Автореферат и диссертация по медицине (14.01.14) на тему:Применение аутологичных стромальных клеток из жировой ткани для восстановления объёма кости альвеолярных отростков/частей верхней и нижней челюстей

На правах рукописи УДК: 616.716.86-089.843

Чаусская Ирина Юрьевна

ПРИМЕНЕНИЕ АУТОЛОГИЧНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ИЗ ЖИРОВОЙ ТКАНИ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ОБЪЕМА КОСТИ АЛЬВЕОЛЯРНЫХ ОТРОСТКОВ/ЧАСТЕЙ ВЕРХНЕЙ И НИЖНЕЙ

ЧЕЛЮСТЕЙ

14.01.14 - стоматология (медицинские науки) 03.03.04 - гистология, цитология, клеточная биология (медицинские науки)

-1 ДЕК 2011

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2011

005004173

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и в ГБОУ «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» Минобрнауки России (Государственное учебно-научное учреждение «Факультет фундаментальной медицины»)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Дробышев Алексей Юрьевич кандидат биологических наук, доцент Рубина Ксения Андреевна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Панин Андрей Михайлович

доктор биологических наук Васильев Андрей Валентинович

Ведущая организация:

Федеральное государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Институт повышения квалификации Федерального медико-биологического агентства» (ФГОУ ДПО ИПК ФМБА России)

Защита состоится « 2011 г. в часов на

заседании диссертационного совета Д 208.041.07 при ГБОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России по адресу: 127473, г. Москва, ул. Делегатская д. 20 стр.1.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ГБОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России: 127206, г. Москва, ул. Вучетича, д. 10а.

Автореферат разослан « ¿У» /// 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, к.м.н. доцент

О.П.Дашкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Актуальной проблемой стоматологии и челюстно-лицевой хирургии является поиск наиболее эффективных средств и методов костной пластики, создающих оптимальные условия для репаратив-ного остеогенеза.

При восстановлении костного дефекта большое значение имеет дистантный тип костеобразования, заключающийся в пролиферации и остеоген-ной дифференцировке собственных стромальных клеток, формировании клеток остеобластического ряда, образующих костную ткань (А.А.Кулаков, А.С.Григорян, 2007). Поэтому одной из актуальных задач тканевой инженерии в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии является создание необходимой массы стромальных клеток, условий для их остеогенной дифферен-цировки и доставки в зону регенерации. В качестве носителя стромальных клеток могут применяться остеопластические материалы, преимущества и недостатки которых хорошо известны, и приведены в многочисленных работах. (Н.А.Плотников, 1967; А.А.Никитин, 2000-2005; О.З.Топольницкий, 2004; А.Ю.Дробышев, 2005; А.И.Воложин и соавт., 1998-2006 и другие.)

Одним из перспективных источников для получения стромальных клеток является жировая ткань. Известно, что в жировой ткани человека сконцентрирована популяция мультипотентных фибробластоподобных клеток мезенхимального происхождения, экспрессирующих маркер стволовых клеток СБ34 (АкЬаис! С. е1 а1., 1992; 81аз1ю\¥ег М. е( а1., 1999). Наиболее важным преимуществом стромальных клеток из жировой ткани является то, что они могут быть выделены в большем количестве, с минимальными болезненными ощущениями для пациента. В результате липосакции и последующих обработок удается получить суспензию отдельных клеток, из которых после центрифугирования можно выделить стромальную фракцию ^ик Р.А. е1 а1., 2002; 11еЬтап ). й а1., 2004; Р1апаЬВепагс1 V. й а1., 2004). Стромальные клетки из жировой ткани хорошо пролиферируют, что позволяет при относительно небольшом сроке культивирования получить достаточное для транспланта-

ции количество клеток. Вышеперечисленное позволяет предполагать, что использование аутологичных стромальных клеток жировой ткани на носителе способно ускорить образование полноценного костного регенерата, что особенно важно для пациентов со значительными по размеру дефектами.

Цель исследования. Обосновать и разработать технологию создания и применения тканеинженерных конструкций на основе аутологичных стромальных клеток из подкожной жировой клетчатки и остеоиндуктивного носителя для ускорения регенерации костной ткани у пациентов с атрофией и дефектами альвеолярных отростков/частей верхней и нижней челюстей. Задачи исследования.

1. Разработать методику выделения, культивирования и подготовки к трансплантации аутологичных стромальных клеток из жировой ткани пациентов.

2. Охарактеризовать экспрессию поверхностных маркеров аутологичных стромальных клеток из жировой ткани.

3. Изучить жизнеспособность и способность аутологичных стромальных клеток из жировой ткани к адгезии на носителях (ГАП и «КоллапАн-Г»).

4. Оценить влияние аутологичных стромальных клеток из жировой ткани на носителях (ГАП и «КоллапАн-Г») на динамику заживления костного дефекта челюстей у людей.

5. Разработать методику индукции дифференцировки стромальных клеток из жировой ткани в остеогенном направлении.

6. Исследовать влияние тканеинженерных конструкций на основе аутологичных стромальных клеток из жировой ткани и стромальных клеток из жировой ткани, индуцированных в остеогеогенном направлении, в сочетании с ос-теогенным носителем на морфологию формирующейся костной ткани в динамике при замещении костных дефектов челюстей людей.

7. Разработать алгоритм применения данной методики в клинической практике.

Научная новизна исследования. Впервые разработана методика выделения, культивирования и подготовки к трансплантации стромальных клеток

жировой ткани человека с использованием среды (АсЬ/апсеБТЕМ™) для поддержания роста недифференцированных мезенхимальных стромальных клеток с добавлением аутологичной сыворотки крови пациента. Использовали два вида клеток: 1. Стромальные клетки жировой ткани, культивированные в стандартных условиях для получения культуры, обладающей регенеративным потенциалом и способностью стимулировать рост сосудов; 2. Впервые использовали смесь стромальных клеток жировой ткани, культивированных в стандартных условиях, с стромальными клетками жировой ткани, культивированными в остеоиндуктивных условиях в течение 3-х недель. Культивированные стромальные клетки жировой ткани в дальнейшем инкубировали в присутствии остеогенных носителей «КоллапАн-Г» или ГАП для создания тканеинженерных конструкций, пригодных для использования в клинике.

Впервые проводилась оценка эффективности применения тканеинженерных конструкций, полученных на основе аутологичных стромальных клеток жировой ткани, выращенных с использованием аутологичной сыворотки крови пациента и остеогенного носителя при восстановлении объема костной ткани у пациентов с дефектами и атрофией альвеолярных отростков/частей верхней и нижней челюстей.

