакодинамические эффекты флавоноидов корней солодки

На правах рукописи

Павлова Светлана Ивановна

ИММУНОСУПРЕССИВНЫЕ И ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ФАРМАКОДИНАМИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ФЛАВОНОИДОВ КОРНЕЙ СОЛОДКИ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

12 мдр т

Москва-2012

005014887

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Мин-здравсоцразвития России и Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздравсоцразвития России.

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Иван Генрихович Козлов

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, профессор

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Николай Львович Шимановский

Даниил Борисович Утешев Алексей Викторович Тутельян

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Минздравсоцразвития России

Защита состоится «» 2012 года в 14:00 часов на заседании

Диссертационного совета Д 208.072.01 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997 г. Москва, ул. Островитянова, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова по адресу: 117997 г. Москва, ул. Островитянова, д.1.

Автореферат разослан « ^ » 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Н.Г. Потешкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

За последние десятилетия в медицине произошел переход исследований на моле-/лярный уровень, и появились более детальные сведения о патогенезе многих завоеваний, существенно изменившие представления о фармакотерапевтических подходах их лечению [Козлов И.Г., 2006]. Важнейшим достижением этого этапа исследований тало выявление молекул, которые играют ведущую роль в возникновении или про-рессировании патологического процесса. Это сформировало концепцию мишень-аправленной терапии и обосновало актуальность разработки инновационных «тар-етных» препаратов, способных селективно корригировать ключевые звенья патогене-а.

В связи с завершением интенсивных исследований в биотехнологии и иммуноло-ии, а также молекулярной биологии и генетике рака, во второй половине XX века были азработаны и внедрены принципиально новые иммуносупрессанты и противоопухо-евые препараты. Примерами таковых лекарственных средств являются монокло-альных антитела и низкомолекулярные ингибиторы сигнальных молекул (циклоспо-ин, макролидные антибиотики, «тинибы») [Кренски А. с соавт., 2006]. Механизмы дей-твия таких лекарственных средств основаны не на неспецифическом уничтожении ак-|Ивно пролиферирующих клеток, а целенаправленной элиминации/угнетении опухолевых или иммунокомпетентных клеток идентичной природы.

Перспективы развития данных областей фармакотерапии тесно связаны с откры-ием более специфичных мишеней. Так, несомненно, актуальным является изыскание высоко избирательных иммуносупрессантов, не оказывающих влияния на клетки, которые не участвуют в иммунном ответе в момент терапевтического использования препаратов. Мишенью для этой подгруппы может являться запущенный в активированных лимфоцитах конкретный регуляторный или эффекторный механизм [Козлов И.Г., 2006]. Идеальный иммуносупрессант должен обладать избирательным действием на отдельные субпопуляции лимфоцитов, не вызывая повреждения как других клеток организма, так и лимфоцитов, осуществляющих реакции противоинфекционного и противоопухолевого иммунитета. На место подобных иммуносупрессантов на сегодняшний день претендуют так называемые «регуляторы/переключатели» иммунного ответа.

Безусловно, «таргетные» лекарственные средства кардинально изменили стратегию фармакотерапии, продемонстрировав высочайшую эффективность в отношении отдельных заболеваний. Однако довольно часто эффект такого препарата оказывается ниже ожидаемого, а резистентность к нему развивается так же, как и при стандартной терапии. Таким образом, в большинстве случаев современные средства служат лишь дополнением к стандартным схемам лечения, в которых классические «нетаргет-ные» противоопухолевые и иммуносупрессивные препараты все еще занимают лидирующее положение.

С точки зрения разработки новых лекарственных препаратов, большой интерес представляет класс полифенольных соединений растительного происхождения, поскольку флавоноиды демонстрируют разнообразные биологические эффекты на орга-низменном уровне [Оог^аск е( а1„ 2010; Ьее ^У. е1 а1„ 2009; 1_и и. е1 а1„ 2011; МэМ-гика Т. е{ а1., 2011]. Изучение их механизмов действия на клеточном и молекулярном уровнях показывает, что некоторые флавоноиды способны селективно влиять на ак-

тивность протеинкиназ [Atluru D. et a!., 1991; Akiyama T. et al., 1987; Trevillyan J.M. et al., 1990], а, как следствие, и на активацию сигнальных путей в клетках млекопитающих [Chen С.С. et al., 2004; Funakoshi-Tago М. et al., 2008; Hirao К. et al., 2010]. На наш взгляд, на этом механизме действия может базироваться не только противоопухолевый, но и селективный иммуносупрессивный эффекты флавоноидов. Это требует экспериментального обоснования возможности применения полифенольных соединений в клинической практике. В связи с чем представляется актуальным исследования имму-нотропной и противоопухолевой эффективности веществ флавоноидной структуры, а также прицельное изучение селективности их влияния на различные звенья (адаптивное и врожденное) иммунной системы.

Цель и задачи

Цель: экспериментальное обоснование перспективы создания новых иммуносу-прессивных и противоопухолевых лекарственных средств на основе соединений флавоноидной структуры, выделенных из экстракта корней солодки.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Отработать технологию выделения и стандартизации биологически активной фракции флавоноидов корней солодки (ФКС).

2. Оценить влияние ФКС на ростовые характеристики (пролиферация, апоптоз) и функциональную активность (продукция цитокинов) клеток адаптивного иммунитета в моделях активации Т- и В-лимфоцитов in vitro.

3. Исследовать фармакологическую эффективность ФКС в экспериментальных моделях иммунопатологических процессов Т- и В-клеточной направленности (контактной чувствительности, индуцированной 2,4-динитрофторбензолом (ДНФБ); реакции трансплантат против хозяина; овальбумин-индуцированной респираторной аллергии).

4. Изучить молекулярные и клеточные механизмы иммунотропных эффектов ФКС, используя модель ДНФБ-индуцированной контактной чувствительности у мышей.

5. Оценить влияние ФКС на некоторые функциональные показатели клеток-эффекторов врожденного иммунитета in vitro: экспрессию поверхностных маркеров активации, продукцию активных форм кислорода, а также поглотительную и бактерицидную активность фагоцитов.

6. Провести оценку влияния ФКС на некоторые показатели врожденного иммунитета in vivo в экспериментальных моделях пептон-индуцированной миграции фагоцитов в брюшную полость и острой стафилококковой инфекции у мышей.

7. Изучить влияние ФКС на ростовые характеристики (пролиферация, апоптоз) клеток различных опухолевых линий и оценить прямую цитотоксичность флавоноидов солодки по отношению к опухолевым клеткам in vitro.

8. Провести оценку эффективности ФКС в моно- и комбинированной с циклофосфа-мидом экспериментальной терапии в модели перевиваемого лимфолейкоза Р388 у мышей.

9. Наметить пути выделения фармакологически активных соединений суммарной фракции ФКС.

Основные положения, выносимые на защиту

1. ФКС подавляют пролиферацию активированных Т- и В-лимфоцитов in vitro. Возможными механизмами отмены активации лимфоцитов являются как прямое анти-

пролиферативное действие, так и изменение баланса Т-хелперных цитокинов, но не индукция апоптоза.

2. ФКС проявляют иммуносупрессивные эффекты в экспериментальных моделях иммунопатологических процессов Т- и В-клеточной направленности у мышей: ДНФБ-индуцированной контактной чувствительности, реакции трансплантат против хозяина и овальбумин-индуцированной респираторной аллергии.

3. Механизмами иммуносупрессорного действия ФКС in vivo являются: ингибирование пролиферации лимфоцитов; изменение цитокинового баланса, свидетельствующее о «переключении» дифференцировки субпопуляций Т-лимфоцитов-хелперов при индукции иммунного ответа; а также непрямая отрицательная регуляция функций зрелых Т-лимфоцитов-эффекторов.

4. ФКС практически полностью отменяя активацию клеток адаптивного иммунного ответа, незначимо изменяют функциональные показатели клеток-эффекторов врожденного иммунитета: экспрессию активационных маркеров, миграционную, поглотительную и микробицидную функцию фагоцитов.

5. ФКС подавляют пролиферацию и индуцируют апоптоз в культуре опухолевых клеток различного гистогенеза, а также повышают эффективность циклофосфамида в экспериментальной противоопухолевой терапии.

Научная новизна исследования

В работе был отработан и модифицирован метод выделения фармакологически активных полифенольных соединений из экстракта корней солодки. Для повышения репрезентативности исследований каждую новую серию выделенных флавоноидов в дополнение к общеизвестному фотохимическому методу (цветная реакция с галловой кислотой) предложено стандартизовать в биологической системе (по выраженности угнетения пролиферации опухолевой линии). Используя стандартизированный препарат ФКС, впервые было проведено исследование его фармакодинамических эффектов в моделях, рекомендованных для доклинического изучения новых фармакологических веществ с иммунотропной и противоопухолевой активностью.

Впервые был продемонстрирован антипролиферативный эффект ФКС in vitro в отношении митоген-активированных человеческих и мышиных Т- и В-лимфоцитов. Было доказано, что антипролиферативный эффект ФКС не связан с индукцией апоптоза. Одним из механизмов антипролиферативного эффекта является модулирующее влияние ФКС на продукцию цитокинов: подавление секреции ИЛ-2 и ИФНу, и повышение уровня ИЛ-6 и ИЛ-17.

Впервые было показано, что ФКС при парентеральном введении проявляют фармакологическую эффективность в экспериментальных моделях иммунопатологических процессов Т- и В-клеточной направленности у мышей: подавляют характерные проявления ДНФБ-индуцированной контактной чувствительности, реакции трансплантат против хозяина и овальбумин-индуцированной респираторной аллергии.

Впервые было продемонстрировано, что внутривенное введение ФКС на ранних сроках после ДНФБ-сенсибилизации приводит как подавлению пролиферативного ответа, так и к снижению абсолютного числа клеток регионарных лимфоузлов. Это коррелирует с изменением цитокинового баланса: наблюдается уменьшение секреции ИЛ-2, ИФНу и ИЛ-4 и увеличение продукции ИЛ-10 и ИЛ-17 клетками регионарных лимфоузлов, что может свидетельствовать о способности флавоноидов солодки переключать

Th1ATh2 иммунные ответы в процессе развития контактной чувствительности на формирование ТМ7-лимфоцитов.

Впервые показано, что на поздних сроках после ДНФБ-сенсибилизации, обработка флавоноидами солодки суммарной фракции спленоцитов, а также выделенных из нее с помощью иммуномагнитной сепарации Т-клеток, приводит к блокаде адоптивного переноса реакции контактной чувствительности несенсибилизированным сингенным мышам-реципиентам. Впервые установлено, что блокирующий эффект ФКС не наблюдается в случае обработки CD8* лимфоцитов-эффекторов, выделенных из спленоцитов сенсибилизированных животных. Воспроизведение блокирующего эффекта ФКС, происходит только после обработки С04*-популяции (не проявляют свойств эффекторов контактной чувствительности) и последующего ее адоптивного переноса совместно с С08+-эффекторами несенсибилизированным мышам-реципиентам.

Впервые показано, что внутривенное введение флавоноидов солодки мышам с овальбумин-индуцированной респираторной аллергией на стадиях сенсибилизации снижает уровень сывороточных антиген-специфических IgE и lgG1, а также изменяет спектр синтезируемых спленоцитами цитокинов (уменьшение секреции ИЛ-2, и увеличение продукции ИФНу и ИЛ-17). Это может свидетельствовать о способности ФКС переключать Th2 иммунный ответ в процессе сенсибилизации к овальбумину на формирование антагонистичных популяций ТМ/ТМ7-лимфоцитов.

Кроме того, продемонстрировано, что введение препарата ФКС на стадии провокации респираторной аллергии интрафарингеальным введением овальбумина мышам, приводит к значимому уменьшению воспалительной инфильтрации бронхов и уменьшению эозинофилов в бронхоальвеолярной лаважной жидкости.

Комплексная оценка влияния ФКС на функции фагоцитов показала, что при использовании их в концентрации (20 мкг/мл), практически отменяющей пролиферацию активированных Т- и B-лимфоцитов, не происходит подавления активации, а также миграционной, поглотительной и бактерицидной активности нейтрофилов и моноцитов/макрофагов. Наряду с этим внутрибрюшинное введение ФКС повышает резистентность мышей к острой стафилококковой инфекции. Это позволяет говорить о возможности селективного иммуносупрессивного эффекта ФКС: ингибировании адаптивного звена иммунной системы, без выраженного подавления функций клеток-эффекторов врожденного иммунитета.

С использованием различных опухолевых клеточных культур продемонстрировано, что ФКС подавляют пролиферацию и индуцируют апоптоз в опухолевых клетках различного видового и гистологического происхождения, а также повышают эффективность алкилирующего цитостатика циклофосфамида в экспериментальной противоопухолевой терапии перевиваемого лимфолейкоза Р388 у мышей.

На основании сравнительного химического и фармакологического анализа в ходе разделения суммарного препарата ФКС определена наиболее активная фракция флавоноидов солодки.

Практическая значимость работы

В процессе работы был отработан и модифицирован метод, позволяющий без значительных трудовых затрат, получать биологически активные полифенольные соединения из экстракта корней солодки, а также подобран комплекс моделей и методов, позволяющих оценивать иммунотропную и противоопухолевую активность и эффективность новых фармакологических агентов.

Совокупность полученных данных углубляет фундаментальные представления о механизмах развития иммунного ответа и патогенезе иммунопатологических процессов, а также дополняют сведения о механизмах фармакологического действия биологически активных веществ флавоноидной структуры.

Доказанное в ходе выполнения работы отсутствие прямой цитотоксичности, возможность регуляции иммунного ответа, а также различное влияние препарата ФКС на функции иммунокомпетентных клеток, участвующих в механизмах врожденного и адаптивного звеньев иммунитета открывает возможность селективной фармакологической иммуносупрессии.

Выявленные в исследованиях принципиально новые механизмы иммунотропного и противоопухолевого действия ФКС, низкомолекулярная структура флавоноидов (что определяет возможность их химического синтеза и направленной модификации), а также данные, полученные в ходе анализа отдельных фракций, являются достаточным основанием для рассмотрения флавоноидов корней солодки как перспективной основы для разработки новых иммуносупрессивных и противоопухолевых лекарственных средств.

Внедрение результатов исследования

Результаты диссертации внедрены в учебный процесс кафедры фармакологии РНИМУ Н.И. Пирогова. Разработанные в диссертации модели и методы используются в экспериментальной работе кафедры и отдела иммунологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова, а также отдела молекулярной и экспериментальной медицины ФГБУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева.

Публикации и апробация работы

Материалы диссертации были представлены на III Съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007); VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2008); Объединенном Иммунологическом Форуме (Санкт-Петербург, 2008); Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии (Казань, 2009); 2nd European Congress of Immunology «Immunity for Life, Immunology for Health» (Берлин, Германия, 2009); III World Asthma and COPD Forum and the World Forum of Pediatrics (Дубай, ОАЭ, 2010); IV World Asthma and COPD Forum, XVI International Congress on Rehabilitation in Medicine and Immunorehabilitation (Париж, Франция, 2011); 30th Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology (Стамбул, Турция, 2011); 11th Annual Meeting of the Federation of Clinical Immunology Societies (Вашингтон, США, 2011); III Всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученых «Достижения молекулярной медицины как основа разработки инновационных лекарственных средств» (Волгоград, 2011).

Работа апробирована на совместном заседании кафедры фармакологии педиатрического факультета, кафедры иммунологии МБФ и отдела иммунологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова. По материалам диссертации опубликовано 57 печатных работы, в том числе 22 статьи в изданиях рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 244 страницах машинописного текста в виде монографии и состоит из введения, главы, посвященной материалам и методам исследований,

а также 6 глав, каждая из которых включает обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение. В конце диссертации представлены заключение, выводы и библиографический указатель, включающий 314 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 56 рисунками и содержит 16 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Препарат ФКС: выделение, верификация, анализ и стандартизация. Флаво-ноиды выделяли из сухого экстракта корней солодки (ООО «Хармс», С.-Петербург) методом спиртовой экстракции с последующей очисткой с применением адсорбционной колоночной хроматографии на полиамидном сорбенте (Polyamide 6; Fluka, Германия) [Карташова Г.С. с соавт., 1997; Корулькин Д.Ю. с соавт., 2007; Левданский В.А. с со-авт., 2006]. Полифенольный состав ФКС доказывали проведением анализа спектров поглощения в ультрафиолетовом (УФ) и инфракрасном (ИК) диапазонах длин волн. Фракционирование ФКС проводили методом обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) с использованием системы Agilent 1200 (Agilent Technologies, США) при длине волны 254,4 нм. Система снабжалась колонкой J'sphere ODS-M8O (4,6*250) мм (YMC Co. Ltd, Германия). В качестве подвижной фазы использовали смесь растворителей ацетонитрил-вода (23:77 %об.), скорость потока 1 мл/мин. ФКС стандартизировали фотометрическим методом Folin-Ciolalteu, используя в качестве стандарта галловую кислоту (Acros Organics, Германия) [Vermerris W. et al., 2006]. Дополнительно проводилась биологическая стандартизация каждой серии препарата с использованием опухолевой линии U-937. В экспериментах использовали препарат ФКС, который в концентрации 10 мкг/мл (в пересчете на галловую кислоту) ингибировал пролиферацию клеток U-937 до уровня 44,0±2,4% от контроля. Лабораторным животным препарат вводили парентерально в изотоническом растворе натрия хлорида с 5% содержанием высокоочищенного этанола, однократная доза ФКС составляла 10 мг/кг. Мыши контрольной группы получали соответствующие объемы растворителя. В опытах in vitro в культуру клеток вносили ФКС в диапазоне 0,1-20 мкг/мл, так, чтобы финальная концентрация этанола не превышала 1%. В контрольные лунки добавляли соответствующие объемы этанола.

Лабораторные животные. Эксперименты проводили на 8-10 недельных (масса 18-22 г.) мышах линий Balb/c, СВА, C57BI/6, DBA/2, а также гибридах BDF1 (C57BI/6xDBA/2)F1, полученных из питомника РАМН (Крюково, Московская область). При работе с животными руководствовались правилами и Международными рекомендациями Европейской конвенции по защите животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997). Протоколы исследований одобрены этическим комитетом РНИМУ им. Н.И. Пирогова.

Клетки периферической крови человека. Выделенную лейкомассу [Пинегин Б.В. с соавт., 2001] или мононукпеарные клетки (МНК) [Boyum А., 1968] периферической крови практически здоровых добровольцев ресуспензировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (полная среда). Для стимуляции Т- и В-лимфоцитов использовали митогены: фитогемагглютинин (ФГА), анти-СРЗ моноклональные антитела (анти-СОЗ) и поквид-митоген (PWM).

Клетки лимфоидных органов мышей. МНК выделяли стандартными методами щадящей гомогенизации лимфоидных органов с удалением эритроцитов путем осмотического лизиса. Клетки культивировали в полной среде RPMI-1640. Для

стимуляции T- и B-лимфоцитов использовали конконавалин А (КонА) и липополисахарид (ЛПС) соответственно. Для иммуномагнитной сепарации субпопуляций лимфоцитов использовали набор реактивов Dynal Mouse Negative Isolation Kit (Invi-trogen Dynal AS, Норвегия).

Клетки бронхоальвеолярной лаважной жидкости мышей. Бронхоальвеоляр-ный лаваж проводили стерильным раствором фосфатно-солевого буфера (ФСБ). Бронхоальвеолярная лаважная жидкость (БАЛ) использовалась для общего и дифференциального подсчета клеток в цитологических препаратах, которые готовили по технологии, описанной в наборе красителей Диахим-Дифф-Квик (НПФ «Абрис+», Россия). Долю эозинофилов, нейтрофилов, макрофагов и лимфоцитов подсчитывали, опираясь на стандартные морфологические критерии.

Клетки опухолевых культур и штаммов. В работе использованы линии опухолевых клеток различного видового (мыши и человека) и гистологического происхождения (А-431, НТ-29, U-373, GL-6, U-937, RAW 264.7, L-929), полученные из коллекции банков глубокозамороженных клеточных культур НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского и ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева. Для поддержания экспоненциального роста культуру пассировали каждые 3-4 дня. Опухолевый штамм Р388 поддерживали пассированием in vivo на мышах линии DBA/2 [Трещалина Е.М. с соавт., 2005].

