Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Кроветворные и стромальные клетки-предшественники после трансплантации костного мозга у больных гемобластозами

6 Од 3 ИЮЛ 1997

На правах рукописи

Момотгок Кира Сергеевна

Кроветворные и стромальпые клетки-предшественники после трансплантации костного мозга у больных гемобластозами

14.00.29 - Гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1997

Работа выполнена в Гематологическом научном центре РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор В.Г. Савченко

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Л.Г.Ковалева доктор медицинских наук, профессор А.И.Колесникова

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский центр передовых медицинских технологий.

Защита состоится "_"_1997г. в_час.

на заседании диссертационного Совета Д 001.45.01 в Гематологическом научном центре РАМН (Москва, 125167, Новозыковский проезд, д.4а)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РАМН

Автореферат разослан "_"_1997г.

Ученый секретарь диссертацинного Совета кандидат биологических наук

ВД.Реук

Актуальность проблемы.

Трансплантация костного мозга в течении последних лет стала одним из ведущих методов терапии гемобластозов, солидных опухоей, ряда наследственные заболевания, таких как талассемии и болезни накопления. Доказана высокая эффективность миелотрансплантации в терапии больных гемобластозами, однако серьезной проблемой остается легальность в раннем постгрансплантационном периоде, развитие рецидивов в различные сроки трансплантации костного мозга ( ТКМ ). Недостаточно изучена динамика восстановления кроветворения в течении длительного времени после трансплантации. До сих пор не выяснены причины и механизмы нарушения функции трансплантата при развитии вторичной болезни или рецидива лейкоза.

Выяснение факторов, влияющих на сроки восстановления кроветворения, представляет значительный интерес, в связи с тем, что одной из основных причин ранней летальности в посттрансплантационном периоде являются инфекционные осложнения, в генезе которых немаловажную роль играет длительность периода цитопении.

Одной из возможных причин развития рецидива лейкоза в ранние сроки после ТКМ является как неполная эрадикация лейкозного клона к началу предтрансплантационного кондиционирования, оказывающее влияние на течение пост-трансплантационного периода как при аллогенной, так и при аутологичной трансплантации, так и присутствие клеток остаточной лейкознй популяции в аутологичном костном мозге. Критерии ремиссии, основывающиеся на морфологических исследованиях костного мозга с учетом данных гемограмм и клинических проявлениях заболевания, очевидно в настоящее время недостаточны для оценки состояния кроветворения.

Эффект режимов предтрансплантационного кондиционирования, включающих циклофосфан и тотальное облучение тела или циклофосфан и миелосан, считается достаточным для уничтожения остаточных клеток лейкозной популяции и освобождения костномозговых ниш для последующей репопуляции клетками миелотрансплзнтата Высокодозная химио- или химиорадиотерапия обеспечивает также иммуносупрессию, необходимую для уменьшения риска отторжения трансплантата. Вместе с тем, повреждающее

действие предтрансплантационной подготовки на костный мозг проявляется не только на уровне гемопоэтических, но и на уровне стромальных предшественников, что может оказывать отрицательное действие на приживление и функционирование трансплантата.

Таким образом, актуальность работы определяется как возможностью более полного понимания характера и закономерностей восстановления гемопоэза в посттрансплантационном периоде, так и выделением группы больных с повышенным риском развития рецидива лейкоза. Исследования, касающиеся повреждающего действия режимов кондиционирования на стромальное микроокружение, могут способствовать выяснению причин нарушения функции трансплантата в различные сроки после ТКМ.

Цель работы: оценить повреждающее воздействие различных режимов предтрансплантационной подготовки на стромальное микроокружение и проследить динамику восстановления кроветворения после трансплантации костного мозга.

Задачи исследования.

1. исследовать интенсивность повреждающего действия различных режимов кондиционирования на стромальное микроокружение на примере колониеобразующих единиц фибробластов ( КОЕ-Ф) костного мозга.

2. сравнить изменение содержания КОЕ-Ф в костном мозге после применения высокодозной химио- и химиорадиоподготовки.

3. оценить факторы, влияющие на длительность посттрансплантационной цитопении на основании исследования цитологических характеристик миелотрансплантата и течения раннего поспрансплпнтпционного периода.

4. изучить особенности восстановления кроветворения на уровне коммитированных клеток-предшественников костного мозга после аллогенной и аутологичной трансплантации костного мозга у пациентов с гемобластозами. с

5. определить факторы, предшествующие развитию рецидива заболевания в посттрансплантационном периоде.

Научная новизна.

В настоящей работе выявлены особенности восстановления кроветворения у реципиентов костного мозга в течение 2 лет после трансплантации костного

мозга. Установлены признаки, связанные с развитием рецидива лейкоза в ранние и отдаленные сроки после ТКМ, определены изменения гемопоэза, возникающие при развитии хронической вторичной болезни. Впервые в отечественной гематологии выявлены повреждения кроветворного микроокружения, возникающие под действием высоких доз цитостатиков и облучения, используемых в предтрансплантациоиной подготовке. В течение года прослежена динамика числа предшественников фибробластлв костного мозга. Также впервые определено влияние развития иммунологического конфликта на клоногенную активность фибробластов в системе in vitro.

Научно-практическая ценность работы.