Практическая значимость работы.

1. Проведенные исследования позволили разработать методику создания и применения тканеинжинерных конструкций на основе стромальных клеток жировой ткани в клинической практике.

2. Доказана, эффективность использования тканеинженерных конструкций на основе аутологичных стромальных клеток из жировой ткани и стромальных клеток из жировой ткани, индуцированных в остеогеогенном направлении, в сочетании с «КоллапАн-Г» в качестве носителя при замещении костных дефектов челюстей пациентов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Разработана оптимальная методика культивирования стромальных клеток жировой ткани с использованием среды для поддержания роста недифференцированных мезенхимальных стромальных клеток с добавлением аутологич-ной сыворотки крови пациента.

2. Создана и оптимизирована тканеинженерная конструкция на основе стромальных клеток жировой ткани, культивированных в стандартных условиях, и на основе комбинации стромальных клеток жировой ткани, культивированных в стандартных условиях, с стромальными клетками жировой ткани, культивированными в остеоиндуктивных условиях.

3. Результаты использования созданных тканеинженерных конструкций в клинике для восстановления объема кости альвеолярных отростков/частей верхней и нижней челюстей.

Внедрение результатов в практику. Результаты исследования используются для проведения практических занятий и лекций у студентов стоматологического факультета кафедры госпитальной хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии МГМСУ, кафедры хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии ФПДО МГМСУ.

Личный вклад автора в выполнение исследования. Автором лично проведено клиническое обследование 18 пациентов с дефектами кости альвеолярных отростков/частей верхней и нижней челюстей, произведен забор подкожной жировой ткани с передней стенки живота методом липосакции.

Автором лично проведено 28 операций по восстановлению альвеолярных отростков/частей верхних и нижних челюстей, забор 72 биопсий костной ткани для гистологического исследования во время установки дентальных имплантатов.

Апробация работы. Работа апробирована и одобрена 1 июля 2011г на межучережденческом заседании кафедр госпитальной хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии ФПДО, ортодонтии и детского протезирования ГБОУ

б

ВПО МГМСУ минздравсоцразвития России и ГУНУ ФФМ МГУ имени М.ВЛомоносова (протокол №19)

Публикации. Основное содержание диссертационного исследования достаточно полно отражено в автореферате и в 3 работах соискателя, в том числе 1 работа опубликована в журнале, рекомендованном ВАК Минобрнау-ки РФ.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 143 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения и четырех глав: обзора литературы, материалов и методов исследования, результаты и обсуждение лабораторных исследований, результаты и обсуждение клинического исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 171 источников, из которых 68 отечественных и 103 иностранных авторов. Работа содержит 2 таблицы и 48 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. Для изучения регенерации костной ткани после введения тканеинжинерных конструкций на основе стро-мальных клеток из жировой ткани и остеогенных носителей в 2008 г. было начато пилотное клиническое исследование, в которое были включены 18 пациентов (10 женщин, 8 мужчин; возраст — 30-65 лет). Все пациенты имели выраженную атрофию костной ткани в области ранее утраченных зубов. Такое состояние костной ткани не позволяло проводить внутрикостную имплантацию без восстановления утраченного объема кости.

Локализация и вид хирургического вмеша- Количесто Мужчны Женщны

тельства пациентов

Верхняя челюсть Односторонний 7 3 4

Проводимая операция дефект

синус-лифтинг Двухсторонний дефект 5 3 2

Нижняя челюсть Односторонний 1 - 1

Проводимая операция дефект

горизонтальная остео- Двухсторонний 5 2 3

томия дефект

Таблица 1

Всем пациентам устраняли дефекты костной ткани с помощью трансплантации тканеинженерной конструкции на основе стромальных клеток жировой ткани (СКЖТ).

При двухстороннем синус-лифтинге 4 пациентам с одной стороны вводили тканеинженерную конструкцию на основе СКЖТ и носителя ГАП, с другой стороны - на основе СКЖТ и носителя КоллапАн-Г.

Локализация дефекта костной ткани Тканеинженерная Конструкция СКЖТ на носителе КоллапАн-Г Тканеинжененая конструкция СКЖТ на носителе ГАП Тканеинженерна конструкция СКЖТ и СКЖТ преддифференцирован-ные в остеогенном направлении (1:1) на носителе КоллапА-Г

I группа И группа III группа

в/ч 10 5 2

н/ч 4 4 3

Таблица 2

В соответствии с утвержденным протоколом включения пациентов в исследование от всех пациентов было получено письменное информированное согласие, а также всем пациентам проводили комплексное биохимическое, клинико-лабораторное и серологическое обследование крови (ВИЧ, НСУ, НВУ, реакция Васермана) и подтверждали отсутствие основных онкомарке-ров (обследование на общий простатоспецифический антиген - ПСА, ПСА свободный, раковоэмбриональный антиген, Са 19-9 — для мужчин; раково-эмбриональный антиген, Са 15-3, Са 19-9, Са-125 — для женщин).

Дентальная объёмная томография (ДОТ) верхней или нижней челюсти проводилась до начала лечения и через 1, 3, 6 месяцев после трансплантации тканеинженерной конструкции. Внутрикостные имплантаты устанавливали через 3-4 месяца после трансплантации. В ходе установки имплантатов проводили забор костной ткани из места введения тканеинжинерных конструкций и из участка здоровой кости (контрольный участок собственной кости пациента). У 18 пациентов взято 54 биопсий из мест введения тканеинже-нерных конструкций и 18 биопсий из контрольных участков собственной кости пациента.

Результат лечения оценивали через 1, 3 и 6 месяцев в соответствии с данными клинического осмотра, дентальной объёмной томографии и гистологическим исследованием костной ткани.

Главным критерием оценки эффективности введения тканеинженер-ных конструкций явилось сравнение данных гистологического исследования и их сопоставление с результатами рентгеновских методов исследования. Во всех группах ранних и поздних осложнений выявлено не было. Отмечалось быстрое заживление послеоперационных ран, по сравнению с традиционными подходами. У пациентов всех групп отмечалось выраженное формирование молодой костной ткани и признаки активного ангиогенеза с формированием мелких капилляров и крупных зрелых сосудов, что, по-видимому, обусловило быстрое заживление операционных ран во всех случаях.

