Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:АЛЛЕЛИ И ГЕНОТИПЫ ГЕНОВ ОСНОВНЫХ ЦИТОКИНОВ И ИХ МЕЖГЕННЫЕ И ВНУТРИГЕННЫЕ СВЯЗИ В АССОЦИАЦИИ С РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ У РУССКОЙ И БАШКИРСКОЙ ПОПУЛЯЦИЙ

СТАШКЕВИЧ Дарья Сергеевна

00346118Э

АЛЛЕЛИ И ГЕНОТИПЫ ГЕНОВ ОСНОВНЫХ ЦИТОКИНОВ И ИХ МЕЖГЕННЫЕ И ВНУТРИГЕННЫЕ СВЯЗИ В АССОЦИАЦИИ С РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ У РУССКОЙ И БАШКИРСКОЙ ПОПУЛЯЦИЙ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

' 2 ФЕд 2СГЭ

Челябинск-2009

003461189

Работа выполнена на кафедре микробиологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинский государственный университет»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация:

Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской Академии наук, г. Екатеринбург

Защита диссертации состоится «25» февраля 2009 года в _ часов на

заседании диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Автореферат разослан «23»января 2009г.

Бурмистрова Александра Леонидовна

Сибиряк Сергей Владимирович

Цейликман Вадим Эдуардович

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Телешева Л.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ревматоидный артрит (РА) -сложнонаследуемое мультифакторное заболевание с неизвестной этиологией [Каратеев Д.Е., 2006; Ре1с1шапп М., 2001]. В настоящее время принято считать, что в предрасположенность/устойчивость к этому заболеванию вносят вклад гены иммунного ответа и другие, не установленные на сегодняшний день, а также факторы окружающей среды [Ьее Б.М., 2001; Буттош О.Р.М., 2003; В!еис1е Р., 2005]. Возможно, инициацию заболевания вызывают микроорганизмы [Горячев Д.В., 2001], вступающие в определенные, нередко непредсказуемые, отношения с организмом хозяина, несущего особые варианты генов, продукты которых прямо или косвенно участвуют в защите организма хозяина.

На сегодня наиболее доказанной является ассоциация РА с носительством определенных аллельных вариантов генов НЬА-В1Ш1 [СпБЛУеН Ь.А., 2005; Б1еис1е Р., 2005], и для нее характерны межэтнические различия [Бурмисгрова АЛ., 2005; Суслова Т.А., 2008; Нашеес! К., 1997]. Территория Челябинской области представлена многонациональным населением, среди которого наиболее распространенными являются популяции: русская, европеоидного происхождения, и башкирская, с комплексом генов иммунного ответа, с высокой частотой встречающихся у монголоидных популяций [Суслова Т.А., 1989; Кузеев Р.Г., 1992; Хуснутдинова Э.К., 2003; Девальд ИВ., 2006]. Формирование популяции русских происходило в течение последних 300 лет миграцией из центральных областей России [Кузеев Р.Г, 1992; Хуснутдинова Э.К., 2003]. Миграционные волны смешивались с проживающими на данной территории различными этносами с монголоидной и финно-угорской составляющей, неоформленными в государства. При метизации этого населения русские, проживающие в Челябинской области, приобретали свои специфические иммуногенетические особенности в распределении генов НЬА и цитокинов [Суслова Т.А., 1989; Бурмисгрова А.Л., 2005].

Башкиры - третья по численности популяционная группа (4,62% на 2002 г.) |Ъйр:/АуогУеео.гц/] Челябинской области, относящаяся к популяциям монголоидного происхождения, исторически сформировавшаяся на территории Южного Урала в период 1-2 в. до нашей эры и отличающаяся наибольшим вкладом монголоидных генетических признаков [Кузеев Р.Г., 1992; Хуснутдинова Э.К., 2003].

В исследованиях ИВ. Девальд и Е.Б. Хромовой показано наличие различий в ассоциации РА с генами и гаплотипами НЬА П класса (БИВ!,

DQA1, DQB1) между русскими и башкирами: у русских выявлены аллельные варианты генов и гаппотипы, предрасполагающие к РА, а у башкир превалируют гены и гаплотипы HLA, определяющие протекцию к РА [Девальд И.В., 2006; Суслова Т.А., Хромова Е.Б., 2008]. Однако вклад генов HLA II класса, как установлено в ряде исследований, составляет всего 30-40% от всей генетической компоненты, определяющей

устойчивость/чувствительность к PA [Wordsworth В.Р., 1992; Dieude P., 2005; Yamamoto, К., 2005].

В свете того, что РА является хроническим воспалительным заболеванием, совершенно ясно, что развитие воспалительного процесса, его исход будут определяться во многом цитокинами, создающими регуляторную биоактивную сеть сигналов, определяющих не только врожденный иммунный ответ, но и формирование адаптивного иммунного ответа, в том числе его направленность, выраженность, персистенцию [Arend W.P., 2001; Lee D.M., 2001; Pollard L., 2005; Christodoulou C., 2006; Mclnnes I.B., 2007]. В настоящее время выполнен ряд работ, посвященных изучению определения уровней различных цитокинов в циркуляции в физиологических условиях и при патологии [Насонов Е.Л., 2001; Соколова В.В., 2007; Monta Y., 1998; Butriminiene I., 2004], оценке интерлейкин-продуцирующей способности отдельных клеток иммунного ответа in vitro [Orino Е., 1992; Harada S., 1999; Yin Z., 1999; Chabaud M., 2001; van Roon J.A.G., 2003], и значительно меньше -генам цитокинов, их рецепторам, транскрипционным регуляторным факторам, постгрансляционной модификации цитокинов [Сенников C.B., 2002; Смольникова М.В., 2007; Bidwell J., 2001; Bennet A.M., 2006]. Данные, полученные в работах этого направления исследований, немногочисленны и чрезвычайно противоречивы, однако их можно суммировать по определенным группам.

1. Для генов цитокинов и их рецепторов отмечены популяционные различия [Goldfeld А.Е., 2000; Baena А., 2002; Haukim N., 2002; Caxnargo J. F., 2004; AguillónJ.C., 2006].

2. Различные аллели генов цитокинов имеют ассоциацию с различным уровнем продукции цитокинов и чувствительностью/устойчивостью к инфекционным и аутоиммунным заболеваниям [Шабалдин A.B., 2007; Chiche J-D., 2001; Hoolegaard M.V., 2006].

3. Группа генов, которые, практически, конститутивно активируются при любом воспалении, составляет широко востребованный «воспалительный/хемотаксический цитокиновый» кластер, который ко-активируется в содружестве с другими кластерами генов, и их продукты взаимозависимо функционируют в клетках, прямо или косвенно определяющих течение иммунного ответа [Boldrick J.C., 2002; Chaussabel D.

2003]. Активация экспрессии генов различных кластеров контролируется в основном через активацию TLR-ассоциированных (Toll like receptors) сигнальных путей [Симбирцев А.С., 2005], и профиль транскрипционной программы обеспечивает «общий ответ» клеток хозяина, определяемый как «видовой ответ тревоги». Исходя го сказанного, можно предположить, что кластер «воспаления» состоит из многих генов, их вариабельностей и комбинаций, которые работают в строгом взаимодействии друг с другом, что позволяет говорить о важности межгенных и внутригенных отношений в формировании общих и специфических защитных ответов организма-хозяина, дестабилизация которых может привести к пролонгированной хронической воспалительной реакции и аутоиммунному процессу.

Цель исследования

Установить особенности распределения аллелей и генотипов генов основных цитокинов у здоровых представителей и больных ревматоидным артритом русской и башкирской популяций и оценить наличие межгенных и внутригенных взаимодействий этих генов в ассоциации с ревматоидным артритом с целью выделения маркеров предрасположенности/устойчивости к данному заболеванию.

Задачи исследования

1. Выявить общие черты и различия в распределении аллель ных вариантов и генотипов генов IL-IRa, IL-4, IL-lp, TNFa между группами практически здоровых лиц русской и башкирской популяций для формирования контрольных групп.

2. Изучить особенности распределения аллелей и генотипов генов IL-IRa, IL-4, IL-ip, TNFa у больных ревматоидным артритом в сравнении со здоровыми лицами в русской и башкирской популяциях.

3. Определить частоты встречаемости аллелей и генотипов генов IL-IRa, IL-4, IL-lp, TNFa при различных клинических вариантах ревматоидного артрита у русских и башкир.

4. Оценить ассоциацию межгенных и внутригенных взаимодействий в виде сочетаний генотипов генов цитокинов с предрасположенностью/устойчивостью к ревматоидному артриту русской и башкирской популяций.

Научная новизна

Впервые дана характеристика распределения частот генов основных цитокинов: аллельных вариантов и генотипов, в русской и башкирской популяциях Челябинской области.

Показано наличие межпопуляционных различий в частотах встречаемости аллельных вариантов и генотипов генов цитокинов IL-IRa, IL-ip, EL-4, TNFa у больных РА русских и башкир.

Новыми являются данные об ассоциации комбинаций конкретных генотипов генов цитокинов IL-lp и IL-4, лежащих на разных хромосомах и характеризующихся альтернативной функцией своих продуктов при воспалении, а также генотипов TNFa, входящих в различные гаплотипы, с устойчивостью/предрасположенностью к РА башкирской и русской популяций.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты сравнительного анализа аллелей, генотипов, внутригенных и межгенных связей генов основных цитокинов в ассоциации с РА у русской и башкирской популяционных групп позволили установить наличие межпопуляционных различий и показать значимость конкретных генотипов генов IL-ip, IL-4, TNFa в создании генетических комбинаций, способных выступить в качестве маркеров предрасположенности/устойчивости к РА у русских и башкир. Данные о носительстве определенных генотипов, образованных полиморфными сайтами в генах TNFa и IL-ip, могут служить теоретической базой в разработке вопросов фармакогеномики и предложены в качестве дополнительных диагностических маркеров РА.

Полученные данные могут бьггь использованы в популяционных исследованиях в рамках научного направления «Генетическое разнообразие человека», а также в работах по разделам экологическая, эволюционная и инфекционная иммуногенетика. Кроме того, обследование двух популяций Челябинской области - русских и башкир, связано с необходимостью получения данных о распределении частот аллелей и генотипов генов цитокинов среди многонационального населения евроазиатской части России и включения полученных сведений в регистр доноров костного мозга.

Анализ полиморфизма генов цитокинов IL-IRa, IL-4, IL-ip, TNFa y русских и башкир Южного Урала проводится впервые.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Для русской и башкирской популяций Челябинской области характерны межпопуляционные различия в распределении полиморфных генов IL-IRa, IL-4, -238 G/A TNFa.

