Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.01) на тему:Комплексная технология переработки корня солодки

РГ6 од

БИБИКОВА НАТАЛЬЯ ЕВГЕНЬЕВНА

* 7 ОПТ №

КОМПЛЕКСНАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ПЕРЕРАБОТКИ КОРНЯ СОЛОДКИ

15.00.01. - Технология лекарств и организация фармацевтического дела

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва - 1999 г.

Диссертация выполнена в Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова и Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР)

Научные руководители:

доктор технических наук, академик РАМН, профессор В.А. Быков

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор химических наук, профессор Г.Г. Запесочная

доктор фармацевтических наук профессор В.И. Прокофьева

доктор фармацевтических наук доцент Н.К. Луняк

Государственный НИИ по стандартизации и контролю лекарственных средств (ГНИИСКЛС, Москва)

Защита диссертации состоится "_"_1999 г.

в _часов на заседании Диссертационного совета Д 074.05.06

при Московской медицинской академии им. ИМ. Сеченова

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской академии им. И.М. Сеченова по адресу: Москва, Зубовская пл., д. 1

Автореферат разослан "_"_1999 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 074.05.06

кандидат фармацевтических наук, доцент В.П.Садчикова

К ГХ Г"~>

Актуальность темы диссертационной работы обусловлена потребностью здравоохранения в эффективных лекарственных средствах из растений, а корень солодки является самым употребляемым компонентом растительных сборов на протяжении многих столетий. Тритерпеноидный препарат глицирам применяется в медицине при бронхиальной астме и ряде других заболеваний, а также широко используется как очень сладкое вещество. Флавоноидные соединения являются источником противоязвенных и желчегонных препаратов (ликвиритон, флакарбин, халкорин). Однако, в большинстве известных технологических способов предлагается получение либо одного, либо другого продукта. В связи с этим, представляется целесообразным поиск комплексной технологии, позволяющей используя один эксграгент, предложить совмещенную схему одновременного получения этих двух груш соединений - нативной суммы флавоновдов и глинирризиновой кислоты.

В существующей нормативной документации на сырье и экстракты солодки в методах анализа приоритет был отдан тритерпеноидам, а флавоноиды были оставлены без внимания. Углубленное изучение компонентного состава корня солодки создает реальные предпосылки для разработки объективных методов анализа, позволяющих определять как глицирризиновуго кислоту, так и флавоноиды, и пригодных для постадайного контроля их производства.

Таким образом, выбранное направление представляется актуальным и перспективным в научном и практическом плане. Работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ НПО ВИЛАР по проблеме "Лекарственные средства'' № 1891-1300-03.

Цель и задачи исследования. Цель данного исследования - разработка комплексной технологии переработки корня солодки с углубленным изучением химического состава и одновременным получением тритерпеновых и флавоновдных препаратов. При этом решались следующие задачи:

- разработка аналитических методов определения тритерпеноидов и флавоноидов в сырье, препаратах солодки и постадийном контроле;

- химико-технологическое исследование лекарственного растительного сырья солодки, разработка технологического регламента производства ликвиритона и технических условий на проликвиригон;

- выделение и идентификация индивидуальных веществ из корней солодки, как образцов для химической стандартизации сырья и препаратов солодки.

Научная новизна. Предложен новый методологический подход к разработке комплексной технологии переработки корня солодки, который заключается в одновременном извлечении ю сырья и выпуске тритерпеновых и флавоноидных препаратов, оптимизации экстрагеитов и параметров экстракции, разработке технологических регламентов, изучению химического состава и разработке методик анализа.

- Выделено 14 компонентов солодки и проведено химическое изучение их структуры с целью использования в аналитических и технологических исследованиях.

Предложена технология производства препарата ликвиритон на основе проликвиритона, при которой был оптимизирован экстр агент, позволяющий совместить полное и целенаправленное извлечение флавоноидоа, и сделан выбор технического решения стадии жидкофазной экстракции.

- Разработаны методики анализа флавоноидов и глицирризиновой кислоты в сырье солодки и препаратах.

- Предложена новая качественная реакция - кетальный тест для структурного анализа гликозидов, содержащих апиозу.

Практическая значимость. Разработан новый методологический подход к разработке комплексной технологии переработки корня солодки, основанный на химико-технологических и аналитических исследованиях, и позволяющий простым и рациональным способом получать и использовать все ее ценные компоненты.

- Предложенный аналитический подход обеспечен получением веществ - стандартов. -Разработан опытно-промышленный регламент на производство ликвиритона.

- Разработаны технические условия на проликвиритон.

- Откорректирована общая технологическая документация комплексной переработки корня солодки - предложены дополнения к регламентам на очищенный экстракт и глицирам.

- Предложенный методологический подход может быть использован при выборе технологических путей комплексной переработки других видов растительного сырья.