Бактериальные штаммы. В работе использован штамм Staphylococcus aureus J49 (S. aureus, АТСС 25923), полученный из коллекции живых культур ФГБУ ГИСК им J1.A. Тарасевича, а также GFP (Green Fluorescent Prote¡n)-3KcnpeccHpyioiHHe штаммы Escherichia coli XL-1 Blue (E. coli-, трансфицирован на кафедре микробиологии и вирусологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова) и S. aureus RN6390 super-GFP (предоставлен профессором William M. Nauseef, Университет Айовы, США). Для экспериментальных целей использовали культуру, находящуюся в средней log-фазе, которую отмывали от питательной среды раствором Хенкса. Расчет количества микробных тел производили исходя из соотношения: 1 единица оптической плотности - 8,5-108 микробных тел/мл при длине волны 540 нм.

Оценка пролиферации клеток. Для оценки пролиферации клетки засевали в 96-луночный планшет для культур клеток в полной среде. В процессе культивирования к опухолевым клеткам или митоген-активированным МНК добавляли 3Н-тимидин и тестируемый агент. К клеткам опухолевых линий, которые характеризовались низкими цифрами включения 3Н-тимидина, перед внесением радиоактивной метки добавляли АТФ. Пролиферацию оценивали, измеряя радиоактивность 3Н-тимидина, включенного в реплицирующуюся ДНК. Результат выражали в процентах от контрольного уровня.

Оценка «раннего» и «позднего» апоптоза. При оценке апоптоза использовали аликвоты, содержащие 106 клеток. «Ранний» апоптоз оценивали, используя Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Beckman Coulter, США). Оценку позднего апоптоза проводили путем окрашивания пропидий иодидом ДНК фиксированных клеток [Darzynkiewicz Z. et al., 1994]. Образцы с клетками анализировали методом проточной цитометрии (Cytomics FC500; Beckman Coulter, США).

МТТ-тест (оценка цитотоксичности ФКС). МТТ-тест проводили по методике, описанной Niks M. с соавт., которая основана на способности митохондриальных де-гидрогеназ живой клетки конвертировать 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид (МТТ) в формазан. Оценку цитотоксичности ФКС проводили при 90% конфлюэнтности клеточной культуры в стационарной фазе роста. Оптическую

плотность формазана, растворенного в диметилсульфоксиде считывали при длине волны 492 нм, долю жизнеспособных клеток выражали в процентах к контролю.

Оценка экспрессии поверхностных клеточных маркеров. Определение фенотипа лимфоцитов (CD3+, CD4*, CD8+), а также оценку экспрессии маркеров активации и трансмиграции (молекулы адгезии CD62L и CD11Ь) фагоцитами проводили методом проточной цитометрии с использованием флуорохром-меченых моноклональных антител к соответствующим молекулам (Invitrogen или Beckman Coulter, США). Окрашивание проводили согласно рекомендациям, приведенным в инструкции производителя. Уровень экспрессии молекул (в процентах и/или единицах интенсивности флуоресценции) оценивали, учитывая фоновое связывание клеток с флуорохром-мечеными IgG (изотипический контроль).

Оценка уровня внеклеточных цитокинов. Мышиные МНК культивировали 24-48 ч в полной среде RPMI-1640 в присутствии КонА. Концентрации цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-17, ИФН-у, ФНО-а, GM-CSF) в супернатантах определяли с помощью набора реактивов Mouse Th1/Th2 FlowCytomix Multiplex (Bender MedSystems, Австрия) и анализировали методом проточной цитометрии, используя программное обеспечение FlowCytomix Pro (Bender MedSystems, Австрия).

Оценка уровня сывороточных иммуноглобулинов. Уровни овальбумин (ОВА)-специфических иммуноглобулинов (lgG1, lgG2a и IgE) в сыворотке крови мышей определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа. Результат выражали в единицах оптической плотности при длине волны 450 нм.

Оценку поглотительной активности фагоцитов проводили методом проточной цитометрии [Пинегин Б.В. с соавт., 2001]. В качестве агента для фагоцитоза использовали живые GFP-трансфицированные (S. aureus; Е. coli) или убитые ФИТЦ-меченые (S. aureus) бактерии.

Оценка продукции активных форм кислорода фагоцитами проводилась ци-тометрическим методом в тесте форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА)-индуцированного кислородного «взрыва» [Пинегин Б.В. с соавт., 2001], используя флуорогенный субстрат дигидрородамин123.

Оценка бактерицидной активности фагоцитов проводилась с использованием классического микробиологического метода посева [Coligan J.E. et al., 1995], где оценивалась суммарная бактерицидная активность фагоцитов периферической крови человека.

Реакция контактной чувствительности. Инициацию реакции контактной чувствительности (КЧ) к ДНФБ у мышей СВА проводили согласно общепринятому экспериментальному подходу [Kim T.Y. et al., 1990]. Животных сенсибилизировали, нанося на кожу брюшка ДНФБ в ацетоне. Через 6 суток после сенсибилизации на внутреннюю поверхность правого уха наносили разрешающую дозу ДНФБ (провокация КЧ). На левое ухо наносили аналогичный объем ацетона. Через 24 часа после повторного нанесения ДНФБ оценивали интенсивность реакции КЧ по разнице (в мм) отека ушей. Часть мышей выводили из опыта на 2-4 сутки после сенсибилизации, выделяли клетки паховых лимфоузлов и использовали для оценки пролиферации и продукции ими цитокинов.

Адоптивный перенос реакции КЧ. Для адоптивного переноса реакции КЧ у ДНФБ-сенсибилизированных мышей-доноров через 6 суток после сенсибилизации выделяли селезенки. Суспензию спленоцитов (3*107 - 108 кл/мышь) или их отдельных

субпопуляций (CD3\ CD4\ CD8*), веделенные магнитной сепарацией, вводили внутривенно интактным мышам-реципиентам. В опытной группе клетки до переноса реципиентам инкубировали с ФКС в течение 30 мин. in vitro. Через 1 ч после переноса клеток мышам-реципиентам наносили разрешающую дозу ДНФБ на ухо. Еще через 24 ч регистрировали интенсивность реакции КЧ.

Реакцию трансппантат против хозяина (РТПХ) индуцировали в полуаллогенной системе. Для этого суспензию клеток селезенки и лимфоузлов (2:1, 108 кл/мышь) мышей родительской линии C57BI/6 (Н-2Ь) внутривенно вводили мышам-реципиентам гибридам первого поколения B6D2F1 (C57BI/6*DBA/2; H-2b/d) [Hakim F. et al„ 1998]. Mo-ниторировали выживаемость и массу тела животных. На 60 день после индукции РТПХ выживших животных выводили из опыта и выделяли печень, кишечник, почки для па-томорфологического исследования.

Модель ОВА-индуцированной респираторной аллергии воспроизводили на мышах Balb/c трехкратной сенсибилизацией внутрибрюшинным введением ОБА, адсорбированного на алюминиевых квасцах на О, 14 и 21 дни эксперимента. Затем с целью провокации вводили интрафарингеально 1% раствор ОБА трехкратно на 29, 31 и 39 дни. После второй ОВА-сенсибилизации часть мышей выводили из опыта и экс-плантировали спленоциты для оценки продукции цитокинов. Спустя 48 ч после последней ОВА-провокации у оставшихся мышей производили забор крови для оценки уровня сывороточных ОВА-специфических иммуноглобулинов и собирали БАЛ.

Модель миграции фагоцитов в брюшную полость воспроизводили на мышах Balb/c. С целью стимуляции выхода фагоцитов в брюшную полость вводили раствор пептона. Через 24 (миграция нейтрофилов) и 72 (миграция макрофагов) часа животных выводили из опыта, подсчитывали количество клеток в брюшной полости. Хемотаксис оценивали по индексу стимуляции (ИС), который рассчитывали по формуле: ИС = А/В, где А - количество клеток в группах на фоне введения пептона, а В - количество клеток в группе отрицательного контроля (стерильный ФСБ).

Модель острой бактериальной инфекции органов брюшной полости воспроизводили у мышей Balb/c и BDF1. Для этого внутрибрюшинно вводили взвесь бактерий (S. aureus, штамм J49, АТСС 25923), 1,5-2,0*109 микробных тел/мышь (LD50-LD70). Препарат ФКС вводили за 1 и 4 ч до заражения мышей. В контрольной и подопытной группах сравнивали динамику гибели животных.

Модель перевиваемой опухоли. Для моделирования опухоли мышам BDFi перевивали внутрибрюшинно суспензию клеток лейкоза Р388 [Трещалина Е.М. с соавт., 2005]. Прогрессирование лейкоза регистрировали по накоплению жидкости в брюшной полости и гибели животных. Противоопухолевый эффект ФКС оценивали по средней продолжительности жизни (СПЖ), показателям увеличения продолжительности жизни (УПЖ, % к контролю). Подсчет числа полных ремиссий производили через 30 дней, подсчет числа излеченных через 90 дней после окончания терапии.

Оценку влияния ФКС на противоопухолевый эффект цикпофосфамида (ЦФ).проводили на модели перевиваемого лейкоза Р388 в параллельном сравнении: контрольной группы; групп, которым вводили ЦФ или комбинацию ЦФ+ФКС. Рассчитывали СПЖ, УПЖ и терапевтический выигрыш (ТВ, изменение продолжительности жизни в % к группе, получающей только ЦФ).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета анализа данных программного комплекса «Microsoft Excel 2007». Вариабельность результатов

подчинялась законам нормального распределения, что позволило отражать их в виде средней арифметической и средней ошибки среднего значения. Для оценки достоверности различий средних использовали t-критерий Стьюдента, разницу считали достоверной при р<0,05. Сравнение динамики гибели животных проводили, используя статистический комплекс программ GraphPad Prism. Для оценки достоверности различий кривых Kaplan-Meier использовали logrank-тест.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Влияние ФКС на активность лимфоцитов при индукции адаптивного иммунного ответа in vitro

В рамках изучения влияния ФКС на адаптивный иммунный ответ in vitro была исследована способность препарата влиять на процессы активации и пролиферации МНК в ответ на Т- и В-клеточные митогены, их апоптоз, а также синтез цитокинов. На начальном этапе исследований оценивали влияние ФКС на пролиферацию мышиных и человеческих МНК, активированных Т- и В-клеточными митогенами. ФКС дозозависимо подавляли пролиферацию как митоген-активированных спленоцитов (выделеннные из мышей линий СВА, BDF1 и Balb/c), так и МНК периферической крови человека (рис. 1). Поскольку не наблюдалось зависимости антипролиферативного эффекта от принадлежности клеток к той или иной линии мышей, результаты экспериментов представлены в виде одной кривой (рис. 1А). Следует отметить, что 20 мкг/мл ФКС практически полностью блокировали пролиферативный ответ активированных МНК.

А Б

—•—ЛПС -»-Ко НА —♦—PWM —«—ФГА —AHTH-CD3

Рисунок 1. Влияние ФКС на пролиферацию митоген-активированных МНК мышей (А) и человека (Б) in vitro.

Антипролиферативный эффект ФКС был также сравнен с эффектом селективного ингибитора тирозинкиназ [Akiyama Т. et al., 1987] флавоноида генистеина. Генистеин подобно ФКС обладал в используемой модельной системе дозозависимым антипро-лиферативным эффектом (данные не приведены), но проявил себя более активным ингибитором ЛПС-активированных спленоцитов мышей: в концентрации 1 мкг/мл уровень пролиферации этих клеток составлял 67,8±6,8%, 5 мкг/мл - 34,7±7,9%, 10 мкг/мл -13,8±3,2%, 20 мкг/мл - 5,6±1,2%. Однако по отношению как к КонА, так и к анти-СРЗ и PWM-стимулированным МНК не было выявлено статистически достоверных различий между эффектами генистеина и ФКС. Учитывая полученные результаты, можно предположить, что в составе ФКС содержатся флавоноиды, способные ингибировать протеин-киназы, однако для таких заключений необходимы дополнительные исследования.

Таким образом, результаты экспериментов по изучению антипролиферативных эффектов ФКС in vitro позволяют заключить, что ФКС в диапазоне концентраций 1-20 мкг/мл обладают дозозависимым антипролиферативным эффектом в отношении мито-ген-активированных Т- и В-лимфоцитов в условиях in vitro, который не имеет межвидовых (человек - мышь) или межлинейных (СВА, BDF1 и Balb/c) различий.

Модель, в которой клетки «обрабатывались» ФКС in vivo с последующей их эксплантацией и активацией митогенами in vitro, использовалась с целью изучить влияние препарата на способность лимфоцитов активироваться. Для этого мышам внутрибрю-шинно вводили ФКС в дозах 10-30 мг/кг (10 мг/кг одно-, двух- или трехкратно с интервалом 12 ч). Через 4 ч после последнего введения ФКС выделяли спленоциты и инкубировали 72 ч в присутствии КонА или ЛПС и оценивали пролиферацию. Данные, представленные на рис. 2, показывают, что включение радиоактивной метки в спленоциты, активированные КонА и ЛПС снижалась в зависимости от дозы ФКС. Таким образом, эти результаты доказывают, что внутрибрюшинное введение ФКС в дозах 10-30 мг/кг дозозависимо подавляет пролиферацию спленоцитов, активированных в условиях in vitro митогенами КонА и ЛПС, что позволяет предположить, что в составе ФКС содержатся вещества, которые, взаимодействуя с лимфоцитами, могут препятствовать не только их пролиферации, но и их активации.

влпс аконА

100

¿J- 80

И 60

я о

CL О.

О) Ь её 40

S ас

С О 20

о.

с: О

рН гЬ

— -tr

-ir Г*"1

ш*,

Рисунок 2. Влияние внутрибрюшинного введения мышам ФКС на пролиферацию эксплантированных спленоцитов, активированных митогенами in vitro.

Юмг/кг

20 мг/кг 30 мг/кг

Доза ФКС

На следующем этапе исследовалась способность ФКС индуцировать апоптоз активированных МНК, как возможный механизм антипролиферативной активности препарата. Для этих целей МНК культивировали 24 ч в присутствии митогенов, затем вносили ФКС (20 мкг/мл), продолжая инкубацию еще в течение 24 ч. Индукции апоптоза не наблюдалось при стимуляции МНК ни одним из митогенов (КонА, ЛПС, анти-СДЗ и PWM). Результаты позволили заключить, что ФКС (20 мкг/мл) не вызывают апоптоза активированных мышиных и человеческих Т- и В-лимфоцитов и индукция апоптоза не является механизмом антипролиферативного эффекта ФКС по отношению к активированным МНК in vitro.

Учитывая, что выраженный антипролиферативный эффект ФКС не сопровождался индукцией апоптоза, следующим шагом стало исследование влияния ФКС на цитокиновый профиль активированных МНК у мышей in vitro в качестве показателя функциональной активности и направленности дифференцировки Т-хелперных лимфоцитов. Принимая во внимание полученные данные, а также, дальнейшие задачи, связанные с исследованиями in vivo, в качестве источника Т-лимфоцитов использовали клетки паховых лимфатических узлов мышей. Выделенные клетки, культивировали 24-48 ч в присутствии КонА и ФКС. В табл. 1 представлены пиковые концентрации цитокинов, определявшихся на этих сроках культивирования.

Таблица 1. Уровни цитокинов в супернатантах КонА-стимулированных МНК лимфоузлов интактной мыши.

Пробы Концентрация цитокинов, пг/мл

ИЛ-2 ИФНу ИЛ-17 ИЛ-6

Контроль 348,6+55,6 6687,0±235,1 6727,5±526,3 259,7110,5

ФКС 10 мкг/мл 326,6±65,4 2933,21211,5* 8845,51430,7* 282,8114,3

ФКС 20 мкг/мл 0 2006,4±190,4* 9006,61356,7* 346,0+12,3*

'достоверные изменения к контролю (р<0,05).

Уровни цитокинов при культивировании с ФКС изменялись в зависимости от концентрации флавоноидов. В концентрации 20 мкг/мл ФКС приводили к угнетению секреции ИЛ-2 так, что значения последнего не определялись. ИЛ-2 - основной фактор роста для Т-клеток, который быстро начинает синтезироваться активированными CD4+ Т-хелперами. Внутриклеточный сигнал, приводящий к экспрессии гена ИЛ-2 в Т-клетке, связан с тирозинкиназными каскадами [Patel M.D. et al., 1987]. Некоторые флавоноиды способны блокировать сопряженную с Т-клеточным рецептором тирозинкиназу p56lck [Akiyama Т. et al., 1987], что коррелирует с уменьшением секреции ИЛ-2 и экспрессии его рецептора Т-лимфоцитами [Trevillyan J.M. et al., 1990]. По всей вероятности, компоненты ФКС тоже могут обладать подобными свойствами, что, по-видимому, и объясняет антипролиферативный эффект ФКС по отношению к активированным Т-клеткам. Судя по наличествующим цитокинам (ИФНу и ИЛ-17), в условиях описываемого эксперимента в процессе активации CD4+ Т-хелперов происходила дифференцировка в Th1 и Th17 субпопуляции. ТМ7-лимфоциты названы так по основному секретируемому ими ци-токину - ИЛ17, а ИФНу является ключевым продуктом Thl-клеток. Во всех изучаемых концентрациях ФКС достоверно снижали секрецию ИФНу, приводя при этом к повышению уровня ИЛ-17. Такие изменения, скорее всего, свидетельствуют о способности ФКС «переключать» Th1 иммунный ответ на формирование субпопуляции Th17. Развитие Th17 типа поддерживают и направляют цитокины, которые продуцируются как лимфоцитами, так и дендритными клетками. Одним из таких цитокинов считается IL-6 [Hirota К. et al., 2010]. ФКС приводили к повышению уровня ИЛ-6, что может служить дополнительным подтверждением формирования Th17 под их влиянием.

К физиологическим функциям Th17 сегодня относят защиту от некоторых внеклеточных патогенов (например, грамотрицательных бактерий) за счет стимуляции образования и мобилизации нейтрофилов [Hirota К. et al., 2010], то есть за счет активации эффектор-ных клеток врожденного иммунитета. Учитывая последнее, а также выявленный в данной работе значительный антипролиферативный потенциал препарата ФКС по отношению к активированным Т- и В-лимфоцитам, есть вероятность, что среди суммы флавоноидов солодки находятся вещества достаточно специфично подавляющие адаптивную реакцию на антиген, меньше затрагивая врожденные механизмы противо-инфекционного иммунитета. Это предположение стало предпосылкой для дальнейшего изучения эффектов ФКС в моделях иммунопатологических ответов на животных.

2. Изучение механизмов иммуносупрессивного действия ФКС в модели иммунопатологического процесса in vivo

Для изучения механизмов действия ФКС в условиях иммунопатологического процесса ¡n vivo была выбрано модель КЧ, индуцированной ДНФБ. На первом этапе оценивалась эффективность ФКС в данной модели. Разделение на группы мышей, получавших ФКС в различных режимах представлено в табл. 2.

Подопытные Путь введения ФКС (10 мг/кг) Сроки введения ФКС

группы Время после сенсибилизации

мышеи 24 ч 36 ч 48 ч

1 +

2 +

3 внутривенный +

4 + +

5 + + +

*Мыши из группы положительного контроля (К+) разбивались аналогично подопытным на подгруппы, между которыми не замечалось значимых различий в интенсивности реакции КЧ и значения статистически обрабатывались вместе. Параллельно наблюдали и отрицательный контроль (К~, интактные мыши, которым на ухо наносили только разрешающую концентрацию ДНФБ).

Введение мышам ФКС через 24-48 ч после сенсибилизации дозозависимо подавляло развитие отека уха (рис. 3). Двух- и трехкратное внутривенное введение ФКС давали почти полное подавление (р<0,05) КЧ: супрессия составляла - 91,0±13,0% и 99,0+6,0% соответственно.

0,25

0 ?

£

F

и

Л5

X

> 0,1

1С

ф

5 0,05

1

L 1

т

ш П й

Рисунок 3. Влияние ФКС на отек уха мышей с ДНФБ-индуцированной КЧ.

К+ - положительный контроль (сенсибилизация + провокация). К- - отрицательный контроль (провокация без сенсибилизации). 1-5 - группы, получавшие ФКС.

