Автореферат и диссертация по медицине (14.01.14) на тему:Применение комбинированного клеточного трансплантата на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани у пациентов с дефицитом костной ткани (клинико-экспериментальное исследов

На правах рукописи

Алексеева Ирина Сергеевна

Применение комбинированного клеточного трансплантата на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани у пациентов с дефицитом костной ткани (клинико-экспериментальное

исследование)

14.01.14 - стоматология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

1 О ЯНВ 2013

Москва-2013

005048368

Работа выполнена в ФГБУ «Центральный научно-исследовательский институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Научные консультанты:

Член-корр. РАМН, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Кулаков Анатолий Алексеевич

Доктор биологических наук, профессор Гольдштейн Дмитрий Вадимович Официальные оппоненты:

Ярыгин Константин Никитич член-корр. РАМН, д.м.н, профессор, заведующий лабораторией клеточной биологии НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН и лабораторией клеточных технологий и тканевой инженерии НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН

Панин Андрей Михайлович д.м.н., профессор, заведующий кафедрой факультетской хирургической стоматологии и имплантологии ГОУ ВПО «МГМСУ им.А.И.Евдокимова» Минздрава России

Шехтер Анатолий Борисович д.м.н., профессор, заведующий лабораторией экспериментальной морфологии научно-исследовательского центра ГОУ ВПО «Первый МГМУ им. Сеченова» Минздрава России Ведущая организация:

ФГОУ ДПО «Институт повышения квалификации Федерального медико-биологического агентства России»

Защита состоится « 20 » февраля 2013 г. в 13.00 часов на заседании диссертационного совета ЦНИИС и ЧЛХ ул.Тимура Фрунзе, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Центральный научно-исследовательский институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии» Минздрава России (ул. Тимура Фрунзе д. 16)

Автореферат разослан «_»_2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ» Минздрава России

к.м.н.

И.Е.Гусева

Список сокращений

ММСК - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки

ЖТ - жировая ткань

ТИК - тканеинженерная конструкция

КТ - компьютерная томография

СВФ - стромально-васкулярная фракция

РКР - обогащенная тромбоцитарная масса

МПа - мегапаскаль

ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Особенностью челюстной костной ткани является то, что при перераспределении или утрате функциональной нагрузки в ней быстро начинаются процессы резорбции. Удаление зубов приводит к атрофии костной ткани альвеолярного отростка, которая происходит не только в зоне удалённого зуба, но и затрагивает окружающую костную ткань вокруг неё.

Актуальной задачей хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии является восстановление утраченного объёма костной ткани с помощью биологических пластических материалов. «Золотым стандартом» при проведении реконструктивных операций в черепно-челюстно-лицевой области считаются аутогенные костные трансплантаты мембранозного происхождения. Однако трудности получения значительного количества аутоматериала и необходимость дополнительного операционного вмешательства существенно ограничивают их применение. В связи с тем, что использование костных материалов или их заменителей не всегда приводит к ожидаемому результату, продолжаются исследования по поиску материала, способного стать альтернативой костным аутотрансплантатам.

За последнее десятилетие значительное развитие получило изучение механизмов регенерации различных органов и тканей с использованием клеточных технологий, возросло количество исследований по использованию стволовых клеток в лечении пациентов. Признано, что клеточная терапия имеет огромный потенциал и может применяться в регенеративной медицине, в частности, для устранения дефектов костной ткани (da Silva Meirelles L, Caplan AI, Nardi NB. 2008; Lee J, Sung HM, Jang JD, Park YW, Min SK, Kim EC. 2010). В стоматологии применение стволовых клеток и тканевой инженерии представляет огромный интерес, так как может обеспечить инновационный подход для создания материала, который может быть использован не только для воссоздания утраченных тканей, но и для стимуляции регенерации кости. Восстановление костной ткани с помощью

клеточных технологий проводится путем трансплантации тканеинженерных конструкций - живых эквивалентов костной ткани (Pittenger MF. 2008).

Основой или каркасом тканеинженерной конструкции должен быть биоматериал с заданными и прогнозируемыми свойствами. Оптимизация выживаемости, пролиферации и дифференцировки ММСК после трансплантации достигается иммобилизацией клеточного трансплантата на матриксе. Матрикс должен обладать следующими свойствами: поддерживать заданную трехмерную структуру конструкцию, быть биосовместимым и биорезорбируемым (Liu X, Smith LA, Hu J, Ma PX 2009).

Трансплантируемые клетки, обеспечивающие непосредственное восстановление костной ткани de novo, представляют собой культуру остеогенных клеток-предшественников, которые могут быть получены путем направленной дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга, жировой ткани или других источников, таких, как надкостница, селезенка, тимус, плацента и др. (Sudo К, Kanno M, Miharada К 2007; Panetta NJ, Gupta DM, Quarto N, Longaker MT. 2009; El Tamer MK, Reis RL. 2009; Mizuno H. 2009; Augello Andrea, Cosimo De Bari. 2010; Charbord P. 2010).

Одним из перспективных источников ММСК является жировая ткань (ЖТ). Исследования иммуннофенотипа ММСК из жировой ткани и красного костного мозга показали, что они практически идентичны друг другу (Mizuno H. 2009; Rada Т, Reis RL, Gomes ME. 2011). К моменту начала нашего исследования в 2006 году в научной литературе были представлены немногочисленные клинические примеры применения ТИК для восстановления костной ткани. Источником ММСК был, как правило, красный костный мозг и изредка надкостница. Использование жировой ткани в качестве источника ММСК для восстановления костной ткани считалось перспективным, но в клинических исследованиях не использовалась.

Разработка методов восстановления костных дефектов с помощью тканеинженерных конструкций на основе ММСК и резорбируемого матрикса

является наиболее перспективным решением сложной клинической задачи по стимуляции репаративного остеогенеза (da Silva Meirelles L, Caplan AI, Nardi NB. 2008).

Цель исследования: оценить клиническую эффективность и безопасность применения комбинированного клеточного трансплантата на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани для замещения костных дефектов у пациентов с выраженным дефицитом костной ткани в области верхней и нижней челюстей. Задачи исследования

1. Разработать протокол создания тканеинженерной конструкции на

основе ММСК: обосновать выбор источника ММСК (жировая ткань) и выбор материала для матрицы носителя.

2. Оценить безопасность и эффективность применения тканеинженерной

конструкции на основе ММСК ЖТ в экспериментальной модели на лабораторных животных.

3. Изучить особенности регенерации костной ткани при применении

тканеинженерной конструкции на основе ММСК ЖТ.

4. Разработать протокол клинико-лабораторного обследования пациентов

перед трансплантацией, ведения послеоперационнного периода.

5. Разработать хирургический протокол применения тканеинженерной

конструкции на основе ММСК в зависимости от локализации и объема дефекта.

6. Провести клиническое исследование по оценке безопасности и

эффективности применения тканеинженерной конструкции на основе ММСК ЖТ.

7. Определить оптимальные сроки проведения внутрикостной

имплантации после применения тканеинженерной конструкции на основе ММСКЖТ.