Положения, выдвигаемые на защиту: - новый методологический подход к разработке технологии комплексной переработки корня солодки;

- результаты химического изучения солодки;

- технология производства ликвиритона из проликвиритона;

- методики анализа флавоноидов и глицирризиновой кислоты в сырье солодки и препаратах.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации опубликованы в 3 научных работах, 1 регламенте, 1 технических условиях и доложены на двух российских конференциях.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 136 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы (глава 1), обсуждение результатов (главы 2-4), экспериментальную часть (главы 5,6) и выводы. В тексте имеется 20 таблиц, 4 схемы и 32 рисунка, список цитируемой литературы содержит 166 ссылок. В приложение вынесен разработанный проект ТУ на проликвиритон, титульные листы регламента и таблицы к обзору литературы,

В литературном обзоре систематизированы сведения по химическому изучению состава тритерпеноидов и фенольных веществ корней солодки, а также их практическому применению.

В главах 2-4 обсуждаются собственные результаты по выделению и структурной идентификации компонентов корня солодки, разработке комплексной технологии переработки солодки и технологического регламента производства ликвиритона, разработке методик анализа флавоноидов и глицирризиновой кислоты в сырье солодки и препаратах.

Экспериментальная часть изложена в двух главах, посвященных изучению индивидуальных веществ (глава 5), химико-технологическим и аналитическим исследованиям солодки (плава 6).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Выделение и структурная идентификация выделенных соединений

Из корней солодки и проликвиритона были выделены 14 индивидуальных веществ, которые приведены в таблице 1 и отнесены к пяти группам: флаваноны, халконы, изофлавоны, фенольные вещества и тритерпеноиды.

Для выделения веществ были использованы методы избирательной экстракции сырья

(экстрагенты этанол и вода) с последующей хроматографией экстрактов на полиамиде (этанол-вода), силихагеле (хлороформ-метанол), рехроматография на полиамиде, силихагеле, сефадексе Ш-20 и перекристаллизация.

Для установления строения выделенных веществ использовались качественные реакции, результаты химических превращений (ацетилирование, кислотный и ферментативный гидролиз), а также данные УФ-, ИК-, ЯМР-, масс-спектров и в некоторых случаях сравнение с достоверными образцами.

Таблица 1

Физико-химические константы выделенных веществ солодки

Соединение Состав м* Т.пл., °С ^Чпахз ИМ

Флавано ны

Ликвиритагенин (1) С15Н12О4 256 193-195 275,310

Ликвиритин (2) С21Н22О9 418 209-211 275,312

Флаванон-биозид (3) С26Н30О13 580 аморф. 275,312

Халконы

Изоликвиритягенин (4) С15Н12О4 256 201-204 255,370

Изоликвиритин (5) С21Н22О9 418 185-186 260,370

Изоглаброзид (6) СгвНзоОп 580 аморф. 240,370

Ликуразид (7) СгбНзоОи 580 150-151 245,370

Изофлавоны

Формононетин (8) С16И1203 268 257-265 260,3ООпл

Ононин (9) С22Н22О9 430 215-217 260,300пл

Фенольные вещества

Дезметилгентизин ПО) С13Н803 244 276-284 259,292

Фенил-янтарная к-та Щ) С10Н10О5 210 аморф. 260

Трнтерпеноиды

Глицирризиновая к-та (12) С42Н62О16 822 228-230(р) 249

ГСО глицирам (13) С42Н«М)15 839 230-230(р) 252

Глицирретовая к-ха (14) С3оН^04 470 292-295(р) 249

1.1. Ф л а в ан о н ы

Все флаваноны и халконы солодки относятся к весьма редкой группе веществ этих классов, не имеющей ОН-группы при С-5, и этим во многом объясняется необычность их химических свойств.

В ЯМР-спектрах веществ М. (рис. 1) ароматические протоны одинаковы и характерны для 7-замещенного цикла А и »-замещенного цикла В. О принадлежности к классу

флаванонов свидетельствует характер сигналов двух протонов при С-3 и аксиального протона Н-2. Таким образом, вещества КЗ относятся к классу флаванонов и содержат лишь два заместителя при С-7 и С-4'.

В спектре ЯМР вещества I (рис. 1) имеются синглетные сигналы двух ОН-групп, что подтверждается образованием диацетата.

Масс - спектр (рис. 2) показывает наличие молекулярного иона (га/г 256), соответ-Рис 2 Фсагменташя ликвтштигекина

-хх: -хог^ - ж

^•♦сн о *

А,+Н 137(100) м С70%) В5120 (40)

ствующего составу СцНцО^ соединения и фрагментов из циклов А (m/z 137) и В (m/z 120), характерных для флаванонов.

Таким образом, не вызывает сомнения, что соединение I имеет структуру лихвири-тигенина (7,4'-дигидроксифлаванона).

Хроматографическая подвижность, спектры ЯМР (рис. 4) и данные гидролиза свидетельствуют, что соединение 2 является глюкозидом, а вещество 3 - апиозилглюкозидом. Состав этих веществ подтвержден данными масс-спектров полевой десорбции (FD-MS).