Выделение и культивирование СКЖТ. Выделение клеток проводили согласно ранее опубликованному протоколу (K.Weinzierl, A.Yemprich, B.Frerich, 2006) с некоторыми модификациями. Для получения первичной культуры клеток СКЖТ человека использовали подкожный жир, полученный в результате липосакции по стандартной методике. Забирали 15 мл жировой ткани из передней брюшной стенки. Выделение клеток осуществляли в стерильных условиях ламинарного бокса. Ткань измельчали сосудистыми ножницами до консистенции суспензии мелких (размером не более нескольких кубических миллиметров) кусочков и смешивали с растворами ферментов коллагеназы I типа (Worthington Biochemical, США) и диспазы (Invitrogen Corporation, Германия) при соотношении объема ткани (в мл) к объему ферментативного раствора (в мл) 1:2. Образец инкубировали при 37°С в течение 30 мин., далее добавляли равный объем среды AdvanceSTEM™ (HyClone) и центрифугировали при 200g в течение 10 мин.

Белесый поверхностный слой, представленный зрелыми адипоцитами и кусочками ферментативно необработанной ткани, удаляли, а осадок, состоящий из СКЖТ, а также остатков соединительной ткани и клеток крови суспендировали, в лизирующем буфере для эритроцитов. Полученную смесь ин-

кубировали 2-3 мин. в 37°С, после чего к образцу добавляли равный объем среды AdvanceSTEM™, фильтровали через нейлоновые мембраны с размером пор 40 мкм. Полученную суспензию клеток высаживали в количестве 1x105 на чашку Петри в среде AdvanceSTEM™/Antibiotic/Antimycotic Solution ЮОх (HyClone) с добавлением аутологичной сыворотки крови пациента (донора жировой ткани) и выращивали в ССЬ-инкубаторс (5% С02; 95% воздуха) при 37°С. Среда AdvanceSTEM™ предназначена для поддержания роста недифференцированных мезенхимальных клеток человека. Смену среды проводили каждые 2-3 дня; при достижении монослоя клетки пассировали. Для получения популяции клеток, индуцированных в остеогенном направлении, клетки культивировали в остеоиндуктивных условиях в течение 3-х недель.

Подготовка аутологичной сыворотки пациента. Забор крови в количестве 80 мл осуществляли в пробирки с гелем для получения сыворотки крови (Vacuette # 455071 BD, США). При формировании кровяного сгустка пробирки с кровью центрифугировали при 400 g в течение 10 мин.

Дальнейшее получение сыворотки осуществляли в стерильных условиях ламинарного бокса. Сыворотку (желтый супернатант) отбирали в пробирку и фильтровали через фильтры 0,45 мкм (Millipore) и 0,22 мкм (Millipore). Далее сыворотку использовали для культивирования СКЖТ или замораживали и хранили при температуре -20°С.

Подготовка тканеинженерной конструкции к трансплантации. СКЖТ снимали с подложки и инкубировали в течение суток в присутствии «КоллапАн-Г» и ГАП, в небольшом объеме среды для культивирования в СО2 -инкубаторе при 37°С.

Гистологический анализ биопсий. Костные блоки фиксировали 4% формалином в течение 1 суток, отмывали в фосфатно-солевом буфере и декальци-нировали в 12% ЭДТА в течение 24-30 дней до полной декальцинации. Затем образцы замораживали, получали криосрезы толщиной 8 микрон и окраши-

вали раствором гематоксилина и эозина по стандартной гистологической методике.

Иммуногистохимический анализ биопсий. Методом иммуногистохи-мического окрашивания криосрезов биопсий была проведена оценка васку-ляризации вновь сформированной костной ткани к CD31 человека (Dako) -маркеру эндотелиальных клеток, а для оценки пролиферации клеток в ткани - антителами к Ki-67 (BD) - маркеру пролиферирующих клеток. Окрашивание проводили в соответствии с протоколом производителя, с использованием станции для автоматического иммуногистохимического окрашивания AutostainerLink 48 (Dako). Окрашенные препараты анализировали при помощи микроскопа Axiovert 40 (Zeiss) и программы AxioVision 4.6. Размер сосудов и их плотность капилляров оценивали на случайных гистологических срезах, окрашенных антителами к CD31. Подсчет сосудов проводили, используя программу MetaMorph 5.0 (Universal Imaging) и Adobe PhotoShop (Adobe Systems). Плотность сосудов подсчитывали на срезах в 4-5 полях зрения (площадь поля зрения 1.107 мм2) на 3 случайных срезах для каждого образца биопсии. При этом сосуды были разделены на 3 группы: капилляры (образования без просвета или длиной менее 20 мкм), сосуды среднего диаметра (образования длиной от 20 до 40 мкм), крупные сосуды (диаметром более 40 мкм). Статистический анализ данных проводился с использованием программы Statistica 6.0, применялся непараметрический критерий Манна-Уитни.

Метод морфометрии костной ткани. Для оценки характеристик вновь сформированной костной ткани была проведена морфометрическая оценка площади костной ткани на случайных гистологических срезах окрашенных гематоксилином (п=270) 15 срезов биопсий каждого пациента. Препараты фотографировали при помощи микроскопа Axiovert 40 (Zeiss, Германия), цветной цифровой камеры AxioCam MRC (Zeiss, Германия) и программы AxioVision 4.6.Морфометрический анализ проводили с использованием программы MetaMorph 7.1.0.0 (Universal Imaging Corporation, США).

il

Метод дентальной объемной томографии (ДОТ). Дентальная объемная томография (ДОТ) проводилась пациентам на этапе подготовки к трансплантации тканеинженерной конструкции, а затем через 1 месяц, 3 месяца и 6 месяцев после операции для контроля регенерации костной ткани.

Дентальная объемная томография выполнялась на аппарате «I-САТ» (I-САТ, США) с коническим лучом рентгеновского излучения.

При исследование пациентов выполнялось стандартное сканирование по протоколу "Full Ист, 20 sec, 0.3 voxel" - высота поля зрения (FOV) составляла 13см, режимы экспозиции были следующие: kV=120; mAs=18,5; see=0,20; воксел=0,3мм. При этом область сканирования включала верхнюю и нижнюю челюсти одновременно.

