Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Экспрессия продуктов HLA-генов I, II классов и вспомогательных белков циркулирующими клетками в норме и при ревматоидном артрите

э

с на правах рукописи

>

Мусатов Михаил Иванович

ЭКСПРЕССИЯ ПРОДУКТОВ НЬА-ГЕНОВ 1,11 КЛАССОВ И ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ БЕЛКОВ ЦИРКУЛИРУЮЩИМИ КЛЕТКАМИ В НОРМЕ И ПРИ РЕВМАТОИДНОМ АРТРИТЕ

14.0036 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

НОВОСИБИРСК - 1995

Работа выполнена в Институте клинической иммунологии Сибирского Отделения РАМН

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор В.И. Коненков Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук A.B. Шурлыгина

доктор биологических наук, профессор А.И. Аутеншлюс доктор медицинских наук В. В. Абрамов

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится "_" _ 1995 г. в _часов на заседании диссертационного совета Д.001.01.01 "Аллергология и иммунология" при Институте клинической иммунологии СО РАМН (6330091, Новосибирск, ул. Ядринцовская, 14).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан "_"_1995.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

О. Т. Кудаева

Общая характеристика работы

Лптуапьпсстъ пгсяедогзаэй HLA-система исследуется на всех уровнях организации живой материи - от молекулярного до надорганизмен-ных, в частности, популяционного. В течение послед:îe.^ десятилетия исследования HLA-белков на молекулярном и надмолекулярных уровнях позволили достичь кардинально новой степени в понимании принципов распознавании своего и чужого, организации молекулярных комплексов и трансдукции акти-вационного сигнала, уточнить области МНС-рестрикции иммунного ответа (Strominger J.C., Wiley D.C. et. al., 1987-1994, Ljunggren H.-G. et. al., 1990, Rammensee H.-G. et. al., 1990, 1993, Kabelitz D„ 1992, Germain R.N., 1994, Vives J., 1994). Однако, реализация этих качественных принципов, то есть механизмы функционирования HLA-молекул на разных уровнях организации иммунной системы в норме и, тем более, при патологии, практически не изучены, хотя иерархии структур должна строго соответствовать иерархия механизмов регуляции (Аозовой В.П., 1988, Курганов Б.И. и соавт., 1989).

Основным специфическим объектом исследований в клинической иммунологии являются периферические лимфоциты и моноциты (мононуклеарные клетки, МК), чей состав по субпопуляционной принадлежности и уровню дифференцировки определяется системными факторами, а свойства отдельных клеток и взаимодействующих клеточных групп - факторами саморегуляции клеточного уровня. Здесь в поведении HLA-молекул как интегральных мембранных белков (Kourilsky F.M. et. al., 1972), должны учитываться постоянно осуществляемые процессы синтеза, экспрессии, секреции и реабсорбции (Любимов А.В., 1981). Все эти процессы также должны быть определенным образом организованы во времени, т.е. оформлены в биологический ритм определенной частоты, так как принцип временной компартментации метаболитов также универсален, как и принцип пространственной компартментации (Фридрих П., 1986), а околочасовая периодичность характерна для клеточного и тканевого уровней (Бродский В.Я., Нечаева Р.В., 1988). В то же время неясно - является ли такая периодичность фактором авторегуляцин этих уровней, или же это регуляторный сигнал вышестоящих систем, иными словами, это проблема физической природы и локализации осциллятора высокочастотных биологических ритмов.

Изучение аутоиммунных заболеваний, прежде всего ревматоидного артрита (РА), показало нарушения во всех известных иммунных феноменах и механизмах (Ширинский B.C., Лозовой В.П., 1985, Чередееа А.Н., Ко-вальчук Л.В., 1989, Strober S., Holoshitz J, 1990, Ratcliffe L.T. et al., 1994). Однако, данные о присутствии в циркуляции при этой патологии значительной доли активированных клеток, зачастую не учитываются при сопоставле-

нии функциональных свойств МК больных и доноров, хотя основные состояниям клетки - пролиферативный покои и активация - характеризуются совершенно разными цитофизиологическими параметрами (Епифанова О.Е. и соавт., 1988, 1989, Робинсон М.В., 1994, Trufaldn V.A. et al., 1994).

В то же время, при РА отчетливо выражены наследственные факторы, проявляющиеся ассоциированностью носительства определенных HLA-генов и наличием заболевания, его клиническими вариантами, эффективностью лекарственной терапии, отдельными параметрами иммунной системы (Лозовой В.П. и соавт., 1988, Серова Л.Д., 1989, Коненков В.И., 1989, Deigh-ton С.М. et. al., 1993, Olive С. et. al., 1994). Несмотря на то, что механизмы реализации HLA-ассоциированности шире функционирования только самих НLA-продуктов на клеточном уровне, очевидно, что накопление таких данных будет полезным для понимания патогенетических механизмов и разработки прогностических критериев.

Особый интерес представляет сравнительное изучение в норме и при РА функций HLA-молекул в МНС-нерестриктированных взаимодействиях, в частности, в функционировании естественных киллерных лимфоцитов.

Отдельным механизмам функционирования иммуноцитов как клеток соответствуют частично перекрывающиеся концепциии топогенеза поверхностных белков (Blobel G., 1980, Лузиков В.Н., 1990) и рециклинга (Быковская С.Н., Грунтенко Е.В., 1982, Mcintosh D. et. al., 1990, Jondal M. et al., 1994). С целью объединения отдельных аспектов изучения молекулярно-кле-точных механизмов функционирования HLA-белков было предложено понятие биогенеза структурных компонентов клеточных мембран, включающее в себя процессы трансляции и транскрипции нуклеиновых кислот, экспрессии генов на уровне мРНК; экспрессии, латеральной диффузии, секреции и реаб-сорбции поверхностных гликопротеинов (Коненков В.И. и соавт., 1988).

Очевидно, что изучение механизмов функционирования HLA-молекул на клеточном и тканевом уровнях должно быть плодотворным в рамках этой концепции, позволяющей объединить иммунологическую феноменологию с закономерностями биологии клетки, включая и временные параметры.

Цель исследования:

исследование функциональной значимости постсинтетических этапов биогенеза HLA-продуктов и вспомогательных молекул циркулирующих клеток иммунной системы у здоровых лиц и больных ревматоидным артритом.

Ссдсчк:

1. исследовать взаимосвязь иммуноцитологических, функциональных и временных параметров экспрессии и секреции HLA-белков в норме;

2. изучить уровни экспрессии HLA-продуктов I и II классов на субпопуляциях циркулирующих ИКК, оценить патогенетическую значимость и диагностические возможности этих параметров при РА;

3. оценить сывороточный уровень и секрецию in vitro продуктов HLA-комплекса I и II классов в норме и у больных РА;

4. выявить функциональное значение уровня экспрессии HLA-продуктов и костимуляторных белков в функционировании естественных киллерных лимфоцитов;

5. исследовать возможности модуляции уровня экспрессии HLA-продуктов покоящихся клеток;

6. проанализировать ассоциированность показателей биогенеза HLA- и костимуляторных белков с носительством аллельных вариантов генов HLA-комплекса I класса.

7. оценить диагностическую значимость определения субпопуляций HLA-DR-экспрессирующих циркулирующих клеток при неаутоиммунной патологии.

Оспозаые положения, выносимые на защиту

1. В покоящихся мононуклеарных клетках периферической крови здорового человека процессы циркуляции мембранного материала организованы в околочасовые клеточные ритмы, что проявляется в циклических и взаимосвязанных изменениях мембранной топографии/экспрессии HLA- и других поверхностных белков, их секреции в окружающую среду и реабсорбции. Последняя для HLA-DR-белков может осуществляться через специфический рецептор массой «40кДа. Отдельные фазы этого цикла определяют способность МК вступать в контактные межклеточные взаимодействия с аутологич-ными и чужеродными клетками, что проявляется в периодически чередующихся фазах максимально возможного ответа и относительной рефрактер-ности.

Процессы рециклизации мембранного материала покоящихся МК позитивно и негативно регулируются гуморальными факторами иммунной системы.

Размах эндогенных колебаний клеточных параметров ограничен генетическими факторами, маркируемыми носительством определенных сочетаний HLA-генов.

2. В иммунной системе ОКР являются фактором авторегуляции как минимум, до тканевого уровня. Осциллятором высокочастотной периодики являются концентрационные колебания, обусловленные природой водных растворов в среде космопланетарных факторов, в частности, определенного уров-

ня ионизирующего излучения. В водных растворах, контактирующих с кислородсодержащей атмосферой, природные липидные, модельные липидные и другие полупроницаемые компартменты не препятствуют прохождению водно-ионных потоков. В этом смысле на клеточном уровне липидный бислой является минимальной морфологической структурой, ответственной за ОКР.

3. При ревматоидном артрите изменения значений параметров биогенеза НЬА-белков, в особенности, ША-ЭИ, а также ^М, НЬРА-1, Рсу-ШП (С016), проявляются в разнонаправленных изменениях уровня их экспрессии, скорости латеральной диффузии, динамики секреции; в их неуправляемости факторами позитивной регуляции рециклинга покоящихся клеток. Схожесть этих и других функциональных показателей клеток больных РА с таковыми у стимулированных МК. здоровых лиц, дает основание сделать вывод об активированном состоянии основных субпопуляций циркулирующих МК при данном заболевании.

Одним из наиболее выраженных расстройств иммунорегуляции при РА на тканевом уровне является измененное соотношение основных циркулирующих субпопуляций активированных Т-лимфоцитов. Значения повышенного содержания ША-ОИ-экспрессирующих Т-лимфоцитов (в основном, за счет С04-позитивных) в комплексе со значениями уровня экспрессии ША-ОИ обладают при РА свойствами качественного показателя.

4. Распознавание чужеродных антигенных структур естественными кил-лерными лимфоцитами является Н1_А-нерестриктированным, но Н1.А-зависимым, так как Н1А-белки обоих классов наряду с НЬРА-1 и Рсу-ШП являются структурами, непосредственно ответственными за распознавание и индукцию литической активности ЕК-лимфоцитов. У здоровых лиц выделяется два характерных типа обеспечения одинакового уровня функциональной активности ЕК: 1) обусловленный Н1_РА-1-, Рсу-, НЬА-АВС- и ША-ОИ-белками, экспрессированными на НЬРА-1+Рсу-ШН+-лимфоцитах; 2) обусловленный НЬРА-1- и ША-ОИ-белками, экспрессированными на НЬРА-1+Рсу-ШН -лимфоцитах. У больных РА функциональная активность ЕК значительно снижена; при этом примерно у трети больных частично сохраняется второй тип - литичсская активность обусловлена НЬРА-1- и ША-ОЯ-белками, но экспрессированными «а НЬРА-1+Рсу-ШП+-лимфоцитах. Снижение литической активности ЕК у больных РА обусловлено активацией части НЬРА-1+Рсу-ШН+-лимфоцитов, что проявляется гиперэкспрессией на них Ш-А-ОИ; эти клетки не участвуют в литическом акте и су-прессируют такую активность других ЕК.

5. Представитель макроглобулинов, АБПА, является фактором авторегуляции ИКК. Модифицированная форма АБПА обладает свойствами уси-

ливать пролиферацию преактивированных лимфоцитов, но отменять в своем присутствии поликлональную митогениндуцированную и олигоклональную ал-лоантигениндуцированную пролиферацию лимфоцитов. В последнем случае эффект реализуется как на уровне антиген-распознающих лимфоцитов, так и на уровне антиген-представляющих СОЗ ОЯ+-лимфоцитов и ОЯ+-моноцитов, у которых АБПА вызывает заметное снижение ОИ-экспрессии, не связанное с эффектом экранирования. Среди поверхностных белков циркулирующих МК показана мембранная форма АБПА массой ~85кДа и два аффинанта АБПА с массами около 80 и 75кДа. У женщин вне гестационного периода и мужчин основными продуцентами АБПА (и других макроглобулинов) являются потомки периферических МК.

Научная новизна

Показано, что изменения поверхностной топографии белков лимфоцитов в процессе латеральной диффузии сопровождаются появлением их новых количеств, а сам процесс АД в лимфоцитах периферической крови, существует эндогенно; эти и другие проявления циркуляции мембранного материала и их функциональные последствия во времени организованы в околочасовые клеточные ритмы. Выявлен осциллятор высокочастотных клеточных ритмов.

Продемонстрировано значительное увеличение уровня экспрессии НЬА-ОИ на активированных периферических Т-лимфоцитах при РА, изменения уровня экспрессии Н1_А-белков I и II классов и костимуляторных белков на всех субпопуляциях периферических МК при данной патологии.

Кинетика секреции растворимых форм НЬА-белков периферическими нестимулированными МК больных РА характерна для стимулированных МК здоровых лиц.

Выявлен мембранный белок МК, обладающий свойствами рецептора для растворимых форм Ш-А-ОЯ-белков.

Обнаружено снижение литической активности ЕК при РА, сопровождающееся увеличением содержания клеток с фенотипическими характеристиками ЕКК, для выявления которых предложено одновременное определение НЬРА-1 и Рсу-ШП. Проведен анализ зависимости функциональной активности ЕК и их иммуноцитологических характеристик, ставший возможным благодаря учету уровня экспрессии продуктов гистосовместимости обоих классов на субпопуляциях ЕК-лимфоцитов.

Изучен источник и индукторы локального синтеза макроглобулинов вне гестационного периода; продемонстрирована модуляция АБПА уровня экспрессии НЬА-ОИ, уточнено его влияние на индукцию пролиферации покоя-

щихся клеток. Выявлены как мембранная форма АБПА, так и его аффинан-ты, экспрессируемые периферическими МК.

Определены генетически детерминированные границы варьирования им-муноцнтологических и функциональных параметров ИКК, маркируемые носи-тельством определенных HLA-генов I класса в норме и при РА.

Практические рекомендации

Так как постоянное присутствие в кровотоке активированных клеток отражает патогенез РА, определение параметров экспрессии HLA-DR на Т-лимфоцитах при этом заболевании имеет высокую диагностическую значимость (приоритет метода на уровне изобретения), а для дифференциальной диагностики РА является полезным определение как литической активности ЕК, так и клеток с фенотипом ЕК. Однако, определение на периферии активированных клеток, в том числе и основных субклассов регуляторных Т-лимфоцитов, не является универсальным методом иммунодиагностики при всех заболеваниях. Кроме этого, необходимо учитывать, что свойства активированных периферических МК при РА некорректно непосредственно сопоставлять со свойствами преимущественно покоящихся периферических клеток в норме. В частности, этот факт имеет прямое отношение к проблеме оценки иммунного статуса и лекарственных препаратов in vitro. Очевидно, что это может быть актуальным в изучении и других аутоиммунных заболеваний.

Понятие "эндогенные иммуномодуляторы" в полной мере применимо к макроглобулинам. Широкий спектр активностей, проявляемых этими белками, их способность комплексироваться с цитокинами, нейромедиаторами, делают их чрезвычайно перспективными как фармакологические препараты. Наряду с этим, очевидно, необходимы технологические исследования по более точной адресации иммуноактивных препаратов: по времени воздействия, по локализации и состоянию клеток-мишеней.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции "Профилактика, диагностика и лечение аутоиммунных заболеваний и вторичны} иммунодефицитов" (Новосибирск, 1985); Всесоюзной конференции Методология, организация и итоги массовых имунологических исследований" (Москва-Ангарск, 1987), IV Всесоюзной конференции по патологии клетга (Москва, 1987); I Всесоюзном съезде иммунологов (Сочи, 1989), IV Всесоюзном съезде патофизиологов (Кишинев-Москва, 1989); IV Международно? конференции по дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека (Вена 1989); IV международной конференции по иммунофармакологии (Рим 1989); 1 съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992); Международное

симпозиуме по иммунологии репродукции (Киев, 1993); Ежегодной отчетной конференции Института клинической иммунологии (Новосибирск, 1993); 12 Международном конгрессе по фармакологии (Торонто, 1994), 12 Европейском совещании иммунологов (Барселона, 1994); Международной конференции "Нейроиммунология, нейроинфекции, нейроимидж" (С-Петербург, 1995).

Апробация диссертации состоялась на расширенном заседании семинара Института клинической иммунологии СО РАМН и общества иммунологов 8 июня 1995 г. (г. Новосибирск).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 44 печатные работы, получено одно авторское свидетельство.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературных данных, материалов и методов исследования, 8 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и библиографического указателя. Она изложена на 300 страницах машинописи и иллюстрирована 40 таблицами и 58 рисунками. Библиографический указатель включает 637 источников.

Содержание работы

Материалы н методы

В работе использовалась кровь 626 здоровых доноров, 252 больных классическим и определенным РА. Диагностика и подбор больных осуществлялись в кардиоревматологическом отделении I Городской клинической больницы и Городском ревматологическом центре. Также обследовано 225 больных другими заболеваниями, в том числе 157 "часто болеющих" детей (г. Ангарск).

Определение поверхностных белков ИКК проводилось методом прямой и непрямой иммунофлюоресценции (ИФ) в соответствии с рекомендациями IUIS (Wick G. et а]. 1976) с использованием поликлональных (ИЭМ им. Н.Ф Гамалеи; Sevac, ЧССР)и моноклоналъных антител (мАТ) зарубежных производителей (Ortho Diagnostics, Behringwerke AG) и отечественных - серий ИКО и ЛТ. мАТ ИКОН были любезно предоставлены проф. A.IO. Барышниковым. Поликлональные антитела и конъюгаты освобождались от микроагрегатов сорбцией последних на мягко фиксированных Fc-не-сущих ксенолейкоцитах (Мусатов М.И., 1981) Для одновременного определения двух поверхностных белков использовалась разработанная нами модификация метода Van Rood (Коненков В.И. и соавт., 1986). Для выявления HLFA-l+FcyRIII+ лимфоцитов использовалась комбинация мАТ ИКОН, ви-

зуализируемых по окрашиванию клеток этидием после комплемент-зависимого порирования и ЕА-системы с человеческим IgG, либо мАТ VEP13 (анти-CDló). Цитофлюориметрические измерения проводились с использованием микроскопов-фотометров MPV-2 и MPV-compact-MT (Ernst Leitz).

Для определения растворимых HLA-белков (pHLA) I класса в плазме и культуралъных супернатантах применялся пул типирующих сывороток, для II класса - мАТ ИК.01. Использовался нефелометр ICS Analyser II (Beckman).

Культивирование клеток проводилось в увлажненной атмосфере с 5% СО2 мини-методом с использованием культуралъных планшетов с соответствующей формой дна в среде RPMI-1640 с бикарбонатом и HEPES-Na (pH 7.2), 10% фетальной телячьей сыворотки и обогащенной 1-глютамином и пируватом натрия. Из антибиотиков применялся только гентамицин (50 мкг/мл). В смешанной первичной однонаправленной культуре лимфоцитов использовалась обработка стимуляторов митомицином С (25 мкг/мл). Куль-туральный пластик и реактивы формы Flow, ФГА и МЛ - Sigma. Пролифе-ративный уровень оценивался по включению Н-тимидина или 5(1251)-йод-2'-дезоксиуридина (ИДУР) с использованием ß-счетчиков SL-30 (Intertechnique), Бэта-2 (Украина) и у.счетчика RIA Gamma 1271 (LKB-Wallac). Активность естественных киллерных клеток (ЕКК) оценивалась против клеток К 562, меченных 3Н-уридином при соотношении МК:мишень 50:1. Все изотоп-меченые соединения отечественного производства, кроме 51Сг в составе хромата натрия (Amersham)

Инкубация клеток с иммуномодулирующими агентами проводилась в течение 90 минут, при этом использовались официнальные препараты Такти-вин и рекомбинантный а2.интерферон. В-активин был любезно предоставлен проф. Р.Н. Степаненко, ИЛ-1 - д.б.н. Н.Ю. Громыхиной, олевил -В.Г. Безгачевым. Тимозин (IV фракция по Гольдштейну) был выделен к.б.н. О.Т. Кудаевой. Ассоциированный с беременностью протеин А (АБПА) и биогенные комплексы плазмина были получены из лаборатории проф. H.A. Зорина.

При исследовании временных параметров процессов в суспензионных клеточных культурах традиционные методы модифицировались, при этом соблюдались два основных условия - 1) поддержание постоянной концентрации клеток в единице объема и 2) синхронные идентичные манипуляции с опытными и контрольными пробами. В опытах по динамике ионной проницаемости мембран использовались "спиртовые" липосомы (Владимиров Ю.А., Добре-цов Г.Е., 1980), приготовленные из суммарных эритроцитарных липидов.

Для измерения флюоресценции зонда МБА (3-метоксибензантрон) использовался МРЛЛсотрас1-МТ в режиме флюороридера.

Для выявления аффинантов для АБПА и рШ-А-ОИ. на мембранах мононуклеарных клеток (МК), проводился электроблоттинг их белков, разделенных электрофорезом, в специализированной ячейке для электропереноса с применением нитроцеллюлозы (ТочеЫп Н. е1. а1., 1979) Иммунопроявление блотов осуществлялось с помощью иммунопероксидазной техники..

Статистическая обработка данных проводилась параметрическими и непараметрическими методами сравнения с использованием РС-прикладных программ Мюго$1а1 и 5(а1^арЬ.

Результаты н ях обсуждение

1. Временная регуляция постсинтетических этапов биогенеза поверхностных белков иммуноцитов

В нестимулированных кратковремнных культурах МК в силу "внутренних" причин, наблюдается волнообразное изменение (Т 20-50 мин.) численности позитивных клеток (НЬА-ОИ, ^М, Рсу-И): при этом их минимум в основном совпадает с максимальным количеством лимфоцитов с диффузным распределением поверхностных белков, а максимум - с накоплением клеток с полярным распределением метки (рис. 1"А").

Кроме этого, лимфоциты с разными видами мембранной топографии ре-цепторных белков различаются по уровню их экспрессии - количество поверхностных молекул нарастает в процессе латеральной диффузии (ЛД) от диффузного распределения как "начальной" фазы - к полярной концентрации. Этот процесс сопровождает периодику численности позитивных клеток - на рис. 1."Б" он показан в виде временной динамики отношения средних уровней экспрессии - полярного к диффузному в каждой временной точке.

Рисунок 1. Временная динамика процессов латеральной диффузии и экспрессии Н1_А-0Я лимфоцитов.

Эмпирические кривые одного из опытов. Пояснения в тексте.

22 ■% к Я 3 К / V ^ Б

я д \л А / Л /

н А / 2 > л/ V

1С / Ь ( V V V

14 1 ' и/ 1 ( V

иин. ^МИН.

10 30 50 70 90 110 10 30 50 70 90 110

Так как данная зависимость наблюдалась для продуктов разных генных систем (рис. 2), очевидно, она является общей закономерностью для поверх-

постных белков лимфоцитов. Сходные закономерности определялись и для периферических моноцитов за тем исключением, что для них не выделялось определенных типов поверхностной топографии, но изменения уровня экспрессии НЬА-ОИ были также статистически значимо зависимы от времени (средний период 42 минуты), амплитуда параметра более 2а от среднего уровня.

Таким образом, топографические изменения положения интегральных молекул в плоскости мембраны тесно связаны с изменениями уровня их экс-

I, и

прессии, т.е. вид распределения - уровень экспрессии является единым понятием.

Рисунок 2. Изменения уровней экспрессии Н1_А-ОР, Б|дМ и Рсд-И в зависимости от вида их распределения на мембранах лимфоцитов.

1-диффузное, И-промежуточное, III-полярное расположение белков. По осям абсцисс - единицы уровня экспрессии (значения тока фотометра). Разница в размерности обусловлена разными приборами. Отличия между последовательными стадиями значимы (и-критерий, р<0.05). Для Ш-А-ОИ показана 1с.

Следует отметить, что и в случае стимулированной антителами ЛД, наблюдается циклическое изменение как общей численности ^М+-клеток (средний период 23 минуты), так и составляющих ее долей лимфоцитов с разными формами распределения метки на мембране.

У больных РА значения этого параметра на исходном уровне (т.е. непосредственно после выделения МК) не отличаются от стимулированных значений доноров и индукция ПС дивалентными антителами его приращения не вызывает.

Под влиянием 90-минутной инкубации с тимозином (300 мкг/мл) у В-лимфоцитов здоровых лиц скорость ЛД достоверно увеличивается (в среднем на 11.7%, р<0.01), в то время как у больных РА остается на прежнем уровне.

Функциональное значение изменений экспрессии-вида распределяния поверхностных белков на примере Н1_А-ОИ оценивалось на модели первичной алло-СКЛ: в 15 культурах сравнивался пролиферативный ответ и уровень экспрессии НЬА-ОИ на отвечающих и стимулирующих клетках,

НЬА-ОЯ

320 240 160 80

Т ВС

40

20

I С ш

I П Ш I п ш

часть из которых фиксировалась на момент их "готовности" к внесению в культуру.

В согласии с литературными данными, интенсивность пролиферации прямо связана с количеством HLA-DR на всех стимулирующих клетках -г=0.743 (р<0.01), однако, теснота связи определяется в основном с DR-белком, расположенным в виде кэпов на лимфоцитах - r=0.652 ^р<0.01), и совместной представляющей активностью таких лимфоцитов с моноцитами -г=0.733 (р<0.01), в то время как масса HLA-DR, распределенного диф-фузно или в виде промежуточных кластеров, с пролиферативным уровнем значимо не связана. Очевидно, что контакт Тх будет происходит в первую очередь с теми АПК, чьи HLA-DR уже находятся в определенной степени агрегированное™.

Современные представления о контактном взаимодействии Тх-АПК предполагают, что после его завершения в повторное взаимодействие Т-лим-фоцит уже не вступает (Dustin M.L., Springer Т.А., 1989, Vives G., 1994). Приведенные корреляционые связи позволяли предположить, что наряду с этим и несмотря на цикличные изменения поверхностной топографии/экспрессии HLA-DR, последующая пролиферация в СКЛ определяется только теми клетками, которые вступили в аллогенное контактное взаимодействие в какой-то небольшой промежуток времени непосредственно после смешивания отвечающих и стимулирующих клеток (соотв. OK и CK). Это подтвердилось в опытах по динамике образования межклеточных конъюгатов.

В кратковременных культурах МК, в отсутствие внешних воздействий идет циклический процесс образования и диссоциации клеточных конъюгатов в виде образования групп в 2-3 клетки между лимфоцитами (Л-Л), моноцитами и лимфоцитами (М-Л) и моноцитами (М-М). Среди интактных МК в среднем конъюгатов всех видов 12.0+0.8%, среди МК, обработанных митомицином С их меньше - 6.5+0.4%.

На рисунке 3 "А" показана усредненная хронограмма (за 4 часа) образования суммарного количества межклеточных конъюгатов при культивировании смеси OK и CK во взвешенном состоянии при комнатной температуре. Средний период составляет 24 минуты в одном цикле, 34 в другом. Параллельно отбирались пробы для культивирования: через 10 минут триплеты аликвот по 100 мкл (105 клеток) смешивались в культуральном планшете. На рисунке 3 "Б" показана эмпирическая кривая одной из "шейкерных" СКЛ. ИС (6.53+7.24) отрицательно связан с численостью конъюгатов М-А среди отвечающих клеток (0.59±0.57%), г=-0.986 (р<0.00001, п=48) и среди стимулирующих клеток (0.44+0.57%), г=-1.0 (р<0.00001, п=48).

60 120 1 30 240

Рисунок 3. Динамика образования межклеточных конъюгатов (А) и пролиферация в "шей-керной" СКЛ (Б).

А - аппроксимация хронограммы полиномом 6-й степени;

Б- эмпирическая кривая одного из опытов.

I - время в минутах.

Столь тесный характер связей показывает, что если в момент смешивания аллогенных клеток либо среди ОК, либо среди СК большинство лимфоцитов и моноцитов находятся в контактных аутологичных взаимодействиях, последующий пролиферативный ответ существенно снижен.

Иными словами, система рефрактерна к внешним стимулам, если занята аутологичными взаимодействиями. В соответствии с этим система (СКЛ) не должна реагировать на повторные стимулы. Действительно, внесение только четверти СК (мы использовали в "полной" СКЛ соотношение СК:ОК = 1:1) вызывает сниженный на 40% ответ, но если внести недостающие 0.75 ОК через 10 минут, то ответ не возрастает ( соотв. "К" и "1" на рис. 4).

к^^Рисунок 4. Супрессия ответа в ........... ...... первичной алло-СКЛ при разобщении во

3 ' " ' '■'' '"'................... БОХ Времени ДОЗЫ стимулирующих КЛвТОК.

и 1'г-д..................................................п=32, пояснения в тексте.

На том же уровне он остается и при внесении недостающей четверти клеток через 1 час ("2"). Добавление через 10 минут 0.25 клеток от "третьего" донора также не меняет уровень пролиферации (60% от контроля, "3"), а при внесении их через час ответ снижается еПрГсильнее (28% от контроля, "4") и его уровень достоверно ниже, чем при ответе только на 0.75 СК этого донора ("5"). Следовательно, супрессия носит поликлональный характер.

Периодические колебания количества поверхностных ОИ-белков лимфоцитов и моноцитов, указывали на возможность временной упорядоченности в процессах их секреции. Концентрации Н1_А-белков I и II классов определялись в супернатантах аликвот МК (НЬА-А^Вти^О), кратковременно (до 3.5 часов) культивируемых во взвешенном состоянии. Осцилляции статистически значимо зависели от времени, период составлял 20-70 минут, поэтому эти процессы также относятся к околочасовым клеточным ритмам.

Очевидно, что верхние экстремумы свидетельствуют о пиках секреции, в то время как нижние - о реабсорбции. На рисунке 5 "А" показан пример динамики секреции-реабсорбции НЬА-ОИ белков в одном из опытов при комнатной температуре (22° С). Концентрация измерена в относительных единицах - Ии - единицах скорости реакции нефелометра. Процессы секреции-ре-абсорбции белков I класса и II были противофазными, а раздельное определение двух продуктов локусов А и В белков I класса - А9 и В^40 показало их практически совпадающую фазность.

Рисунок 5. Секреция-реаб-сорбция Н1-А-0Я (А) и 51Сг-макромолекул (Б) в динамике наблюдения.

По осям ОУ- в "А"- Ш, в "Б"- отношение активности осадка к надосадку.

Параллельное определение с HLA-DR секреции и реабсорбции меченых 51Сг клеточных белков (Beelen R.H-J., Walker W.B., 1984; а также см. рис. 8, "А"), показало их синхронность (рис. 5"Б"). Использование этого метода показало, что интенсивность (амплитуда) определяется, наряду с температурой, активностью цитоскелетных элементов и состоянием липидного бислоя, так как предобработка клеток соответствующими агентами вызывала существенное снижение размаха колебаний. Возможна и интенсификация процессов секреции-реабсорбции (т.е. процессов рециклизации мембранного материала): в течение 1 часа олевил (1мкг/мл) ускоряет вывод меченного 51Сг материала из МК в среднем на 30%, а р-0С2-ИФ (100 ЕД/мл) - на 38%.

Сопоставление количеств экспрессированного на клетках DR-белка и его концентрации в супернатанте кратковременных культур (12 наблюдений) показало, что имеется прямая связь между этими показателями - коэффициент множественной линейной регрессии R=0.68 (р<0.05), однако, среди рассматриваемых категорий DR-несущих клеток значимый вклад определяется только для моноцитов (р=0.05), в то время как для лимфоцитов и суммы всех позитивных клеток отмечается только тенденция к связи (соотв. р=0.09 и р=0.06).

Динамика секреции-реабсорбции HLA-DR, очевидно, подразумевала наличие механизма их акцепции МК. Выделив гомогенный препарат DR-белка (в химическом, но не иммунном смысле, так как для аффинного фракционирования сыворотки донора DR3,5 использовались мАТ ИКО-1 к неполиморфным специфичностям), в условиях иммуноблоттинга было показано

нековалентное связывание pDR с белком массой около 40 кДа из состава цитоплазматических мембран МК.

Дальнейшие исследования должны выяснить, является ли способность рецептировать растворимые HLA-DR неизвестной ранее функцией уже описанного мембранного белка МК, или же она связана с неизвестным ранее поверхностным белком.

Таким образом, все исследованные постсинтетические параметры биогенеза HLA-продуктов периферических МК у здоровых лиц являются взаимосвязанными динамическими показателями, организованными в околочасовые клеточные ритмы.

2. Осциллятор околочасовых клеточных ритмов

Попытки идентифицировать если не осциллятор, то хотя бы клеточную структуру, воспринимающую сигналы внешнего датчика, предпринимались неоднократно. Было установлено, что минимально необходимой органеллой для существования околосуточных ритмов является клеточная мембрана с сохраненной способностью к ионной регуляции (Гудвин Б., 1979). Дальнейший прогресс в этом вопросе тормозился представлениями о структурных субстратах водно-ионого транспорта, постулирующими наличие гипотетических энергопотребляющих "каналов", "насосов" белковой природы. Необходимость этого снимается убедительно экспериментально обоснованной концепцией об ио-нофорной и каналоформерной функции мембранных липидов, доказывающей формирование липопероксидных каналов в природных и модельных бислоях. Единственным условием является наличие обычной кислород-содержащей атмосферы (Лебедев A.B., 1990). Так как наши эксперименты проводились не в среде инертного газа, то вопрос о наличие канальных структур в липидных бислоях переходит в категорию такого же имманентного атрибута любого эксперимента, как, например, барометрическое давление.

Используя 51 Cr в составе хромата натрия как метку, мы показали периодичность его включения в биообъекты, заключенные в липидные мембраны разного уровня сложности: если в кариоцитах (МК) секреция/реаб-сорбция метки связана как с клеточными белками, так и низкомолекулярным материалом (рис. 6 "А", а также см. рис. 5,"Б"), то в эритроцитах (рис.6 "Б") и тенях эритроцитов (рис. 6"В") и, тем более, в липосомах из эритро-цитарных липидов (рис. 6 "Г"), очевидно, хромовая метка маркирует водно-ионные потоки. После добавления раствора радионуклида к взвеси эритроцитов наблюдается постепенное проникновение хромат-иона внутрь клеток, связывание части метки с внутриклеточными элементами и, начиная со 180-й минуты, процесс проникновения/выхода принимает вид периодического (за-

висимость от времени статистически значима по критериям Аббе и серий). Сходная картина наблюдается и при использовании нелипидной полупроницаемой мембраны, диализной, при регистрации динамики выхода ИДУР в диализат. В опытах с тенями эритроцитов и липосомами периодичность выявляется сразу, так как, очевидно, внутри них метка ни с чем не связывается, а неспецифическая сорбция с липидами находится на уровне ошибки счета.

6 'лсрт-10"^ и 1

Б Л А

4 • Л д/ г

3 Лч^ Г

2 I ' V

0 1 2 3 А 5 часы

сутки

дсрт-10"

т

1

2 часы

Рисунок 6. "А" - доля радиоактивности (в %) макромолекулярного материала (осаждаемого сульфатом аммония) в супернатантах меченных 51Сг МК. "Б"- динамика проницаемости эритроцитов человека для 5,Сг. "В"- то же для теней эритроцитов. "Г"- то же для унила-меллярных ("спиртовых") липосом из эритроцитарных липидов. Аликвоты теней эритроцитов и липосом отмывались на миллипоровых фильтрах. Учтена неспецифическая сорбция изотопа на фильтрах. Все измерения производились с интервалом в 10 минут

Вода является основным тушителем флюоресценции встроенного в ли-пиды мембраны 3-метоксибензантрона. Регистрация с его помощью водных потоков в суспензии как эритроцитов, так и липосом (рис. 7) продемонстрировала сходные результаты - периодический процесс с характеристиками ОКР. Использование хромовой метки в синхронных опытах с липосомами при

600 560 ЕМБЯ Рис.7

520 \ Л

400 \ \ л!* г \г<

440 400 1 V 1 V часы

0 2 3 4 5

37° С и при 4° С показало в последнем случае значительное снижение амплитуды, что можно объяснить фазовыми перестройками в липидном бислое.

Таким образом, мембрана, а точнее, только липидньш бислой является минимально необходимой структурой для существования ОКР.

Очевидно, что природа периодических водно-ионных потоков связана со свойствами водных растворов. В 1987 году была показана периодичность колебаний светорассеяния в растворах солей и белков (Черников Ф.Р., 1987). Сходные данные были получены нами при измерении активности аликвот, отбиравшихся через равные промежутки времени и одного и того же места в сосуде из водного раствора ИДУР. Использовавшаяся нами модель у-счетчика исключала влияние внешних излучений и возможных примесей других у—излучателей на точность измерения концентрации радионуклида. На рисунке 8 "А" показан результат замеров проб, отбиравшихся через 10 минут, в "Б" - при ежеминутном отборе. В обоих случаях зависимость от времени значений в ряду динамики статистически значима. Варьируя частоту забора проб, можно было выделить различные спектральные составляющие: в "А" средний период составляет 35 минут, в "Б" выявляются гармоники с периодами около 5 минут и 1 часа. Данный феномен не связан с погрешностью использовавшегося дозатора, определявшейся гравиметрическим методом.

А цш.10~3 [я] \ ЧуМ,: Рисунок 10. Б Пояснения в тексте.

й сри.1Г3

• юпмипипи ямписпии 1, минуты • Я и И 4» М И 7» (0 99 100 1, минуты

Современные модели организации водных растворов предполагают образование обладающих наименьшей свободной энергией пространственных структур (клатратов) из молекул воды и растворенных веществ. Любое внешнее воздействие, нарушающее термодинамическое равновесие, приводит к их временной диссоциации и последующему возвращению в состояние равновесия. Мы полагаем, что обнаруженные нами концентрационные колебания в водных растворах являются результатом резонансного суммирования процессов на этом уровне, а синхронизирующими факторами будут периодические внешние воздействия.

Известно, что поверхности Земли достигает как первичное космическое излучение (КИ), так и порождаемое им вторичное излучение. Чтобы не вводить новой терминологии, поясним, что под КИ мы понимаем ту его гамма-компоненту, которую можем зарегистрировать на у-счетчике: нижняя граница чувствительности окна поднимается выше обычных низкоэнергетнческих излучений, составляющих естественный фон, верхняя открывается максимально. Таким образом, внутри свинцовой гамма-камеры регистрируется определенную часть спектра КИ. Варьируя интервалы измерений, можно выделить различные частотные составляющие: при замерах через 10 минут средний период составляет 30 минут, при ежеминутных замерах - 3.4 минуты, при 4 замерах в минуту - 30.9 секунды (рис.9).

Рисунок 9. Динамика интенсивности КИ при ежеминутных измерениях. Средний период 3.4 минуты; кроме минутных циклов, видны периоды в 20-30 минут.

При синхронных ежеминутных измерениях КИ и отборах аликвот раствора ИДУР, анализ полученных значений (без предварительного сглаживания) показывает наличие статистически значимой связи - Т)=0.209 (для п =120 и 5% уровня критическое значение - 0.15).

КИ, является, вероятно, не единственной, но очевидной составляющей осциллятора высокочастотных ритмов, в том числе ОКР.

Описываемые нами эмпирические кривые водно-ионной проницаемости и концентрационных колебаний в водных растворах напоминают т.н. макроскопические флуктуаци, изучающиеся под руководством проф. С.Э. Шноля, однако мы предлагаем иную интерпретация их природы.

Таким образом, водная среда и космопланетарчые факторы (в частности, определенный уровень ионизирующего излучения) формируют высокочас-

и II

тотные проторитмы локальных водно-ионных потоков, воспринимаемые клетками аэробных организмов через кислород-зависимые каналы биомембран и являющиеся очевидной основой для периодической организации их жизненных отправлений.

у

С точки зрения лабораторной диагностики, ориентированной на нормативные значения, биоритмы вообще и ОКР в частности, являются одним из факторов неопределенности в оценке индивидуальных количественных показателей. Однако, статистически значимые различия таких параметров в норме и

при патологии показывают наличие факторов, чье влияние перекрывает область эндогенных колебаний. Такому сравнительному исследованию отдельных этапов биогенеза интересующих нас белков в норме и при РА посвящена дальнейшая часть работы.

3. Уровень экспрессии HLA-продуктов I и II классов и костимуля-торных белков на поверхностной мембране субпопуляций циркулирующих МК в норме и при ревматоидном артрите.

Различия между здоровыми лицами и больными РА как в численности HLA-DR-экспрессирующих Т-лимфоцитов, так и их уровне экспрессии, показаны на рисунке 10.

Рисунок 10. Графическое представление численности HLA-DR-экспрессирующих Т-лимфоцитов и их уровней экспрессии у здоровых лиц и больных ревматоидным артритом.

Здоровые лица - темные квадраты, больные первичным ДОА - светлые квадраты.

Больные РА - серопозитивный вариант - темные кружки, серонегативные вариант - темные крестики.

По оси ординат - процентное содержание HLA-DR-экспрессирующих Т-лимфоцитов (CD3+DR+); от общей доли С03+-лимфоцитов; по оси абсцисс -уровень DR-экспрессии в относительных единицах (ОЕ, значения тока фотометра): для каждого индивида это средняя из замеров 100 позитивных клеток. Площадь в двумерной системе используемых координат является графическим выражением объединенного показателя экспрессии, ОПЭ.

Таким образом, ОПЭ HLA-DR на циркулирующих Т-лимфоцитах при РА имеет свойства качественного показателя, так как показывает значимые отличия от здоровых лиц уже при самом факте наличия РА - при всех клинических вариантах, в том числе и на ранних стадиях. В интервалах 7-21% DR+-T-KAeTOK и уровня экспрессии HLA-DR 11-20 O.E. ОПЭ обладает 100% чувствительностью, диагностический коэффициент составляет 20.7, что позволяет установить правильный диагноз более, чем в 99% случаев.

Дальнейший сравнительный анализ показал (табл. 1 и рис. 11 рядом с таблицей): у больных РА увеличена как общая численность С08-позитивных клеток и доля DR-несущих среди них, так и уровень экспрессии HLA-DR. Общая численность С04+-клеток у больных РА не изменена, однако, пропорция DR-несущих среди них увеличена почти в 2 раза и более, чем в 3 раза на них увеличена экспрессия HLA-DR. В результате одно и тоже ко-

54DR Т-лимфоцитов

, ♦ •• •

. • • * • • •

• • •

• * • * * •

ОЕ

0 5 7 9 11 13 15 17

D ■

В В ■

■ ш ■

личество Т-клеток в норме и при РА несут существенно отличающееся количество ОИ-белка, что показывает ОПЭ на рис.13. Эта же закономерность отражается и в соотношении С04+0Я+/С08НТЖ+: у здоровых лиц оно составляет 1.33 а у больных - 1.94, в то время как обычный "иммунорегулятор-ный индекс" составляет соответственно 1.82 и 1.49.

Таблица 1. Уровни экспрессии Н1_А-продуктов I и II классов на СЭ4- и С08-позитивных Т-лимфоцитах и их относительное содержание в периферической крози здоровых лиц (I, п=33)и больных РА (II, п=21)

Еоп. и Еавс - уровни экспрессии НЬД-ОИ и Н1А-АВС.

Рисунок 11. ОПЭ Н1_А-0Р для Сй4- и СР8-позитивных Т-лимфоцитов у здоровых лиц (светлые столбики) и больных РА (темные столбики).

Группы СГ4* Т-пим$оциты СБО* Т-лимфоциты

И ЕЙВС Евя ХАВС- X ЕЙ вс Еря ХБЧ* /-ПЕС"

I. И 43.67 23.90 6.70 1.91 1.50 23.91 23.20 7.13 1.43 2.05 п 1.30 0.41 0.29 0.13 1.49 1.49 0.44 0.28 0.24 0.49

II.11 48.81 24.55 11.53 6.76 1.55 27.54 24.74 10.17 3.17 1.46 п 2.44 0.62 0.65 0.68 0.67 1.08 0.36 0.47 0.30 0.76

Р1-11 н.д. н.д. <0.01 <0.01 н.д. <0.05 н.д. <0.01 <0.ОКО.01

При клинически неблагоприятных вариантах заболевания все исследованные параметры в соответствующих подгруппах не различаются и остаются на уровне общей группы, за исключением численности С04+: при увеличении степени активности с I до II их доля растет с 37.5+3.18% до 44.8+3.21% (р<0.01), такого же уровня она достигает при фиброзно-склеротической фазе заболевания - 44.8+3.21%.

Таким образом, резко увеличенное представительство НЬА-ОК на циркулирующих Т-лимфоцитах при РА связано с обеими субпопуляциями Т-клеток, но с С04+-лимфоцитами в большей степени, чем с С08+-лимфо-цитами. То, что эта закономерность остается практически неизменной при всех клинических вариантах заболевания, позволяет ее также считать качественным признаком для данной патологии.

Данные по экспрессии НЬА-продуктов на других субпопуляциях циркулирующих МК представлены в таблице 2. Определяемое у больных РА снижение уровня экспрессии НЬА-белков обоих классов на СОЗ--лимфоцитах, или не-Т-клетках, фактически должно быть выражено больше, так как проведенные позднее исследования этих параметров показали увеличение их значений на ЬРА-1-позитивных лимфоцитах, также не относящихся к Т-ростку. Тем не менее, полученные данные показывают досто-

верное снижение уровней экспрессии ЬИА-продуктов как I, так и II классов

на этих лимфоцитах у больных РА.

Таблица 2. Уровни экспрессии Н1_А-продуктов I и II классов на циркулирующих СйЗ", -Ц^-лимфоцитах и моноцитах и их относительное содержание в норме и при РА. Экспрессия С016 и 1_РА-1 на 1_РА-1 -позитивных лимфоцитах.

Примечание: Данные по СОЗ-нега-тивным лимфоцитам и моноцитам получены в тех же выборках здоровых лиц и больных РА, что отражены на рис. 12, а данные по

1_РА-позитивным лимфоцитам получены в других группах - 73 донора и 62 больных РА.

Доля РсдР+1_РА-1 + определена с пом. мАТ УЕР-13(С016), экспрессия РсдН- по числу эритроцитов .

При анализе клинических вариантов заболевания отмечено только некоторое возрастание численности ОИ-позитивных не-Т-лимфоцитов при серопо-зитивном варианте РА (26.89±1.69, р<0.05), и рентгенологической стадии Ш-1У (27.0±1.33, р<0.05).

Численность Н1А-ОН-позитивных моноцитов у больных РА не отличается от здоровых лиц, однако, уровни экспрессии Н1_А-белков обоих классов на них существенно снижены. Анализ по клиническим группам в этих показателях существенных отличий не выявил.

В то же время лимфоциты, экспрессирующие Н1.РА-1 -белок, при РА демонстрируют, напротив, повышение уровня экспрессии продуктов главного комплекса гистосовместимости, особенно выраженное для НЬА-ОИ, что сопровождается и численным возрастанием доли этих клеток в циркуляции. Для больных РА характерно как возрастание доли ЬРА-1-экспрессирующих лимфоцитов и их субпопуляций так и уровней экспрессии самого ЬРА-белка и РсуШИ. Сравнение этих параметров в разных клинических группах позволило выявить только снижение уровней экспрессии 1_РА-1 и НЬА-белков обоих классов в среднем на 12-15% при длительности заболевания в 5 и более лет, по сравнению с больными менее 1 года (р<0.05), однако, и в этих группах его значения выше, чем у здоровых лиц.

Показатели Здоровые лица Больные РА Р(П-кр«т.)

1. ША-МГСРЗ" 2. Н1А-ЛВС-СОЗ" 3. ЕЩА-ЙВС 4. ЕЮЙ-ОЯ 17.31 ±0.46 1.52*0.35 26.90*0.52 26.0020.4В 25.50^0.51 2.87*0.49 24.67*0.42 24.26:5:0.36 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01

5. Ш»-ВН* -мои. 6. ШЛ-ЙВС--ион. 7. ЕЩЛ-ЙВС 8. Ещл-вл 9.42±1.18 2.21±0.41 34.40*0.83 35.05*0.42 9.19*0.95 5.08*0.49 30.70*0.56 31.67*0.51 > 0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01

9. 1ГА-1* -лнмф. 10. ЕН1Л-ПВС 11. Енич-ск 8.69±0.31 14.89*0.27 11.24*0.23 13.15*0.54 15.52*0.32 14.51±0.34 < 0.01 < 0.01 < 0.01

12. ШНГГс7В* 13. ШЫ'ГСуЛ- 14. 15. ЕрстН/ип-1* 4.00±0.17 4.69±0.31 4.44*0.13 11.72*1.91 6.0310.39 7.32*0.49 6.29*0.19 14.07*1.53 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01

Следует отметить, что у больных РА, по сравнению со здоровыми лицами, среди СВЗ+-, СОЗ~-лимфоцитов и моноцитов увеличена доля клеток, на которых не выявляются НЬА-белки I класса. При данной патологии, очевидно, это явление связано с заметной для этих типов клеток тенденцией к снижению уровня экспрессии НЬА-АВС-белков.

Общим, системным фактором, вызывающим выявленные разнонаправленные изменения экспрессии НЬА- и костимуляторных белков периферических мононуклеаров при ревматоидном артрите мы полагаем активированное состояние всех основных субпопуляций циркулирующих лимфоцитов, а также моноцитов.

Анализ с такой точки зрения маркерных и функциональных признаков периферических моноцитов у части доноров и больных, входивших в представленную нами общую выборку, позволяет считать периферические моноциты при РА находящимися в состоянии примирования/активации.

Очевидно, что реагирование активированных МК больных РА на им-мупомодулирующие препараты должно быть отличным от циркулирующих МК здоровых лиц, в основном представленных покоящимися клетками.

В таблице 3 представлены результаты полуторачасового культивирования периферических МК здоровых лиц и больных РА с Тактивином (1 мкг/мл), В-активином (10 мкг/мл) и ИЛ-1 (80 ед/мл).

Сравнимый со здоровыми лицами эффект у больных РА отмечается только после инкубации с В-активином - возрастает уровень экспрессии НЬА-ОИ на не-Т-лимфоцитах. Слабый, но достоверный прирост экспрессии НЬАЛ, тем не менее, не превышает базалъных значений параметра основной выборки больных. Прирост уровня экспрессии НЬА-ОЯ на СОЗ+-лимфоцитах значительно меньше такового у здоровых лиц, при этом у больных не возрастает и доля ОИ-позитивных Т-лимфоцитов.

СОЗ* лимфоциты Н1Л-СЯ* % Енич-ои

| контроль] ¡Тактивин] |ИЛ-11 2.67*0.45 10.00i0.43"" 3.50*0.35" 5.45*Л.42 13.35+0.44— 6.56*0.55

12.12i0.43 15.28±0.7СГ~

I контроль | |в-активнн]

соэ"

лимфоциты Еньй-АВС IZ4.36iO.ZS 25.34*0.42*"

Ешл-Вй 23.80i0.62 28.80i0.48*"

моноциты Н1А-ЛВС"54 Н1АЧЖ* % Етл-м)

[24.63*0.33 27.35*0 .Ьв****]

I контроль I |В-активин| [ИЛ-1| 5.42*0.64 4.42^.52" 3.83*0.50"

71.17*1.68 34.66*0.73

79.4211.93" 38.37i0.66"

Таблица 3. Влияние кратковременной инкубации с Тактивином, В-активином и интерлейкином-1 на экспрессию Н1А-белков I и II классов субпопуляциями периферических МК здоровых лиц и больных РА.

Данные по 12 здоровым лицам и 12 больным РА (заключены в рамки), М±т. Приведены только те параметры, где наблюдался достоверный эффект.

Уровень значимости отличий (и-крит.): * - р<0.05, ** - р<0.01.

Принципиально сходная картина наблюдалась также при сравнении эффектов а-2-интерферона (табл. 4): для больных РА приведен единственный достоверно изменившийся параметр (заключенный в рамку).

Таблица 4. Эффект часовой инкубации МК 10 здоровых лиц и 10 больных РА с ре-комбинантным аг-интерфероном (100 ед/мл) на уровни Н1А- и 1_РА-1 -экспрессии и численность клеток, их экспрессирующих.

Показатели контроль paj-ИФ

Лимфоциты ША-АВС* % Ehla-abc HLA-BR* % Ehla-dr Hohouhtu HLA-ABC* % Енш-ftbc HLA-DR* % Ешл-dr

92.51i0.33 Z5.56i0.73 30.15i0.75 16.63±0.68

3a.35i0.26-30.76^0.52" 33.85*0.68* 19.79i0.48*

8.45±0.62 14.26i0.57*

30.50i0.22 35.22i0.64*

6.65i0.34 10.54±0.S3*

31.12*0.51 36.72i0.58*

Слева- показатели LFA-1-негативных клеток; Справа - показатели LFA-l'''-лиыфоцитов

Показатели контроль ра^-ИФ

LFA-1* я

LFA-l*FcyR

LFfl-l*FcyR

El.rft-1

Ehla-abc

ehla-bb

7,60i0.64 % 4.75i0.59 % 2.В5Ю.32 3.61±0.35 ll.00i0.59 9.05i0.38

EL

12.20il.13*"* 8.60iG.93*"* 3.60±0.43 5.10±0.57** 12.89i0.62** 11.02i0.54***

•44i0.76 9.99i0.63"*

Очевидно, что эффекты использовавшихся нами иммуномодуляторов в первые 1-1.5 часа в преимущественно покоящихся клетках доноров реализуются через интенсификацию процессов рециклизации мембранного материала и вывода на поверхность мембраны дополнительного количества белковых молекул. Одним из общих свойств активированных клеток является, с одной стороны, интенсификация белкового синтеза, но одновременно и его экономность, поэтому резервными цитоплазматическими пулами они, как правило, не обладают (Епифанова O.E. и соавт., 1988). Слабая или отсутствующая реактивность периферических МК больных РА в описанных условиях является, по нашему мнению, дополнительным аргументом в пользу их активированности.

4. Продукция растворимых антигенов гистосовместимости в норме и при ревматоидном артрите.

Состояния пролиферативного покоя и активации подразумевают и разный характер секреции клеточных белков в окружающую среду. Проанализируем с этой точки зрения продукцию растворимых белков главного комплекса гистосовместимости.

При определении сывороточного уровня HLA-белков I класса (раздельно по продуктам локусов А и В), а также НLA-DR-белков, статистически значимых отличий между здоровыми лицами (75 человек) и больными РА (72 человека) не выявляется (рис. 12).

У больных I степенью активности содержание HLA-A-белков значимо выше, а HLA-B - ниже, чем у доноров, но у больных II-III степенями активности таких отличий не наблюдается. Тенденции общей группы больных РА в отношении сывороточного уровня HLA-A.-B-белков определяются картиной, характерной для больных женщин (89% всей группы больных). Наиболее высокий уровень циркулирующих DR-белков отмечается как у здоровых, так и у больных РА старше 40-летнего возраста. В целом анализ клинических групп не выявляет принципиальных отличий от усредненной выборки больных, так же как и выделение классов в ранжированном ряду обсуждаемых показателей не совпадает с клиническими группами.

Рисунок 12 Сывороточные уровни HLA-A-, HLA-B- и HLA-DR-белков у здоровых лиц и больных РА.

Доноры - светлые столбики, больные РА -заштрихованные. По оси OY - относительные единицы концентрации ОЕ, М±т.

Примечание: ОЕ для HLA-A.-B и HLA-DR непропорциональны в силу разной преципити-рующей активности мАТ и поликлонапьных антител.

Отмеченная тенденция к повышению содержания pHLA-A в циркуляции проявляется в достоверно большем накоплении этих белков в нестимули-рованных культурах и культурах с ФГА МК больных на 3 сутки по сравнению с pHLA-B как в группе больных, так и в группе доноров (р<0.05). На рис. 13 динамика накопления pHLA-A отмечена пунктиром. Основные отличительные моменты в содержании pHLA I класса в культуральных су-пернатантах заключаются в характерной кинетике их накопления: узловой точкой являются 3 сутки. У здоровых лиц в нестимулированных культурах от 3 до 6 суток продолжается накопление этих белков (отрезок 1), но у больных их содержание снижается (отрезок 3). В то же время накопление pHLA-I к 6 суткам в стимулированных культурах у доноров и больных идет одинаково (отрезок 2). 3-х суточная отметка в накоплении pDR при культивировании также является точкой перегиба: в ней совпадают концентрации pDR в спонтанных культурах МК больных, доноров и доноров с ФГА. К 6 суткам уровне pDR совпадают в спонтанных культурах больных и стимулированных культурах доноров (отрезок 4), а в спонтанных культурах доноров снижается (отрезок 5). В то же время в стимулированных культурах клеток больных РА накопление pDR идет на достоверно более низком уровне, чем в спонтанных (кривая 6).

Рисунок 13. Динамика спонтанного и стимулированного ФГА накопления рН1_А. По осям ординат - ОЕ. Пояснения в тексте.

100 HLA-A-B 200 HLA-DH 4

60 / ^ 1 - 2 150 \ 5

20 // ' У /У /X /У ^ 3 100 - 6

"0" 3 6 сутки "0" 3 6 сутки

Таким образом, динамика накопления pHLA, в особенности, pDR, в спонтанных культурах больных РА аналогична накоплению pHLA в стимулированных ФГА культурах здоровых лиц. Иными словами, по способности секретировать HLA-белки, поведение периферических МК больных аналогично поведению активированных in vitro МК доноров.

Вопрос о функциональной роли pHLA является очень непростым. В серии работ, основанных на моделях ФГА- и PPD-индуцированной пролиферации обосновывается взгляд на pDR как специфический и неспецифический фактор негативной регуляции (Claus R. et. al., 1990-1994). Для выделения и определения pDR авторами использовались мАТ к неполиморфным специфичностям атого белка. Выделение нами сходным образом препарата pDR от донора DR3.5 позволило предварительно оценить характер его влияния в неспецифической поликлональной активации покоящихся МК (ответ на ФГА и МЛ) и специфической олигоклональной активации (СКЛ). Использовались МК трех доноров гаплотипов DR3.5; DR1,3; DR1.5 и pDR в дозе 0.1, 1 и 10 мкг/мл. Во всех указанных дозах pDR на интенсивность МЛ -пролиферации влияния не оказывал, ФГА-ответ подавлялся только в дозе pDR в 10 мкг/мл. В СКЛ, "полуаллогенной" с точки зрения серотипи-рования, pDR от того же донора, что и CK, также ингибировал ответ. Так как с уменьшением дозы pDR степень подавления снижалась, с клетками тех же доноров было проведено "титрование" количеством CK: при снижении их количества в 6 раз подавляющий эффект 0.1мкг/мл pDR отменялся, а при снижении в 12 раз наблюдалась стимуляция - по сравнению с контролем ответ возрастал в среднем на 32%.

Следует отметить, что к настоящему времени известны, как минимум, три источника "растворимого" HLA-материала, дающих гетеродимерные молекулы различающейся массы (альтернативный сплайсинг, локальный мембранный протеолиз, секреция экзосом), кроме этого, HLA-материал сущест-

вует и в виде отдельных цепей. Наряду с этим, часть его комплексирована с липидными фрагментами (теряющимися при обычном аффинном фракционировании). Это семейство морфологически различных продуктов каждого HLA-локуса существует в виде двух аллельных вариантов и не исключен дальнейший полиморфизм пептидной структуры каждого из них, связанный с ДНК-вариантами. Очевидно, что все это структурное множество функционально неравнозначно в осуществлении своих задач, связанных с носитель-ством специфических пептидов.

В силу этих условий, мы можем пока только заключить, что клеточно-ассоциированые HLA-DR-белки и плазменный DR-содержащий материал без липидного фрагмента при определенных условиях (в частности, концентрации как белка, так и клеток) могут оказывать синергический эффект на пролиферативную активность в СКА.

Если в изучении функциональной роли растворимых HLA-продуктов основные трудности носят методический характер, то значение этих молекул в физиологии естественных киллерных лимфоцитов длительное время оставалось без внимания, может быть, в силу того, что была твердо установлена МНС-нерестриктированность их литической активности и, к тому же, неспособность этих клеток представлять антигены, несмотря на наличие HLA-белков всех трех локусов (Brooks C.F., Moore М., 1986).

5. Взаимосвязь функциональной активности естественных киллерных клеток с уровнями экспрессии HLA- и костимуляторных молекул.

Анализ литературных данных показывает, что при выделении ЕКК происходит резкое снижение их цитолитической активности - по данным разных источников, при достижение 70-100% концентрации этих клеток их активность, по сравнению с таковой в составе МК, падает в 10-300 раз.

В силу такой, еще неизученной особенности естественных киллеров, сопоставление иммуноцитологических характеристик и функциональной активности ЕКК мы проводили методами корреляционного анализа. Однако, зависимость цитолитической активности ЕКК от количественного содержания HLFA-1-экспрессирующих ЕК-эффекторов и их субпопуляций оказалась сложного нелинейного характера. Единственным ранжирующим критерием, позволившим выделить в имеющихся выборках здоровых лиц и больных РА внятные подгруппы, оказалось количество HLA-DR-белков, экспрессиру-емых HLFA-^-лимфоцитами.

Среди здоровых лиц и больных РА было выделено по 3 подгруппы (табл.5). У доноров первая представлена женщинами и мужчинами среднего возраста (31 год, 23-48), близкий поло-возрастной состав и у второй группы

(16 человек); третья состоит в основном из молодых мужчин (средний возраст 26.25 лет: 21-31; 14 человек).

Выделенные подгруппы не различаются между собой по уровню цито-

токсичности, по содержанию НЬКА-1- и Рсу-лимфоцитов. Кроме этого, нет

различий и по частотам встречаемости как отдельных Н1_А-антигенов, так и

НЬА-гаплотипов и -фенотипов.

Таблица 5. Варианты относительного содержания субпопуляций Н1_РА-1 -экспресси-рующих лимфоцитов и их уровней цитолиза у здоровых доноров и больных РА.

Показатели доноры больные Средняя арифметическая ±10 значимые отличия внутри групп

II, nß Ш,

1. Индекс цитотокс., V. 51.21114.48 51.561 8.40 51.21114.48

2?.06*10.25 26.57*11.46 »26.33114.82 1, II - III

2. LFA-lTcr-лииф., * 4.691 1.94 2.97± 1.22 6.71± 2.13 II - 1. Ill

6.641 Z.66 5.57± 1.74 10.771 4.25 1. II - III

3. LFA-l*Fc*-fMM$., V. 3.441 1.08 5.00± 1.03 3.211 0.99 II - 1, III

8.421 2.86 4.10± 1.4Z 4.571 1.24 1. II - III

* - несмотря на средние тенденции, ИЦ в данной группе больных выше, чем в I и II.

У больных РА группы гомогенны в распределении полов (мужчин во всей анализируемой выборке больных РА всего 6 человек); не наблюдается отличий в возрастном составе больных. Анализ частоты встречаемости градаций таких клинических показателей, как активность, рентгенологическая стадия, длительность заболевания, серопозитивность также не позволил сделать вывод о преобладании каких-либо из них в выделенных группах больных.

К такому же выводу приводит и анализ частот встречаемости как отдельных HLA-антигенов, так и HLA-гаплотипов и -фенотипов.

У здоровых лиц во второй группе характер связей функциональной активности и показателей экспрессии поверхностных белков на субпопуляциях HLFA-1-экспрессирующих лимфоцитах описывается уравнениями полиномиальной регрессии 3 и 4 порядка, эта группа занимает промежуточное положение между первой и третьей, которые представляют собой два характерных типа обеспечения одинакового уровня цитолитической активности ЕКК субпопуляциями HLFA-1-экспрессирующих лимфоцитов, обусловленные, в одном случае HLFA-1-, Fey-, HLA-ABC- и -DR-белками, в другом -HLFA-1 и HLA-DR (рис. 14).

У больных РА частично сохраняются связи, характерные для здоровых лиц, но они обусловлены НЬРА-1+Рсу+-лимфоцитами (вторая группа, рис. 15 слева). В третьей группе больных никаких линейных связей с цитотоксичес-кой активностью нет. Характер связи носит сложный характер, описываемый функциями, очевидно, более высокого уровня, чем полиномиальная регрессия.

0.3 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 Г X 7 * Т I t j» 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 r T 7 Г ? 7 7 7

LT A* LFA* LFA LFA * LFA+ LFA LFA ♦ LFA * LFA f IFA * IFA ♦ LFA*

% Fe Шк Fe" F.* Mle % Fe ми» Uli Fe"

Х> М»Ьс МЛе % % Mdz

Первая группа доноров Третья группа доноров

Рисунок 14. Варианты корреляционных связей цитолитаческой активности и количественных показателей ЕК-клеток у здоровых лиц.

ОПЭ для соответствующих белков обозначены как М. Значения коэффициента корреляции (Браве-Пирсона) 0.461 и 422 значимы на 5% уровне для одностороненного оценивания, остальные - для двустороннего.

Рисунок 15. Варианты зависимости иммуноцито-логических

показателен и литической активности ЕККУ

больных РА.

Справа - III группа больных РА. По оси ОХ -% клеток, по оси OY - ИЦ (в процентах).

HLFA-1+Fc»— лимфоциты-□ А 8 12 16

40

30

20

10

......-......4-

}.......Щ-1 \........j;

2 3 4 5 Б 7 HLFA-l"*" Fey*" лимфсщпы-П

На рисунке 15 справа заштрихованные участки представляют собой площадь, образуемую двумя параметрами - индексом цитотоксичности и численностью НЬРА-1+Рсу+- и НЬРА-ГРсу -лимфоцитов. В случае полной линейной связи эта площадь занимала бы половину квадрата по диагонали.

При данном способе изображения достаточно наглядно видно, что "площади цитолиза", характерные для ЬРА-1+Рсу+-лимфоцитов и для ЬРА-1+Рсу -лимфоцитов, в общем, не пересекаются. Иными словами, наблюдается некий баланс в численном соотношении этих субпопуляций Н1_,РА-1-экспрессирующих клеток, обеспечивающий определенный уровень цитоли-

тической активности. Данное заключение характерно не только для рассматриваемой подвыборки больных РА, но также и для остальных групп больных и здоровых лиц.

Однако, с ростом доли ЬРА-1+Рсу+-лимфоцитов, а главное, их Ш-А-ОЛ-экспрессии, начинает проявляться свойство этих клеток подавлять цитолитическую активность других ЕК - сначала это проявляется в виде тенденции у доноров II группы (ОПЭ Ш-А-ОИ для этих клеток 54.81±9.10, г=-0.311), а у больных РА I группы превращается в значимую связь (соответственно 131.11+26.04, Г=-0.504, рис. 15 слева).

В пользу активированного состояния ЕКК при РА говорят также их неспособность отвечать на дополнительную стимуляцию ра—2-ИФ - не изменяются как их иммуноцитологические показатели, (табл. 4), так и способность образовывать конъюгаты и лизировать клетки-мишени.

Выявленное нами с помощью корреляционного анализа участие в ли-тическом акте, наряду с Н1_РА-1 также Н1-А-молекул обоих классов, подтверждается аналогичными экспериментами с помощью соответствующих мАТ (табл. 6).

Таблица 6. Изменения цитотоксической активности ЕКК (М±т) после обработки МК моно-клональными антителами ИКО-11 (анти-HLFA-l), ЕЗД8 (анти-HLA-ABC), ИКО-1 (анти-HLA-DR) и м AT P3x63Ag.8.653 в качестве контроля у здоровых лиц и больных РА.

Показатели Здоровые лица Больные Ffl Примечание:

Исходные значения.. ____49.5Lt2.ll 29.14i2.63 после значе-

Контроль (РЗхБЗАд.8 653) 47.32*3.01 31.26il.99 ний в опыте

анти-LFA-l ........ ____29.51i4.14 11/14 17.10i2.33 11/11 указана час-

анти-HLA-ABC ...... .... 1.49*6.75 В/ 8 7.10+2.17 В / В тота

анги-HLA-DB ....... 27.14i5.47 В/ 9 34.19i3.9CT 5/16 эффекта.

В обоих группах исходные значения и контроль между собой не различались. Как внутри групп доноров, так и больных РА игнорирующие эффекты мАТ были достоверны (р<0.01); однако, у больных РА мАТ ИКО-1 вызывали слабую, но значимую стимуляция цитолиза (р<0.05, отмечено звездочкой). Однако, группа из 16 больных РА оказалось гетерогенной по эффекту анти-011-антител: у 5 человек ИЦ снижался, а у И -повышался. По своим иммуноцитологическим характеристикам эти лица относились соответственно ко II и I группам больных (табл. 5).

У больных II группы, то есть таких больных, у которых связи имму-ноцитологических параметров и цитолитической активности частично напоминают таковые у здоровых лиц, воздействие мАТ анти-ОИ проявляется также, как и у здоровых доноров - подавлением цитолитической активности. Те из больных РА, которые соответствуют I группе, то есть имеют те же

связи инвертированными, характеризуются самым высоким уровнем LFA-1+Рсу+-лимфопитов и гиперэкспрессией поверхностных белков, реагируют на aimi-DR-обработку повышением цитолиза (до нижних границ "нормы"). Очевидно, что блокирование активности части НЬРА-1+Рсу+-лимфоцитов с помощью анти-ОН-антител снимает их супрессирующий эффект и цитоли-тическая активность восстанавливается почти до донорского уровня.

Этим же механизмом мы можем объяснить неполную отмену цитоли-тической активности мАТ ИКО-1 у здоровых лиц: определенный уровень HLA-DR есть и в норме, в основном, на Н1_.РА-1+Рсу+-лимфоцитах. Анти-DR-антитела "выводят их из строя", но оставшиеся HLFA-1+DR клетки обеспечивают примерно половинный уровень цитотоксической активности.

Неполная отмена киллинга антн-LFA-aiггителами, очевидно, связана с описанным для этого белка феноменом повышения "аффинности" взаимодействия после контакта с лигандами - белками семейства ICAM (Vives J., 1994): полная экранировка экспрессированного HLFA-1 антителами до внесения клеток-мишеней не исключает вывода его резервных порций после начала межклеточного контакта.

Эффект анти-Н1А-АВС-антител и у здоровых лиц, и у больных настолько выражен, что носит качественный характер: связывание (экранирование) HLA-продуктов I класса ведет к безоговорочной отмене NK-активнос-ти. Это значит, что HLA-продукты I класса, как и II, необходимы для стимуляции ЕК-лимфоцита к литическому акту.

Таким образом, распознавание, осуществляемое естественными киллер-ными лимфоцитами является HLA-нерестриктированным, но HLA-обуслов-ленным процессом.

Несомненно, что экспрессия HLA-DR-молекул на активированных клетках также является не просто "маркером активации", а связана с неисследованными пока функциями этих молекул, связанными с регуляцией про-лиферативной активности. Такие гипотезы начинают обсуждаться в последнее время (Oedum N. et al., 1994). Изучение связанных с белками гистосовмес-тимости молекулярно-клеточных механизмов регуляции пролиферативной активности, очевидно, будет иметь прямую связь с проблемой патогенетической коррекции избыточной активации ИКК и паренхиматозных клеток при РА и других аутоиммунных заболеваниях и состояниях. В этой связи особый интерес в последнее время вызывают макроглобулины (МГ).

6. Иммунные аспекты регуляторной роли АБПА

До недавнего времени МГ считались регуляторами активности протеи-наз в системе гемостаза, причем считалось, что большинство из них синтези-

руется в процессе беременности. С появлением данных о снижении в их присутствии митоген-индуцированной пролиферации, возникла точка зрения об иммунодепрессивной функции МГ как "белков беременности". Однако, данные последних лет показали, что они являются постоянными компонентами плазмы как женщин вне гестационного периода, так н мужчин и являются рестрикторами цитокиновой регуляции (Borth W., 1992, Zorin N.A. et ah, 1992, Zorin N.A., Zhabin S.G., 1994).

Способность АБПА участвовать в регуляции активации лимфоцитов оценивалась нами в моделях индукции поли- или олигоклональной пролиферации. АБПА использовался в культурах в диапазоне доз, охватываших как концентрации белка в плазме беременных женщин в III триместре, так и физиологический уровень у небеременных женщин и мужчин.

Пролиферативньш ответ на ФГА и МЛ в присутствии АБПА существенно подавлялся в равной степени как у женщин, так и мужчин. Корреляционный анализ полученных данных показал, что как у мужчин, так и у женщин интенсивность пролиферации на МА или ФГА в присутствии АБПА значимо не связана с возрастом доноров, уровнем спонтанной пролиферации, пролиферации в присутствии АБПА и таковой в присутствии МА или ФГА. Изучение воздействия разных доз АБПА на ФГА-и МЛ-инду-цированную пролиферацию показало однотипность реагирования мужчин и женщин. С уменьшением дозы АБПА уровень пролиферации приближается к контрольному, а у женщин на 5-е сутки отмечается тенденция к синергизму МЛ и малых доз АБПА. При этом не наблюдается значимых различий в выраженности пролиферации на все 7 использованных доз белка при сравнении соответствующих групп мужчин и женщин (рис. 16, 1-4).

Следовательно, АБПА является выраженным ингибитором стимулированной поликлональной пролиферации Т- и B-лимфоцитов, нивелирующим половые, возрастные и индивидуальные вариации.

Однако, культивировании МК с АБПА (без митогенов) вызывает до-зозависимое увеличение пролиферативной активности лимфоцитов (рис. 16, 5-8) Его интенсивность определяется исходным уровнем пролиферативной активности (для женщин р=0.848; р<0.01, для мужчин р=0.754; р<0.01). При этом для клеток мужчин не наблюдается связи между возрастом и возрастанием пролиферативной активности, а зависимость для клеток женщин имеет параболический характер с точкой перегиба в 35.5 лет. В подгруппе женщин моложе этого возраста с ростом концентрации АБПА пролиферация падает (рис. 16, 7), а в подгруппе старше 35.5 лет, наоборот, растет по мере увеличения дозы АБПА в культуре.

Рисунок 16. Дозозависимое действие АБПА на спонтанную и митогениндуцированную пролиферацию МК здоровых женщин (30 человек) и мужчин (23 человека). Регрессионный анализ.

1 - пролиферация МК женщин в присутствии АБПА и ФГА; 2- то же для клеток мужчин. 3 - пролиферация МК женщин в присутствии АБПА и МЛ; 4 - то же для МК мужчин. 5 - пролиферация МК женщин в присутствии АБПА; 6 - то же для МК мужчин;

7 - зависимость пролиферации МК женщин моложе 35.5 лет от дозы АБПА;

8 - то же для МК женщин старше 35.5 лет. По осям OY 1-4: 100% - ответ на митоген без АБПА; OY 5-8: 100% - спонтанная пролиферация. По осям ОХ 1-8: концентрация АБПА (log мкг/мл).

Ингибирующий эффект АБПА (100 мкг/мл) на поликлональную активацию проявляется и после кратковременной (1.5 часа) инкубации с ним МК и последующих отмываний - после этого ответ на ФГА снижается в среднем на 76%, а на МЛ - на 40%.

90-минутная преинкубация с АБПА в дозе 100 мкг/мл с последующими отмываниями также достоверно подавляет ответ в однонаправленной первичной СКЛ: преинкубация стимулирующих клеток снижает ответ в среднем в 1.24 раза, а отвечающих - в 2.65 раза, постоянное присутствие белка в культуре снижает пролиферативный ответ еще сильнее (рис. 17).

Рисунок 17. Эффект АБПА на уровень пролиферации в однонаправленной первичной алло-СКЯ.

I - культивирование в присутствии 100 мкг/мл АБПА;

II - предобработка респондеров 100 мкг/мл АБПА 90 минут;

III - предобработка стимуляторов 100 мкг/мл АБПА 90 минут; К - контрольная пролиферация. Данные по 14 культурам доноров-мужчин.

Титрование дозы АБПА в культуре от 125 до 4 мкг/мл (5 двукратно уменьшающихся разведений) выявило плавное снижение ответа, где зависимость пролиферативного уровня (у) от концентрации АБПА (х) аппроксимируется уравнением у= 22.073х®

После инкубации с АБПА отмечается значимое снижение экспрессии НЬА-ОИ на не-Т-лимфоцитах и моноцитах (рис. 18, опытные столбцы заштрихованы), которое происходит как за счет того, что часть клеток становится негативными, а на оставшихся снижается плотность молекул белка.

ш

жг щтг

л>се

ц\т*

SS13

щ/яе те

3I.4T

зг.ег ли

JltS

шг

лав

ш ш

13

ш

-t.lS-

-7.SS

J

Более выраженный эффект белка на отвечающие клетки свидетельствует и о других механизмах его влияния, очевидно, реализующихся на уровне хелпе-ров-индукторов.

Эффект АБПА, проявляющийся в снижении стимулированого уровня пролиферации после кратковременной преинкубации с ним, указывал на существование механизма рецепции этого белка. С помощью иммуно-блоттинга установлено, что АБПА входит в состав белков МК как женщин, так и мужчин, однако его масса определена в 85 кДа, в то время как масса субъединицы АБПА, находящегося в циркуляции, составляет 205 кДа и они формируют тетрамер (или димер димеров) массой 820 кДа (Жабин С.Г., Зорин Н.А., 1988). Очевидно, что в организме существует не менее двух форм АБПА, одна из которых (85 кДа) является компонентом цитоплазматичеких мембран, вторая же (820 кДа) находится в циркуляции.

Кроме этого, в составе цитоплазматических мембран МК находятся два белка с молекулярными массами около 80 и 75 кДа, обладающие аффинитетом к АБПА. Возможно, что обнаруженные аффинанты в нативном состоянии являются субъединицами, а не самостоятельными белками, или входят в состав каких-либо других рецепторных структур. Однако, массы обоих обнаруженных рецепторных белков отличаются от массы рецептора для комплекса АБПА-протеиназа - 94 кДа, который, тем более, определяется как мономерный (Жабин С.Г., 1993).

Снижение экспрессии ША-ОИ не является результатом экранирования этих белков АБПА, по крайней мере, в условиях иммуноблоттинга, АБПА не конкурирует с мАТ ИКО-1 за субстрат связывания.

Известно, что в процессе беременности основным продуцентом АБПА является трофобласт. Однако, источник АБПА вне гестационного периода и, тем более, у мужчин, неясен. Логично было предположить, что при выполнении макроглобулинами одной из своих функции, регуляции активности про-теиназ, их связывание с последними должно восприниматься продуцирующими клетками как потребление продукта и индуцировать гомеостатический ответ. Были сконструированы биогенные комплексы одной из основных серино-вых протеин аз - плазмина с а-2-макроглобулином (П-МГ) и антиплазмином

(П-АП).

СОЗ 014 лимфоциты Эффект 7/7. р<0.05 ОЯ* моноциты эффект 6/7. р<0.05 СОЗ*ОЯ+ лимфоциты Эффект 4/7. р>0.05

ОПЗ 400 300 200 50 Рисунок 18

После 6 суток в культуральном супернатанте происходит значительное накопление а-2-макроглобулина, ассоциированного с беременностью а2-гли-копротеина и ассоциированного с беременностью протеина А. На рисунке 19 показан синтеза АБПА в нестимулированных культурах МК под влиянием П-МГ и П-АП.

Рисунок 19. Влияние комплексов П-МГ и П-АП на продукцию АБПА культурами периферических МК здоровых доноров.

Данные в виде М и 15; звездочками отмечены значимые (р<0.05) отличия от контроля (О, без комплексов). В интервалах до 200 мкг/мл П-МГ и до 2 мкг/мл П-АП продукция АБПА выше у мужчин.

Следует отметить, что уровень продукции АБПА в ответ на физиологические концентрации исследовавшихся комплексов превышал плазменную концентрацию этого белка.

Таким образом, у мужчин и женщин (вне гестационного периода), очевидно, основными продуцентами макроглобулинов являются клетки иммунной системы, причем локальная концентрация может достигать существенных значений.

Всплески фибринолитической активности наблюдаются не только при травмах, но также при злокачественном росте, в очагах острого и хронического воспаления (Веремеенко К.Н. и соавт., 1968, Kordula Т. et al., 1994, Graziadei J. et al., 1994), что показывает участие макроглобулиновой регуляции практически во всех известных иммунных феноменах.

7. Ассоциированность показателей биогенеза HLA- и костимулятор-ных белков с носителъством аллельных вариантов генов HLA-комплекса I класса.

Ассоциированность функций иммунитета с носителъством определенных HLA-генов была описана не только для таких межсистемных показателей, как, например, предрасположенность или резистентность к определенным заболеваниям, но и для отдельных показателей тканевого и клеточного уровней организации иммунной системы. В представленной работе сопоставлялось но-

АБПА, нг/мл 243

51 2С9 ИМ

П-МГ, мкг/мл

О (.05 0.20 2.CJ

П-АД мхг/мл

- культуры МК 5-ти доноров-мужчин, е-культуры МК 5-ти женщин

сительство аллельных вариантов НЬА-генов I класса с выраженностью в общей сложности 37 количественных параметров циркулирующих МК: для СГ)3+-, СОЗ -ЛИМфОЦИТОВ, МОНОЦИТОВ, НиАЛ-позитивных лимфоцитов и их Рсу-позитивных и -негативных субпопуляций учитывалось их относительное содержание, численность среди них НЬА-АВС- и НЬА-ОК-позитивных клеток и уровни экспрессии этих белков; для НЬРА-1-несущих лимфоцитов учитывались также уровни экспрессии НЬРА-1 и РсуШП, а также показатель ЕК-цитолиза; наряду с сывороточными уровнями рН1_А (продуктов ло-кусов -А, -В и -ОИ), анализировались их уровни в динамике спонтанного и ФГА-стимулированного культивирования.

У здоровых лиц такая связь выявлена в виде 135 ассоциаций - 64-х негативных и 71-й позитивной. При анализе у здоровых лиц тех же параметров с носительством гаплотипов НЬА, выявлено 96 ассоциаций - 51 позитивная и 45 негативных.

Анализ связи показателей МК больных РА с носительством отдельных НЬА-генов выявил 64 ассоциации - 32 позитивных и 32 негативных. По сравнению со здоровыми лицами, из этих 64 ассоциаций 10(15.6%) совпадало с таковыми у здоровых лиц, 4(6.25%) было инвертированных, а 48 (78.15%) составляли новые ассоциации, то есть не встречающиеся у здоровых лиц. Среди последних - 7 ассоциаций приходились на счет 2-х антигенов, А28 и А19+32, нехарактерных для здоровых доноров.

Анализ ассоциированности Н1_А'-гаплотипов выявил у больных РА 61 ассоциацию - 35 позитивных и 26 негативных. Среди всех них на счет совпадающих со здоровыми людьми приходилось уже только 2(3.3%), 3(4.9%) - на счет инвертированных, а 56(91.8%) составили новые ассоциации. Среди них 36 составляли ассоциации с нехарактерными для здоровых лиц гаплоти-пами.

Такой сравнительный "брутто-анализ" НЬА-ассоциированности имму-ноцитологических и функциональных параметров циркулирующих МК наглядно показывает изменение ее характера у больных РА. В качестве примера НЬА-ассоциированности с такими признаками на рис. 20 показаны групповые средние уровня экспрессии Н1_А-АВС-6елков на НЬРА-1-по-зитивных лимфоцитах у обладателей соответствующих Н1_А-антигенов и -гаплотипов среди здоровых лиц и больных РА.

Следует отметить, что у больных РА область пониженных значений параметра, определяемая негативными ассоциациями, соответствует у здоровых лиц области его повышенных значений, определяемой позитивными ассоциациями.

Рисунок 20. Уровень экспрессии HLA-белковI класса в зависимости от носительства HLA-антигенов и гаплотипов I класса.

негативные ассоциации

АЗВ7

IA10B40I ASQ8I

11

12

13

14

15

16

Вольные РА 17 18

HLA-ABC на LFA-1+ о.е.

А3040

п

А9В12

Д1В161

А10В40 А11В5

I

А11В12

А9ВЗБ

|А10В35| негативные ассоциации

позитивные ассоциации

Здоровые лица

Несмотря на существование разных гипотез о природе HLA-ассоции-рованности, нам представляются более верными представления о полигенной детерминации проявлений иммунитета, а природа ассоциированности связана с явлением неравновесного сцепления: наследование HLA-генов тесно сцеплено с комплексом генов "истинной предрасположенности к заболеваниям", как резюмировали Международные совещания по этой проблеме в начале 70-х годов (Ивани П., 1975). Аллельные варианты этих генов и их продуктов в настоящее время начинают активно изучаться. В частности, это гены, находящиеся внутри HLA-комплекса и связанные с внутриклеточными этапами биогенеза Н LA-продуктов - постсинтетическим протеолитическим контролем и объединением с антигенными пептидами (Campbell R.P., 1994. Tongio М.-М. et al., 1994).

HLA-ассоциированность, таким образом, маркирует системные генетические факторы, в определенной мере определяющие границы эндогенной вариабельности параметров клетки.

8. Диагностическая значимость определения субпопуляций HLA-DR-экспрессирующих циркулирующих клеток при неаутоиммунной патологии.

Наряду с определением уровня экспрессии HLA-DR, подсчет только относительной численности DR-экспрессирующих Т-лимфоцитов при РА показал себя надежным лабораторным признаком, обладающим 93% чувствительности и 96.5% специфичности в артрологической патологии. В силу этого были оценены диагностические возможности определения субпопуляций периферических HLA-DR-экспрессирующих МК при неартрологической и

неаутоиммунной патологии - при скрининговых клинико-иммунологических обследованиях детей дошкольного возраста и в остром периоде клещевого энцефалита.

При одномоментном обследовании по 27 параметрам трех групп детей (I -56 здоровых детей, II - 89 "часто болеющих" и III - 19 "часто болеющих" и имеющих в анамнезе хроническое неспецифическое заболевание; группы II и III - в период клинического здоровья) между группами I—II ни один из использовавшихся тестов значимых различий не выявил. Между группами I—III тенденциями к значимой вероятности различий (U-критерий) обладали НСТ-тест (р=0.02), стимулированная ЛПС продукция ФНО-а (р=0.05), а значимые различия были только в относительной численности сегментоядерных лйкоцитов (р=0.022).

Вместе с тем, при повторном обследовании через 5 месяцев части детей (49 человек), оставшихся во II группе диспансерного наблюдения, определялся следующий ряд вероятностей значимых различий параметров (парный t-Стьюдента): 1) 0.025x10 (НСТ-тест ), 2) 0.00019 (включение JH -ти ми-дина в нестимул, культурах), 3) 0.0019 (стим. продукция ФНО-а), 4) 0.0068 (CD4+ в мм3), 5) 0.0093 (CD8+ в мм3), 6) 0.012 (CD22+ в мм ), 7) 0.013 (CD3+DR+ в мм3), 8) 0.026 (лимфоциты в мм3), 9) 0.027 (CD4+ %), 10) 0.03 (CD8+DR+ в мм3), И) 0.031 (CD4+DR+ %), 12) 0.037 (CD3+ в мм3).

При анализе корреляционных связей между клинико-иммунологически-ми параметрами внутри групп детей, находящихся в одном детском учреждении (яслях или садике) был выявлен феномен формирования своеобразной композиции связей параметров, которая отличается от таковых в других детских коллективах (Михайленко A.A., 1993, личное сообщение). На уровне использовавшихся лабораторных тестов это проявляется значительным варьированием состава циркулирующих лейкоцитов, в первую очередь, в соотношении мононуклеарных и сегментоядерных лейкоцитов и относительной гомогенностью в процентном содержании основных субпопуляций лимфоцитов. Большинство иммунных показателей детей из групп, различающихся по соотношению МК/сегментоядерные лейкоциты, как правило, статистически значимо различаются как при сравнении больных и здоровых детей, так и внутри этих групп. Так как обсуждаемые группы немногочисленны, 10-15 человек, то при объединении всех данных в одну выборку, различия соответственно уравновешиваются.

Другой моделью для оценки диагностических возможностей определения DR-экспрессирующих клеток в периферической крови послужили данные обследования лиц, укушенных вирусофорным клещом и получавших, в порядке

клинических испытаний, препарат с предполагаемой интерфероногенной активностью. Группа наблюдаемых лиц после первого обследования (1-2 дня после нападения клеща) разделилась на заболевших (10 человек) и незабо-левших (8 человек), что дало возможность ретроспективно оценить разницу в их исходных показателях. Наблюдался следующий ряд вероятностей значимых различии параметров: 1) 0.02x10 ( соотношение лимфоциты/моноциты; моноциты ОК+ в %), 2) 0.0012 (сегментоядерные лейкоциты в мм ), 3) 0.0025 (лейкоциты в мм3), 4) 0.0055 (моноциты ОИ+в мм3), 5) 0.009 (С08ЧЖ+ В %), 6) 0.015 (СЭ4+0{Г в %). 7) 0.034 (моноциты в мм3).

Таким образом, определение активированных субпопуляций циркулирующих МК, в первую очередь, субпопуляций ОН+-Т-лимфоцитов, не является универсальным иммунным показателем: если при РА эти тесты имеют свойства, приближающиеся к качественным показателям, то в случайных бесповторных выборках больных ДОА (рис. 10), "часто болеющих детей" они не показывают отличий от соответствующих групп сравнения, а в остром периоде клещевого энцефалита по чувствительности их опережают показатели упрощенной лейкограммы.

Заключение

Задача клинической иммунологии состоит в коррекции нарушений иммунитета в патологии. Иными словами, необходимо управлять процессами клональной пролиферации, приводящими к накоплению носителей иммунных функций - специализированных клеток (дифференцировке). Последняя, как известно, является необратимым, то есть нерегулируемым процессом.

Главным итогом представленной работы является изучение механизмов авторегуляции иммунокомпетентных клеток в период пролиферативного покоя, то есть тогда, когда еще возможно поддержание постоянства их свойств.

Введение и дальнейшее развитие концепции биогенеза НЬА-продуктов покоящихся ИКК было обусловлено необходимостью выделить, с одной стороны, их специфику как клеток иммунной системы, а с другой - подчеркнуть их отличие от внешне сходных процессов активированных клеток. Учитывая наследственно обусловленные (системные) ограничители изменчивости параметров, исследование выраженности отдельных этапов биогенеза продуктов НЬА -комплекса и других поверхностных белков в норме составило направление научных исследований, позволившее в настоящей работе показать, что фактором саморегуляции является присутствие на поверхностной мембране ИКК продуктов Н1_А-комплекса, а гомеостатические механизмы определяются временной динамикой его количественных параметров. Разнообразие программ временной структуры задается свойствами водных растворов в сре-

де космопланетарных факторов, а выбор осуществляется клеткой благодаря наличию липидной мембраны и кислород-содержащей атмосферы, поэтому можно сказать, что осциллятор околочасовых клеточных ритмов является эндогенным, но вопрос о его вне- или внутриклеточной локализации некорректен.

Важным фактором саморегуляции являются макроглобулины, в частности, АБПА, ограничивающие процессы клональной пролиферации.

Системные нарушения иммунитета при ревматоидном артрите проявляются постоянным присутствием в циркуляции активированных клеток, относящихся к разным субклассам МК, но, в первую очередь, к С04-Т-клет-кам. Их свойства могут быть явно неблагоприятными для индивида, но не могут быть "искаженными" или "измененными патологическим процессом" и, соответственно, не модулируются под воздействием факторов регуляции покоящихся клеток.

Очевидно, что в дальнейшем акценты иммунологических исследований при ревматоидном артрите должны быть перенесены на изучение причин и механизмов активации аутореактивных клеток и способов элиминации их потомков.

Выводы

1. Латеральная диффузия и связанные с ней топографические изменения положения интегральных молекул в плоскости мембраны (HLA-DR, IgM, Fcy-RIII) связана с уровнем их экспрессии, нарастающим при изменении характера распределения белков от диффузного к полярному. Процесс ЛД на части циркулирующих лимфоцитов индуцируется эндогенными лигандами in vivo. При отсутствии внешних стимулов в кратковременной культуре МК здоровых лиц наблюдается циклическое (средний период 38 минут) изменение этих параметров, что проявляется как вариабельностью численности клеток, позитивных по данному поверхностному белку, так и непостоянством в уровне экспрессии данного белка на отдельных клетках. Выявленные периодические изменения показателей имеют характеристики околочасовых клеточных ритмов.

2. В кратковременных суспензионных культурах МК концентрация растворимого HLA-A, -В и DR-содержащего материала (pHLA) изменяется периодически с периодами 20-70 минут. Интенсивность (амплитуда и скорость) секреции-реабсорбции белков покоящихся клеток зависит от температуры, активности цитоскелета, состояния липидного бислоя и позитивно регулируется а-2-интерфероном и факторами в составе тимических экстрактов (олевил).

3. Аффинно выделенный из сыворотки с помощью мАТ ИКО-1 НЬА-ПЖ-содержащий материал (рОИ) не влияет на МЛ-индуцированную пролиферацию, в высоких дозах подавляет Ф ГА-пролиферацию и ответ на аутологичные и полуаллогенные (по НЬА-ОИ) клетки-стимуляторы в скл, но в дозе 0.1мкг/мл н сниженном количестве клеток-стимуляторов способен повышать ответ в СКЛ.

В составе белков цитоплаэматических мембран МК здоровых лиц обнаружен белок массой ~40 кДа, обладающий аффинитетом к рОИ.

4. Наряду с генетическими факторами, периодические изменения уровня экспрессии НЬА-ОИ на МК и их способности образовывать конъюгаты с аутологичными и аллогенными клетками обусловливают разный уровень ответа на аллогенные МК, причем периоды высокого пролиферативного ответа в СКЛ чередуются с периодами относительной рефрактерности. Кратковременное разобщение вносимой дозы клеток-стимуляторов вызывает поликлональ-ную супрессию пролиферативного ответа.

5. У больных РА значительно повышено представительство НЬА-ОИ на периферических Т-лимфоцитах, преимущественно за счет С04+-клеток, при этом уровень экспрессии Н1_А-белков I класса снижен. Сниженные уровни экспрессии НЬА-ОИ при данной патологии характерны для СОЗ -лимфоцитов и моноцитов, в то время как на НЬРА-1-позитивных лимфоцитах наблюдается повышенная экспрессия НЬА-белков обоих классов, С016 и самого НЬРА-1. Показатели ОИ-экспрессии Т-лимфоцитов при РА имеют свойства качественных признаков, в то время как при ряде других патологий неаутоиммунного характера диагностического значения не имеют.

6. Полуторачасовая инкубация МК доноров с препаратами тимуса и костного мозга, цитокинов (ИЛ-1 и а-2-ИФ) приводит к повышению уровней экспрессии НЬА-белков обоих классов, НЬРА-1 и С016, для клеток больных РА характерно отсутствие таких эффектов. Скорость стимулированной ЛД в норме может позитивно регулироваться тимическими факторами (тимозин IV). У больных РА этот показатель снижен более чем в 6 раз и под влиянием тимозина не изменяется.

7. У больных РА повышена численность как НЬРА-1-позитивных лимфоцитов, так и их Рсу - и Рсу+-субпопуляций, при этом цитолмтическая активность ЕК существенно снижена. У здоровых лиц выделяется два характерных типа обеспечения одинакового уровня цитолитической активности ЕКК субпопуляциями НЬРА-1-экспрессирующих лимфоцитов, обусловленные, в одном случае НЬРА-1-, Рсу-, НЬА-АВС- и -ПК-белками, в другом - НЬРА-1 и НЬА-ОИ. Последний тип сохраняется только у части больных

РА.

8. Сывороточные уровни pHLA, кодируемых локусами А, В и DR, у больных РА и здоровых лиц не различаются. Кинетика продукции этих белков in vitro, в особенности pDR, в нестимулированных культурах МК больных аналогична таковой в стимулированных ФГА культурах клеток здоровых доноров.

9. У здоровых лиц выявлена 231 ассоциация параметров биогенеза HLA- и вспомогательных белков с носительством отдельных HLA-генов и гаплотипов А- и В-локусов. У больных РА ассоциированность с теми же показателями выражена слабее (выявлено 125 ассоциаций) и носит иной характер: 87.8% из них связано с носительством HLA-генов, нехарактерных для здоровых лиц, инвертировано - 5.6% и только 9.6% ассоциаций совпадает с таковыми у здоровых лиц.

10. Представитель макроглобулинов, модифицированная форма АБПА, является выраженным ингибитором стимулированной поли- и олигоклональ-ной пролиферации, в то время как сам АБПА умеренно повышает пролифе-ративную активность лимфоцитов. Полуторачасовая инкубация МК с АБПА приводит к заметному падению экспрессии HLA-DR на CD3 -лимфоцитах и моноцитах и последующему снижению пролиферации в СКЛ. Культуры периферических МК способны синтезировать АБПА в выраженных количествах. Среди белков цитоплазматических мембран МК обнаружена мембранная форма АБПА (85 кДа) и два белка (80 и 75 кДа), обладающих аффинитетом к АБПА.

11. Околочасовые клеточные ритмы водно-ионной проницаемости сохраняются в ряду объектов с последовательно упрощаемой организацией мембран: кариоциты - эритроциты - тени эритроцитов - липосомы из эритроци-тарных липидов - диализная мембрана. Динамическое измерение концентрации вещества в водном растворе показывает наличие неслучайных колебаний; в том числе выявляются составляющие, по величине периода напоминающие ОКР. Динамическое измерение естественного у-фона в диапазоне энергий излучения >100 кэв ("космического излучения") показывает аналогичные закономерности. Сравнение этих двух синхронно регистрировавшихся параметров показывает наличие нелинейной статистически значимой корреляционной связи.

12. Регуляция как процесс обратимых изменений гомеосгатически важных параметров в клетках иммунной системы возможна в период пролифера-тивного покоя и проявляется как околочасовая периодичность их функций.

Список работ по теме диссертации

1. С.М. Шеогин. М.И. Мусатов. B.C. Кожевников. Применение стандартизированных формалинизированных эритроцитов, нагруженных у-глобулином, для определения клеток, несущих Fc-рецептор // Лаб. Дело,- 1978. - N 3,- С. 162-163,

2. М.И. Мусатов. К вопросу о ритмах движения иммуноглобулиновых рецепторов B-клеток человека // Современные аспекты физиологии, адаптации и патологии.

- Новосибирск, 1979. - С. 57-58.

3. С М. Щергин. Г.З. Шубинский. B.C. Кожевников и соавт. Влияние тимозина на субпопуляции лимфоцитов человека // Бюлл. эксперим. биол. мед. - 1980. -Т.89, N 2, - С. 192-194.

4. М.И. Мусатов Метод удаления агрегированных глобулинов из конъюгатов // Внедрение иовых методов в практическое здравоохранение и научно-исследовательскую работу. - Новосибирск, 1981. - С.82-83.

5. М.И. Мусатов. Розеткообразование с диагностикумом для обнаружения ревматоидного фактора - метод выявления "третьей" субпопуляции лимфоцитов // Теоретические и практические вопросы профилактики, диагностики и терапии наиболее распространенных заболеваний Сибири и Дальнего Востока. - Новосибирск, 1983. - С.81-82.

6. В.П. Лозовой. В.И. Коненков. B.C. Ширинский и соавт. Характеристика функций иммунной системы у здоровых и больных ревматоидным артритом в динамике рапогрязелечения // Курортные факторы в терапии хронических заболеваний. Тезисы докладов межрегиональной научно-практической конференции, -Новосибирск, 1984. - С.44-45.

7. М.И. Мусатов. В.И. Коненков В.Н. Лозовой. Роль блокады микротрубочек в модуляции стимулирующей активности аллоантигенов в первичной смешанной культуре лимфоцитов человека / / Функциональные характеристики циркулирующего пула иммунокомпетентных клеток. - Новосибирск, 1984.- С.34-35.

8. М.И. Мусатов. Е.Д. Петрова. В.Н. Лозовой. В.И. Коненков Снижение функции естественных киллеров у больных ревматоидным артритом // Профилактика, диагностика и лечение аутоиммунных заболеваний и вторичных иммуно-дефицитов. Тезисы докладов Всесоюзной конференции. Новосибирск. - 1985. -Т.1, - С.54-56,

9. В.И. Коненков. Ю.Н. Наумов. М.И. Мусатов и соавт. Уровень экспрессии продуктов генов HLA комплекса И класса на клетках периферической крови здоровых лиц и больных ревматоидным артритом // Иммунология. - 1986. - N б, - С. 71-72.

10. В.И. Коненков. Ю.Н. Наумов. М.И. Мусатов. В.Ф. Прокофьев. Способ диагностики ревматоидного артрита. A.c. 1327006 СССР, - 1987.

11. М.И. Мусатов^ Хронобиологические закономерности как фактор нестабильности иммунологических показателей // Методология, организация и итоги массовых

иммунологических обследований. Тезисы докладов Всесоюзной конференции. -Москва. - 1987. - С. 185-186.

12.М.И. Мусатов. B.C. Кожевников. В.И. Коненков. В.П. Лозовой Зависимость шединга HLA-антигенов I и II классов от времени. Связь колебаний ше-динга HLA-антигенов и меченных макромолекул / / Бюлл. эксперим. биол.

мед. - 1987. - Т. 104, N 9, - С.327-329.

13.М.И. Мусатов. Подвижность поверхностных HLA-молекул II класса при взаимодействиях клеток иммунной системы. Автореф. дис. канд. - Новосибирск,

1987.

14.М.И. Мусатов. В.И. Коненков. Роль цитоскелета и состояния липидного би-слоя в регуляции функциональной активности лимфоцитов / / Тезисы докладов IV Всес. конф. по патологии клетки. Москва. - 1987.- С. 145.

15.М.И. Мусатов. В.И. Коненков. В.П. Лозовой. Взаимосвязь уровня экспрессии и характера распределения поверхностных белков с функциональной активностью лимфоцитов человека в первичной аллогенной смешанной культуре // Иммунология. - 1987. - N 6, - С.63-64.

16.Н.Б. Орлов. М.И. Мусатов. В.И. Коненков. Генетический анализ эффективности межклеточных взаимодействий при ответе на аллоантигены // Оценка и коррекция состояния иммунной системы в клинике и эксперименте. - Новосибирск, 1987. - С.55-63.

17. В.И. Коненков. М.И. Мусатов. Подвижность мембранных белков лимфоцитов человека как фактор функциональной активности клеток иммунной системы // Проблемы и перспективы современной иммунологии. Методологический анализ. - Новосибирск, Наука, 1988. - С.74-87. ,

18.В.И. Коненков. М.И. Мусатов. Н.Б. Орлов и др. Ассоциированность генов HLA—комплекса с параметрами иммунного статуса и роль HLA-молекул в проявлении функциональной активности клеток иммунной системы. // Клиническая иммунология и иммуногенетика. Новосибирск, 1988. - С.57-63.

19.Е.Д. Петрова. М.И. Мусатов. В.И. Коненков. А.Ю. Барышников. Естественная цитотоксичность клеток, экспрессирующих Fc-рецептор и HLFA-1-белок у здоровых лиц // Экспериментальная и клиническая иммунология на Востоке страны. Тез. докл. региональной конф. Красноярск, 1988. - Т.1, - С.105.

20.В.И. Коненков. Е.Д. Петрова. Ю.Н. Наумов и др. Нарушения процессов биогенеза поверхностных молекул гистосовместимости в патогенезе аутоиммунных заболеваний. Там же, Т.2., С.39.

21.E.H. Наумова. Ю.Н. Наумов. Б.В. Протопопов. М.И. Мусатов. О погрешностях иммунологических методик. Там же, Т2, - С.63-64.

22.В.И. Коненков. М.И. Мусатов. Ю.Н. Наумов. И.Ю. Короткова. Биогенез HLA

антигенов на поверхностной мембране клеток периферической крови / / Средства и методы биоспецифической коррекции в гематологии и трансфузио-логии. Тез. докл. Республиканской конф. Минск, 1988. - С.61-62.

23.V.l. Konenkov. Yu.N. Naumov. M.I. Musatov. E.D. Petrova. I.Yu. Korotkova. Diagnostic significance of quantitative analysis of T-lymphocyte antigen activation expression in rheumatoid arthritis // Tissue Antigens. - 1989. - V.33, N 2, -P.328.

24.М.И. Мусатов. С.Г. Жабип. Б.В. Протопопов. В.И. Коненков. Влияние ассоциированного с беременностью протеина А на аллогенную смешанную культуру лимфоцитов человека // Иммуногенетические аспекты аутоиимунных заболеваний и вторичных иммунодефицитов человека. Тез. докл. Всесоюзного симпозиума. Новосибирск, 1989. - С.41-42.

25.С.Г. Жабин. Н.В. Мальцева. В.И. Коненков. М.И. Мусатов. H.A. Зорин. Значение ассоциированного с беременностью протеина А в регуляции иммунитета. Тез. докл. IV Всес. съезда патофизиологов. Кишинев, 1989. - Т1, - С.

256.

26.М.И. Мусатов. Разобщение во времени стимулирующей дозы как супрессирую-щий фактор в аллогенной смешанной культуре лимфоцитов. Тез. докл. I Всесоюзного съезда иммунологов. Москва, 1989. - Т.1, - С. 73.

27.V.l. Konenkov. M.I.Musatov. Yu.N. Naumov. V.P. Lozovov. Cellular models for estimation of immunomodulating drug efficacy //J. Immunol, and Immunopharmacol.

- 1989. - V.9, N 3, - P. 145.

28.В.И. Коненков. Е.Д. Петрова. М.И. Мусатов. И.В. Кудрявцева. Дифферен-цировка и функциональная активность натуральных киллеров при ревматоидном артрите // Иммунология. - 1990, - N 3, - С.59 - 62.

29.Ю.П. Падула. М.И. Мусатов. Циркадианные характеристики не-Т-клеточного звена иммунной системы как прогностические критерии эффективности бальнеотерапии хронических неспецифических воспалительных заболеваний женской половой сферы / / Актуальные вопросы бальнео-пелоидотерапии при санаторно-курортном лечении. Тез. докл. Республиканской конф. Владивосток, 1990. - С. 98-99.

30.А.М. Ковалевская. H.H. Беседнова. Ю.И. Гришин и соавт. Использование радиоизотопных методов в оценке реакций клеточного иммунитета. Методические рекомендации. Владивосток, 1990. - 28 с.

31. М.И Мусатов. С.Г. Жабин. Б.В. Протопопов. H.A. Зорин. В.И. Коненков. Влияние ассоциированного с беременностью протеина А на первичную аллогенную культуру лимфоцитов человека// Иммунология. 1992, - N 3, - С. 59-60.

32.М.И. Мусатов. Н.В. Мальцева. С.Г. Жабин. H.A. Зорин. В.И. Коненков. Влияние ассоциированного с беременностью протеина А на спонтанную и мито-гениндуцированную пролиферацию лимфоцитов человека // Иммунология. -

1992, - X 4, - С.25 - 27.

33.М.И. Мусатов. С.Г. Жабин. H.A. Зорин. В.И. Коненков. Доказательства существования рецептора для HLA-DR на мембранах мононуклеарных клеток Тез. докл. I съезда иммунологов России. Новосибирск, 1992. - С. 319-320.

34.М.И. Мусатов К вопросу о биоинформационных функциях воды. Там же, С320.

35.N.A. Zorin. S.G. Zhabin. M.I Musatov et.al. Immunoregulatoiy properties of pregnancy-associated macroglobulins and other proteinase inhibitors // Immunology of Reproduction. International Symposium. Kiev, Ukraina, 19-23 Oktober 1993. - P. 84.

36.С.Г. Жабин. H.A. Зорин. М.И- Мусатов. Использование коллоидного золота для иммуноцитохимического анализа субпопуляций иммунокомпетентных клеток // Клиническая лабораторная диагностика - 1993. - N б, - С. 62-64.

37.М.И. Мусатов. О физической природе осциллятора клеточных биоритмов // Институт клинической иммунологии СО РАМН. Научный отчет 1993. Новосибирск. - 1994. - С. 19.

38.М.И. Мусатов. С.Г. Жабин. В.И. Коненков. Н.А. Зорин. Влияние плазмина и его комплексов с (X-2-макроглобулииом и (Z-2-антиплазмином на пролифератив-ную активность лимфоцитов человека // Б юл. эксперим. биол. мед.- 1994. - N

9, - С. 304-305.

39.N.A. Zorin. S.G. Zhabin. R.M. Zorina. M.I Musatov. Immunoregulatoiy activity of plasma proteinase inhibitors // Canadian J. Physiol, and Pharmacol.- 1994. - V. 72, SuppL 1, - P. 262.

40.S.G. Zhabin. N-A. Zorin. M.I Musatov. Secretion of proteinase inhibitors and plasminogen by immunocompetent cells // 12^ European immunology meeting. Abstracts. Barcelona, 1994. - P. 265.

41.V.I. Konenkov. L.O. Chemitsina. M.I. Musatov. An immunosuppresive effect of tick-borne encephalitis virus // Ibid., P. 419.

42.С.Г. Жабин. H.A. Зорин. М.И. Мусатов. Влияние модифицированных плаз-мином ингибиторов протеиназ на продукцию макроглобулинов мононуклеарными клетками крови человека в культуре // Цитология. - 1994. - Т.3б,- N 12, - С. 1200-1204.

43.Л.О. Черницына. В.И. Коненков. М.И. Мусатов и соавт. Применение раннего индуктора интерферона радостна для экстренной профилактики и комплексной терапии клещевого энцефалита. Нейроиммунология, нейроинфекции, ней-роимидж. - (Мат. межд. научи, конф.), Спб. Лики России, 1995. - С. 122-126.

44.С.Г. Жабин. Н.А. Зорин. М.И. Мусатов. Влияние плазмина и его комплексов с а2-антиплазмином и 0С2"макРогл°булином 113 секрецию ингибиторов протеиназ и плазминогена периферическими мононуклеарными клетками // Вопросы мед. химии. -1995. - N 3, - С. 34-37.