К- К+ 1

4

Учитывая многоэтапность иммунопатогенеза КЧ, а также многокомпонентный состав ФКС, вполне очевидно, что механизмы ограничения флавоноидами развития данной реакции могут быть многообразны. Поэтому в целях изучения иммуносупрессор-ных механизмов ФКС препаратом воздействовали:

1) на ранних сроках после сенсибилизации (стадия индукции иммунного ответа), чтобы оценить влияние на пролиферативную активность и направленность дифференци-ровки лимфоцитов-эффекторв КЧ;

2) на поздних сроках после сенсибилизации для оценки влияния на функциональную активность зрелых лимфоцитов-эффекторов.

Изучение механизмов иммуносупрессивного эффекта ФКС на стадии индукции иммунного ответа. Основываясь на результатах исследований, в которых ФКС супрессировали индуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов in vitro, было сделано предположение, что нарушение формирования клона Т-лимфоцитов-эффекторов КЧ может являться одним из механизмов иммуносупрессивного действия препарата. Для подтверждения этого оценивали влияние ФКС на пролиферативный ответ и количество клеток МНК регионарных лимфоузлов.

Динамика пролиферации МНК регионарных лимфоузлов при инициации КЧ (ранее полученная в нашей лаборатории) демонстрирует, что пролиферация клеток начинает возрастать через 24 ч после нанесения ДНФБ на брюшко мышей, достигает пиковых

значений через 96 ч, затем постепенно снижается к 168 ч. Учитывая динамику проли-феративной активности и данные литературы относительно механизмов развития КЧ [У^апаЬе Н. е1 а1„ 2002], можно предположить, что пик пролиферации клеток лимфоузлов преимущественно отражает активность ДНФБ-специфических лимфоцитов-эффекторов, а уменьшение их количества на 6 день после сенсибилизации обусловлено миграцией зрелых эффекторов КЧ и распределением их по тканям. Опираясь на эти факты, при оценке влияния ФКС на пролиферацию ДНФБ-активированных лимфоцитов исследуемый агент вводили через 24 или 24 и 48 ч после сенсибилизации, оценивая пролиферативный ответ в интервале 72-96 ч.

На фоне введения ФКС пролиферация и «клеточность» ДНФБ-активированных клеток, выделенных из паховых лимфоузлов, ингибировалась дозозависимо (рис. 4). В суммарной дозе 20 мг/кг эти показатели угнетались ФКС более чем на 70% в сравнении с контрольной группой, что позволило заключить, что внутривенное введение ФКС (10 мг/кг) через 24 и 48 ч после ДНФБ-сенсибилизации дозозависимо снижает количество клеток и пролиферативный ответ МНК регионарных лимфоузлов у мышей в модели КЧ.

Рисунок 4. Изменение пролиферации МНК и количества клеток в регионарных лимфоузлах после внутривенного введения мышам ФКС через 24-48 ч после сенсибилизации.

10,0 20,0 Доза ФКС, мг/кг

Поскольку было обнаружено, что введение (после ДНФБ-сенсибилизации) ФКС приводит к подавлению интенсивности КЧ, и на этих же сроках наблюдалось снижение количества клеток-эффекторов КЧ, в результате подавления их пролиферативного ответа, целью следующего эксперимента стало исследование влияния ФКС на функцию иммунокомпетентных клеток, участвующих в реализации КЧ. Для этого определяли ци-токиновый профиль эксплантированных из регионарных лимфоузлов МНК на пике их пролиферативной активности на фоне введения ФКС через 24-48 ч после сенсибилизации. Мышам опытной группы через 24 и 48 ч после сенсибилизации вводили ФКС (10 мг/кг, внутривенно). На 4 сутки после сенсибилизации выделяли клетки паховых лимфоузлов, инкубировали (с КонА) и исследовали уровни цитокинов в супернатантах. Изменения цитокинов под влиянием ФКС представлены в табл. 3.

Таблица 3. Влияние ФКС (10 мг/кг, внутривенно) через 24 и 48 ч после ДНФБ-сенсибилизации на секрецию цитокинов клетками регионарных лимфоузлов._

Группы Концентрация цитокинов, пг/мл

ИЛ-2 ИЛ-10 ИЛ-4 ИФНу ИЛ-17 ФНОа ИЛ-6 ГМ-КСФ

К+ 1926,5 ±238,2 807,5 ±21,3 302,0 ±42,7 42000,0 ±7000,5 5378,5 ±508,9 160,0 ±7,5 2100,5 ±212,0 826,5 ±174,6

ФКС 919,0 ±61,2* 947,5 ±91,5* 157,5 ±22,2* 16828,0 ±2251,1* 7972,0 ±336,0* 182,0 ±15,0 2910,5 ±964,0 1153,0 ±164,5

100

2 80

0

о-60

1 40

20 0

I Пролиферация □ Клеточность

т

т 1

|—^—|—£—,

гг

'достоверные изменения показателя (р<0,05).

Введение ФКС мышам приводило к снижению продукции как ИЛ-2 и ИФНу, так и ИЛ-4, но при этом происходило повышение уровней ИЛ-10 и ИЛ-17 по сравнению с контрольной группой. При развитии реакции КЧ ИЛ-2 абсолютно необходим для пролиферации и дифференцировки эффекторных Т-лимфоцитов: CD4+ и CD8* субпопуляций. Следовательно ингибирование продукции ИЛ-2 на фоне применения ФКС может объяснить ранее выявленный антипролиферативный эффект препарата. К тому же ИЛ-2 наряду с ИФНу является маркером созревания при иммунном ответе Т-лимфоцитов-хелперов первого типа (Th1), тогда как ИЛ-4 характеризует главным образом диффе-ренцировку Т-хелперов второго типа (Th2). Тот факт, что применение ФКС достоверно снижали продукцию ИЛ-4 и ИФНу, может свидетельствовать о том, что флавоноиды солодки могут блокировать формирование Th1- и ТЬ2-субпопуляций.

Считается, что С08+Т-кпетки (основные эффекторы КЧ) для полноценного цито-токсического ответа при развитии должны получать стимулы от CD4+ Th1 лимфоцитов (основной поставщик ИЛ-2) [Mescher M.F. et al., 2006]. К тому же CD4+ Th1, являясь главным источником ИФНу, который усиливает экспрессию МНС первого класса, увеличивая вероятность распознавания антигена и цитотоксический ответ CD8*-эффекторов. Вероятно, что изменение в цитокиновом репертуаре лимфоцитов (подавление секреции ИЛ-2 и ИФНу) под влиянием ФКС способствовали угнетению реакции КЧ, что было продемонстрировано на мышах. Следует отметить, что ФКС, подавляя секрецию ИЛ-4 и ИФНу, приводили к увеличению уровней ИЛ-17 и ИЛ-10. Судя по профилю цитокинов, при введении ФКС на стадии индукции иммунного ответа, происходило «переключение» с ТЫЯИ2 на формирование Th17 популяции. На наш взгляд, уместно здесь провести параллель с исследованием цитокинов in vitro, продуцируемых КонА-стимулированными клетками лимфоузлов интактных мышей. Влияние ФКС на КонА-стимулированные интактные МНК было сходным по определенным позициям с цитокино-вым профилем иммунных клеток, формирующихся при КЧ при введении ФКС: ингибирование секреции ИЛ-2 и ИФНу сопровождалось нарастанием уровня ИЛ-17.

С точки зрения современных представлений, ТМ7-клетки могут участвовать как в иммунной защите от патогенов, так и в формировании иммунопатологии. По современным представлениям ведущими цитокинами, дифференцирующими ThO-лимфоциты в направлении Th17 являются ИЛ-6, TGFp и ИЛ-23. Стимуляция ThO ИЛ-23 приводит к образованию Th17 -эффекторов с высоким провоспалительным потенциалом [McGeachy M.J. et al., 2006], роль которых в иммунопатогенезе КЧ сегодня обсуждается [Cavani A. et al., 2010; Oboki К. et al., 2006]. В то же время в работе McGeachy с соавт. показана возможность дифференцировки ТМ7-лимфоцитов (при одновременном влиянии ИЛ-6 и TGFP), характеризующихся продукцией не только ИЛ-17, но и противовоспалительного ИЛ-10 и способных сдерживать Th 17-опосредованную патологию [McGeachy M.J. et al., 2006]. Судя по спектру синтезируемых цитокинов, именно такой фенотип Th17-лимфоцитов, мог сформироваться под воздействием ФКС при угнетении КЧ.

В своем развитии Th17, по крайней мере, у мышей [Oboki К. et al., 2006] имеют взаимосвязь с формированием адаптивной популяции FOXP3* Treg. С одной стороны эта связь выражается в наличии общего цитокина-индуктора TGFp. В «наивных» Т-клетках этот цитокин индуцирует транскрипционный фактор FOXP3 (маркер Treg), а совместно с ИЛ-6 - RORyt, запуская антагонистическую транскрипционную программу ТМ7-клеток [Hirota К. et al., 2010; Yang Х.О. et al., 2008]. С другой стороны эти две клеточные популяции (Th17 и Treg) способны преобразовываться друг в друга [Fujisawa Y.

et а)., 2011; Radhakrishnan S, et al., 2008]. Так, трансфекция в мышиные гемопоэтиче-ские стволовых клетки RORyt, специфичного для Th17, приводит к созреванию как Th17, так и Treg. При этом трансплантация этих клеток летально-облученным мышам не приводит к аутоиммунным процессам, но подавляет реакцию КЧ при сенсибилизации животных ДНФБ [Fujisawa Y. et al., 2011]. Все эти данные вкупе позволяют предположить, что в условиях нашего эксперимента ФКС переключал иммунный ответ в направлении формирования ТИ17-лимфоцитов, но наряду с таковыми формировались и Treg клетки, сдерживающие развитие КЧ.

Таким образом, на данном этапе установлено, что супрессорное действие ФКС на развитие КЧ способно реализоваться при использовании данного агента на стадии сенсибилизации. Это, по-видимому, происходит за счет как подавления пролиферации ДНФБ-специфических Т-лимфоцитов-эффекторов, а также и за счет «переключения» направленности иммунного ответа.

Влияние ФКС на функциональную активность зрелых лимфоцитов-эффекторов в модели ДНФБ-индуцированной КЧ у мышей. Как уже отмечалось, созревшие лимфоциты-эффекторы КЧ (после завершения пролиферации и диффе-ренцировки) через 120 ч после ДНФБ-сенсибилизации мигрируют из регионарных лимфоузлов и расселяются по тканям. Для исследования влияния ФКС на функциональную активность зрелых клеток-эффекторов КЧ, был использован традиционный метод адоптивного переноса. В основе этого метода лежит индукция КЧ при введении несенсибилизированному животному (К", интактные мыши) клеток (содержащих Т-лимфоциты) от сенсибилизированного сингенного донора (К+). Спленоциты для осуществления адоптивного переноса КЧ выделяли через 6 суток после ДНФБ-сенсибилизации. В предварительных экспериментах (оценка «раннего» апоптоза спле-ноцитов при инкубации с ФКС) было выявлено, что ФКС (20 мкг/мл) не проявляют прямого цитотоксического действия и не являются индукторами их апоптоза in vitro.

Результаты по адоптивному переносу КЧ спленоцитами представлены на рис. 5. При предварительной (до введения мышам-реципиентам) инкубации спленоцитов ДНФБ-сенсибилизированных доноров в течение 30 мин. с ФКС (20 мкг/мл) выраженность отека уха у реципиентов при повторном нанесении ДНФБ (0,016±0,006 мм) не различалось с таковыми значениями в группе К" (0,010+0,004 мм) и была на 84% ниже в сравнении с группой, которой переносили спленоциты без обработки флавоноидами (К7+, 0,099±0,008 мм; р<0,05).

Рисунок 5. Интенсивность реакции при адоптивном переносе КЧ спленоцитами или их популяциями сенсибилизированных мышей интактным син-генным реципиентам. (КГ) - отрицательный контроль, (К+) - положительный контроль, (К-/+) - адоптивный перенос КЧ спленоцитами, CD3+ или CD8+лимфоцитами, (ФКС) - перенос клеток, проинкубированных с ФКС.

Учитывая литературные данные о принадлежности эффекторов КЧ к Т-клеточной популяции, на следующем этапе были проведены эксперименты по иммуномагнитной сепарации Т-клеток (СОЗ+-лимфоцитов) из спленоцитов сенсибилизированных ДНФБ мышей и обработке их ФКС перед адоптивным переносом животным-реципиентам

(рис. 5). Как и предполагалось, Т-лимфоциты сенсибилизированных мышей эффективно переносили КЧ несенсибилизированным реципиентам. Выраженность реакции (0,107±0,006 мм) статистически не отличалась от группы с адоптивным переносом суммарной фракции спленоцитов (0,099+0,008 мм). Инкубация in vitro сепарированных Т-лимфоцитов с ФКС (20 мкг/мл) блокировала способность этих клеток адоптивно переносить КЧ интактным мышам: отек уха составил 0,017±0,007 мм, что практически совпадало с аналогичным показателем в группе К". В результате этого этапа исследований можно сделать вывод, что ФКС обладают не только антипролиферативным эффектом на стадии формирования ДНФБ-специфичных лимфоцитов, но и способны блокировать функциональную активность зрелых клеток-эффекторов, ответственных за адоптивный перенос реакции КЧ, не вызывая их гибели вследствие индукции апоптоза или прямой цитотоксичности.

Следующим шагом стала оценка субпопуляционной селективности действия ФКС. CD4+ и CD8+ лимфоциты выделяли иммуномагнитной сепарацией из спленоцитов мышей, сенсибилизированных ДНФБ; чистота выделенных субпопуляций составляла 90,0±1,0%. Перенос чистой популяции CD8+ вызывал адоптивный перенос КЧ интактным мышам-реципиентам (рис. 5). Значение отека уха составило 0,086+0,014 мм, что статистически не различалось с интенсивностью отека при переносе спленоцитов или Т-лимфоцитов. У мышей, которым перенесли сепарированные CD4+, выраженность отека была значительно меньше (0,034+0,008 мм; р<0,05). Выяснив, что в условиях нашего эксперимента реакция КЧ переносилась CD8+ лимфоцитами, в следующие серии экспериментов было решено ввести еще одну опытную группу: (С08+ФКС) - адоптивный перенос КЧ интактным мышам CD8+ лимфоцитами, преинкубированными с ФКС (20 мкг/мл, 30 мин.). Однако, преинкубация выделенных CD8* лимфоцитов с ФКС не вызвала подавления развития отека ушей (0,080+0,020 мм), т.е. реакция КЧ была «успешно» адоптивно перенесена (рис. 5). Это может свидетельствовать об отсутствии прямого подавляющего эффекта ФКС на CD8+ кпетки-эффекторы КЧ и позволяет заключить, что в условиях проводимого эксперимента CD8+ субпопуляция Т-лимфоцитов проявляет свойства клеток-эффекторов КЧ; антиген-специфические CD4+ лимфоциты не способны в достаточной степени переносить КЧ в условиях приводимой модели КЧ; обработка in vitro ФКС CD8+ лимфоцитов-эффекторов с последующим их адоптивным переносом интактным мышам не вызывает ингибирования реакции КЧ.

Рисунок 6. Интенсивность реакции при адоптивном переносе КЧ популяциями спленоцитов сенсибилизированных мышей интактным мышам. (К ) - отрицательный контроль, (К_,+)

- адоптивный перенос КЧ спленоци-тами, (CD8+CD4) - перенос КЧ смесью CD8+ и CD4* лимфоцитов, (ФКС)

- перенос CD4+ лимфоцитов, инкубированных с ФКС, с последующим добавлением CD8+ лимфоцитов.

После обсуждения полученных результатов было решено провести модифицированный эксперимент с выделением тех же популяций спленоцитов от сенсибилизированных ДНФБ мышей. Культивированию в присутствии ФКС теперь подвергали CD4+ лимфоциты, которые вводили мышам-реципиентам совместно с неинкубированными с

0,1

1 °'08 g 0,06 Ш 0,04

5

0,02

гп

К К /+ | CD8+CD4 | ФКС

¡мм 0,010 0,099 1 0.087 ] 0,023 |

ФКС CD8+ лимфоцитами. По рис. 6 видно, что инкубация CD4+ с ФКС, с последующим добавлением CD8* привела к супрессии реакции КЧ на 83% (р<0,05) по сравнению с соответствующим контролем. Отек уха в этой группе мышей достоверно не отличался от значений отека в группе К-. Таким образом, в результате проведенного эксперимента выяснилось, что преинкубация CD4* спленоцитов сенсибилизированных мышей с ФКС (20 мкг/мл) и смешивание ее с CD8+ лимфоцитами-эффекторами приводит при адоптивном переносе к угнетению КЧ.

К настоящему времени накоплен материал о существовании различных регуля-торных популяций иммунокомпетентных клеток (как естественных, так и адаптивно сформированных), способных подавлять иммунный ответ на разных его стадиях, предотвращать аутоиммунные реакции и индуцировать толерантность к антигену. Доказано, что негативная регуляция иммунного ответа иммунорегуляторными клетками возможна, как путем непосредственного их контакта с эффекторными клетками [Paust S. et al., 2004], так и с помощью секреции ими ингибиторных цитокинов - ИЛ-10 и TGF-ß [Taylor A. et al., 2006]. При иммунном ответе наряду с эффекторными клетками развиваются адаптивные Treg. Исследования, проведенные с использованием модели КЧ, демонстрируют, что у мышей, сенсибилизированных ДНФБ, роль подобных клеток-регуляторов могут выполнять различные субтипы CD4+ лимфоцитов [Cavani A. et al., 2008, 2010; Gober M.D. et al., 2008; Gorbachev A.V. et al., 2001]. Учитывая, что в предыдущих экспериментах не было выявлено проапоптогенного действия ФКС, последний экспериментальный результат с использованием адаптивного переноса, позволяет предположить, что именно CD4+ лимфоциты, которые не проявляли свойств клеток-эффекторов КЧ, приобретают в процессе обработки ФКС регуляторную функцию. Вероятно, ФКС индуцируют их супрессорный потенциал и, таким образом, опосредованно инактивируют CD8+ клетки-эффекторы КЧ. По всей видимости, для осуществления су-прессорного эффекта нужен прямой контакт регуляторных CD4+ Т-лимфоцитов с CD8+ эффекторами КЧ.

С учетом результатов, полученных на экспериментальной модели КЧ, можно заключить, что иммуносупрессивные механизмы ФКС реализуются на разных стадиях (как афферентной, так и эффекторной) развития реакции КЧ. Ввиду того, что исследуемый препарат ФКС содержит сумму полифенольных соединений, то и выявленные механизмы иммуносупрессорного действия могут быть обусловлены разными компонентами. Возможно, что среди флавоноидов солодки одни соединения обладают выраженным антипролиферативным эффектом по отношению к лимфоцитам, а другие способны супрессировать активность зрелых адаптивно сформированных лимфоцитов-эффекторов КЧ посредством отрицательной регуляции их эффекторной функции.

3. Эффективность ФКС в моделях иммунопатологических процессов Т- и B-клеточной направленности /л vivo

Изучение эффективности ФКС в экспериментально терапии РТПХ. С учетом того, что в экспериментах было выявлено, что ФКС супрессируют С08+-зависимый иммунный ответ в модели КЧ, было решено исследовать ФКС в модели острой РТПХ, где главным пусковым механизмом иммунопатогенеза является активация цитотокси-ческих Т-лимфоцитов, направленных против аллоантигенов [Van den Brink M.R., 2002]. На рис. 7 представлена динамика гибели (А) и изменения массы (Б) мышей в группах отрицательного контроля (К-), положительного контроля (К+, мыши с индуцированной РТПХ) и группе, получающей внутрибрюшинно ФКС (10 мг/кг 3 раза в неделю). Начи-

ная с 12-14 дня после индукции РТПХ, в группе К+ и у мышей на фоне ФКС наблюдались признаки истощения (снижение массы тела животных). В группе К+ гибель животных отмечалась на 39-46 дни после индукции РТПХ, и абсолютная выживаемость составила 62%. Сравнительные патогистологическое исследование печени, кишечника и почек проводили у животных, выживших к 60 дню наблюдения в группе К+ и пролеченных ФКС. В печени мышей группы К+ наблюдалась выраженная паренхиматозная белковая дистрофия с очагами некроза, а на фоне терапии ФКС просматривались лишь незначительные дистрофические изменения. В почках мышей группы К+ отмечалась белковая гидропическая дистрофия эпителия канальцев, воспалительная инфильтрация, просветы канальцев были заполнены аморфными массами. Клубочки почек были полнокровны, отмечалась гибель отдельных клубочков. На фоне введения ФКС изменения канальцев почек носили локализованный характер. В ткани кишечника, как в группе К+, так и на фоне терапии, морфологические проявления РТПХ были выражены незначительно. Различия выражались лишь в том, что в группе К+ наблюдались лим-фоидная инфильтрация слизистой в виде «лимфоидных полей». Таким образом, эффективность ФКС была подтверждена еще в одной модели иммунопатологического процесса Т-клеточной направленности, и полученные данные позволяют заключить, что курсовое внутрибрюшинное введение ФКС увеличивает выживаемость мышей в модели острой РТПХ у мышей, что сопровождается снижением выраженности гистопа-тологических изменений органов-мишеней.