Экспериментальная часть работы. Стромальные клетки жировой ткани (СКЖТ) рассматриваются как перспективный источник клеток для клеточной терапии и тканевой инженерии. Однако в большинстве протоколов выделения и культивирования СКЖТ используется среда DMEM с добавлением фетальной бычьей сыворотки (ФБС). ФБС содержит необходимый коктейль факторов роста, гормонов и витаминов, стимулирующих клеточную адгезию и пролиферацию в условиях культивирования in vitro (A.L.Mazlyzam et al., 2004; H.Liu et al., 2004; S.G.Llames et al., 2004). В то же время, имеются сведения о том, что клетки, выращенные с использованием сывороток животных, потенциально небезопасны, в частности, существует риск заражения прионами или вирусами культуры клеток, а также возможность иммунной реакции со стороны организма реципиента (J.L.Spees et al., 2004; M.Sundin et al., 2007). В последние годы предпринимаются попытки исключить из культуральных сред для выращивания клеток для клеточной терапии сыворотки животных и найти им адекватную замену.

В этой связи нами была поставлена задача получения и культивирования СКЖТ с использованием аутологичной сыворотки (АС) пациента вместо ФБС, что позволило улучшить качественные показатели культуры. На осно-

ве получаемых таким образом СКЖТ была разработана методика создания тканеинженерных конструкций с использованием синтетических остеоген-ных материалов (ГАП и «КоллапАн-Г»). В дальнейшем разработанная методика создания тканеинжинерных конструкций была использована для лечения пациентов с дефектами и атрофией костной ткани.

В настоящей работе были определены функциональные характеристики СКЖТ, культивируемых в среде AdvanceSTEM™ (HyClone)/ Antibiot-ic/Antimycotic Solution 100x (HyClone) с добавлением 10% сыворотки крови донора жировой ткани (АС), и основные показатели качества получаемой в результате культуры, а также проведено сравнение некоторых из них с соответствующими характеристиками, определенными для клеток, выращиваемых в среде DMEM с теми же дополнительными компонентами.

1. Сравнение пролиферативной активности СКЖТ при культивировании в средах AdvanceSTEM или DMEM в присутствии аутологич-ной сыворотки или 10% фетальной бычьей сыворотки. При подсчете клеток, культивируемых в различных средах, было установлено, что максимальный уровень пролиферации (деления клеток) демонстрируют клетки, выращиваемые в среде AdvanceSTEM™ с аутологичной сывороткой.

2. Оценка уровня апоптоза и распределения клеток СКЖТ по фазам клеточного цикла. Поскольку известно, что избыточное стимулирование пролиферации может приводить к повышению уровня апоптоза клеток (запрограммированной клеточной гибели) в культуре, представлялось необходимым получить ответ на вопрос, является ли сочетание среды AdvanceSTEM™ с аутологичной сывороткой оптимальным для получения культуры СКЖТ с этой точки зрения. Для этой цели была проведена оценка уровня апоптоза методом проточной цитофлуориметрии.

Были определены достоверные отличия в уровне апоптических клеток: в случае СКЖТ, культивированных в среде AdvanceSTEM™ с добавлением ФБС этот показатель составлял 2,23±0,3 (М±т), в то время как для клеток,

культивированных в среде AdvanceSTEM™ с добавлением АС крови пациента, аналогичный показатель составлял 1,28±0,5 (М±ш).

Из полученных данных можно сделать вывод о том, что сочетание компонентов среды AdvanceSTEM™ с аутологичной сывороткой крови пациента эффективно стимулирует пролиферацию СКЖТ в культуре без повышения уровня апоптоза.

З.Характеристика экспрессии поверхностных клеточных маркеров СКЖТ методом проточной цитофлуориметрии. Для анализа СКЖТ использовали только фракцию клеток, прикрепленную к пластику. Мезенхи-мальные предшественники среди СКЖТ выявляли на основании совместной экспрессии CD73 и CD 105 или CD73 и CD49a. Относительное содержание клеток с характерной экспрессией маркеров мезенхимальных предшественников костного мозга (CD73, CD49a) за два пассажа культивирования вырастает до 16±5%. В тоже время, количество клеток с экспрессией маркеров мезенхимальных предшественников жировой ткани (CD73, CD105) вырастает более чем в 10 раз и составляет уже 57±12%.

Следовательно, выделяемая и культивируемая описанным нами способом популяция СКЖТ обладает характеристиками мезенхимальных стро-мальных клеток.

4.0ценка мультипотентных свойств СКЖТ при культивировании с использованием AdvanceSTEM™ с аутологичной сывороткой.

Известно, что популяция стромальных клеток, выделяемых из подкожной жировой клетчатки и культивируемых с использованием ФБС, содержит мезенхимные стволовые клетки, обладающие мультипотентными свойствами, то есть способностью дифференцироваться в нескольких направлениях (Zuk et al„ 2002). Для проверки мультипотентности получаемой при культивировании с использованием AdvanceSTEM™ с АС, СКЖТ 2-4 пассажей помещали в среду для индукции адипоцитарной, хондрогенной, эндотели-альной или остеогенной дифференцировки (Рис.1).

Таким образом, при культивировании СКЖТ в среде AdvanceSTEM™ (HyClone)/Antibiotic/Antimycotic Solution ЮОх (HyClone) в сочетании с AC крови пациента клетки демонстрируют характерные для мезенхимальных стволовых клеток мультипотентные свойства.

Л i с -г- ■:

"-'-А,'-; ц г , Л»-'- i

Рисунок 1. Индукция дифференцировки стромальных клеток жировой ткани, культивированных в среде AdvanceSTEM ™ (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution ЮОх (HyClone) с добавлением аутологичной сыворотки крови пациентов, в адипоцитарном (А), хондрогенном (Б), остеогенном (В) и эндотелиальном (Г) направлениях.

5,Оценка пролиферативной активности стромальных клеток жировой ткани в условиях индукции остеогенной дифференцировки при культивировании в среде AdvanceSTEM™ с аутологичной сывороткой.

Остеогенную дифференцировку через 7 дней наблюдали только в культуре СКЖТ, культивированных в AdvanceSTEM|М с добавлением АС. Во всех остальных случаях (AdvanceSTEM™ с 10% ФБС, DMEM с 10% АС и DMEM с 10% ФБС) отчетливые признаки остеогенной дифференцировки появлялись только на 21 день. Кроме того, только в условиях культивирования AdvanceSTEM™ с 10% АС в культуре сохранялся высокий уровень пролиферации при индукции остеогенной дифференцировки.

6. Анализ способности СКЖТ адгезировать на «КоллапАн-Г» и ГАП. Создание тканеинженерных конструкций. Полученные с использованием флуоресцентного стереомикроскопа и сканирующего электронного микроскопа результаты свидетельствуют о том, что клетки адгезируют на ГАП, однако, большое их количество остается в суспензии даже после культивирования в течение суток в присутствии носителя (Рис.2А, Б).

