Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Исследование эндотелиопротективных свойств L-аргинина и его комбинаций с амлодипином и индапамидом.

На правах рукописи

Малыхин Виталий Алексеевич

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭНДОТЕЛИОПРОТЕКТИВНЫХ СВОЙСТВ Ь-АРГИНИНА И ЕГО КОМБИНАЦИЙ С АМЛОДИПИНОМ И ИНДАПАМИДОМ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г з ¡.:.\?

Курск-2009

003465348

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Покровский Михаил Владимирович Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Провоторов Владимир Яковлевич кандидат медицинских наук Алыменко Максим Алексеевич

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита состоится «» 2009 г. в « & Ъу» на

заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава.

Автореферат разослан « 'У » 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Пашии Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В современном мире, особенно в развитых странах, артериальная гипертензия (АГ) является одним из основных факторов, повышающих шшалидизацшо и смертность за счет таких грозных осложнений, как инфаркт миокарда, сердечная недостаточность и инсульт (Бойцов С.А., 2005; Гогин Е.Е., 2002). Прогноз и терапевтические последствия изменений артериального давления (АД) днем и ночью до настоящего времени до конца не изучены. Анализируя данные литературы, становится очевидным, что показатели суточного профиля АД, т.е. среднесуточные, среднедневные, средненочные, индексы нагрузки давлением, более информативны для оценки степени тяжести артериальной гипертензии, чем данные разовых измерений АД (Харченко О.О., 2003). Было высказано предположение, что у больных с артериальной гипертензией, у которых не отмечено ночное снижение АД, высокий риск возникновения инсульта. Результаты исследований JI.H. Задорожной и соавторов, проведенных в 2000 г., свидетельствуют, что при повышенном АД ночью у больных более выражено поражение органов-мишеней (гипертрофия миокарда, сердечная недостаточность, ретинопатия и др.). В ходе длительных наблюдений (более 7 лет) было установлено, что у больных с нарушенным суточным ритмом («нон-диппер», «найт-пикер», «гипер-диппер»), особенно у женщин, частота развития сердечно-сосудистых осложнений достоверно выше (Mancia G. et al., 2004).

P. Verdecchia и соавторы в ходе исследований, проведенных до 2008 г., установили, что уровень смертности от сердечно-сосудистых заболеваний ниже у больных, у которых при суточном МАД не выявлено повышение среднего АД, а также то, что этот показатель повышается у больных, у которых ночное АД выше дневного («найт-пикеры») или недостаточно снижено («нон-дипперы»).

В России распространенность АГ среди взрослого населения превышает 30%; наша страна занимает одно из первых мест в Европе по смертности от инсультов и ИБС (Беленков Ю.Н., 2005; Гавриков H.A., 2001).

Одной из основных причин АГ является эндотелиальная дисфункция (ЭД) и в первую очередь - нарушение релаксационных свойств эндотелия (Остроумова О.С., 2005; Зодионченко B.C., 2002). Впервые о самостоятельной роли сосудистого эндотелия в регуляции сосудистого тонуса было заявлено в статье Furchgott и Zavvadzki, опубликованной в журнале «Nature» в 1980 г.

Основным механизмом, лежащим в основе ЭД, является снижение образования и биодоступности оксида азота (NO) при одновременном повышении уровня супероксиданиона и продукции мощных вазоконстрикторов (Марков Х.М., 2005).

Таким образом, дисфункция эндотелия проявляется дисбалансом между медиаторами, обеспечивающими в норме оптимальное течение всех эндотелийзависимых процессов (Небиеридзе Д.В., 2005).

Патогенез сердечно-сосудистых заболеваний, в частности АГ, вероятно, связан с нарушением баланса эндотелиальных субстанций. Основное значение в развитии ЭД имеют свободнорадикальное окисление, продукция мощных

вазоканстрикторов (эндопероксидов, эндотелинов), a также цитокинов, которые подавляют продукцию N0 (Марков Х.М., 2005; Heitsch Н., Brovkovych S., Malinski Т., Wiemer G., 2001; Bautista L.E., 2003; Wyatt A.W., 2004.)

Эндотелий секретирует мощные вазоактивные вещества: вазодалататоры (NO, эндотелиальный гиперполяризующий фактор, простациклин) и вазоконстрикторы (AT II, эндотелии, свободные радикалы недоокисленных жирных кислот, простагландин Р2-альфа и тромбоксан А2) (Агеев Ф.Т., 2001; Бойцов С.А., 2005; Кательницкая Л.И., 2005). Наиболее важным вазодилататором считается N0.

N0 синтезируется из L-аргинина под влиянием эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) путем присоединения молекулярного кислорода к конечному атому азота гуанидиновой группы L-аргинина (Граник В.Г., 2004).

Изучение состояния сосудистой стенки и поиск возможностей целенаправленного лечения ЭД является важной клинико-эксперименталыюй задачей, но вместе с тем не существует препаратов для специфической коррекции эндотелиальной дисфункции.

В настоящее время одним из наиболее осуществимых методов повышения уровня N0, устранения его дефицита и вызываемой этим дефицитом дисфункции эндотелия сосудов является введение в организм L-аргинина. Однако его роль как обязательного эндотелиотропного аддитива к базисной антигипертензивной терапии не достаточно определена и изучена.

В связи с вышеизложенным являлось актуальным изучение эндотелиопротективных свойств L-аргинина с гипотензивными препаратами, обладающими эндотелиотропной активностью (блокатором кальциевых каналов дигидропиридинового ряда амлодипином и тиазидоподобным диуретиком - индапамидом) при экспериментальном дефиците оксида азота.

Номер государственной регистрации темы - 01.2.00 950904.

Цель исследования: провести оценку эндотелио- и кардио-протективных эффектов L-аргинина и его комбинаций с амлодипином и индапамидом в эксперименте.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи исследования:

1. Изучить влияние L-агринина, амлодипина, индапамида и их комбинаций на суточный профиль давления.

2. Изучить эндотелиопротективную активность L-аргинина при L-NAME-индуцированной модели дефицита N0.

3. Изучить эндотелиопротективную активность блокатора кальциевых каналов дигидропиридинового ряда амлодипина при L-NAME-индуцированной модели дефицита N0.

4. Изучить эндотелиопротективную активность тиазидоподобного диуретика индапамида при L-NAME-индуцированной модели дефицита N0.

5. Изучить эндотелиопротективную активность сочетанного применения L-аргинина и блокатора кальциевых каналов дигидропиридинового ряда амлодипина при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO.

6. Изучить эндотелиопротективную активность сочетанного применения L-аргинина и тиазидоподобного диуретика индапамида при L-NAME-индуцированной модели дефицита N0.

Научная новизна исследования.

Было впервые проведено суточное мониторирование артериального давления у крыс, получавших L-аргинин, амлодипин, индапамид и их комбинации при использовании модели L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции. Было установлено что у иктактньгх крыс тип суточного профиля представлял из себя диппер тип, у крыс с L-NAME-индуцированной патологией - нон-диппер тип. Также было установлено что монотерапия амлодипином и индапамидом не приводила к нормализации суточного профиля, а комбинированное использование данных препаратов с L-аргинином нормализовало суточный профиль давления и приводило его к диппер типу.

В работе впервые показано, что L-аргинин в дозах 30 и 200 мг/кг (однократно в сутки внутрижелудочно в течение 7 дней) оказывает дозозависимое эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированной NO-дефицитной ЭД. Амлодипин 0,5 мг/кг и индапамид 2 мг/кг (однократно в сутки внутрижелудочно в течение 7 дней) как монотерапия также обладали эндотелиопротективными эффектами на выбранной модели патологии. Сочетанное использование L-аргинина с блокатором кальциевых каналов дигидропиридинового ряда амлодипином и тиазидоподобным диуретиком индапамидом показало аддитивное эндотелиопротективное действие.

Практическая значимость. В работе обоснована эффективность сочетанного применения L-аргинина, антагониста кальция дигидропиридинового ряда амлодипина и тиазидоподобного диуретика -индапамида для коррекции L-NAME-индуцированной NO-дефицитной ЭД в эксперименте. Продемонстрировано что сочетанное использование данных препаратов нормализует тип суточного профиля.

Показано, что их сочетанное использование позволяет нормализовать изменение соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в 5 раз, предотвратить снижение показателей биохимических маркеров ЭД (Total NO, экспрессию NO-синтетазы), а также добиться положительной динамики морфофукциональных показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр миокардиоцитов и прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением, диаметр миокардиоцитов и адренореактивности и т.д.).

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания комбинаций L-аргинина с амлодипином индапамидом при состояниях, сопровождающихся эндотелиальной дисфункцией.

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования, касающиеся антигипертензивной и эндотелиопротективной активности амлодипина («Амлодипин» производства

ОАО «Фармстандарт-Лексредства»), индапамида («Индапамид» производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства»), включены в состав документов, поданных на регистрацию в МЗ РФ (РУ № 000084).

Результаты работы используются в работе кардиологического отделения МУЗ «Городская больница скорой медицинской помощи», кардиологического отделения МУЗ «Городская больница № 1» г. Курска и в лекционных курсах кафедры фармакологии КГМУ, кафедры фармакологии БелГУ.

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых КГМУ, 2007 г., XV Национальном конгрессе «Человек и лекарство», XIII Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, II Национальном конгрессе терапевтов, III Всероссийской конференции молодых ученых, организованной Воронежской государственной медицинской академией им. H.H. Бурденко и Курским государственным медицинским университетом. Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии, анатомии человека, гистологии, внутренних болезней № 2, НИИ экологической медицины КГМУ. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Положения, выносимые на защиту.

1. L-аргинин в дозах 30 и 200 мг/кг однократно в сутки течение 7 дней внутрижелудочно оказывает дозозависимое эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированной NO-дефицитной ЭД. Амлодипин 0,5 мг/кг и индапамид 2 мг/кг как монотерапия также обладали эндотелиопротективными эффектами на выбранной модели патологии, нормализации суточного профиля давления не происходило.

2. Совместное использование L-аргинина (200 мг/кг) с амлодипином 0,5 мг/кг оказывает эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO, выражающееся в снижении КЭД, нормализации суточного профиля давления, положительной динамике результатов нагрузочных проб и морфологических исследований, а также в предотвращении снижения концентрации нитрит-ионов. При этом цифры артериального давления приближались к целевым.

3. Совместное использование L-аргинина (200 мг/кг) с индапамидом 2 мг/кг оказывает эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO, выражающееся в снижении КЭД, нормализации суточного профиля давления, положительной динамике результатов нагрузочных проб и морфологических исследований, а также в предотвращении снижения концентрации нитрит-ионов NOx. При этом отмечается положительное фармакодинамическое взаимодействие L-аргинина и индапамида в отношении эндотелио- и кардиопротективного действия при L-NAME-индуцированном дефиците NO.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка использованной литературы, включающего 315 источник, из

них 144 - отечественных и 171 - зарубежных авторов. Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста, содержит таблиц - 17, рисунков - 43, схем - 1.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Опыты проводились на белых крысах-самцах линии Wistar массой 250300 г. N-mirpo-L-арпшин метиловый эфир (L-NAME) вводился ежедневно один раз в сутки внутрибрюшинно, в дозе 25 мг/кг в течение 7 дней. Мониторирование суточного давления проводилось на 7 сутки с помощью аппаратно-программного комплекса Biopac МР100. Крысы помещались в иммобилизационную камеру, далее ежечасно в течение 24 часов проводилось измерение артериального давления с помощью хвостовой манжеты. Полученные результаты обрабатывались с помощью программы AcqKnowledge 3.8.1 и пакета Microsoft Office 2003.

На 8 день от начала эксперимента под наркозом (этаминал натрия 50 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации гемодинамических показателей, болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли непрерывно посредством датчика и компьютерной программы «Bioshell». Функциональные пробы: внутривенное введение ацетилхолина (40 мкг/кг) (Laursen J.B., 1997) и нитропруссида натрия (30 мкг/кг) (Галаган М.Е., 1991; Покровский М.В. и соавт., 2005-2008 гг.).

Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца и посредством датчика P23ID «Gould» США, АЦП L-154 и компьютерной программы «Bioshell» регистрировали показатели кардиогемодинамики (левожелудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dt шах), максимальную скорость расслабления (-dp/dt max), частоту сердечных сокращений (ЧСС) и интенсивность функционирования структур (ИФС) (произведение частоты сердечных сокращений и давления, развиваемого левым желудочком (мм рт.ст. х уд./мин).

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности:

1. Нагрузка объёмом (внутривенное одномоментное введение 0,9% раствора NaCl, из расчёта 0,4 мл на 100 г) (Меерсон Ф.З., 1980).

2. Проба на адренореактивность (внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида из расчёта 0,1 мл на 100 г) (Меерсон Ф.З., 1980).

3. Нагрузка сопротивлением (пережатие восходящей аорты на 30 сек) (Меерсон Ф.З., 1980).

Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункиин. Нами использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO,

позволяющая после депротеинизации сыворотки крови проводить одноэтапное количественное определение суммарных нитратов и нитритов. Принцип метода заключается в одновременном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии хлористого ванадия и реакции диазотирования с последующим развитием окраски, интенсивность которой определяли спектрофотометрически при длине волны 540 нм. Анализ 100 мкл депротеинизированной сыворотки проводили в 96 луночных планшетах с плоским дном. Чувствительность метода на приборе Labsystems Multiskan МСС/340 составляет 1,7 мкМ. Для колориметрического определения нитрит-иона использовали реактив Грисса, состоящий из равных частей раствора I (0,05% раствор N-нафтилэтилендиамина в воде) и раствора II (1% раствор сульфаниламида в 30% уксусной кислоте). Оба раствора хранятся в темноте при температуре 4°С в течение нескольких месяцев. Для приготовления раствора хлористого ванадия 400 мг VCI3 растворяли в 50 мл IN HCl с последующим фильтрованием через бумажный фильтр. Всегда использовали свежеприготовленный раствор.

Уровень метаболитов NO (то есть суммарную концентрацию нитратов и нитритов, NOs) определяли колориметрическим методом по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящим в состав реактива Грисса. Для построения калибровочной кривой использовали IM раствор NaN02 в воде, который хранили при температуре -20°С; перед употреблением его разводили в 1000 раз и готовили серию разведений для построения кривой (Метельская В.А., Туманова Н.Г., 2005).

Для морфологического подтверждение развития моделируемых патологических процессов и в комплексной оценке эффективности препаратов проведено гистологическое исследование сердца (во всех сериях эксперимента), почек, надпочечников, участков брюшной и сонной артерий). Материал фиксирован в 10% формалине с последующей заливкой в парафин. Использованы окраски гематоксилином Pero и эозином для выявления ранних повреждений миокардиоцитов по Ван Гизон, ставилась ШИК-реакция. При морфометрии сердца использовано определение диаметра кардиомиоцитов по методике Г.Г. Автандилова (1994).

Обоснование доз и дизайн эксперимента. Исследована эндотелиотропная активность L-аргинина производства EUROBIOPHARM GmgH, Hamburg, в дозе 30 мг/кг, что соответствует разрешенной суточной дозе в России по СанПиН - М.Р.2.3.1.1915 (2004), и в дозе 200 мг/кг, которая была определена нами по данным литературы (Wu G., Bazer F.W., Cudd Т.А., Jobgen W.S. et al., 2007) Согласно литературным данным, именно начиная с дозы 30 мг/кг L-аргинин проявляет эндотелио- и кардиотропные эффекты (Böger R.H., Bode-Böger S.M., 2001).

В хронических экспериментах при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота L-аргинин вводился в соответствующих дозах один раз в сутки внутрибрюшинно в течение 7 дней через 30 минут после введения L-NAME.

Принятая схема соответствует основной массе экспериментальных исследований на крысах (Deng L.Y., 1993). Препараты с доказанным

плейоотропным эндотелиопротективным действием вводили внутрижелудочно в течение 7 суток при L-NAME-опосредованной модели дефицита оксида азота, амлодипин («Амлотоп», производства «Макизфарма»), индапамид («Индапамид», производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства»), использовали в дозах 0,5 мг/кг и 2 мг/кг соответственно, что соответствует данным доступной литературы и выявляет эффективное гипотензивное и кардиопротективное действие препаратов в экспериментах, ранее проведённых в нашей лаборатории.

При комбинированном использовании L-аргинина с препаратами с доказанными эндотелиопротективными свойствами использовались те же дозы, пути введения и продолжительность применения.

Достоверность наблюдавшихся при действии исследованных препаратов изменений параметров, как абсолютных, так и в приростах от исходного уровня, определяли разностным методом описательной статистики с нахождением средних значений сдвигов (М), средней ошибки средней арифметической (±ш) и вероятности возможной ошибки (р), рассчитанной с использованием t-test для групп с различной дисперсией. Различия оценивали как достоверные при р<0,05. Статистические расчеты проводились с использованием программы Microsoft Excel 2003.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Динамика функциональных, биохимических и морфологических показателей при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита NO.

Длительное, в течение 7 суток, однократное внутрибрюшинное введение L-NAME в дозе 25 мг/кг привело к стойкому повышению артериального давления (рис. 1 ).

Проведение функциональных проб с оценкой реакций на эндотелий-зависимую и эндотелийнезависимую вазодилатацию показало существенные различия в группе с L-NAME-индуцированной патологией в отличие от интактных животных. На рисунке 2а - верхняя кривая - АД систолическое, далее - АД диастолическое и ЧСС. Реакция на введение ацетилхолина характеризуется резким падением артериального давления и брадикардией.

После окончания миокардиального компонента артериальное давление восстанавливается. Треугольник над кривой восстановления артериального давления принимался нами за площадь эндотелийзависимой реакции.

На рис. 26 представлена реакция на ацетилхолин при моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции. При этом видно, что площадь эндотелийзависимой реакции в несколько раз меньше, чем у интактных животных.

72,9

^ ^р ^ ^ г^ » -о •

Время

Рисунок 1. Функциональные, биохимические и морфологические 20 показатели при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита 15 N0.

Примечание. ю

* - р < 0,05 в сравнении с группой интактных животных. 5

□ - Иптактные

83,6%

66,0%'

[

I

@ - ЬЫАМК

на эндотелийзависимую вазодилатацию (внутривенное введение ацетилхолина 40 мкг\кг) у интактных животных.

Примечание. Треугольники над кривыми артериального давления - объяснение по тексту.

Аналогично оценивали эндотелийнезависимую реакцию на внутривенное введение нитропруссида. Обращает на себя внимание отсутствие принципиальной разницы в площадях эндотелийнезависимых реакций у интактных и опытных групп животных, несмотря на существенно более высокие цифры АД (рис. 3).

Математическое выражение описанного явления представлено нами в виде коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), являющегося отношением площади над кривой восстановления среднего артериального давления в ответ на внутривенное введение нитропруссида к площади над кривой восстановления среднего артериального давления в ответ на внутривенное введение ацетилхолина.

В наших экспериментах КЭД в группе интактных животных составил 1,1±0,09, при Ь-ЫАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота он был в 5 раз больше - его значение составило 5,4±0,08 (рис. 1). Ь-ЫАМЕ-индуцированный дефицит оксида азота привёл к увеличению абсолютных значений ЛЖД в пробе на адренореактивность и снижению миокардиального резерва в пробе на нагрузки сопротивлением (рис. I).

У интактных животных показатель исчерпания миокардиального резерва к 25 секунде составил 83,6±7,7, а у животных с Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией он значительно ниже - до 66,0±5,5% (рис. 1).

на эндотелийзависимую вазодилатацию (внутривенное введение нитропруссида натрия 30 мкг\кг) у интактных животных.

Примечание. Треугольники над кривой артериального давления - объяснение по тексту.

Характерная динамика биохимических маркеров Ь^АМЕ-индуцированного дефицита оксида азота представлена на рис. 1. Так, концентрация нитрит-ионов (>40х) у животных, получавших Ь-ЫАМЕ, составила 61,2 ±3,6,тогда как у интактных- 114,1±4,1 мкМоль (рис. I).

Также наблюдается изменение суточного профиля давления. У интактных животных диппер-тип, у животных с Ь-ЫАМЕ индуцированной эндотелиальной дисфункцией нон-диппер тип (рис. 1).

Подтверждением функционально-биохимических показателей, отражающих развитие Ь^АМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции, явились результаты морфологических исследований. Площадь поперечного сечения резко увеличена при сохранённом диаметре ядер при одном увеличении. Морфометрические исследования показали, что у интактных животных поперечное сечение составило 9,1±1,1, а у животных, получавших Ь-ЫАМЕ- 18,4±1,1 мкМ.

Аналогично прослеживалась морфологическая картина изменений сосудистой стенки почечных артериол. У интактных животных - клетки эндотелия расположены плоско, при Ь-ЫАМЕ-патологии - сосуд спазмирован, стенки утолщены, эндотелий дезориентирован.

Таким образом, ежедневное в течение 7 суток, внутрибрюшинное введение Ь-ЫАМЕ в дозе 25 мг/кг вызывает развитие эндотелиальной дисфункции, характеризующейся резким увеличением КЭД, АД, изменением профиля суточного давления, повышением адренореактивности с развитием скрытой сердечной недостаточности, характерными биохимическими сдвигами

и гистологической картиной гипертрофии миокарда и гиперплазии сосудистого русла.

2. Исследование эндотелиопротективной активности Ь-аргинина, амлодиппна и индапамида при L-NAME-индyuиpoвaннoй модели дефицита N0 в эксперименте.

Исследования показали, что Ь-аргинин обладает выраженным дозозависимым эндотелиопротективным эффектом. Наши исследования позволили установить, что амлодипин и индапамид обладают эндотелио- и кардиопротективным эффектами, сопоставимыми или превосходящими таковые у Ь-аргинина. Так, КЭД у интактных животных составил - 1,1±0,1, у Ь-ЫАМЕ - 5,4±0,б, Ь-ЫАМЕ + Ь-аргинин (30 мг/кг) - 2,7±0,3, Ь-ЫАМЕ + Ь-аргинин (200 мг/кг) - 2,5±0,1, Ь-ЫАМЕ + амлодипин (0,5 мг/кг) - 2,1±0,3, Ь-ЫАМЕ + индапамид (2 мг/кг) - 3,3±0,4 (рис. 4).

Проба на адренореактивность у животных с Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией на фоне терапии Ь-аргинином, амлодипином и индапамидом также обнаружила снижение максимальных цифр левожелудочкового давления. У интактных животных - 199,2±8,3, у Ь-ЫАМЕ - 247,3±4,8, у Ь-аргинина (30 мг/кг) - 222,7±16,6, у Ь-аргинина (200 мг/кг) - 201,6±12,3, у амлодипина (0,5 мг/кг) - 201,3±14,4, у индапамида (2 мг/кг) - 247,9±9,3 мм рт.ст. Аналогичная тенденция выявлена в пробе на нагрузку сопротивлением. Сократимость на 25 секунде нагрузки составила у интактных животных -83,6±7,7% к 5-й секунде, взятой за 100%. Ь-ЫАМЕ-индуцированная патология -66,0±5,5%, Ь-ЫАМЕ + Ь-аргинин (30 мг/кг) - 69,0±5,6%, Ь-ЫАМЕ + Ь-аргинин (200 мг/кг) - 84,4%±8,8, Ь-ЫАМЕ + амлодипин - 71,6%±6,4, Ь-ЫАМЕ + индапамид - 68,7±5,1%.

На рисунке 4 представлены данные о концентрации нитрит-ионов в сыворотке крови экспериментальных животных. Под влиянием Ь-аргинина в дозе 200 мг/кг концентрация нитрит-ионов увеличивалась и достоверно не отличалась от интактных животных. Амлодипин и индапамид не предотвращали Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота (рис. 4).

Влияния на суточный профиль артериального давления Ь-аргинина в двух дозах, амлодипина и индапамида не выявлено (рис. 4).

Влияние указанных препаратов на диаметр кардиомиоцитов также выявило существенные преимущества Ь-аргинина (200 мг/кг) в способности предотвращать гипертрофию миокардиоцитов. Ь-аргинин (30 мг/кг), амлодипин (0,5 мг/кг) и индапамид (2 мг/кг) заняли промежуточное положение между интактными животными и животными с Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией {рис. 4).

Таким образом, по совокупности функциональных, биохимических, морфологических показателей, отражающих эндотелио- и кардиопротективные эффекты, Ь-аргинин (200 мг/кг) проявил активность, сопоставимую или превосходящую таковую у амлодипина и индапамида.

■ САД

■ ДАЛ

АДр

—247,3*'

цяа]

не

1

йЗ

.241. л\\

чЧЧЧ

чЧЧЧ

- Интактные -Ь-МАМЕ

•Ь^АМЕ+ 1_-аргиннн 30 мг/кг

- Ь-ЫАМЕ+Ь-аргинин 200 мг/кг " 1.-иАМЕ+амлоднпин 0,5 мг/кг ~ Ь-ЫАМЕ+индапамид 2 мг/кг

25"

Ср Ад

а 100 I ж

Л -Г1 Время

— СрАд ИмПктныв —СрАд1-^вт«

—СрАд ]..Ывтв+1-вргииим 30мг -СрАд 1.^вт**1.-артин41200мг

— СрАд 1-^тв*вмлодит*10,5мг —СрАд и-Матв.имДачамиД 2мг

Рисунок 4. Влияние Ь-аргинина 30 и 200 мг/кг, амлодипина 0,5 мг/кг, инда-

памида 2 мг/кг на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0. Примечание.

** - р < 0,05 в сравнении с группой животных,

* - р < 0,05 в сравнении с группой интактных животных

14 И

Интактные ¡£) - Ь-КАМР. щ - Ь-Аргинин 30 мг/кг

Ь-Аргинин 200 мг/кг ^ - Алодипин 0,5 мг/кг ¡д - Индапамид 2 мг/кг

3. Изучение эндотелиопротективной активности сочетанного применения Ь-аргшшна и антагониста кальция амлодипина при Ь^АМЕ-индуцированнои модели дефицита N0 в эксперименте.

Сочетанное применение амлодипина (0,5 мг/кг) с Ь-аргннином (200 мг/кг) на фоне Ь^АМЕ-индуцированного дефицита оксида азота приводило к значительному снижению артериального давления, что не достигалось при монотерапии отдельно Ь-аргинином и амлодипином (рис. 5).

КЭД при сочетанном использовании Ь-аргинина и амлодипина составил 1,5±0,1, что отличается от монотерапии амлодипином - КЭД - 2,1 ±0,3 и приближается к показателям у интактных животных - КЭД - 1,1±0,1 и в 2,5 раза отличается от Ь^АМЕ-индуцированной патологии - КЭД - 5,4±0,6 (рис. 5).

При сочетанном использовании Ь-аргинина и амлодипина происходила нормализация суточного профиля давления - смена с нон-диппер на диппер тип (рис. 5)

Абсолютные значения максимального ЛЖД в ответ на введение адреналина у животных, получавших амлодипин с Ь-аргинином, составили -183,5 + 12,1, что меньше, чем у амлодипина - 201,3±14,4, и меньше, чем у Ь-аргинина - 201,6+12,3, при показателе у интактных - 199,2±8,3 и у животных Ь-МАМЕ-индуцировакной патологией - 247,3±4,8 мм рт.ст. (рис. 5). Аналогичная ситуация отмечалась при проведении пробы на нагрузку сопротивлением. У интактных животных показатель исчерпания миокардиального резерва составил - 83,6±7,7%, Ь-КЛМЕ-индуцированная патология - 66,0±5,5%, Ь-аргинин - 84,4±8,8%, сочетанное применение Ь-аргинина и амлодипина - 75,5±4,8% (рис. 5).

Концентрация нитрит-ионов (\'Ох) при сочетанном использовании амлодипина и Ь-аргинина оказалась выше, чем при монотерапии амлодипином (рис. 5).

Морфометрия диаметра кардиомиоцитов также показала преимущество комбинации амлодипина и Ь-аргинина по сравнению с монотерапией амлодипином. Диаметр миокардиоцитов составил в группе амлодипин + Ь-аргинин - 9,0, монотерапии амлодипином - 10,0, интактных - 9,1, животных с Ь^АМЕ-индуцированной патологией - 18,5 мкм (рис. 5).

Таким образом, сочетанное применение антагониста кальция амлодипина с донатора N0 Ь-аргинина выявило существенные преимущества по сравнению с монотерапией амлодипином по совокупности функциональных, биохимических и морфологических критериев, характеризующих выраженность и степень эндотелиальной дисфункции, а также сопутствующих ей признаков гипертрофии миокарда и ремоделирования сосудистого русла.

I - ИитшткЛ' L-NAME, ID- L-NAMb>»»wcvueii« O.J мс'кг IV-L* NA\№< V.-*pimm< 200 мгкг, v- 1>N ЛМК T * МЛОЛ ИПММ 0,5 МГКГ» L. t^vmwi 200 Mrtir

5,4*

m

Ш »

Ж ж

ж щ

ш

2,1*

кэд

2,5"

♦♦♦♦ ♦♦♦♦

АДп

НС

-И)гтагт»мс

1 1 L-NAME

0,5 мг/кг

■ — L-NAMC+l.-opmHmi 200 мг'кг - -ér — l.-NAME+ew/юдилнн 0,5 мг/кг+Ь-аргинин 200 мг/гг 66%" -1

10"

15"

20"

25"

200 180 160 140-»120 5.100 I во 60 40 20 О

Время

СрАД

- СрАд Интэктныв -СрАд L-Name

-СрАд L-Name+L-аргинин

- СрАд L-Name+амлодипин

-СрАд L-Name+L-аргинин+амлодипин

"114, Г

NOx

"107,9**'

61,2*

67,8*

97,6**

k »i«» л .I

ÍÍÍJJ

1

тгг

IB»

i

120

100

80

ч

60 4

*

40

20

0

Рисунок 5. Влияние комбинированного применения Ь-аргинина 200 мг/кг и амлодипина 0,5 мг/кг на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0.

Примечание. ** - р < 0,05 в сравнении с группой Ь-МЛМЕ животных,

* - р < 0,05 в сравнении с группой интактных животных.

ДМ

-18,5-

I

а

10,2*

10* ш

rV5 20 S-15 10

£3 - Интактные Е2 - L-NAME И - L-Аргинин 200 мг/кг

15 И - Амлодипин 0,5 ЕЭ - L-Аргинин 200 мг/кг + Амлодипин 0,5 мг/кг

4. Изучение эндотелиопротективной активности сочетанного применения Ь-аргинина и тиазидоподобного диуретика индапамида при LrNAME-lIHдyциpoвaннoй модели дефицита N0 в эксперименте.

Сочетанное применение Ь-аргинина (200 мг/кг) с тиазидоподобным диуретиком индапамидом (2 мг/кг) оказывало эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0 (рис. 6).

Так, при сочетанном применении индапамида с Ь-аргинином обнаружено положительное фармакодинамическое взаимодействие, что привело к снижению КЭД. У интактных животных КЭД составил 1,1±0,1, Ь-ЫАМЕ -5,4±0,б, Ь-аргинин и индапамид до 2,2±0,1 (рис. 6).

При сочетанном использовании Ь-аргинина и индапамида происходила нормализация суточного профиля давления - смена с нон-диппер на диппер тип.

В экспериментах на открытом сердце также обнаружена эффективность сочетанного использования Ь-аргинина с индапамидом по сравнению с монотерапией. Так, максимальные цифры ЛЖД при применении комбинации Ь-аргинина и индапамида в пробе на адренореактивность составили 226,9+5,2, тогда как отдельно индапамид 247,9±9,3, Ь-аргинин - 201,6+12,3, интактные -199,2±8,3, Ь-КАМЕ - 247,2±4,8 мм рт.ст. Аналогичная ситуация обнаружена при проведении пробы на нагрузку сопротивлением. У интактных животных показатель исчерпания миокардиального резерва составил - 83,6+7,7%, индапамида - 68,7±5,1%, Ь-аргинин - 84,4±8,8%, а их сочетания - 88,3+7,4%, тогда как животные с Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией - 66,0±5,5% (рис. 6).

В то же время концентрация нитрит-ионов (ЫОх) под влиянием комбинированного применения Ь-аргинина и индапамида увеличивалась в сравнении с монотерапией индапамидом (рис. 6).

Обращает на себя внимание, что Ь-аргинин значительно увеличивал' концентрацию нитрит-ионов ЫОх, тогда как индапамид не оказывал существенного влияния на данный показатель. Последнее позволяет предполагать, что именно Ь-аргинин оказывает влияние на предотвращение падения концентрации нитрит-ионов ЫОх в плазме лабораторных животных в условиях Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0 (рис. 6).

Функционально-биохимические показатели подтвердились результатами морфометрии кардиомиоцитов. Средний диаметр кардиомиоцитов животных, получающих комплексную терапию 13,0 мкм, что достоверно не отличалось от монотерапии индапамидом.

Таким образом, сочетанное использование тиазидоподобного диуретика индапамида и Ь-аргинина оказывало эндотелиопротективное действие на модели Ь-МАМЕ-индуцированного дефицита N0, выражающееся в снижении КЭД, а также предотвращении снижения нитрит-ионов (Ж)х) и динамики результатов нагрузочных проб и морфологических исследований. При этом наблюдалось снижение цифр артериального давления.

[ • L-NAStV, I

я J ЧГ'ю: rV-L-NAMh<L-

КЭД

3,3**

www 2,5"

www

WWWS ♦♦♦♦

www

■WW44*

•W4WV ♦♦♦♦

■WWWN

.WW4W - - *♦♦♦

АДр

lie

........•,....„......

► — LNAMFlH.-iprmmH 200 * br — L-NAMK ►инл»м««нд 2 мг'ит-'-ЬчргинШ! 200 м

20" 15"

250 200 150 100 50 0

-СрАд Мнтактные

- СрАд L-Name

- СрАд l-Name+L-аргинин

- СрАд L-Name+имдапамид

- СрАд L-NanTe+L-аргинин+индапамид

<$> о0

# ф ф tf <v v я

cP

NOx

"115,1*

N

61,2*

573*

.NN4W .V4WV .

I»»»'

83,7*

Рисунок 6. Влияние комбинированного применения L-аргинина 2 мг/кг и ! индапамида 2 мг/кг на I функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании

L-NAME-индуцированного дефицита NO.

Примечание. ** • р < 0,05 в сравнении с группой L-NAME животных,

* - р < 0,05 в сравнении с группой интактных животных

ЕЭ - Интактные S3 - L-NAMH Q - L-Аргинин 200 мг/кг

И - Индапамид 2 мг/кг Ш - L-Аргишш 200 мг/кг + Индапамид 2 мг/кг

выводы

1. Обнаружено изменение суточного профиля артериального давления с диппер на нон-диппер тип у крыс, получавших Ь-ЫАМЕ в течение 7 суток, что сопровождалось повышением адренореактивности, снижением суммарного количества стабильных метаболитов оксида азота и увеличением диаметра кардиомиоцитов. Комбинированное использование Ь-аргинина (200 мг/кг) с амлодипином 0,5 мг/кг, а также использование Ь-аргинина (200 мг/кг) с индапамидом 2 мг/кг приводило к нормализации суточного профиля.

2. Ь-аргинин в дозе 200 мг/кг однократно в сутки течение 7 дней проявлял выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь^АМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражалось в снижении КЭД до уровня интакгных животных, а также в полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов ]МОх. Результаты нагрузочных проб выявили предотвращение повышения адренореактивности. Ь-аргинин 200 мг/кг предотвращал увеличение поперечного диаметра кардиомиоцитов. Ь-аргинин 30 мг/кг также проявлял эндотелио- и кардиопротективиую активность, однако уступал Ь-аргинину 200 мг/кг. Монотерапия Ь-аргинином в изученных дозах не позволяла достичь целевых значений артериального давления.

3. Амлодипин 0,5 мг/кг проявлял эндотелиопротективное и кардиопротективное действие на модели Ь-МАМЕ-индуцированного дефицита N0 по совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей. Монотерапия амлодипином не достигала целевых значений артериального давления.

4. Индапамид 2,0 мг/кг проявлял эндотелиопротективное и кардиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0 и по совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей. Монотерапия индапамидом не достигала целевых значений АД.

5. Комбинированное использование Ь-аргинина (200 мг/кг) с амлодипином 0,5 мг/кг оказывало выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражалось в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) до уровня, близкого к интактным животным, а также в предотвращении снижения содержания нитрит-ионов МОх. Важно подчеркнуть, что при этом отмечалось существенное предотвращение развития гипертензии, что не достигалось при монотерапии отдельно Ь-аргинином и амлодипином.

Одновременно результаты нагрузочных проб выявили способность комбинации предотвращать повышение адренореактивности в большей степени, чем развитие скрытой сердечной недостаточности на фоне повышения реакции на реоксигенацию, что связано с гемодинамическим профилем механизма действия амлодипина как антагониста кальция. Морфологические исследования обнаружили предотвращение увеличения поперечного диаметра кардиомиоцитов под влиянием комбинации Ь-аргинина с амлодипином у животных с Ь-И А МЕ-индуцированной патологией такое же, как и при монотерапии препаратами.

6. Комбинированное использование Ь-аргинина (200 мг/кг) с индапамидом 2 мг/кг оказывало выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражалось в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) до уровня, приближающегося к интактным животным, а также в предотвращении снижения концентрации нитрит-ионов >Юх. При этом не достигались цифры артериального давления. Одновременно результаты нагрузочных проб выявили способность комбинации предотвращать повышение адренореактивности и развитие скрытой сердечной недостаточности на фоне повышения реакции на реоксигенацию. Морфологические исследования обнаружили предотвращение увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов под влиянием комбинации Ь-аргинина с индапамидом у животных с Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Методические подходы для количественной оценки развития эндотелиальной дисфункции при L-NAME-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте / М.В. Покровский, В.А. Малыхин, Т.Г. Покровская и др. // Кубанский науч. мед. вести. - 2006. - № 10 (91). -С. 72-77.