Н-2 Н-1" Н-1"'

1.1 __I_1—J_I_I_i_I___I—J_

5,5 5,0 4,5ет

УФ-спектры ликвиритика (1) и сакуранина (2) в этаноле Рис. 4. Фрагменты спектров ЯМР и с добавлением ацетата натрия (1а и 2а) Ликвиритина (А) ифлаванон-биозида (Б)

Отнесение углеводной части к 4'-лоложению было сделано сравнением их УФ-спектров со спектром агликона ликвиритигенина Ц) в метаноле и с добавлением ацетата натрия (рис. 3). Выявлено, что во всех веществах N3 свободен гидроксил при С-7. Известно, что свободная 7-ОН группа в 5-дезоксифлаванонах вызьшает с NaOAc сдвиг основного пика (275 нм) на 60 нм. Во флаванонах, где 7-ОН группа замещена (например, сакуранин), свободная 4'-ОН группа не реагирует с NaOAc и УФ-спектр не отличается от исходного (рис. 3). Приведенные данные свидетельствуют, что соединение 2 является ликвиригином, а флаванон-биозид 3 не отличается по структуре от описанного в литературе для солодки уральской,

2 - Ликвиритин R = Glc _3 - Флаванон-биозид R = Glc-Api

1.2. Хал коны

ЯМР- и масс-спектр вещества 4 соответствуют составу и структуре 4,2',4'-три-гидроксихалкона (изоликвиритигенина).

.-О-Р

но^^^он^. 4. - Изоликвиритигенин Я = Н

5 - Изоликвиритин II = Ос б. - Изоглаброзид Я = Ис-Ар!

ТСХ и ЯМР свидетельствуют, что вещества 5, 6, 7 являются гликозидами, причем по данным гидролиза соединение 5 содержит глюкозу, а соединения б и 7 - глюкозу и апиозу. Состав этих веществ подтвержден данными ЛЭ-МВ. Вещество 5 было вдетифици-ровано как изоликвиритин, а вещество 6 как изоглаброзид. Следует отметить идентичность спектров ЯМР биозида 2 (рис. 5) и достоверного образца ликуразида

1.3. И з о флаво н ы Бесцветные кристаллические соедиения 8_ и 9. были отнесены к изофлавонам на основании УФ-, и масс-спектров. В ЯМР-спектрах имеется характерный для

изофлавонов синглет Н-2 (6 8,1), сигналы 7-замешенного цикла А и 4'-замещенного цикла В, а также синглет СНзО-группы. Вещество 8, дающее моноацетат при ацегилировании было идентично формононетину, я-с

8 - Формоноветян К = Н

9 - Ононин Я = Ос

ОСНз

Вещество 9 при гидролизе образует глюкозу и агликон формонетин. Для него возможна лишь структура 7-0-|МЭ-птакопиранозил-4'-метоксиизофлавона (ононин).

1.4. Фенольные вещества Вещества 10 и Д выделены в очень малых количествах и для них предложены вероятные структуры, которые согласуются со спектральными данными (МЭ и ЯМР), Полученные данные соответствуют структуре дезметилгентизина для соединения 10 и н-гидроксифенил-янтарной кислоты для Щ).

Вещество Ц весьма лабильно, дает малиново-красное оксрашивание с диазореакгивом, располагается с В* около 0,9 на бумажной хроматограмме, используемой в ФС 42-2425-86 "ликвиритон", поэтому может быть хорошим маркером в определении подлинности препарата.

1.5. Тритерпеноиды сн> ^соон

12 Глицирризиновая кислота Н

сн

13 Глицирам Я =

сн сн>

Рис. б

'пектр ^-ЯМР глицирама (13) в дейтеролирвдине

1МУ

и

НТ|Л ПТ ТЧГ> 6

Г

гги^чр » '' ' I ИТ! Г1 М Г? И I Г| м ГТТУТ»

г

" )| "II 1 РРМ

Протонные и углеродные ЯМР-спектрьг свидетельствуют о принадлежности соединений 12-14 к тригерпеноидам. Глицирризияовая кислота (12) при гидролизе образует глицир-ретовую кислоту (Д4) и 2 молекулы глюкуроновой кислоты.

В ПМР-спектре (рис. 6) сигналы аномериых протонов (5 5,0 и 5,3) в виде двух хорошо разрешенных дублетов с константой взаимодействия 7 Гц подтверждают Р-конфигурацию

гликозидных связей и Сг конформацию обоих й-глюкуроновых фрагментов глицирризиновой кислоты. В спектре ПМР хорошо видны синглеты 7-ми метальных групп (6 0,8-1,5), протона при двойной связи Н-12 (5 5,9) и ряд других сигналов.

С помощью спектров 13С-ЯМР было подтверждено 1-»2'-соединение двух молекул глюкуроновых кислот. Не было выявлено различий с литературными данными по характеристике сигналов агликона (14) - 18р-глицирретовой кислоты.

Глицирам (моноаммоний глицирризинат 13). Ранее было сделано отнесение аммонийной группы к карбоксилу С-30 глицирретовой кислоты, однако "С-ЯМР-спекгр позволяет отнести катион №Ц+ к карбоксилу глюкуроновой кислоты.

2.3. Кетальный тест в структурном анализе апиозидов

В ходе структурного анализа апиозип-глюкозидов была предложена качественная реакция - кетальный тест на наличие 2,3-цис-диольной группировки, позволяющий не только облегчить идентификацию апиозы, но и выбрать изомеры, имеющие цис-ориекгацию гидроксилов при Сг я Сз. Раствор ликуразида, содержащего апиозу, при добавлении подкисленного ацетона легко образует кеталь, более подвижный в условиях ТСХ, чем исходное вещество:

С1 О-Я п 0-Я

КОЛ ситроен, ^У но 6н

2. Технология комплексной переработки корня солодки

В последние годы заводы по переработке солодки оказались за рубежом, в связи с чем возникла задача - создание и внедрение рациональной комплексной технологии переработки корня солодки с разработкой нескольких лекарственных средств, связанных общей технологической цепочкой, представленной на схеме 1.

Схема 1 - комплексной переработки корня солодки

В большинстве известных технологических способов предлагается получение либо тритерпеноидов, либо флавоноидов. Поэтому целесообразным представлялся поиск технологической схемы одновременного получения этих двух групп соединений. В ходе решения этой задачи был найден экстрагент, позволивший совместить исчерпывающее извлечение из сырья гликозилированных тритерпеноидов и флавоноидов, а затем удалось, отдаляя нативную сумму флавоноидов, одновременно обогатить экстракт глицирризиновой кислотой.

2.1. Технология получения препарата ликвиритон Технология комплексной переработки солодки позволяет при производстве глицирама или очищенного экстракта одновременно получать порошкообразную субстанцию проликвиритона, содержащую около 20% флавоноидов (в ликвиритоне - около 55%). Фармакологические опыты показали отчетливое противоязвенное действие проликвиритона, сопоставимое с эффектом ликвиритона в соответствующих дозах.

Для получения ликвиритона из проликвиритона было опробовано несколько методов.

1) Перекристаллизация. Проликвиритон является легкоплавким, аморфным, водорастворимым суммарным продуктом и перекристаллизация или высаживание для него оказались совершенно непригодными.

2) Хроматография. Хорошие результаты получены при хроматографировании проликвиритона на полиамиде. Этот метод используется в известном производстве ликвиритона, но он включает отдельный регламент получения полиамидного сорбента, что значительно удорожает продукт. Другие сорбенты, как АЬ03, ($-циклодекстрин и силикагель были малоэффективны.

3) Экстракция. Экстракция порошка проликвиритона растворителями, смешивающимися с водой (спирт, ацетон, водный ацетон) была неэффективна: спирт практически не изменяет состав проликвиритона, а в ацетоне продукт растворяется очень мало. Долее наши усилия были сосредоточены на экстракции водного раствора проликвиритона

2.1.1. Выбор экстрагента в экстракции проликвиритона. Важным моментом явился подбор рабочей концентрации проликвиритона в воде. Раствор готовили в горячей воде (около 80 °С) непосредственно перед экстракцией, т.к. при стоянии даже в течение 1 ч из раствора с концентрацией 1:3 г/мл начинает выпадать смолистый осадок целевых веществ, а в более разбавленных растворах смола появляется сразу же. Наиболее устойчивыми являются растворы проликвиритона 1:1 и 1:2 г/мл.

Для извлечения флавоноидов го водного раствора проликвиритона были рассмотрены несколько растворителей: бутанол, этилацетат, их водные смеси. Из них лишь эгилацетат позволяет достигнуть 56% содержания флавоноидов, а бутанол - приблизиться к нему.

Форзкстракция хлороформом или

4 \\

Рис.7. УФ- спектры в 50 % спирте.

\ \ У 875 \ 296 316 \

петролейным эфиром практически не приводит к его очистке: в эти растворители переходит менее 1,5% экстрактивных веществ.

УФ-спекгры (рис. 7) свидетельствуют, что состав фсольных веществ в ходе

р пролихвиргона, 2 - Бутанольное извлечение ю проликвиртона, экстракции проликвиритона названны-

3 - Этиланетегное извлечение из проликвиртсна,

4 - Извлечение смесью бутанол-этилацетег-вода.

ми растворителями изменяется незна-

чительно, лишь в этил ацетатном извлечении заметны различия, что подтверждено также данными ВЭЖХ.

По данным ТСХ и ВЭЖХ водный раствор после 3 экстракций бутанолом не содержит флавоноидов, а после 5 экстракций этилацетатом их содержание все еще значительно. Поэтому для концентрирования флавоноидов эффективной является последовательная экстракция этилацетатом и бутанолом, и смешивание сухих остатков после упаривания экстрактов. Этот метод может быть рекомендован для производства.

Далее нами были изучены тонкости проведения технологического процесса экстракции для выборв технического решения.

2.1.2. Прогивоточная жидкофазная экстракция. При отработке стадии экстракции бутанолом в дискретном фракционном режиме было обнаружено, что содержание флавоноидов в экстрактах падает (I - 52%, П - 43%, Ш - 35%) и, хотя масса экстрактивных веществ увеличивается с увеличением числа экстракций, но извлекаемые сопутствующие

вещества снижают содержание флавоноидов в суммарном экстракте до 40 %.