В результате исследований, выполнявшихся в течении 5 лет в отделении химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга ГНЦ РАМН с участием лаборатории физиологии кроветворения и ряда других подразделений, в процессе наблюдения за 35 пациентами с различными гемобластозами, получены следующие практически важные результаты:

Определено необходимое для восстановления кроветворения после ТКМ количество миелокариоцитов, мононуклеаров, и кроветворных гранулоцитарно-моноцитарных ( КОЕ-ГМ ) и эритроидных бурстобразующих ( БОЕ-Э ) клеток-предшественников в миелотрансплантате,. Установлено отсутствие связи продолжительности посттрансплантационной цитопении и содержания в миелотрансплантате миелокариоцитов, мононуклеаров и кроветворных предшественников. Вместе с тем обнаружено статистически достоверное уменьшение периода посттрансплантационного агранулоцитоза при переливании более 4,1 х 104/кг КОЕ-ГМ. Длительность предшествующей терапии, вариант гемобластоза, присоединение в раннем постгрансплантационном периоде инфекционных осложнений и развитие иммунологического конфликта также не влияло на сроки восстановления нормального состава периферической крови.

На основании исследования содержания гранулоцитарно-моноцитарных колониеобразующих клеток в костном мозге до начала кондиционирования и особенностей восстановления кроветворения в посттрансплантационном периоде выявлены признаки, характерные для пациентов с высоким риском

развития рецидива лейкоза. Установлено, что при бессобытийном течении постгрансплантационного периода восстановление клоногенного состава костного мозга происходит в течении 24 - 36 недель после ТКМ. Развитие вторичной болезни II- III ст. тяжести приводит к резкому снижению числа колониеобразующих единиц гранулоцитов и моноцитов в костном мозге.

Проведен сравнительный анализ различных режимов предтрансплантационной подготовки по степени их повреждающего действия на стромальные предшественники костного мозга и оценена динамика числа КОЕ-Ф после лучевого и цитостатического воздействия.

Оценено влияние присоединения посттрансплантационного иммунологического конфликта на колониеобразующую способность предшественников фибробластов в культуре костного мозга.

Не было обнаружено зависимости между восстановлением числа КОЕ-ГМ, свидетельствующим о восстановлении нормального гемопоэза в посттрансплантационном периоде и изменением числа КОЕ-Ф, возникающим под действием высокодозной предтрансплантационной подготовки, что, очевидно, может свидетельствовать о большем значении в поддержании гемопоэза других клеточных компонентов микроокружения.

Внедение в практику

Меток культивирования in vitro гранулоцитарно-моноцитарных и фибробластных предшественников костного мозга в течение 6 лет используется в работе отделения терапии гемобластозов и трансплантации костного мозга ГНЦ РАМН.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 3 работы в отечественных и зарубежных изданиях.

Апробация диссертации. Основные положения диссертации изложены на Международных школах гематологов в г. Москве - июнь 1992г, январь 1993г, январь 1996г, в г. Гомеле -июнь 1995г, июнь 1996г, Российском научном симпозиуме " Экологические факторы и кроветворение " в Москве 1992г, Международном симпозиуме по

острым лейкозам в г. Мюнстере, ФРГ, февраль 1994г, Международном симпозиуме по острым лейкозам в г. Вильседе, ФРГ, июнь 1996г.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 100 страницах текста , состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 19 отечественных и 234 зарубежных источника литературы. В работе 18 таблиц, 24 рисунка.

Диссертация выполнена в отделении химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга ( зав. - доктор медицинских наук, профессор В.Г.Савченко) ГНЦ РАМН ( директор - академик АМН А.И.Воробьев).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬПЫХ

В клинике химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга Гематологического Научного центра РАМН наблюдались 35 пациентов с гемобластозами, хоторым в 1991 - 1994 г. была выполнена миелотрансплантация. Среди больных было 25 мужчин и 10 женщин в возрасте от 15 до 44 лег. Из 25 пациентов с острыми лейкозами 16 страдали острыми нелимфобластными лейкозами ( ОНЛЛ ), 7 - острым лимфобластным и 2 -недифференцируемым лейкозом. 7 пациентам ТКМ произведена по поводу хронического миелолейкоза, 2 - лимфобластной лимфосаркомы и 1 -пароксизмальной ночной гемоглобинурии. Продолжительность заболевания не превышала 30 месяцев. Всем пациентам проводилась специфическая, но не стандартизованная терапия. К моменту ТКМ 20 больных с ОЛ был в фазе первой полной ремиссии, 1 - 2-й полной ремиссии, 3 - в неполной ремиссии и 1 в рецидиве, рефрактерном к химиотерапии.

26 пациентам произведена аллогенная трансплантация костного мозга, 4 -сингенная ( одному больному дважды от одного донора ), 5 - аутологичная. В предтрансплантационной подготовке использовались 2 режима кондиционирования : миелосан 4 мг/кг. с -7 по -4 день и циклофосфан ( ЦФ ) 60 мг/кг. в -3 и -2 днн - у 21 пациента; и циклофосфан 60 мг/кг. в -7 и -6 дни и гиперфракционированное тотальное облучение тела ( ТОТ ) 2 х 2 Су с -4 по -2

дни - у 14 больных. Повторная трансплантация миелосупрессивной подготовки.

Распределение больных в зависимости от

проводилась без Таблица 1

Вид ТКМ число больных диагноз режим подготовки

онлл олл хмл лса пнг аа ЦФ + МИЕЛ ЦФ + тот

аллогенная 26 12 8 5 1 - 17 9

сингенная 5 - - 2 1 2 3 1

аутологичная 5 1 1 - - - 1 4

всего 36 16 9 7 2 2 21* 14

Основными осложнениями в посттрансплантационном периоде были присоединение инфекционных осложнений, несостоятельность трансплантата, развитие раннего рецидива лейкоза и вторичной болезни.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КОСТНОГО МОЗГА IN VITRO

В работе основаны на клональные методы исследования гранулоцитарно-

макрофагальных, эритроидных и фибробластных клеток-предшественников в

культурах костного мозга in vitro. Пункции костного мозга производили перед

началом подготовки, во время эксфузии костного мозга, на 3 и 4 неделе, 3, 6, 9 и

12 месяце после миелотрансплантации.