15

КолпапАн-Г (X 2,2)

Рисунок 2. Стромальные клетки жировой ткани, меченные прижизненным красителем РКН-26, на носителях ГАП и КоллапАн-Г. А - световая микроскопия, Б, В - флуоресцентная микроскопия, Г — сканирующая электронная микроскопия. Масштабный отрезок 1мм (А, Б, В) и ЮОрш (Г).

При использования «КоллапАн-Г» в качестве носителя было показано, что клетки адгезируют существенно лучше, чем на ГАП, и равномерно распределяются по всей поверхности носителя (Рис.2В, Г). Культивирование СКЖТ в присутствие остеогенных носителей «КоллапАн-Г» или ГАП позволило создать тканеинженерные конструкции, пригодные для использования в клинике.

Результаты клинических исследований и обсуждение.

В случае введения пациентам тканеинженерных конструкций, как на основе СКЖТ и «КоллапАн-Г», так и состоящих из СКЖТ и ГАП, на дентальных объемных томографиях и при гистологическом анализе отмечалось выраженное формирование молодой кости. При использовании тканеинженер-ной конструкции на основе СКЖТ и ГАП у пациентов была выявлена неоднородность сформированной кости, которая определялась при дентальной объемной томографии (Рис.3) и визуализировалась во время установки им-плантатов (усилие при установке 25-ЗОН/мм2) и забора костных блоков для гистологического исследования (Рис.4а).

{ 11 -' 1 д. 1 * Т I X 1

1 • ► а^г* | 'лике* | ** [' ^¡г Г ¿лЛ.,1.......А......;.. .1.. I..... ч 11 ; 4' ж ...............1

Рисунок 3 Дентальная объёмная томография пациента 3 месяца после операции двухсторонний синуслифтинг. Слева увеличение высоты костной ткани произведено за счет подсадки стромапьных клеток жировой ткани на носителе-ГАП, справа с использованием стромальных клеток жировой ткани на КоллапАн-Г.

Из данных литературы известно, что при замещении костных дефектов с использованием ГАП этот остео пластический материал может до конца не резорбироваться и оставаться во вновь формирующейся кости продолжительное время, что снижает ее однородность (А.Ю.Дробышев, 2001).

Однако отмечалось наличие участков полной резорбция ГАП (Рис. 4Б), что свидетельствует о том, что присутствие СКЖТ в зоне формирующейся кости способствует резорбции ГАП. Помимо формирующейся костной ткани в зоне введения тканеинжинерных конструкций на основе СКЖТ и «КоллапАн-Г», СКЖТ и ГАП наблюдался активный ангиогенез с формированием мелких капилляров и крупных зрелых сосудов (Рис.4, 5), что, по-видимому, обусловило быстрое заживление операционных ран во всех случаях.

- .и.: .

• & '

Вййг"г г 9и

Рисунок 4. Декальцинированные криосрезы биопсий, полученных после введения тканеинженерной конструкции на основе стромальных клеток жировой ткани и ГАП. Иммуногистохимическое окрашивание антителами С031, выявляющими сосуды; препараты докрашены гематоксилином, эозином.Звездочками отмечены участки нерезорбированного ГАП, черными стрелками - вновь сформированные костные трабекулы, краснымистрелками -сосудистые структуры (коричневое окрашивание). Масштабный отрезок 1 ООцш.

Рисунок 5. Декальцинированные криосрезы биопсий, полученные после введения тканеинженерной конструкции на основе стромальных клеток жировой ткани и «КоллапАн-Г». Иммуногистохимическое окрашивание антителами CD31, выявляющими сосуды; препараты докрашены гематоксилином, эозином. Черные стрелки указывают на вновь сформированные костные трабекулы, красные стрелки - на сосудистые структуры (коричневое окрашивание). Масштабный отрезок ЮОцт.

Таким образом, при использовании в качестве носителя как ГАП, так и

«КоллапАн-Г» гистологически и на ДОТ было отмечено формирование молодой костной ткани, сопровождающееся формированием сосудов и капилляров. Однако, поскольку в ряде случаев был обнаружен нерезервированный ГАП, для дальнейших исследований в качестве носителя был выбран «Кол-лап Ан-Г».

Учитывая данные, полученные другими авторами (J.R.Dudas, К.G.Marra, G.M.Cooper 2006), и базируясь на результатах собственных исследований, нами было установлено, что для улучшения стимуляции регенеративного процесса необходима предварительная дифференцировка СКЖТ в остеоген-ном направлении. В связи с этим было предложено использовать при создании тканеинженерной конструкции сочетание СКЖТ, обладающих, выраженным ангиогенными и антиапоптотическими потенциалом, и СКЖТ. преддифференцированных в остеогенном направлении (в соотношении 1:1), на носителе «КоллапАн-Г».

Мы предположили, что данная комбинированная тканеинженерная конструкция способна увеличить количество сосудов в тканях, за счет присутствия СКЖТ, что в свою очередь должно приводить к улучшению кровотока и уменьшению или исчезновению симптомов ишемии, а так же будет обладать выраженными остеогенными свойствами за счет наличия преддифференцированных в остеогенном направлении СКЖТ, что должно оказывать благоприятное влияние на вторичную стадию остеогенеза и формирование моло-

дой кости. У пациентов, которым вводили тканеинженерную конструкцию, полученную на основе «КоллапАи-Г» и сочетания СКЖТ, культивированных в обычных условиях с СКЖТ, культивированных в остеоиндуктивных условиях в течение 3-х недель, при обследовании через 3 месяца на ДОТ (Рис.6) определялось, что костно-пластический материал рентгенологически не дифференцируется от губчатого вещества собственной кости. При гистологическом исследовании было зафиксировано формирование молодой костной ткани и образование мелких капилляров, артериол и крупных стабильных сосудов, состоящих из всех трех слоев, включая интиму, медию и адвен-тицию (Рис.7), а также значительное уменьшение грануляционной ткани в сравнении с результатами в I и II группах (Рис.4,5) (усилие при установке имплантатов 35-40Н/мм2)

Рисунок 6. Дентальная объёмная томография через 3 месяц после операции, левосторонний синуслифтинг. Регистрируемое слева увеличение высоты костной ткани за счет введения ткане-инженерной конструкции на основе «КоллапАн-Г» и сочетания СКЖТ, культивированных в обычных условияхСКЖТ, культивированных в течение 3-х недель в остеоиндуктивных условиях, в соотношении 1:1.

Рисунок 7. Декапьцинированные криосрезы биопсий, полученных после введения ткане-инженерной конструкции на основе сочетания СКЖТ и СКЖТ, преддифференцированных в остеогенном направлении (в соотношении 1:1), на носителе «КоллапАн-Г» Иммуногистохимическое окрашивание антителами С031; препараты докрашены гематоксилином, эозином. Черные стрелки указывают на вновь сформированные костные трабекулы, красные стрелки - на сосудистые структуры (коричневое окрашивание). Масштабный отрезок ЮОдш.

Подсчет вновь формирующихся сосудов с помощью иммуногистохими-ческого окрашивания при использовании тканеинженерных конструкций показал, что введение пациентам СКЖТ, культивированных в стандартных условиях, с клетками, преддифференцированными в остеогенном направлении, в сочетании с «КоллапАн-Г» достоверно увеличивает количество крупных сосудов (Рис. 8) по сравнению с использованием тканеинженерных конструкций на основе СКЖТ, культивированных в стандартных условиях, в сочетании с ГАП или «КоллапАн-Г». Также наблюдается тенденция к увеличению капилляров и сосудов среднего диаметра при использовании этой же конструкции. Из полученных результатов видно, что использование ткане-инженерной конструкции на основе клеток СКЖТ, культивированных в стандартных условиях, с клетками, преддифференцированными в остеогенном направлении, в сочетании с «КоллапАн-Г» создает оптимальные условия для стимуляции ангиогенеза.

крупные сосуды

-Г+Л-

СКЖТ на носителе ГАП СКЖТ на носителе «КолланАн- сочетание СКЖТ и СЮКТ, Г» прелдифферениированныхя

остеотенно.м направлении (о соотношении 1:1) на носителе « КоллалАн-Г»

Рисунок 8. Подсчет количества капилляров, крупных сосудов и сосудов среднего диаметра формирующихся при введении тканеинженерных конструкций пациенту на основе СКЖТ и остеоин-дуктивных носителей ГАП и «КоллАпан-Г».

А в результате морфометрического анализа формирования костной ткани при использовании тканеинженерных конструкций (Рис.9) было показано, что использование СКЖТ, культивированных в стандартных условиях, с клетками, преддифференцированными в остеогенном направлении, в сочетании с «КоллапАн-Г» достоверно увеличивает содержание формирующейся

20

костной ткани в регенерате по сравнению с использованием тканеинженер-ных конструкций на основе СКЖТ, культивированных в стандартных условиях, в сочетании с ГАП или «КоллапАп-Г». Из полученных результатов можно сделать вывод о том, что использование тканеинженерной конструкции на основе клеток СКЖТ, культивированных в стандартных условиях, с клетками, преддифференцированными в остеогенном направлении, в сочетании с «КоллапАн-Г» является оптимальным.

90

Й8 80

8 70 -

8-

I 60

50 -

£

>5 40

6 30 -

т ?0

Я

о. с 10

СКЖТ на носителе ГАП СКЖТ на носителе «КолланАн-Г»

сочетание СКЖТ и СКЖГ, прсллиффсрепннровапных в ооеогспном направлении (в соотношении 1:1) на и «КолланАн-Г»

Рисунок 9. Оценка формирования костной ткани при введении тканеинженерных конструкций на основе СКЖТ и остеоиндуктивных носителей.

Избыточной пролиферации в зоне введения тканеинженерных конструкций обнаружено не было: на криосрезах, окрашенных К167, маркером, выявляющим пролиферирующие клетки, обнаруживались лишь единичные позитивные клетки (рис. 10А). Эти данные косвенно свидетельствуют о безопасности введения тканеинженерных конструкций на основе СКЖТ: несмотря на активную пролиферацию клеток СКЖТ в культуре, в присутствии остеоиндуктивного носителя и при остеогенной индукции, сколько-нибудь значительной пролиферации клеток в ткани при введении пациентам на момент забора биопсийного материала обнаружено не было. Для сравнения приведены результаты гистологического окрашивания здорового участка кости того же пациента после декальцинации (рис.1 ОБ).

I .

. -' V If .

HiW. ЙКЗ

Рисунок 10. A - Декальцинированный криосрез биопсии, полученный после введения тканеинженерной конструкции на основе СКЖТ и СКЖТ, преддифференцированных в остеогенном направлении (в соотношении 1:1), на носителе «КоллапАн-Г». Иммуногистохимическое окрашивание антителами Ki67; препараты докрашены гематоксилином, эозином. Черная стрелка указывает на Ю67 позитивную клетку (коричневое окрашивание). Б - Декальцинированный криосрез биопсии, полученный из контрольного участка собственной кости пациента. Окрашивание гематоксилином, эозином. Черная стрелка указывает на участок здоровой кости. Масштабный отрезок 100|im.

Таким образом, в результате данного исследования мы установили, что

комбинированная тканеинженерная конструкция, включающая сочетание СКЖТ и СКЖТ, преддифференцированных в остеогенном направлении (в соотношении 1:1) на носителе «КоллапАн-Г» является оптимальной для стимуляции ангиогенеза и репаративного остеогенеза. ВЫВОДЫ

1. Разработана методика выделения, культивирования и подготовки к трансплантации СКЖТ человека с использованием среды AdvanceSTEM™ (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution ЮОх (HyClone) с добавлением 10% сыворотки крови донора жировой ткани (аутологичной сыворотки).

2. Получаемая культура СКЖТ обладает высокой способностью адгезиро-вать к пластику и экспессировать характерные для стромальных клеток поверхностные маркеры PDGFbR, CD 105, CD90, CD49a. Культура СКЖТ обладает мультипотентными свойствами, то есть способностью дифференцироваться в адипоцитарном, остеогенном, хондрогенном и эндотелиальном направлениях.

3. Культура СКЖТ обладает высокой пролиферативной активностью, низким уровнем апоптоза и способна к адгезии на носителях ГАП и «Колла-пАн-Г». Культивирование СКЖТ в присутствие остеогенных носителей

22

«КоллапАн-Г» или ГАП позволило создать тканеинженерные конструкции, пригодные для использования в клинике.

4. Использование тканеинженерных конструкций из СКЖТ и ГАП, СКЖТ и «КоллапАн-Г»для восстановления объема кости у пациентов ускоряет регенерацию костной ткани, но недостаточная однородность и минерализация образуемой кости снижает её прочностные характеристики.

5. Разработана методика индукции дифференцировки стромальных клеток из жировой ткани в остеогенном направлении. Получаемая описанным способом культура СКЖТ обладает более высоким потенциалом дифференцировки в остеогенном направлении, чем культуры, получаемые стандартным способом.

6. Использование комбинированной тканеинженерной конструкции, полученной на основе «КоллапАн-Г» и сочетания СКЖТ, культивированных в обычных условиях, с СКЖТ, культивированных в остеоиндуктивных условиях, достоверно увеличивает содержание формирующейся костной ткани и образование крупных сосудов по сравнению с тканеинженерными конструкциями на основе СКЖТ, культивированных в обычных условиях, в сочетании с ГАП или «КоллапАн-Г». Использование комбинированной тканеинженерной конструкции существенно уменьшает сроки регенерации и органотипи-ческого восстановления утраченной костной ткани по сравнению с традиционными подходами костной пластики, позволяет сократить сроки реабилитации пациентов, через три месяца возможна установка дентальных импланта-тов.

7. Разработан алгоритм применения методики выделения, культивирования СКЖТ, сбора тканеиженерных конструкций с использованием СКЖТ в качестве клеточного компонента и клинического применения данных конструкции.

Практические рекомендации

1. Для сокращения сроков органотипического восстановления утраченной

костной ткани у пациентов рекомендована трансплантация в зону костного

23

дефекта комбинированной тканеинженерной конструкции на основе сочетания СКЖТ и СКЖТ, преддифференцированных в остеогенном направлении (в соотношении 1:1), на носителе «КоллапАн-Г».

2. Для получения жировой ткани рекомендовано использовать методику липосакции подкожной жировой клетчатки из передней брюшной стенки справа и слева от белой линии живота без ее повреждения.

3. Учитывая особенности выделения, хранения и транспортировки жировой ткани, а так же особенности трансплантации тканеинженерных конструкций рекомендовано проведение данных манипуляций в специализированных клиниках хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. К.А. Рубина, В.Ю.Сысоева, И.Ю. Чаусская, Н.И. Калинина, А.Ю. Дро-бышев, Разработка технологии выделения и культивирования аутологичных стромальных клеток жировой ткани для увеличения объема утеренного костного субстрата.// Тезисы докладов и сообщений, представленных на всероссийский симпозиум по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» СПб. 2009(12-14 октября). С. 783-784

2. И.Ю. Чаусская, А.Ю. Дробышев, К.А. Рубина, Применение композиции аутогеннйх стромальных клеток и гидроксиапатита для восстановления объема альвеолярного отростка/части верхней и нижней челюстей.// Сборник тезисов IV Всероссийского симпозиума с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» СПб. 2010(21-22 апреля). С. 290-291.

3. А.Ю. Дробышев, К.А. Рубина, В.Ю. Сысоева, Н.И. Калинина, O.A. Григорьева, A.B. Мелерзанов, С.А.Румянцев, И.Ю. Чаусская Клиническое исследование применения тканеинжинерной конструкции на основе аутологичных стромальных клеток из жировой ткани у пациентов с дефицитом костной ткани в области альвеолярного отростка верхней челюсти и альвеолярной части нижней челюсти. Научно-практический журнал «Вестник экспериментальной и клинической хирургии. - 2011. - Том IV,№4. - С. 767-775.

Отпечатано в РИО МГМСУ 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20, стр. 1. Заказ № 1018. Тираж 100 экз.

Актуальность исследования.

Актуальной проблемой стоматологии и челюстно-лицевой хирургии является поиск наиболее эффективных средств и методов костной пластики, создающих оптимальные условия для репаративного остеогенеза.

При восстановлении костной ткани большое значение имеет вторая стадия репаративной регенерации, заключающаяся в пролиферации и остеогенной дифференцировке собственных стромальных клеток, формировании клеток остеобластического ряда, образующих костную ткань (А.А.Кулаков, А.С.Григорян, 2007). Поэтому одной из актуальных задач в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии является создание необходимого количества стромальных клеток, условий для их остеогенной дифференцировки и доставки в зону регенерации. Тканевая инженерия решает данную задачу путем создания тканеинженерных конструкций на основе стромальных клеток из разных источников и остеогенного носителя для дальнейшей трансплантации их в зону дефекта.

ТТрпрттртгхт/тнт-тлд г/ггхпиигл тттта пптт\щрн1ла ртпгшятп.нму ь-пртт/

-А. X А XX X Л А. АХ V/ 111 / у ■ ' ■ 11^1. ^ XXX 1/1 V X V/ 111М^11«111/1/ V IV./ X V X V IV является жировая ткань. Известно, что в жировой ткани человека сконцентрирована популяция мультипотентных фибробластоподобных клеток мезенхимального происхождения (СКЖТ), экспрессирующих маркеры стволовых клеток СБ 105, СБ73, СЭ90 и способных дифференцироваться в нескольких направлениях, в том числе в остеогенном и эндотелиальном (АкИаш! О. е1 а1., 1992; 81а81ю\уег М. е1 а1., 1999; Бо1штс1 е1 а1., 2006). Наиболее важным преимуществом стромальных клеток из жировой ткани является то, что они могут быть выделены в большем количестве, с минимальными болезненными ощущениями для пациента. Стромальные клетки из жировой ткани хорошо адгезируют к пластику и пролиферируют, что позволяет при относительно небольшом сроке культивирования получить достаточное для трансплантации количество клеток (гик Р.А. е1 а1., 2002; ЯеИтап I. & а1., 2004; Р1апа1-Вепагс1 V. & а1., 2004). Перечисленные свойства этих клеток позволяют предполагать, что использование аутологичных стромальных клеток жировой ткани в сочетании с остеогенным носителем способно ускорить образование полноценного костного регенерата, что особенно важно для пациентов со значительными по размеру дефектами. Цель исследования.

Обосновать и разработать технологию создания и применения тканеинженерных конструкций на основе аутологичных стромальных клеток из подкожной жировой клетчатки и остеогенного носителя для регенерации костной ткани у пациентов с атрофией и дефектами альвеолярных отростков/частей верхней и нижней челюстей. Задачи исследования.

1. Разработать методику выделения, культивирования и подготовки к трансплантации аутологичных стромальных клеток из жировой ткани пациентов.

2. Охарактеризовать экспрессию поверхностных маркеров аутологичных стромальных клеток из жировой ткани.

3. Изучить жизнеспособность и способность аутологичных стромальных клеток из жировой ткани к адгезии на носителях (ГАП и «КоллапАн-Г»).

4. Оценить влияние аутологичных стромальных клеток из жировой ткани на носителях (ГАП и «КоллапАн-Г») на динамику заживления костного дефекта челюстей у людей.

5. Разработать методику индукции дифференцировки стромальных клеток из жировой ткани в остеогенном направлении.

6. Исследовать влияние тканеинженерных конструкций на основе аутологичных стромальных клеток из жировой ткани и стромальных клеток из жировой ткани, индуцированных в остеогеогенном направлении, в сочетании с остеогенным носителем на морфологию формирующейся костной ткани в динамике при замещении костных дефектов челюстей людей.

7. Разработать алгоритм применения данной методики в клинической практике.

Научная новизна.

Впервые разработана методика выделения, культивирования и подготовки к трансплантации стромальных клеток жировой ткани человека с использованием среды AdvanceSTEM™ (среда для поддержания роста недифференцированных мезенхимальных стромальных клеток) с добавлением аутологичной сыворотки крови пациента. Для создания тканеинженерных конструкций использовали: 1. стромальные клетки жировой ткани, культивированные в среде AdvanceSTEM™ с аутологичной сывороткой (АС), для получения культуры, обладающей регенеративным потенциалом и способностью стимулировать рост сосудов; 2. впервые использовали смесь стромальных клеток жировой ткани, культивированные в среде AdvanceSTEM™ с аутологичной сывороткой (АС), со стромальными клетками жировой ткани, культивированными в остеоиндуктивных условиях в течение 3-х недель. Смесь культивированных стромальных клеток жировой ткани в дальнейшем инкубировали в присутствии остеогенных носителей «КоллапАн-Г» или ГАП для создания тканеинженерных конструкций, пригодных для использования в клинике.

Впервые проводилась оценка эффективности применения тканеинженерных конструкций, полученных на основе аутологичных стромальных клеток жировой ткани, выращенных с использованием аутологичной сыворотки крови пациента и остеогенного носителя при восстановлении объема костной ткани у пациентов с дефектами и атрофией альвеолярных отростков/частей верхней и нижней челюстей. Практическое значение.

1. Проведенные исследования позволили разработать методику создания и применения тканеинжинерных конструкций на основе стромальных клеток жировой ткани в клинической практике.

2. Доказана, эффективность использования тканеинженерных конструкций на основе аутологичных стромальных клеток из жировой ткани и стромальных клеток из жировой ткани, индуцированных в остеогеогенном направлении, в сочетании с «КоллапАн-Г» в качестве носителя при замещении костных дефектов челюстей пациентов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработана методика культивирования стромальных клеток жировой ткани с использованием среды для поддержания роста недифференцированных мезенхимальных стромальных клеток с добавлением аутологичной сыворотки крови пациента.

2. Создана и оптимизирована тканеинженерная конструкция на основе стромальных клеток жировой ткани, культивированные в среде Ас1уапсе8ТЕМ™ с аутологичной сывороткой (АС) и на основе комбинации стромальных клеток жировой ткани, культивированные в среде АсЬ/апсеБТЕМ™ с аутологичной сывороткой (АС), с стромальными клетками жировой ткани, культивированными в остеоиндуктивных условиях.

3. Результаты использования созданных тканеинженерных конструкций в клинике для восстановления объема кости альвеолярных отростков/частей верхней и нижней челюстей.

Апробация работы

Работа апробирована 1 июля 2011г на совместном заседании кафедр госпитальной хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии ФПДО, кафедра ортодонтии и детского протезирования (протокол №19)

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа проиллюстрирована 48 рисунками и 2таблицами. Библиография включает работ 171 работ, из которых 68отечественных и 103 зарубежных авторов.

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика выделения, культивирования и подготовки к трансплантации СКЖТ человека с использованием среды AdvanceSTEM™ (HyClone)/ Antibiotic/Antimycotic Solution ЮОх (HyClone) с добавлением 10% сыворотки крови донора жировой ткани (аутологичной сыворотки).

2. Полученная культура СКЖТ обладает высокой способностью адгезировать к пластику и экспессировать характерные для стромальных клеток СКЖТ поверхностные маркеры PDGFbR, CD 105, CD90, CD49a. Культура СКЖТ обладает мультипотентными свойствами, то есть способностью дифференцироваться в адипоцитарном, остеогенном, хондрогенном и эндотелиальном направлениях.

3. Полученная культура СКЖТ обладает высокой пролиферативной активностью, низким уровнем апоптоза и способна к адгезии на носителях ГАП и «КоллапАн-Г». Культивирование СКЖТ в присутствие остеогенных носителей «КоллапАн-Г» или ГАП позволило создать тканеинженерные конструкции, пригодные для использования в клинике.

4. Использование тканеинженерных конструкций на основе СКЖТ и ГАП, СКЖТ и «КоллапАн-Г» для восстановления объема кости у пациентов стимулирует регенерацию костной ткани, которая характеризуется недостаточной однородностью и минерализацией.

5. Разработана методика индукции дифференцировки стромальных клеток из жировой ткани в остеогенном направлении. Получаемая описанным способом культура СКЖТ обладает более высоким потенциалом дифференцировки в остеогенном направлении, чем культуры, получаемые стандартным способом.

6. Использование комбинированной тканеинженерной конструкции, полученной на основе «КоллапАн-Г» и сочетания СКЖТ, культивированных в среде AdvanceSTEM™ с АС, с СКЖТ, культивированных в остеоиндуктивных условиях, достоверно увеличивает содержание формирующейся костной ткани в регенерате и стимулирует образование кровеносных сосудов по сравнению с тканеинженерными конструкциями на основе СКЖТ, культивированных в среде АёуапсеБТЕМ™ с АС, в сочетании с ГАП или «КоллапАн-Г». Использование комбинированной тканеинженерной конструкции приводит к органотипическому восстановлению утраченной костной ткани, что делает возможным установку дентальных имплантатов через 3 месяца и позволяет сократить сроки реабилитации пациентов.

7. Разработан алгоритм создания тканеиженерных конструкций и их клинического применения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для сокращения сроков органотипического восстановления утраченной костной ткани у пациентов рекомендована трансплантация в зону костного дефекта комбинированной тканеинженерной конструкции на основе сочетания СКЖТ, культивированных в стандартных услвоиях, и СКЖТ, преддифференцированных в остеогенном направлении (в соотношении 1:1), на носителе «КоллапАн-Г».

2. Для получения жировой ткани рекомендовано использовать методику липосакции подкожной жировой клетчатки из передней брюшной стенки справа и слева от белой линии живота без ее повреждения.

3. Учитывая особенности выделения, хранения и транспортировки жировой ткани, а так же особенности трансплантации тканеинженерных конструкций рекомендовано проведение данных манипуляций в специализированных клиниках хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии.