Автореферат и диссертация по медицине (14.00.22) на тему:Использование культивированных стромальных клеток костного мозга в сочетании с углеродным матриксом для замещения костных дефектов

-с-И.А

л о

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ЦЕНТРАЛЬНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ТРАВМАТОЛОГИИ И ОРТОПЕДИИ им. Н. Н. ПРИОРОВА

На правах рукописи

ЕЛИКАШВИЛИ Мераби Абрамович

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУЛЬТИВИРОВАННЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА В СОЧЕТАНИИ С УГЛЕРОДНЫМ МАТРИКСОМ ДЛЯ ЗАМЕЩЕНИЯ КОСТНЫХ ДЕФЕКТОВ

14.00.22 — Травматология и ортопедия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 1993

Работа выполнена в Центральном ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте травматологии и ортопедии им. Н. Н. Приорова

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Ю. Г. Шапошников

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор X. А. Мусалатов

доктор медицинских наук А. И. Кавешников

Ведущее учреждение — Российский Медицинский Государственный Университет

Защита состоится » 1993 г. в час.

на заседании специализированного Совета К 074.02.01 в Центральном научно-исследовательском институте травматологии и ортопедии им. Н. Н. Приорова (125299, Москва, ул. Приорова, 10).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института

Автореферат разослан « 3»г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор мед. наук

С. С. Родионова

Актуальность проблемы» Возможность замещения значительных костных дефектов, несмотря на большое количество предложенных способов, остается серьезной проблемой, требующей поиска новых, высокоэффективных методов.

В последние годы был разработан метод получения моно-слойных культур стромальных клеток костного мозга и показано, что они при обратной трансплантации в диффузионных камерах и под капсулу почки образуют костную ткань /Зриденштейн А.Я. и др., 1970; Мискароэа Э.Д. и др., 1970 ; Чайлахян Р.К. и др., 1970; Фриденштейн А.Я., Лалыкина К.С., 1973 ; Фриден-штейн А.Я., Лурия F..А., I960 ; Чайлахян Р.К. и др., 1904 ; Ashton В.А. «t al. , 1984 ; Bab I« et al., 1966; Owen M. , Tridenebtein A.Ia., 1988/. Этим было доказано, что среди культивируемых клеток есть остеогенные клетки-предшественники. Одновременно было установлено, что под капсулой почки костеобразование не наблюдалось при отсутствии каркаса, создающего для клеток определенную пространственную ориентацию и натяжение /Чайлахян Р.К. и др., I97B ; Лациник Н.В. и др., I960 ; Фреденштейн А.Я. и др., 1931; yridenabtela A.I*, et al. , 1982/.

С учетом этого, некоторыми авторами были предприняты попытки использования культивированных стромальных клеток костного мозга в сочетании с каркасом - аллогенным губчатым деминерализованным костным трансплантатом (ДКТ) - для замещения костных дефектов. Однако не вполне адекватные н корректные методологические приемы, примененные авторами, не позволяют достоверно оценить полученные результаты, т.е. остеогенную активность самих пересаженных в костный дефект клеток (применение ДКТ, который сам является мощным индуктором остеогенеза, неадекватность экспериментальной модели,

отсутствие данных о характере костных дефектов и конечных результатах лечения больных).

В этой связи вполне обоснованными представляются поиски биологически инертных материалов, не обладающих антигенными свойствами и не содержащих индукторов остеогенеза, в качестве матрицы (каркаса) для культивированных стромальных клеток костного мозга.

В этом смысле обращают на себя внимание углеродные материалы и, особенно, волокнистые углеродные материалы отечественного производства, к числу которых принадлежит "Урал-JIM", успешно примененный в ЦИТО для пластики сухожилия в эксперименте /Лебедев B.C. и др., 1968 ; Павлова М.Н. и др., 1991; Лебедев B.C., 1991/. Однако влияние этого материала на регенерацию костной ткани не изучено, также как и возможность использования культивированных стромальных клеток костного мозга в сочетании с этим углеродным материалом для замещения костных дефектов, что и определяет актуальность предпринятого исследования.

Цедь и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение остеогенной активности комбинированных трансплантатов, состоящих из культивированных стромальных клеток костного мозга и углеродного материала "Урал-JIM", в костном дефекте в эксперименте на кроликах.

Для осуществления этой цели в работе были поставлены следующие задачи.

I. В связи с противоречивыми литературными данными о регенерации дефектов черепа у кроликов при сохранении целостности твердой мозговой оболочки, отработать экспериментальную модель, для чаго изучить самостоятельную регенера-

- 3 -

цию дефектов черепа у кроликов.

2. Исследовать влияние углеродного материала "Урал-ЛМ" на регенерацию дефектов черепа у кроликов.

3. Изучить влияние углеродного материала "Урал-ЛМ" на жизнедеятельность стромальных клеток костного мозга в условиях монослойных культур.

4. Изучить регенерацию дефектов черепа у кроликов при аутотрансплантации культивированных стромальных клеток костного мозга в сочетании с углеродным материалом "Урал-ЛМ".

Научная новизна работы

1. Впервые изучена эффективность аутотрансплантации в костный дефект культивированных стромальных клеток костного мозга в сочетании с углеродным волокнистым материалом "Урал-ЛМ" и показано отсутствие остеогенной активности у таких комбинированных трансплантатов.

2. Впервые изучено влияние углеродного материала "Урал-ЛМ" на репаративный осгеогенеэ и установлено, что при имплантации углерода данной марки в дефекты черепа у кроликов создаются условия, тормозящие регенерацию костной ткани.

Научно-практическая ценность работы

- Научная ценность проведенного исследования определяется вкладом, который вносит данная работа в разработку проблемы пределов и возможностей развития костной ткани при аутотрансплантации культивированных стромальных клеток костного мозга в костный дефект я клинике и эксперименте.

- В исследовании даны характеристики углеродного материала "Урал-ЛМ" как' пластического материала для имплантации с цельп замещения костных дефектов, а также охарактеризованы его биологические свойства (биологическая совместимость

со стромальными клетками костного мозга, влияние на репара-тивны£1 остеогенез), что весьма важно, учитывая возрастающий интерес исследователей к использованию углеродных материалов в проблеме заместительной хирургии кости.

Основные выводы работы и вытекающие из нее положения имеют значение как для экспериментальной травматологии и ор- ' топедии, так и для практического здравоохранения, поскольку вносят определенный вклад в разработку проблемы поисков новых способов эффективного замещения дефектов костей.

- Установлено отсутствие остеогенной активности у комбинированных трансплантатов, состоящих из аутологичных культивированных стромальных клеток костного мозга и углеродного волокнистого материала "Урал-ЛМ" в костном дефекте, в связи с чем такие трансплантаты не могут быть рекомендованы к использованию в клинических условиях с целью замещения костных дефектов костной тканью.

- Предложены возможные пути методологических подходов для создания условий, способствующих остеогенной активности стромальных клеток костного козга при их трансплантации в костный дефект.

- В связи с полученными данными о самостоятельной регенерации дефектов черепа у кроликов при сохранении целостности твердой мозговой оболочки, рекомендован осторожный подход к этой модели эксперимента при изучении влияния различных факторов на репаоативный остеогенез и/или роли этих факторов в замещении костных дефектов костной тканью.

Конкретные результаты проведенных исследований могут быть использованы:

- при выборе модели в экспериментальной травматологии и ортопедии ;

- .при поиска путей использования культивированных стро-1 мальных клеток костного мозга для замещения костных дефектов костной тканью;

- при преподавании курса ортопедии и ортопедической реабилитации студентам медицинских ВУЗов и курсантам ЦИУ врачей.

Положения, выносимые на защиту

1. Комбинированные трансплантаты, состоящие из аутоло-гичных культивированных стромальных клеток костного мозга и углеродного материала "Урал-ЛМ", в дефектах черепа кроликов не обладают остеогенной активность» .

2. При изучении роли собственно культивированных стромальных клеток костного мозга в процессе костеобразования в костном дефекте отсутствие остеогенеза является достаточным доказательством неэффективности пересаженных клеток. В то ие время, в случае образования костной ткани в костном дефекте после трансплантации культивированных стромальных клеток костного мозга для доказательства того, что пересаженные клетки являются источником костеобразования, необходимы разработка и применение адекватных методов клеточной маркировки.

3. Углеродный материал "Урал-ЛМ" при имплантации в дефекты черепа кроликов существенно задерживает репаративную регенерацию костной"ткани.

Апробация работы. По тема диссертации опубликованы три научные работы.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы (219 наименований, из них 103 на иностранных языках), иллюстрирована 54 рисунками. Всего 142 страниц машинописного текста.

- 6 -

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ j

Материалы и методы исследования

Исследования la vive проведены на 61 половозрелом кролике массой 2,5-3,5 кг, которым под наркозом с помощью цилиндрической электрофрезы наносились дефекты черепа диамет- : ром 12 мм в теменных областях с обеих сторон от сагиттально-' го шва. Методика опеоации предусматривала полное сохранение j целостности твердой мозговой оболочки.

В качестве имплантационного материала использовался углеродный волокнистый материал "Урал-ЛМ", содержащий не менее 99,0? углерода, с толщиной моноволокна В мк /Лебедев B.C., ! 1991/.

В соответствии с поставленными в данной работе задачами было проведено 3 серии экспериментовî

1-43 дефекта черепа ничем не заполнялись i

2-45 дефектов заполнялись углеродным материалом "Урал-ЛМ" {

3-34 дефекта заполнялись углеродным материалом "Урал-ЛМ" в сочетании с культивированными стромальными клетками костного мозга.

Животные I и 2 серии в большинстве случаев подвергались перекрестным экспериментам.

В работе использовано I? культуральных штаммов стромаль-ных клеток костного мозга, полученных в монослойных культурах из костного мозга тазовой кости 17 кроликов.

У животных I серии операционные раны после формирования дефектов черепа ушивали наглухо.

Животным 2 серии в дефекты черепа имплантировали углеродный материал "Урал-ЛМ", изготовленный в форме порошка или

мелко нарезанных углеродных волокон воЯлокообразной консистенции, стерилизованный за сутки до операции в сухожаровом шкафе при температуре 180°С в течение 2 ч.

Углеродный порошок получали из углеродной ткани "Урал-ЛМ" путем измельчения в шаровой мельнице, затем в количестве 1015 кг имплантировали в дефекты черепа кроликов на твердую мозговую оболочку. У II кроликов (12 дефектов) область дефекта черепа прикрывали углеродным диском из ткани "Урал-ЛМ" диаметром 15-16 мм, так что ткань сверху перекрывала края костной раны. У 5 кроликов (5 дефектов) область дефекта черепа, заполненного углеродным порозком, ничем не прикрывали.

Из углеродной ткани "Урал-ЛМ" путем ее разволокнения получали углеродные нити, которые нарезали на углеродные волокна различной толщины, длиной 2-3 мы (так называемая углеродная "кройка"). 28 дефектов черепа у 22 кроликов рыхло заполняли углеродной "крошкой" в количестве 10-15 иг, помещая ее на твердую мозговую оболочку. Область дефекта черепа прикрывали диском из углеродной ткани диаметром 15-16 мы.

У животных 3 сери» из газовой кости получали треугольной формы биоптат с основанием и высотой 0,8-1 см. Операционную рану послойно ушивали кетгутовыми швами.

Полученный биоптат помещали в стерильную чайку Петри и немедленно доставляли в стерильный бокс, где не позднее, чем через 15-20 мин после взятия биоптата, из него готовили клеточную суспензию и производили эксплантацию костномозговых клеток в культуральныв сосуды.

Для этого в стерильных условиях суспензию стромальных клеток костного мозга фильтровали через 4-слойныЙ капроновый фильтр для удаления оставшихся стромальных агрегатов. Костномозговые клетки осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в

течение 10 мин и ресуспензировали в культуральной среде,после чего производили подсчет ядерных клеток костного мозга в камере Горяева.

Культивирование стромальных клеток костного мозга производили по методике, разработанной в лаборатории иммуномореологии НИИЭМ им. Г.Ф. Гамалеи /Фриденштейн А.Я. и др., 1970; Фриденштейн А.Я., 1988/.

Клетки костного мозга эксплантировали в отечественные культуральные флаконы объемом 250 мл с плотностью ядерных

п

клеток 1-1,5x10 на флакон и помещали в термостат при температуре 37°С. Как правило, костны;! мозг, полученный от одного кролика, засевали в 2-3 культуральных флакона.

На 12-14-й день в первичной культуре клеток костного мозга наблюдалось образование монослоя фибробластоподобных клеток, после чего клетки последовательно пассировали до 1У пассажа в культуральные флаконы вдвое большей емкости, так что к 1У пассажу культивирование клеток осуществлялось во флаконах емкостью I л. Таким образом получали массу фибробластоподобных клеток 1У пассажа в 2-4 однолитровых культуральных флаконах в среднем за 5-6 нед.

Перед трансплантацией клетки 1У пассажа снимали с I л культурального флакона с помощью 0»25/4 раствора трипсина и готовили клеточную взвесь. Действие трипсина приостанавливали добавлением эмбриональной телячьей сыворотки. Подсчитывали количество полученных клеток в камере Горяева. Культивированные клетки осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливали. Полученную

Q

клеточную массу (с 1-2 однолитровых флаконов порядка 10 клеток» равномерно перемегарали с 10-15 мг углеродного порошка.

- 9 - :

Комбинированный трансплантат, состоящий из стромальных клеток костного мозга и углеродного порошка, имеющий слизепо-добную консистенцию, помещали на углеродный диск из ткани "Урал-ЛМ" и производили аутотрансплантацию в дефект черепа кролика (в II дефектов у 8 кроликов), при этом смесь клеток с углеродным порошком оказывалась на твердой мозговой оболочке, а углеродный диск располагался поверх трансплантата, перекрывая края костной раны.

В другой группе опытов полученную клеточную массу (порядка клеток) равномерно перемешивали с 10-15 мг углеродной "крошки". Комбинированный трансплантат, состоящий из стромальных клеток костного мозга и углеродной "крошки",также помещали на углеродный диск из ткани "Урал-ЛМ" и производили аутотрансплантацию в дефект черепа кролика (в 23 дефекта у 14 кроликов) так, чтобы смесь клеток с углеродной "крошкой" оказывалась на твердой мозговой оболочке, а углеродный диск располагался сверху, перекрывая края костной раны.

Эвтаназию кроликов всех серий производили через I, 3 и б мес после операции. Оценивали состояние мягких тканей свода черепа в оперированной области. Кости свода черепа выделяли и подвергали макроскопическому исследовании. Производили рентгенографии костей черепа с помощью аппарата ЕШ750 В при режиме 40 кВТ с экспозицией 0,02 с. Изъятые кости свода черепа фиксировали в 10$ растворе формалина и подвергали деминерализации в растворе азотной кислоты, после чего во фронталь- . ной плоскости вырезали среднюю часть области дефекта шириной ' 4-5 мм с обязательным захватом неповрежденной во время операции костной ткани. После обычной гистологической обработки образцов в спиртах возрастающей плотности осуществляли заливку тканевых блоков в целлоидин.

Целлоидиновые срезы толщиной 7-10 мк, произведенные во фронтальной плоскости, окрашивали гематоксилином и эозином и по Ван-Гиэону.

Биологическую совместимость имплантируемого углерода со стромальными клетками костного мозга изучали в опытах In Yitro путем их совместного культивирования по методике, разработанной в лаборатории генетики ЦИТО (зав. лабораторией - проф. Е.М. Меерсон) ст. науч. сотр. В.К. Ильиной и ст. науч. сотр. Ф.С. Барер.

С этой целью были использованы культуральные штаммы стромальных клеток костного мозга 1У-У пассажей, полученные от грех кроликов.

Было проведено 3 серии опытов In vitro ;

1 - культивирование стромальных клеток костного мозга на покровном стекле (контрольная серия);

2 - культивирование стромальных клеток костного мозга на подложке из тканного углеродного материала "Урал-ЛЫ";

3 - культивирование стромальных клеток костного мозга на подложке из углеродной "крошки*,

Исследуемые образцы углеродного материала фиксировались к покровным стеклам и помещались на дао культуральных флако- , нов, содержащих питательную среду.

Посевная концентрация клеток составляла 1x10 на один флакон.

Результаты оценивали после образования плотного монослоя клеток на покровном стекле в контроле (на 4-е сутки субкультиэирования) с использованием световой и сканирующей электронной микроскопии. .

Световая микроскопия препаратов производилась по общепринятой методике после фиксации и окрашивания по Май-Грюн-

вальду и Гимзе. Для сканирующей электронной микроскопии отобранные образцы фиксировали в 2,5? растворе глютаральдегида на фосфатном буфере (рН 7,2-7,4) с последующим обезвоживанием в спирте. Обезвоженные образцы напыляли медью и исследовали в сканирующем электронном микросхопе GSM-I5 при ускоряющем напряжении 15 кВ.

Результаты исследования и их обсувдение

Дефекты теменной костя у кроликов самостоятельно полностью замещались костной тканью с восстановлением анатомической целостности свода черепа, что подтверждалось при макроскопическом, рентгенологическом я гистологическом исследованиях. Новообразованная кость к 3 мес после операции имела преимущественно губчатое, а к 6 вес - пластинчатое строение. Регенерация костной ткани вдет равномерно как с краев дефекта, так и в центральной части последнего в тесной связи с твердой мозговой оболочкой, что подтверждает известное положение об остеогенной активности твердой мозговой оболочки у кроликов, выполняющей роль надкостницы у этих животных /Канторова В.И., 1972, 1975, 1982, 1989/.

Полученные нами данные полностью подтверждают результаты исследований, свидетельствующих о полноценной самостоятельной . регенерации теменных костей у кроликов при сохранении целостности твердой мозговой оболочки /Баракина Н.5. и др., 1952; Брудастов Н.Й., 1954; Полежаев Л.В. и др., 1956, 1957, 1977, 1962; Slrole К, , 1960/.

Данные,полученные нами при изучении биологической совместимости углеродного материала "Урал-ЛМ" со стромальными клетками костного, мозга в опытах in ritre , показали, что на подложках из рыхло расположенных диспергированных угольных воло-

кон стромальные клетки костного мозга хорошо пролиферировалк, тесно соприкасались с углеродными волокнами или плотно охватывали их длинными отростками. Большинство клеток располагалось непосредственно на углеродных волокнах.

Проведенные исследования указывают на то, что углеродный материал "Урал-ЦТ не оказывает токсического влияния на стромальные клетки костного мозга при культивировании in vitre и не препятствует пролиферации культивируемых клеток. В связи с этим можно полагать, что рыхло расположенные диспергированные углеродные волокна могли бы слуиить матрицей для культивированных стромальных клеток костного мозга при их трансплантации в костный дефект.

При изучении влияния углеродного материала "Урал-ЛМ", приготовленного в форме псГролка, на регенерацию дефектов черепа кроликов через 6 мес после операции макроскопически выявлялась значительная импрегнация мягких тканей всего свода черепа углеродными частичками. Область дефекта была заполнена плотной тканью, преимущественно имеющей костную консистенцию и включающей углеродные частицы, что особенно отчетливо определялось при осмотре со стороны полости черепа.

Рентгенологически к этому сроку края костной раны были неровными, размытыми, в некоторых участках определялись с трудом. В центральной части дефекта были видны плотные кего-могенные тени с небольшими участками обызвествления.

Микроскопически область дефекта была заполнена новообразованной костной тканью преимущественно пластинчатого строения с включениями нескольких мелких углеродных конгломератов, некоторые из которых лежали на твердой мозговой оболочке: в этом месте новообразованная костная ткань отсутствовала» Тон-

кий слой углеродных частиц лежал на поверхности новообразованной костной ткани.

Можно полагать, что при имплантации в дефекты черепа углеродного порошка, большая часть мельчайших углеродных частиц мигрирует из области дефекта, тогда как в ■оставшейся свободной области при этом создаются условия для самостоятельной регенерации костной ткани.

У другой группы животных 2-й серии порошок из углеродного материала "Урал-ЛМ" прикрывали диском из этой же ткани;пря этом углеродные частички мигрировали из области дефекта в гораздо меньшей степени, чем у предыдущей группы кроликов и, слипаясь, образовывали крупные плотные конгломераты, заполнявшие большую часть дефекта.

Микроскопически через I мес после операции в местах, где углеродные конгломераты неплотно прилежат к поверхности твердой мозговой оболочки,со стороны последней, особенно по крав костной раны, выявлялись отдельные очаги костеобразования, размеры которых зависели от величины промежутков между углеродными конгломератами и твердой мозговой оболочкой. Участки дефекта, свободные от углеродных конгломератов и не связанные с твердой мозговой оболочкой, были заняты клеточно-во-локнистой тканью, бедной клеточными элементами.

К 3-м и б-и месяцам после операции существенных изменений в ране не наступало, В области дефекта также, как-и в одномесячний срок, выявлялись плотные углеродные конгломераты из слипшихся частичек углеродного пороика. Свободнне промежутки между ними были заполнены небольшими костными разрастаниями, прилегающими к твердой мозговой оболочке. На больших участках костных дефектов, где углеродные скопления

- 14 -

плотно прилегали к твердой мозговой оболочке, очаги костной ткани отсутствовали. В отдельных дефектах наблюдались большие краевые костные разрастания, расположенные на поверхности твердой мозговой оболочки, под углеродными конгломератами.

Рентгенологически и макроскопически выявлялась незначительная костная регенерация.

Полученные результаты свидетельствовали о том, что при создании условий, препятствующих миграции углеродных частиц из области дефекта, эти мелкие частички слипаются в крупные плотные углеродные конгломераты. В небольших промежутках между конгломератами, а также между ними и твердой мозговой оболочкой, со стороны последней образуются очаги костной ткани. Таким образом, углеродный порошок из ткани "Урал-ЛИ" не препятствовал дифференцировке остеогенных клеток твердой мозговой оболочки, но выполняя интерпонирующую роль, этим препятствовал формированию костной ткани.

При имплантации в дефекты черапа кроликов мелко нарезанных углеродных волокон, полученных иэ' ткани "Урал-ЛМ"(так называемой углеродной "крошки"), макроскопически на всех сроках воспалительные явления в мягких тканях свода черепа отсутствовали. Гистологически через I нес после операции костная рана была заполнена широким слоем клеточно-волокнистой ткани, состоящей из многочисленных клеток фибробластическо-го ряда, ыелкоклеточных элементов и рыхло расположенных в ; этой ткани углеродных волокон. Регенерация костной ткани наблюдалась только по краю дефекта. Твердая мозговая оболочка была несколько утолщена, но элементов костеобраэова-ния как на поверхности, так и в толще ее не установлено.

К 3-м и б-и месяцам после операции клеточно-волокнис-тая ткань становилась более плотной за счет увеличения во-

локнистых элементов и приобретала характер рубца. Также многочисленны были фибробласты. Регенерация кости по краям не прогрессировала, формировалась костная эамнкательная пластинка. Рентгенологически к этому сроку края раны оставались четкими с незначительным краевым регенератом.

Таким образом, углеродная "крошка" из углеродного материала "Урал-ЛМ" при имплантации в дефекты черепа кроликов существенно задерживала регенерацию костной ткани, создавая, по всей видимости, условия, препятствующие новообразованию костной ткани из остеогенных клеток твердой мозговой оболочки и одновременно способствуя пролиферации фибробластов с развитием широкого слоя рубцовой ткани. Тем самым было показано, что данный вариант заполнения дефектов черепа у кроликов углеродным материалом "Урал-ЛМ" создает условия для изучения остеогенной активности собственно пересаженных культивированных стромальных клеток костного мозга и поэтому приемлем в качестве экспериментальной модели для выяснения этого вопроса.

При заполнении дефектов черепа комбинированными трансплантатами, состоящими из углеродного материала "Урал-ЛМ" в виде "крошки" (каркас) и аутологичных культивированных стромальных клеток костного мозга, через I мес после операции область дефекта была заполнена клеточно-волокнистой тканью, богатой клеточными элементами фибробластического ряда и включающей рыхло расположенные мелкие углеродные волокна. Незначительный краевой костный регенерат лежал на поверхности твердой мозговой оболочки. Очаги новообразованной костной ткани в центральной части дефекта не выявлялись. К 3-м и б-и месяцам после операции область дефекта была заполнена широким слоем рубцовой ткани. Регенерация кости не нарастала. Рентгенологически к этому сроку края костного дефекта были четкими,

с единичными неровностями по окружности. В центральной части дефекта костный регенерат не прослеживался.

При имплантации в дефекты черепа кроликов комбинированных трансплантатов, состоящих из углеродного порошка, ткани "Урал-ЛМ" и аутологичных культивированных стромальных клеток костного мозга, макроскопическая, рентгенологическая и гистологическая картины ничем не отличались от группы животных,которым имплантировали углеродный порошок и ткань без культивированных клеток. . ;

Таким образом, при аутотрансплантации в дефекты черепа, кроликов культивированных стромальных клеток костного мозга в сочетании с углеродным материалом "Урал-ЛМ" установлено отсутствие как ускорения краевой костной регенерации, так и новообразования костной ткани в центральной части дефекта. Процесс регенерации дефекта черепа, в целом, ничем не отличался от таковой у группы животных, которым имплантировали углеродный материал без клеток.

Причины неэффективности аутотрансплантации культивированных стромальных клеток костного мозга в сочетании с углеродным материалом "Урал-ЛМ" в костный дефект могли бы быть ; представлены следующим образом. -

Можно полагать, что большая часть пересаженных в дефекты черепа кроликов клеток погибает, что подтверждает данные других авторов /Саргсян A.A., 1990/. Гибель клеток может быть обусловлена как неадекватностью кровообращения и недостаточностью питания за счет диффузии, так и явлениями асептического воспаления, которые всегда имеет место в послеоперационной ране и могут оказать губительное влияние на чувствительные к окружающей среде культивированные клетки костного мозга.

- 17 -

Гибель большинства культивированных стромальных клеток костного мозга, безусловно, приводит к снижению их концентрации, которая становится намного ниже критической, при которой костеобразование из этих клеток без воздействия индуктора ос-теогенеза невозможно /Ориденштейн А.Я. и др., 1970 ; Фриден-штейн А.Л., Ладынина Н.С., 1973; Фреденштейн А.Я., Лурия Е.А., I960/.

С другой сторона, послеоперационные раны с первых же суток подвержены агрессии фибробластов соединительной ткани /Серов В.В., Шехтер A.B., 1991/.

Флбробласты, активно мигрируя в костную рану, заполненную углеродной "кропкой", обладающей способностью адсорбировать на своей поверхности питательные вещества, по всей видимости, находят благоприятную среду для своей жизнедеятельности и интенсивной пролиферации. В подтверждение приведенного соображения в настоящем исследовании было установлено, что при имплантации углеродной "крошки" (даже без культивированных стромальных клеток костного мозга) дефекты черепа заполняют- . ся соединительной тканью, очень богатой клеточными элементами, преимущественно фибробластами.

С другой стороны, культивированные стромальные клетки костного мозга при трансплантации в костный дефект перед началом пролиферации проходят так называемый "шоковый" период, который при культивировании ia vitro составляет 28 ч /Фриден-штейн А.Я., Лурия Е.А., 1930/, a la vivo , не исключено, и более.

В то же время, фибробласты соединительной ткани активно пролифериругат, заполняют костную рану и, безусловно, создают свою микросреду, которая, вероятно, препятствует остеогенной диф[«ренцировке оставиихся в отвых культивированных стромальных клеток костного мозга.

- 18 -

Следовательно, можно полагать, что отсутствие образования костной ткани из пересаженных в костный дефект аутологич-ных культивированных стромальных клеток костного мозга связано как с гибелью большинства из них, и в связи с этим уменьшением их концентрации, которая становится намного меньше критической, так и с отсутствием необходимых условий для остео-генной дифференцировки оставшихся в живых трансплантированных клеток.

С учетом полученных в настоящем исследовании данных и теоретических предпосылок, представляются перспективными дальнейшие поиски оптимальных условий для жизнедеятельности культивированных стромальных клеток костного мозга, которые бы способствовали пролиферации и остеогенной дифференцировке этих клеток в костной ране. г

Следует отметить, что при изучении роли собственно культивированных стромальных клеток костного мозга в процессе кос-теобразования в костном дефекте отсутствие остеогенеза является достаточным доказательством неэффективности пересаженных клеток. В то же время, в случае образования костной ткани в костном дефекте после трансплантации культивированных стромальных клеток костного мозга для доказательства того, что пересаженные клетки являются источником костеобразования, необходимы разработка и применение адекватных методов клеточной маркировки.

ВЫВОДЫ

1. Углеродный материал "Урал-ЛЫ" не оказывает токсического влияния на стромальные клетки костного мозга и не препятствует их пролиферации в условиях монослойной культуры.

2. Углеродный материал "Урал-ЛМ", вне зависимости от формы его приготовления, при имплантации в дефекты черепа кроликов

- 19 -

задерживает регенерацию костной ткани,

3. Углеродный материал "Урал-ЛЫ", приготовленный в форме войлока, состоящего из рыхло расположенных мелко нарезанных углеродных волокон, при имплантации в дефекты черепа кроликов способствует интенсивной пролиферации соединительнотканных фибробластов с развитием широкого слоя рубцовой ткани.

4. Аутотрансплантация культивированных стромальных клеток костного мозга в сочетании с биологически инертным углеродным материалом "Урал-ЛМ" в дефекты черепа кроликов- не приводит к образовании костной ткани из пересаженных клеток или к ускорение костной регенерации, в связи с чем комбинированные трансплантаты в таком варианте не целесообразно использовать для замещения костных дефектов в клинике.

5. Большие дефекты черепа, диаметром 12 мм, при сохранении целостности твердой мозговой оболочки у кроликов полностью замещаются новообразованной костной тканью в основном за счет остеогенеза со стороны твердой мозговой оболочки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТВД ДИССЕРТАЦИИ

1. Регенерация костной ткани при замещении дефектов черепа углеродным материалом "Урал" в эксперименте //Материалы □колы "Биология опорно-двигательного аппарата". - Харьков, 1992. - С. 98-98 (в соавт. с М.Н. Павловой, В.К. Ильиной).

2. Особенности регенерации костной ткани при заполнении дефекта углеродным материалом "Урал-ЛМ" (экспериментальное исследование) //Эцдопротезирование в травматологии и ортопедии. - М., 1993. - С.///~//<$(8 соавт. с М.Н. Павловой).

- 20 -

3. О возможности использования углеродного волокнистого материала "Урал-ЛМ" в качестве матрицы для культивированных стромальных клеток костного мозга при замещении дефектов кости (экспериментальное исследование //Там же. - С. "/¿М (в соавт. с В.К. Ильиной, Ф.С. Барер).

Подписано в печать (/, О / 199Зг.

МАЛОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «ПЕТИТ»

Зак. *(% Тир. Щ