8. Провести сравнительный анализ динамики регенерации костной ткани

с использованием тканеинженерной конструкции на основе ММСК

ЖТ с контрольной группой пациентов, которым проводилось традиционное лечение с использованием деминерализованного ксеногенного костного материала. Научная новизна исследования:

Впервые разработан протокол создания трехкомпанентной тканеинженерной конструкции на основе ММСК жировой ткани для репаративного остеогенеза, который позволил сократить сроки изготовления ТИК ЖТ, а также максимально обеспечить сохранность и жизнедеятельность трансплантаруемых клеток.

Впервые разработана схема сборки тканеинженерной конструкции в условиях операционной.

Впервые доказана эффективность и безопасность применения комбинированного клеточного трансплантата на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани у пациентов с выраженным дефицитом костной ткани в области верхней и нижней челюстей.

Впервые в клиническом исследовании получена морфологическая характеристика костного регенерата, образовавшегося после трансплантации ТИК на основе ММСК ЖТ. Костный регенерат имеет признаки строения пластинчатой костной ткани.

Впервые проведена сравнительная морфологическая оценка особенностей костного регенерата после трансплантации ТИК ЖТ и «Bio-Oss» в области дна верхнечелюстной пазухи, а также динамики регенерации костной ткани после трансплантации ТИК ЖТ и имплантации «Bio-Oss». Выявлены принципиальные гистоморфологические различия у вновь образованной костной ткани.

Впервые установлено, что образование кости de novo после трансплантации ТИК ЖТ, происходило без признаков образования хрящевой ткани.

Впервые ТИК ЖТ использовалась для заполнения

постэкстракционных лунок зубов. Применение ТИК ЖТ в области лунок удаленных зубов позволило не только предотвратить резорбцию костной ткани, но и воссоздать её объём.

Впервые продемонстрировано, что трансплантация ТИК ЖТ в область дефекта позволяет получить объем костной ткани, который ограничивается объемом тканеинженерной конструкции.

Впервые проведена клинико-рентегенологическая оценка полученных результатов после трансплантации ТИК ЖТ в клинической практике Практическая значимость

В результате проведенного экспериментального и клинического исследования был разработан новый способ создания тканеинженерных конструкций для восстановления костной ткани, основанный на принципе свободного распределения клеток в фибриновом сгустке внутри матрицы-носителя.

Доказано, что использование тканеинженерной конструкции приводит к стимуляции репаративного остеогенеза и ускоряет восстановление костной ткани, позволяет сократить сроки лечения. Научные положения, выносимые на защиту

1. Жировая ткань является наиболее перспективным источником ММСК, которые могут быть преддифференцированны в остеогенном направлении для применения в клинической практике.

2. Трехкомпонентная тканеинженерная конструкция (ТИК) обеспечивает регенерацию костной ткани в области дна верхнечелюстной пазухи и постэкстракционных лунок. Применение обогощенной тромбоцитарной массы (РЯР) в ТИК как третьего компонента предотвращает вымывание клеток при трансплантации.

3. Использование ТИК ЖТ для восстановления дефектов костной ткани альвеолярных отростков приводит к восстановлению костной ткани и

стимуляции репаративного остеогенеза, и позволяет добиться органотипической регенерации костной ткани.

4. Качественные характеристики вновь образованной костной ткани после трансплантации ТИК ЖТ через 120 дней позволяют провести дентальную имплантацию. Внедрение результатов в практику.

Получено разрешения на применение новой медицинской технологии «Метод восстановления костной ткани альвеолярного отростка в области дна верхнечелюстной пазухи» ФС №2010/366 от 7 октября 2010 гг. Результаты исследования используются в практике в отделение клинической и экспериментальной имплантологии ЦНИИС и 4JTX; материалы исследования используются при подготовке врачей-стоматологов на кафедре гистологии и эмбриологии Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова. Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на Всероссийской и международной научной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (Москва2007); на международной конференции в Санкт-Питербурге "Высокие технологии. Инновации. Инвестиции" (Санкт-Питербург2007); на международной образовательной конференции Nobel Biocare (в рамках Nobel Biocare World Tour-2007) (Москва 2007); на научно-практической конференции стоматологов и челюстно-лицевых хирургов Центрального федерального округа Российской Федерации с международным участием «Технологии XXI века в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии» (Тверь 2008); на Всероссийском Конгрессе с международным участием «Стоматология XXI века» (Самара 2008); на научно-практической конференции "Современные технологии в стоматологии" X Ежегодный научный форум "Стоматология 2008" (Москва2008); на первой Международной конференции ЦНИИС и 4JIX, Bicon Institute и Harvard School of Dental Medicine (Москва2008); на

конференции по проблемам имплантологии, организованной Bicon Institute и TSDental group (Москва 2011).

Предзащитное обсуждение диссертационной работы состоялось на совместном заседании сотрудников отделения клинической и экспериментальной имплантологии, отдела ортопедиченской стоматологии и имплантологии, отдела амбулаторной хирургической стоматологии, отдела патоморфологии, отдела разработок высоких технологий в челюстно-лицевой хирургии, отделения рентгенологии, отделения пародонтологии ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ».

Личный вклад автора

Автор непосредственно участвовал в проведении всех экспериментальных и клинических исследованиях, сборе, обработке и анализе полученного экспериментального и клинического материала; написание статей, докладов.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 13 в журналах, рекомендованных перечнем ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура диссертации Материалы диссертации изложены на 216 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения и пяти глав: обзора литературы, материалов и методов исследования, результаты экспериментального исследования, результаты клинического исследования, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 341 источник, из которых 48 отечественных и 293 иностранных авторов. Работа содержит 15 таблиц и 87 рисунков.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Экспериментальное исследование. Задачами экспериментального исследования были: выбор материала-носителя для культуры клеток; изучение репаративного остеогенеза при использовании различных имплантационных материалов и ТИК ЖТ; обоснование выбора источника ММСК - жировой ткани, а также доказательство эффективности и безопасности использования ТИК ЖТ на основе ММСК для устранения костных дефектов.

В исследование было включено 17 животных (разнополые кролики массой более 4 кг и возрастом старше 2 лет), которые были распределены на 6 групп: 1 группа - контрольная (критические дефекты), 2 группа - дефекты закрывались PRP, 3 группа - дефекты закрывались BioOss + PRP, 4 группа -дефекты закрывались Биоматрикс + PRP, 5 группа - дефекты закрывались Остеоматрикс + PRP, дефекты закрывались ТИК+PRP (Табл. 1). Животным под общей анестезией с помощью трепана диаметром 10 мм проводили формирование критических дефектов в области теменных костей - по два отверствия в каждой теменной кости, отступя от сагиттального шва по 5 мм. Далее проводилось закрытие дефектов с помощью ТИК ЖТ, «Остеоматрикса» («Коннектбиофарм», Россия), «Биоматрикса» («Коннектбиофарм», Россия), «BioOss» («Geistlich», Швейцария), PRP. Животные выводились из эксперимента на 120 сутки.