2. Исследование эндотелиопротективных дозозависимых эффектов L-аргинина / В.А. Малыхин, A.C. Белоус, Я.И. Залозных и др. // Университетская наука: Взгляд в будущее: сб. тр. 72-й науч. конф. КГМУ и сес. Центрально-Черноземного науч. центра РАМН: в 3 т. - Курск: КГМУ, 2007. - Т. 3. - С. 177-178.

3. Применение L-аргинина в комплексе с амлодипином и индапамидом при экспериментальном моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции / В.И. Кочкаров, В.А. Малыхин, Т.Г.Покровская и др. // Кубанский науч. мед. вести. - 2007. - № 1-2 (94-95).-С. 52-56.

4. Применение L-аргинина в комплексе с амлодипином при экспериментальном моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции / В.А. Малыхин, A.C. Белоус, Я.И. Залозных и др. // Университетская наука: Взгляд в будущее, сб. тр. 72-й науч. конф. КГМУ и сес. Центрально-Черноземного науч. центра РАМН: в 3 т. -Курск: КГМУ, 2007. - Т. 3. - С. 171-172.

5. Применение L-аргинина в комплексе с индапамидом при экспериментальном моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции / В.А. Малыхин, A.C. Белоус, Я.И. Залозных и др. // Университетская наука: Взгляд в будущее, сб. тр. 72-й науч. конф. КГМУ и сес. Центрально-Черноземного науч. центра РАМН: в 3 т. -Курск: КГМУ, 2007. - Т. 3. - С. 178-179.

6. Принципы фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции / Т.Г. Покровская, В.А. Малыхин, М.В. Покровский и др. // Кубанский науч. мед. вестн. - 2007. - № 1-2 (94-95). - С. 146-149.

7. Комбинирование амлодипина и L-аргинина при коррекции эндотелиальной дисфункции в эксперименте / В.А. Малыхин, М.В. Малыхина, Т.Г. Покровская и др. // Фармация из века в век: тр. научно-практической конф. - СПб., 2008. - Ч. 5. - С. 108 -110.

8. Коррекция эндотелиальной дисфункции комбинацией небиволола и L-аргинина / В.А. Малыхин, ЯМ. Залозных, Т.Г. Покровская и др. И Фармация из века в век: тр. научно-практической конф. - СПб., 2008. -4.5.-С. 105-108.

9. Малыхин, В.А. Эффекты сочетанного применения L-аргинина в комплексе с амлодипином и индапамидом при L-NAME индуцированном дефиците оксида азота / В.А. Малыхин // Материалы III Всерос. конф. молодых ученых, организован. Воронежским гос. мед. акад. им. H.H. Бурденко и Курским гос. мед. ун-том. - Воронеж, 2009. - Т. 2. -С. 247-251.

10. Сравнительное изучение потенциальных эндотелийпротекторов и препарата импаза при моделировании дефицита окида азота / М.В.Покровский, В.А. Малыхин, В.И. Кочкаров и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - М,, 2009. - № 8. - С. 154-157.

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 12.03.2009 г. Подписано в печать 13.03.2009 г. Формат 30x42% Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 68А. Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.

В современном мире, особенно в развитых странах, артериальная ги-пертензия (АГ) является одним из основных факторов, повышающих инва-лидизацию и смертность за счет таких грозных осложнений, как инфаркт миокарда, сердечная недостаточность и инсульт (Бойцов С.А., 2005; Гогин Е.Е., 2002). Прогноз и терапевтические последствия изменений АД днем и ночью до настоящего времени до конца не изучены. Анализируя данные литературы, становится очевидным, что показатели суточного профиля АД, т.е. среднесуточные, среднедневные, средненочные, индексы нагрузки давлением, более информативны для оценки степени тяжести артериальной гипер-тензии, чем данные разовых измерений АД (Харченко О.О., 2003). Было высказано предположение, что у больных с артериальной гипертензией, у которых не отмечено ночное снижение АД, высокий риск возникновения инсульта. Результаты исследований JI.H. Задорожной и соавторов, проведенных в 2000 г., свидетельствуют, что при повышенном АД ночью у больных более выражено поражение органов-мишеней (гипертрофия миокарда, сердечная недостаточность, ретинопатия и др.). В ходе длительных наблюдений (более 7 лет) было установлено, что у больных с нарушенным суточным ритмом («нон-диппер», «найт-пикер», «гипер-диппер»), особенно у женщин, частота развития сердечно-сосудистых осложнений достоверно выше (Mancia G. et al., 2004).

Р. Verdecchia и соавторы в ходе исследований, проведенных до 2008 г., установили, что уровень смертности от сердечно-сосудистых заболеваний ниже у больных, у которых при суточном МАД не выявлено повышение среднего АД, а также то, что этот показатель повышается у больных, у которых ночное АД выше дневного («найт-пикеры») или недостаточно снижено («нон-дипперы»).

В России распространенность АГ среди взрослого населения превышает 30%; наша страна занимает одно из первых мест в Европе по смертности от инсультов и ИБС (Беленков Ю.Н., 2005; Гавриков H.A., 2001).

Одной из основных причин АГ является эндотелиальная дисфункция (ЭД) и в первую очередь - нарушение релаксационных свойств эндотелия (Остроумова О.С., 2005; Зодионченко B.C., 2002). Впервые о самостоятельной роли сосудистого эндотелия в регуляции сосудистого тонуса было заявлено в статье Furchgott и Zawadzki, опубликованной в журнале «Nature» в 1980 г.

Основным механизмом, лежащим в основе ЭД, является снижение образования и биодоступности оксида азота (NO) при одновременном повышении уровня супероксиданиона и продукции мощных вазоконстрикторов (Марков Х.М., 2005).

Таким образом, дисфункция эндотелия проявляется дисбалансом между медиаторами, обеспечивающими в норме оптимальное течение всех эндо-телийзависимых процессов (Небиеридзе Д.В., 2005).

Патогенез сердечно-сосудистых заболеваний, в частности АГ, вероятно, связан с нарушением баланса эндотелиальных субстанций. Основное значение в развитии ЭД имеют свободнорадикальное окисление, продукция мощных вазоконстрикторов (эндопероксидов, эндотелинов), а также цитоки-нов, которые подавляют продукцию NO (Марков Х.М., 2005; Heitsch Н., Brovkovych S., Malinski Т., Wiemer G., 2001; Bautista L.E., 2003; Wyatt A.W., 2004.)

Эндотелий секретирует мощные вазоактивные вещества: вазодилатато-ры (NO, эндотелиальный гиперполяризующий фактор, простациклин) и вазо-констрикторы (AT II, эндотелии, свободные радикалы недоокисленных жирных кислот, простагландин Б2альфа и тромбоксан А2) (Агеев Ф.Т., 2001; Бойцов С.А., 2005; Кательницкая Л.И., 2005). Наиболее важным вазодилата-тором считается NO.

NO синтезируется из L-аргинина под влиянием эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) путем присоединения молекулярного кислорода к конечному атому азота гуанидиновой группы L-аргинина (Граник В.Г., 2004).

Изучение состояния сосудистой стенки и поиск возможностей целенаправленного лечения ЭД является важной клинико-экспериментальной задачей, но вместе с тем в настоящее время не существует препаратов для специфической коррекции эндотелиальной дисфункции.

В настоящее время одним из наиболее осуществимых методов повышения уровня N0, устранения его дефицита и вызываемой этим дефицитом дисфункции эндотелия сосудов является введение в организм Ь-аргинина. Однако его роль как обязательного эндотелиотропного аддитива к базисной антигипертензивной терапии не достаточно определена и изучена.

В связи с вышеизложенным являлось актуальным изучение эндотелио-протективных свойств Ь-аргинина с гипотензивными препаратами, обладающими эндотелиотропной активностью (блокатором кальциевых каналов дигидропиридинового ряда амлодипином и тиазидоподобным диуретиком -индапамидом) при экспериментальном дефиците оксида азота.

В настоящее время достаточно большое внимание уделяется Ь-аргинину как предшественнику N0, а вот изучение комбинации Ь-аргинина с гипотензивными препаратами, обладающими эндотелиотропностью (блокатором кальциевых каналов дигидропиридинового ряда амлодипином и тиазидоподобным диуретиком - индапамидом), при экспериментальном моделировании эндотелиальной дисфункции в литературе нами не обнаружено.

Работа выполнена по инициативному плану, включена в программу «Изучение патологических состояний сердечно-сосудистой системы. Разработка современных медицинских технологий профилактики, диагностики и лечения болезней системы кровообращения» на 2006-2010 гг. Номер государственной регистрации темы - 01.2.00 950904

Цель исследования: провести оценку эндотелиопротективного эффекта Ь-аргинина и его комбинаций с амлодипином и индапамидом в эксперименте.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи исследования:

1. Изучить влияние Ь-агринина, амлодипина, индапамида и их комбинаций на суточный профиль давления.

2. Изучить эндотелиопротективную активность Ь-аргинина при Ь-КАМЕ-индуцированной модели дефицита N0.

3. Изучить эндотелиопротективную активность блокатора кальциевых каналов дигидропиридинового ряда амлодипина при Ь-ИАМЕ-индуцированной модели дефицита N0.

4. Изучить эндотелиопротективную активность тиазидоподобного диуретика индапамида при Ь-МАМЕ-индуцированной модели дефицита N0.