А Б

75-

---К-

■К+ ----ФКС

-к+

-ФКС

20 30 40 Дни наблюдения

34

32

>Гч

(1) :«)

Э

м ■>я

2

ш

о

о

га

2 24

22

20

.т-1

т / .-1 , л

4

■ /.тР-Х ьр '1

1 I

10 20 30 40 Дни наблюдения

Рисунок 7. Динамика гибели (А) и массы тела (Б) мышей с индуцированной РТПХ; К~ -интактные мыши, К+ - положительный контроль (индукция РТПХ), ФКС - группа с индуцированной РТПХ, получающая внутрибрюшинно ФКС.

Изучение эффективности ФКС в модели ОВА-индуцированной респираторной аллергии у мышей. Учитывая, что ФКС снижали активацию и пролиферацию ЛПС- и Р\А/М-стимулированных лимфоцитов, была исследована эффективность фла-воноидов в модели иммунопатологического процесса В-клеточной направленности: модели респираторной аллергии. ФКС (10 мг/кг, внутривенно) вводили через 4 и 24 ч после каждой сенсибилизации (группа ФКС1) или за 1 ч до каждой провокации (группа ФКС2). Результаты, полученные в группах положительного контроля, представлены в

виде К+. Для оценки направленности дифференцировки лимфоцитов под влиянием ФКС при индукции иммунного ответа, исследовали цитокиновый профиль спленоцитов через 26 ч после двукратной ОВА-сенсибилизации (рис. 8).

В сулернатантах группы К+, полученных при культивировании спленоцитов, определялись ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИФНу и ФНОа. Введение ФКС после сенсибилизации приводило к статистически значимым изменениям ИЛ-2, ИЛ-6 и ИФНу, кроме того в этих пробах определялся ИЛ-17, который отсутствовал в контроле. Уровень ИФНу на фоне ФКС более чем в 10 раз, а ИЛ-6 в 7 раз достоверно превышали контрольное значение. Напротив, величина ИЛ-2 составляла 48,7±4,5 пг/мл, что было ниже (р>0,05), чем в группе К+. В то же время не наблюдалось значимых различий для ИЛ-4 (9,2+5,3 пг/мл уэ. 16,8+9,7 пг/мл) и ФНОа (50,7+8,2 пг/мл Ув. 41,6±10,0 пг/мл) между сравниваемыми группами.

1400

с; 1200

■§ 1000 1=

800 600 400 200 0

Л х 5

1С

О S

=Т

пК+

■ ФКС

I

Рисунок 8. Уровни цитокинов в супер-натантах через 48 ч инкубации КонА-стимулированных спленоцитов, экс-плантированных после двукратной ОВА-сенсибилизации. К+ - положительный контроль. ФКС - группа мышей, которой вводили ФКС через 4 и 24 ч после ОВА-сенсибилизации.

ИЛ-2 ИФНу ИЛ-6 ИЛ-17

Цитокины, уровни которых повышались (ИФНу, ИЛ-6, ИЛ-17) при иммунном ответе на ОВА на фоне ФКС, могли быть продуктами как дендритных клеток, индуцирующих ТЬ17-ответ (ИЛ-6), как и самих хелперных субпопуляций: Th1 продуцируют ИФНу, а Th17 - ИЛ-17. Дополнительно источником высокого уровня ИФНу могли стать и другие клетки (NK-клетки, NKT и др.), способствующие Thl-дифференцировке. Складывается впечатление, что использование ФКС на стадии сенсибилизации при аллергическом ответе (где преобладают Th2) переключает иммунный ответ в направлении Th1 и Th17. Хотя считается, что Th1 и Th17 выступают в роли антагонистических субпопуляций [Damsker J.M. et al., 2010], есть наблюдения, что они могут быть и эффекторами-колабораторами [Damsker J.M. et al., 2010; O'Connor R.A. et al., 2008], a Th17-лимфоциты (при определенном цитокиновом «окружении») даже превращаются в Th1 [Bending D. et al., 2009; Lee Y.K. et al., 2009]. Роль Th17 в модели ОВА-индуцированной астмы частично изучена и показана в экспериментальных моделях с использованием трансгенных мышей дефицитных по ИЛ-17 [Nakae S. et al., 2002] или его рецептора, а также с использованием монокпональных антител к этому цитокину [Schnyder-Candrian S. et al., 2006]. При этом результаты были неоднозначными и зависели от протокола исследования. В большинстве экспериментов показано, что дефицит ИЛ-17 на стадии сенсибилизации ослабляет [Nakae S. et al., 2002], а во время провокации приводит к усилению проявлений аллергического воспаления в бронхах [Oboki К. et al., 2008; Schnyder-Candrian S. et al., 2006].

На следующем этапе для подтверждения влияния ФКС (при иммунном ответе на ОВА) на «переключение» Th2/Th1 хелперных популяций в сыворотке крови мышей определяли уровни ОВА-специфических иммуноглобулинов, поскольку эксперименты, проведенные с мышиными цитокин-стимулированными В-клетками in vitro, говорят о

том, что цитокины могут переключать синтез изотипов. Так, ИЛ-4 индуцирует переключение синтеза с 1дМ на 1дв1 и 1дЕ, а ИФНу ингибирует ИЛ-4 и переключает изотипы иммуноглобулинов с 1дС1 и 1дЕ на 1д02а [Неиээег С.Н. е1 а\., 1991].

Уровень ОВА-специфического 1дС1 в сыворотке мышей из группы К+ был значительно повышен в сравнении с интактными мышами (1,50±0,06 (/е. 0,03+0,01, р<0,05). Тогда как величина 1дС1 (0,85+0,07) на фоне внутривенного введения ФКС после сенсибилизации оказалась ниже (р<0,05), чем в группе К+. Среднее значение 1д02а в группах К+ и ФКС1 не имело достоверных различий. Уровень 1дЕ на фоне ФКС также достоверно снижался по сравнению с группой положительного контроля (рис. 9).

Рисунок 9. Уровни (в единицах оптической плотности) сывороточных ОВА-специфических иммуноглобулинов через 48 ч после последней провокации мышей с ОВА-индуцирован-ной респираторной аллергии. К -интактные мыши. К+ - положительный контроль. ФКС1 - введение ФКС через 4 и 24 ч после каждой сенсибилизации.

В ходе данного этапа эксперимента было выявлено, что внутривенное введение ФКС после ОВА-сенсибилизации уменьшает сывороточные аллерген-специфические ; 1д01 и 1дЕ, что может свидетельствовать о снижении функциональной активности ТИ2 на фоне ФКС. Однако не наблюдалось повышения уровня 1д02а (изотип, переключение на который стимулирует ИФНу - маркер ТИ1-клеток). Учитывая предыдущие результаты, касающиеся цитокинового профиля спленоцитов после ОВА-сенсибилизации, можно предположить, что «переключение» иммунного ответа на фоне ,' применения ФКС происходило в сторону формирования ТМ7 и ТИ1-лимфоцитов, но с преобладанием Т1117-иммунного ответа. Последнее может быть связано с тем, что ФКС снижают продукцию ИЛ-2, необходимого для дифференцировки ТЫ.

Через 48 ч после последней ОВА-провокации также проводили бронхоальвеоляр-ный лаваж. Абсолютное количество клеток БАЛ было значимо больше в группе К+ в 1 сравнении с интактными мышами: среднее значение ("Ю6 клеток/мышь) достигало 1,53+0,10, тогда для интактных мышей этот показатель был 0,38+0,07. Введение ФКС за 1 ч до провокации (ФКС2) достоверной снижало как общее количество клеток (0,86±0,16, р<0,05), так и количество эозинофилов в БАЛ (рис. 10), снижение доли последних происходило за счет нарастания доли моноцитов/макрофагов.

Рисунок 10. Долевое распределение эозинофилов (Эо), макрофагов (Мф), нейтрофилов (Нф) и лимфоцитов (Лф) в БАЛ, полученной через 48 ч после последней провокации мышей с ОВА-индуцированной респираторной аллергией. К- - интактные мыши. К+ - положительный контроль. ФКС2 - введение ФКС за 1 ч до провокации.

1Эо шМф аНф аЛф шДругие

35,7

ф 5

« 40% с

о

4 20% 0%

I Др

К+ ФКС2

Таким образом, исследования эффективности ФКС в модели ОВА-инду-цированной респираторной аллергии у мышей позволяет заключить, что внутривенное введение ФКС на стадии сенсибилизации изменяет баланс Т-хелперных цитокинов и снижает сывороточные уровни аллерген-специфических lgG1 и IgE, введение ФКС на стадии провокации способствует уменьшению количества клеток и эозинофилов в БАЛ.

Подводя итоги результатов изучения эффективности ФКС в моделях иммунопатологических процессов Т- и В-клеточной направленности, можно заключить, что эти соединения могут стать перспективными кандидатами для создания новых лекарственных препаратов, уменьшающих проявления патологического иммунного ответа. Имму-носупрессивное действие ФКС основывается не на цитотоксических эффектах, а на функциональных изменениях иммунокомпетентных клеток. На фоне ФКС уменьшается секреция ростового фактора - ИЛ-2 (это может являться одним из механизмов анти-пролиферативного действия в отношении лимфоцитов), а также меняется спектр Т-хелперных цитокинов (что говорит об изменении поляризации иммунного ответа).

В ряде экспериментов ФКС повышали секрецию ИЛ-17 иммунокомпетентными клетками (в случае КЧ, одновременно и ИЛ-10), что может косвенно свидетельствовать о том, что этот препарат является «переключателем» иммунного ответа: Th1/Th2 —> Th17 (или, в определенных случаях, регуляторных Th17/Treg). Рецепторы для ИЛ-17, представлены на многих иммунокомпетентных клетках, в том числе высоко экспресси-рованы на нейтрофилах, через которые опосредуется их активация. Дополнительно, ИЛ-17 стимулирует выработку гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и, таким образом, контролирует образование нейтрофилов. Поэтому на сегодняшний день считается, что естественная функция ТМ7-лимфоцитов основана на мобилизации нейтрофилов, то есть в дополнительном подключении механизмов врожденного противоинфекционного иммунитета для элиминации внеклеточных патогенов. Учитывая это, можно предположить, что ФКС представляют собой группу потенциальных веществ-кандидатов в иммуносупрессивные агенты селективно подавляющих адаптивный иммунный ответ на антиген, нежели врожденную противоинфекционную иммунную реакцию. Для того, чтобы экспериментально доказать возможность проявления селективной иммуносупрессии было исследовано влияние ФКС на некоторые функции клеток врожденного иммунитета, а также их эффективность в модели бактериальной инфекции мышей.

4. Изучение влияния ФКС на некоторые функциональные показатели

клеток-эффекторов врожденного иммунитета в моделях in vitro и in vivo

Принцип функционирования системы врожденного иммунитета базируется во многом на развитии реакций воспаления и фагоцитоза. Во время острой фазы воспаления, в частности, в результате бактериальной инфекции, нейтрофилы «экстренно» мигрируют в очаг воспаления, где также функционируют и резидентные клетки врожденного иммунитета. Таким образом, нейтрофилы и моноциты/макрофаги обычно являются первыми клетками, реагирующими на инфекцию. При терапии неселективными иммуносупрессантами (цитостатики, глюкокортикостероиды), подавляющими «первую линию» иммунной защиты, высока вероятность возникновения инфекционных осложнений, бороться с которыми весьма трудно. Учитывая последнее, при разработке им-муносупрессантов рационально делать упор на вещества высокоспецифично подавляющие адаптивную иммунную реакцию на антиген, и в меньшей степени затрагиваю-

щие врожденные механизмы противоинфекционного иммунитета. В связи с чем в настоящей работе исследования, проведенные в рамках врожденного иммунитета, были преимущественно сосредоточены на влиянии ФКС на функциональные возможности профессиональных фагоцитов в моделях in vitro и in vivo.

Влияние ФКС на экспрессию фагоцитами молекул адгезии CD62L и CD11b. Основываясь на том, что активационный статус фагоцитов коррелирует со снижением экспрессии CD62L [Venturi G.M. et al. 2003] и увеличением экспрессии CD11b/CD18 [Barczyk М. et al. 2010], в настоящем исследовании экспрессия этих молекул была использована для оценки влияния ФКС на способность этих клеток к активации ir> vitro. В эксперименте использовали цельную донорскую кровь и ЛПС (0,1 мкг/мл) в качестве активатора. До активации опытные пробы инкубировали с ФКС (20 мкг/мл, 30 мин). Как показало исследование, более 90% нейтрофилов и моноцитов экспрессируют CD62L. Однако к 30-45 мин. инкубации даже в нестимулированных фагоцитах происходило спонтанное снижение экспрессии этого маркера. На этих же сроках в присутствии ФКС (без ЛПС) экспрессия оставалась на высоком уровне как для нейтрофилов (рис. 11 А), так и для моноцитов. ЛПС-стимуляция приводила к выраженному снижению (по сравнению с нестимулированными клетками) экспрессии CD62L на нейтрофилах и моноцитах. Преинкубация с ФКС достоверно не изменяла ответ нейтрофилов на ЛПС ни на одном из сроков инкубации, тогда как при воздействии данным агентом на моноциты наблюдалась некоторая тенденция к ускорению шеддинга CD62L.

А Б

—*—Контроль —ФКС —»—ЛПС —Ж—ЛПС+ФКС

-А—Контроль —♦— ФКС -•—ЛПС —ЛПС+ФКС

Время инкубации с ЛПС, мин.

О 15 ЗО 45 60 75

Время инкубации с ЛПС, мин

Рисунок 11. Влияние ФКС на спонтанную и ЛПС-стимулированную экспрессию CD62L (А) и CD11b (Б) нейтрофилами периферической крови человека.

Окрашивание образцов крови показало, что практически 100% фагоцитов экспрессируют CD11b, но с низкой интенсивностью. За время инкубации даже в пробах отрицательного контроля (без стимуляции ЛПС) наблюдалось спонтанное (в сравнении со стимулированными клетками более медленное) увеличение экспрессии этого маркера. Следует отметить, что такой же характер носили изменения интенсивности флуоресценции при инкубации с ФКС без стимуляции клеток ЛПС. Добавление ЛПС времязависимо достоверно (р<0,05) повышало экспрессию CD11b на фагоцитах. Предварительная инкубация с ФКС не только не ингибировала, но даже способствовала (статистически недостоверно) нарастанию ЛПС-индуцированной экспрессии CD11b на нейтрофилах (рис. 11 Б) и моноцитах.

Таким образом, результаты проведенных исследований позволяют заключить, что ФКС не препятствуют ЛПС-индуцированному шеддингу CD62L и усилению экспрессии CD11b нейтрофилами и моноцитами периферической крови человека in vitro, свидетельствуя о том, что ФКС не препятствуют ЛПС-активации фагоцитов.

Влияние ФКС на миграцию моноцитов/макрофагов и нейтрофилов, стимулированную пептоном in vivo. Для приближения экспериментальных условий к реальным, оценка миграции нейтрофилов и макрофагов проводилась нами в модели in vivo. Как свидетельствуют данные, полученные в нашей лаборатории, в мазках пери-тонеального смыва через 24 ч после введения пептона доминирующими являются нейтрофилы (80±9,2%), тогда как через 72 ч в смыве преобладают макрофаги (75±7,3%) [Емельянов А.Ю., 1997]. Основываясь на этих фактах, влияние ФКС на миграцию нейтрофилов и моноцитов/макрофагов оценивалось через 24 и 72 ч соответственно. Подопытным группам животных за 1 ч до инъекции пептона вводили внутри-брюшинно ФКС (10 мг/кг трехкратно с интервалом 4 ч), а группе отрицательного контроля (К") - раствор стерильного ФСБ. В группе К" уровни абсолютного количества клеток в смывах брюшной полости составляли 3,7±0,6 и 3,3±0,4 (х10е) клеток соответственно через 24 и 72 ч. ФКС (без пептона) не приводили к изменению численности клеток в брюшной полости (результаты были сопоставимы с К"): средние значения ИС равнялись 1,3±0,3 (нейтрофилы) и 0,9±0,1 (моноциты). Введение пептона увеличивало клеточность смывов брюшной полости как через 24, так и через 72 ч. Индекс стимуляции выхода нейтрофилов в группе К+ составил 4,8±0,8 (р<0,05). Введение ФКС+пептон несколько увеличивала этот показатель до 5,4±0,6 (недостоверно). ИС макрофагов, как при введении пептона, так и при комбинации ФКС+пептон оказался 2,2±0,3. Эти результаты позволили заключить, что ФКС значимо не влияют на индуцированный пептоном хемотаксис нейтрофилов и макрофагов в брюшную полость у мышей Balb/c.

Влияние ФКС на поглотительную способность нейтрофилов и моноцитов/макрофагов. В качестве источника фагоцитов использовали лейкоциты человека. Опытные пробы инкубировали перед добавлением бактерий с ФКС (20 мкг/мл, 30 мин). Обработка ФКС не приводила к изменению процента фагоцитирующих нейтрофилов и моноцитов при использовании ФИТЦ-меченых или GFP-экспрессирующих бактерий, свидетельствуя о том, что ФКС значимо не затрагивают поглотительную функцию фагоцитов человека in vitro.

Влияние ФКС на продукцию активных форм кислорода фагоцитами и их бактерицидную функцию. Эффективный фагоцитоз в итоге реализуется не только благодаря поглощению патогена, но, в большей степени, его киллингу. Наиболее важными факторами разрушения микроорганизма в фаголизосоме считаются активные формы кислорода и азота.

Предварительная инкубация лейкомассы с ФКС (20 мкг/мл, 30 мин.) значимо не изменяла процент ФМА-активированных нейтрофилов и моноцитов, продуцирующих реактивные метаболиты кислорода в сравнении с ФМА-стимулированными клетками (К+) (табл. 4). Однако при этом ФКС снижали (р<0,05) интенсивность флуоресценции фагоцитов. Следует отметить, что инкубирование лейкоцитов с ФКС в отсутствии активатора не приводило к каким-либо значимым изменениям по сравнению не активированными ФМА фагоцитами (К ).

На следующем этапе была изучена суммарная бактерицидная активность фагоцитов периферической крови человека. До постановки реакции киллинга опытную про-

бу инкубировали с ФКС (20 мкг/мл, 30 мин). После реакции поглощения и киллинга фагоциты лизировали, бактерии засевали на плотную питательную среду, затем подсчитывали количество выросших колоний в пробах и рассчитывали процент «переваренных» фагоцитами за 60 мин. микроорганизмов (показатель бактерицидно-сти). Предварительная обработка лейкоцитов ФКС не снижала процент «переваренных» стафилококков, и показатель бактерицидное™ составлял 42,0±9,7% (иг. 42,5±3,0 % в контроле).

Таблица 4. Влияние ФКС на продукцию активных форм кислорода фагоцитами периферической крови человека при стимуляции ФМА. К-- нестимулированные фагоциты; ФКС - обработка клеток ФКС без стимуляции ФМА; К+ - ФМА-активированные фагоциты, ФМА+ФКС - обработка ФКС + активация ФМА.

Группы Нейтрофилы Моноциты

% активации Интенсивность флуоресценции, ед. % активации Интенсивность флуоресценции, ед.

К~ 2,6 ± 0,4 14,7 ±2,0 5,8 ± 1,1 11,7 ±2,3

ФКС 0,9 ± 0,4 12,6 ±2,2 6,2 ±3,1 10,4 ±2,7

К+ 96,5 ± 1,2 151,0 ±40,9 78,9 ± 3,8 22,0 ± 5,8

ФМА+ФКС 93,6 ± 2,0 68,7 ±17,1* 67,1 ±4,8 15,7 ±3,2*

•достоверные изменения по отношению к группе К+ (р<0,05).

Таким образом, результаты этой серии опытов позволили заключить, что ФКС (20 мкг/мл) не изменяют количество фагоцитов периферической крови человека, продуцирующих активные формы кислорода в ответ на активатор протеинкиназы С ФМА, однако снижают интенсивность окислительного «взрыва» в активированных нейтрофилах и моноцитах, что не сопровождается подавлением бактерицидной активности фагоцитов по отношению к S. aureus in vitro.

Влияние ФКС на течение экспериментального острого бактериального воспаления органов брюшной полости. Модель острой бактериальной инфекции у мышей рекомендуется не только для изучения антимикробной, но и иммунотропной активности новых фармакологических веществ [Хаитов P.M. с соавт, 2005]. Как показывают собственные наблюдения, а также изучение опыта других исследователей, выраженная микробная нагрузка вызывает летальный исход мышей в течение первых 7-10 дней наблюдения. На таких ранних этапах инфекции воспалительная реакция опосредует вовлечение клеток (преимущественно фагоцитов) и гуморальных факторов врожденного (но не адаптивного) иммунитета, что и позволяет косвенно оценивать функциональные возможности этого звена иммунной системы. В данной работе острое бактериальное воспаление органов брюшной полости воспроизводили введением сублетальной дозы (LD50-LD70, S. aureus), поскольку не исключалась возможность усугубления течения инфекционного процесса на фоне потенциального иммуносупрессивно-го агента. Мышам опытной группы за 1 ч до заражения вводили внутрибрюшинно ФКС (10 мг/кг трехкратно с интервалом 4 ч).

В контрольной группе к концу первой недели наблюдения более 50-70% мышей погибали (рис. 12). Напротив, в группе, получавшей инъекции ФКС, большая часть животных выживала. Выживаемость животных в контрольной группе составила 31,3+11,6%, а в группе, получавшей препарат, была более чем в 2 раза выше (р=0,0026, log-rank тест) и соответствовала 87,5±8,3%. При вскрытии павших животных определялась как картина сливного перитонита: утолщение и сосудистое инъецирование брюшины, вздутие петель кишечника, очаги межкишечных абсцессов, а также при-

знаки генерализации гнойно-воспалительного процесса: абсцессы в паренхиматозных органах. Напротив, если экспериментальное животное (контрольной или подопытной групп) выживало, в большинстве случаев отмечалось четкое ограничение гнойно-воспалительного очага за счет спаечного процесса. Данное исследование позволило заключить, что краткосрочное предварительное внутрибрюшинное введение ФКС не только не усугубляет течение инфекционного процесса на ранних этапах, но и повышает выживаемость мышей Ва1Ь/с с гнойно-воспалительным процессом брюшной полости стафилококковой этиологии.

-«— Контрол ь -*- ФКС

Рисунок 12. Влияние трехкратного предварительного внутри-брюшинного введения ФКС на выживаемость мышей Balb/c в модели острого бактериального воспаления органов брюшной полости стафилококковой этиологии

0-1-1-1-1-1-1-1-1—

0 2 4 6 8 10 12 14 Продолжительность жизни, дни

Одной из задач доклинического исследования веществ с иммунотропной активностью является исключение иммунотоксического действия, вызванное либо самим «родительским» веществом, либо его метаболитом [Хаитов P.M. с соавт, 2005]. Для решения поставленной задачи рекомендуется подход, с использованием не только однократных доз, но и длительного введения препаратов, чтобы оценить степень и обратимость возможного повреждения. Учитывая, что иммуносупрессивные препараты в клинической практике могут рекомендоваться длительными курсами, была оценена эффективность предварительного 21-дневного режима введения с использованием отобранной в предыдущих опытах однократной дозы ФКС. В данной серии экспериментов использовались гибриды первого поколения BDF1, что обусловлено их большей жизнеспособностью по сравнению с линейными мышами. Для интегральной оценки иммунотоксического действия длительного курса введения ФКС на клетки как врожденного, так и адаптивного иммунитета, проводились морфологические исследования лимфоидных органов. Для этого часть мышей из каждой группы после 3-х недельного введения ФКС выводились из опыта без бактериального заражения, у которых извлекали паховые лимфоузлы, селезенку, тимус и бедренные кости для патоморфологического исследования.

Результаты определения массы и абсолютного количества кариоцитов в лимфоидных органах представлены в табл. 5. Как видно из представленных данных, не наблюдалось достоверных отличий ни по одному из определяемых параметров между мышами контрольной группы и животными, получающими инъекции ФКС в течение 21 дня. Также не было выявлено никаких изменений при патоморфологическом исследовании срезов лимфоидных органов и костного мозга.

Таблица 5. Влияние курсового (режим через день в течение 3 недель) внутрибрюшинного введения ФКС в дозе 10 мг/кг на массу* и абсолютное количество ядросодержащих клеток

Группы Отношение массы органа к массе животного, мг/г Абсолютное количество клеток, х 106/на орган

Тимус Селезенка Тимус Селезенка Паховые лимфоузлы

Контроль 2,5±0,5 7,4±0,3 63,3±8,5 202,5±26,8 3,7±0,6

ФКС 2,9±0,1 6,7±0,2 70,5±10,1 201,0±22,5 4,2±0,6

*Масса лимфоузлов не определялась из-за трудностей, связанных с полным отделением соединительной и жировой ткани.

Динамика гибели мышей после их бактериального заражения (рис. 13), показывает достоверность различий выживаемости животных при длительном предварительном введения ФКС по сравнению с контролем. В контрольной группе выживаемость составила 22,2±13,6%, а на фоне использования ФКС этот показатель повышался до 66,7±15,7%(р = 0,0487).

-Контроль

-ФКС

Рисунок 13. Влияние курсового (21 день) предварительного внутрибрюшинного введения ФКС (10 мг/кг) на выживаемость мышей ВОМ в модели острого бактериального воспаления органов брюшной полости стафилококковой этиологии.

2 4 Б 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Продолжительность жизни, дни

По-видимому, большое значение в повышении выживаемости животных в использованной инфекционной модели могло иметь, по крайней мере, отсутствие выраженного подавляющего влияния на фагоцитарную составляющую клеточного эффекторного звена врожденного иммунитета и способность «организма» ограничивать гнойно-воспалительный процесс. Не исключается и тот факт, который обсуждается в доступной литературе, что флавоноидные соединения могут обладать прямым антибактериальным эффектом [На(апо Т. е( а!,. 2000]. С другой стороны при лимфо- и гематогенной генерализации инфекции и реакция иммунной системы выходит на другой уровень, приобретая черты системного воспаления с полиорганной недостаточностью, главным патогенетическим фактором которой является продукция клетками врожденного иммунитета ФНОа, запускающего генерацию свободных радикалов в клетках-мишенях. Сдерживание развития последнего за счет антиоксидантных и противовоспалительных эффектов флавоноидов также могло способствовать выживанию экспериментальных животных в данной модели (вид^уата Т. е1 а1,. 2008].

5. Изучение противоопухолевых эффектов ФКС

Имеются многочисленные данные о рост-ингибирующих эффектах флавоноидов. Учитывая это, данный пласт природных соединений может быть использован для

скрининга с целью отбора новых противоопухолевых веществ. В связи с чем следующий этап работы был посвящен изучению противоопухолевых эффектов ФКС и их механизмов.

Влияние ФКС на пролиферацию опухолевых клеток in vitro. На начальном этапе оценивалось влияние ФКС на пролиферацию опухолевых клеток in vitro. При рассмотрении действия ФКС (экспозиция 24 ч) на рост опухоли в культуре, обращает на себя внимание дозозависимое ингибирование пролиферации в диапазоне концентраций 1-20 мкг/мл (рис. 14). ФКС обладали рост-ингибирующей активностью по отношению, как к человеческим, так и мышиным линиям, которые гистологически принадлежали к гемобластозам (RAW 264.7, U-937), ракам (эпителиальные и эпителиоподоб-ные опухоли: НТ-29, U-373, GL-6, А-431) и саркомам (опухоли из клеток соединительной ткани: L-929). Наибольшей активностью ФКС обладали в культуре глиобластомы U-373 и моноцитарной лимфомы U-937: ИК5о соответствовала 6 мкг/мл и 7,5 мкг/мл соответственно. Таким образом, результаты экспериментов позволили заключить, что ФКС в диапазоне концентраций 1-20 мкг/мл обладают дозозависимым антипролифера-тивным эффектом по отношению к опухолевым клеткам in vitro,который не имеет значимой видовой или гистологической специфичности.

Антипролиферативный эффект ФКС, мог быть реализован, по крайней мере, двумя способами: индукцией гибели клеток или остановкой культуры в контрольных точках (Gi/S, G2/M) клеточного цикла. Поэтому следующим этапом явилось изучение жизнеспособности и апоптоза опухолевых клеток в присутствии ФКС. При тестировании различных опухолевых линий наблюдались идентичные по направленности изменения изучаемых параметров. В качестве примера-иллюстрации выбрана глиобластома U-373, характеризующаяся диплоидным набором хромосом [Kiss R. et al„ 1995], что делает репрезентативными цитометрические гистограммы распределения пиков ДНК по интенсивности флуоресценции после окраски флуорохромами.

Для изучения цитотоксичности ФКС (экспозиция 24 или 48 ч) в культуру вносили через 24 ч: после формирования клеточного монослоя и стационирования культуры. Как демонстрирует рис. 15 существенное снижение метаболически активных клеток во всех изучаемых опухолевых культурах происходило только после 48-часового воздействия ФКС. Было замечено, что выраженность данного эффекта ФКС меньше, по сравнению со способностью ФКС ингибировать пролиферацию. Хотя, следует отметить, что максимальные изменения жизнеспособности под влиянием ФКС проявились на тех опухолевых линиях, где наблюдался более выраженный антипролиферативный эффект. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что антипролиферативный эффект ФКС (с высокой долей вероятности) не связан с прямой цитотоксичностью фла-воноидов солодки.

Типичные гистограммы при оценке «позднего» апоптоза распределялись на несколько пиков. Покоящиеся клетки (Go), и клетки в Gi фазе клеточного цикла, содержат количество ДНК, соответствующее диплоидному набору хромосом (на гистограмме: диплоидный Go/Gi пик). В G2 фазе и во время митоза в клетках число хромосом удвоенное, что на гистограмме отражается в виде тетраплоидного G2/M пика. В синтетическую (S) фазу содержание ДНК промежуточное - колеблется от ди- до тетраплоидного. В апоптозирующих клетках уровень ДНК в результате межнуклеосомальной деградации снижается, и появляется субдиплоидный пик.

1ЧА\Л/264.7 (ИК50 =2.5 мкг/мл)

О 5 10 15 20 11-373 (ИК50=6 мкг/мл)

О 5 10 15 20 25

НТ-29 (ИК5о=15 мкг/мл)

и-937 (ИК50=7,5 мкг/мл)

вЬб (ИК50> 20 мкг/мл)

Ь-929 (ИК80«1О мкг/мл)

Рисунок 14. Влияние ФКС на пролиферацию клеток различных мышиных и человеческих опухолевых линий. ИК50- концентрация ФКС, ингибирующая пролиферацию на 50%. По оси ординат - пролиферация, % к контролю. По оси абсцисс - концентрация ФКС (мкг/мл).

А: 24 ч инкубации с ФКС

Б: 48 ч инкубации с ФКС

100 80 60 40 20

5 10 15 20 Концентрация ФКС, мкг/мл

25

5 10 15 20 Концентрация ФКС, мкг/мл

м Рисунок 15. Влияние ФКС на жизнеспособность клеток линии 11-373 в МТТ-тесте. По оси ординат: оптическая плотность (СЮ) при длине волны 492 нм (эквивалент доли жизнеспособных клеток) в % относительно контрольного значения.

А: 24 ч инкубации с ФКС

Б: 48 ч инкубации с ФКС

Р1_4 1_од

1_од

Рисунок 16. Влияние ФКС на уровень апоптоза клеток опухолевой линии 11-373. А. Закрашенная гистограмма • ФКС. В. Закрашенная гистограмма - контроль.

инкубация с

Инкубация клеток 11-373 с ФКС приводила к изменению долевого распределения суб-, ди- и тетраплоидных клеток в культуре по сравнению с контролем (рис. 16 и рис. 17). При 24-часовой экспозиции клеток с ФКС (20 мкг/мл) уровни субдиплоидного пика в опытных пробах (ФКС) различных серий экспериментов характеризовались довольно значительным разбросом, что свидетельствует лишь о недостоверной тенденции к индукции апоптоза на этих сроках инкубации. Однако при 24 ч инкубации с ФКС значимо снижалась доля клеток, образующих С0Л31-пик и повышалась доля клеток в С2/М-пике по сравнению с контрольными образцами. Это может свидетельствовать о нарушении вхождения клеток в фазу митоза - остановке клеточного цикла в С2/М-фазе. Через 48 ч инкубации с ФКС наблюдался достоверный рост доли апоптозирующих клеток.

О суб G0/G1 DG0/G1 OS

QG2/M

60%

—I— 25,1 1 39,2* т —I— 32,3* Т

_j_ 22.1

А . 23,5 —f—

— i. 21.2

49,5

—i— 247- 153*

1 28,6*

14,2

ФКС-24 ч

ФКС-48 ч

Рисунок 17. Влияние ФКС на долевое распределение опухолевых клеток линии 11-373 по плоидности (фазам клеточного цикла) при цитофлуориметриче-ской оценке после окраски фиксированных клеток проидий ио-дидом. Контрольные значения при 48 ч инкубации клеточной культуры достоверно не отличались от такового при инкубации в течение 24 ч.

Контроль-24-48 ч

•Достоверные изменения параметра по отношению к контрольному значению (р<0,05).

Достоверный проапоптогенный эффект ФКС (48-часовая экспозиция) и характерный рост G2/M-nnra наблюдался в остальных тестируемых линиях человеческих опухолевых клеток в условиях in vitro. В то время как значимое антипролиферативное действие, наблюдаемое уже через 24 ч инкубации с ФКС, не сопровождалось ни цито-токсичностью, ни увеличением апоптоза в культуре клеток на этих сроках наблюдения. Обобщая данные о влиянии ФКС на пролиферацию, жизнеспособность и долевое распределение пиков флуоресценции ДНК-пролидий можно заключить следующее: по-видимому, ингибирование пролиферации является следствием остановки опухолевых клеток в С2/М-фазе клеточного цикла под влиянием ФКС, вызывающую последующую апоптотическую гибель этих клеток.

Рассуждая о механизмах проапоптогенного действия ФКС в культуре опухолевых клеток, интересно провести параллель с их эффектом по отношению к активированным нормальным лимфоцитам. ФКС не индуцировали апопоза последних и не изменял распределение клеток по фазам клеточного цикла, что свидетельствует о различном влиянии его на опухоль-трансформированные и нормальные клетки. Лимфоциты, находящиеся в GO фазе, при действии на них митогенов вступают в клеточный цикл. В G1 фазе выделяют, так называемую, точку рестрикции, которая делит G1 фазу на два функционально различных этапа. В течение раннего этапа, клетка «оценивает» присутствующие в ее окружении ростовые факторы и «принимает решение», делится ей или возвратиться в GO фазу [Jones S,M. et al., 2000]. По-видимому, при воздействии ФКС на митоген-активированные лимфоциты происходило ингибирование клеточного цикла на уровне G0/G1pa„HS„ и в лимфоците либо не происходила активация, либо клетка из ранней G1-фазы цикла переходила в состояние пролиферативного покоя (GO фаза).

Изучение противоопухолевого эффекта ФКС в модели /л vivo. На следующем этапе исследовали противоопухолевую эффективность препарата ФКС /л vivo, а также его влияние на противоопухолевый эффект ЦФ в модели лимфолейкоза мышей Р388. Экспериментальную терапию начинали через 24 ч после перевивки гемобластоза. ЦФ вводили внутрибрюшинно однократно, а ФКС - внутрибрюшинно в режиме через день (каждый четный день) до начала гибели животных в группе.

Монотерапия ФКС не обладала противоопухолевой эффективностью: Динамика гибели и СПЖ мышей в группе, получавшей ФКС, статистически не отличалось от контрольных значений (9,5±0,4 vs. 9,9±0,3 дней) (табл. 6 и рис. 18А). Как показывают представленные в табл. 6.1 данные, использование ЦФ совместно с ФКС приводило к достоверному увеличению СПЖ животных с признаками роста опухоли по сравнению с мышами, пролеченными только ЦФ и «сдвигало» кривые в сторону увеличения продолжительности жизни (р<0,05, logrank тест) (рис. 18В/С). Необходимо заметить, что в группе, которой вводили ФКС с ЦФ (150,0 мг/кг), до 10% мышей выживали.

Таблица 6. Влияние ФКС на противоопухолевый эффект ЦФ у мышей с лейкозом Р388

Группы Доза СПЖ", дни УПЖ, % ТВ, %

ЦФ, мг/кг ФКС, мг/кг

Контроль - - 9,9±0,3 - -

ЦФ 100 - 18,9±0,8 90,9 -

150 - 26,8±0,6 170,7 -

ЦФ+ФКС 100 10 23,4±0,9* 136.4 23,8

150 10 36,0±2,6* 263,6 34,3

•достоверность по отношению к группе, получавшей только ЦФ. "СПЖ - средняя продолжительность жизни мышей с признаками роста опухоли.

-ЦФ100

ЦФ+ФКС

О 5 10 15 20 25 Продолжительность жизни, дни

-ЦФ 150

-ЦФ+ФКС

U

ч_

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 5560 Продолжительность жизни, дни

- Контроль

Ч,

0 2 4 6 8 10 12 14

Продолжительность жизни, дни

Рисунок 18. Влияние ФКС (А), ЦФ (100 мг/кг и или 150 мг/кг) и их совместного применения (В, С) на динамику гибели мышей BDF1 с лимфолейкозом Р388.

Существует множество фактов о тропности флавоноидов к нуклеотид-связывающему домену мембранного Р-гликопротеина и обсуждается возможность повышения чувствительности опухолей к химиотерапевтическим агентам этими соединениями, как результат ингибирования Р-гликопротеин-зависимого транспорта цитоста-тиков из опухолевой клетки [Choi С.Н., 2005]. Учитывая, что ЦФ не является субстратом семейства АТФ-зависимых мембранных транспортеров, к которым относится Р-гликопротеин, следует признать, что в условиях нашего эксперимента механизм потен-

цирования эффекта ЦФ был другим. Потенцированию эффектов ЦФ, по-видимому, способствовали собственные противоопухолевые механизмы ФКС, выявленные в данной работе (остановка в С2/М-фазе клеточного цикла и апоптоз опухолевых клеток).

Обсуждая результаты эксперимента, следует подчеркнуть, что при лечении ФКС с ЦФ в высокой дозе (150,0 мг/кг) около трети животных в группе погибали на 8-13 день без признаков прогрессирования гемобластоза (не наблюдался выпот в брюшную полость, но были заметны признаки токсичности: потеря массы тела) (рис. 18С). Учитывая описанные в предыдущем разделе результаты (длительное введение ФКС в таком же режиме не вызывало смерти или каких-нибудь других признаков токсичности у ин-тактных мышей), можно свидетельствовать о потенцировании токсичности больших доз ЦФ на фоне использования ФКС. В целом, полученные результаты свидетельствует о перспективности дальнейшего углубленного исследования отдельных флавонои-дов корней солодки, преследуя цель создания препаратов, повышающих эффективность противоопухолевой терапии, которые показали, что ФКС не обладают значимым противоопухолевым эффектом в модели лимфолейкоза мышей Р388, но потенцируют противоопухолевый эффект ЦФ в экспериментальной терапии лимфолейкоза Р388. В комбинации с большими дозами ЦФ ФКС способны потенцировать токсичность этого цитостатика.

Несмотря на достаточное количество экспериментальных фактов о возможности снижения токсичности цитостатиков флавоноидами [Bokemeyer С. et al., 1996; Siddique Y.H. et al., 2008], необходима настороженность при комбинированном использовании соединений этого «нетоксичного» класса в каждом конкретном случае. Поскольку фла-воноиды (высокие дозы, длительная терапия) способны вызывать индукцию микросо-мальных ферментов печени [Park D. et al., 2009; Rahden-Staron I. et al., 2001], высока вероятность изменения фармакокинетики совместно применяемого цитостатика. ЦФ -пролекарство, в реализации его фармакологического действия значительную роль играет изоформа цитохрома Р-450 - CYP2B, катализируя гидроксилирование ЦФ с образованием активных метаболитов [Chang Т.К. et al., 1993]. Показано, что активационный метаболизм ЦФ может ускоряться некоторыми флавоноидами [Rahden-Staron I. et al., 2001] и экстрактом зеленого чая, что может потенцировать образование акролеина и фосфорамид-мустарда, повышая как токсичность [Park D. et al., 2009], так и, вероятно, противоопухолевый эффект. Известно, что фосфорамид-мустард - основной алкили-рующий метаболит, отвечающий за противоопухолевый эффект ЦФ, а акролеин, не обладая алкилирующими свойствами, вызывает токсические эффекты [Anderson D. et al., 1995]. Вероятно, в условиях, когда используются большие дозы ЦФ, индукторы микросомальных ферментов, могут приводить к накоплению этих метаболитов и потенцированию как противоопухолевого, так и токсического эффектов цитостатика.

6. Хроматографическое разделение и сравнительная оценка фармакодинамических эффектов фракций препарата ФКС

Результаты оценки влияния ФКС на функциональную активность клеток врожденного и адаптивного иммунитета, а также оценка его противоопухолевого действия позволяют предполагать возможность создания иммуносупрессивных и противоопухолевых лекарственных препаратов на основе отдельных соединений ФКС. Поэтому еще одной задачей настоящей работы стала попытка наметить подходы к выявлению фармакологически активных веществ в составе ФКС. Однако в препарат ФКС входят различные полифенольные соединения, которые могут различаться между собой как по

активности в отношении выявленных фармакологических эффектов, так и, возможно, эти эффекты могут быть опосредованы различными веществами. Поэтому задачей этого этапа исследования стало не только наметить пути обнаружения активного фармакологического начала, но и попытка ответить на следующие вопросы:

1) Активностью одних и тех же или различных соединений обусловлены противоопухолевый и иммуносупрессивный фармакодинамические эффекты препарата ФКС?

2) Могут ли выявленные различные иммуносупрессивные механизмы ФКС (антипро-лиферативный и негативная «непрямая» регуляция функции зрелых эффекгорных лимфоцитов) быть результатом фармакологической активности разных флавонои-дов?

Хроматографический анализ и фракционирование ФКС. На полученной ОФ-ВЭЖХ хроматограмме ФКС обнаруживалось до 17 отдельных пиков (рис. 19), различающихся по интенсивности абсорбции и площади под кривой. На основании полученной хроматограммы ФКС были разделены на 4 фракции (фр №1 - №4) путем выборочной комбинации отдельных пиков, которые были стандартизированы методом Folin-Ciocalteu, выражая концентрацию полифенолов в массовых эквивалентах галловой кислоты на единицу объема фракции.

Рисунок 19. ОФ-ВЭЖ-хроматограмма препарата ФКС.

Сравнительная оценка антипролиферативной активности фракций ФКС по отношению к нормальным и опухоль-трансформированным клеткам in vitro. Как

демонстрирует рис. 20А, среди тестируемых фракций антипролиферативной активностью (по отношению к опухолевым клеткам U937) сравнимой с ФКС обладала только фракция №1. Фракции №2, №3 и №4 в концентрациях 5-10 мкг/мл обладали статистически достоверной, но меньшей противоопухолевой активностью. Ряд антипролиферативной активности фракций, полученных при хроматографическом разделении ФКС можно представить следующим образом ФКС г Фр №1 > Фр №4 > Фр №3 > Фр №2.

А Б

ОФКСОФр №1 афр №2ПФр №ЗИФр №4 ПФКС афр №1 афр №2ШФр №ЗШФр №4

1 мкг/мл 5 мкг/мл 10 мкг/мл 1 мкг/мл 5 мкг/мл 10 мкг/мл

Рисунок 20. Сравнительная оценка влияния ФКС и ее фракций на пролиферацию клеток линии U-937 (А) и КонА-активированных МНК мыши (Б) in vitro.

При сравнительной оценке антипролиферативных эффектов по отношению к активированным Т-клеткам все фракции ФКС проявили in vitro выраженную антипроли-феративную активность и наблюдались дозовая зависимость (рис. 20Б). Таким образом, результаты проделанных экспериментов позволяют заключить, что все фракции ФКС обладают способностью ингибировать пролиферацию как опухоль-трансформированных клеток линии U-937, так и нормальных КонА-активированных спленоцитов мыши, но фракция №1 по антипролиферативной активности и эффективности сравнима с таковыми параметрами суммарного препарата ФКС и превосходит по эффективности остальные протестированные фракции (фр №2 - №4).

Сравнительная оценка влияния фракций ФКС на функциональную активность зрелых Т-лимфоцитов-эффекторов КЧ, индуцированной ДНФБ у мышей. Поскольку все фракции ФКС в различной степени проявляли способность уменьшать пролиферативный ответ активированных Т-лимфоцитов мыши (то есть влиять на процесс формирования антиген-специфического клона), то следующим экспериментальным шагом стала попытка ответить на вопрос все ли они способны негативно регулировать функцию уже зрелого Т-лимфоцита на заключительной эффекторной стадии иммунного ответа. Для решения такой задачи была выбрана модель адоптивного переноса спленоцитами ДНФБ-индуцированной контактной чувствительности сингенным реципиентам, которая, как показали наши исследования, воспроизводится CD8*-лимфоцитами и угнетается суммарным препаратом ФКС.

С учетом того, что в предыдущей серии экспериментов, фракция №1 в концентрации 10 мкг/мл более выражено угнетала пролиферацию активированных Т-лимфоцитов, а эффекты фракций №2, №3 и №4 были сравнимы между собой, то с «экономической» точки зрения соотношения «затраты - польза» сравнивали эффекты фракции №1 и смеси фракций № 2, 3 и 4. Как демонстрирует рис. 21, предварительная обработка спленоцитов фракцией №1 (10 мкг/мл, 30 мин.), интенсивность развития адоптивно перенесенной КЧ была значимо ниже (р<0,05), в сравнении с группой К~'+. Однако обработка спленоцитов суммарным образцом, состоящим из фракций Ns2 - №4 в эквивалентной концентрации не отменяла переноса КЧ интактным мышам.

0,12

5 0,1

2

>s 0,08

0)

3 >» 0,06

а

о 0,04

О

0,02

Рисунок. 21. Влияние фракций ФКС (фр №1 - фр №4) на способность спленоцитов ДНФБ-сенсибилизированных мышей адоптивно переносить реакцию КЧ несенсибилизированным сингенным мышам-реципиентам.

К-

К+/- Фр1 Фр2+3+4

Такие результаты, по-видимому, свидетельствуют о том, что флавоноиды, обладающие более выраженным антипролиферативным эффектом, в большей степени способны угнетать и активность зрелых эффекторов КЧ. Таким образом, можно подытожить, что во фракции N91, полученной путем хроматографического разделения препарата ФКС, содержатся соединения, которые не только обладают антипролиферативной ак-

тивностью, но и подавляют способность спленоцитов ДНФБ-сенсибилизированных мышей адоптивно переносить КЧ сингенным реципиентам. Поэтому с позиций изыскания новых лекарственных препаратов перспективным является дальнейшее разделение фракции №1 или идентификация отдельных ее флавоноидов с целью их химического синтеза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В рамках данного диссертационного исследования проведено экспериментальное обоснование перспективы создания иммуносупрессивных и противоопухолевых лекарственных препаратов на основе ФКС. В табл. 7 и 8 обобщены полученные в исследованиях иммунотропные и противоопухолевые фармакодинамические эффекты ФКС, а также механизмы их реализации. На наш взгляд фармакологические эффекты ФКС, в основе действия которых нет прямой цитотоксичности по отношению к клетке-мишени, представляются особенно перспективным с точки зрения «воплощения в жизнь» концепции регуляторов/переключателей иммунного ответа и селективной иммуносупрес-сии.

Таблица 7. Обзор основных иммунотропных и противоопухолевых эффектов ФКС, полученных в опытах in vitro.

Эффекторы адаптивного иммунного ответа (Т-, В-лимфоциты) Эффекторы врожденного иммунитета (фагоциты) Опухолевые клетки

Ак Пр Апо Секреция цитокинов Миграция Поглощение бактерий Генерация АФК Киллинг Пр Апо

4 1 0 ¿ИЛ-2 i ИФНу т ИЛ-17 0 0 1 0 1 Т

Сокращения: Ак - активация, Пр - пролиферация, Апо - апоптоз, АФК - активные формы кислорода, угнетающий эффект, | - стимулирующий эффект, 0 - отсутствие эффекта.

Таблица 8. Обзор основных иммунотропных и противоопухолевых эффектов ФКС, полученных на мышиных моделях.

Модели Эффекты/Механизмы

Адаптивного иммунного ответа КЧ | пролиферации и N клеток в регионарных лимфоузлах; переключение ТМЛЪ2 —► ТМ7/Тгед (?); непрямое ингибирование эффекторов; 1 выраженности отека

аллергия переключение ТЬ2 ТМ/ТМ7; 11дЕ и 1дС1в сыворотке; 11Чтеток и Ео БАЛ

РТПХ | выживаемости; | патоморфологических проявлений

Для оценки врожденного иммунитета | резистентности к в. аогеиз-инфекции; отсутствие ингиби-рования миграции фагоцитов в брюшную полость

Злокачественного новообразования | эффективности и токсичности цитостатика ЦФ

Сокращения: N клеток - абсолютное количество клеток, Ео - эозинофилы, угнетающий эффект, | - стимулирующий эффект.

Полученные в работе результаты демонстрируют способность ФКС подавлять адаптивный иммунный ответ, ингибируя активацию Т- и В-лимфоцитов, но, не индуцируя их апоптоза. Особенное внимание хочется обратить на то, что механизм отмены активации базируется не только на прямом антипролиферативном эффекте, но и способности ФКС подавлять формирование характерного антигенспецифического клона лимфоцитов-эффекторов, «переключая» иммунный ответ на уровне хелперных и/или регуляторных клеток. Кроме того, ФКС могут негативно регулировать и функцию уже сформированных зрелых Т-лимфоцитов-эффекторов. Результаты исследования позволяют также предполагать возможность селективного иммуносупрессивного эффекта препарата ФКС: ингибирование адаптивного звена иммунной системы, без выраженного подавления функций клеток-эффекторов врожденного иммунитета, участвующих в элиминации бактериальных патогенов. Об этом свидетельствует то, что ФКС в концентрации, практически полностью отменяющей активацию и пролиферативный ответ лимфоцитов (клеток адаптивного иммунитета), незначимо влияют на активацию фагоцитов (клеток-эффекторов врожденного иммунитета), а также их миграционную, поглотительную и микробицидную функцию. Следует отметить, что способность ФКС переключать иммунный ответ в направлении Th1/-лимфоцитов, может дополнительно способствовать активации эффекторов врожденного иммунитета (нейтрофилов) и повышению резистентности организма к внеклеточным патогенам.

Подводя итоги диссертационной работы, прежде всего, задаешься вопросом о специфичности для конкретного препарата ФКС, либо универсальности для всего класса соединений флавоноидной структуры пусковых механизмов, лежащих в основе выявленных фактов и феноменов. Могут ли множественные эффекты ФКС иметь единую фармакодинамическую природу?

Фармакологические эффекты большинства лекарственных средств опосредованы специфическими макромолекулами организма (рецепторами), связывание с которыми изменяет цепь биохимических реакций в клетке-мишени. Рецепторы могут быть как мембранными, так и внутриклеточными структурами. Мембранный рецептор является обычно начальной частью сигнального пути и не является непосредственным передатчиком активационного сигнала на эффекторную систему. В связи с этим блокада мембранного рецептора может привести к выраженному фармакологическому эффекту лишь при отсутствии альтернативных путей передачи сигнала или независимо активированных внутриклеточных молекул-посредников (часто встречается при злокачественных новообразованиях). В аспектах современной фармакотерапии иммунопатологических и онкологических заболеваний особенный интерес представляют центральные молекулы-регуляторы передачи активационного сигнала, «замыкающих» на себе несколько путей, важных для патологического процесса.

Большинство экспериментальных данных свидетельствует о влиянии флавоноидов на активность киназ [Atluru D. et а!., 1991; Akiyama Т. et al., 1987; Trevillyan J.M. et al., 1990]. В исследованиях in vitro с использованием очищенных ферментов или клеточных экстрактов продемонстрировано прямое связывание некоторых флавоноидов с протеинкиназами. Есть мнение, что флавоноиды способны взаимодействовать с АТФ-связывающими сайтами ферментов, обладая структурным сходством с молекулой АТФ [Dangles О., et al., 2008]. С большой долей вероятности можно констатировать, что большинство биологических эффектов основаны на способности липофильных флаво-

ноидов проникать в клетку и ингибировать перенос фосфатных групп с участием фер-ментов-киназ.

На сегодняшний день считается бесспорным, что процессы фосфорилирования с участием рецепторных и нерецепторных протеинкиназ играют одну из наиглавнейших ролей в передаче рецептор-опосредованного ростового сигнала, в том числе и в опухолевой клетке [Ullrich А. et al„ 2008]. И, по-видимому, трансфосфорилирование - это один из общих биохимических механизмов передачи сигнала извне и/или усиления внутриклеточного сигнала, который выводит клетку из состояния покоя. Опираясь на экспериментальные факты, демонстрирующие, что в процессе трансмембранной передачи ростового сигнала происходит всплеск аэробного синтеза АТФ на плазматической мембране клетки с участием NADFH-дегидрогеназы, который инициирует каскадный механизм тирозинспецифического фосфорилирования [Карелин A.A. с соавт., 2000], полагается, что роль пула АТФ, который быстро синтезируется примембранно в ответ на ростовой фактор, сводится не, сколько к энергетическому обеспечению, но преимущественно к химической передаче сигналов фундаментальных клеточных процессов. Таким образом, мембранотропные селективные ингибиторы АТФ-связывающего центра протеинкиназ теоретически должны ослаблять действие сигнального АТФ и прерывать передачу внутриклеточного ростового пути в активированной клетке.

Использование флавоноидов, способных селективно ингибировать различные активированные протеинкиназы, может стать общей стратегией изыскания препаратов -низкомолекулярных ингибиторов сигнальных молекул. Такие соединения или их синтетические производные, вероятно, должны ослаблять как гиперактивированный (за счет мутаций и/или амплификации протоонкогенов) ростовой сигнал в опухолевой клетке, так и влиять на активацию, пролиферацию и реализации эффекторных функций клеток иммунной системы. В последнем случае, мишенью для флавоноидных соединений (в случае селективного ингибирования специфических киназ) могут стать активированные лимфоциты или запущенный в них конкретный регуляторный или эффекторный механизм. Следовательно, появляется вероятность проявления избирательной иммуносу-прессии: минимальное влияние на клетки, которые не участвуют в иммунном ответе в момент терапевтического использования препарата. С опорой на проанализированные литературные данные можно рассуждать и о молекулярных механизмах выявленных эффектов препарата ФКС. С большой долей вероятности, полученные в настоящем диссертационном исследовании противоопухолевая и иммуносупрессивная активности ФКС, базируются на ингибировании сигнальных молекул, активированных при запуске иммунного ответа или опухолевой трансформации. ФКС - низкомолекулярные соединения, что допускает возможность как достаточно «дешевого» химического синтеза лекарств de novo на их основе, так и выявление среди них (скрининг in vitro) высокоспецифичных блокаторов молекулярных мишеней, патогномоничных для конкретного заболевания, с целенаправленной их химической модификацией с цепью оптимизации фармакодинамических свойств и фармакокинетики.

ВЫВОДЫ

1. Флавоноиды корней солодки дозозависимо угнетают активацию стимулированных in vitro митогенами человеческих и мышиных Т- и B-лимфоцитов как за счет прямого антипролиферативного действия, так и изменения баланса Т-хелперных цитоки-

нов, которое выражается в снижении уровней ИЛ-2 и ИФНу и увеличении ИЛ-6 и ИЛ-17.

2. Флавоноиды корней солодки не индуцируют апоптоза активированных человеческих и мышиных Т- и В-лимфоцитов in vitro, а также на фоне длительного их введения мышам не вызывают патоморфологических признаков цитотоксичности в лим-фоидных органах.

3. Флавоноиды корней солодки при парентеральном введении на ранних сроках после сенсибилизации 2,4-динитрофторбензолом, подавляют развитие реакции контактной чувствительности у мышей, что сопровождается дозозависимым уменьшением абсолютного количества клеток регионарных лимфоузлов за счет снижения их про-лиферативного ответа.

4. Снижение пролиферативного ответа клеток регионарных лимфоузлов, как и в случае митоген-стимулированной пролиферации in vitro, сопровождается изменением цитокинового баланса: наблюдается уменьшение секреции ИЛ-2, ИФНу и ИЛ-4 и увеличение продукции ИЛ-10 и ИЛ-17, что может свидетельствовать об изменении Т-хелперной регуляции иммунного ответа под влиянием флавоноидов корней солодки.

5. На поздних сроках после сенсибилизации 2,4-динитрофторбензолом (после завершения пролиферации и эмиграции зрелых клеток-эффекторов из регионарных лимфоузлов в селезенку) обработка флавоноидами корней солодки суммарной фракции спленоцитов, а также выделенных из нее Т-лимфоцитов, приводит к блокаде адоптивного переноса реакции контактной чувствительности несенсибилизи-рованным мышам-реципиентам.

6. Мишенью для препарата флавоноидов корней солодки является полученная из спленоцитов на поздних сроках после сенсибилизации 2,4-динитрофторбензолом CD4* субпопуляция, которая при взаимодействии с CD8* клетками-эффекторами приводит к блокаде адоптивного переноса контактной чувствительности.

7. На стадии сенсибилизации мышей в модели овальбумин-индуцированной респираторной аллергии внутривенное введение флавоноидов корней солодки изменяет спектр синтезируемых спленоцитами цитокинов (уменьшение секреции ИЛ-2, но увеличение ИФНу и ИЛ-17), а также снижает уровень сывороточных антиген-специфических IgE и lgG1, что еще раз подтверждает способность препарата флавоноидов солодки изменять Т-хелперную регуляцию иммунного ответа.

8. На стадии провокации овальбумином респираторной аллергии у мышей внутривенное введение флавоноидов корней солодки, приводит к уменьшению абсолютного количества клеток и эозинофилов в бронхоальвеолярной лаважной жидкости. ■

9. Курсовое парентеральное введение флавоноидов корней солодки увеличивает выживаемость мышей в экспериментальной модели реакции трансплантат против хозяина, что сопровождается снижением выраженности характерных гистопатологи-ческих изменений в печени и почках.

10. Флавоноиды корней солодки значимо не подавляют функциональную активность клеток-эффекторов врожденного иммунитета in vitro: не ингибируют поглотительную и бактерицидную активность фагоцитов периферической крови человека, не влияют на изменение экспрессии молекул адгезии (CD62L и CD11b) в процессе ЛПС-активации, умеренно снижая интенсивность ФМА-индуцированного окислительного «взрыва». In vivo флавоноиды корней солодки не подавляют индуциро-

ванную пептоном миграцию нейтрофилов и макрофагов в брюшную полость и повышают резистентность мышей к острой стафилококковой инфекции.

11. Флавоноиды корней солодки подавляют пролиферацию и индуцируют апоптоз в опухолевых клетках различного видового и гистологического происхождения in vitra, а также могут повышать эффективность циклофосфамида в экспериментальной противоопухолевой терапии лимфолейкоза у мышей.

12. При хроматографическом разделении препарата флавоноидов корней солодки получена фармакологически активная фракция, которая обладает антипролифера-тивной активностью и подавляет способность клеток-эффекторов адоптивно переносить контактную чувствительность.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Погобало A.B., Анашкина E.H., Павлова С.И., Сергеев A.B. Перспективные химио-профилактические препараты. II Материалы XIII Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва, 3-7 апреля, 2006, с. 32.