Таблица 2

Экстракция водного раствора прояиквиритона_

Проликвиритон Полученная субстанция

масса %сод.. Условия масса % сод.. Выход от

техн.,г флавон экстракции техн..,г флавон теории,%

Экстоакиия бутанолом. насыщенным водой (противоток)

260,0 17,1 Раствор в воде 1:2 г/мл, 13 порций

(13*20г) по 40 мл, 9-кратная экстракция, слив

нижней фазы, 13*60 мл бутанола

Собрано экстрактов (сухой остаток):

4 пусковых 28,52 59,6 110,9

5 режимных 29,24 55,8 75,1

4 остановочных 7,20 51,9 24,6

Суммарно 13 экстрактов: 64,96 55,5 71,0

Экстракция этилацетатом. насыщенным водой (противоток)

84,0 22,4 Раствор в воде 1:4 г/мл, 12 порций

(12*7г) по 27 мл, 9-кратная экстракция, слив

нижней фазы, 12*27 мл этилацетата

Собрано суммарно 12 экстрактов (сухой остаток): 9,43 71,0 35,6

4-Коатная экстракция смесью бутанол-этилапетат-вода

5,0 22,4 Раствор в воде 50 мл, 4-кратная 8,7 57,7 91,6

экстракция смесью 4*60 мл

При противоточной жидкофазной экстракции флавоноидов та водного раствора про-ликвиритона использование бутанола, насыщенного водой, позволяет получать достаточно высокий выход продукта (табл. 2) с содержанием флавоноидов свыше 50 %. В этом методе экстракции бутанолом нами отрабатывались различные способы противотока (слив верхней или нижней фазы), соотношение фаз, кратность экстракций.

Процесс жидкофазной противоточной экстракции состоит из трех стадий: пусковой, рабочий и остановочный режим. Анализировались экстракты и рафинаты всех трех стадий процесса. В полунепрерывном противоточном режиме со сливом нижней фазы достаточно результативна 5-сгупенчатая экстракция (схема 2) на 3 аппаратах бутанолом, насыщенным водой, в соотношении водный растЕор - зкстрагент 1:1,5 (таб. 2). При этом в пусковых экстрактах содержание флавоноидов наиболее высокое. Следует отметить, что в выбранном режиме жидкофазной противоточной экстракции со сливом нижней фазы число ступеней экстракции "п " зависит от числа аппаратов (А): п = 2А-1, т.е. в 5 аппаратах п = 9, а в 3 аппаратах п= 5.

Схема 2

Противоточная экстракция на 3 аппаратах

=2

--1 И,

ЭЕг а*,© © *г «э-

4Ег ЗЕ3 В,

О

ы

1 3 _ 42, 23,

Ко Я *

@ »г 523 зг.

А

ч

в - эксгтр*гвих

К - экстракт

Н - рафиюг

К - раствор пролихаярк-гова

4Е1 гяг @

Ф я, я,-►

2Е3 (ЕГ) & Нг Л4 -

5Вг зг3 г.

. ^з гв1 ®

<25

*

1ч *

К)

Была опробована также лабораторная установка противоточной жидкофазной экстракции этилацетатом, насыщенным водой, взамен бутанола (таб. 2). Эффективность экстракции при этом снижается вдвое

(71,0%->35,6%) и в рафинате остаются наиболее ценные флаванон-биозиды. Не увеличивает эффективность экстракции этил-ацетатом и добавление 10% этанола.

51з

Э

гг

я

за

2.1.3. Фракционная экстракция, использованная в регламенте. Таким образом, этллацетат, как экстрагент не позволяет достичь поставленной цели, буганол приводит к желаемому результату, но в режиме трудоемкой противоточной жидкофазкой экстракции, а их смесь дает хорошие результаты в производстве ликвпритона. В таблице 2 приве-Схема 3

дены результаты фракционной 4-кратной экстракции смесью бутанол - згилацетат - вода. В этих опытах получены хорошие результаты (выход > 90%), что послужило основой регламента. Технологический процесс состоит из одной стадии "получение ликвири-тона", которая включает операции, показанные на схеме 3..

Выводы. Ликвнритон может быть получен из проликвири-тона несколькими методами:

1)хроматография на полиамиде,

2) последовательная экстракция эгилацетатом и бутанолом, 3) прогивоточная экстракция бутанолом, насыщенным водой, 4) экстракция смесью буганол-этил ацетат-вода.

Первые два способа весьма дорогостоящие, трудоемкая прогивоточная жидкофазная экстракция бутанолом может стать конкурентоспособной в непрерывном варианте. Для производства ликвиритона нами был выбран и отработан в виде регламента более дешевый (по трудозатратам) и простой в аппаратурном оформлении вариант четырехкратной экстракции смесью бутанол - этилацетат - вода. В целом предложенная комплексная технология переработки корня солодки позволяет простым и рациональным способом получать и использовать все ее ценные компоненты.

Технологическая схема производства ликвиритона

Шроликвиритон |-

[вода

¡Н-Бутанол

¡Вода очииенная|-

[эгшшцетат

н

|Вода очищенная^.

|Спирт

этиловыйI

ХП-х.1 | растворение проликвиритона

ТП-1.2 Экстракция флавоноидов

IV эк-т

1-1X1 эк-ты

ГП-1.3

Упаривание экстракта

]

ТП-1.41 Сушка и 1 | измельчание|

[ Готовый продукт ликвнриток

Рис. 8. УФ-спектры в 95 % спирте.

3. Аналитические исследования солодки 3.1. Подлинность сырья и флавоноидных препаратов

УФ-спектры проликвиритона и ликвиритона различаются лишь по интенсивности

поглощения и могут служить их качественной характеристикой (рис.7, 8). О многокомпонентном составе этих фенольных субстанций свидетельствуют хромато-граммы ТСХ и ВЭЖХ.

Было проведено сравнение образцов солодки голой и солодки

—- — —- — • ~ д»» та; гш

1 - Ликвиритон 2 - Ликвер1гшгенин, 3 - ГСО ликуразид, „<,¡5 методом тсх (рис 9) в 4 - ГСО ликуразид, 5 - ГСО глицираи УФ-свете 366 нм в солодке уральской, наряду с общими для обоих видов пятнами

флавоноидов, видны ярко-синие флуоресцирующие шггна сложных кумаринов и

куместанов с Иг 0,7-0,9. Их наличие может служить качественной реакцией подлинности

с. уральской. Диагностически»! компонентом с. голой является изофлаван глабридин.

Таблица 3

Величины Я, некоторых индивидуальных веществ

Вещество ТСХ БХ

свет видим УФ 254 ДСК №ОН

изоликвиритигенин (4) 0,9 желтый темный оранж. 0,05 ярко-желт.

ликвиритигенин (1) 0,8 - фиолет. желт. 0,28 ярко-желт.

ононин (9) 0,6 - фиолет. -

изоликвиритин (5) 0,5 желтый темный оранж.

флаванон-биозид (3) 0,5 - фиолет. желт. 0,60 желто-зел.

лмквиршин (2) 0,5 - фиолет. желт. 0,50 желто-зел.

ликуразид (7) 0,4 желтыи темный оранж. 0,25 оранжевый

фенилянтарная к-та (И) 0,3 - красный 0,90 с ДСК красный

ГСО глицирам (13) 0,1 - синий -

При изучении индивидуальных веществ (табл. 3) показано, что в этой же зоне располагаются флаваноновый и халконовый агляконы Ц) и (4). С диазореактивом (ДСК) они окрашиваются в желтый или оранжевый цвет, Практически невозможно на тонком слое отличить флаваноновый моногликозвд (2) и биозид (3), тогда как халконовые

аналоги (5) и (I) имеют желтую окраску и легко различаются по величине Изофлавон (9), как и флаваноны, является бесцветным веществом и определяется на хроматограмме в УФ-свете 254 нм. Одновременно былол проведено сравнение индивидуальных веществ методом круговой хроматографии на бумаге в 3% растворе ЫаС! - в условиях ФС 42-242586 "Ликвиритон".

На рисунке 9 видны различия между двумя видами солодки не только в верхней, но и в средней части пластинки: в солодке уральской доминирует пятно на уровне ликвиритина (Дг 0,5), а в солодке голой - желтое шггно на уровне ГСО ликуразида (Кг 0,4), что делает ее предпочтительным сырьем при получении стандартного образца.

Храматограмма ТСХ корней солодки

1 - солодка уральская

2 - солодка голая

3 - ГСОликуразид

4 - ГСОглицирам Пластинки "силуфол УФ 254"

хлороформ-метанол-вода 61:32:7 УФ 254 и 3 66 нм, ДСК Рис. 9

I I I I 1 2 3 4

3.2. Методы количественной оценки глицнрризииовой кислоты в флавоноидов ТСХ-анализ ГК а флавоноидов. Для контроля технологического процесса и количественных измерений предложено использовать ТСХ на силуфолегм в системе ио-РЮН-25%№ШН(7:3) или ВиОН-ЕЮН-1н Ш4ОН (6:3:3). Проявление - в УФ-свете 254 нм; глицирризиновая кислота - пятно с голубой флуоресценцией на уровне ГСО глицирама 0,15). Флавокоиды - желтые пятна в видимом свете (Яг 0.5, 0.7). Полосы глицирри-зиновой кислоты н ГСО глицирама вырезают, элюируют и спекгрофотометрируют при 252 нм.

Для анализа флавоноидов в сырье, проликвиритоне и ликвиритоне разработан метод

0.9 0

0.8 0

0.2 0

Об

05 0

0.4 0

0.3

0.2 0

0.1 §

§

прямого спектрофогометрнрования с использованием стандартного образца ликуразида или кверцетина.

ВЭЖХ-авализ ГК и флавоноидов (нзократическнн режим). Для постадийного контроля в комплексной технологии переработки солодки был проведен подбор условий для одновременного ВЭЖХ-анализа флавоноидов и глицирризиновой кислоты в различных субстанциях солодки. Условия ВЭЖХ-анализа приведены на рис. 10 и И, процентное содержание определено по площадям пиков и приведено в таблице 4.

Таблица 4

Количественная оценка субстанций солодки методом ВЭЖХ

Содержание, % (по площади пиков)

Субстанция 18 Р-ПК флавоноиды

I. Сухой экстракт солодки 25-30% 40-50%

2. Обогащенный экстракт солодки 45-55 % 5-10 %

3. Техническая глицирризиновая к-га 64-78 % 2-3 %

4. Глицирам 65-77% -

5. Проликвиритон 3-5 % 78-85 %

Эти даные позволяют на качественном уровне оценить динамику изменения содержания ГК и флавоноидов в различных субстанциях, а замеры с использованием ГСО глицирама делают возможным его количественное определение. В ВИЛАРе разработан способ получения ГСО глицирама с чистотой (ВЭЖХ) не менее 97 %.

Глицирризиновая кислота относится к тритерпеноидам, но имеет довольно интенсивный максимум поглощения при длине волны 252 ни (Е|* 140) и ее легко дегек-

Рис. 10. Хроматограмма ВЭЖХ ГСО глицирама

Хроматограф СпЬоп, колонка 3,9*300мм, Эерагоп ввХОв, 8мкм, подвижная фаза МеСМ-3%АсОН (35:65), скорость элюирования 1 мл мин. УФ-детектор 252 нм.

11 1 1 1 I ■ 1 '' I ■' 1 ■ I ■ 1 ■ ■ I " ' 11 • 1 1 •

<м 5.|| 10.11 15.я г*.и !•

Рис. 11.

Хроматограмма ВЭЖХ экстракта солодки

Хроматограф Du Pont, колонка 4,6 * 250 мм, Zorbax ODS, 5мкм, подвижная фаза МеОН-2.5%АсОН (58:42), температура колонки 55°С, скорость элюирования 1 мл мин. УФ-детектор 252 нм.

тируют в хроматографе в изократическом режиме элюирования в условиях, приведенных на рис. 10 или на рис. 11.

Стандартный образец глицирама имеет несущественные примеси и основной пик 18р-ГК составляет не менее 97 % (рис. 10). Субстанция препарата глицирам включает до 15 % 18-элимера (18а-ПС) и других изомеров ГК, поэтому основной пик 18^-ГК составляет лишь 70 %. В этих же условиях анализируют и другие тритерпеновые препараты солодки, такие как густой, сухой и обогащенный экстракты. При этом в экстрактах определяют также сумму флавоноидов, которая элюируется в первых же фракциях (Rt менее 6 мин) - рис. 11.

Попутно отметим, что метод ТСХ не позволяет обнаруживать различия между субстанцией и стандартом глицирама, которые выявляет ВЭЖХ, - на тонком слое оба дают одно пятно.

ВЭЖХ-аиализ флавоноидов (линейный градиент). Изучены методом ВЭЖХ также флавоноидные препараты проликвиритон и ликвиритон, которые представляют собой многокомпонентные смеси. Их состав бьш изучен методом ВЭЖХ с линейным градиентом растворителя при элюировании (см. рис. 12). Флавоноиды обладают интенсивным поглощением в УФ-свеге, причем флаваноны имеют максимум поглощения при 275 нм (рис. 12А), а халконы • при 375 нм (рис. 12Б).

Таким образом, показана возможность использования метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для качественной и количественной оценки препаратов корня солодки, в том числе их компонентного состава в условиях обращенно-фазового процесса с изократическим и линейно-градиентным режимом подачи растворителя.

3Î5 ш Ликвирчтчн « С Ss яас 7 Я Mai» ® 1 275 ш jïKieypa зил iiLJLJJL.JHlL___1

i JhtKBHpHWat i.l 1. .11.1. i Лыхура в ma <ж> 375 им 1 I il l\

Рис. 12. Хроматограмма ВЭЖХ препарата яшвиритон Хроматограф Du Pont, колонка 4,6*250 мм, Zorbax ODS, 5мкм, подвижная фаза - градиент от 20 до 40 % МеОН в 1,5 % АсОН за 60 мин, температура колонки 45 °С, скорость элюирования 1 мл / мин. УФ-детектор 275 нм (А) и 375 нм (Б).

3.3. Методы анализа флавоноидов в сырье солодки

В отечественной нормативно-технической документации отсутствуют методики анализа флавоноидов в сырье солодки. Нами проведена отработка методики, пригодной

Таблица 5

Удельные коэффициенты поглогцения

Стандартный образец Молекулярная масса Е}* при длинах волн, нм

275 295 315 375

ГСО ликуразид 550 115 200 200 600

ГСО кверцетин 302 380 260 260 780

Ликвиритин 418 320 160 160 -

Ликвиритигенин 256 430 170 170 -

для анализа глицирризиновой кислоты и флавоноидов, причем было показано что полнота извлечения достигается при однократной экстракции сырья 50 % спиртом в соотношении 1:100. Принципиальное значение имеет выбор стандартного образца.

Для этой цели нами был опробован ряд соединений, характеристика которых приведена в таблице 5 и на рисунке 8.

Если учитывать возможную унификацию методов анализа флавоноидов в сырье, экстрактах и субстанциях (см. табл. 6), то выбор в качестве стандарта флаванонов (ликвиритигеюш, ликвиригин) нецелесообразен (хотя они имеют максимум поглощения при 275 им, как и субстанции флавоноидов), т.к. в данную часть УФ-спектров экстрактов сырья вносит заметный вклад поглощение глицирризиновой кислоты (см. рис. 8). На поглощение при 295 и 315 нм она не оказывает влияние, поэтому возможно использование как ГСО кверцетина (315 нм), так и ликуразида (295 и 375 нм).

Таблица 6

Содержание флавоноидов в различных субстанциях в зависимости от стандарта

Субстанция Содержание шавоноидов, %

кверцетин ликуразид ликвиригин ликвиритигенин

Пролшсвиригон Ликвиритон Сухой экстракт Сырье солодки 21,4 53,8 18,7 5,7 22,0 58,9 20,0 6,0 25,5 64.5 23.6 6,5 19,0 48,0 17,6 5,5

Ликуразид-стандарт малодоступен, его растворы нестабильны и используются в анализе ликвиритона только для одноразового построения калибровочного графика. Напротив, ГСО кверцетин легко доступен, дешев, широко применяется для стандартизации лекарственного растительного сырья и препаратов, его растворы стабильны.

Нами проведены все необходимые эксперименты с использованием ГСО кверцетина. По данной методике был проанализирован один образец сырья солодки в 9 независимых повторностях. Результаты статистической обработки проведенных опытов представлены

Таблица 7

Метрологические характеристики методики

f Х,% S Р,% tff.fi ДХ Е, %

9 5,5 0,17 95 2,31 ±0,35 ±7,3

в таблице 7, из которой видно, что ошибка единичного определения методики составила ±7,3%.

Отсутствие систематической ошибки было доказано опытами с добавками ГСО кверцетина к навеске сырья и в экстракт. По предлагаемой методике количественного определения флавоноидов проведен анализ ряда образцов корня солодки, в которых содержание флавоноидов находилось в пределах от 4,6 до 6,7 % (см. табл.6). Полученные данные использовались при изучении сырья в ходе хранения.

Для анализа флавоноидов в субстанциях проликвиритона и ликвиритона также использовался метод прямого спектрофотометрирования с применением ГСО кверцетина или ликуразида.

ВЫВОДЫ

1. Разработана комплексная технология переработки корня солодки.

2. Предложен новый методологический подход к разработке технологии, учитывающий химический состав изучаемого лекарственного растительного сырья. На основании такого подхода возможны и дальнейшие научные разработки в области производства лекарственных средств из растений.

3. Из корня солодки и фенольных препаратов были выделены 14 соединений и проведена их структурная идентификация. Выделенные соединения отнесены к флаванонам, халконам, гаофлавонам, другим фенольным веществам и тригерпеноидам.

4. Были идентифицированы: ликвиритигенин, ликвиритин, флаванон-биозид, изоликвиритигенин, изоликвиритин, изоглаброзид, ликуразид, формононетин, ононин, дезметилгентизин, фенилянтарная кислота, глицирризиновая кислота и ее производные -глицирретовая кислота и глицирам.

Для установления строения выделенных веществ использовались химические превращения (ацетилирование, кислотный и ферментативный гидролиз) и данные УФ-, ИК-, 'Н-ЯМР-, "С-ЯМР-, масс-спектров, ТСХ и ВЭЖХ. Предложена новая качественная реакция - кетальный тест для структурного анализа гликозидов, содержащих апиозу.

5. Разработаны современные методики качественного и количественного определения флавоноидов и глицирризиновой кислоты с использованием стандартных образцов глицирама, ликуразида, ликвиритина и кверцетина - для химической стандартизации сырья солодки и препаратов ликвиригон и проликвиригон.

6. Разработаны технические условия на проликвиритон.

7. В рамках разработки комплексной технологии переработки корня солодки и одновременного выпуска трнгерпеновых и флавоноидных препаратов предложена технология производства ликвиритона из проликвиритона.

8. Для оптимизации технологии и параметров экстракции был подобран экстр агент, позволяющий совместить полное и целенаправленное извлечение флавоноидов, и сделан выбор технического решения стадии жидкофазной экстракции.

9. Разработан опытно-промышленный регламент на производство ликвиритона и откорректирована общая технологическая документация комплексной переработки корня солодки.

Основное содержание диссертации опубликовано в работах:

1. Солодка: проблемы рационального использования сырья. / В.А.Быков, Г.Г.Запесочная, ВАКуркин, Е.В.Авдеева, Н.СДыбулько, Н.Е.Бибикова. Н Научно-практическая конференция "Современное состояние и перспективы научных исследований в области фармации". Тезисы докладов, Самара, 1996. С. 113-114.

2. Фармакогностический мониторинг - основа контроля качества сырья и фитопрепаратов. / В.А.Быков, Г.Г.Запесочная, В.А.Куркин, Е.В.Авдеева, Н.Е.Бибикова. // V Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". Тезисы докладов, Москва, 1998. C.64S-646.

3. ВЭЖХ в анализе сырья и препаратов солодки - Glycyrrhiza L. / Г.Г.Запесочная, ВАКуркин, САПинеев, Н.Е.Бибикова, А.Б.Лапин // Научно-практическая конференция "Современные тенденции развития фармации". Тезисы докладов, Самара, 1999. С. 80-85.