Оценку фибробластных колоний проводили в монослойных культурах по

методу, разработанному в лаборатории А.Я.Фриденштейна в модификации

Л.П.Герасимовой и др.

Гранулоцитарные предшественники оценивали по методу Pike и Robinson

( 1970 ) в модификации Л.П.Герасимовой и С.И.Шерешкова. Мононуклеарнуто

фракцию клеткок костного мозга после разделения в градиенте плотности

фикола культивировали в двуслойных агаровых культурах, где в качестве

колониестимулируюшего фактора использовали фидер из лейкоцитов

периферической крови донора. В качестве культуральной среды использовали

модифицированную среду Маккоя.

После 9-10 дневного инкубирования при 37° С, в условиях абсолютной влажности и 5% СОг в воздухе, культуры подсчитывали, принимая за колонию клеточные агрегаты, содержащие более 50 клеток; скопления менее 50 клеток считали кластерами. Эффективность клонирования оценивали по относительному ( на 105 клеток ) и абсолютному ( в мл костного мозга ) количеству.

Эритроидные предшественники оценивали в клоногенных культурах в метилцеллюлозе по методу Iscove ( 1974 ). Подсчет бурстов проводили в инвертированном микроскопе на 14 сутки культивирования. За один бурст принимали агрегат, состоящий из 50 и более клеток или из 3 и более колоний.

Всего в динамике было оценено 135 культур гранулоцитарных, 100 -фибробластных и 19 - эритроидных предшественников. Для получения контрольных значений содержания в костном мозге фибробластных предшественников обследовано 20 и гранулоцитарных - 28 здоровых доноров.

Статистическая обработка полученных данных выполнена с помощью пакета компьютерных программ SAS ( Statistical Analysis System Institute, USA ). Оценка различий между группами осуществлялась с использованием методов описательной статистики и дисперсионного анализа.

Исследования кроветворных и стромальных предшественников проводились в лаборатории физиологии кроветворения ГНЦ РАМН ( зав. проф. И.Л. Чертков ) совместно с к.б.н. Л.П.Герасимовой и к.б.н. Т.Е.Манаковой.

Стандартный комплекс исследований периферической крови и пунктатов костного мозга проводился в клинико-диагностической лаборатории ГНЦ ( зав. Л.Ю.Тихонова).

Оценка приживления костного мозга по содержанию эритроцитов донорского фенотипа в периферической крови реципиентов проводилась в лаборатории иммуногематологии ГНЦ РАМН к.м.н. Л.П.Порешиной (руководитель лаборатории акад. Е.А.Зотиков).

Статистическая обработка полученных данных выполнена в лаборатории биомедицинской статистики ГНЦ с.н.с.Е.Р.Масловой ( руководитель лаборатории к. ф-м. н. С.М.Куликов ).

РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

ДЕЙСТВИЕ РАЗЛИЧНЫХ РЕЖИМОВ КОНДИЦИОНИРОВАНИЯ НА СТРОМАЛЬНЫЕ ПРЕДШЕСТВЕННИКИ.

Действия применяемых в нашей клинике режимов кондиционирования на стромальное микроокружение оценивалось по изменению числа фибробласгных предшественников в костном мозге. Критериями разделения больных на группы являлись диагноз и схема предтрансплантационной подготовки. Тип произведенной ТКМ при формировании групп не учитывался, так как доказано, что кроветворное микроокружение не трансплантируется и репарация повреждений происходит только за счет клеток реципиента.

За контрольные были приняты значения КОЕ-Ф, полученные при обследовании 20 доноров и составившие 23,3 ± 6,3 на 105 эксплантированных в культуру клеток костного мозга.

Исследовали костный мозг 19 пациентов, 15 из которых перенесли ашюгенную, 2 - сингенную и 3 - аутологичную ТКМ. 10 больных страдали ОМЛ, 5 - ОЛЛ и 4 - ХМЛ. К моменту начала подготовки все пациенты с острыми лейкозами находились в состоянии полной ремиссии, ХМЛ - в фазе акселерации. Терапия у больных ОМЛ проводилась цитозаром и рубомицином по стандартной программе. Пациентам с ОЛЛ проводилась специфическая, но не стандартизованная терапия. Все больные ХМЛ до начала подготовки получали миелосан или в виде монотерапии, или в сочетании с гидроксимочевиной.

Таблица 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ_

Диагноз Число ТипТКМ Терапия Подготовка

больных алло синг ауто (мес) ЦФ+ТОТ ЦФ+Миел

ОМЛ 10 8 - 2 7-13 5 5

ОЛЛ 5 4 - 1 8-29 - 5

ХМЛ 4 2 2 - 8-30 - 4

Химиорадиоподготовка ( циклофосфан и ТОТ ) была использована у 5 пациентов с ОМЛ. Все больные ОЛЛ, ХМЛ и 5 - ОМЛ в качестве кондиционирования получили циклофосфан и миелосан.

Перед началом химиорадиоподготовки в группе больных ОМЛ уровень КОЕ-Ф был ниже контрольного, в среднем 6,7 ± 4,7 на 103 миелокариоцитов: от отсутствовия колониеобразования в культуре, до нормальных значений.. К 6-му месяцу наблюдения еотмечалось увеличение количества КОЕ-Ф в костном мозге по сравнению с исходными данными, однако остававшееся на крайне низком уровне. Уменьшение числа КОЕ-Ф в группе больных с длительной ремиссией к 36 неделе после ТКМ по времени совпадало с развитием ХВБ у двух пациентов. Развитие рецидива лейкоза у 2х пациентов сопровождалось уменьшением колониеобразования КОЕ-Ф в культуре ( рис. 1).