2. Павлова С.И., Анашкина Е.Н, Козлов И.Г., Силаева Т.В., Хрусталев С.А., Шашкина М.Я., Сергеев A.B. Противоопухолевые и антитоксические свойства экстракта корня солодки. // Материалы IV съезда онкологов и радиологов СНГ, Баку, 28 сентября - 1 октября, 2006.

3. Павлова С.И., Гладков И.В., Давыдова Н.В., Дибирова Г.О., Козлов И.Г. Влияние экстракта корня солодки на ростовые характеристики опухолевых и нормальных мононуклеарных клеток in vitro. II Вестник Уральской медицинской академической науки. 2006,1(3), 173-175.

4. Павлова С.И., Гладков И.В., Давыдова Н.В., Сергеев A.B., Козлов И.Г. Различные механизмы подавления пролиферации митоген-активированных лимфоцитов экстрактом корня солодки. II Материалы Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия», Курск, 16-18 мая, 20.06, с. 130.

5. Павлова С.И., Сергеев A.B., Дмитриева Н.Б., Дибирова Г.О., Козлов И.Г. Изучение противоопухолевой активности экстракта корня солодки in vivo и in vitro. Н Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2006, 5(4), 17-18.

6. Павлова С.И., Гладков И.В., Дмитриева Н.Б., Дибирова Г.О., Козлов И.Г. Флавоноиды корня солодки подавляют пролиферацию лимфоцитов в разных экспериментальных моделях. II Иммунология Урала. 2007, 6(1 ), 24-25.

7. Павлова С.И., Гладков И.В., Сергеев A.B., Дмитриева Н.Б., Дибирова Г.О., Козлов И.Г. Влияние экстракта корня солодки и глицирризиновой кислоты на пролиферацию опухолевых и нормальных клеток. II Материалы VIII Конгресса «Современные проблемы аллергологии иммунологии и иммунофармакологии», Москва, 27-29 июня, 2007, с. 255.

8. Павлова С.И., Сергеев A.B., Дмитриева Н.Б., Дибирова Г.О., Козлов И.Г. Флавоноиды корня солодки подавляют митоген-стимулированную пролиферацию Т- и В-лимфоцитов. II Психофармакология и биологическая наркология. 2007, 7(2), 2-1886. Материалы III Съезда фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению», Санкт-Петербург, 23-27 сентября.

9. Павлова С.И., Гладков И.В., Кягова A.A., Козлов И.Г. Флавоноиды корня солодки подавляют индуцированную in vitro и in vivo пролиферацию лимфоцитов. II Российский иммунологический журнал. 2007,1/10(3-4), 279-282.

10. Павлова С.И., Гладков И.В., Сергеев A.B., Козлов И.Г. Антипролиферативные свойства экстракта корня солодки и его компонентов. II Российский биотерапевтический журнал. 2008, 7(1), 49.

11. Павлова С.И., Кягова А.А., Дмитриева Н.Б., Дибирова Г.О., Козлов И.Г. Влияние флавоноидов корня солодки на развитие реакции контактной чувствительности у мышей. // Российский иммунологический журнал. 2008, 2/11(2-3), 201.

12. Павлова С.И., Гладков И.В., Кягова А.А., Ларина Н.А., Козлов И.Г. Флавоноиды корня солодки подавляют реакцию контактной гиперчувствительности. // Вестник Уральской медицинской академической науки. 2008,19(1), 57-59.

13. Малышев П.Ю., Павлова С.И., Дмитриева Н.Б., Козлов И.Г. Флавоноиды - потенциальный источник новых селективных иммунодепрессантов. // Онкогематология. 2008, 4, 55-56.

14. Насибов Р.С., Павлова С.И., Дибирова Г.О., Дмитриева Н.Б., Милешина С.Е., Козлов И.Г. Перспективы создания липосомальных форм лекарственных препаратов флавоноидов. // Онкогематология. 2008,4, 62.

15. Павлова С.И., Насибов Р.И., Козлов И.Г. Изучение антипролиферативных и проап-оптогенных эффектов веществ растительного происхождения. // Онкогематология. 2008, 4, 64.

16. Павлова С.И., Насибов Р.С., Тимаков М.А., Малышев П.Ю., Козлов И.Г. Флавоноиды корня солодки и функции фагоцитов. // Вестник Уральской медицинской академической науки. 2009, 24(2/1), 50-51.

17. Сергеев А.В., Козлов И.Г., Павлова С.И., Погобало А.В. Антиоксидантная и антитоксическая активность иммуномодуляторов «Чаговит» и экстракт корня солодки. И Материалы II Московской региональной научно-практической конференции (с международным участием) «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты», Москва, 28-29 мая, 2009, с. 76-78.

18. Насибов Р.И., Павлова С.И., Малышев П.Ю., Козлов И.Г. Флавоноиды корня солодки повышают резистентность мышей BALB/c к стафилококковой инфекции. // Сборник трудов X Международного конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Казань, 20-23 мая, 2009, с. 253-254.

19. Тимаков М.А., Павлова С.И., Козлов И.Г. Флавоноиды, ингибирующие тирозинки-назные рецепторы - потенциальные агенты в терапии опухолей, экспрессирующих рецептор эпидермального фактора роста. // Вестник Уральской медицинской академической науки. 2009, 24(2/1), 166-167.

20. Павлова С.И., Насибов Р.И., Малышев П.Ю., Козлов И.Г. Влияние флавоноидов корня солодки на функции фагоцитов человека. II Сборник трудов X Международного конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», Казань, 20-23 мая, 2009, с. 255-256.

21. Kyagova А.А., Kozir L.A., Pyatnitskii I.A., Gorshkova N.V., Pavlova S.I., Kozlov I.G., Ma-lakhov M.V., Potapenko A.Ya. Immunospecific suppression of contact hypersensitivity by psoralen photolysis products. // 13th Congress of the European Society for Photobiology and 2nd Conference of the European Platform for Photodinamic Medicine, Wroclaw, Poland, September 5-10, 2009, p. 108-109.

22. Павлова С.И., Насибов P.C., Шкопоров A.H., Цицуашвили М.Д., Козлов И.Г. Изменение параметров фагоцитоза под влиянием флавоноидов корня солодки. II Российский иммунологический журнал. 2009, (3/12), 3-4, 303-309.

23. Pavlova S., Nasibov R„ Kozlov I. Inhibition of stimulated lymphocyte proliferation by licorice root flavonoids. II Eur. J. Immunol. 2009, 39(S1), S756.

24. Kyagova A., Kozir L., Gorshkova N„ Pyatnitskii I., Pavlova S„ Kozlov I., Malakhov M., Potapenko A. Immunosuppression induced by psoralen photoproducts can be realized through generation of adhesive cells with specific suppressive functions and apoptotic cells. II J. Invest. Dermatol. 2009,129, 36.

25. Albegova D.Z., Pavlova S.I., Kyagova A.A., Tsitsuashvili M.D., Malyshev P.Yu., Kozlov I.G. Flavonoids decrease cellularity and lymphocyte proliferation in mice contact sensitivity. II International Journal on Immunorehabilitation. 2010,12(1), 86.

26. Албегова Д.З., Павлова С.И., Малышев П.Ю.. Цицуашвили М.Д., Дибирова Г.О., Демина М.В., Козлов И.Г. Флавоноиды - ингибиторы сигнальных путей. II Российский аллергологический журнал. 2010,1(1), 7-8.

27. Tsitsuashvili M.D., Pavlova S.I., Stepanov G.O., Albegova D.Z., Kozlov I.G. The prospect of a nanosomal forms of flavonoid drugs. II International Journal on Immunorehabilitation. 2010,12(1), 86.

28. Малышев П.Ю., Павлова С.И., Албегова Д.З., Дмитриева Н.Б., Жукова И.Б., Дибирова Г.О., Козлов И.Г. Флавоноиды - потенциальный источник для создания противоопухолевых препаратов. II Российский аллергологический журнал. 2010, 1(1), 115-116.

29. Павлова С.И., Шкопоров А.Н., Албегова Д.З., Дмитриева Н.Б., Жукова И.Б., Козлов И.Г. Оценка фагоцитоза с использованием GFP-экспрессирующих бактерий. // Российский аллергологический журнал. 2010,1(1), 142-143.

30. Цицуашвили М.Д., Павлова С.И., Степанов Г.О., Албегова Д.З., Демина М.В., Козлов И. Г. Возможность оптимизации фармакокинетики и повышения эффективности препаратов флавоноидов. II Российский аллергологический журнал. 2010, 1(1), 199-200.

31. Албегова Д.З., Павлова С.И., Кягова А.А., Цицуашвили М.Д., Малышев П.Ю., Козлов И.Г. Флавоноиды снижают «неточность и пролиферацию в реакции контактной чувствительности. II Международный журнал по иммунореабилитации, 2010, 12(2), 105.

32. Цицуашвили М.Д., Павлова С.И., Албегова Д.З., Козлов И.Г. Перспективы создания наносомальных форм препаратов флавоноидов. // Международный журнал по иммунореабилитации, 2010,12(2), 105.

33. Павлова С.И., Албегова Д.З., Кягова А.А., Демина М.В.. Козлов И.Г. Влияние флавоноидов солодки на цитокиновый профиль лимфоцитов в модели контактной чувствительности. // Цитокины и воспаление. 2010, 9(3), 50.

34. Albegova D.Z., Pavlova S.I., Kyagova А.А., Tsitsuashvili M.D., Malyshev P.Yu., Kozlov I.G. Licorice root flavonoids and contact sensitivity in mice. // In: Advances in Allergy, Asthma and Immunology: From Basic Science to Clinical Management. R. Sepiashvili [ed.], Bologna, 2010, p.147-152.

35. Tsitsuashvili M.D., Pavlova S.I., Stepanov G.O., Albegova D.Z., Kozlov I.G. The prospect of a nanosomal forms of flavonoid drugs. II In: Advances in Allergy, Asthma and Immunology: From Basic Science to Clinical Management. R. Sepiashvili [ed.], Bologna, 2010, p.153-156.

36. Павлова С.И., Малышев П.Ю., Насибов P.C., Дмитриева Н.Б., Жукова И.Б. Синер-гичный антипролиферативный эффект флавоноидов солодки и доксорубицина по отношению к эритремии человека K562/DOX. II Вестник Уральской медицинской академической науки. 2010, 29(2/1), 262-262.

37. Цицуашвили М.Д., Павлова С.И., Албегова Д.З., Маркина Е.В., Жукова И.Б. Сравнение антипролиферативного эффекта различных экспериментальных лекарственных форм флавоноидов корня солодки. II Вестник уральской медицинской академической науки. 2010, 29(2/1), 276-277.

38. Павлова С.И., Албегова Д.З., Кягова А.А., Козлов И.Г. Механизмы иммуносупрес-сивной активности флавоноидов корня солодки при контактной чувствительности у мышей. II Российский иммунологический журнал. 2010,4/13(3), 248-254.

39. Павлова С.И., Албегова Д.З., Кягова А.А., Козлов И.Г. Механизмы иммуносупрес-сивного действия флавоноидов корня солодки при контактной чувствительности у мышей: угнетение функции Т-лимфоцитов-эффекторов опосредуется неэффектор-ными клетками. // Медицинская иммунология. 2010,12(6), 503-510.

40. Павлова С.И., Албегова Д.З., Дмитриева Н.Б., Дибирова Г.О., Козлов И.Г. Флавоноиды корня солодки влияют на функции активированных лимфоцитов мыши и человека. II Российский иммунологический журнал. 2011, 5/14(1), 62-68.

41. Pavlova S.I., Albegova D.Z., Kartavaya E.V., Shevchenko M.A., Guryanova S.V., Tsitsuashvili M.D., Kozlov I.G. Evaluation of Licorice Root Flavonoid Effect in Experimental Model of Asthma. // Proceedings and Abstracts of the IV World Asthma and COPD Forum and the XVI International Congress on Rehabilitation in Medicine and Immunorehabilitation, Paris, France, April 30 - May 3, 2011, p. 43.

42. Tsitsuashvili M.D., Pavlova S.I., Albegova D.Z., Kozlov I.G. Kinetics of Fluorochrome-Labeled Nanosome Interaction with Tumor Cell Line in Vitro. II Proceedings and Abstracts of the IV World Asthma and COPD Forum and the XVI International Congress on Rehabilitation in Medicine and Immunorehabilitation, Paris, France, April 30 - May 3, 2011, p. 64.

43. Pavlova S.I., Albegova D.Z., Kartavaya E.V., Shevchenko M.A., Guryanova S.V., Tsitsuashvili M.D., Kozlov I.G. Licorice Root Flavonoids in Experimental Model of Asthma.// International Journal on Immunorehabilitation. 2011, 13(1), 89-91.

44. Tsitsuashvili M.D., Pavlova S.I., Albegova D.Z., Kozlov I.G. Interaction of Fluorochrome-Labeled Nanosomes with U937 Tumor Cell Line In Vitro. II International Journal on Immunorehabilitation. 2011,13(1), 102-103.

45. Цицуашвили М.Д., Павлова С.И., Козлов И.Г. Кинетика взаимодействия наносом с клетками опухолевой линии in vitro. II Аллергология и иммунология. 2011, 12(1), 11-13.

46. Цицуашвили М.Д., Павлова С.И., Албегова Д.З., Козлов И.Г. Изучение кинетики взаимодействия флуорохром-меченых наносом с клетками опухолевой линии U-937 in vitro. II Аллергология и иммунология. 2011,12(1), 18.

47. Павлова С.И., Албегова Д.З., Картавая Е.В., Шевченко М.А., Гурьянова С.В., Цицуашвили М.Д., Козлов И.Г. Оценка эффективности флавоноидов корня солодки в "экспериментальной модели бронхиальной астмы. II Аллергология и иммунология. 2011,12(1), 23.

48. Pavlova S„ Albegova D., Tsitsuashvily M„ Shevchenko M., Guryanova S., Kozlov I. Licorice flavonoids modulate cytokine production during immune responses in a mouse asthma model. // Abstracts of the 30 Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology, Istanbul, Turkey, June 11-15, 2011, p.1156.

49. Tsitsuashvili M.D., Pavlova S.I., Albegova D.Z., Stepanov G.O., Dmitrieva N.B., Dibirova G.O., Kozlov I.G. Antiproliferative Effects of Nanosomal Drug Forms of Licorice Flavonoids. // Abstract Supplement of 11th Annual Meeting of the Federation of Clinical Immunology Societies, Washington, USA, June 23-26, 2011, p. 152-153.

50. Kyagova A.A., Pavlova S.I., Albegova D.Z., Pyatnitsky I.A., Kozlov I.G., Kozir L.A., Potapenko A.Y. Suppression of contact hypersensitivity to 2,4-dinitroflourobenzene in mice caused by psoralen photooxidation products. II Book of Abstracts of 14th Congress European Society for Photobiology, Geneva, Switzerland, September 1-6,2011, p. 133.

51. Kyagova A.A., Albegova D.Z., Pavlova S.I., Pyatnitsky I .A., Kozlov I.G., Kozir L.A., Potapenko A.Y. Modulation of the contact hypersensitivity in mice by psoralen photooxidation products: alteration in the cytokine balance and generation of cells with specific suppressive function. II J. Invest. Dermatol., 2011, 131S, S100.

52. Павлова С.И., Албегова Д.З., Дмитриева Н.Б., Дибирова Г.О., Козлов И.Г. Изучение эффективности флавоноидов корня солодки при септическом шоке у мышей. II Вестник Уральской медицинской академической науки, 2011, 35(2/2), 48-49.

53. Павлова С.И., Цицуашвили М.Д., Тимаков М.А., Милешина С.Е., Козлов И.Г. Механизмы антипролиферативной активности флавоноидов корня солодки по отношению к клеткам человеческой гистиоцитарной лимфомы U-937. // Вестник Уральской медицинской академической науки. 2011, 35(2/2), 49-50.

54. Павлова С.И., Цицуашвили М.Д., Дибирова Г.О., Кукушкин Г.В., Козлов И.Г. Изучение противоопухолевых эффектов флавоноидов корня солодки в экспериментальных моделях in vitro и in vivo. II Вестник Волгоградского медицинского университета. 2011, 64-66.

55. Tsitsuashvili M.D., Pavlova S.I., Kozlov I.G. Evaluation of Licorice Root Flavonoid Antiproliferative Effect in Different Tumor Cell Lines. // International Journal on Immunorehabilitation. 2011,13(2), 165-166.

56. Цицуашвили М.Д., Павлова С.И., Тимаков M.A., Албегова Д.З.,Дибирова Г.О., Козлов И.Г. Флавоноиды корня солодки подавляют пролиферацию опухолевых клеток. //Аллергология и иммунология. 2011,12(2), 210.

57. Павлова С.И., Албегова Д.З., Кягова А.А., Дмитриева Н.Б., Козлов И.Г. Иммуноре-гуляторные механизмы флавоноидов корня солодки в подавлении реакции контактной чувствительности. // Аллергология и иммунология. 2011. 12(2), 207-208.

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

анти-СОЗ моноклоналные антитела к антигену CD3

БАЛ бронхоальвеолярная лаважная жидкость

ДНФБ 2,4-динитрофторбензол

ИК50 ингибирующая концентрация, соответствующавя 50% эффекту

ИЛ интерлейкин

ИФН интерферон

ИС индекс стимуляции

КонА конканавалин А

КЧ контактная чувствительность

ЛПС липополисахарид

МНК мононуклеарные клетки

ОБА овальбумин

ОФ-ВЭЖХ обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография

РТПХ реакция трансплантат против хозяина

ФГА фитогемагглютинин

ФИТЦ флуоресцеинизотиоцианат

ФКС флавоноиды корней солодки

ФМА форбол-12-миристат-13-ацетат

ФНО фактор некроза опухолей

ФСБ фосфатно-солевой буфер

ЦФ циклофосфамид

GFP Green Fluorescent Protein, зеленый флуоресцирующий белок

PWM поквид-митоген

Заказ № 43-П/02/2012 Подписано в печать 08.02.2012 Тираж 80 экз. Усл. п.л.2,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

За последние десятилетия в медицине произошел переход исследований на молекулярный уровень, и появились более детальные сведения о патогенезе многих заболеваний, существенно изменившие представления о фармакотерапевтических подходах к их лечению [9]. Важнейшим достижением этого этапа исследований стало выявление молекул, которые играют ведущую роль в возникновении или прогрессировании патологического процесса. Это сформировало концепцию мишень-направленной терапии и обосновало актуальность разработки инновационных «таргетных» препаратов, способных селективно корригировать ключевые звенья патогенеза.

В связи с завершением интенсивных исследований в биотехнологии и иммунологии, а также молекулярной биологии и генетике рака, во второй половине XX века были разработаны и внедрены принципиально новые иммуносупрессанты и противоопухолевые препараты. Примерами таковых лекарственных средств являются моноклональных антитела и низкомолекулярные ингибиторы сигнальных молекул (циклоспорин, макро-лидные антибиотики, «тинибы») [13]. Механизмы действия таких лекарственных средств основаны не на неспецифическом уничтожении активно пролиферирующих клеток, а целенаправленной элиминации/угнетении опухолевых или иммунекомпетентных клеток идентичной природы.

Перспективы развития данных областей фармакотерапии тесно связаны с открытием более специфичных мишеней. Так, несомненно, актуальным является изыскание высоко избирательных иммуносупрессантов, не оказывающих влияния на клетки, которые не участвуют в иммунном ответе в момент терапевтического использования препаратов. Мишенью для этой подгруппы может являться запущенный в активированных лимфоцитах конкретный регуляторный или эффекторный механизм [9]. Идеальный иммуносупрессант должен обладать избирательным действием на отдельные субпопуляции лимфоцитов, не вызывая повреждения как других клеток организма, так и клонов лимфоцитов, осуществляющих реакции противоинфекционного и противоопухолевого иммунитета. На место подобных иммуносупрессантов на сегодняшний день претендуют так называемые «регуляторы/переключатели» иммунного ответа.

Безусловно, «таргетные» лекарственные средства кардинально изменили стратегию фармакотерапии, продемонстрировав высочайшую эффективность в отношении отдельных заболеваний (например, некоторых он-когематологических). Однако довольно часто эффект такого препарата оказывается ниже ожидаемого, а резистентность к нему развивается так же, как и при стандартной терапии [13]. Таким образом, в большинстве случаев современные средства служат лишь дополнением к стандартным схемам лечения, в которых классические «нетаргетные» противоопухолевые и иммуносупрессивные препараты все еще занимают лидирующее положение.

С точки зрения разработки новых лекарственных препаратов, большой интерес представляет класс полифенольных соединений растительного происхождения, поскольку многие флавоноиды демонстрируют разнообразные биологические эффекты на организменном уровне [29, 78, 60, 70, 86, 165, 181, 211, 244. 256, 258, 265, 295]. Изучение их механизмов действия на клеточном и молекулярном уровнях показывает, что некоторые флавоноиды способны селективно влиять на активность протеинкиназ [40. 107], а как следствие и на активацию сигнальных путей в клетках млекопитающих [61, 62, 63, 93, 118, 166, 297, 313]. На наш взгляд, на этом механизме действия может базироваться не только противоопухолевый, но и селективный иммуносупрессивный фармакодинамический эффект флаво-ноидов. Это требует экспериментального обоснования возможности применения полифенольных соединений в клинической иммунологии и онкологии. В связи с чем представляется актуальным исследования иммуно-тропной и противоопухолевой эффективности веществ флавоноидной структуры, а также прицельное изучение селективности их влияния на различные звенья (адаптивное и врожденное) иммунной системы.

Цель и задачи

Целью данного диссертационного исследования стало экспериментальное обоснование перспективы создания новых иммуносупрессивных и противоопухолевых лекарственных средств на основе соединений флавоноидной структуры, выделенных из экстракта корней солодки.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Отработать технологию выделения и стандартизации биологически активной фракции флавоноидов корней солодки (ФКС).

2. Оценить влияние ФКС на ростовые характеристики (пролиферация, апоптоз) и функциональную активность (продукция цитокинов) клеток адаптивного иммунитета в моделях активации Т- и В-лимфоцитов in vitro.

3. Исследовать фармакологическую эффективность ФКС в экспериментальных моделях иммунопатологических процессов Т- и В-клеточной направленности (контактной чувствительности, индуцированной 2,4-динитрофторбензолом (ДНФБ); реакции трансплантат против хозяина; овальбумин-индуцированной респираторной аллергии).

4. Изучить молекулярные и клеточные механизмы иммунотропных эффектов ФКС, используя модель ДНФБ-индуцированной контактной чувствительности у мышей.

5. Оценить влияние ФКС на некоторые функциональные показатели клеток-эффекторов врожденного иммунитета in vitro: экспрессию поверхностных маркеров активации, продукцию активных форм кислорода, а также поглотительную и бактерицидную активность фагоцитов.

6. Провести оценку влияния ФКС на некоторые показатели врожденного иммунитета in vivo в экспериментальных моделях пептон-индуциро-ванной миграции фагоцитов в брюшную полость и острой стафилококковой инфекции у мышей.

7. Изучить влияние ФКС на ростовые характеристики (пролиферация, апоптоз) клеток различных опухолевых линий и оценить прямую цито-токсичность флавоноидов солодки по отношению к опухолевым клеткам in vitro.

8. Провести оценку эффективности ФКС в моно- и комбинированной с циклофосфамидом экспериментальной терапии в модели перевиваемого лимфолейкоза Р388 у мышей.

9. Наметить пути выделения фармакологически активных соединений суммарной фракции ФКС.

Основные положения, выносимые на защиту

1. ФКС подавляют пролиферацию активированных Т- и В-лимфоцитов in vitro. Возможными механизмами отмены активации лимфоцитов являются как прямое антипролиферативное действие, так и изменение баланса Т-хелперных цитокинов, но не индукция апоптоза.

2. ФКС проявляют иммуносупрессивные эффекты в экспериментальных моделях иммунопатологических процессов Т- и В-клеточной направленности у мышей: ДНФБ-индуцированной контактной чувствительности, реакции трансплантат против хозяина и овальбумин-индуциро-ванной респираторной аллергии.

3. Механизмами иммуносупрессорного действия ФКС in vivo являются: ингибирование пролиферации лимфоцитов; изменение цитокинового баланса, свидетельствующее о «переключении» дифференцировки субпопуляций Т-лимфоцитов-хелперов при индукции иммунного ответа; а также непрямая отрицательная регуляция функций зрелых Т-лимфоцитов-эффекторов.

4. ФКС практически полностью отменяя активацию клеток адаптивного иммунного ответа, незначимо изменяют функциональные показатели клеток-эффекторов врожденного иммунитета: экспрессию активацион-ных маркеров, миграционную, поглотительную и микробицидную функцию фагоцитов.

5. ФКС подавляют пролиферацию и индуцируют апоптоз в культуре опухолевых клеток различного гистогенеза, а также повышают эффективность циклофосфамида в экспериментальной противоопухолевой терапии.

Научная новизна исследования

В работе был отработан и модифицирован метод выделения фармакологически активных полифенольных соединений из экстракта корней солодки. Для повышения репрезентативности исследований многокомпонентного препарата каждую новую серию выделенных флавоноидов в дополнение к общеизвестному фотохимическому методу (цветная реакция с галловой кислотой) предложено стандартизовать в биологической системе (по выраженности угнетения пролиферации опухолевой линии).

Используя стандартизированный препарат флавоноидов корней солодки, впервые было проведено исследование его фармакодинамических эффектов в моделях, рекомендованных для доклинического изучения новых фармакологических веществ с иммунотропной и противоопухолевой активностью.

Впервые был продемонстрирован антипролиферативный эффект ФКС in vitro в отношении митоген-активированных человеческих и мышиных Т- и В-лимфоцитов. Было доказано, что антипролиферативный эффект ФКС не связан с индукцией апоптоза. Одним из механизмов анти-пролиферативного эффекта является модулирующее влияние ФКС на продукцию цитокинов: подавление секреции ИЛ-2 и ИФНу, и повышение уровня ИЛ-6 и ИЛ-17.

Впервые было показано, что ФКС при парентеральном введении проявляют фармакологическую эффективность в экспериментальных моделях иммунопатологических процессов Т- и В-клеточной направленности у мышей: подавляют характерные проявления ДНФБ-индуцированной контактной чувствительности, реакции трансплантат против хозяина и овальбумин-индуцированной респираторной аллергии.

Впервые было продемонстрировано, что внутривенное введение ФКС на ранних сроках после ДНФБ-сенсибилизации приводит как к подавлению пролиферативного ответа, так и к снижению абсолютного числа клеток регионарных лимфоузлов. Это коррелирует с изменением цитоки-нового баланса: наблюдается уменьшение секреции ИЛ-2, ИФНу и ИЛ-4 и увеличение продукции ИЛ-10 и ИЛ-17 клетками регионарных лимфоузлов, что может свидетельствовать о способности флавоноидов солодки переключать ТЫ/Т112 иммунные ответы в процессе развития контактной чувствительности на формирование ТЬ17-лимфоцитов.

Впервые показано, что на поздних сроках после ДНФБ-сенсибилизации, обработка флавоноидами солодки суммарной фракции сплено-цитов, а также выделенных из нее с помощью иммуномагнитной сепарации Т-клеток, приводит к блокаде адоптивного переноса реакции контактной чувствительности несенсибилизированным сингенным мышам-реципиентам. Впервые установлено, что блокирующий эффект ФКС не наблюдается в случае обработки СБ8+ лимфоцитов-эффекторов, выделенных из спленоцитов сенсибилизированных животных. Воспроизведение блокирующего эффекта ФКС, происходит только после обработки СВ4+-попу-ляции (не проявляют свойств эффекторов контактной чувствительности) и последующего ее адоптивного переноса совместно с СБ8+-эффекторами несенсибилизированным мышам-реципиентам.

Впервые показано, что внутривенное введение флавоноидов солодки мышам с овальбумин-индуцированной респираторной аллергией на стадиях сенсибилизации снижает уровень сывороточных антиген-специфических ^Е и ^01, а также изменяет спектр синтезируемых спленоцитами цитокинов (уменьшение секреции ИЛ-2, и увеличение продукции ИФНу и ИЛ-17). Это может свидетельствовать о способности ФКС переключать ТЬ2 иммунный ответ в процессе сенсибилизации к овальбумину на формирование антагонистичных популяций ТЫ/ТЫ7-лимфоцитов.

Кроме того, продемонстрировано, что введение препарата ФКС на стадии провокации респираторной аллергии интрафарингеальным введением овальбумина мышам, приводит к значимому уменьшению общего количества клеток и эозинофилов в бронхоальвеолярной лаважной жидкости.

Комплексная оценка влияния ФКС на функции фагоцитов показала, что при использовании их в концентрации (20,0 мкг/мл), практически отменяющей пролиферацию активированных Т- и В-лимфоцитов, не происходит подавления активации, а также миграционной, поглотительной и бактерицидной активности нейтрофилов и моноцитов/макрофагов. Наряду с этим внутрибрюшинное введение ФКС повышает резистентность мышей к острой стафилококковой инфекции. Это позволяет говорить о возможности селективного иммуносупрессивного эффекта ФКС: ингибировании адаптивного звена иммунной системы, без выраженного подавления функций клеток-эффекторов врожденного иммунитета.

С использованием различных опухолевых клеточных культур продемонстрировано, что ФКС подавляют пролиферацию и индуцируют апоптоз в опухолевых клетках различного видового и гистологического происхождения, а также повышают эффективность алкилирующего цитостатика циклофосфамида в экспериментальной противоопухолевой терапии перевиваемого лимфолейкоза Р388 у мышей.

На основании сравнительного химического и фармакологического анализа в ходе разделения суммарного препарата ФКС определена наиболее активная фракция флавоноидов солодки.

Практическая значимость работы

В процессе работы был отработан и модифицирован метод, позволяющий без значительных трудовых затрат, получать биологически активные полифенольные соединения из экстракта корней солодки, а также подобран комплекс моделей и методов, позволяющих оценивать иммуно-тропную и противоопухолевую активность и эффективность новых фармакологических агентов.

Совокупность полученных в работе данных углубляет фундаментальные представления о механизмах развития иммунного ответа и патогенезе иммунопатологических процессов, а также дополняют сведения о механизмах фармакологического действия биологически активных веществ флавоноидной структуры.

Доказанное в ходе выполнения работы отсутствие прямой цитоток-сичности, возможность регуляции иммунного ответа, а также различное влияние препарата ФКС на функции иммунокомпетентных клеток, участвующих в механизмах врожденного и адаптивного звеньев иммунитета открывает возможность селективной фармакологической иммуносупрессии.

Выявленные в исследованиях принципиально новые механизмы им-мунотропного и противоопухолевого действия ФКС, низкомолекулярная структура флавоноидов (что определяет возможность их химического синтеза и направленной модификации), а также данные, полученные в ходе анализа отдельных фракций, являются достаточным основанием для рассмотрения флавоноидов корней солодки как перспективной основы для разработки новых иммуносупрессивных и противоопухолевых лекарственных средств.

Внедрение результатов исследования

Результаты диссертации внедрены в учебный процесс кафедры фармакологии ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздравсоцразвития РФ. Разработанные в диссертации модели и методы используются в экспериментальной работе кафедры и отдела иммунологии ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздравсоцразвития РФ, а также отдела молекулярной и экспериментальной медицины ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогаче-ва» Минздравсоцразвития РФ.

Публикации и апробация работы

Материалы диссертации были представлены на III Съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007); VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2008); Объединенном Иммунологическом Форуме (Санкт-Петербург, 2008); Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии (Казань, 2009); 2nd European Congress of Immunology «Immunity for Life, Immunology for Health» (Берлин, Германия, 2009); III World Asthma and COPD Forum and the World Forum of Pediatrics (Дубай, ОАЭ, 2010); IV World Asthma and COPD Forum, XVI International Congress on Rehabilitation in Medicine and Immunorehabilitation (Париж, Франция, 2011); 30th Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology (Стамбул, Турция, 2011); 11th Annual Meeting of the Federation of Clinical Immunology Societies (Вашингтон, США, 2011); III Всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученых «Достижения молекулярной медицины как основа разработки инновационных лекарственных средств» (Волгоград, 2011).

Работа апробирована на совместном заседании кафедры фармакологии педиатрического факультета, кафедры иммунологии МВФ и отдела иммунологии ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздравсоцразвития РФ. По материалам диссертации опубликовано 57 печатных работы, в том числе статей в изданиях рекомендованных ВАК РФ - 22.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 244 страницах машинописного текста в виде монографии и состоит из введения, главы, посвященной материалам и методам исследований, а также 6 глав, каждая из которых включает обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение. В конце диссертации представлены заключение, выводы и библиографический указатель, включающий 314 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 56 рисунками и содержит 16 таблиц.

выводы

1. Флавоноиды корней солодки дозозависимо угнетают активацию стимулированных in vitro митогенами человеческих и мышиных Т- и В-лимфоцитов как за счет прямого антипролиферативного действия, так и изменения баланса Т-хелперных цитокинов, которое выражается в снижении уровней ИЛ-2 и ИФНу и увеличении ИЛ-6 и ИЛ-17.

2. Флавоноиды корней солодки не индуцируют апоптоза активированных человеческих и мышиных Т- и В-лимфоцитов in vitro, а также на фоне длительного их введения мышам не вызывают патоморфологи-ческих признаков цитотоксичности в лимфоидных органах.

3. Флавоноиды корней солодки при парентеральном введении на ранних сроках после сенсибилизации 2,4-динитрофторбензолом, подавляют развитие реакции контактной чувствительности у мышей, что сопровождается дозозависимым уменьшением абсолютного количества клеток регионарных лимфоузлов за счет снижения их пролифе-ративного ответа.

4. Снижение пролиферативного ответа клеток регионарных лимфоузлов, как и в случае митоген-стимулированной пролиферации in vitro, сопровождается изменением цитокинового баланса: наблюдается уменьшение секреции ИЛ-2, ИФНу и ИЛ-4 и увеличение продукции ИЛ-10 и ИЛ-17, что может свидетельствовать об изменении Т-хелперной регуляции иммунного ответа под влиянием флавонои-дов корней солодки.

5. На поздних сроках после сенсибилизации 2,4-динитрофторбензолом (после завершения пролиферации и эмиграции зрелых клеток-эффекторов из регионарных лимфоузлов в селезенку) обработка флавоноидами корней солодки суммарной фракции спленоцитов, а также выделенных из нее Т-лимфоцитов, приводит к блокаде адоптивного переноса реакции контактной чувствительности несенсиби-лизированным мышам-реципиентам.

6. Мишенью для препарата флавоноидов корней солодки является полученная из спленоцитов на поздних сроках после сенсибилизации 2,4-динитрофторбензолом CD4+ субпопуляция, которая при взаимодействии с CD8+ клетками-эффекторами приводит к блокаде адоптивного переноса контактной чувствительности.

7. На стадии сенсибилизации мышей в модели овальбумин-индуцированной респираторной аллергии внутривенное введение флавоноидов корней солодки изменяет спектр синтезируемых спле-ноцитами цитокинов (уменьшение секреции ИЛ-2, но увеличение ИФНу и ИЛ-17), а также снижает уровень сывороточных антиген-специфических IgE и IgGl, что еще раз подтверждает способность препарата флавоноидов солодки изменять Т-хелперную регуляцию иммунного ответа.

8. На стадии провокации овальбумином респираторной аллергии у мышей внутривенное введение флавоноидов корней солодки приводит к уменьшению, как общего количества клеток, так и эозинофи-лов в бронхоальвеолярной лаважной жидкости.

9. Курсовое парентеральное введение флавоноидов корней солодки увеличивает выживаемость мышей в экспериментальной модели реакции трансплантат против хозяина, что сопровождается снижением выраженности характерных гистопатологических изменений в печени и почках.

10. Флавоноиды корней солодки значимо не подавляют функциональную активность клеток-эффекторов врожденного иммунитета in vitro: не ингибируют поглотительную и бактерицидную активность фагоцитов периферической крови человека, не влияют на изменение экспрессии молекул адгезии (CD62L и CD lib) в процессе ЛПСактивации, умеренно снижая интенсивность ФМА-индуцированного окислительного «взрыва». In vivo флавоноиды корней солодки не подавляют индуцированную пептоном миграцию нейтрофилов и макрофагов в брюшную полость и повышают резистентность мышей к острой стафилококковой инфекции.

11. Флавоноиды корней солодки подавляют пролиферацию и индуцируют апоптоз в опухолевых клетках различного видового и гистологического происхождения in vitro, а также могут повышать эффективность циклофосфамида в экспериментальной противоопухолевой терапии лимфолейкоза у мышей.

12. При хроматографическом разделении препарата флавоноидов корней солодки получена фармакологически активная фракция, которая обладает антипролиферативной активностью и подавляет способность клеток-эффекторов адоптивно переносить контактную чувствительность.

Глава 8 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Значительную нишу среди современных разработок как противоопухолевых, так и иммуносупрессивных лекарственных средств к настоящему времени заняли моноклональные антитела. Опыт по разработке и клиническому использованию антител позволяет назвать их «препаратами будущего». Однако даже при всех успехах биотехнологии и генной инженерии расходы на производство терапевтических моноклональных антител и химически синтезируемых лекарственных препаратов несравнимы.

Также к числу современных лекарственных препаратов, которые целенаправленно элиминируют опухолевые клетки (но не используются в качестве иммуносупрессантов), относят селективные ингибиторы тирозин-киназ (так называемые «тинибы»). Клинический опыт применения «тини-бов» свидетельствует о хорошей их переносимости при длительном приеме. Однако успех терапии ингибиторами тирозинкиназ во многом зависит от сложной системы цитогенетического и молекулярного мониторинга, позволяющего выбирать тактику терапии в каждом конкретном случае, следовательно, впечатляющие терапевтические результаты наблюдаются лишь при определенных новообразованиях. Существует и проблема резистентности к терапии «тинибами»: отсутствие ответа на лечение, когда «дефектная» тирозинкиназа определяется в относительно небольшом количестве опухолевых клеток. Кроме того, возможны и механизмы приобретенной резистентности, как результат клональной эволюции, включающей появление дополнительных мутаций в опухолевых клетках и, вследствие этого, активации нечувствительных к данному «тинибу» других семейств сигнальных молекул. Все эти факты свидетельствует о том, что область разработки менее токсичных, высокоспецифичных и при этом относительно «простых» для производства иммуносупрессивных и противоопухолевых лекарственных средств требует дальнейшего развития.

В рамках данного диссертационного исследования проведено экспериментальное обоснование перспективы создания новых иммуносупрес-сивных и противоопухолевых лекарственных препаратов на основе соединений флавоноидной структуры из корней солодки. В табл. 8.1 и 8.2 обобщены полученные в исследованиях иммунотропные и противоопухолевые фармакодинамические эффекты ФКС, а также механизмы их реализации. На наш взгляд фармакологические эффекты ФКС, в основе действия которых нет прямой цитотоксичности по отношению к клетке-мишени, представляются особенно перспективным с точки зрения «воплощения в жизнь» концепции регуляторов/переключателей иммунного ответа и селективной иммуносупрессии.

Полученные в работе результаты демонстрируют способность фла-воноидов солодки подавлять адаптивный иммунный ответ, ингибируя активацию Т- и В-лимфоцитов, но, не индуцируя их апоптоза. Особенное внимание хочется обратить на то, что механизм отмены активации базируется не только на прямом антипролиферативном эффекте, но и способности ФКС подавлять формирование характерного антигенспецифического клона лимфоцитов-эффекторов, «переключая» иммунный ответ на уровне хелперных и/или регуляторных клеток. Кроме того, ФКС могут негативно регулировать и функцию уже сформированных зрелых Т-лимфоцитов-эффекторов. Результаты исследования позволяют также предполагать возможность селективного иммуносупрессивного эффекта препарата ФКС: ингибирование адаптивного звена иммунной системы, без выраженного подавления функций клеток-эффекторов врожденного иммунитета, участвующих в элиминации бактериальных патогенов. Об этом свидетельствует то, что ФКС в концентрации, практически полностью отменяющей активацию и пролиферативный ответ лимфоцитов (клеток-эффекторов адаптивного иммунитета), незначимо влияют на активацию фагоцитов (клеток-эффекторов врожденного иммунитета), а также их миграционную, поглотительную и микробицидную функцию, что позволяет осуществлять первую линию антимикробной защиты организма на фоне фармакологической отмены «нежелательного» адаптивного иммунного ответа.