2. В башкирской популяции протекторным к ревматоидному артриту является генотип С/Т +3953 IL-ip, а поздний возраст начала ревматоидного артрита ассоциирован с генотипом 2r/2r VNTRIL-4.

3. В русской популяции только у женщин установлен маркер предрасположенности к ревматоидному артриту - SNP -1031 Т/С TNFa, а клинические варианты - ранний возраст начала ревматоидного артрита и возникновение системных проявлений, соответственно, ассоциированы с генотипами +3953С/Т гена IL-lp, и -308G/A TNFa.

4. Среди всех изученных межгенных и внутригенных взаимодействий генов цитокинов для формирования предрасположенности/устойчивости к ревматоидному артриту имеют значение следующие комбинации: у башкир с чувствительностью/устойчивостью к ревматоидному артриту ассоциированы различные генотипы комбинации генов цитокинов +3953 IL-Iß и VNTRIL-4, у русских - чувствительность к ревматоидному артриту ассоциирована с комбинациями генотипов гена TNFa G/A-308 - С/А -863 и G/A-308 - Т/С -1031.

Внедрение результатов исследования

Результаты работы внедрены в учебный процесс: используются при преподавании отдельных тем курса иммунологии на биологическом факультете ГОУ ВПО «Челябинский государственный университет».

Апробация работы и публикации

Материалы диссертационной работы обсуждались на конференциях: «IV конференция Иммунологов Урала» (г. Уфа, 2005), «Новые лабораторные технологии в диагностике и лечении заболеваний человека» (г. Челябинск,

2006), «V конференция Иммунологов Урала» (г. Оренбург, 2006), Конференция молодых ученых, поев, памяти профессора H.H. Кеворкого «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (г. Пермь 2006), XI Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (г. Санкт-Петербург,

2007), международная конференция «Биотехнология как научно-практический приоритет развития Кировской области» (г. Киров, 2007), «VI конференция Иммунологов Урала» (г. Ижевск, 2007), конференция зональной лаборатории иммунологического типирования тканей «Фундаментальное и прикладное значение оценки генов иммунного ответа» (г. Челябинск, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация представляет собой рукопись объемом 133 страницы машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, глав с описанием собственных исследований, заключения, выводов, приложения и списка литературы, включающего 170 источников, в том числе 46 отечественных и 123 иностранных. Работа иллюстрирована 8 рисунками и 27 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Характеристика обследованных лиц. Проведенная работа относится к типу ретроспективных исследований «случай-контроль» [Реброва О.Ю., 2002]. Анализ ассоциации полиморфизма генов цитокинов проводили на

выборках больных РА русской (97 человек) и башкирской (61 человек) популяций. Отбор больных с диагнозом ревматоидный артрит осуществлялся ассистентами кафедры внутренних болезней ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» на базе НУЗ «ДКБ на ст. Челябинск ОАО РЖД» и врачами ревматологами ревматологического отделения МУЗ Городской Клинической больницы №6 г. Челябинска вне зависимости от возраста, стадии и клинического варианта РА (табл.1, 2). В качестве критериев диагностики заболевания были приняты Критерии Американской ревматологической Ассоциации (1987 г.).

Таблица 1

Демографическая характеристика обследуемых групп _

Общее количество Русские Башкиры

Группа сравнения Больные РА Группа сравнения Больные РА

213 % 97 % 93 % 61

Мужчин 119 55,9 17 17,5 62 66,7 7 11,5

Женщин 94 44,1 80 82,5 31 33,3 54 88,5

Средний возраст, лет 34,6±0,75 51,7±1,3 36,1±0,98 47,2±1,4

Таблица 2

Клиническая характеристика больных РА

Клинико-анатомическая ха рактеристика Русские, п=90 Башкиры, п=61

Количество пораженных суставов олигоартрит 4 (4,4%) 1 (1,6%)

полиартрит 86 (95,6%) 60 (98,4%)

Системные проявления 18(20%) 0 (0%)

Наличие ревматоидного фактора (РФ) серопозитивный 74 (82,2%) 49 (80,33%)

серонегативный 16(17,8%) И (18,03%)

Степень активности I - минимальная 26 (28,9%) 23 (37,7%)

П - средняя 58 (64,4%) 31 (50,8%)

III - высокая 6 (6,7%) 7(11,5%)

Рентгенологическая стадия артрита I 11(12,2%) 8 (13,1%)

II 38 (42,2%) 21 (34,9%)

III 31 (34,4%) 20 (32,8%)

IV 10(11,1%) 12 (19,7%)

Функциональная недостаточность опорно-двигательного аппарата 0 29 (32,2%) 15 (24,6%)

I 36 (40%) 27 (44,3%)

II 24 (26,7%) 18(29,5%)

III 1 (1,1%) 1 (1,6%)

Средний возраст начала заболевания, лет 40,5+1,47 37,9±1,44

Длительность заболевания, лет 10,2±1,12 9,9±0,91

Группы контроля включали практически здоровых лиц русской (213 человек) и башкирской (93 человека) популяций. Принадлежность к популяционной группе определялась по данным генеалогического анамнеза до третьего поколения (согласно рекомендациям 8-го Международного Симпозиума в 1980г., Лос-Анджелес, США).

Иммуногенетические методы исследования

Работа велась на базе лаборатории иммуногенетического типирования (Научно-учебный центр молекулярной иммуногенеггики УрО РАН/ ГОУ ВПО «Челябинский государственный университета/ОГУТТ «Челябинская областная станцня переливания крови»). Исследовали 7 полиморфных вариантов 4 генов цитокинов: 1Ь4, ПЛЯа, 1Ь-1(3, ЮТа (табл.3).

Для исследования были использованы образцы тотальной ДНК, выделенной из цельной венозной крови взрослых неродственных между собой практически здоровых представителей и больных РА русской и башкирской популяций.

Генотипирование осуществляли путем прямой ПЦР-амплификации и ПДРФ-анализа, в качестве метода детекции использовался электрофорез в 1,5% агарозном или 8% акриламидном гелях.

Таблица 3

Характеристика исследуемых генов

ген полиморфизм Локализация в гене, характеристика

1Ь- уетя второй интрон: аллели с 2-х, 3-х, 4-мя, 5-ю и 6-ю кратными

повторами

1Ь-4 уши третий интрон: аллели с 2-кратным, 3-х кратным повтором

ЕЬ-10 +3953 СУТ 5 экзон: рестрикционный сайт, эндонуклеаза рестрикции ТаЧ1(65°); +3953* Т: 550п.н. - редкий, +3953*С: 404,146 п.н. - частый

Т№а Промотор:

-1031 Т/С ВрН (37°) -1031*С: 193; 71 п.н. - редкий,-1031*Т: 264 пл. -частый;

-863 С/А ТаЯ(65°) -863*А:104;21 пл. - редкий, -863*С:125п.н. -частый;

-308 Б/А N«>1(37°) -308* А:126 п.н- редкий,-308*0:104;22п.н. -частый;

-238 в/А ВатШ(37°)-238*А:128п.н.-реякий,-238*0:109;19п.н.-частый.

Статистическая обработка результатов

Критериями для анализа служили: частота аллельного варианта, частота генотипа, частоты сочетаний генотипов, показатель отношения шансов (OR), критерий относительного риска (RR) с расчетом 95% доверительного интервала [Реброва О.Ю., 2002], среднее арифметическое вариационного ряда и ошибка среднего (М±ш) [Гланц С., 1999].

Отклонение частот генотипов от распределения Харди-Вайнберга оценивали с помощью сравнения ожидаемых (рассчитанных по уравнению Харди-Вайнбрега) и наблюдаемых частот используя у2 тест для многопольных таблиц [Реброва О.Ю., 2002]. Достоверность различий в частотах встречаемости аллелей и генотипов для одной степени свободы рассчитывалась согласно %2 критерию, критерию %2 с поправкой Иейтса на непрерывность и точному двухстороннему критерию Фишера [Зарецкая Ю.М., 1983; Гланц С., 1999]. Для оценки статистической значимости распределения частот генотипов в исследуемых группах применялся критерий максимального правдоподобия (G или х2мь) для степеней свободы больше 1.

Отдельно проводили оценку ассоциации сочетаний генотипов исследуемых генов с предрасположенностью к РА - трехфакторные взаимодействия, с помощью иерархического логлинейного анализа.

Было проанализировано носительство одновременно двух генотипов разных генов, располагающихся на одной (IL-IRa и IL-1P) или на разных хромосомах (для пар генов EL-lRa и IL-4, IL-1Р и IL-4) и полиморфных сайтов одного гена (для гена TNFa).

Процедура анализа состояла из следующих этапов.

- Кодирование трехфакторного взаимодействия: ген I (один ген) - ген П (второй ген) - предрасположенность к РА.

- Для каждого сочетания данные о частотах встречаемости генотипов сводили в таблицу сопряженности с тремя входами: ген I, ген П, предрасположенность к РА. Критериями для оценки достоверности служили: критерий Максимального Правдоподобия G или x2ml и критерий Пирсона отклонения Фримана-Тьюки [Sokal R.R., 1995]. Поскольку в таблицах имелись частоты меньше 5, то ко всем ячейкам добавляли константу 8 = 0,5.

Затем процедура повторялась для двухфакторных взаимодействий, которые входили в составленное трехфакторное взаимодействие:

- комбинации генотипов двух генов (кодировка: ген I; ген П) позволяет оценить вероятную ассоциацию или наследуемость двух генов;

- комбинация генотипов одного гена и предрасположенность к РА (кодировка: ген I и предрасположенность к РА) - распределение частот генотипов, если оно было бы характерно только для первого гена без учета второго, среди больных РА и здоровых лиц;

и

- комбинация генотипов второго гена и предрасположенность к РА (кодировка: ген П и предрасположенность к РА) - носительство генотипов, если оно было бы характерно только для второго гена без учета первого, среди больных РА и здоровых лиц.

Во всех случаях различия считали статистически значимыми при р< 0,05, незначимыми при р >0,10; для промежуточных значений р (0,05^р< 0,10) обсуждали тенденцию к различиям.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Работа проводилась в два этапа, которые тесно связаны между собой: первый относится к научному направлению «Генетическое разнообразие человека» и был необходим для создания групп контроля двух изучаемых популяций Челябинской области: русских и башкир, без которых нельзя было выполнить второй этап в рамках проблемы поиска генов-кандидатов предрасположенности/устойчивости к РА.

Анализ распределения генов цитокинов в выборках практически здоровых лиц русской и башкирской популяций Челябинской области

Наблюдаемые в исследовании частоты генотипов в выборках русских и башкир соответствуют ожидаемым согласно закону Харди-Вайнберга, данные популяции находятся в состоянии равновесия.

При исследовании здоровых лиц русской и башкирской популяций установлены межпопуляционные различия в распределении следующих вариантов генов: ILl-Ra, IL-4, -238 SNP Q/A TNF, которые представлены на рис. 1, 2, 3.

-Жг--

-----1 i

, - —1

■ —X

У:1 „, У

* JP & # #

ф 4 t*1 t* &!■ yf

аллели и генотипы IL-1Ra

Рис. I. Распределение аллелей и генотипов 1Ь-Ша у русских и башкир Челябинской области Примечание: темные столбики - частоты аллелей и генотипов (ИЯа у русских; светлые столбики - частоты аллелей и генотипов 1Ь-Ша у башкир; I - уровень значимости р<0,1; 1 - уровень значимости р<0,05

г ф?

Рис. 2. Сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов 1Ь-4 в популяционных группах русских и башкир Челябинской области Примечание: темные столбики - частоты аллелей и генотипов 11,-1 Ка у русских; светлые столбики - частоты аллелей и генотипов И1 Ка у башкир; - уровень значимости р<0,1, - уровень значимости р<0,05

Рис. 3. Сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов -238 G/A TNFа в популяциях русских и башкир Примечание: темные столбики - частоты аллелей и генотипов -238G/A TNFa у русских; светлые столбики - частоты аллелей и генотипов -238G/A TNFa у башкир; .-у- - уровень значимости р<0,05

Таким образом, для башкирской популяции в сравнении с русской характерны следующие особенности:

1. IL-IRa - снижена частота аллеля 2г (%2=9,12, р=0,0025) и отсутствует генотип 2г/2г (точный двухсторонний критерий Фишера - р=0,007), повышена частота аллеля 4г (%2=5,94, р=0,015) за счет повышенных частот генотипов 4г/4г (х =2,84, р=0,09), 4г/3г (точный двухсторонний критерий Фишера -р=0,085);

2. ТЬ-4 - высокая частота аллеля 2г (х =26,13", 1 степень свободы, р<0,0001) и несущих его генотипов (2г/2г, Зг/2г; в = 24,15; 2 степени свободы; р=0,00001), ассоциированных с повышенной продукцией 1Ь-4;

3. ТТЧРа - высокие частоты аллеля -238*А (%~7,77; 1 степень свободы; р=0,0053) и его гетерозиготного генотипа в/А (0=7,295; 2 степени свободы; р=0,026; О А - %3=5,72; 1 степень свободы; р~0,017), отвечающих за пониженную продукцию ТЫ Ра.

Не установлено отличий в частотах аллелей и генотипов, образованных полиморфными сайтами ЮТа -308 в/А, -1031 Т/С, -863 С/А и +3953 С/Т 1Р, между представителями русской и башкирской популяций. Согласно литературным данным, для полиморфных сайтов +3953 С/Т П-1(), -308 С/А Т№а характерны межэтнические различия [Вппкшап В.М.И., 1997; Asghar Т. 2004; AguiH6n 1.С. 2006]. Можно предположить, что на отсутствие межпопуляционных различий повлияли процессы ассимиляции башкирской популяции с другими, проживающими на территории Челябинской области.

Анализ ассоциации полиморфизма генов 1Ь-Ша, 1Ь-1р, 11.-4, ТМРа с предрасположенностью и клиническими вариантами ревматоидного артрита у русских и башкир

В группе больных РА русской популяции частоты генотипов исследуемых генов соответствовали равновесию Харди-Вайнберга, кроме частоты редкого гомозиготного генотипа С/С -1031 ЮТа. У больных такой генотип не был обнаружен, тогда как его ожидаемая частота составила 4,3% (х2=4,1, р<0,05). Полученные различия можно объяснить редкостью данного генотипа.

В выборке больных РА башкирской популяции отличия в частотах наблюдаемых генотипов связаны с генотипами +3953 1Ь-1Р Т/Т, С/Т: для генотипа Т/Т наблюдаемая частота была выше теоретически ожидаемой (11,5% против 3,6%, х2=Ю,77, р<0,005), а частота гетерозиготного генотипа -ниже, чем теоретически ожидаемая (14,8% против 30,6%, х2=5,0, р<0,03). Можно предположить, что изменения частот генотипов связаны со стохастическими процессами в малых выборках [Фогель Ф., 1990; Шевченко В.А., 2002].

Предрасположенность/устойчивость к РА

Больные РА русской популяции. В общей группе больных РА частоты аллелей и генотипов генов 1Ь-111а, 1Ъ-1р, 1Ь-4, ТОТа не отличались от частот в выборке практически здоровых лиц. В группе женщин, больных РА, установлен маркер чувствительности к РА - генотип Т/С -1031 ТОТа (45% против 29,8%, С=5,11; 2 степени свободы, р=0,078,3^=43, р=0,038, для одной степени свободы, 1Ш=1,51; 95%ДИ 1,02+2,25; (Ж=1,89; 95%ДИ 1,03+3,62; рис.4.).

80 70 60 ^ 50

Е

о 40

й 30 у

20 10 О

С/С Т/С Т/Т

генотипы-1031 Т№а

Рис. 4. Частоты генотипов -1031 Т/С ТОТ а в группах женщин, больных РА и здоровых,

русской популяции

Примечание: темные столбики - частоты генотипов -1031 Т/С ТЫРа среди женщин, больных РА; светлые столбики - частоты генотипов -1031 Т/С "ШРа в группе практически

здоровых женщин;

Л - уровень значимости р<0,1; А — уровень значимости р<0,05

Больные РА башкирской популяции. С предрасположенностью к РА установлена ассоциация полиморфного сайта +3953 С/Т 1Ь-1|3 (С=8,0830; 2 степени свободы, р=0,018). Группа больных РА характеризовалась повышенной частотой гомозиготного генотипа Т/Т+3953 (критерий

Фишера - р=0,052) и сниженной - гетерозиготного генотипа С/Т (/гс поправкой Йейтса=4,50, р=0,034; 1 степень свободы), что представлено на рис 5. Можно предположить, что генотип +3953 С/Т 1Ь-1Р является протектором развития РА у башкир С>К=0,38; 95%ДИ 0,17- 0,88.

<рз,г

X 55 45т"______ш

¡ш.

Рис. 5. Частоты генотипов 11,-1 р у больных РА и практически здоровых лиц башкирской

популяции

Примечание: уровень значимости р<0,1; уровень значимости р<0,05

В отличие от русской популяции у башкир-женщин не установлено ассоциации генов цитокинов с предрасположенностью к РА.

Клинические варианты РА. В соответствии с третьей задачей исследования оценивали распределение аллелей и генотипов генов ГИЫа, 1Ь-1Р, 1Ь-4, ТЫ Ра при различных клинических вариантах РА у русских и башкир.

1. Частоты встречаемости аллелей и генотипов генов 1Ь-Ша, 1Ь-1р, 1Ь-4, ТЫРа были одинаковы в группах серопозитивного и серонегативного вариантов РА у русских и башкир.

2. В группе больных РА русской популяции установлен маркер раннего возраста начала ревматоидного артрита - генотип С/Т +3953 1Ь-1р (в= 5,78; две степени свободы, р=0,056; для одной степени свободы, /2 с поправкой Йейгса=4,66, р=0,031; ОК=3,17; 95% ДИ 1,19-8,45; 1Ж=2,1; 95%ДИ 1,19-3,72).

3. У башкир определен маркер позднего начала РА - генотип 2Ш2К УШИ 1Ь-4 (частота в группе с поздним РА 35%, а с ранним - 7,7%; С=6,74, две степени свободы, р=0,034, -¿с поправкой Йейтса=5,20, одна степень свободы, р=0,023; ОЯ=6,46; 95%ДИ 1,204-42,94, 1Ш=4,55; 95%ДИ 1,28-16,15).

4. Полиморфизм в точке -3080/А ТЫБа ассоциирован с наличием системных проявлений в группе русских, больных РА (табл.4.).

Таблица 4

Распределение аллелей и генотипов БМ* -308 в группах больных РА с

системными проявлениями и без системных проявлений

Группа больных с Группа больных х2, OR, 95% ДИ

системными без системных р-уровень

s s проявлениями, проявлений, значимости

ч е п=18, кол-во п=72, кол-во

< аллелей - 36 аллелей - 144

п % п %

А 11 30,56 16 11,1 8,54 3,52; 1,45+8,5

G 25 69,44 128 88,9 р=0,0035 0,28;

0,12+0,69

генотипы G= = 8,7114; 2 степени свободы; р=0,013

А/А 1 6,25 0 0 критерий Фишера -р=0,2

G/A 9 56,25 16 22,5 4,24 р=0,04 3,5;

1,17+10,5

G/G 8 50 56 78,9 6,25 р=0,012 0,23;

0,07+0,7

Критерий OR показал, что высокопродуктивный аллель -308*А с заменой и его гетерозиготный вариант G/A предрасполагают к возникновению

системных проявлений у больных РА, а аллель нормальной продукции -308*G в гомозиготном состоянии (G/G) является протекторным для развития системных осложнений.

Таким образом, установлены межпопуляционные различия частотного распределения аллелей и генотипов генов IL-lRa, IL-ip, IL-4, TNFa у практически здоровых представителей и больных РА русской и башкирской популяционных групп. Особенностью башкирской популяции является достоверное повышение частоты встречаемости генотипа 2R/2R IL-4, связанного с поздним возрастом первой атаки РА, что является более удачным клиническим вариантом развития PA [Wilder R.L., 1996; Wolff J.L., 2002].

Межгенные и внутригенные комбинации генотипов генов IL-lRa, IL-ip, IL-4, TNFa и их ассоциация с РА

Было проанализировано носительство одновременно двух генотипов разных генов, располагающихся на одной (IL-lRa и IL-ip) или на разных хромосомах (для генов IL-lRa, IL-4, EL-lp) и полиморфных сайтов одного гена (для гена TNFa). Наш подход основан на использовании иерархического логлинейного анализа, в котором создавались таблицы сопряженности для частот комбинаций определенных генотипов пары генов у больных РА и здоровых лиц. Достоверность оценивалась с помощью критерия максимального правдоподобия и отклонений Фримана-Тьюки. Были составлены следующие трехфакторные комбинации для представителей русской и башкирской популяций:

1. IL-1Р (ген I) - IL-lRa (ген П)- предрасположенность/устойчивость к РА;

2. IL-1Р (ген I) - IL-4 (ген П) - предрасположенность/устойчивость к РА;

3. IL-lRa (ген 1) - TL-4 (ген И) - предрасположенность/устойчивость к РА;

4. SNPs в промоторе TNFa - предрасположенность/устойчивость к РА.

В комбинации включены гены, продукты которых находятся в тесном

взаимодействии друг с другом при развитии воспаления и во многом определяют направленность адаптивного иммунного ответа и формирование аутоиммунного процесса. Каждое из описанных выше трехфакторных взаимодействий в свою очередь состоит из трех двухфакторных взаимодействий (поэтому анализ называется иерархическим).