Рисунок 1

Динамика числа КОЕ-Ф у больных ОМЛ

при разном течении посттрансплантационного периода

число КОЕ-Ф на 10 клеток

14 г щремиссия

12 Г ГП арецидив

10 8 6 4 2 0

-

«Вд Ш вд йи

до 3 4 12 24 36 время после трансплантации (недели)

В другой группе больных ОМЛ в качестве подготовительного режима использовалось сочетание миелосана и циклофосфана. Исходный уровень КОЕ-Ф у этих пациентов составлял 16,8 ± 2,8 на 105 ядросодержащих клеток, практически не отличаясь от контрольного. Предтрансплантационный уровень КОЕ-Ф у больных ОМЛ не влиял на выбор режима кондиционирования. Снижение числа КОЕ-Ф в костном мозге происходило к 4й неделе после ТКМ ( рис. 2 ). В течении года после применения высокодозной химиотерапии тенденции к восстановлению числа КОЕ-Ф в костном мозге не наблюдалось, в отличие от изменений происходивших после химиорадиоподготовки.

Рисунок 2

Динамика числа КОЕ-Ф у больных ОМЛ в зависимости от режима кондиционирования

число КОЕ-Ф на 105 клеток ,

— ел ЦФ + Миел

■ ЦФ + ТОТ

до 3 4 12 24 36 время после трансплантации (недели)

Нами отмечены различия в динамике восстановления числа КОЕ-Ф в костном мозге больных с различными вариантами гемобластозов ( рис 3 ). До начала подготовки к ТКМ количество КОЕ-Ф в костном мозге больных ОЛЛ было 5,1 ± 2,7, ХМЛ -4,9 ± 2,7 на 103 экашантированных в культуру клеток. Исходный уровень КОЕ-Ф у больных ОМЛ не отличался от контрольного.

Рисунок 3

Дциамика числа КОБ-Фу бш!Ы1ьк лактауд! при режиме кэд/д щиониршаши ЦФ+Миьи

число КОЕ-Ф на 10 клеток 2

1,5

0,5 О

Дзное

тош 5 ОМЛ

ПХМЛ

_ен

цд,

я

до 3 4 12 24 36

время после трансплантации (недели)

1

У пациентов ОМЛ и ОЛЛ с 3 - 4 недели после высокодозной химиотерапии фнбробластные предшественники в костном мозге определялись на низком уровне, без тенденции к восстановлению их числа к 36й неделе после ТКМ. У пациентов с ХМЛ с одной стороны наиболее выражено снижение предтрансплантационного числа КОЕ-Ф, с другой - даже в период максимального снижения числа фибробластных предшественников - к 12 - 20 неделе после ТКМ, сохраняется колониеобразование КОЕ-Ф в культурах.

Все больные ХМЛ (рис 4 ) получали миелосан в течении 6 - 30 месяцев или в виде монотерапии, или в сочетании с гидроксимочевиной. Зависимости исходного уровня КОЕ-Ф и длительности терапии, а, соответственно, и дозы полученного в течении предтрансплантационного периода миелосана выявлено не было. Вместе с тем по изменению числа КОЕ-Ф в поспрансплантационном периоде обнаруживались закономерности, связанные с длительностью предтрансплантационного лечения. К 4й неделе после ТКМ наименее выраженное снижение числа КОЕ-Ф ( до 44% от исходного ) произошло у пациента, получавшего миелосан в течении 10 месяцев, при длительности терапии миелосаном 7 месяцев содержания КОЕ-Ф в костном мозге составило до 9% предтрансплантационного, а наиболее высоким уровень КОЕ-Ф оказался у пациента, получавшего миелосан в течении 30 месяцев.

Рисунок 4

Динамика числа КОЕ-Ф у больных ХМЛ при режиме кондиционирования ЦФ + Миел

число КОЕ-Ф на 10^ клеток 10

к»д Д

вд

□ П1

а П 2 а ПЗ

.НД 1ЦсЛ]

до 4 12 24

время после трансплантации (недели)

Ш.

36

У больных ХМЛ к 36 неделе после ТКМ отмечено восстановление содержание КОЕ-Ф до предтрансштнтационного уровня в 2х случаях. Можно предположить, что особенности повреждающего воздействия химиоподготовки у пациентов с хроническим миелолейкозом связаны с длительной предшествующей терапией миелосаном, сопровождающейся, по-ввдимому, изменением популяционного состава фибробластных предшественников.

Таким образом на основании проведенного исследования нами были выявлены следующие закономерности: режимы предтрансплантационного кондиционирования, включающие высокие дозы циклофосфана, миелосана и тотальное облучение тела, оказывают выраженное токсическое действие на жлетки-предшественники фибробластов костного мозга, проявляющееся практически сразу после воздействия с последующим восстановлением числа КОЕ-Ф до исходного уровня по меньшей мере в течении 12 - 16 недель. Повреждающее действие высоких доз миелосана характеризуется более поздним, по сравнению с тотальным облучением тела, уменьшением числа КОЕ-Ф костного мозга, проявляющимся к 4й неделе после трансплантации и отсутствием признаков восстановления колониеобразования фибробластных предшественников костного мозга в течении Збти недель. Развитие в посттрансплантационном периоде хронической вторичной болезни или рецидива лейкоза сопровождается уменьшением эффективности колониеобразования фибробластов.