Для выделения первичных культур ММСК использовали образцы жировой ткани из области шеи кроликов. Биоптаты доставляли в лабораторию в течение одного часа после операции в транспортном контейнере. Тканеинженерную конструкцию создавали путем объединения в трех компонентов: ММСК ЖТ, материала-носителя, обогащенную тромбоцитами плазму кроликов за 2 часа до трансплантации. Морфологическое исследование проводили на 120 сутки после имплантации остеоиндуктивных материалов и трансплантации ТИК ЖТ.

Таблица 1 Распределение животных по группам (количество животных/отверстий).

Группа Контроль РЯР ВюОвв +РЯР Биоматрикс +РЯР Остеоматрикс +РЯР ТИК +РЯР

Кол-во животных /кол-во отверстий 3(12) 3(12) 3(12) 3(12) 3(12) 2(8)

Обогащенная тромбоцитарную плазму получали стандартным методом. Культуру ММСК стромально-васкулярной фракции жировой ткани (СВФЖТ) получали следующим образом: жировую ткань многократно промывали раствором Хенкса, затем добавляли стерильный раствор коллагеназы I типа (250 Ед/мл) и инкубировали при 37°С в течение 2-3 часов. Изолированные клетки осаждали центрифугированием (1100 об/мин в течение 10 мин) и переносили в культуральную посуду с полной ростовой средой (БМЕМ/Р12 1:1с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки до 10%, Ь-глутамина (4 шМ) и амикацина (500 мг/Л)). Флаконы помещали в С02-инкубатор при стандартных условиях (37°С, 5% С02), через 24 часа проводили замену среды, удаляя при этом неприкрепленные клетки. В течение 1-1,5 недель культура ММСК достигала состояния субконфлюентного монослоя, после чего ее рассаживали в 5-7 раз. В работе использовали клетки 4-5 пассажа.

Остеогенная дифференцировка. Для направленной дифференцировки клетки рассаживали на 90 мм чашки Петри или 6-луночные планшеты и после достижения ими конфлюентного монослоя заменяли ростовую среду на дифференцировочную (ростовая среда с добавлением 1,25-дигидроксивитамина БЗ 10-8М, Ь-аскорбиновой кислоты 50 мг/Л, Р-глицерофосфата 10-2М). Для выявления очагов минерализации клетки дважды промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ), фиксировали

охлажденным 70% этанолом и окрашивали 40мМ ализариновым красным S (рН=4.1) в течение 5 мин. Несвязанный краситель отмывали ФСБ. Биомеханическое исследование. Поскольку одной из задач исследования было создание полноценной органотипической конструкции, замещающей костную ткань, было проведено исследование по способности ТИК ЖТ выдерживать те же физиологические механические нагрузки, что и витальная кость. Для исследования биомеханических характеристик материала и анализа динамики их изменений были выбраны три группы объектов. В исследовании были использованы разнополые кролики массой более 4 кг и возрастом старше 2 лет, в каждую группу исследования были включены по три животных. Группа «Влажный остеоматрикс» - материал «Остеоматрикс», вымоченный в физрастворе 1 сутки при температуре 37 С. Группа «Имплантированный остеоматрикс» - материал «Остеоматрикс» Группа «ТИК ЖТ» - тканеинженерная конструкция на основе материала «Остеоматрикс» и аутологичной фракции ММСК ЖТ, преддифференцированные в остеогенном направление. Исследуемые материалы вводились подкожно в область холки и спины животных на срок в 120 суток. В результате исследования были проанализированы по пятнадцать обьектов идентичных габаритов в каждой группе (каждому кролику подкожно вводились по 5 образцов исследуемого материала данной группы). Для исследования механических характеристик, полученной in vivo ткани использовался ряд механических:

1) Прочность при сжатии

2) Прочность при изгибе на Динстат

3) Показатель твердости (конической точки текучести Клиническое исследование. Трансплантация тканеинженерной конструкции рассматривалась как альтернатива аутотрансплантации костной ткани. Возраст пациентов, включенных в клиническое исследование от 29 до 60 лет. Срок наблюдения за пациентами после трансплантации ТИК составил от 1,5 до 5 лет. Всем пациентам планировалась стоматологическая реабилитация с

установкой дентальных имплантатов. Все пациенты были соматически здоровы. Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией (2000 гг.). Трансплантация ТИК ЖТ проводилась у 20 пациентов с выраженным дефицитом костной ткани в области дна верхнечелюстной пазухи, выраженной атрофией альвеолярного отростка нижней челюсти в области жевательных зубов. В исследование также были включены пациенты, которым проводилось удаление зубов в связи с подвижностью зубов 3-4 степени, разрушением коронковой части зуба и цемента корня, а также наличием прикорневых кист. После заполнения лунок ТИК в виде костной стружки во всех случаях рана ушивалась наглухо с помощью перемещенного полнослойного слизисто - надкостничного лоскута.

В группу сравнения пациентов, которым проводилось увеличение высоты альвеолярного отростка в области верхнечелюстной пазухи с помощью ТИК, были включены пациенты с аналогичной патологией, которым проводилось увеличение высоты альвеолярного отростка с наиболее часто используемым имплантационным материалом «Вю-Овв» - (80 пациентов). Возраст пациентов составил от 35 до 65 лет, женщин - 49, мужчин - 31. Срок наблюдений за пациентами составил 5 лет.

Образцы вновь образованной костной ткани, получали методом трепанобиопсии во всех группах.

Для определения степени атрофии альвеолярного отростка, расположения нижнечелюстного канала, состояния верхнечелюстных пазух, состояния пародонта зубов до начала лечения и после проводились рентгенологические исследования: компьютерная томография (КТ), ортопантомография. КТ- исследования проводилось до начала лечения и через 4, 12, 24, 60 месяцев после трансплантации ТИК, в группе сравнения («Вю-Овв») - 6,12, 60 месяцев после имплантации материала.

Таблица 2 Распределение пациентов но типу хирургического вмешательства.

Количество пациентов Мужчины Женщины

Синус-лифтинг с трансплантацией ТИК Односторонний 9 3 6

Двухсторонний 1 1

Синус-лифтинг с трансплантацией ТИК + в области лунок зубов Односторонний 1 1

Двухсторонний 2 1 1

Трансплантация ТИК в виде блоков на нижней челюсти Двухсторонний дефект 3 1 2

Трансплантация ТИК в области лунок зубов 4 4

Синус-лифтинг с ВшОвв Односторонний 46 19 27

Двухсторонний 34 11 23

Забор жировой ткани. Липоаспирацию проводили в пупочной области под местной инфильтрационной анестезией. Объем липоаспирата рассчитывался исходя из предполагаемого объема ТИК, а также с учетом объема, который подвергался криоконсервированию. В зависимости от этого объем липоагнспирата составлял от 20-60 мл.

Создание индивидуальных костных блоков для восполнения дефицита костной ткани на нижней челюсти. Для создания трехмерной компьютерной модели черепа человека проводили спиральную компьютерную томографию. Полученные данные в формате Б1СОМ обрабатывали с помощью программы для работы с медицинскими форматами Ыикак ЗЭ, в которой строилась трехмерная модель нижней челюсти. С помощью ЗБ реконструкции определялся объем дефицита костной ткани, и создавалась модель необходимого трансплантата. По

созданной трехмерной модели при помощи системы автоматизированного проектирования FreeCAD проектировался её прототип и изготавливалась стереолитографическая модель. Полученную модель трансплантата вырезали с помощью трехосной фрезеровальной машины Roland MODEL A MDX-15 («Roland», Япония). Фрезеровку осуществляли с помощью сверла диаметром 1 мм (скорость вращения 6000 об/мин, точность хода 0.1 мм, глубина прохода 0.5 мм). Данные параметры фрезеровки применялись для получения наиболее точной формы. В производстве индивидуального трансплантата использовался материал-носитель «Остеоматрикс» («Коннектбиофарм», Россия) в виде блока размером 3x2,5x12 см: обрабатывалась на 3D фрезеровальном станке. После фрезеровки образец упаковывали и стерилизовали гамма-излучением в 16 кГр. Внутренняя поверхность трасплантата полностью совпадала с рельефом альвеолярного отростка. Выделение стромально-васкулярной фракции жировой ткани (СВФ ЖТ) СВФ ЖТ выделяли из липоаспирата, полученного у пациентов, которым планировалось проведение лечения с помощью ТИК ЖТ. Липоаспират промывали раствором Версена и дезагрегировали путем инкубации в растворе Версена с добавлением 0,25% трипсина при 37°С в течение 1,5 часов. Клеточную суспензию центрифугировали 10 минут при 1100 об/мин, осадок разводили ростовой средой (DMEM/F12 1:1 с добавлением аутологичной сыворотки до 10%, амикацина до 500 мг/л), переносили в чашки Петри и инкубировали при стандартных культуральных условиях (37°С, 5% С02). Плотность посева составляла 1,5-2 тыс. клеток на см2. Спустя двое суток неприкрепившиеся клетки удаляли, заменяя ростовую среду на свежую. По достижении 80% конфлюентного монослоя клетки рассевали в новую культуральную посуду в плотности 1,5-2 тыс. клеток на см3. Ростовую среду меняли каждые 3 суток.

Анализ экспрессии специфических поверхностных маркеров в исследуемых культурах проводили с помощью проточного цитофлуориметра "FACS Calibur" ("BD Biosciences", США). Использовали мышиные

моноклональные антитела ("РИагМтдеп", "СИетюоп" США). В качестве отрицательного контроля использовали неспецифические мышиные (кроличьи) ^О тех же фирм. Результаты обрабатывали с помощью программы МБ1 2.8

Остеогенная дифференцировка. Для направленной остеогенной дифференцировки клетки рассаживали на 90 мм чашки Петри и по достижении 80% конфлюентного монослоя заменяли ростовую среду на дифференцировочную (БМЕМ с 10% аутологичной сыворотки крови, 100 мкг/мл амикацина, 50 мг/л Ь-аскорбиновой кислоты, 10 мМ/л Р-глицерофосфата натрия и 10 нМ 1,25-дигидроксивитамина 03). Замену среды на свежую производили каждые 3 суток.

Приготовление обогащенной тромбоцитами плазмы проводили по стандартной методике.

Микробиологический контроль проводился в Центре молекулярной диагностики ФБУН Центрального НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора: перед сборкой ТИК брали смыв с носителя и отправляли его вместе с образцом клеточной суспензии на бактериологическое исследование. Сборка тканеинженерной конструкции. После отмывания блоков или крошки «Остеоматрикса» с раствором Хэнкса («ПанЭко», Россия) с цефазолином («Синтез», Россия) (1г/Л) на них наслаивали смесь культуры клеток после остеогенной дифференцировки и обогащенной тромбоцитами плазмы, после чего по каплям добавляли раствор тромбина ("РХ Соппау", Польша) 50 Ед/мл на 10% растворе хлорида кальция («Дальхимфарм», Россия) до полимеризации. В зависимости от индивидуальных особенностей пациента полимеризация фибринового сгустка происходила в интервале от 2 до 5 минут.

Гистологические методы исследования (гнстоморфометрия) в клиническом исследовании. Биопсийный материал, полученный от пациентов во время дентальной имплантации, помещали в забуференный нейтральный 10% формалин («Вюорйса», Италия) и фиксировали 24 часа. Образцы для гистологического исследования представляли собой столбики

костной ткани 3 мм в диаметре и длинной от 8 до 10 мм Фиксированный материал промывали проточной водой в течение 24 часов. Затем проводили кислотную декальцинацию с использованием смеси соляной и муравьиной кислот («Biooptica», Италия) в течение 6 часов, после чего проводилась промывка образцов в фосфатном буфере (рН=7,4). Материал обезвоживали, заливали в парафин и делали серийные срезы. Для проведения гистоморфометрического исследования из серии срезов случайным образом с помощью программного обеспечения Random выбирали 6 стекол, содержащих 4 среза. 5 стекол окрашивали по Массону - Голднеру, 1 стекло гематоксилином по Мейеру с докраской эозином.

Для морфометрического анализа на стекле выбирали третий слева срез. Если его качество было недостаточно высоким, то выбирали следующий срез. С помощью описанного метода рандомизации достигалась максимально случайная выборка объекта исследования.

Гистоморфометрия в экспериментальном исследовании. В

экспериментальном исследовании теменные кости экспериментальных животных фиксировали в нейтральном 10% забуференном формалине в течении 7 дней, после чего образцы подвергались обычной гистологической проводке с использованием электролитической декальцинации в перенасыщенном растворе ЭДТА. Затем вырезали образцы ткани для гистологического исследования, проводили по нарастающей концентрации спиртов и апельсинового масла и заливали в парафин. Из заключенных в парафин блоков готовили серийные гистологические срезы (перпендикулярно поверхности теменной кости), из которых отбирали препараты из середины блока и окрашивали гематоксилинами по Бокку и Мейеру, а затем докрашивали эозином.

По микрофотографии среза определяли середину регенерата, делили регенерат на четыре равные доли (Рис. 1). Поскольку распространение фронта костного регенерата идет с края дефекта к центру, то методом разделения костного регенерата на краевые и центральные зоны ('/4 и 4/4

краевые зоны, а 2/4 и 3Л центральные зоны) можно независимо выявить процессы остеоиндукции и остеокондукции, вызываемые материалом.

Морфометрическое исследование проводили методом раздельного подсчета доли (процента) тканевых структур и имплантированного материала в регенерате с использованием freeware программного пакета анализа изображения ImageJ 1.41 («National Institutes of Health», США) при увеличении х12.

Рис 1. Краевые и центральные зоны регенерата.

В качестве элементов учета выбрали пластинчатую, ретикулофиброзную ткань, остеоид, рыхловолокнистую и плотную неоформленную (фиброзную) соединительную ткань. Доли тканевых компонентов регенерата получали как отношение площадей компонентов к общей площади костного дефекта, границы которого определяли по характерному опилу кортикальных пластин материнской кости, и представляли в процентном отношении.

Методика подсчета. Регенерационный процесс оценивали с помощью показателей, выбранных согласно рекомендации Международной ассоциации исследователей костной ткани (Parfitt AM, Drezner МК, Glorieux FH, Kanis JA, Malluche H, Meunier PJ, Ott SM, Recker RR 1987). Относительный объем тканевых компонентов регенерата вычисляли как отношение площади всего среза к площади отдельных компонентов костного регенерата.

Статистический анализ полученных данных производили с использованием программного продукта SigmaStat 3.5 (Systat Software Inc, США). Вычисляли групповое среднее арифметическое (М) и стандартную

ошибку среднего для долей (SEM). Нормальность распределения вариант определялась тестом Шапиро-Вилка. В случае, если распределение вариант соответствовало нормальному распределению, для установления межгрупповых различий применяли однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом Ньюмана-Кейлса и /-тест (для попарного сравнения данных контрольной и опытной групп). В случае, если распределение вариант в группе не соответствовало нормальному распределению, для межгрупповых сравнений применяли ранговый дисперсионный анализ Краскала-Уоллисса с последующим тестом Данна и теста Манна-Уитни (для попарного сравнения данных контрольной и опытной групп). Для всех сравнений был выбран 5% уровень значимости.

Результаты собственных исследований и их обсуждение Обоснованием выбора жировой ткани как источника ММСК для экспериментального и клинического исследования стали: малоинвазивность метода получения значительного объема ММСК; низкий уровень клеточного старения ММСК ЖТ при многократном культивировании; образование кости de novo в экспериментальном и клиническом исследовании после трансплантации ТИК ЖТ. Объем липоаспирата рассчитывался исходя из предполагаемого объема ТИК, а также с учетом объема, который подвергался криоконсервированию. В зависимости от этого объем липоаспирата (в клиническом исследовании) составлял от 20-60 мл.

Для изучения репаративного остеогенеза в экспериментальном исследовании и выбора материала-носителя проводилось формирование критических дефектов теменных костей у взрослых кроликов. Модель повреждения костей свода черепа кролика была выбрана потому, что регенерация кости в этой зоне и челюстно-лицевой области человека протекает сходным образом, поскольку кость свода черепа, как и кость челюсти, имеет мембранное происхождение (Schmitz JP, Hollinger JO, 1986). В ходе экспериментального исследования был изучен остеогенез при имплантации обогащенной тромбоцитами плазмы - PRP, остеоиндуктивных

материалов «Биоматрикс», «ВюС^» и «Остеоматрикс» в сочетании с обогащенной тромбоцитами плазмой, а также при трансплантации ТИК ЖТ. В экспериментальном исследовании морфометрия тканевых компонентов регенерата во всех вышеперечисленных группах (Табл. 1) показала, что ни в одной из групп, где были использованы костнопластические материалы, закрытия дефектов не произошло (Табл.3). Все используемые в эксперименте имплантационные материалы, которые входили в группы сравнения в эксперименте рассматривались как возможные носители клеток. В контрольной группе и группе, где дефект заполняли РЯР: через 120 суток после операции основу регенерата составляла фиброзная соединительная ткань. Заполнения дефекта костной тканью не происходило. Одной из причин этого явления было разрастание фиброзной ткани, мешающее росту и распространению новообразованной костной ткани. (Рис.2). Через 120 дней после имплантации «Биоматрикса» относительный объем вновь образованной кости составлял 3%, материал полностью резорбировался; большая часть регенерата была представлена плотной волокнистой соединительной тканью (Рис.3)

При имплантации в зону дефекта «Остеоматрикса» происходило незначительное образование новой кости, доля материала составляла 24% (Рис.4)

Рис.2. Контрольная группа. Панорама костного дефекта теменной кости у кролика из контрольной группы через 120 дней после операции. Область костного дефекта заполнена фиброзной соединительной тканью (1). Заполнение дефекта костной тканью происходит со стороны материнской кости (3) и твердой мозговой оболочки (2). Окраска гематоксилином и эозином. X 32.

Рис.3. Панорама костного дефекта теменной кости у кролика из группы Биоматрикс. Область костного дефекта частично заполнена фиброзной соединительной тканью (2) и вновь образованной костью (1). Заполнение дефекта костной тканью происходит со стороны материнской кости. (3 -твердая мозговая оболочка). Окраска гематоксилином и эозином. Х32.

Рис.4. Панорама регенерата в области костного дефекта теменной кости через 120 дней после имплантации Остеоматрикса. Основу регенерата составляют фиброзная ткань и нерезорбированный материал (1). Костный регенерат в области материнской кости не обнаружен (2). Окраска гематоксилином и эозином. Х32.

При закрытии дефектов «ВтОвв» объем вновь образованной кости составлял 2%, доля материала составляла 65% (Рис.5).

Рис.5. Панорама костного регенерата через 120 дней после имплантации «ВшС^в». Нерезервированный материал (1) расположен среди фиброзной ткани. Окраска гематоксилином и эозином, х 32.

В качестве материала- носителя был выбран «Остеоматрикс» - выбор был обусловлен тем, что материал обладал свойствами необходимыми для матрица - носителя: биосовместимость, пористая структура, механическая прочность, возможность ЗБ моделирования. Материал биодеградируемый; не препятствует росту, пролиферации и дифференцировке клеточной культуры, поддерживает заданный объем и структуру в течение 120 дней.

Таблица 3 Относительный объем тканевых компонентов регенерата в экспериментальном исследовании.

ВЮОбб Биоматрикс Остеоматрикс ТИК

Пластинчатая кость 0,08 2,75 0 15,19

Ретикулофиброзная кость 1,26 9,02 0 23,40

Остеоид 0 0,28 0 0,78

Жировая ткань 5,11 28,23 1,32 21,65

Соединит, ткань 65,1 59,72 74,92 30,60

Материал 28,42 0 23,76 8,38

Характерной особенностью группы, где дефекты заполнялись ТИК ЖТ, было активное образование костной ткани в регенерате после трансплантации во всех зонах регенерата, в основном вокруг балок трансплантата равномерно по всей его толщине. Основу регенерата составила вновь сформированная костная ткань, находящаяся как на стадии остеоида, так и ретикулофиброзной и пластинчатой кости. В отличие от других групп, в группе ТИК вновь образованная костная ткань заполняла поры носителя на всем его протяжении. Новообразованная костная ткань со стороны материнской кости сливалась с костной тканью внутри трансплантата (Рис.6)

Рис.6. Регенерат теменных костей через 120 дней после трансплантации тканеинженерной конструкции (ТИК). Поры материала заполнены преимущественно ретикулофиброзной и пластинчатой костной тканью, среди которой располагается рыхлая волокнистая соединительная ткань. Окраска гематоксилином и эозином, х32.

Трансплантация тканеинженерной конструкции на основе ММСК стромально-васкулярной фракции жировой ткани значительно повлияла на процессы репаративного остеогенеза в области костного дефекта. В толще регенерата присутствовала рыхлая волокнистая соединительная ткань и лишь в небольшом количестве фиброзная ткань. Остеогенез наблюдали как на поверхности твердой мозговой оболочки, так и по всей толщине трансплантата, что свидетельствовало о высоком регенерационном потенциале привнесенных культивированных остеогенных клеток. Образование кости de novo происходило без признаков образования хрящевой ткани. Повсеместное образование молодой костной ткани на поверхности материала, было непосредственно связано с пролиферативной активностью трансплантированной клеточной культуры.