1. Комбинация «частоты встречаемости комбинаций генотипов гена I и гена П» (ген I - ген II).

2. Комбинация «частоты встречаемости генотипов первого гена у больных РА и здоровых лиц» (ген I - предрасположенность/устойчивость к РА).

3. Комбинация «частоты встречаемости генотипов второго гена у больных РА и здоровых лиц» (ген П - предрасположенность/устойчивость к РА).

Использование статистических методов исследования при составлении комбинаций генотипов генов цитокинов позволило установить

межпопуляционные различия между русскими и башкирами, больными РА, заключающиеся в том, что предрасположенность/устойчивость к РА у башкир ассоциирована с межгенной комбинацией генотипов генов 1Ъ-1р - 1Ь-4, у русских - с внутригенными комбинациями различных БЫРв ЮТа: «-308 - -863», «-308--1031».

У башкир к РА предрасполагают две комбинации генотипов ГЬ-1 р - 1Ь-4 (С[4]=12,75; р=0,013): Т/Т-ЗК/2Я (011=10,04; 95%ДИ 1,16-87,1; Ш=9,05; 95%ДИ 1,09+14,6) и СС-ЗШЗН (СЖ=2,36; 95%ДИ 1,06-5,24; И1=1,96; 95% ДИ 1,05-3,66), а устойчивость к РА ассоциирована с комбинацией СУТ-ЗКУЗК (ОЯ=0,11; 95%ДИ 0,014+0,904; Ш1=0,11; 95% ДИ 0,015-Ю,84).

У больных РА русской популяции комбинация генотипов 1Ь-1р — 1Ь-4 оказалась значима только у женщин, больных РА: чувствительность к РА ассоциирована с сочетанием генотипов С/Т-ЗШт ((Ж=3,6; 95% ДИ 1,41+9,2; Ш=3,02; 95% ДИ 1,32-6,9).

Отличительной чертой больных РА русской популяции являлась ассоциация внутригенных комбинаций вОТв ТХГа с восприимчивостью к РА: у больных РА повышены частоты встречаемости сочетаний С/А-308-С/А-863 (12,37% против 2,82%, у? с поправкой Йейтса=9,45, р=0,0021, одна степень свободы; ОК=4,87; 95% ДИ 1,76-13,45; Ю1=4,39; 95%ДИ 1,69-41,4); С/А-308 — Т/С-1031 ЮТа (12,37% против 3,76%; одна степень свободы, х,2 с поправкой Йейтса=6,83, р=0,009, ОЯ=3,62; 95% ДИ 1,42+9,2; Ш1=3,29; 95% ДИ 1,38+7,82) по сравнению с группой контроля.

В комбинациях 8ЫРв ТЫРа «-863 - -1031 и предрасположенность/устойчивость к РА» и «-238 - -1031 и предрасположенность/устойчивость к РА» у русских и башкир оказались значимы двухфакторные взаимодействия между генотипами «ген I (-1031) и ген П (-863)» (у русских - 0[8]=247,2; р<0,0001, у башкир - 0[8]=65,011; р<0,0001), «ген I (-1031) и ген П (-238)» (у русских -<3[8]=33,358; р=0,00005, у башкир - С[8]= 49,989; р<0,0001). Однако комбинации «ген I -предрасположенность/устойчивость к РА» и «ген П — предрасположенность/устойчивость к РА» для каждой из этих пар БМ^ Т№а оказались статистически незначимы. По нашим предварительным данным, между «-1031 и -863», «-1031 и -238» гена ТОРа вероятно существование неравновесного сцепления (1ЛЭ).

Оценка комбинации «1Ь-Ша - 1Ь-4 — предрасположенность к РА» и комбинации «1Ь-1р - 1ИИа - предрасположенность к РА» не показала статистической значимости для развития РА ни трехфакторных, ни входящих в их состав всех двухфакторных взаимодействий у представителей русских и башкир Челябинской области.

В основу проведенного исследования вклада генов цитокинов в формирование предрасположенности к ревматоидному артриту положен комплексный подход, при котором проведена оценка распределения полиморфных вариантов генов IL-IRa, IL-4, IL-lp, TNFa среди практически здоровых лиц двух популяций Челябинской области: русских и башкир, и анализ частот встречаемости аллельных вариантов, генотипов и сочетаний генотипов среди больных РА.

Установлены межпопуляционные особенности в распределении частот встречаемости аллельных вариантов и генотипов полиморфных генов IL-IRa, IL-4, -238 G/A TNFa среди практически здоровых лиц русской и башкирской популяций. Кроме того, менаду популяциями русских и башкир показаны различия в ассоциации полиморфных сайтов исследуемых генов с чувствительностью/устойчивостью к РА: у башкир генотип +3953 С/Т IL-ip — протектор РА, у женщин русской популяции предрасполагает к РА генотип -1031 Т/С TNFa, и с клиническими вариантами РА: возрастом начала РА (+3953 С/Т IL-ip, 2r/2r IL-4) и наличием системных проявлений (-308 G/A TNFa).

Важность предварительной оценки полиморфной структуры генов цитокинов в популяциях различного происхождения диктуется необходимостью проведения анализа особенностей распределения в популяциях мира аллелей генов-кандидатов при различных аутоиммунных комплексных и инфекционных заболеваниях [Фрейдлин М.Б., 2006; Шабалдин А.В., 2007; Camargo J.F., 2004]. На сегодняшний день известно, что частота РА, его клинический полиморфизм и тяжесть неодинаковы у разных народов [Asgar А.К., 2003; Ferucci E.D., 2004; Aguillôn J.C., 2006], возможно, это связано с межпопуляционными различиями в распределении генов цитокинов, которые наряду с системой HLA являются одним из факторов, определяющих отличия в распространенности РА.

В то же время, представленные результаты показывают сложность получения однозначных ответов, когда речь идет о генах цитокинов, являющихся древнейшим защитным звеном у многоклеточных эукариот (начиная с беспозвоночных), и, вероятно, поэтому имеющих как эволюционно-устойчивые генные комбинации [Фрейдлин М.Б., 2001], так и множество вариантов межгенных взаимодействий, в ходе развития физиологических и патологических воспалительных реакций [Коненков В.И., 2003], вариабельность которых определяется как генетическим полиморфизмом и различными генными сочетаниями, так и окружающими условиями и стохастическими процессами.

Об этом может свидетельствовать факт влияния конкретных генотипов, входящих в одну и ту же комбинацию генов IL-lp - IL-4, на ее функциональную значимость в отношении чувствительности/устойчивости к РА у различных популяций, а именно башкирской и русской. Установлено:

1. Гетерозиготный генотип С/Т полиморфного сайта +3953 IL-ip является протекторным для развития РА у башкир и входит в комбинацию генов IL-ip - IL-4, ассоциированных с устойчивостью к РА.

2. У русских гетерозиготный генотип С/Т +3953 IL-ip является маркером неблагоприятного признака — раннего возраста начала PA (OR=3,17; 95% ДИ 1,19+8,45), и входит в комбинацию генотипов IL-lp - IL-4, определяющих чувствительность к РА у женщин.

3. Гомозиготный генотип Зг/Зг VNTR IL-4 способен образовывать комбинации с различными генотипами IL-ip, и эти вариации межгенных взаимодействий имеют различную ассоциацию с РА в одной и той же популяции: у башкир - комбинация С/С - Зг/Зг проявляет себя как предрасполагающая к развитию РА, а С/Т -Зг/Зг - ассоциирована с устойчивостью к РА.

Мы понимаем, что оценка межгенных комбинаций, в основе которой лежат математические методы исследований, является только моделью взаимодействия различных генов, их генотипов и гаплотипов между собой. Но изучение таких отношений имеет, как отмечает ряд авторов [Brassart D., 2006; Ritchie M.D., 2005], большое будущее и поможет приблизить понимание механизмов многих патологических состояний и, прежде всего, сложно наследуемых мультифакторных заболеваний, в том числе РА.

Выводы

1. Между популяциями русских и башкир установлены межпопуляционные различия в распределении аллельных вариантов и генотипов генов IL-IRa, IL-4, -238 G/A TNFa и сходство по частотам аллелей и генотипов полг"-орфных локусов IL-ip, -1031Т/С, -863 С/А, -308 G/A TNFa.

2. Предрасположенность/устойчивость к ревматоидному артриту в русской и башкирской популяциях определяется различными вариантами генов цитокинов: в русской популяции только у женщин выявлен маркер предрасположенности к ревматоидному артриту - генотип Т/С -1031 TNFa, а у башкир - гетерозиготный генотип С/Т +3953 IL-ip - протектор ревматоидного артрита.

3. В русской популяции ранний возраст начала атаки, наличие системных проявлений ревматоидного артрита ассоциированы с конкретными генотипами С/Т +3953 IL-lp, -308 G/A TNFa. У башкир поздний возраст начала ревматоидного артрита ассоциирован с генотипом 2r/2r IL-4.

4. У русских комбинации генотипов внутри гена TNFa «-308 —863» и «-308 — -1031» определяют чувствительность к ревматоидному артриту.

5. Функциональная значимость комбинации различных генов, располагающихся на разных хромосомах, IL-ip — IL-4, в отношении устойчивости/чувствительности к ревматоидному артриту в башкирской и русской популяциях зависит от конкретных генотипов, входящих в эту комбинацию.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Сташкевич, Д.С. Распределение генов HLA-DRB1, ILl-Ra у больных ревматоидным артритом русской национальности, проживающих на территории Челябинской области / Д.С. Сташкевич, Е.Б. Шамшурина // Сборник тезисов докладов всероссийского конкурса инновационных проектов «Живые системы» - Киров, 2005 - С. 269 -271.

2. Сташкевич, Д.С. Роль генетических систем АРИЛ-1 и HLA-DRB1 в развитии ревматоидного артрита/ Д.С. Сташкевич, AJI. Бурмистрова, Т.А. Суслова, M.JI. Филипенко, ЕЛ. Воронина, Е.Б. Шамшурина, И.В. Шмунк, И.В. Девальд/ Иммунология Урала. Материалы ГУ конференции иммунологов Урала. -Уфа, 2005. - С. 91-92.

3. Сташкевич, Д.С. Характер распределения аллелей генов АРИЛ-1 и ИЛ-4 у больных ревматоидным артритом русской национальности, проживающих в Челябинской области /Д.С. Сташкевич, А.Л. Бурмистрова, Т.А. Суслова, И. В. Шмунк, Е.Б. Шамшурина, И. В. Девальд, М.Л. Филипенко, E.H. Воронина // Успехи современного естествознания: Материалы юбилейной конференции с международным участием «Современные проблемы науки и образования».-М.: «Академия Естествознания», 2006. — №3. -С.52-53.

4. Stashkevich, D.S. Distribution of HLA-DRB1 and IL1-RA genes' frequencies in patients with rheumatoid arthritis under conditions of man-caused loading of Chelyabinsk city / D.S. Stashkevich, E.B. Shamsurina, A.L. Burmistrova, T.A. Suslova, M.L. Philipenko, E.N. Voronina, I.V. Devald, A.O. Isakanova, M.N. Boldiriva, L.P.Alekseev // European journal of natural history, 2006. - №3. -P.135-137.

5. Сташкевич, Д.С. Распределение аллель пых вариантов генов АРИЛ-1 и ИЛ-4 у больных ревматоидным артритом русской национальности, проживающих в Челябинской области / Д.С. Сташкевич, Т.А. Суслова, И.В. Шмунк, Е.Б. Шамшурина, О.Н. Димчева, МЛ. Филипенко, E.H. Воронина // Материалы конференции, посвященной 25-летию Центральной научно-исследовательской лаборатории Челябинской государственной медицинской академии. - Челябинск, 2006. -С. 90-91.

6. Сташкевич, Д.С. Характеристика частот встречаемости аллелей генов HLA-DRB1*04, IL IRA у больных ревматоидным артритом русской национальности, Челябинской области / Д.С. Сташкевич, Е.Б. Шамшурина, О.Н. Димчева, АЛ. Бурмистрова, Т.А. Суслова // Russian Journal of IMMUNOLOGY: Российская научно-практическая конференция «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия», вводные лекции и тезисы докладов. - 2006 - Vol.9 - Sup.3. -С.94.

7. Суслова, Т.А. Распределение частот аллелей генов цитокинов ИЛ-lRa, ИЛ-4 в популяциях русских и башкир Челябинской области / Т.А. Суслова, АЛ. Бурмистрова, Д.С. Сташкевич, Е.Б. Шамшурина //

Аллергология и иммунология. - М.: «Медицина — Здоровье», 2006. -Том 7, №3. - С.252

8. Бурмистрова, A.JI. Аллельные варианты генов цитокинов ИЛ-10, ИЛ-1РА, ИЛ-4 у больных ревматоидным артритом русской национальности, проживающих в Челябинской области / А.Л. Бурмистрова, Д.С., Сташкевич, Т.А. Суслова, Е.Б. Шамшурина, И.В. Девальд, А.О. Исаканова, О.Н. Димчева, Е.П. Конева, М.Л. Филипенко, Е.Н. Воронина // Иммунология Урала: Материалы V конференции иммунологов Урала. - Оренбург, 2006. - №1(5). — С. 155-156.

9. Сташкевич, Д.С. Иммуногенетический профиль по генам ИЛ-ip, ИЛ-1Ра, ИЛ-4 у русских и башкир Челябинской области / Д.С. Сташкевич, А.Л. Бурмистрова, Т.А. Суслова, И.В. Девальд // Вестник Уральской медицинской академической науки: Всероссийская конференция молодых ученых, посвященная памяти Н.Н. Кеворкова «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к практике». - Екатеринбург, 2006. -№3-1 (14). - С230-233.

10. Сташкевич, Д.С. Полиморфизм генов цитокинов ИЛ-1в, Ш1-1Ра, ИЛ-4 у больных ревматоидным артритом русской национальности Челябинской области / Д.С. Сташкевич, А.Л. Бурмистрова, Т.А. Суслова, А.О. Исаканова, И.В Девальд, О.Н. Димчева // Вестник Оренбургского государственного университета. - Оренбург, 2006. - № 10, приложение Часть 2. - С.346 - 351.

11. Суслова, Т.А. Ассоциация полиморфизмов генов цитокинов ИЛ-1Ра, ИЛ-4, ИЛ-1|3 с возрастом атаки ревматоидного артрита у башкир Челябинской области / Т.А. Суслова, Е.Б. Хромова, Д.С. Сташкевич, А.Л. Бурмистрова, И.В. Девальд, О.Н. Димчева // Аллергология и иммунология. V Всемирный конгресс по иммунопатологии и аллергии, V Европейский конгресс по астме. - М.: «Медицина - Здоровье», 2007. - Т.8, №1. -С.76.

12. Суслова, Т.А. Анализ ассоциации полиморфизмов генов IL-ip, 1L-1RA, IL-4 с возрастом начала ревматоидного артрита у пациентов русской этнической группы Челябинской области / Т.А. Суслова, Д.С. Сташкевич, А.Л. Бурмистрова, И.В. Девальд, А.О. Исаканова, О.Н. Димчева //Медицинская иммунология. 11 Всероссийский научный форум с международным участием им. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге». - Санкт-Петербург «Человек», 2007. - Т.9, № 2-3. -С. 206-207.

13. Бурмистрова, А.Л. Гены цитокинов и их рецепторов маркеры предрасположенности и клинических вариантов течения ревматоидного артрита в различных этнических группах Челябинской области / А.Л. Бурмистрова, Т.А. Суслова, Д.С. Сташкевич// Сборник материалов Международной конференции «Биотехнология как научно-практический приоритет развития Кировской области». - Киров: «Изд-во ВятГУ», 2007. — Т.1. —С.9-13.

14. Бурмистрова, А.Л. Молекулярно-генетический анализ полиморфизмов генов цитокинов - интерлейкина-ip, рецептора антагониста

интерлейкина-1 и интерлейкина-4 у больных ревматоидным артритом башкирской этнической группы, проживающих в Челябинской области / А.Л. Бурмистрова, Д.С. Сташкевич, Т.А. Суслова, И.В. Девальд, А.О. Исаканова, О.Н. Димчева // Медицинская иммунология. - Санкт-Петербург: «Человек», 2007. - Т.9., № 6 - С. 631-634.

15. Сташкевич, Д.С. Распределение аллелей и генотипов БОТ полиморфизма в точках -308, -238 гена Т№а в выборках здоровых лиц и больных ревматоидным артритом русской этнической группы Челябинской области / Д.С. Сташкевич, А.Л. Бурмистрова, Т.А. Суслова, Е.Б. Хромова, И.В. Девальд, А.О. Исаканова // Иммунология Урала: Материалы VI конференции иммунологов Урала. - Ижевск, 2007.- С. 92-93.

16. Бурмистрова, А.Л. Полиморфизм гена фактора некроза опухолей а у больных ревматоидным артритом русской популяции Челябинской области/ А.Л. Бурмистрова, Д.С. Сташкевич, Т.А. Суслова, Е.Б. Хромова, А.О. Исаканова, И.В. Девальд // Успехи современного естествознания: Фундаментальные и прикладные исследования в медицине. Научная международная конференция. - М.: «Академия Естествознания», 2007. - №12 (приложение). - С.134-137.

17. Сташкевич, Д.С. Иммуногенетический анализ полиморфизма в гене фактора некроза опухолей альфа у больных ревматоидным артритом русской и башкирской этнических групп Челябинской области /Д.С. Сташкевич // Сборник рефератов научно-исследовательских работ аспирантов. - Челябинск: Изд-во ЮУрГУ, 2007. - С.29-30.

18. Хромова, Е.Б. Вклад гена НЬА-ОКЛ *04 и БОТ полиморфизмов гена ЮТа в предрасположенность к ревматоидному артриту у русских Челябинской области / Е.Б. Хромова, Д.С. Сташкевич, А.Л. Бурмистрова, А.О. Исаканова // Вестник Челябинского государственного университета. Биология. - Челябинск, 2008. - Вып1., №4. - С.32-33.

19. Сташкевич, Д.С. Полиморфизм гена фактора некроза опухолей а и предрасположенность к ревматоидному артриту у представителей башкирской популяции Челябинской области / Д.С. Сташкевич, Е. В. Шахматова, Т.А. Суслова, И.В. Девальд // Вестник Челябинского государственного университета. Биология. - Челябинск, 2008. - Вып1., №4. - С.36-37.

20. Суслова, Т.А. Генетическая предрасположенность к ревматоидному артриту: роль генов и гаплотипов НЪА класса II / Т.А. Суслова, А.Л. Бурмистрова, Е.Б. Хромова, Д.С. Сташкевич, И.В. Девальд, А.О. Исаканова, М.Н. Болдырева, ЛЛ. Алексеев // Иммунология. - 2008. - Т.29, №3. - С137-141.

СТАШКЕВИЧ Дарья Сергеевна

АЛЛЕЛИ И ГЕНОТИПЫ ГЕНОВ ОСНОВНЫХ ЦИТОКИНОВ И ИХ МЕЖГЕННЫЕ И ВНУТРИГЕННЫЕ СВЯЗИ В АССОЦИАЦИИ С РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ У РУССКОЙ И БАШКИРСКОЙ ПОПУЛЯЦИЙ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Челябинск - 2009

Подготовлено к печати в издательстве «Челябинская государственная медицинская академия». Лицензия № 01906. отпечатано в типографии «ПРИНТМЕД». Подписано к печати 19.01.09г. Объем 1 п.л. Формат 64x84. Гарнитура «Times New Roman Суг». Бумага для офисной техники, 80 мг/м2.

Тираж 100 экз.

Актуальность проблемы

Ревматоидный артрит (РА) - сложнонаследуемое мультифакторное заболевание с неизвестной этиологией [16, 84]. В настоящее время принято считать, что в предрасположенность/устойчивость к этому заболеванию вносят вклад гены иммунного ответа и другие, не установленные на сегодняшний день, а также факторы окружающей среды [11, 16, 82, 84 116, 153]. Возможно, инициацию заболевания вызывают микроорганизмы [9], вступающие в определенные, нередко непредсказуемые отношения с организмом хозяина, несущего особые варианты генов, продукты которых прямо или косвенно участвуют в защите организма хозяина. На сегодня хорошо известно, что РА ассоциирован с носительством определенных аллельных вариантов генов НЬАЛЖВ1 [76, 82], и эти ассоциации имеют этнические различия [5, 35].

Однако гены НЬА обеспечивают только часть общего генетического риска, примерно у 25% больных не обнаружено генов предрасположенности к РА в пределах главного комплекса гистосовместимости, и в то же время здоровые лица являются носителями генов предрасположенности к РА второго класса НЬА [167]. Скрининг генома показал участие в восприимчивости к РА других генов, рассеянных по всему геному [82, 96]. Несмотря на исследования в этой области, вопрос об этиологии заболевания до сих пор остается открытым [90, 116]. Проблема РА рассматривается как приоритетное направление «Декады костей и суставов 2000 — 2010», которая проходит под эгидой ВОЗ во многих странах мира, включая Россию [16, 22].

Территория Челябинской области представлена многонациональным населением, среди которого распространенными являются русская, популяция европеоидного происхождения, и башкирская — микст-популяция [45], с набором комплекса генов иммунного ответа, с высокой частотой встречающихся у монголоидных популяций [36]. В исследованиях И.В. Девальд и Е.Б. Хромовой, проведенных в лаборатории молекулярной иммуногенетики УрО РАН, показано наличие различий в ассоциации РА с генами и гаплотипами HLA IT: DRB1, DQA1, DQB1 между русскими и башкирами: у русских установлены аллельные варианты генов и гаплотипы, предрасполагающие к РА, а у башкир превалируют гены и гаплотипы HLA, определяющие протекцию к PA: DRB1*07,*12,*13 и целый гаплотип - В* 13 - DRB1*07- DQA1*0201- DQB 1*0201. Если у европеоидов аутоиммунные заболевания часто связаны с гаплотипом В* 15- DRB1*04 [35], то у башкир, больных РА, такой гаплотип не был представлен, что может являться их особенностью как популяции монголоидов, а наличие РА ассоциировалось с DRB 1*17(03) [12].

В свете того, что РА является хроническим воспалительным заболеванием, совершенно ясно показано в ряде работ, что развитие воспалительного процесса, его исход будет определяться во многом цитокинами, создающими регуляторную биоактивную сеть сигналов, определяющих не только врожденный иммунный ответ, но и формирование адаптивного иммунного ответа, в том числе его направленность, выраженность, персистенцию [52, 74, 116, 123, 139]. Опубликованы работы, посвященные изучению определения уровней различных цитокинов в циркуляции в физиологических условиях и при патологии [22, 33, 51, 68], и оценка интерлейкин-продуцирующей способности отдельных клеток иммунного ответа in vitro [79, 135], и значительно меньше — генам цитокинов, их рецепторов, транскрипционным регуляторным факторам, посттрансляционной модификации цитокинов [17, 27, 79, 97, 101]. Многие авторы считают, что большую роль в развитии предрасположенности и вариабельности течения мультифакторных заболеваний играют не столько отдельные аллели генов, сколько их сочетания [34, 37, 38, 63], прежде всего в сетевых взаимодействиях клеток воспаления, обеспечивающих «цитокиновый разговор». Накопление данных о распределении аллельных вариантов, генотипов и гаплотипов генов цитокинов среди различных популяций позволит приблизиться к пониманию ряда механизмов развития мультифакторных заболеваний и лечь в основу как профилактической медицины, так и подходов к лечению и созданию технологий получения современных лечебных препаратов [8, 28, 96]. Однако данные, полученные в работах этого направления исследований немногочисленны и чрезвычайно противоречивы, но их можно суммировать по определенным группам:

1. Для генов цитокинов и их рецепторов отмечены популяционные различия [48, 56, 69, 89, 97].

2. Различные аллели генов цитокинов имеют ассоциацию с различным уровнем продукции цитокинов и чувствительностью/устойчивостью к инфекционным и аутоиммунным заболеваниям [41, 72, 101].

3. Группа генов, которые, практически, конститутивно активируются при любом воспалении, составляет широко востребованный «воспалительный/хемотаксический цитокиновый» кластер, который ко-активируется в содружестве с другими кластерами генов, и их продукты взаимозависимо функционируют в клетках, прямо или косвенно определяющих течение иммунного ответа. Активация экспрессии генов различных кластеров контролируется в основном через активацию ТЬЯ-ассоциированных сигнальных путей [29], и профиль транскрипционной программы обеспечивает «общий ответ» клеток хозяина, определяемый как «видовой ответ тревоги». Исходя из сказанного, можно предположить, что кластер «воспаления» состоит из многих генов, их вариабельностей и комбинаций, которые работают в строгом взаимодействии друг с другом, что позволяет говорить о важности межгенных и внутригенных отношений в формировании общих и специфических защитных ответов организма-хозяина, дестабилизация которых может привести к пролонгированной хронической воспалительной реакции и аутоиммунному процессу.

Результаты недавних исследований показали, что развитие воспалительного ответа на встречу с инфекционными агентами определяется цитокиново-хемокиновой сетью, эффективность которой зависит от реализации общей и специфической программы активации транскрипции генов, работающих в тесном содружестве, несмотря на свое расположение на разных хромосомах [29].

Данная работа посвящена исследованию полиморфизма нескольких генов цитокинов про- и противовоспалительного действия у больных РА двух основных популяционных групп: русских и башкир, проживающих на территории Челябинской области.

Цель исследования

Установить особенности распределения аллелей и генотипов генов основных цитокинов у здоровых представителей и больных ревматоидным артритом русской и башкирской популяций и оценить наличие межгенных и внутригенных взаимодействий этих генов в ассоциации с ревматоидным артритом с целью выделения маркеров предрасположенности/устойчивости к данному заболеванию.

Задачи исследования

1. Выявить общие черты и различия в распределении аллельных вариантов и генотипов генов 1Ь-1Яа, 1Ь-4,1Ь-1р, ТИР а. между группами практически здоровых лиц русской и башкирской популяций для формирования контрольных групп.

2. Изучить особенности распределения аллелей и генотипов генов 1Ь-1Яа, ГЬ-4, 1Ь-1р, ТЫРа у больных ревматоидным артритом в сравнении со здоровыми лицами в русской и башкирской популяциях.

3. Определить частоты встречаемости аллелей и генотипов генов 1Ь-1Яа, 1Ь-4, 1Ь-1(3, ТИБсх при различных клинических вариантах ревматоидного артрита у русских и башкир.

4. Оценить ассоциацию межгенных и внутригенных взаимодействий в виде сочетаний генотипов генов цитокинов с предрасположенностью/устойчивостью к ревматоидному артриту русской и башкирской популяций.

Научная новизна

Впервые дана характеристика распределения частот генов основных цитокинов: аллельных вариантов и генотипов, в русской и башкирской популяциях Челябинской области.

Показано наличие межпопуляционных различий в частотах встречаемости аллельных вариантов и генотипов генов цитокинов 1Ь-Ша, 1Ь-1р, 1Ъ-4, Т№а у больных РА русских и башкир.

Новыми являются данные об ассоциации комбинаций конкретных генотипов генов цитокинов 1Ь-1р и 1Ь-4, лежащих на разных хромосомах и характеризующихся альтернативной функцией своих продуктов при воспалении, а также генотипов Т№а, входящих в различные гаплотипы, с устойчивостью/ предрасположенностью к РА башкирской и русской популяций.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Для русской и башкирской популяций Челябинской области характерны межпопуляционные различия в распределении полиморфных генов 1Ь-1Ка, 1Ь-4, -238 в/А ТОТа.

2. В башкирской популяции протекторным к ревматоидному артриту является генотип С/Т +3953 1Ь-1(3, а поздний возраст начала ревматоидного артрита ассоциирован с генотипом 2г/2г УЫТЯ1Ь-4.

3. В русской популяции только у женщин установлен маркер предрасположенности к ревматоидному артриту - 81МР -1031 Т/С Т№а, а клинические варианты — ранний возраст начала ревматоидного артрита и возникновение системных проявлений, соответственно, ассоциированы с генотипами +3953С/Т гена 1Ь-1[3, и -3080/А Т№а.

4. Среди всех изученных межгенных и внутригенных взаимодействий генов цитокинов для формирования предрасположенности/устойчивости к ревматоидному артриту имеют значение следующие комбинации: у башкир с чувствительностью/устойчивостью к ревматоидному артриту ассоциированы различные генотипы комбинации генов цитокинов +3953 1Ь-1(3 и УТчЛИ. 1Ь-4, у русских — чувствительность к ревматоидному артриту ассоциирована с комбинациями генотипов гена Т№а 0/А-308 -С/А -863 и 0/А-308 - Т/С -1031.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты сравнительного анализа аллелей, генотипов, внутригенных и межгенных связей генов основных цитокинов в ассоциации с РА у русской и башкирской популяционных групп позволили установить наличие межпопуляционных различий и показать значимость конкретных генотипов генов 1Ь-1р, 1Ь-4, Т№а в создании генетических комбинаций, способных выступить в качестве маркеров предрасположенности/устойчивости к РА у русских и башкир. Данные о носительстве определенных генотипов, образованных полиморфными сайтами в генах Т№а и 1Ь-1[3, могут служить теоретической базой в разработке вопросов фармакогеномики и предложены в качестве дополнительных диагностических маркеров РА.

Полученные данные могут быть использованы в популяционньтх исследованиях в рамках научного направления «Генетическое разнообразие человека», а также в работах по разделам экологическая, эволюционная и инфекционная иммуногенетика. Кроме того, обследование двух популяций Челябинской области - русских и башкир, связано с необходимостью получения данных о распределении частот аллелей и генотипов генов цитокинов среди многонационального населения евроазиатской части России и включения полученных сведений в регистр доноров костного мозга.

Анализ полиморфизма генов цитокинов 1Ь-1Ка, 1Ь-4, 1Ь-1 (3, ПЧРа у русских и башкир Южного Урала проводится впервые.

Внедрение результатов исследования. Результаты работы внедрены в учебный процесс: используются при преподавании отдельных тем курса иммунологии на биологическом факультете ГОУ ВПО «Челябинский государственный университет».

Апробация работы и публикации. Материалы диссертационной работы обсуждались на конференциях: «IV конференция Иммунологов Урала» (г. Уфа, 2005), «Новые лабораторные технологии в диагностике и лечении заболеваний человека» (г. Челябинск, 2006), «V конференция Иммунологов Урала» (г. Оренбург, 2006), Конференция молодых ученых, поев, памяти профессора Н.Н. Кеворкого «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (г. Пермь 2006), XI Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (г. Санкт-Петербург, 2007), международная конференция «Биотехнология как научно-практический приоритет развития Кировской области» (г. Киров, 2007), «VI конференция Иммунологов Урала» (г. Ижевск, 2007), конференция зональной лаборатории иммунологического типирования тканей «Фундаментальное и прикладное значение оценки генов иммунного ответа» (г. Челябинск, 2008).

По материалам диссертации опубликовано 20 работ.

Выводы

1. Между популяциями русских и башкир установлены межпопуляционные различия в распределении аллельных вариантов и генотипов генов IL-IRa, IL-4, -238 G/A TNFa и сходство по частотам аллелей и генотипов полиморфных локусов IL-lp, -1031Т/С, -863 С/А, -308 G/A TNFa.

2. Предрасположенность/устойчивость к ревматоидному артриту в русской и башкирской популяциях определяется различными вариантами генов цитокинов: в русской популяции только у женщин выявлен маркер предрасположенности к ревматоидному артриту — генотип Т/С -1031 TNFa, а у башкир - гетерозиготный генотип С/Т +3953 IL-1(3 - протектор ревматоидного артрита.

3. В русской популяции ранний возраст начала атаки, наличие системных проявлений ревматоидного артрита ассоциированы с конкретными генотипами С/Т +3953 IL-ip, -308 G/A TNFa. У башкир поздний возраст начала ревматоидного артрита ассоциирован с генотипом 2r/2r IL-4.

4. У русских комбинации генотипов внутри гена TNFa «-308 — 863» и «-308 —1031» определяют чувствительность к ревматоидному артриту.

5. Функциональная значимость комбинации различных генов, располагающихся на разных хромосомах, IL-ip — IL-4, в отношении устойчивости/чувствительности к ревматоидному артриту в башкирской и русской популяциях зависит от конкретных генотипов, входящих в эту комбинацию.

Заключение

Наше исследование посвящено анализу вклада аллельных вариантов генов 1Ь-1Яа, 1Ъ-4, 1Ь-1(3, ТОТа, их генотипов и межгенных взаимодействий в предрасположенность и клинические варианты ревматоидного артрита у представителей русской и башкирской популяций Челябинской области. Тема исследования выбрана в связи с тем, что развитие воспалительного процесса, в который вовлечены белковые продукты генов 1Ь-1К.а, 1Ь-4, 1Ь-1(3, ТЫБа, во многом определяет течение РА, предполагается участие этих генов в развитии предрасположенности/ устойчивости к РА. Таким образом, мы изучали, насколько значима ассоциация генов цитокинов с предрасположенностью к РА. В ходе проведенного исследования нами был поставлен ряд задач, в результате решения которых мы пришли к следующему заключению.

1. Первой задачей было установление распределения частот аллельных вариантов, генотипов полиморфных генов 1Ь-1К.а, 1Ь-4,1Ь-1р, Т№а в выборках здоровых лиц русской и башкирской популяций для формирования групп контроля. Необходимость оценки распределения частот аллелей и генотипов генов 1Ь-Жа, 1Ь-4, 1Ь-1р, ПМТа у практически здоровых лиц двух популяций диктуется следующим рядом положений. Группы русских и башкир — самые многочисленные на территории Челябинской области [170], при этом относятся к популяциям различного историко-этнического происхождения. Популяция русских формировалась в течение последних 300 лет миграцией из центральных областей России [19]. Миграционные волны смешивались с проживающими на данной территории различными этносами с монголоидной и финно-угорской составляющей, неоформленными в государства. При метизации этого населения русские, проживающие в Челябинской области, приобретали свои специфические иммуногенетические особенности в распределении генов и антигенов HLA, генов цитокинов [19, 36].

Башкирская популяция - единственная, из проживающих на территории Челябинской области, которая сформировалась именно на этой территории в период 1-2 в. до нашей эры и отличается наибольшим вкладом монголоидных генетических признаков [19, 45, 170].

По данным многих авторов, формирование предрасположенности к РА имеет этнические особенности. В работах И.В. Девальд и Е.Б. Хромовой установлены специфические маркеры предрасположенности к РА у русских и башкир среди генов HLA [5, 12, 35, 48]. Анализ литературы позволил нам прийти к выводу, что и для распределения генов цитокинов характерны межпопуляционные различия [6, 48]. Таким образом, необходимо было провести оценку распределения аллелей и генотипов генов цитокинов среди практически здоровых представителей двух популяций и только после установления наличия или отсутствия особенностей в частотах встречаемости аллелей и генотипов, изучить вклад генов IL-IRa, IL-4, IL-ip, TNFa в развитие предрасположенности к РА.

Анализ показал наличие межпопуляционных различий в распределении аллелей и генотипов генов IL-IRa, IL-4 и полиморфного сайта -238 G/A TNFa среди русских и башкир.

IL-IRa. Из литературных данных также известно наличие межэтнических различий в распределении аллелей и генотипов IL-IRa. Для русских Челябинской области, как и в других европеоидных популяциях (бельгийцы, финны, французы), характерна высокая частота аллеля 2г - на уровне 20% -30%, и сходны частоты его гомозиготных генотипов 2г/2г [70,71, 161].

Так как башкиры являются микст-популяцией с преобладанием монголоидной компоненты, то мы провели сравнение выборки башкир по частотам аллелей и генотипов 1 Яа с монголоидными популяциями. Показано, что для них характерна низкая по сравнению с европеоидами частота аллеля 2г, но выше частота другого распространенного аллеля и его гомозиготного генотипа 4г/4г [ 103, 16В].

1Ь-4. При сравнении частот генотипов 1Ь-4, установленных в нашем исследовании, с распределением в мировых популяциях (литературные данные), мы получили следующие результаты. Распределение генотипов УЫТЯ И-4 у русских сходно с частотами аллелей и генотипов у европеоидных популяций и характеризуется накоплением гомозигот Зг/Зг [70, 88, 160]. У монголоидных популяций в целом повышены частоты генотипов, несущих аллель 2г (Зг/2г, 2 г/2 г), для иллюстрации приведен рисунок 7 [130, 166]. русские собств исс европеоиды французы иведы банкиры собств исс китайцы японцы тнлеугы Кемеровской обл

О 20 40 60 80 100 частота, %

Рис. 7. Распределение генотипов ИЛ-4 у русских и башкир, сравнение с мировыми популяциями

-238 G/A TNFa. При сравнении результатов нашего исследования по распределению аллелей и генотипов SNP -238 TNFa с литературными данными выявить закономерности в распределении аллелей и генотипов между различными популяциями установить не удалось. Для иллюстрации на рисунке 8. приведены частоты генотипов, образованных полиморфным сайтом -238 G/A TNFa.

Рис. 8. Распределение -238 G/A TNFa в различных популяциях

IL-ip. Хотя в литературе указаны межпопуляционные особенности в распределении аллелей, генотипов полиморфного сайта +3953С/Т IL-lp между европеоидными и монголоидными популяциями, в нашем исследовании не установлено различий между русскими и башкирами.

Частоты аллелей и генотипов IL-1(3 у русских сходны с распределением в мировых популяциях европеоидного происхождения. Распределение аллелей и генотипов SNP +3953С/Т IL-ip в выборке башкир было сходно с таковым у русских, но отличалось от частот аллельных вариантов и генотипов у других монголоидных популяций [149, 168]. Вероятно, сходство с европеоидными популяциями в распределении аллелей и генотипов 1Ь-1р является характерной особенностью башкирской популяции, так как подобное распределение получено в исследовании, проведенном на жителях Башкирии [43].

TNFa. Частоты аллелей и генотипов, образованных полиморфными сайтами -3080/А, -863С/А и -1031Т/С гена ЮТа не отличались между выборками русских и башкир. При анализе литературных данных распределение этих полиморфных сайтов между популяциями было сходно.

Таким образом, можно подвести итог: русские Челябинской обладти относятся к типичной популяции европеоидного происхождения, хотя и имеют свои особенности в распределении редких аллелей и генотипов 1Ь-1Яа, частоты которых могут быть маркерами данной популяции.

Башкиры являются микст-популяцией и, хотя имеют черты сходства с типичными монголоидными популяциями, все-таки обладают сходством с популяциями европеоидного происхождения, вероятно, обусловленным метизацией с другими популяциями Челябинской области.

2. Вторая задача посвящена установлению вклада генов 1Ь-1 Яа, 1Ь-1Р, 1Ь-4, Т№а в предрасположенность/устойчивость и клинические варианты РА в двух популяциях - русских и башкир.

РА относят к мультифакторным комплексным заболеваниям, чувствительность к которым определяется генетической составляющей и условиями окружающей среды. Основным генетическим фактором риска для РА являются гены классического иммунного ответа II класса системы НЬА [82, 116]. Однако генами НЬА II класса обеспечивается лишь 30% - 50% общего семейного риска развития РА (по данным разных авторов). Скрининг генома показал наличие и других генов восприимчивости к РА, рассеянных по всему геному [96]. Среди них большое внимание привлекают гены цитокинов и их рецепторов, продукты которых определяют развитие и персистирование воспалительного процесса, при этом они могут действовать совместно, или роль цитокинов может быть независимой от HLA.

В нашем исследовании не удалось установить маркеры предрасположенности к РА у русских среди исследуемых полиморфных сайтов генов IL-IRa, IL-1(3, IL-4. Необходимо отметить, что участие исследуемых генов в развитии предрасположенности к РА показано далеко не во всех исследованиях.

В нашем исследовании показано, что частота генотипа Т/С -1031 TNFa повышена в группе женщин, больных РА русской популяции (45% против 29,8% %"=4,30, р=0,038). Полученные результаты говорят об ассоциации полиморфизма в точке -1031 TNFa с ревматоидным артритом у женщин. Это предполагает, что женщины с генотипом Т/С имеют более высокий риск развития данного заболевания, чем с другими генотипами -1031 TNFa (RR=1,51 95%ДИ=1,02-2,25; OR=l,89 9 5 % ДИ= 1,03-К3,62).

В доступной литературе мало данных о связи этого полиморфизма с РА, [106, 163], он оказался более значимым для других мультифакторных заболеваний [134, 137]. Можно предположить, что влияние этого сайта опосредовано наличием неравновесного сцепления с точкой -308 G/A TNFa.

У больных РА башкирской популяции показана значимость полиморфизма типа SNP +3953 IL-1(3 для предрасположенности к данной патологии: протекторными свойствами обладал генотип С/Т по сравнению с носительством двух других генотипов IL-lp (Т/Т и С/С).

Участие различных аллельных форм и генотипов генов IL-1 р в развитии предрасположенности к РА и вариабельности его течения спорно: в некоторых исследованиях обнаружена связь [62], а в других -нет [69, 103, 107]. Кроме того, некоторые авторы высказывают предположение о том, что аллель +3953*Т в гомозиготном и гетерозиготном состояниях предрасполагает к возникновению РА, другие, наоборот, подчеркивают его протекторную роль, и существует точка зрения о нейтральности данного аллеля к развитию РА.

В работе C-G. You показано повышение частот редкого аллеля Т и гетерозиготного генотипа С/Т SNP +3953 IL-ip у женщин, больных РА, авторами выдвинуто предположение о связи этого полиморфизма и пола при развитии предрасположенности к РА у монголоидов [168]. В работе A. Cantagrel et al. установлено, что редкий аллель +3953*Т связан с повышенным риском эрозивного течения РА в сочетании с генами HLA, кодирующими общий эпитоп [62, 70].

Полученные нами данные о протекторной роли генотипа С/Т +3953 IL-ip у башкир Челябинской области согласуются с результатами работы, проведенной группой российских исследователей, в которой показана связь между носительством редкого аллеля +3953*Т IL-lp в гетерозиготном состоянии и низким уровнем пролактина в сыворотке крови (р=0,03) и редким развитием анемий (р=0,03) у больных РА европеоидного происхождения, проживающих на территории Сибири. Этот частный эффект объясняется ими как протективное действие редкого аллеля +3953*Т IL-lp при РА, поскольку уровень пролактина коррелирует с активностью аутоиммунного воспаления [6].

3. Для установления маркеров вариабельности течения РА среди исследуемых полиморфных генов цитокинов группы больных делились по возрасту начала заболевания, иммунологическому варианту РА (серопозитивный, серонегативный РА), РА с системными проявлениями и без системных проявлений.

При делении на группы по клиническим признакам мы установили ассоциацию 8ЫР+3953 генотипа С/Т 1Ь-1(3 с ранним началом заболевания у русских Челябинской области и генотипа 2г/2г \TNTR в гене 1Ь-4 с поздним возрастом возникновения РА у башкир.

Влияние 8ЫР в точке +3953 гена 1Ь-1р на тяжесть течения РА подтверждается в различных исследованиях, однако данные противоречивы. Например, в исследовании N. ВисЬз еЪ а1. показано, что носительство редкого аллеля +3953 *Т повышено в группе с деструктивным РА [66].

Учитывая спорные данные о влиянии этого БЫР на экспрессию белка 1Ь-1р и различия в связи с предрасположенностью, и клиническими вариантами РА, описанными в литературных источниках, можно предположить, что носительство генотипа С/Т является более благоприятным признаком у больных РА. Считается, что «ранний РА» протекает легче, чем поздний. По данным И.В. Девальд РА [12] у представителей башкирской популяции Челябинской области также протекает легче, чем у европеоидов этого региона. Суммируя полученные результаты, можно сделать следующий вывод: замена С—> Т в точке +3953 1Ь-1Р благоприятствует более легкому течению РА. Очевидно его опосредованное влияние на развитие РА в зависимости от того, с какими полиморфными сайтами 1Ь-1р или какими генами он вступает в неизвестные на сегодняшний день взаимодействия.

Мы установили маркер позднего начала РА у башкир — генотип 2r/2r VNTRIL-4.

По данным литературы, существует связь между VNTR 2R аллелем и возрастом начала и клиническим течением некоторых мультифакторных заболеваний. К примеру, Vandenbroeck К. показал ассоциацию между 2R и поздней атакой множественного склероза [160]. Buchs N. продемонстрировал, что 2R аллель может быть протективным фактором тяжести деструкции суставов при РА: пациенты с недеструктивным артритом имели повышенную частоту 2R аллеля [67].

В то же время, нам не удалось установить ассоциации полиморфизма генов IL-lRa, IL-4, IL-lß, TNFa с иммунологическим вариантом РА (серопозитивный и серонегативный РА) ни у русских, ни у башкир.

В группе больных РА с системными проявлениями, русской популяции показано повышение частоты аллеля -308*А и его гетерозиготного генотипа. Мы предполагаем, что высокопродуктивный аллель -308*А с заменой и его гетерозиготный вариант (G/A) предрасполагают к возникновению системных проявлений у больных PA (OR=3,52; 95% ДИ 1,45-8,5 OR=3,5; 95% ДИ 1,17-10,5), а аллель нормальной продукции -308*G и его гомозиготный генотип являются протекторными для развития системных осложнений (OR=0,28; 95% ДИ 0,12-0,69, OR-0,23; 95% ДИ 0,07-0,7).

Связь полиморфизма гена TNFa с мультифакторной патологией чаще всего изучается для SNP-308. Ряд исследований показывает изменение частот аллелей и генотипов полиморфизма в точке -308 у больных РА по сравнению с контролем, на основании чего делается вывод о предрасполагающей роли аллеля -308*А и его генотипов к развитию РА [75, 78, 80].

В то время как существуют работы, не подтверждающие влияния -308 точки, как и других SNPs, на транскрипционную активность и связь с РА [60, 106, 114], этот полиморфный сайт изучается в России, как один из факторов предрасположенности к РА. В группе больных РА европеоидного происхождения, проживающих на территории Новосибирской области (Россия), выявлено достоверное повышение частоты гетерозиготного генотипа G/A -308 (OR=l,98, 95%ДИ 1,04-3,8; RR=1,68, 95%ДИ 1,05-2,69, р=0,02), а частота генотипа гомозиготного по аллелю нормальной продукции G/G снижена. Авторы предполагают, что этот генотип является протективным фактором для РА (OR=0,52, 95% ДИ 0,27-0,99; RR=0,85, 95% ДИ 0,74-0,98, р=0,03). Влияние замены в сайте -308 сказывается и на клинической картине заболевания: у больных РА до назначения патогенетической терапии генотип G/A -308 ассоциируется с повышенным содержанием клеток с фенотипом CD16+ (р=0,02) и отсутствием в системном кровотоке цитокинов IL-2 и IL-7 (р<0,05) [6].

Полученные нами данные согласуются с данными зарубежной литературы, где описано влияние полиморфизма в точке -308 TNFa на тяжесть течения РА [110], наличие ревматоидных узелков [162].

Вероятнее всего, один цитокиновый ген не является решающим в развитии предрасположенности и клинических признаков заболевания, скорее всего, важно взаимодействие цитокиновых генов, располагающихся на одной и на разных хромосомах, в связи с чем мы проводили анализ «межгенных и внутригенных взаимодействий».

4. Завершающий этап работы был посвящен оценке ассоциации межгенных и внутригенных взаимодействий в предрасположенность/устойчивость к РА.

В нашей работе не удалось установить значимых взаимодействий между УЫТЯ 1Ь-1Ка - 8ЫР+3953 1Ь-1р и предрасположенностью к РА, несмотря на существование работ, в которых показана связь этих полиморфизмов в виде сочетаний генотипов и гаплотипов с мультифакторными заболеваниями [34, 105, 121].

Не получено статистической значимости комбинации двух противовоспалительных цитокинов: УЫТЯ 1Ь-1Ка - УЫТЯ 1Ь-4 и предрасположенностью к РА, и в доступной литературе нет данных о сочетанном влиянии этих генов.

Установлена значимость комбинации УЫТЯ 1Ь-4 - БЫР+3953 1Ь-1Р, при этом различия сильнее в башкирской популяции, у русских — только у женщин.

Мы предполагаем, что аллель +3953 *Т 1Ь-1р в сочетании с аллелем 2К 1Ь-4 чаще встречается у больных РА (для сочетаний совместно «Т/Т - ЗК/2Б1» и «С/Т- 311/211» (Ж=1,79 95%ДИ 1,11-2,89), а с аллелем ЗЯ аллель +3953*Т 1Ь-1р — реже (для сочетаний совместно «Т/Т 1Ь-1Р -ЗК/ЗЯ 1Ь-4», «С/Т 1Ь-1(3 - ЗМЯ 1Ь-4» (Ж=0,43 95%ДИ 0,24-0,77).

Это новые данные, которых нет в доступной нам литературе, дальнейшее их изучение позволит по-новому взглянуть на профилактику и лечение РА.

Анализ комбинаций генотипов, образованных полиморфными сайтами гена ТЫРа, показал значимость следующих комбинаций:

-3080/А--863С/А» и «-3080/А--1031Т/С» для РА только у представителей русской популяции. Согласно литературным данным, эти сочетания содержат гетерозиготные генотипы, в которых редкие аллели связаны с повышенной продукцией ТЫБа [49, 100, 148] — ключевого цитокина, участвующего в патогенезе РА. В доступных нам исследованиях нет данных по сочетанному влиянию этих генотипов на предрасположенность к РА.

Высоко достоверную значимость взаимодействия между генотипами «-1031 -863» и «-1031 -238» в обеих популяциях без влияния на предрасположенность к РА можно объяснить наличием сцепления между этими полиморфными сайтами гена TNFa. Неравновесное сцепление SNPs -1031 и -863 показано в зарубежных источниках [56, 118, 149]. Однако нет литературных данных, описывающих неравновесное сцепление между полиморфными точками -238 и -1031.

У башкир в нашем исследовании не установлено влияния аллелей, генотипов и сочетаний генотипов TNF а на предрасположенность к РА, вероятно, развитие восприимчивости к РА развивается у этой популяции за счет участия других генов.

Таким образом, в основу проведенного исследования по оценке вклада генов цитокинов в формирование предрасположенности к ревматоидному артриту положен комплексный подход, при котором проведен анализ распределения полиморфных вариантов генов IL-lRa, IL-4, IL-lß, TNFa среди практически здоровых лиц двух популяций и изучение частот встречаемости аллельных вариантов, генотипов и сочетаний генотипов среди больных РА.

Установлено, что полиморфные варианты исследуемых генов характеризуются специфичностью распространения в популяциях различного происхождения. Таким образом, различные популяционные группы имеют своеобразный «генетический портрет» по частотам аллельных вариантов и генотипов генов цитокинов.

На сегодняшний день известно, что частота РА, его клинический полиморфизм и тяжесть неодинаковы у разных народов [48, 53, 85], возможно, это связано с межпопуляционными различиями в распределении генов цитокинов, которые наряду с системой НЬА являются одним из факторов, определяющих отличия в распространенности РА.

Важность предварительной оценки полиморфной структуры генов цитокинов в популяциях различного происхождения диктуется необходимостью формирования групп риска мультифакторной патологии, в частности РА, и проведения анализа между особенностями распределения в популяциях мира аллелей генов-кандидатов различных заболеваний и спецификой встречаемости в популяциях мультифакторной патологии.

Исследование распределения аллелей, генотипов внутри группы больных РА и при сравнении с частотами в группе практически здоровых лиц позволило установить маркеры предрасположенности и вариабельности течения РА. Однако вклад исследуемых генов невелик, это означает, что аллельные варианты указанных генов — лишь небольшая часть потенциального наследственного разнообразия, приводящего к возникновению РА.

В то же время, представленные результаты показывают сложность получения однозначных ответов, когда речь идет о генах цитокинов, являющихся древнейшим защитным звеном у многоклеточных эукариот (начиная с беспозвоночных), и, вероятно, поэтому имеющих как эволюционно-устойчивые генные комбинации [37], так и множество вариантов межгенных взаимодействий, в ходе развития физиологических и патологических воспалительных реакций [17], вариабельность которых определяется как генетическим полиморфизмом и различными генными сочетаниями, так и окружающими условиями и стохастическими процессами.