ФАКТОРЫ. ВЛИЯЮЩИЕ НА СРОКИ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ГЕМОПОЭЗА

Репопуляция костного мозга происходит за счет кроветровных клеток трансплантата. В костномозговой взвеси присутствуют все представители кроветворной иерархии, от репопулирующих костный мозг клеток до монопотентных коммитированных предшественников. Первыми в дифференцировку вступают гранулоцитарно-макрофагальные и эритроидные колониеобразующие клетки, затем наиболее дифференцированные представители отдела полиолигопотентных предшественников, способные обеспечивать кроветворение трансплантата в течении 1 месяца.

Одним из наиболее доступных способов оценки функционирования

трансплантата является определение его способности поддерживать нормальный состав периферической крови. В качестве прогностического критерия длительности поспрансплантационной цитопении большинство авторов предлагают использовать именно содержание КОЕ-ГМ в костномозговой взвеси в пересчете на килограмм веса тела больного. В качестве менее достоверных критериев используется содержание в костномозговой взвеси миелокариоцитов и мононуклеаров.

Восстановление кроветворения у больных, перенесших аллоТКМ

Аллогенная трансплантация костного мозга была произведена 25 пациентам в возрасте от 15 до 41 года.

Длительность лейкоцитопении после аллоТКМ при оценке по медиане составила 23 дня (15 - 49), агранулоцитоза - 24 (15 - 52) и тромбоцитопении - 28 суток ( 16 - 127 ). У 35% пациентов сроки выхода из цитопении и агранулоцитоза совпадали, у 50% - отставали на 1-3 и у 15% - более чем на 4 дня.

Содержание в костномозговой взвеси миелокариоцитов, оцениваемое непосредственно во время эксфузии, было 8 - 28,2 х Ю9 ( Ме - 18,9 ), что в пересчете на килограмм веса реципиента составило 1,7 - 4,4 х 108 ( Ме 2,9 ). Количество мононуклеаров, перелитых из рассчета веса больного, составляло 10,6 ± 2,8 х 107, Ме 7,4 ( 0,2 - 16,7 ); КОЕ-ГМ 3,0 ±1,7 х 10<, Ме 2,2 ( 0,5 -18,9) и БОЕ-Э 2,9 ± 1,2 х 104 , Ме 1,0 ( 0,2 - 16,7 ). Было определено минимально необходимое для восстановления кроветворения количество миелокариоцитов -1,7 х 108, мононуклеаров - 0,2 х 107, КОЕ-ГМ - 0,5 х 104 в пересчете на килограмм веса реципиента.

В таблице 3 представлены цитологические характеристики трансплантата у пациентов с длительностью агранулоцитоза от 15 до 24 и от 25 до 52 дней.

И хотя больным с более ранним выходом из цитопении ( I группа ) было перелито большее число миелокариоцитов п кроветворных предшественников, статистически достоверные отличия ( Р<0,05 ) были выявлены только для гранулоцитарных предшественников ( рис 5).

Таблица 3

.'.Цитологические параметры трансплантата у больных _ с различной длительностью иитопении_

цитологические параметры трансплантата

Длительность мкц/кг моно/кг КОЕ-ГМ/кг БОЕ-Э/кг

цитопении .. (х 101) (х 107) . (х 10") (хЮ«)

М±т М±тп М±ш М±ш

15-24 31,6 ±1,7 9,3 ± 1,8 5,7 ±1,6 3,5 ±2,1

п=13

25-49 28,4 ±2,3 10,5 ± 2,1 2,1 ±0,4 1,7 ±0,8

п-12

Значительное увеличение содержания гранулоцитарных

предшественников в миелотрансплантате не приводило к увеличению риска присоединения ОВБ.

.,:..: ; ■ , . : Рисунок 5

Влияние характеристик трансплантата на длительность иитопении после алло ТКМ

КОЕ-ГМ И БОЕ-Э на 10 каегок иклоицмоцет« и мямотстофы н» «идете«

8

6

4

2

0 КОЕ-ГМ БОЕ-Э ° МКЦ МОНО 1—J длительность агранулоцитоза меньше 25 дней длительность агранулоцитоза больше 25 дней

Не было обнаружено связи длительности цитопении с диагнозом и длительностью заболевания и режимом кондиционирования. Присоединение в посттрансплантационном периоде инфекционных осложнений, развитие острой вторичной болезни и раннего рецидива заболевания не не не вызывало замедления восстановления кроветворения в ранние сроки после ТКМ.

JLfii

Восстановление кроветворения у больных, перенесших аутоТКМ

Аутологичная трансплантация была произведена 4 больным ОМЛ и 1 -OJIJI в возрасте от 18 до 39 лет. Объем эксфузии составлял от 1020 до 1200 мл. После центрифугирования и добавления DMSO в качестве криопротектора костномозговые клетки хранились в парах жидкого азота в течении от 3 недель до 10 месяцев.

Длительность лейкоцитопении после аутоТКМ составила 25 суток ( 18 -59 ), агранулоцитоза - 34 ( 21 - 63 ), тромбоцитопении - 50 дней ( 38 - 60 ). Двое больных не вышли из агранулоцитоза - один в связи с недостаточной клеточностыо трансплантата, погибший на + 72 день от инфекционных осложнений и один - на фоне раннего рецидива острого лейкоза, диагностированного на +97 день после ТКМ. Смерть у этого больного наступила на + 147 день после ТКМ.

Содержание миелокариоцитов в замораживаемом костном мозге составило 9,0 - 30,3 х 109, или в пересчете на кг веса тела больного 25,8 ± 10,1 х 107, Ме 22,9 ( 19,0 - 51,0 ), мононуклеаров - 9,1 ± 3,5 х 107 , Ме 10,4 ( 0,3 - 13,0 ), КОЕ-ГМ - 13,7 ± 6,1 х 104/кг, Ме 14,4 ( 0,06 - 26,0 ). Для всех оцениваемых параметров минимальные значения - у пациента с ОМЛ, погибшего в аплазии, максимальные - у больной ОМЛ с ранним рецидивом.

