Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Исследование аллельного полиморфизма генов HLA-DRBI 04, HLA-DOB1 и пролиферативной активности клеток у больных ревматоидным артритом

$ ь 1 ; 8

АКАДЕМИЯ МЕДВДНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ КЛИНИЧЕСКОЙ 1МУНОЯОГИИ

На правах рукописи УДК 575.22:575.113.2+61^.017.1

САРТАКОВА

Марина Леонидовна

ИССЛЕДОВАНИЕ АЛЛЕЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМ ГЕКОВ НЬА-ОШ 04, Ни-ООВ! И ПР0.Ш5ЕРАТИВН0Я АКТИВНОСТИ КЛЕТОК У БОЛЬНЫХ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ.

14.00.35 - Аллергология и ига ология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени кандидата медицинских наук

НОВОСИБИРСК - 1991

Работа выполнена в лаборатории клинической иммуногенетики Института клинической иммунологии СО АМН СССР и лаборатории радиохимии Новосибирского института биоорганической химии СО АН СССР.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Б.И.Коненков

доктор химических наук

А. Г. Плетнёв

Официальные оппоненты: локгор медицинских наук б.с.ширинскпй -кандидат биологических наук _с.п.коваленко

Ведущая организация - институт иммунологии минздрава СССР

Защита состоится "_"_______г__19Э_ г. в _ часов на

заседании Специализированного совета К 001.01.01. Института клинической иммунологии СО АМН СССР по адресу: г.Новосибирск, 630091, ул.Ядринцовская, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института клинической иммунологии С-0 АМН СССР.

Автореферат разослан "_"____1991г.

Учёный секретарь Специализированного совета,

кандидат биологических наук - О.Е.КУДАЕВА

'•Ч'^^-О-? ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РДБОТН

Актуальность проблемы. Исследования в области молекулярной генетики главного комплекса гистосовместимости значительно расширили наши представления о степени полиморфизма региона НЬА-Х), что находит своё выражение как в картировании на этом участке 6-ой хромосомы новых генов (НЬАЧЖВЗ) (J.Kawaiet а1.,1990), так и в расширении перечня их аллельных вариантов. (.Т.Воатег et а1.,1991). Этому способствовало внедрение в практику новейших методов, позволяющих изучать микрополиморфизм НЬА на уровне ДНК -рестриктного анализа, "прогулки по хромосоме", олиготипирования, секвенирования генов.

На основе данных о дополнительном полиморфизме НЬА. и разработки методов ДНК-гипирования в настоящее время продолжается поиск генетических маркеров для заболеваний человека с' наследственной предрасположенностью. • Гибридизацией

аллельспецифичных олигонуклеотидных зондов с геномными ДНК в ряде случаев были установлены высокоассоциированные с. некоторыми заболеваниями аллели ньа. Так, наряду с известными данными о позитивной ассоциированности ревматоидного артрита (ра) с серологически выявляемой специфичностью Н1Л-Ш4 в результате олигонуклеотидного типирования был показан более тесный характер ассоциированности этого заболевания с некоторыми ей аллельнами вариантами, чем с широкой специфичностью ньачжд (С.Ыерот et з.1., 1989).

Было также установлено, что этническая принадлеишость обследуемых лиц оказывает влияние как на закономерности распределения молекулярных вариантов иьа-0В4 в здоровой популяции, так и на характер ассоциаФивных связей с РА.

Вместе с этим, подобные исследования полиморфизма гена НЬА-ВйВ1 04 и установление ассоциированных с РА аллелей этого гена у нас в стране ещё не проводились. Отсутствует информация о частоте аллельных вариантов НЪА-ОЕВ! 04-гена как в здоровой популяции, так и среди больных РА, проживающих в Западной Сибири.

Между тем, широкая паспространённость РА в данном регионе и связанные с ним ранняя временная нетрудоспособность, инвалидизация больных в молодом возрасте, а также необходимость дифференцированного подхода в диагностике заболеваний на основе учёта этнической принадлежности обследуемых лиц ( ы.МеЬга,1988) делают важным исследование полиморфизма гена НЬА-ШВ1 04 среди больных РА и здоровых жителей Западной Сибири.

Весьма противоречивыми оказались представленные в литературе результаты по оценке ассоциированности РА с аллелями другого гена НХА-В0В1 03, тесно сцепленного с НЬАЧЖВ1 04-геном (В.ЭЗлйа! аЛ.,1987; С.Ыерош еЪ а1.1989;

Ранее было установлено, что третьему гипервариабельному региону гена ньа-ШВ1 , в котором сосредоточены основные различия между аллелвными вариантами нъа-ш4, соответствует часть а-спирали белковой молекулы ньа класса II, которая взаимодействует на поверхностной мембране со структурой Т-клеточного рецептора {В.хдп® е1 а1.,1988). Показано, что это взаимодействие, обусловленное структурными особенностями нха антигенпрезентирующих клеток, определяет эффективность иммунного ответа на чужеродные антигены (К.Н1гауата,1986'), Исследование антигенраслозяающей функции, в зависимости от генотипа н1а-БВВ1 04 и нта-Б0В1 клеток-респондеров, также представляет определённый теоретический интерес, так как это позволяет приблизиться к пониманию

молекулярных механизмов генетики иммунного ответа, который может контролироваться НХА-молекулами на центральном уровне через позитивную селекцию предшественников Т-лимфоцитов.

Всё изложенное выше явилось основанием для проведения настоящего комплексного структурно-функционального исследования некоторых генов региона НЬА-Б.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось изучение закономерностей распределения аллельных вариантов гечов

НХА-ПЕВ1 04 И НЬА-С<ЗВ1 у НЬАЧЖ4~П03ИТИВНЫХ бОЛЬНЫХ РА И ЗДОрОВЫХ

жителей Западной Сибири и различий функциональной активности антигенраспознагадах клеток в алло-СКЛ, обусловленной полиморфизмом этих ньА-генов.

Соответственно поставленной цели перед исследованием были выдвинуты следующие задачи:

1. Установить серологические специфичности НЬА-га, с которыми связан наибольший риск развития РА у европеоидов в Западной Сибири и оценить вклад НЬА-Ш в клинический полиморфизм заболевания.

2. Провести сравнительный анализ распределения аллельных вариантов генов НЬА-ШВ1 04 и НЬА-БС©1 среди здоровых жителей Западной Сибири в сопоставлении с лицами монголоидного и кавказоидного происхождения, проживающих в других регионах мира.

3. Идентифицировать аллельные варианты генов НЬА-ГОВ1 04 и Н1А-Р0В1 у НХА-пид-позитивных лиц в Западной Сибири, ассоциированные с развитием РА, клиническими вариантами его течения и эффективностью терапии.

4. Исследовать спонтанную и стимулированную в

однонаправленной СКЛ пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови у НЬА-шм-позитивннх больных РА и здоровых лиц в зависимости от аллельной HLA-DRB1 04- и HLA.-DQB1 ггоинадлежности.

Научная новизна работы.■ Применение аллельспецифичных олигонуклеотидов позволило впервые в СССР выявить молекулярные Варианты гена kla-drb1 04 - hla-drb1 0404 и hla-drb1 0408, для которых показана более тесная связь с заболеванием (rr=12.02), чем для широкой серологической специфичности hla-dr4 (rr=3.95). Негативный характер ассоциированности с РА выявлен для других аллелей этого гена - hla-drb1 0403 и hla-drbi 0407.

Наши исследования также показали, что частота аллелей гена HLA-DQB1 03 не отличается в группах нъа-вд4-позитивных больных РА и здоровых лиц в обследуемой субпопуляции. Вместе с этим у здоровых европеоидов Сибири впервые обнаружена не встречающаяся ранее ассоциация HLA-DE4 с НЪА-DQwI (аллели HLA-DQB1 0501 и HLA-DQB1 0601).

При сравнительном анализе характера распределения аллельных вариантов генов. HLA-DRB1 04 и HLA-DQB1 03 среда лиц европеоидного происхождения, проживающих в Западной Сибири и некоторых других странах Западной Европы и США, были выявлены как существенные различия, так и сходства в распределении этих аллелей, что может формировать своеобразный маркёрный "портрет" субпопуляций.

Были показаны изменения антигенраспознающей функции Т-клеток в зависимости от их HIA-DRB1 04 и HXA-DRQB1 -генотипа в однонаправленной - алло-СКЯ. Установлено, что клетки, несущие HLA-DRB1 0403 и -DRB1 0407 являются высоко отвечающими по

сравнению с ньа-шв1 0404 и 0408 (р<0.01). Невыявлящийся у

больных ра генотип ньа-б0в1 0501 и 05в1 0601 маркирует низкую спонтанную пролиферативную активность.

Практическая ценность работы. В результате проведенного исследования показано, что диагностическая значимость иммуногенетических методов при установлении заболевания может быть существенно повышена с помощью модекулярно-генетических подходов на основе ДНК-типирования. Это связано с тем, что высокоспецифичные олигонуклеотиды, гибридизующиеся с комплементарными участками ДНК, позволяют идентифицировать не выявляющиеся серологическими методами молекулярные варианты, которые в большей степени (в 3 раза), чем серологические специфичности ассоциированы с развитием РА.

Метод ДНК-типирования олигонуялеотидами апробирован на базе лаборатории радиохимии НИБХ АН СССР. Подобраны экспериментальные условия, сохраняющие строгую специфичность и высокую чувствительность метода. Обнаруженные закономерности в характере распределения аллелей "КХА-ШЕ1 0404 и -БРВ1 0408 могут быть основанием для рекомендации применения данного метода в клинической практике при диагностике РА в обследованной субпопуляции.

На зэлиту выносятся следующие ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ:

1. Ассоциированность Ра у европеоидов Западной Сибири, длительное время проживающих среди коренного монголоидного населения, с аллелъными вариантами гена НГЛ-БРВ1 04 - НЬА-ГЛ?31 0404 и НЪА-йРВ1 0408 носит более тесный характер в сравнении с

серологически идентифицируемой специфичностыи НЬА-ВН4.

2. Распределение аллелей генов НЬА-окв 04 и НЬА-РОШ 03 среда европеоидов Западной Сибири существенно отличается от его характера у кавказоидного населения других стран мира, и его определение, вероятно, может быть использовано для популядаонио-генетических исследований не только на этническом, но и на национальном уровне.

3. Аллели генов НХА-ШВ1 и -В0В1 являются общими маркёрами интенсивности спонтанной и стимулированной аллоаятигенами пролиферативной активности лимфоцитов. Накопление или снижение частоты этих аллелей среди больных РА является истиной причиной сделанных ранее заключений о снижении пролиферативной активности клеток при РА.

4. Отсутствие полной ассоциированности РА с серологически выявляемыми специфичностями НЬА-системы может быть связано с наличием у этих больных идентичных структур ДНК в третьем гипервариабельном регионе второго экзона гена ньа-МШ1 , взаимодействующего с Т-клеточным рецептором, и не выявляемыми с помощью антител.

Апробация работы и публикации. Полученные результаты были доложены и обсуждены на I Все сошном симпозиуме по иммуногене тике (Новосибирск, 1989 г.), I Всесоюзном съезде иммунологов (Дагомыс, 1989 г.), I Всесогоном симпозиуме иммунологов (Цхалтубо, Т990 г.), II Всесоюзном съезде медицинских генетиков (Алма-Ата, 1990 г.), IV Всесоюзном съезде ревматологов (Минск, 1991 г.).

Апробация работы состоялась на расширенном семинаре Института клинической иммунологии СО АМН СССР 10 октября 1991 г.

По теме диссертации опубликовано .9 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста. В её состав входят введение, обзор литературы, описание материалов и методов, результаты исследовании и их обсуждение, изложенные в з главах, заключение и выводы. Диссертация иллюстрирована 13 рисунками и 23 таблицами. Список литературы состоит из 310 источников, из них 55 работ отечественных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы рассмотрены следующие вопросы:

1). Молекулярное строение HLA-D-региона и его белковых продуктов;

2). Ассоциированность РА с антигенами HLA класса II и генами D-региона комплекса HI.А; 3).НТ.А, кг« регулятор функциональной активности иммунокомпетентных клеток в норме и при РА.

Материалы и методы. Обследованы 167 человек, среди которых 107 здоровых .лиц и 60 больных определённым и классическим РА. Были проанализированы данные, включающие информацию о клинических вариантах заболевания у амбулаторных больных городского ревматологического центра и пациентов, проходящих курсовое лечение в ревматологическом отделении I городской клинической больницы.

В тестах по гибридизации геномных ДНК с олигонуклеотидами для проверки специфичности метода были использованы ДНК, выделенные из трансформированных вирусом Эпштейна-Барр B-клеточных линий (beiden, The Netherlands с. чйтко установленным фенотипом и известной последовательностью hla-MB1 04 и hla-DQB1 03 генов. МПК выделяли из стерильно взятой, стабилизированной 2.7% раствором

ЭДТА периферической венозной крови здоровых доноров и больных РА по методу A.Boyum (1968).

Бее обследованные лица были типированы по HLA-антигенам i и II классов, используя стандартный микролимфоцитогоксический тест с применением широкого набора аллоантисывороток XI Международного Уоркшопа по гистосовместимости и Ленинградского НИИ гематологии, дополненного аллоантисыворотками фирмы "Behring".

Пролиферативная активность Т-лимфоцитов на аллоантигены у DR4—позитивных здоровых лиц и больных РА, являющихся носителями различных аллельных HLA-вариантов генов HLA-DEB1 04 и HLA-DQB1 исследовалась в однонаправленной CKJI. При этом в качестве стимуляторов для всех отвечающих тестируемых клеток использовались клетки с фенотипом HIA-A2,B7,35,DR1,2,DQw1.

ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови HLA-DR4-позитивных здоровых и больных Р к (C.Gautreau et al.,1983. ).

Амплификация ДНК производилась в соответствии с протоколами и рекомендациями XI-го Уоркшопа. По 0.3 мкг каждой из геномных ДНК лейкоцитов и B-клеточных линий амллифицировали в 50 мкл буферного раствора, содержащего 67 мМ Трис-HC.l pH 8.8 (при t=26°C) ("Sigma"), 16.6 мМ сульфат аммония ("Sigma"), 3.4 мМ хлорид магния ("Sigma"),10 мМ ДТТ, 2 Ед. термостабильной .KHK полимеразы из гтютш aquaticus ("Фермент"). В реакционную смесь добавляли по 25 пкмолей каждого праймера для амплификации гена НТА-ШВ1 04 и гена HLA-DQBI 03. Выполнялись Я5 циклов амплификации, состоящих из последовательных стадий денатурации при 95°С- I мин., праймирования при 57°С для DQBI 03 генов и при 60с,С для DRBI 04 генов- 1.5 мин. и полимеризации цепи при 72°С в течений 2 мин.

Для гибридизации использовались меченные гакма-^Р-АТ® олигонуклеотиды, полученные из Медицинского института биорегуляции (г. ¡Еукуока, Япония ). Пре гибридизацию и гибридизацию мембран проводили в растворе, содержащем хлорид тетраметиламмония при температуре 54°С.

Отмывка мембран проводилась в растворе, таксе содерааадм хлорид тетраметиламмошя прй температуре, строго соответствунаей длине олигонуклеотидов, т.е. при t=580C (для 18-звеньевцх олигонуклеотидов ) (ВДЛ'.'ооа. et а1.1985).

Отмытые мембраны сушили и экспонировали с рентгеновской плёнкой РМ-В ("Гасма") и уси.ливакции экраном типа "ЭУИ-1". Гибридизационнке сигналы выявляли чепея 2 и 16 часбв.

Статистическую обработку полученных материалов проводили, используя пакет программ ИКИ СО АМН СССР и генетгасо-статистические методы (Г.В.Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ НЕКОТОРЫХ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ СПЕЦ1НИЧН0СТЕЙ В ГРУППАХ ЗДОРОВЫХ ЛИЦ И БОЛЬНЫХ РА. Стремлением диагносцировать РА, занимающий первое место по распространенности среди всех воспалительных заболеваний суставов, и осуществлять прогноз течения на ранних стадиях его развития продиктованы интенсивные научные исследоватшя, связанные с поиском генетического маркёра для РА. Одними из возможных кандидатов этого являются гены комплекса 1гс.а, которые наряду с другиии генетическими и средсвыми факторами могут определять повишениуп чувствительность к развитию такого мультифакториалыгего заболевания, как РА. Ранее была показжа ассоциированность РА с

некоторыми серологическими специфичностями НЪА-dr во многих популяциях (R.Martell,1990; N.Ohta,1982).

Цель настоящего раздела работы - проанализировать распределение HLA-DR-антигенов среди больных РА и здоровых еввропеоидов Западной Сибири, длительное время проживающих среди коренного монголоидного населения.

Проведенное нами серологическое исследование показало, что в данной субпопуляции сохраняется ассоциированность РА с антигеном HLA-DR4 (табл.1.). По нашим результатам в группе больных частота HLA-DR4 составляет 58.33$ против ZB.17% в контроле(RR=3.95). Существенных различий в распределении других антигенов HLA-DR, и в частности характерного для больных РА по некоторым данным (F.Nichols et al.,1989 и др.) антигена HXA-DR1, среди больных РА и здоровых европеоидов Западной Сибири нами не выявлено.

Проанализировав частоту некоторых ньА-специфичносгей при различных клинических вариантах РА. нами было установлено, что

Таблица Т.

Частота некоторых антигенов НЬА в группах больных РА и

Здоровых жителей Западной Сибири.

HLA-фенотип Здоровые {п=107) Больные (п=60 ) Относительный риск (RR)

п % п %

HLA-DR1 25 23.36 12 20.00 -1.22

HLA-DR2 20 18.69 13 21.66 1.20

HLA-DR3 33 30.86 16 26.66 -0.82

HLA-DR4 28 26.17 35 58.33 3.95**

HXA-DR5 £9 27.10 18 30.00 1.15

HLA-DR7 29 27.10 7 11.66 -3.55**

Примечание.В этой и других таблицах: * - р<0.05; ** - р<0.001

локус ньа-и? региона о играет важную роль не только в развитии ра, но и в формировании клинического полиморфизма заболевания, что проявляется повышением частоты определённых Н1А-Ш-специфичностей у больных с рядом клинических признаков: характером течения заболевания, наличием или отсутствием экстраартикулярных поражений, выраженностью внутрисуставных изменений, побочными решениями на применение некоторых лекарственных препаратов и т.д.

Несмотря на высокую частоту этого антигена НЪА-Ш4 у больных РА заболевание возникает не у всех носителей этой серологической специфичностии. Более того, не все, а только 58.33% больных ра имеют антиген ИЬЛ-ОК4. Это указывает на относительную ограниченность метода серотипирования для идентификации высокоассоциированного с РА диагностического критерия.

Исходя из этого, мы продолжили иммукогенетический анализ ассоциативных связей РА с НХА на молекулярном уровне. С этой цель» мы исследовали распределение отличающихся по аминокислотной последовательности в третьем гиперваряабельном регионе аллельных вариантов некоторых нъа-ок- и -од-специфичностей у ньа-го4-п03итибн>1х лиц.

ДНК-ТИПИРОВАНИЕ ГИБРИДИЗАЦИЕЙ олигонуклеотидных зондов С ГЕНОМНЫМИ АМШШШЦИРОЗАННЪМИ ДИК ЗДОРОВЫХ ЛИЦ ii больных РА с

5ек0тип0м НЬА-ПЙ4. Имеющиеся сведения о последовательности молекулярных вариантов гена нт,А-БЕВ1 04, которых на сегодня насчитывается не менее восьми (,Т.Вос1тег еЬ а1.,1991), легли в основу данного раздела работы. Известно, что продукты всех этих генов распознаются аллоантисыворотками кок НЪА-Ш?4-антиген, что

свидетельствует о гетерогенности этой серологической специфичности. Вместе с этим, фактические данные об отсутствии 100?-ой выявляемостл НЬАЧЖ4 при РА с одной стороны, и развитии заболевания далеко не у всех носителей этого антигена с другой стороны, наводят на мысль о возможности предпочтительного распределения некоторых аллельных вариантов нЬА-гав1 04 как в группе здоровых лиц, так и среда больных РА.

Одни!'.! из наиболее важных аспектов установления молекулярно-генетическик критериев для диагностики РА является сравнительное исследование распределения аллельных вариантов гена ша-б1?в1 04 среди здоровых представителей различных этнических групп. В связи с этим, мы провели анализ частотных характеристик молекулярных подтипов НГД.-Ш4 у здоровых носителей этого антигена в сравнении с уже известными данными, полученными при исследованиях в других субпопуляциях.

Непосредственный анализ частоты встречаемости аллелей гена ньа-ШВ1 04 в нашей выборке показал существенные различия в характере их распределения среди Н1А-Ш4-позитивных европеоидов, проживающих в Западной Сибири по сравнению с ориентами и лицами кавказоидной популяции в странах Западной Европы и США.

Подобные различия могут проявиться в закономерностях распределения аллелей гена НХА~0ВВ1 04 и среди больных РА с различным этническим представительством. В связи п этим, была исследована их частота и определена степень их ассоциированности с заболеванием у Щ/А-ШМ-позигивных больных РА, проживающих в данном регионе СССР.

Наши результаты олиготипирования показали, что распределение

я^Ь ?

ЗБС- 7001

о ^

530-8601

€

ЗйО- 7006

О

©

ЭБО- 1007

1

* о

Б00- 7001

1 —

л * ^

о _

.30-8601

1 "О ,

1?©3

ББО- -7006

ЭБО- 7007

Рисунок I. Дот-гибридизация геномных ДНК больных РА (а) и здоровых

ор

лиц (61 г. меченными гамма- -Р-АТФ олигонуклеотидами, выявляющими некоторые аллели гена Н1.а-М?В1 04: 7001- все, кроме 040Т.0402 и 0409

7006- 0401, 0409

7007- 0402

860Т- 040Т, 0405, 0407, 0408, 0409

Таблица 2.

Частотная характеристика аллелей НЬАЧЖВ1 04-гена у представителей различных этнических групп.

Dw-специфичность % Dw4 Dvd 0 Pw1 3 Dw14 DW15

ньа-DRBI 04-аллель 0401 0402 0403 0407 0404 0408 0405

1 Западная Сибирь 30.43 4.35 65.22 0 0

а Западная Германия 66.0* 13.00 9.0* II.0* 0

3 сша (штат Техас) 55.9* 8.5 17.0 28.8** 0

4 Юго-Восточная Англия 73.3* 0 4.1** 2.1 0

5 Северная Англия 49.10 0 8.8* 22.8** 0

6 Норвегия 70.00* 0 7.14* 22.85** 0

7 Япония nd 7.5 nd nd 25.5**

Примечание, nd-нет данных.

анализируемых аллелей среди больных РА в ряде случаев совпадает, а в других случаях достоверно отличается от его закономерностей у здоровых лиц в русской субпопуляции и больных РА лиц европеоидного происхождения в других субпопуляциях.

Наиболее существенные различия получены нами для специфичности HbA^-Dwu (ERB1 0404 + DBB1 0408), частота которой среди больных РА составляет 19.23Ж, тогда как среди здоровых лиц она не выявлена ни в одном из случаев. При этом показатель относительной риска составляет 12.02, что значительно превышает величину этого показателя для серологически выявляемой специфичности HLA-DR4 (RK=3.95). Негативный характер

1 аблица 3.

Частота аллелей гена НЬА-бнв1 04 среди больных РА и здоровых жителей Западной Сибири.

НЪА-аллели ^-специфичность Здоровые (п=23) Больные (п=26) Относительный риск(ни)

0401 30.43 42.31 1.65

0402 Г>У»10 4.35 7.69 1.83

0403 0407 1)4713 65.22 30.77 '-4.22*

0404 0408 0У)14 0 19.23 ' 12.02*

0405 ¡>«15 0 0 -

0406 сикгг 0 0 -

ассоциированности г, РА выявлен нами для специфичности НЬА-ЛиМЗ (Н1,А-СНВ1 0403 + НТ,А-Ш<В1 0407), частота которой значительно снижена. Волее того, у кавказоидов Западной Сибири мы выявили не зотречаюшуюся ранее гаметную ассоциацию НЬАЧЯЫ с НЬА-ВОл1 :НЬА-С«В1 0501 И -ТХ2В1 0601 ).

Относительно особенностей формирования клинической картины РА индивидов с различным ньачжв1 04-генотипом нами получены 1анные, которые ещй раз свидетельствуют о важной . роля ■ генетического компонента в развитии болезни.

Учитнвая, что РА является мультифакториальным заболеванием, и его развитие может обуславливаться суммарным действием нескольких генов, мы так же исследовали роль другого локуса. Б-региона. г НЬА-ВСЗ, тесно ассоциированного с локус.ом -НХА-1Ж, и его отдельных

аллелей в предрасположенности к РА.

Наши результаты гибридизации олигонуклеотидов с геномными ДНК больных РА и здоровых жителей Западной Сибири показали, что в отличие от аллелей гена ньа-г®в1 04, аллели гена ньа-б0в1 03. распределены в обеих группах практически равномерно.

Проведенный нами анализ распределения гаплотипов аллелей ньа-ю®1 04-б<2в1 в сравниваемых группах выявил ряд различий:полное огсутстшо среди больных ра гаплотипов г{ьа-шш1 0407 - нха-00.В1 0301, я1а-шв1 0407 - б0в1 0302 (1®=-8.63) и ньа-бе!в1 0407 - в0б1 0501 (ве=-5.89) и, напротив, отсутствие среди здоровых лиц "гаплотипа ньа-1жв1 0408 - б0в1 0301 (1ж=7.3). Заключая этот раздел работы, следует отметить, что в нашей субпопуляции для локуса ньа-во не выявлена самостоятельная роль в генетической детерминации ра, тогда как риск его развития, главным образом, связан с аллелями нъа-шш1 -гена.

КОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ВЗАШОДЕЙСТВВИЙ В АЛЛО-СКЛ. Пролиферативный ответ Т-лимфоцитов на адлоаитигены можно рассматривать как гп vitгo-мoдeль иммунного ответа на чужеродные, а так же на изменённые или при нарушениях процессов аутораспознававия неизменённые собственные антигены, так как происходящие в алло-СКЛ взаимодействия и процессы отражает общие закономерности формирования иммунного ответа.

Наши результаты показали, что вместе со снижением пролиферативных ответов в алло-СКЛ в общей группе 1ШНИЯ4-позитивннх больных РА наблюдается повышение спонтанной пролиферации лимфоцитос.

При сопоставлении результатов алло-СКЛ и спонтанной

пролиферации с учётом аллельной НЪА-ВЙВ1 04-принацлежности внутри каждой из групп (больных ра и здоровых лиц) обнаружено, что как у ньа-1®4-позитивных больных ра, так и у здоровых ньа-ш4-позитивных лиц с генотипом н1а-1жв1 0401 средние значения спонтанной пролиферации и величина митотических индексов ниже, -чем таковые у носителей генов нъа-1жв1 0403 + н1а-бвв1 0407 (нъа-оиз).

Нами также показано, что при наличии в генотипе антигенграспознающих. клеток одного и того же аллельного варианта гена КЬА-БКБ1 04 не наблюдается различий в уровнях пролиферативной активности на аллоантигены при сопоставлении результатов алло-СЮ* между группами больных РА и здоровых европеоидов западной Сибири.

Таблица 4.

Стимулированная аллоаятигенами пролиферация лимфоцитов периферической крови больных ра и здоровых лиц, являющихся носителями аллелей гена ньа-бкв1 04.

ы НЬА,—ВДВ1 04-аллели 0401 Здоровые(1 - 4 ) N Больные(5-8) критерий достоверности

п М 5 ш п М 1 ш

1 0401(&я4) 3 2.09 10.59 5 8 1 .45 >0.1 критерий Уилкоксона- Манна-Уитни: р >0.05 1-5 р >0.05 3-7

2 0402(В»10) 1 3.40 б 2 1 .22

3 0403 0407(&и13) 13 5.21 »1.19 7 3 2.43 ■0.02

4 0404 0408(Ву»14) 0 - 8 4 1 .30' = 0. Г4

Ките рии Уилкоксона-Манна-Уитни и Стьмдента: р <0.05 1-3 Критерий Стьюдента: р <0.01; р <0.05 5-7 ' 7-8

р >0.05 5-8

Сравнивая результата обоих тестов в объединённых группах, мы выявили значительное повышение уровней пролиферативных ответов на аллоантигены у носителей аллелей HIA-DRB1 04-03 и -DKB1 0407 (Pwíñ) по сравнению с таковыми у носителей НХА-Ш4, тогда как разницы в спонтанной пролиферации в сравниваемых группах не обнаруживается.

Следовательно, вне зависимости от наличия заболевания ответ на аллоантигены, в первую очередь, определяется их ША-гаВ1 -генотипом, тогда как спонтанная пролиферация, уровень которой отражает преактивацию Т-лимфоцитов in vivo, по-видимому, зависит от каких-то ещё дополнительных факторов. Это могут быть циркулирующие имунные комплексы, ревматоидный фактор, коллаген типа П и т.д.

В межклеточных взаимодействиях в СКЛ принимают участие молекулярные продукты не только локуса HIA-DR, но и других локусов ü-региона, В частности - HI.A-DQ (E.Mellins et al., 19871.

Исходя из этого, мы провели анализ уровней спонтанной и пролиФетэативной активности лимфоцитов у больных FA и здоровых носителей различных аллелей гена НТ.а-dqbi , неравновесно сцепленных со специфичностью HXA-DR4.

Мы установили, что спонтанная пролиферация у клеток носителей HT.A-DQB1 0301 и HLA-EQB1 0302 достоверно отличается от таковой у носителей HLA-DQB1 0501+0601. Б наших экспериментах наблюдались наиболее высокие значения спонтанной пролиферации при фенотипе HLA-DQwi (0501- и 0601-аллели), чем у носителей аллелей НЪА-PQBI .0301 и HLA-DQB1 0302.

В это же время, в алло-СКЛ клетки с фенотипом hi.a-DQ.v1 являются более сильными респондерами, чем hba-dqw7 и ht,a-dqw8.

Причём, клетки с фенотипом Н1А-Б0я1 (нгл-В0В1 0501 и -00В1 0601)

Таблица 5.

Пролиферативная активность в алло-СЮГ лимфоцитов периферической крови здоровых лиц и больных РА, связанная с различными вариантами гена НЪА-0<ЗВ1,

N аллели гена НЬА-вев1 Специфичность БОяг Здоровые N Больные РА

п М « ш п М * т

1 0501 0601 4 7.45*2.94 4 0 -

2 0301 Б0«г7 6 3.26*0.86 5 5 1.53*0.17

3 0302 С0»г8 7 3.92*1.23 6 12 1.57«0.15

Критерий достоверности Уилкоксона-Манна-Уитни:

р < 0.05; р < 0.01; 2-6 3-7

р < 0.01; р < 0.01; 1-2 1-3 Р > 0.05; р 2-3 6- > 0 -7 05

отсутствуют в группе больных РА и представлены только у здоровых лиц.

В данной части работы мы исследовали антигенраспознапцую Функцию Т-клеток и показали, что их функциональная активное,-зависит от генотипа ре с п он дер;.'п. Можно предположить, что это, в свою очередь, определяется фенотипом обучающих Т-лимфоциты клеток тимуса. При этом важную роль в данном процессе выполняет определённый участок первого домена (а.м.к. около позиции 70) молекулы НЪА-ш,' который непосредственно взаимодействует с 'Т-клеточным рецептором.

Анализ результатов культуральных исследований среди НЬА-Ш4-позитивных здоровнх лиц и больных РА в сочетаниии с данными ДНК-типирования, указывающими на преимущественное распределение среди больных РА аллельного варианта НТД-ШВ1 0401 и наибольший риск развития заболевания у носителей аллелей HLA-DRB1 0404 и HLA-DRB1 0408 и повышенную частоту HXA-DRB1 0403 и HLA-DRB1 0407 в группе здоровых, позволяет сделать вывод о том, что различия в структуре Ш-его гипервариабельного региона гена HLA-DRB1 04 имеют ■ важное значение в антигенраспознающей функции Т-клеток .in vitro.

ВЫВОДЫ

i. Характер распределения серологически идентичных

специфичностей ньа-Ш среди здоровых и больных РА европеоидов Западной Сибири имеет свои отличия в сравнении с кавказоидами европейской части СССР и других регионов их расселения при сохранении высокой степени ассоциированности РА с HLA-DR4 (RR=3.95).

Р ДНК-типирование олигонуклеотидвнми зондами,

идентифицирующими аллельные варианты гена hla-drbi 04, также показало существенные различия в характере их распределения среди HLA-DR4-no3HTHBHHx больных РА и здоровнх европеоидов, проживающих в Западной Сибири в сравнении с европеоидами США, Канады и стран Западной Европы. Б субпопулятдии европеоидов Западной Сибири наряду с характерной гаметной ассоциацией hia-dr4 с hba-DQw7 и -DQwe впервые выявлена ассоциация КьА-М?4 с HLA-DQwl, что может быть следствием рекомбинационных событий между локусами kla-dk и hla-bq в процессе эволюции системы ICLA.

-l2

3. Степень ассоциированности аллелей гена НТ,а-шв1 04 - НЪА-БЕВ1 0404 и -ГОВ1 0408 г. РА более, чем в 3 раза привышает ассоциированность этого заболевания с общей специфичностью НБА-Ш4. Протйктиьным действием мри реализации предрасположенности к РА обладают аллели Н1А-ШВ1 0403 и -0ВВ1 0407.

4. Характер ассоциированности развития РА и его клинической картины с аллелями НТА-ШВ1 04-гена н Яяпадной Сибири имеет как общие с. европеоидами других стран, так и отличительные закономерности, обусловленные этническим происхождением больных РА, что необходимо в обязательном порядке учитывать при сопоставлении данных генотипирования.

5. Лимфоциты здороннх лиц - носители аллелей НТ.А-генов -В<ЗВ1 0501 и -п<зВ1 0601 обладают низкой спонтанной пролиферативной активностью в алло-СКЛ. Этот НТА-генотип не выявляется в обследуемой группе больных РА.

6. Аллели НЪА-Ш?В1 0403 и -ОНВ1 0407 характеризуют генотип .лимфоцитов здоровых лиц и больных РА с высокой способностью пролиферировать к шию-СКЛ; низкий уровень распространения этих аллелей в группе больных РА наряду с отсутствием среди здоровых лиц носителей аллелей НХА-ШБ1 0404 и -Ш)В1 0408, маркирующих низкий отпет н аплп-ОКЛ существенно корректирует сложившееся мнение о снижении функциональной активности Т-клеток при РА.

список работ, опубликованных по теме диссертации.

Т. Сартакхжн М.Л. Использование олигонуклеотидных зондов, комплементарных коротким участкам ВДВ1 г'ена, для ранней диагностики твенильного ревматоидного артрита. //I Всесоюзный съезд иммунологов. Тез.докладов.-Да! чшис,ТЗЯЭ. - С..5Я-59.

2. Сартакова M.JI. Применение метода ДНК-типирования с использованием олигонуклеотидных зондов для ранней диагностики ревматоидного артрита. //I Всесоюзный симпозиум по иммуногенетике. Тез. докладов.-Новосибирск, 1989.-с.58.

3. Сартакова М.Л., Коненков В.И. Исследование аллельного полиморфизма HLA-DRB1 04 гена гибридизацией синтетических олигонуклеотидных зондов с амплифицированной геномной ДНК. //Иммунология.-1990.- N 6.-с.71-74.

3. Сартакова М.Л., Коненков В.И. Исследование структуры третьего гипервариабельного региона DRB1 04 гена гибридизацией аллельспецифичных олигонуклеотидных зондов в амплифицированной геномной ДНК. //И Всесоюзный съезд медицинских генетиков. Тез. докладов.- Алма-Ата, 1990.-с.386.

4. Сартакова М.Л., Коненков В.И. Методы ДНК-типирования НЪА с использованием аллельспецифичных олигонуклеотидных зондов в диагностике аутоиммунных заболеваний человека. //II Всесоюзный симпозиум "Реабилитация иммунной системы". Тез. докладов.-Цхалтубо, 1990.

5. Сартакова М.Л., Коненков В.И. Определение структуры третьего гипервариабельного участка DRB1 04 гена гибридизацией олигонуклеотидных зондов с амплифицированной геномной ДНК. //I Всесоюзная конференция "Геном человека-90". Тез. докладов.-Переславль-Зале сский, 1990.

6. Сартакова М.Л., Коненков В.И. Исследование структуры третьего гипервариабельного региона DRB1 04 гена гибридизацией аллельспецифичных олигонуклеотидных зондов в амплифицированной геномной ДНК. //II Всесоюзный съезд медицинских генетиков. Тез. докладов.- Алма-Ата, 1990.-с.386.

7. Konenkov V.T., Sartakova M.I. Differences in MLC proliferative responses influenced by HLA-Dw - in patients with rtheumatoid arthritis and normal Siberians. //XI International istocompatibility Workshop and Conference.-Yokohama, 1991. N 0002.

8.Sartakova M.L., Konenkov V.I. Determination of DRB alleles of DR4 subtypes by o]igonuccleotyping in patients with rheumatoid arthritis. /'/American J. Hum. Genetics.-1 991.-1 pi

9. Sartarova M.I,., Konenkov V.I. Allelic HXA-DRB1 04 gene polymorphism in West Siberia Caucasians and in patients witn rtheumatoid arthritis. //XT International Histocompatibility W'ors'nop and Conference.-Yokohama, 1991. N 0019.

3aic.4I2.Tnp.I00 3K3.Heu.;i. 1,5. $op»iaT-60x84/16.EyMara nncv«w.

Tun.CO AMH CCCP.r.HoBocHCHpcK,