5. Изучить эндотелиопротективную активность сочетанного применения Ь-аргинина и блокатора кальциевых каналов дигидропиридинового ряда амлодипина при Ь-МАМЕ-индуцированной модели дефицита N0.

6. Изучить эндотелиопротективную активность сочетанного применения Ь-аргинина и тиазидоподобного диуретика индапамида при Ь-ЫАМЕ-индуцированной модели дефицита N0.

Научная новизна исследования. В работе впервые проведено суточное мониторирование артериального давления при моделировании Ь-МАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс. Продемонстрировано что у интактных крыс тип суточного профиля артериального давления пред-ставлет из себя диппер тип, у крыс с Ь-КАМЕ-индуцированной патологией -нон-диппер тип. Установлено что монотерапия амлодипином и индапамидом не приводит к нормализации суточного профиля артериального давления, а комбинированное использование данных препаратов с Ь-аргинином нормализует суточный профиль давления и приводит его к диппер типу.

В работе показано, что Ь-аргинин в дозах 30 и 200 мг/кг (однократно в сутки внутрижелудочно в течение 7 дней) оказывает дозозависимое эндоте-лиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированной МО-дефицитной ЭД. Амлодипин 0,5 мг/кг и индапамид 2 мг/кг (однократно в сутки внутрижелудочно в течение 7 дней) как монотерапия обладают эндоте-лиопротективными эффектами на выбранной модели дефицита оксида азота.

Сочетанное использование L-аргинина с блокатором кальциевых каналов ди-гидропиридинового ряда амлодипином и тиазидоподобным диуретиком ин-дапамидом оказывает аддитивное эндотелиопротективное действие.

Практическая значимость. В работе обоснована эффективность соче-танного применения L-аргинина, антагониста кальция дигидропиридинового ряда амлодипина и тиазидоподобного диуретика - индапамида для коррекции L-NAME-индуцированной NO-дефицитной ЭД в эксперименте. Показано, что их сочетанное использование нормализует суточный профиль артериального давления переводя его из нон-диппер типа в диппер. Кроме того позволяет нормализовать изменение соотношения сосудистых реакций на аце-тилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелий-независимая вазодилатация) с уменьшением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в 5 раз, предотвратить снижение показателей биохимических маркеров (Total NO), а также добиться положительной динамики мор-фофукциональных показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр мио-кардиоцитов и прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением, диаметр миокардиоцитов и адренореактивности, соотношение интима-медиа и т.д.).

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания L-аргинина в комбинации с амлодипином и индапами-дом при артериальной гипертензии.

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования, касающиеся антигипертензивной и эндотелиопро-тективной активности индапамида «Индапамид» производства ОАО «Фарм-стандарт-Лексредства», включены в состав документов, поданных на регистрацию в МЗ РФ (РУ № 000084).

Материалы диссертационного исследования, касающиеся антигипертензивной и эндотелиопротективной активности амлодипина «Амлодипин», индапамида «Индапамид» производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», включены в состав документов, поданных на регистрацию в МЗ РФ (РУ № 000084).

Результаты работы используются в работе кардиологического отделения МУЗ «Городская больница скорой медицинской помощи», кардиологического отделения МУЗ «Городская больница № 1» г. Курска и в лекционных курсах кафедры фармакологии КГМУ, кафедры фармакологии БелГУ.

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых КГМУ, 2007 г., XV Национальном конгрессе «Человек и лекарство», XIII Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, II Национальном конгрессе терапевтов, III Всероссийской конференции молодых ученых, организованной Воронежской государственной медицинской академией им. H.H. Бурденко и Курским государственным медицинским университетом. Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии, анатомии человека, гистологии, внутренних болезней № 2, НИИ экологической медицины КГМУ. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Положения, выносимые на защиту

Положения, выносимые на защиту.

1. L-аргинин в дозах 30 и 200 мг/кг однократно в сутки течение 7 дней внутрижелудочно оказывает дозозависимое эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированной NO-дефицитной ЭД. При монотерапии L-аргинином, амлодипином и индапамидом нормализации суточного профиля артериального давления не происходило. Амлодипин 0,5 мг/кг и индапа-мид 2 мг/кг как монотерапия обладали эндотелиопротективными эффектами на выбранной модели патологии,

2. Совместное использование L-аргинина (200 мг/кг) с амлодипином 0,5 мг/кг нормализует суточный профиль артериального давления, оказывает эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO, выражающееся в снижении КЭД, положительной динамики результатов нагрузочных проб и морфологических исследований, а также в предотвращении снижения концентрации нитрит-ионов ЫОх,. При этом цифры артериального давления приближались к целевым.

3. Совместное использование Ь-аргинина (200 мг/кг) с индапамидом 2 мг/кг нормализует суточный профиль артериального давления, оказывает эндотелиопротективное действие на модели Ь-1ЧАМЕ-индуцированного дефицита N0, выражающееся в снижении КЭД, положительной динамики результатов нагрузочных проб и морфологических исследований, а также в предотвращении снижения концентрации нитрит-ионов Ж)х. При этом отмечается положительное фармакодинамическое взаимодействие Ь-аргинина и индапамида в отношении эндотелио- и кардиопротективного действия при Ь-МАМЕ-индуцированном дефиците N0.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка использованной литературы, включающего 315 источник, из них 144 - отечественных и 171 - зарубежных авторов. Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста, содержит таблиц - 18, рисунков - 37, схем - 1.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено изменение суточного профиля артериального давления с диппер на нон-диппер тип у крыс, получавших Ь-КАМЕ в течение 7 суток, что сопровождалось повышением адренореактивности, снижением суммарного количества стабильных метаболитов оксида азота и увеличением диаметра кардиомиоцитов. Комбинированное использование Ь-аргинина (200 мг/кг) с амлодипином 0,5 мг/кг, а также использование Ь-аргинина (200 мг/кг) с индапамидом 2 мг/кг приводило к нормализации суточного профиля.

2. Ь-аргинин в дозе 200 мг/кг однократно в сутки течение 7 дней проявлял выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражалось в снижении КЭД до уровня интактных животных, а также в полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов 1\Юх. Результаты нагрузочных проб выявили предотвращение повышения адренореактивности. Ь-аргинин 200 мг/кг предотвращал увеличение поперечного диаметра кардиомиоцитов. Ь-аргинин 30 мг/кг также проявлял эндотелио- и кардиопротективную активность, однако уступал Ь-аргинину 200 мг/кг. Монотерапия Ь-аргинином в изученных дозах не позволяла достичь целевых значений артериального давления.

3. Амлодипин 0,5 мг/кг проявлял эндотелиопротективное и кардиопро-тективное действие на модели Ь-МАМЕ-индуцированного дефицита N0 по совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей. Монотерапия амлодипином не достигала целевых значений артериального давления.

4. Индапамид 2,0 мг/кг проявлял эндотелиопротективное и кардиопро-тективное действие на модели Ь-КАМЕ-индуцированного дефицита N0 и по совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей. Монотерапия индапамидом не достигала целевых значений АД.

5. Комбинированное использование Ь-аргинина (200 мг/кг) с амлодипином 0,5 мг/кг оказывало выраженное эндотелио- и кардиопротективное действие на модели Ь-МАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражалось в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) до уровня, близкого к интактным животным, а также в предотвращении снижения содержания нитрит-ионов ИОх. Важно подчеркнуть, что при этом отмечалось существенное предотвращение развития гипертензии, что не достигалось при монотерапии отдельно Ь-аргинином и амлодипином.

Одновременно результаты нагрузочных проб выявили способность комбинации предотвращать повышение адренореактивности в большей степени, чем развитие скрытой сердечной недостаточности на фоне повышения реакции на реоксигенацию, что связано с гемодинамическим профилем механизма действия амлодипина, как антагониста кальция. Морфологические исследования обнаружили предотвращение увеличения поперечного диаметра кардиомиоцитов под влиянием комбинации Ь-аргинина с амлодипином у животных с Ь-МАМЕ-индуцированной патологией такое же как и при монотерапии препаратами.

6. Комбинированное использование Ь-аргинина (200 мг/кг) с индапа-мидом 2 мг/кг оказывало выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь-КАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражалось в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) до уровня, приближающегося к интактным животным, а также в предотвращении снижения концентрации нитрит-ионов ЫОх. При этом не достигались цифры артериального давления. Одновременно результаты нагрузочных проб выявили способность комбинации предотвращать повышение адренореактивности и развитие скрытой сердечной недостаточности на фоне повышения реакции на реоксигенацию. Морфологические исследования обнаружили предотвращение увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов под влиянием комбинации Ь-аргинина с индапамидом у животных с Ь-КАМЕ-индуцированной патологией.

121

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение эндотелиальной дисфункции, вызванной моделированием дефицита оксида азота в эксперименте, требует выбора патофизиологической модели с созданием наиболее приближенных условий к клиническим. Принимая этот факт во внимание, установление взаимосвязи фармакологических изысканий с формированием объективной методологии оценки, явилось на-чальныым этапом наших исследований, который был посвящен разработке методологических подходов к экспериментальному моделированию дефицита оксида азота.

Так, в ходе наших исследований проведенных в эксперименте на белых крысах линии Wistar был разработан комплекс методических подходов, включающий моделирование патологии, и последующую оценку ее физиологическими, биохимическими и морфологическими методами.

Эндотелиальную дисфункцию, вызванную дефицитом оксида азота моделировали ежедневным в/б введением в течение 7 дней крысам-самцам ингибитора фермента eNOS N-нитро-Ь-аргинин метилового эфира (L-NAME-индуцированная ЭД).

Механизм ингибирования выработки NO в случае, использования L-NAME заключается в конкурентном ингибировании фермента eNOS аналогом L-аргинина — L-NNA. L-NAME фактически является пролекарством: в организме этот эфир гидролизуется с участием специальных ферментов — эстераз, давая активный ингибитор — L-NNA. В свою очередь дефицит сосудистого N0 вызывает существенные изменения функций системы кровообращения в целом. Эти нарушения включают: снижение эффектов эндотелий-зависимых вазодилататоров и повышение вазоконстрикторных влияний, рост АД, нарушения системной и региональной гемодинамики, функций сердца, увеличение экспрессии адгезивных молекул эндотелия, агрегации тромбоцитов; прилипание их и лейкоцитов к сосудистой стенке; пролиферацию и миграцию гладкомышечных клеток с образованием неоинтимы, синтез внеклеточного матрикса и др. [27, 200, 213].

Данные результаты подтверждают и наши исследования. В/б введение в течение 7 дней крысам-самцам ингибитора фермента еТЧОЗ Ь-МАМЕ приводит к выраженной АГ и эндотелиальной дисфункции. Соответственно АД у животных с патологией составило САД - 190,3 ± 6,7, ДАД - 145,0 ± 3,9 мм рт.ст., тогда как у интактных животных САД - 137,7 ±3,7, ДАД - 101,9 ± 4,3 мм рт.ст.

По данным литературы такой умеренно пролонгированный среднедо-зовый режим введения Ь-ЫАМЕ приводит к провоспалительным (увеличение адгезивных и инфильтративных эффектов моноцитов) и пролиферативным (появление пролиферирующих антигенпозитивных ядерных клеток) изменениям сосудистого русла, характерных для патофизиологических проявлений при развитии раннего первичного атеросклеротического процесса [31, 39]. При этом повышается активность АПФ и АТ I рецепторов, приводящая к повышению активности АТ II [29, 30, 32], повышается экспрессия хемокинов, хемотаксических пептидов моноцитов [31, 33], адгезивных молекул эндотелия, транформирующего фактора роста [34, 35, 36]. Кроме того, повышается продукция супероксид-анионов и активность факторов транскрипции (нукле-арный фактор каппа В, активатор плазминогена 1) [37, 38, 40]. Введение Ь-МАМЕ снижало продукцию N0* (общее количество нитратов и нитритов) в сегменте аорты, а совместное введение Ь-аргинина с Ь-ЫАМЕ восстанавливало содержание 1\ЮХ до уровня интактных животных. Кроме того, Ь-аргинин препятствует адгезии моноцитов, одним из механизмов данного эффекта является непосредственное, а также обусловленное аутокринными и паракрин-ными эффектами Ь-аргинина снижение хемотаксической активности эндоте-лиального слоя [164, 195]. В литературе имеются данные о снижении под влиянием Ь-аргинина образования провоспалительных цитокинов - интер-лейкина-1(3, интерлейкина-6 и фактора некроза опухоли (ТЫБ-а) и металло-протеаз, активированных МБ-кВ на модели культуры мышечных клеток мышей [190]. Таким образом, дополнительное введение Ь-аргинина приводит к нормализации и модулированию каскадных провоспалительных иммунологических ответов, возникающих при введении блокатора синтеза оксида азота L-NAME, аналогичных развитию первичного раннего атеросклероза доклинической фазы развития.

Последнее время в исследованиях причин развития и прогрессирования сердечно-сосудитых заболеваний обращено к асимметричному диметиларги-нину (АДМА), названного новым маркером и фактором риска развития и прогрессирования эндотелиальной дисфункции и атеросклероза

Vallance и др. [148] впервые описали ассиметричный диметиларгинин (ADMA) в качестве эндогенного ингибитора синтазы окиси азота (NOS) в 1992 году. С этого времени роль данной молекулы в процессе регуляции эн-дотелиального синтеза окиси азота привлекает повышенное внимание, так как ассиметричный диметиларгинин (ADMA) является эндогенным регулятором эндотелиальной функции у людей.

Экспериментальное моделирование с введением L-NAME идеологически сопоставима с новой концепцией риска развития сердечно-сосудистых заболеваний в клинической ситуациии, связанной с увеличением в плазме крови асиметричного диметиларгинина (АДМА).

Для оценки степени развития эндотелиальной дисфункции в ходе проведенных нами исследований был выявлен показатель, названный нами КЭД® (коэффициент эндотелиальной дисфункции), являющийся, отношением площади эндотелийнезависимой вазодилатации (ЭНВД) восстановления АД в ответ на введение нитропруссида (НП) к площади эндотелийзависимой вазодилатации (ЭЗВД) восстановления АД в ответ на введение ацетилхолина (АХ). На наш взгляд именно КЭД® является объективным показателем ЭД так, как с одной стороны учитывает снижение вазодилатационного ответа на ацетилхолин, а с другой стороны учитывает увеличение ответа вазодилатации на нитропруссид, который связан с гиперреактивностью точек приложения эндогенного NO в результате его длительного дефицита.

Степень развития эндотелиальной дисфункции выявленная с помощью демонстрировало увеличение данного показателя у животных с блокадой NO-синтазы - 5,4, по сравнению с интактными животными - 1,1. Описанный симптомокомплекс клинически можно экстраполировать на злокачественную гипертензию.

L-NAME- индуцированная модель патологии приводит к повышению показателей сократимости миокарда. ЛЖД, +dp/dt, -dp/dt. Значения были достоверно выше соответствующих значений интактных животных, что, вероятно, обусловлено гипертрофией левого желудочка. Кроме того, проба на адренореактивность, нагрузка сопротивлением на 25 секунде пережатия аорты и постгипоксическая реактивность миокарда сопровождались достоверно более высокими значениями ЛЖД и скоростных показателей, что также согласуется с данными по эндотелиальной дисфункции [178, 187, 194].

Результаты определения биохимических маркеров ЭД подтвердили результаты физиологических методов. Так NO-продуцирующая функция эндотелия исследованная на основании данных увеличения экспрессии e-NOS (в процентах от контроля) и содержания нитрит-ионов NOx обнаружила, что моделирование L-NAME-индуцированного дефицита NO приводит к резкому снижению экспрессии e-NOS и содержания нитрит-ионов (NOx).

Также, результаты гистологических исследований показали, что в обоих случаях присутствует гипертрофия миокардиоцитов, утолщение мышечного слоя сосудистой стенки и спазм артериол, наиболее выраженный в почечных артериях, а также «вздыбливание» эндотелиоцитов.

Данный комплекс методических подходов, использованный нами с применением, функциональных, биохимических и морфологических методов, связанный с развитием дефицита NO, вследствие блокады NO-синтазы,позволил нам в достаточной степени объективно оценивать состояние функции эндотелия при моделировании ЭД, и последующей ее фармакологической коррекции.

Сравнительные исследования L-аргинина с сердечно-сосудистыми препаратами, обладающими доказанными эндотелиопротективными свойствами, в частности с блокатором кальциевых каналов дигидропиридинового ряда амлодипином и тиазидоподобным диуретиком - индапамидом выявили в разной степени эндотелио- и кардиопротективные эффекты у всех изучаемых препаратов.

Ь-аргинин при Ь-ГЧАМЕ-индуцированном дефиците N0 выявил дозо-зависимое снижение КЭД® (2,7±0,1 при ЗОмг/кг и 2,5±0,1 при 200 мг/кг), приближая его значение таковому у интактных животных, а так же снижение значений АД при Ь-МАМЕ-индуцированной патологии (САД = 177,6±9,6 мм рт. ст, ДАД = 140,1±6,4 мм рт. ст). Результаты биохимических проб обнаружили полное предотвращение снижения содержания нитрит-ионов Ж)х.

Механизмы реализации данных эффектов Ь-аргинина, учитывая вышеизложенное, по-видимому, связано с тем, что Ь-аргинин увеличивает синтез N0 в эндотелиальных клетках, за счет конкурентного вытеснения Ь-ЫАМЕ из связи с ферментом еТЧОБ. Возможным механизмом объясняющим восстановление активности нитроксидергической системы являются данные о преодолении сниженной доступности внутриклеточного пула Ь-аргинина при введение дополнительного количества его извне («парадокс Ь-аргинина»), возникающего при долгосрочном воздействии (в нашем случае при гипоэст-рогении). Кроме того, следует иметь в виду, ряд других общебиологических свойств Ь-аргинина (помимо его роли в качестве субстрата для еЖ)8), оказывающих существенное влияние на деятельность сердечно-сосудистой системы в норме и при патологии. Как щелочная аминокислота Ь-аргинин может способствовать деполяризации мембран ЭК и регулировать рН в этих клетках, а также рН крови [20], обеспечивая электрокинетическое отталкивание отрицательно заряженных эритроцитов. Как регулятор связывания макромолекул с клетками крови Ь-аргинин в высоких концентрациях снижает вязкость крови [217].

Следует отметить и другие возможные полезные корригирующие эффекты Ь-аргинина возможных метаболических нарушений, возникающих при гипоэстрогенном состоянии. Как стимулятор секреции инсулина, гормона роста, глюкагона и пролактина Ь-аргинин участвует в регуляции участвует в регуляции метаболизма глюкозы, белков и липидов [31]. Введение Ь-аргинина людям с толерантностью к инсулину и вызываемой ею ограниченной вазодилатацией восстанавливает эти параметры [151]. Дисфункцию эндотелия, связанную с дефицитом ЫОу больных с ожирением, также удаётся устранить с помощью Ь-аргинина .

Результаты миокардиальных нагрузочных проб, проводимых в нашем исследовании, выявили предотвращение повышения адренореактивности и снижения миокардиального резерва на фоне повышения прироста сократимости миокарда при проведении гипоксической пробы. Морфологические исследования миокардиоцитов обнаружили предотвращение под влиянием Ь-аргинина увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов у животных с моделированием дефицита N0 введением экзогенного блокатора еИ08 Ь-КАМЕ.

Кардиопротективные эффекты Ь-аргинина опосредованно связаны, очевидно, с предотвращением нарушений синтеза оксида азота, возникающего в результате острой или хронической гипоксии. В механизме реализации этого явления имеют значение: предотвращение инактивации N0 супероксидным радикалом, особенно в присутствии окисленных липопротеинов, преодоление обратимой связи е>Ю8 с кавеолином, конкурентное ингибиро-вание с накапливающимся в крови и клетках АЭМА, что наблюдалось в эксперименте у кроликов с искусственной гиперхолестеринемией и у больных атеросклерозом [154, 156].

Профилактическое введение Ь-аргинина уменьшает размер ишемиче-ско-репефузионного повреждения миокарда [10], увеличивает силу изометрических сокращений кардиомиоцитов при моделировании эндотелиальной дисфункции [3]. Ре1^:Ёо Я.Э. (2007) представляя интересные данные о механизме транспорта Ь-аргинина в миокардиоциты, доказывая его независи | | ^ | ^ | мость от содержания N3" , К" , Са" , и Mg*' и подтверждая основное значение САТ-2А транспортной системы (у ), высказывает гипотезу о весомой кардиопротективной роли L-аргинина при катаболических нарушениях, проявляющейся при повышении уровня L-аргинина в плазме крови [210].

Использование L-аргинина нормализует эндотелийзависимую вазоре-лаксацию и ангиогенный ответ при введении сосудистого фактора роста (VEGF), фактора роста фибробластов на модели хронической миокардиаль-ной ишемии у лабораторных свиней при моделировании холестеролиндуци-рованной эндотелиальной дисфункции. Авторы подчёркивают перспективность использования такой комбинированной терапии при лечении выраженной стадии заболеваний коронарных сосудов [171]. Использование врутри-венного введения L-аргинина восстанавливает эндотелиальную дисфункцию и нормализовывало циркадность колебаний артериального давления у молодых реципиентов при пересадке сердца [174]. Таким образом, принимая во внимание вышеизложенное, имеются все обоснования ожидать от комбинации L-аргинина с другими препаратами, имеющие доказанные эндотелио- и кардиопротективные эффекты аддитивного эффекта на показатели функции эндотелия и миокарда.

Эти предположения подтверждаются данными нашего исследования. Результаты изучения основных антигипертензивных препаратов, выявили в достаточной степени, как и L-аргинин эндотелио- и кардиопротективную активность на моделях L-NAME-индуцированной патологии, что выражалось в снижении КЭД® предотвращении снижения содержания нитрит-ионов NOx. Одновременно результаты нагрузочных проб выявили предотвращение повышения адренореактивности и развития скрытой сердечной недостаточности. Морфологические исследования миокардиоцитов обнаружили предотвращение под действием препаратов увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов.

Полученные результаты подтверждают существующие данные о эндо-телипротективном действии дигидропиридоновых антагонистов кальция и тиазидоподобных диуретиков.

Антагонисты кальция (АК) дигидропиридинового ряда (нифедипин, амлодипин, лацидипин, пранидипин, фелодипин) в эксперименте и в клинических исследованиях улучшают эндотелийзависимую вазодилатацию за счет увеличения уровня NO [1, 4, 5, 11, 15, 16, 17, 36, 168]. Выявлено несколько механизмов усиления высвобождения NO на фоне лечения АК. Пранидипин достоверно увеличивал концентрацию цГМФ в ГМК, культивируемых совместно с эндотелиальными клетками, не влиял на базальную экспрессию эндотелиальной NO-синтазы в эндотелиальных клетках и не оказывал эффекта в присутствии ингибитора NO-синтазы. Он также повышал активность супероксиддисмутазы в эндотелиальных клетках, что блокировало разрушение NO. Таким образом, основными механизмами повышения уровня NO являются антиоксидантное действие АК, увеличение активности супероксиддисмутазы, предупреждение деградации NO [45, 46, 47, 198]. В экспериментах было показано, что лацидипин увеличивает уровень эндотелиальной NO-синтазы в ткани аорты [188, 221].

Можно утверждать, что антиатеросклеротические (усиление гидролиза холестерина, снижение внутриклеточной аккумуляции липидов), антипроли-феративные (подавление миграции и пролиферации ГМК и макрофагов) и антиагрегационные свойства АК дигидропиридинового ряда обусловлены их влиянием на NO.

Кроме того, АК оказывают ангиопротективный эффект, обусловленный снижением тока Са2+ через L-каналы, торможением агрегации тромбоцитов, уменьшением адгезии моноцитов и пролиферации ГМК, инактивацией эндо-телина. АК также ингибируют экспрессию молекул адгезии VCAM-1 и ICAM-1 [5, 6, 11, 14, 33, 36, 45, 153].

Индапамид, помимо диуретического действия оказывает прямое вазо-дилатирующее действие за счет своих антиоксидантных свойств, повышая биодоступность NO, уменьшая его разрушение [203].

По результатам экспериментальных данных, индапамид вызывает регрессию гипертрофии миокарда, обусловленную перегрузкой давлением за счет снижения активности АПФ в плазме крови и миокарде с уменьшением активности шРНК АПФ в миокарде и уровня альдостерона в плазме крови [169]. Экспериментальные данные свидетельствуют также о способностях индапамида блокировать потенциалозависимые кальциевые каналы, что сопровождается уменьшением входа в клетку ионов кальция и высвобождением его из эндоплазматической сети в ответ на введение ангиотензина II [170].

Однако использование исследуемых препаратов на модели с Ь-ЫАМЕ-индуцированной артериальной гипертензии ни в одном случае не достигали значений по совокупности критериев оценки (АД, КЭД® и др.) ЭД у интакт-ных животных. Следовательно, не могут рассматриваться в виде монотерапии.

Сочетанное применение Ь-аргинина с амлодипином и индапамидом оказывало эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, что выражалось в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД®) до уровня, близкого к интактным животным, а также в предотвращении снижения содержания нитрит-ионов ЫОх. При этом отмечалось существенное предотвращение развития гипертензии в сравнении с монотерапией этими препаратами.

Одновременно результаты нагрузочных проб выявили способность комбинаций в большей степени предотвращать повышение адренореактивно-сти и развитие скрытой сердечной недостаточности. Морфологические исследования миокардиоцитов обнаружили предотвращение под влиянием комбинаций Ь-аргинина с антигипертензивными препаратами поперечного диаметра миокардиоцитов у животных с патологией.

Очевидно, положительное фармакодинамическое взаимодействие со-четанного применения Ь-аргинина с антигипертензивными препаратами связано с их разными точками приложения действия.

Амлодипин по-видимому предупреждает деградацию N0 за счет увеличения активности супероксиддисмутазы [45, 46, 47]. Возможно, увеличивает уровень эндотелиальной ЫО-синтазы [188, 221]. Кроме того, амлодипин оказывают ангиопротективный эффект, обусловленный снижением тока Са2+ через Ъ-каналы, торможением агрегации тромбоцитов, уменьшением адгезии моноцитов и пролиферации ГМК, инактивацией эндотелина. Также ингиби-рует экспрессию молекул адгезии УСАМ-1 и 1САМ-1 [5, 6, 11, 14] [153].

Индапамид, помимо диуретического действия оказывает прямое вазо-дилатирующее действие за счет своих антиоксидантных свойств, повышая биодоступность N0, уменьшая его разрушение [203]. Кроме того, в плазме крови и миокарде с уменьшает активность тРНК АПФ и уровень альдосте-рона в плазме крови [169].

Также возможно, Ъ-аргинин при длительном применении предотвращает развитие окислительного стресса, увеличение образования АГ)МА, аль-достерона и развития метаболических изменений, развивающейся при данной патологии.

Результаты исследований К. Zweiker и соавторов, проведенных в 1994 г., свидетельствуют, что при повышенном АД ночью у больных более выражено поражение органов-мишеней (гипертрофия миокарда, сердечная недостаточность, ретинопатия и др.). В ходе длительных наблюдений (более 7 лет) было установлено, что у больных с нарушенным суточным ритмом («нон-дипперы», «найт-пикеры», «гипер-дипперы»), особенно у женщин, частота развития сердечно-сосудистых осложнений достоверно выше (Мапс1а О.е! а1., 1997). Р. УеМессЫа и соавторы в ходе исследований, проведенных до 1994 г., установили, что уровень смертности от сердечно-сосудистых заболеваний ниже у больных, у которых при суточном МАД не выявлено повышение среднего АД, а также то, что этот показатель повышается у больных, у которых ночное АД выше дневного («найт-пикеры») или недостаточно снижено («нон-дипперы»). Следвательно, приводя суточный ритм к нормальному можно избежать перечисленных выше осложнений и снизить смертность.

Таким образом, по совокупности функциональных, биохимических, морфологических критериев, характеризующих выраженность и степень эн-дотелиальной дисфункции, на моделях Ь-МАМЕ-индуцированной ЭД Ьаргинин проявил активность, сопоставимую или превосходящую таковую, у антагониста кальция дигидропиридинового ряда - амлодипина и тиазидопо-добного диуретика - индапамида. Сочетанное применение L-аргинина с данными препаратами выявило существенные преимущества по сравнению с монотерапией в отношении усиления NO-продукции эндотелием сосудов, при этом в отдельных случаях достигался целевой уровень АД, либо предотвращение гипертензии было более существенным, чем при монотерапии.