При оценке влияния на течение раннего посттрансплантационного периода клеточных параметров аутотрансплантата, обращает на себя внимание положительная, статистически достоверная ( Р<0,05 ), связь между удлинением периода цитопении и увеличением клеточности костномозговой взвеси ( рис. 6 ).

Положительное влияние на длительность периода агранулоцитоза наиболее выражена для миелокариоцитов и КОЕ-ГМ. Оценивая результаты корреляционного анализа и учитывая малое число наблюдений в группе больных, можно говорить лишь о тенденционной зависимости между длительностью цитопении и клеточным составом трансплантата. Вместе с тем нельзя исключить влияния на удлинение посттрансплантационной цитопении присутствующих в аутомиелотрансплантате остаточных клеток лейкозной

Рисунок 6

Влияние характеристик трансплантата на длительность цитопении после ауто 1КМ

содержание различных клеток в трансптангатс

50 40 30 20 10

21 27 41 52 61

время после трансплантации (дни )

__МКЦГ1о1

# монет КОЕ-ГМ/10

популяции, определяющих развитие раннего рецидива связанной с ним опухолевой цитопении.

При сравнении числа перелитых миелокариоцитов, мононуклеаров, КОЕ-ГМ при различных типах трансплантации костного мозга (рис 7 ) обнаружено, что количество миелокариоцитов и мононуклеаров в костномозговой взвеси, переливаемой при аллогенной, сингенной и аутологичной трансплантации, практически одинаково.

Рисунок 7

Сравнительная характеристика цитологических параметров трансплантата при различных типах ТКМ

МКЦ/1(Г

КОЕ-ГМ/10

МОНО/Ю

С—! АЛЛО

[::н синг

■■■ АУГО

При этом содержание КОЕ-ГМ в аутомиелотрансплантате значительно выше, чем костном мозге, полученном от здоровых доноров. По- видимому, это связано со значительной примесью клеток остаточной лейкозной популяции, способных к колониеобразованию in vitro. В таком случае увеличение количества КОЕ-ГМ более чем в 7 раз не может определить ни более раннего выхода из агранулоцитоза, ни ускоренного восстановления количества лейкоцитов и тромбоцитов.

Таким образом, если при аллогениой и сингенной ТКМ достаточным цитологическим критерием полноценности миелотрансплантата является содержание миелокариоцитов и мононуклеаров, то при аутологичной трансплантации, учитывая невозможность количественного определения клеток остаточной лейкозной популяции, сохраняется необходимость оценивать содержание в трансплантате кроветворных предшественников с целью прогнозирования течения поспрансплантационного периода.

ВОССТАНОВЛЕНИЕ КРОВЕТВОРЕНИЯ ПОСЛЕ ТКМ

Обсуждая восстановление числа кроветворных предшественников, необходимо отметить, что, по данным большинства авторов КОЕ-ГМ и БОЕ-Э в течении 2 лет после ТКМ достигают предтрансплантационного уровня, а для восстановления нормального числа КОЕ-ГМ необходимо 4 года. При этом отмечено отставание в сроках восстанавления гемопозза после аутологичной трансплантации, связанное с пролиферацией и дифференцировкой ранних кроветворных предшественников, перенесших цитостатическое воздействие и криохонсервирование. Однако встречаются работы, где отмечено более раннее восстановление клоногенного состава костного мозга, вплоть до 4 - 6 месяцев после ТКМ.

За контрольные значения в настоящей работе принято содержание КОЕ-ГМ в костном мозге 28 здоровых доноров, которое составляет 56,7 ± 22,0 на 105 миелокариоцитов.

Нами было исследовано содержание КОЕ-ГМ в костном мозге у 31 пациента. При ретроспективной оценке в костном мозге больных различными гемобластозами посттрансплантационного периода был обнаружен различный

характер восстановления числа КОЕ-ГМ. Зависимости от числа перелитых гранулоцитарных предшественников, режима подготовки и типа ТКМ выявлено не было.

Динамика числа КОЕ-ГМ в костном мозге больных острыми нелимфобластными лейкозами.

Был исследован костный мозг 14 больных ОНЛЛ. Перед началом подготовки морфологически ремиссия была подтверждена у 12 пациентов, 1 пациентка была в рецидиве, рефрактерном к проводимой химиотерапии, 1 - в неполной ремиссии.

Исходный уровень КОЕ-ГМ у больных ОНЛЛ составил 70,1 ± 28,8 на 105 миеяокариоцитов, от отсутствия колониеобразования in vitro, до количеств, значительно превышающих контрольные значения, что свидетельствует о гетерогенности данной группы по колониеобразующей способности клеток костного мозга.

По течению постгрансплантационного периода больные с ОНЛЛ были разделены на 4 группы

1. с продолжительной пост-трансплантационной ремиссией, п= 5

2. с развитием раннего рецидива, п= 5

3. с присоединением ОВБ, п= 3

4. погибшие в раннем посттрансплантационном периоде, n= 1

До начала подготовки к ТКМ у больных с длительной постгрансгшантационной ремиссией в костном мозге обнаруживалось 40,5 ± 16,5 КОЕ-ГМ на I05 миелокариоцитов. Через 3 недели после трансплантации КОЕ-ГМ в костном мозге не определялись, однако с 4й до 24ю неделю после трансплантации количество КОЕ-ГМ постепенно увеличивалось и составило 39,2 ± 7,9 на 10sклеток, что сопоставимо с нормальными значениями, (рис 8 ).

В дальнейшем, с 24й недели наблюдения, у всех больных с рецидивом, развившемся на 32- 57й неделе ТКМ, и ХВБ, колониеобразование в культурах отсутствовало. Развитие ОВБ сопровождалось во всех случаях резким снижением количества КОЕ-ГМ в костном мозге вплоть до их отсутствия.

Рисунок 8

пр« раннем рещзмве у одного бшвлогх)

коетмно кпегок зяг

Содержание КОЕ-ГМ в костном мозге больных

ОМЛ после ТКМ при длительной ремиссии

КОЕ-ГМШ? клеток 60 50 40 30 20 10 0

до 3 4 12 24

время после трансплантант (надет)

да 3 4 12

ером послс тфэнспяантея«! ^яелф

У всех пациентов с отсутствием колониеобразования в культурах костного мозга перед началом подготовки к ТКМ рецидив заболевания развился в течение 3 - 4 месяцев. За время наблюдения у 4 пациентов роста КОЕ-ГМ ие отмечено ни в одной пробе, и лишь у одного в раннем периоде после ТКМ отмечалось резкое увеличение числа КОЕ-ГМ и КлОК ( на Зй неделе - до 325 и 195 на 105, на 4й - до 166 и 227 на 105 клеток ), что характерно для лейкозного типа роста в культуре, и возможно связано с вступлением в пролиферацию остаточного лейкозного клона. К 12й неделе наблюдения ни в одном случае роста КОЕ-ГМ в культуре не было.

Динамика числа КОЕ-ГМ в костном мозге больных ОЛЛ и ЛСА.

Исследование проводилось в группе из 8 больных ОЛЛ. Из них 7 перенесли аллогенпую и 1 - аутологичную трансплантацию. К началу подготовки все пациенты были в ремиссии. Учитывая условность подобного объединения, в эту группу включены 2 больных лнмфобластной лимфосаркомой, заболевание у которых протекало с поражением костного мозга; один перенес аллогенную и 1 - сингенную ТКМ. Содержание КОЕ-ГМ у пациентов этой группы перед началом кондиционирования было снижено по сравнению с нормой и составило 14,9 ± 6,2 на 105миелокариоцитов.

По течению постгрансплантационного периода больные ОЛЛ и ЛСА были разделены на 4 группы:

1. с длительной ремиссией, п= 4,

2. с развитием раннего рецидива, п= 3,

3. пациенты с присоединившейся ОВБ, п= 1

4. погибшие в раннем посттрансплантационном периоде, п= 2

В первой группе исходный уровень КОЕ-ГМ составлял 12,9 ±4,1 на 105 эксплантированных в культуру клеток. Увеличение числа КОЕ-ГМ в костном мозге у больных ОЛЛ и ЛСА происходило значительно быстрее, чем при ОНЛЛ. К Зй неделе содержание КОЕ-ГМ было 11,6 ± 4,1 на 105 ядросодержащих клеток. С 4й до 36й недели после трансплантации среднее число гранулоцитарных предшественников не отличалось от исходного уровеня и составило к 4ой неделе 19,9 ± 3,9, а к 36й неделе - 26,1 ± 3,6 на 105 миелокариоцигов, не достигая контрольных значений. В позднем посттрансплантационном периоде рецидив лейкоза развился у 2 пациентов, чему в обоих случаях предшествовало резкое уменьшение колониеобразования в культуре. ОВБ развилась у одного больного ОЛЛ, чему предшествовало резкое снижение колониеобразования КОЕ-ГМ в культурах костного мозга.

Рисунок 9

Содержание КОЕ-ГМ в костном мозге больных

ОЛЛ после ТКМ при длительной ремиссии

при рением радриве снеток

О

до 3 4 12 24 36

время после трансплантации (недели)

■ром ШСК-Тр(М71»К»1И<<Не№Ш)

У 3-х больных рецидив заболевания развился в раннем посттрансплантационном периоде. Содержание КОЕ-ГМ в этой группе больных

до начала подготовки было 20,6 ± 9,8 на 105 клеток. При этом восстановления кроветворения на протяжении 12ти недель наблюдения не произошло ни в одном случае, и к моменту морфологически диагностируемого рецидива колониеобразование в культурах костного мозга отсутствовало у всех пациентов.

Динамика числа КОЕ-ГМ в костном мозге больных ХМЛ.

Трансплантация костного мозга проведена 8 пациентам с ХМЛ. У всех заболевание было в фазе акселерации. 4 из них погибли в раннем посттрансплантационном периоде ( 2 - от ОВБ и 2 - от инфекционных осложнений . У одного больного в связи с выраженным миелофиброзом не удавалось получить материал для исследования. Таким образом колониеобразующая способность костного мозга исследовалась у 3 пациентов с ХМЛ (рис. 10 ). 2 больных перенесли сингенную и 1 - аллогенную ТКМ.

Исходный уровень КОЕ-ГМ в костном мозге пациентов с ХМЛ составил 36,9 ± 14,5 на 105 миелокариоцитов, причем у 2 больных не отличался от нормального, и у 2 был снижен. После развития ОВБ у одного больного роста колоний гранулоцитарных предшественников в культуре не было в течении всего периода наблюдения.

Рисунок 10

Содержание КОЕ-ГМ в костном мозге больных ХМЛ после ТКМ

к при длительной ремиссии КОЕ-ГМ/КГ с=]

120 100 80 60 40 20 0

СИНГ АЛЛО

12 24 52

до 3 4

время после трансплантации (недели)

По истечении 1 года наблюдения у 2 пациентов, перенесших сингенную ТКМ, количество КОЕ-ГМ оставалось ниже как нормального, так и исходного

уровня. Вместе с тем после аллогенной трансплантации, уровень гранулоцитарных предшественников превысил исходный более чем в 2,5 раза. Ремиссия у этого больного сохранялась в течении 3 лет.

Можно предположить, что описанные различия в сроках и характере восстановления содержания КОЕ-ГМ в костном мозге больных с различными гемобластозами связаны не только с особенностями течения заболевания, но и с нашими возможностями с помощью морфологических и куль тур алъных методов оценить полноту ремисии перед началом кондиционирования. В ремиссии у больных ОЛЛ в костном мозге определяется нормальное количество КОЕ-ГМ, а при развитии рецидива всегда происходит резкое снижение числа клоногенных предшественников гранулоцитов и макрофагов. При острых миелоидных лейкозах нормальное содержание колоний и соотношение колоний и кластеров в костном мозге возможно как на фоне морфологически подтвержденной ремиссии, так и в рецидиве. Вместе с тем известно, что неопластические клетки, содержащиеся менее чем в 1% от мононуклеарной клеточной популяции, морфологическими методами не определяются, а исследование костного мозга больных ОНЛЛ в ремиссии методом проточночной цитометрии, позволило выявить резидуальный опухолевый клон в 12 - 65% случаев. Таким образом, в условиях неполной эрадикации лейкозного клона во время лечения, прешествующего трансплантации, можно предположить, что при острых миелоидных лейкозах дпя уничтожения резидуальных клеток в реакции "трансплантат против лейкоза" и становления донорского кроветворения требуется более продолжительное время.

Таким образом, восстановление гемопозза у больных острыми лейкозами в первую очередь определялось состоянием основного заболевания на момент трансплантации. Особенности режима кондиционирования, количество перелитых миелокариоцитов и тип перенесенной трансплантации не влияли на восстановление клоногенного состава костного мозга у больных после ТКМ.

Хипамика числа КОЕ-ГМ и КОЕ-Ф в посттрансплантационном периоде

Повреждение микроокружения во время предтрансплантационного :ондиционирования, подтвержденное нами для предшественников [шбробластов наиболее выраженно в период восстановления содержания КОЕ-"М в костном мозге.

Рисунок И

Соотношение КОЕ-ГМ и КОЕ-Ф в костном мозге больных после ТКМ

20 15 10 5 0

КОЕ-ГМ и КОК-Ф/10 клеток

. _1 КОЕ-ГМ

ЯШ КОЕ-Ф

3 месяца 6 месяцев

время после трансплантации

При сопоставлении числа фибробластных и гранулоцитарно-моноцитарных предшественников костного мозга в различные сроки после ТКМ [ рис 11 ) нами не было выявлено зависимости между восстановлением КОЕ-ГМ и изменением числа КОЕ-Ф, что, очевидно, может свидетельствовать о большем значении в поддержании гемопоэза других клеточных компонентов микроокружения, таких как жировые, эндотелиальные клетки и макрофаги.

ВЫВОДЫ

1. Действие режимов предтрансплантационного кондиционирования на кроветворное микроокружение выражается в снижении эффективности колониеобразования фибробластных предшественников костного мозга больныхгемобластозами.

2. Режим предтрансплантационного кондиционирования, включающий циклофосфан и миелосан, оказывает более выраженное повреждающее действие

на клетки-предшественники фибробластов костного мозга по сравнению с режимом, включающим циклофосфан и тотальное облучение тела.

3. Длительность цитопении после аллогенной трансплантации костного мозге уменьшается при увеличении содержания в трансплантате гранулоцитарно-моноцитарных предшественников. Количество миелокариоцитов, мононуклеаров и эритроидных предшественников, в трансплантате не влияет на сроки выхода из постграисплантационной цитопении. Развитие острой вторичной болезни и рецидива лейкоза не вызывает удлинения периода цитопении.

4. У больных острыми лейкозами восстановление числа гранулоцитарно-моноцитарных предшественников в костном мозге происходит к 24 неделе после трансплантации. В случае развития раннего рецидива острого лейкоза восстановления нормального кроветворения не происходит.

5. Отсутствие колониеобразования в костном мозге у больных острыми нелимфобластными лейкозами до трансплантации является признаком развития раннего рецидива лейкоза.

6. Развитие хронической вторичной болезни сопровождается уменьшением числа гранулоцитарно-моноцитарных и фибробластных предшественников в костном мозге

7. Снижение числа фибробластных предшественников костного мозга, возникающее под действием предтрансплантационного кондиционирования, не влияет на восстановление гранулоцитарно-моноцитарных предшественников в течение 1 года после трансплантации костного мозга.

Основные публикации по теме диссертации.

1. Момотюк К.С. "Прогностическая значимость определения количества коммитированных клеток-предшественников в трансплантате". Тезисы симпозиума "Экологические факторы и кроветворение " . Москва, 1992г. стр 79 -80.

2. Momotuk K.,Gerasimova L., Savchenko V., Kuiikov S„ Mendeleeva L., Lubimova L. Influence of different conditioning regimens on stroma precursors. Annals of Hematology, 1995, v70, suppl2, abstr 103.

3. Momotuk K.,Gerasimova L., Savchenko V., Kulikov S., Mendeleeva L., Lubimova L. Influence of different conditioning regimens on stroma precursors. Acute leukemias V, 1996. p. 345 - 349.

Издательство АО "Диалог-МГУ". ЛР N 063999 от 04.04.95.

Подписано к печати 7.05.97г.

Усл.печ.л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ N 375.

Тел. 939-38-90, 939-38-91. Факс 939-38-93.

119899, Москва, Воробьевы Горы, МГУ