Результатом экспериментального исследования при трансплантации ТИК ЖТ стало утверждение, что трансплантация ТИК ЖТ в область дефекта позволяет получить такой объем костной ткани, который ограничивается лишь объемом самой тканеинженерной конструкцией, в последствие это было подтверждено клинически - объем трансплантата по данным КТ с течением времени не менялся (срок наблюдения от 12 до 60 месяцев). Также эксперимент подтвердил предположение, что ТИК является полноценным аутотрансплантатом, внутри которого происходят процессы регенерации: образование костной ткани в регенерате после трансплантации происходило во всех зонах регенерата, независимо от «удаленности» от материнской кости. Эти данные были подтверждены и в клиническом исследовании: образование костной ткани при трансплантации ТИК ЖТ наблюдалось по всей толщине трансплантата.

Использование РЫР как дополнительного компонента в ТИК позволяло предотвратить вымывание клеток при трансплантации. Культура клеток, преддифференцированных в остеогенном направлении, смешивалась с обогащенной тромбоцитами плазмой. Далее полученная суспензия наносилась на материал-носитель, после чего проводилась полимеризация. Таким образом, клеточная культура фиксировалась в порах материала.

Полученные результаты экспериментального исследования позволили определить срок проведения дентальной имплантации при использовании ТИК ЖТ в клиническом исследовании в 120 дней.

Результаты исследования механических характеристик материала-носителя и ТИК ЖТ: В ходе исследования были проанализированы по пятнадцать образцов ТИК, влажного и имплантированного материала «Остеоматрикс» идентичных габаритов как носителя ТИК. Результаты продемонстрировали значительные различия образцов выбранных групп по всем механическим характеристикам. Если прочность при сжатии и предел прочности при изгибе у влажного и имплантированного «Остеоматрикса» почти не различались и были равны 34 МПа, то прочность при сжатии ТИК

(после трансплантации) была значительно меньше и составила 17 МПа. Предел прочности при изгибе по Динстату у «влажного Остеоматрикса» составил 3,4 МПа, у «имплантированного Остеоматрикса» - 3,2 МПА, у ТИК - 2,5 МПа. Уменьшение прочности ТИК указывало на то, что культура ММСК ЖТ, преддифференцированных в остеогенном направление ведет себя более агрессивно по отношению к субстрату по сравнению с соединительно-тканным окружением, присутствующим в образцах группы «Имплантированный остеоматрикс». При этом твердость у ТИК составляла 14 МПа, у «влажного Остеоматрикса» -5,6 МПа, «имплантированного Остеоматрикса» - 10 МПа.

Прочностные характеристики ТИК ЖТ в клиническом исследовании оценивали при установке имплантатов и измеряли с помощью ручного динамометрического ключа: введение имплантатов проводилось при усилие в 45 Н/см.

В ходе клинического исследования был оптимизирован технологический процесс приготовления кл еточного трансплантата, а именно: сокращение сроков культивирования было достигнуто за счет увеличения объема липоаспирата. Увеличение объема липоаспирата позволяло получить большой объем малодифференцированных клеток, что способствовало уменьшению количества пассажей культивирования. Наименьший срок культивирования составил 14 дней, максимальный срок культивирования составлял 30 дней, что было обусловлено так называемой лаг-фазой, которая длится от 3 до 10 суток в зависимости от индивидуальных особенностей организма.

Сокращение сроков дифференцировки: сроки дифференцировки в начале исследования составляли 21 сутки, но потом были сокращены до 14 суток. Этого срока оказалось достаточно для дифференцировки, что было подтверждено литературными данными. После 14 суток начиналась выраженная минерализация внеклеточного матрикса, и открепление клеток от поверхности материала становилось затруднительно: при откреплении

клеток от ростковой среды на сроке более 14 дней, часть из них оставалась на материале. Также для сокращения срока по подготовке ТИК впервые была разработана схема сборки ТИК в условиях операционной.

Для увеличения высоты костной ткани в области дна пазухи (Рис. 7А, 8А) использовалась ТИК ЖТ в виде мелких блоков (0,5см X 0,5см X 0,5см) и костной крошки. На КТ через 120 дней после трансплантации у всех пациентов в зоне трансплантации определялась сформированная костная ткань, сливающаяся с костной тканью альвеолярного отростка, по структуре соответствующая неизмененной костной ткани (Рис.7Б, 8Б). В отдаленных сроках наблюдений объем трансплантата был постоянным, в области проведенной трансплантации была видна неизмененная костная ткань (Рис.7В, 8В).

Пациентам, которым проводилось удаление зубов, лунки заполнялись ТИК ЖТ в виде мелкой костной крошки. Через 120 дней по данным КТ после удаления зуба и трансплантации ТИК ЖТ, структура костной ткани имела структуру неизмененного альвеолярного отростка (Рис.7Б, 8Б). Морфологическое исследование биопсийнного материала, полученного из лунок, показало, что костный регенерат состоял преимущественно из зрелой пластинчатой костной ткани, ориентированной наподобие балок губчатой кости. В результате применение ТИК ЖТ в области лунок удаленных зубов позволило не только предотвратить резорбцию костной ткани, но и воссоздать её объём.

Увеличение высоты и ширины альвеолярного отростка на нижней челюсти было проведено у трех пациентов. В процессе подготовки к проведению данных операций был разработан метод создания индивидуальных костных блоков для восполнения дефицита костной ткани на нижней челюсти.

Рис. 7А

^ I Яя

Рис. 7Б

_ _ _Рис. 8В

Через 21 месяц после трансплантации ТИК ЖТ и 17 месяцев после дентальной имплантации.

Лечение пациентов с данной патологией было остановлено в связи полученными неудовлетворительными результатами, связанными приживлением трансплантатов.

Таблица 4 Осложнения при трансплантации ТИК ЖТ на нижней челюсти.

Количество пациентов 3 Зона обнажения трансплантата Осложнения в %

1 Частично с одной стороны 25%

1 Полностью с одной стороны 50%

1 Обнажение с двух сторон 100%

В группу осложнений вошли все пациенты (100%), которым было проведено увеличение высоты и ширины альвеолярного гребня с помощью индивидуально изготовленных трансплантатов с двух сторон: у одного пациента произошло частичное обнажение дистальной части трансплантата с одной стороны — трансплантат был частично удален (25%). У второй и третьей пациенток при проведение дентальной имплантации после двухсторонней трансплантации ТИК ЖТ - была обнаружена подвижность трансплантата (в одном случае с одной стороны - 50%, в другом случае с двух сторон-100%) - трансплантаты были удалены (Табл.4). При этом после удаления трансплантатов, не произошло усугубления исходного состояния, т.е. исходные параметры костной ткани до хирургического вмешательства остались прежние.

Результаты гистологического исследования Сравнительный анализ динамики регенерации костной ткани с использованием тканеинженерной конструкции на основе ММСК ЖТ в клинике был проведен с контрольной группой пациентов, которым проводилось лечение с использованием имплантационного материала «Вю-ОБв», материала наиболее часто используемого в хирургической стоматологии и имплантологии.

При гистологическом исследовании зоны трансплантации ТИК ЖТ через 120 дней было выявлено, что образцы состояли из трех зон: материнской кости, промежуточной и зоны регенерата (также как и при трансплантации ТИК ЖТ в экспериментальном исследовании) (Рис.9).

Зона, содержащая ТИК, состояла преимущественно из новообразованной трабекулярной костной ткани. Исследование с помощью поляризационной микроскопии и окраской пикросириусом красным указывало на компактизацию остеина в трабекулах.

Рис.9. Зоны образца. 1 - зона материнской кости, 2 - промежуточная зона, содержащая между материнской костью и зоной регенерата, 3 - зона регенерата.

На поверхностях костных балок отмечались участки активного неоостеогенеза с активными остеобластами и выселяющимися из рыхлой волокнистой соединительной ткани фибробластоподобными клетками. Материал «Остеоматрикс» располагался как в тесном контакте с костными балками, так и в виде свободно лежащих фрагментов, а также включался в архитектонику балки, тогда между костным веществом и материалом образовывался тесный контакт по типу склеивающей пластинки. Межтрабекулярное пространство было заполнено в основном рыхлой волокнистой соединительной тканью (РВСТ) с большим количеством сосудов венозного и артериального типа различного калибра. Среди полей РВСТ встречались участки фиброзной ткани. В структуре регенерата также обнаруживали участки неорганизованного фибрина в виде бесклеточных базофильных образований, иногда содержащих тромбоциты. Вокруг депозитов фибрина воспалительная или макрофагальная инфильтрация не обнаруживалась.

При морфометрическом исследовании гистологических срезов было выявлено, что костный регенерат через 120 дней после трансплантации ТИК состоял в основном из костной ткани, её относительная объемная доля составила 41,13%. Рыхлая волокнистая соединительная ткань с красным и желтым костным мозгом занимала основной объем межтрабекулярного пространства -38,6%. Относительная доля фиброзной ткани -8,4% и депозитов фибрина занимали 2,44%, что составляло незначительную часть костного регенерата (Рис.10).

Доля составных частей регенерата через 120 дней после трансплантации ТИК ЖТ

ФТ

■ Материал

РВСТ

Костшяткань

Депочпты фпбрпна

Типы тканей

Рис. 10. Относительные объемные доли составных частей костного регенерата после трансплантации ТИК.

Доля составных частей регенерата через 180 дней после пмплантащш BioOss

■ Материал Депозиты аФТ

■ Костнаяткань

Рис.11. Относительная объемная доля составных частей костного регенерата.

В группе контроля (у пациентов, которым проводилось лечение с использованием имплантационного материала «Bio-Oss»): неоостеогенез наблюдался на поверхности гранул, было выявлено значительное количество фиброзной ткани (41,13%), что свидетельствовало о патологической регенерации. Выраженная инфильтрация остеокластами и макрофагами в сочетании со склеротическими изменениями

свидетельствовала о негативной реакции организма на остеопластический материал «Bio-Oss». Костная ткань через 180 дней после имплантации являлась не зрелым костным регенератом (Рис.11).

Особенности костного регенерата через 180 дней после имплантации «BioOss»: высокое содержание фиброзной ткани; практически полное отсутствие рыхлой волокнистой соединительной ткани; значительное количество остеоидной и ретикулофиброзной костной ткани; низкое содержание пластинчатой костной ткани (Рис.12).

Рис.12. Костный регенерат через 180 дней после имплантации «Bio Oss». Окраска по Массону-Голднеру, Х32.

Особенности костного регенерата через 120 дней после трансплантации ТИК ЖТ: низкое содержание фиброзной ткани; умеренное содержание рыхлой волокнистой соединительной ткани; незначительное количество остеоидной костной ткани и ретикулофиброзной костной ткани; преобладание пластинчатой костной ткани (Рис.13).

Рис. 13. Костный регенерат после трансплантации ТИК ЖТ через 120 дней. Окраска по Массону-Голднеру, Х50.

В результате проведенного экспериментального и клинического исследования был разработан новый способ создания тканеинженерных

конструкций для восстановления костной ткани, основанный на принципе свободного распределения клеток в фибриновом сгустке внутри матрицы-носителя. В качестве источника регенерации тканеинженерная конструкция включает в себя мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани, преддиференцированные в остеогенном направлении, обогащенную тромбоцитами плазму и резорбируемый материал на основе ксеногенного костного коллагена. Культура остеопрогениторных клеток охарактеризована по основным маркерам остеобластического дифферона. Используемый материал отвечает требованиям, предъявляемым к материалам для тканевой инженерии. Получен инновационный высокотехнологичный тканеинженерный продукт для клинического применения. Эффективность применения ТИК ЖТ подтверждена результатами клинического исследования.

Выводы.

1. Разработана трехкомпонентная тканеинженерная конструкция (ТИК) на основе биорезорбируемого материала-носителя «Остеоматрикс», мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), выделенных из жировой ткани и преддиференцированных в остеогеном направлении и обогощенной тромбоцитарной массы (PRP). Образование кости de novo после трансплантации ТИК ЖТ. в экспериментальном и клиническом исследовании обосновало использование жировой ткани как источника мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток для восстановления костной ткани. Применение PRP как третьего компонента обеспечило нормальное течение регенеративного процесса при трансплантации ТИК ЖТ, а также предотвратило вымывания клеток при трансплантации.

2. Подтверждена безопасность применения тканеинженерной конструкции на основе ММСК ЖТ в экспериментальной модели на

лабораторных животных и клиническом исследовании: трансплантация ТИК ЖТ в область дефекта позволяет получить такой объем костной ткани, который ограничивается объемом самой тканеинженерной конструкцией

3. Подтверждена эффективность применение ТИК ЖТ для устранения дефицита костной ткани и восполнения костных дефектов. Трансплантация ТИК ЖТ позволила добиться органотипической регенерации кости в области трансплантации, что подтверждено гистоморфметрическим исследованием: через 120 дней после трансплантации костный регенерат имеет структуру зрелой костной ткани.

4. При использовании ТИК ЖТ образование костной ткани проходит без признаков образования хрящевой ткани. Образование костной ткани в регенерате после трансплантации ТИК ЖТ происходит во всех зонах регенерата, независимо от «удаленности» от материнской кости, что позволяет рассматривать трансплантацию ТИК ЖТ в области дна верхнечелюстной пазухи, постэкстракционной лунке как альтернативу аутотрансплантации

5. Оценка сравнительной эффективности использования ТИК ЖТ с использованием материала ВюОбз - материала наиболее часто используемого в хирургической и челюстно-лицевой стоматологии показало, что при использовании ТИК ЖТ объем вновь образованной костной ткани составил 41,13%, объем рыхлой волокнистой соединительной ткани с красным и желтым костным мозгом составил - 38,6%. При использовании ВюОбб объем вновь образованной костной ткани составил 14% объем рыхлой волокнистой соединительной ткани составил менее 1 %

6. Качественные характеристики (биомеханическая прочность, состав регенерата) вновь образованной костной ткани через 120 дней

после трансплантации позволяют провести дентальную имплантацию

7. Применение ТИК ЖТ в области лунок удаленных зубов позволяет предотвратить резорбцию костной ткани и полностью воссоздать её объём. По данным КТ через 120 дней структура костной ткани имеет структуру неизмененного альвеолярного отростка. Морфологическое исследование биопсийнного материала, подтверждает, что костный регенерат состоит преимущественно из зрелой пластинчатой костной ткани

8. По данным рентгенологического исследования (за период наблюдения от 1 года до 5 лет) объем трансплантата остается неизменным. Выживаемость дентальных имплантатов, установленных в области трансплантации составила 95,5 %.

Практические рекомендации.

1 Объем липоаспирата должен быть рассчитан исходя из

предполагаемого объема ТИК, а также с учетом объема, который подвергается криоконсервированию. На 20 мл липоаспирата (без учета транспортной среды) приходится в среднем - 10 мл жировой ткани. Из этого количества может быть получено не менее 40 млн. ММСК на 2-3 пассаже.

2 Оптимальным сроком для дифференцировки клеток является 14 дней.

3 Использование РКР в ТИК как третьего компонента является

обязательным, так как заключение преддифференцированных в остеогенном направлении клеток в фибриновый гель, состоящий из обогащенной тромбоцитами плазмы, позволяет смоделировать нормальное течение регенеративного процесса, а также предотвратить вымывание клеток при трансплантации.

4 Проведение сборки ТИК в условиях операционной позволяет сократить

срок подготовки ТИК.

5 При трансплантации ТИК нет необходимости использования

барьерных мембран, так как образование костной ткани происходит во всех зонах регенерата, независимо от «удаленности» от материнской кости.

6 Оптимальный срок проведения дентальной имплантации после

трансплантации ТИК 120 дней.

7 При увеличении высоты альвеолярного отростка в области дна

верхнечелюстной пазухи, а также при заполнении постэкстракционных лунок рекомендуется использование материала-носителя в виде крошки. Использование материала-носителя в виде блоков приводит к усилению процессов фиброза по сравнению с использованием материала - носителя в виде крошки.

Список работ, опубликованных по теме диссертации в журналах ВАК:

1. Кулаков A.A., Гольдштейн Д.В., Григорьян A.C., Ржанинова A.A., Алексеева И.С., Арутюнян И.В., Волков A.B.. Клиническое исследование эффективности применения комбинированного клеточного трансплантата на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани у пациентов с выраженным дефицитом костной ткани в облати верхней и нижней челюсти. // Клеточные технологии в биологии и медицине.-2008,- №4. С.206-210.

2. Алексеева И.С., Арутюнян И.В., Волков A.B., Шураев А.И.. Применение комбинированного клеточного трансплантата на основе аутологичных мультипотентных стромальных клеток жировой ткани у пациента с выраженным дефицитом костной ткани в области верхней челюсти. //Стоматология. - 2009.- №6,- С.32-35.

3. Волков A.B., Алексеева И.С., Кулаков A.A., Гольдштейн Д.В., Шустров С.А., А.И. Шураев, Арутюнян И.В., Бухарова Т.Б., Ржанинова A.A., Большакова Г.Б., Григорьян A.C.. Регенерация костей черепа взрослых кроликов при имплантации коммерческих остеоиндуктивных

материалов и трансплантации тканеинженерной конструкции. //Клеточные технологии в биологии и медицине.-2010. -№2,- с .72-77.

4. Бухарова Т.Б., Арутюнян И.В., Шустров С.А., Алексеева И.С., Федюнина И.А., Логовская JI.B., Волков A.B., Ржанинова A.A., Григорьян A.C., Кулаков A.A., Гольдштейн Д.В. Тканеинженерная конструкция на основе мультипотетных стромальных клеток жировой ткани и материала «Остеоматрикс» для регенерации костной ткани. //Клеточные технологии в биологии и медицине, - 2011.-№3, С.167-173.

5. Волков A.B., Шустров С.А., Алексеева И.С.,' Бухарова Т.Б., Хохлов С.Б, Кулаков A.A., Гольдшейн Д.В. Создание индивидуальных трехмерных конструкций для восстановления челюстно-лицевых костных дефектов. //Пародонтология.- 2011.- № 4(61).-С. 61-64.

6. Алексеева И.С., Волков A.B., Кулаков A.A., Гольдшейн Д.В. Клинико-экспериментальное обоснование использования комбинированного клеточного трансплантата на основе мультипотентных мезенхимных стромальных клеток жировой ткани у пациентов с выраженным дефицитом костной ткани челюстей. //Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2012.-№1. - С. 97-105.

7. Алексеева И.С., Волков A.B., Кулаков A.A., Гольдшейн Д.В. Экспериментальное обоснование использования тканеинженерной конструкции на основании мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани для регенерации костной ткани в модели критических дефектов теменных костей у кроликов.//Российский биотерапевтический журнал/- 2012. -№1. — С.75-77.

8. Алексеева И.С., Волков A.B., Кулаков A.A., Гольдшейн Д.В. Жировая ткань как перспективный источник получения мультипотентных стромальных клеток взрослого организма. Журнал «Пародонтология» №2(63) 2012 год, стр 21-25.

9. Алексеева И.С., Волков A.B., Кулаков A.A., Гольдштейн Д.В.,

А.И.Шураев. Клинические примеры трансплантации тканеинженерной конструкции для восполнения дефицита костной ткани в области дна верхнечелюстной пазухи. // Институт Стоматологии,- 2012.-№1.-С.45-48.

Ю.Алексеева И.С., Кулаков A.A., Гольдштейн Д.В., Волков A.B. Восстановление костной ткани после удаления зубов при использовании тканеинженерной конструкции на основе мультипотентных стромальных клеток жировой ткани.//Стоматология,-2012,- №4.-С.35-37.

П.Алексеева И.С., Рачинская O.A., Шураев А.И., Волков A.B., Кулаков А.А, Гольдштейн Д.В. Сравнительная оценка эффективности образования костной ткани при трансплантации тканеинженерной конструкции и остеопластического материала «Bio-Oss» в области дна верхнечелюстной пазухи. //Стоматология.- 2012,- №6.-С.31-35.

12. Алексеева И.С., Кулаков A.A., Гольдшейн Д.В. Клинический пример использования тканеинженерной конструкции для восстановления костной ткани в области дна верхнечелюстной пазухи. //Пародонтология,- 2012.-№3.-С.44-49.

13.Гольдштейн Д.В., Кулаков A.A., Волков A.B., Макаров A.B., Алексеева И.С., Арутюнян И.В.. Патент РФ на изобретение №2380105 «Биотрансплантат, способ его получения и способ лечения дегенеративных и травматических заболеваний костной ткани челюстно-лицевой области», от 29.07.2010.

Заказ № 49-П/12/2012 Подписано в печать 17.12.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru