Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Кардио- и эндотелиопротекторные эффекты производных 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата

На правах рукописи

005016832

ХАРИТОНОВА Ольга Владимировна

КАРДИО- И ЭНДОТЕЛИОПРОТЕКТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ ПРОИЗВОДНЫХ 3-(2,2,2-ТРИМЕТИЛГИДРАЗИНИЯ) ПРОПИОНАТА

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 о;.;;.;; ш

Белгород - 2012

005016832

Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Минобрнауки РФ

Научный руководитель Даниленко Людмила Михайловна

кандидат фармацевтических наук

Официальные оппоненты: Шапошников Андрей Александрович

доктор биологически наук, профессор, ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Минобрнауки РФ, заведующий кафедрой биохимии и фармакологии

Резников Константин Михайлович

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, ГБОУ ВПО «Воронежская государственная медицинская академия им. H.H. Бурденко» Минздравсоразвития РФ, заведующий кафедрой фармакологии

Ведущая организация ГБОУ ВПО «Курский государственный

медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ

Защита состоится « 34у> ¡ЛССМ 2012 г. в « » часов на заседании совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.015.13 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, д.85

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Автореферат разослан » ¿Й/г/?£¿/2012 г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук,

доктор биологических наук 1. В.И. Кочкаров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В настоящее время в современной кардиофармакологии продолжается поиск новых эффективных методов защиты миокарда от ишемического и реперфузионного повреждения, в том числе и средств, позволяющих сохранить структуру и функции кардиомиоцитов в условии ишемии и предотвратить дисфункцию эндотелия как самостоятельной мишени терапевтического воздействия при сердечно-сосудистых

заболеваниях.

В то же время, последнее десятилетие в экспериментальной кардиофармакологии было ознаменовано активным поиском и изучением механизмов эндогенной кардиоцитопротекции. В числе таких воздействий, существенно повышающих толерантность миокарда к ишемическому и реперфузионному повреждению, находится феномен ишемического прекондиционирования (ИП) миокарда. Состояние прекондиционирования возникает после создания нескольких кратковременных эпизодов ишемии / реперфузии, предшествующих длительной ишемии. Зарегистрированы инфарктлимитирующий, антиаритмический и эндотелиопротективный эффекты прекондиционирования миокарда (Петрищев H. Н. и соавт, 2001; Yellon D. M., Downey J. M., 2003).

В последние годы рядом авторов описано и так называемое межорганное или дистанционное ишемическое прекондиционирование (ДИП) (Liem D.A. et al., 2002; Tapuria N. et. al., 2008; Walsh R.S. et. al., 2009). Оно заключается в том, что степень ишемического повреждения сердца значительно снижается, если повреждению предшествует ишемия/реперфузия отдаленных органов. Так, ишемия конечности вызывает ИП и уменьшает зону инфаркта миокарда (Kharbanda R.K. et al., 2002; Birnbaum Y. et. al., 2007).

Изучение механизмов раннего и позднего ишемического прекондиционирования указывает на то, что ИП развивается через триггеры и медиаторы, которые могут быть имитированы фармакологическими агентами и таким путем стимулированы полезные эффекты ишемического прекондиционирования без эпизодов ишемии. Сокращение ишемического повреждения фармакологическими препаратами, имитирующими эндогенную контришемическую защиту, может оказаться важным в клинической практике.

Исследований, посвященных применению 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата при сердечно-сосудистых заболеваниях достаточно. Общеизвестно, что 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионат приводит к ограничению потока жирных кислот через мембраны митохондрий и защищает клетку от гибели в условиях кислородного голодания (Тепляков А.Т., 2003; И.Я. Калвиньш 2004), однако, до сих пор не изучался вопрос о его возможности прекондиционировать миокард.

Анализируя стадию реализации защитных эффектов по типу прекондиционирования, многие исследователи обращают внимание на значительную роль АТФ-зависимых калиевых каналов (КАтФ-каналы) (O'Rourke В., Lin Y.F. et al., 2004; Raval A.P. et al., 2007). Реализацию их защитного потенциала связывают с гиперполяризацией мембраны вследствие

их открытия, активацией системы оксида азота, антиапоптическими механизмами (ТакавЫ е1 а1., 2000; Ноэвтапп К.А., 2006). Каналы этого типа располагаются на плазматической мембране нервных клеток, на внутренней мембране митохондрий, широко представлены в эндотелии.

Кроме того, установлено, что 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионат обладает кардио- и эндотелиопротекторными эффектами, а также возможно усиление этих эффектов за счет введения в структуру его молекулы новых функциональных групп, а именно остатка никотиновой кислоты, гиполипидемические и вазоактивные свойства которой общеизвестны.

Таким образом, сведения о противоишемическом, эндотелио-и кардиопротекторном эффекте 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата и его производных (никотинат (СТК-733), 5-бромникотинат (СТК-734), 5-гидроксиникотинат (СТК-735), глицинат (СТК-61К) 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата калия) позволят раскрыть перспективу их применения в качестве высокоэффективных лекарственных средств, и тем самым, улучшения существующих методов лечения сердечно-сосудистых заболеваний.

Цель исследования: оценить эффективность фармакологического прекондиционирования с помощью 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата и провести сравнительную характеристику противоишемической, эндотелио-и кардиопротекторной активности 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата с некоторыми его производными.

Задачи исследования:

1. В эксперименте изучить сравнительные количественные характеристики эффектов локального и дистантного ишемического прекондиционирования по значениям функциональных, биохимических и планиметрических оценок коронарооклюзионного инфаркта миокарда.

2. Исследовать противоишемические эффекты 3-(2,2,2-триметилгидра-зиния) пропионата при коронароокклюзионном инфаркте миокарда в эксперименте.

3. Изучить пути реализации эффектов 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата по механизму ишемического прекондиционирования при моделировании коронароокклюзионного инфаркта миокарда в эксперименте.

4. Исследовать противоишемическию эффективность производных 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата в сравнении с 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионатом при моделировании коронароокклюзионного инфаркта миокарда.

5. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата и его производных при моделировании дефицита оксида азота в эксперименте.

Научная новизна. В работе впервые показано, что положительный эффект противоишемического действия 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата, обусловлен действием на митохондриальные Кдтф каналы, эндотелиальную (еМОБ) и индуцибельную (¡N08) - N0 синтазы. Впервые показано, что механизм реализации кардиопротективного действия 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата обусловлен влиянием на нитроксидэрги-

ческую систему и КдтФ-каналы. Это позволяет рассматривать альтернативный механизм кардиопротективного действия 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата, связанный с реализацией механизмов фармакологического прекондиционирования.

Впервые в сравнительном аспекте исследовано противоишемическое, зндотслио- и кардиопротекторное действие 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата и его производных на модели коронароокклюзионного инфаркта миокарда у кроликов и Ь-ЫАМЕ индуцированного дефицита N0 у крыс.

Практическая значимость. В работе экспериментально обоснована эффективность применения фармакологического прекондиционирования с помощью 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата для профилактики и коррекции ишемических нарушений в миокарде.

Показано, что производные 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата (СТК-733, СТК-734, СТК-735, СТК-61К) обладают выраженной противоишемической, кардио- и эндотелиопротективной активностью, а также положительно влияют на динамику морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр кардиомиоцита, прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением, адренореактивность).

Полученные данные позволяют рекомендовать проведение доклинических исследований новых производных 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата, с целью возможности разработки высокоэффективных препаратов для лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний сопровождающихся эндотелиальной дисфункцией.

Внедрение результатов научных исследований. Результаты диссертационного исследования, используются в лекционных курсах кафедры фармакологии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, кафедры фармакологии и фармацевтических дисциплин Института последипломного медицинского образования ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет».

Положения, выносимые на защиту.

1. 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионат уменьшает величину зоны некроза при моделировании коронароокклюзионного инфаркта миокарда. Блокада КАтФ-каналов глибенкломидом, неселективная блокада еМОБ с помощью Ь-ЫАМЕ, селективная блокада ¿N08 с помощью аминогуанидина полностью нивелируют корригирующий эффект 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата, сходный с механизмом ИП.

2. 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионат, оказывает эндотелио- и кардиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита N0, выражающееся в уменьшении КЭД, снижении адренореактивности, предотвращении исчерпания миокардиального резерва, нормализации биохимических маркеров, морфологических показателей, которые реализуются по механизму дистантного ишемического прекондиционирования с вовлечением КАтФ-каналов, еЫОЗ и ¡N08.

3. Производные 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата оказывают выраженное противоишемическое действие при моделировании

коронароокклюзионного инфаркта миокарда у кроликов, эндотелио- и кардиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита NO у крыс по сравнению с 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионатом. Максимальный эффект достигается при использовании субстанции СТК 735, что выражается наиболее значимым снижением КЭД, улучшением показателей сократимости при проведении нагрузочных проб, уменьшением диаметра кардиомиоцитов.

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и международных конференциях молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность» ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Курск, 2010; 2011), XVII национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010), V национальном конгрессе «Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология» (Санкт-Петербург, 2010), III Всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученые «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» (Волгоград, 2011).

Апробация диссертации проведена на межкафедральной научной конференции кафедр фармакологии и фармацевтических дисциплин Института последипломного медицинского образования ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», фармацевтической химии и фармакогнозии, биохимии и фармакологии, фармацевтической технологии и управления экономики здравоохранения, анатомии и гистологии человека, медико - биологических дисциплин ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, 3 из них - в изданиях, рекомендуемых ВАК Минобрнауки РФ.

Личный вклад автора. Личный вклад автора состоит в проведении анализа отечественных и зарубежных источников по теме диссертационного исследования, непосредственном участии в получении исходных данных, постановке эксперимента, личном участии в апробации результатов исследования, статистической обработке и обсуждении экспериментальных данных, подготовке основных научных публикаций по теме выполненной работы.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментальных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 182 источника, из них 64 отечественных и 118 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 130 страницах машинописи, содержит таблиц - 3, рисунков - 33, формул -2, схем-4.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперимент выполнен на 70 крысах линии Wistar массой 200-220 г, 84 кроликах массой 2-2,2 кг.

В ходе эксперимента животные содержались в условиях стандартной экспериментальной биологически чистой комнаты, температура воздуха

составляла 22-24 °С, освещение - 12ч/12ч светлый/темный цикл, крысы получали гранулированный корм и фильтрованную водопроводную воду.

Фармакологическое прекондиционирование осуществляли с помощью внутривенного введения 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата.

Максимальная суточная доза 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата (Милдронат®, производства «GRINDEX», Латвия) для человека массой 70 кг равна 1000 мг. В эксперименте дозу препарата пересчитывали по общепринятой формуле межвидового переноса доз по Freireich М. Et al. и Улановой И.П., что составило 90 мг/кг для крыс, затем вводили внутрибрюшинно экспериментальным животным для оценки эндотелио- и кардиопротективной активности препарата, и 40 мг/кг для кроликов, вводили внутривенно при изучении противоишемической активности. Расчет доз производных 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата производили с учетом молярной массы 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата, исходя из количества вещества -0,616 моль при расчетах доз для крыс, которые составили СТК 733 -189,0 мг/кг, СТК 734 - 237,3 мг/кг, СТК 735 - 199,1 мг/кг, СТК 61К -159,6 мг/кг. В случае кроликов количество вещества составило 0,274 моль, а дозы соответственно СТК 733 - 84,1 мг/кг, СТК 734 - 105,5 мг/кг, СТК 735 -88,5 мг/кг, СТК 61К - 71,0 мг/кг.

Изучение влияния ДИП и фармакологического прекондиционирования на размер зоны некроза проводили на модели коронароокклюзионного инфаркта миокарда у кроликов (Himory et al., 1989).

Локальное ишемическое прекондиционирование (ЛИП) моделировали путем трех периодов временной окклюзии левой коронарной артерии на 2 и 5 минут в чередовании с периодами реперфузии. ДИП осуществляли путем наложения жгута на верхнюю треть бедра на 10 минут с последующей 20 минутной реперфузией и моделированием патологии. Контролем правильности наложения жгута служило отсутствие пульса на артериях голени.

Производные 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата (лабораторные шифры СТК 733, СТК 734, СТК 735 и СТК 61К), синтезированные Всероссийским научным центром по безопасности биологически активных веществ (ВНЦ БАВ), г.Купавна, в соответствующих дозах вводили животным за 30 мин до перевязки коронарной артерии, в маргинальную вену уха кролика. Через 30 минут после коронарной окклюзии осуществляли снятие лигатуры и проведение реперфузии миокарда в течение 90 мин.

После этого осуществляли забор крови из правого желудочка сердца в одноразовую вакуумную пробирку с антикоагулянтом, для определения специфического маркера повреждения кардиомиоцитов Troponin I (Tnl). Уровень Tnl определяли на иммунофлуоресцентном приборе Triage MeterPro (Biosite, США) с использованием тест-системы Cardiac Panel. Подсчет площадей интактного и некротизированного миокарда левого желудочка производили на каждом из четырех произведенных срезов с помощью попиксельного анализа в программе Adobe Photoshop 9.0. Данные по размерам площади инфаркта представляли в виде отношения некротизированного миокарда к интактному (в процентах).

С целью подтверждения гипотезы о реализации эффектов прекондиционирования через активацию системы синтеза NO и КАТФ- каналы животным вводили L-NAME в дозе 25 мг/кг/сут, глибенкламид в дозе 0,4 мг/кг и аминогуанидин в дозе 100 мг/кг.

Исследование эндотелио- и кардиопротективных эффектов 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата (90 мг/кг) и его производных СТК 733 (189 мг/кг), СТК 734 (237,3 мг/кг), СТК 735 (199,1 мг/кг), СТК 61К (159,мг/кг) проводили при моделировании дефицита оксида азота, L-NAME вводили ежедневно в/б с первых суток эксперимента в дозе 25 мг/кг/сут. На восьмой день от начала эксперимента под наркозом катетеризировали сонную артерию для регистрации гемодинамических показателей; болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в бедренную вену.

Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли непрерывно посредством датчика и компьютерной программы "Biopac Systems, Inc.". Эндотелийзависимая (ЭЗВД) и эндотелийнезависимая (ЭНЗР) сосудистые реакции оценивали посредством проведения функциональных проб с внутривенным введением ацетилхолина (АХ) - 40 мкг/кг (Laursen J.B., 1997) и нитропруссида натрия (НП) - 30 мкг/кг (Галаган М.Е., 1991).

Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца и посредством датчика TSD104A "Biopac Systems, Inc." и компьютерной программы "Biopac Systems, Inc.", США, регистрировали показатели кардиогемодинамики.

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы (Меерсон Ф.З., 1980; Пашин E.H., 1993).

В качестве биохимических маркеров ЭД определяли концентрацию в сыворотке крови нитратов и нитритов, с использованием модифицированного метода определения стабильных метаболитов NO. Исследование проводилось по общепринятой методике (Метельская В.А., Туманова Н.Г., 2005).

Патоморфологическую оценку проводили по морфометрическим показателям поперечного сечения кардиомиоцитов. Изучение микропрепаратов, фотопротоколирование и морфометрия осуществлялись с помощью микроскопа Leica DM4000B, оснащенного системой видеорегистрации и программным обеспечением для архивирования и анализа изображений Leica Application Suite Version 3.8.0.

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли в программе Microsoft Excel версии 7.0 при помощи средств пакета анализа. «Описательная статистика» применялась для нахождения среднего значения (М) показателей и ошибки среднего (т). «Двухвыборочный t-тест с различными дисперсиями» использовался для сравнения соответствующих показателей в различных группах животных и определения достоверности различий между ними. Статистически значимыми считали различия при значениях двустороннего р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Влияние исследования 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата, локального и дистантного ишемического прекондиционирования на величину зоны некроза при моделировании коронарооклюзионного инфаркта миокарда.

Наложение лигатуры на нисходящую ветвь левой коронарной артерии в контрольной группе животных приводило к развитию некроза миокарда левого желудочка, размер которого составил 26,6±1,2 % (рис.1).

зо.о

25,0

20,0

15,0

5,0

О,О

мц

дип

Конт роль

Рис. 1. Влияние применения милдроната, локального и дистантного прекондиционирования на относительную величину зоны некроза (%), при моделировании коронарооклюзионного

инфаркта миокарда.

Примечание. Здесь и далее: МД - милдронат, ЛИП - локальное ишемическое прекондиционирование, ДИП - дистантное ишемическое прекондиционирование. *-р<0,05 в сравнении с контролем.

ЛИП осуществляли путем пережатия левой коронарной артерии за 30 минут до моделирования инфаркта миокарда, ДИП реализовывали пережатием бедренной артерии, фармакологическое прекондиционирование -внутривенным введением 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата в дозе 90 мг/кг за 30 минут до моделирования коронароокклюзионного инфаркта миокарда, что приводило к достоверному уменьшению площади некротизированного миокарда (рис.1).

Затем проводили определение уровня Тп1, который характеризует степень повреждения сердечной мышцы при инфаркте миокарда, являясь специфичным и высокочувствительным показателем. Уровень Тп1 в исследуемых группах составил: в группе контроля 16,3±0,2, МД - 12,2±0,8, ЛИП - 5,2±0,4, ДИП -4,6±0,3 (нг/мл) (р<0.05).Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что ЛИП, ДИП и фармакологическое прекондиционирование 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионатом демонстрируют

противоишемические свойства, при этом значения ЛИП и ДИП сопоставимы, показатель фармакологического прекондиционирования несколько выше, однако достоверно, в сравнении с группой контроля, оказывает выраженный терапевтический эффект.

/

2. Влияние блокады МО-синтазы и АТФ-зависимых калиевых каналов на эффекты 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата и дистантного ирекондициоиирования при моделировании коронароок-клюзионного инфаркта миокарда.

Неселективная блокада эндотелиальной (еТМОЗ) ЫО-синтазы с помощью в/в введения Ь-ИАМЕ в дозе 25 мг/кг и селективная блокада индуцибельной >Ю-синтазы (¡N08) с помощью в/в введения в дозе 100 мг/кг аминогуанидина на фоне моделирования инфаркта миокарда, применения 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата и ДИП привела к блокированию эффектов ишемического и фармакологического прекондиционирования.

Контроль МЦ ДИП ИМАМЕ АМ ГБ

■ Контроль т МД И ДИП

Рис. 2. Влияние блокады е>105 и ¡N08 КО-синтаз и АТФ-зависимых калиевых каналов на эффекты милдроната и дистантного прекондиционирования при моделировании коронароокклюзионного инфаркта миокарда (%).

Примечание. Ь-ИАМЕ - Ы-нитро-Ь-аргинин метиловый эфир, АМ -аминогуанидин, ГБ- глибенкламид; *-р<0,05 в сравнении с контролем.

Величина зоны некроза в группе животных, получавших Ь-ЫАМЕ и 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата на фоне моделирования инфаркта миокарда, составила 23,5±1,2%, в группе животных, получавших Ь-ЫАМЕ и ДИП, - 22,5±0,8%, аминогуанидин и 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата -26,3±2,9%, аминогуанидин и ДИП - 23,0±2,0% (р<0,05) (рис. 2).

Блокирование КАтФ-каналов с помощью внутрибрюшинного введения глибенкламида дозе 0,4 мг/кг на фоне моделирования инфаркта миокарда, применения 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата и ДИП привела к нивелированию эффектов ишемического и фармакологического прекондиционирования. Величина зоны некроза в группе животных, получавших глибенкламид и 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата на фоне моделирования инфаркта миокарда, составила 32,6±1,8%, а в группе ДИП+глибенкламид 23,5±1,8% (р<0,05) (рис.2). Уровень Тп1 в вышеупомянутых группах составил 14,6±0,6 и 17,3±0,7 нг/мл (р<0,05) соответственно.

3.Влияние производных 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата на величину зоны некроза при моделировании коронарооклюзионного инфаркта миокарда.

Полученные данные о противоишемическом эффекте производных 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата в отношении ограничения некротизированного участка отчетливо показали, что все субстанции оказывают противоишемический эффект преобладающий или сопоставимый с препаратом сравнения (рис.3). Наиболее выраженный противоишемический эффект, максимально снижающий размера зоны некроза, выявлен у субстанции СТК 735 - 13,Ш,4 % (р<0,05).

% /1 30,0 ^^

25,0 ' 3

||11|||__*__*_____

20,0 Ь ЕЯ * ,7 0*

^ ^ ^^^---^-^^—^-т---

Контроль МД СТК 733 СТК 734 СТК 735 СТК 61К

■ Контроль н МД □ СТК 733 03 СТК 734 0СТК735 П СТК 61К I Рис. 3. Влияние милдроната и его производных СТК-733, СТК-734, СТК-735, СТК-61К, на относительную величину зоны некроза (%), при моделировании коронарооклюзионного

инфаркта миокарда.

Примечание.*-р<0,05 в сравнении с контролем.

В ходе исследования уровня концентрации Тп1, были получены следующие результаты: так, минимальные значения были достигнуты у субстанций СТК-735 6,1 ±0,5 нг/мл, несколько выше СТК-734 6,6±0,4 нг/мл и СТК-61К 7,7±0,7 нг/мл, максимальные значения у СТК 733 10,2±0,8 нг/мл (р<0,05).

4. Исследование эндотелио- и кардиопротективной активности 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата и его производных при Ь^АМЕ-индуцированном дефиците N0 с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований

Внутрибрюшинное введение крысам - самцам Ь-ЫАМЕ в дозе 25 мг/кг/сутки однократно в течение 7 суток приводило к стойкому повышению артериального давления (АД) до уровня 190,3±6,7/145,0±3,9 (р<0,05). При в/в введении субстанций и 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата стабилизации значений АД не наблюдалось, уровень САД и ДАД был достоверно выше

соответствующих значений интактных животных (137,7±3,7 /101,9±4,3) во всех сериях эксперимента. Однако отмечалась тенденция к его некоторому снижению до значений 180,3±2,9/132,5±5,4 у СТК 735 и 183,1±3,3/125, 1±4,7 СТК 733 (р<0,05) (при сравнении с интактными).

■ КонтрольЭь^АМЕи МдН СТК 733 0 СТК 734 И СТК 735 И СТК 61К

Рис. 4. Влияние 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата, СТК-733, СТК-734, СТК-735, СТК-61К на КЭД, усл. ед. (при Ь-МАМЕ-индуцированном дефиците оксида азота.

Примечание. КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции; *-р<0,05 в сравнении с интактными, **-р<0,05 в сравнении с Ь-ЫАМЕ.

При проведении функциональных проб с оценкой развития на эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой вазодилатациии нами использован коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД); являющийся отношением площади эндотелийнезависимой вазодилатации восстановления АД в ответ на введение нитропруссида к площади эндотелийзависимой вазодилатации восстановления АД в ответ на введение ацетилхолина (Покровский М.В. 2006).

В наших экспериментах КЭД в группе интактных животных составил 1,1±0,1, при Ь-ЫАМЕ- индуцированном дефиците оксида азота в 5 раз больше, его значение составило 5,4±0,6 (р<0,05). Терапия 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионатом и его производными во всех группах привела к достоверному снижению этого показателя, что характеризует эндотелиопротективное действие всех исследуемых соединений (рис.4). При этом, КЭД в группах производных 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата значительно ниже чем у препарата сравнения милдроната.

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных с Ь-ЫАМЕ-индуцированным дефицитом оксида азота проводились нагрузочные пробы. Проба на адренореактивность на фоне терапии милдронатом (90 мг/кг)

11

13

I не приводила к снижению цифр ЛЖД и составила 250,8±6,7 мм.рт.ст, в то время как СТК 735 предотвращал развитие адренореактивности до 201,5±4,3 мм.рт.ст. (р<0,05) (рис.5А).

■ Контроль Н Ь^АМЕ Ш МД И СТК 733 0 СТК 734 0 СТК 735 ШСТК61К

Рис. 5. Влияние 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата, СТК-733, СТК-734, СТК-735, СТК-61К на показатели сократимости левого желудочка сердца крыс при проведении пробы

на адренореактивность, мм.рт.ст (А); нагрузку сопротивлением, % (Б); диаметр кардиомиоцитов (В), мкм; суммарная концентрацию нитрит- и нитрат-ионов (Г), мМоль/мл; на фоне 1.-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота.

Примечание. *-р<0,05 в сравнении с интактными, **-р<0,05 в сравнении с Ь-ИАМЕ.

Кардиопротективные эффекты были обнаружены при проведении пробы на нагрузку сопротивлением. Сократимость на 25 секунде нагрузки составила у интактных животных - 83,6±2,1 %. Ь-ЫАМЕ-индуцированная патология -66,0±2,3, Ь-ЫАМЕ + МД - 75,1±3,2, Ь-ИАМЕ + СТК 733 - 74,4±3,9, Ь-КАМЕ + СТК 734 - 72,7±4,1, Ь-ЫАМЕ+ СТК 735- 84,4±2,8, Ь-ЫАМЕ + СТК61 - 69,7± 4,3 (%)(р<0.05) (рис.5Б). Тгким образом, результаты исследования функционального состояния эндотелия сосудов и миокарда при проведении нагрузочных проб выявили отчетливое кардиопротективное действие наиболее активного соединения СТК 735.

Характерная динамика биохимических маркеров представлена на (рис. 5Г). Так, концентрация нитрит-ионов(1\Юх) у животных, получавших L-NAME, составила 61,2±3,6 мМоль/мл (р<0,05), в группе у интактных этот показатель был на уровне 114,1 ±4,1 мМоль/мл. У животных получавших СТК 735, показатель составлял 110,1±3,2 мМоль/л (р<0,05), что несколько выше, чем у всех остальных исследуемых субстанций и милдроната (рис. 5Г).

Результаты исследования демонстрировали, что терапия изучаемыми веществами в разной степени предотвращает развитие гипертрофии кардиомиоцитов (рис. 5В). Так, в группе животных получавших СТК 735 диаметр кардиомиоцитов составил 13,1±0,9 мкм, в то время как данный показатель у животных с патологией равен 18,5±1,1 мкм (р<0,05), у интактных 9,1±1,1 мкм.

Рис. 6. Морфологическая картина миокарда Рис. 7. Морфологическая картина миокарда

крыс в серии, получавшей терапию МД. крыс в серии, получавшей терапию СТК 735.

А - очаговая полихромазия кардиомиоцитов А - умеренное равномерное кровенаполнение

Окр. гематоксилином и эозином. Микрофото. капилляров. Окр. гематоксилином и эозином.

Х400. Микрофото. Х400.

Таким образом, результаты исследования функционального состояния эндотелия и миокарда при проведении нагрузочных проб выявили более отчетливое эндотелио- и кардиопротективное действие у СТК 735, выражающееся в предотвращении увеличения адренореактивности и падения ЛЖД при проведении пробы на нагрузку сопротивлением, увеличение концентрации нитрит-ионов (ИОх) и предотвращение увеличения диаметра кардиомиоцитов по сравнению с животными, у которых моделировали Ь-ЫАМЕ-индуцированный дефицит N0.

Таким образом, в ходе проведенного исследования было выявлено, что ДИП и 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионат обладают выраженным противоишемическим эффектом на модели коронарооклюзионного инфаркта миокарда. КАТФ-каналы являются эффекторным механизмом в реализации противоишемического эффекта действия как ДИП, так и 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионата. N0 выступает как триггер ИП. И в том и другом случае синтез его осуществляется за счет активации ¡N08 и еЖ)8. 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат конкурируя за рецепторы гамма-бутиробетаина (ГББ), снижает концентрацию карнитина, при этом его уровень возрастает. В результате из-за сродства геометрии ГББ к АХ происходит активация эндотелиальных ацетилхолиновых рецепторов, что приводит к индукции синтеза N0.

Проведенные исследования выявили у производных 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата более высокую противоишемическую эффективность в сравнении с милдронатом при моделировании коронароокклюзионного инфаркта миокарда и кардио- и эндотелиопротективную активность при моделировании Ь-ЫАМЕ индуцированного дефицита N0, что дает возможность рассматривать полученные результаты экспериментов как основу для дальнейших исследований этих веществ с целью разработки потенциальных лекарственных препаратов.

Таким образом, полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные доклинические исследования новых производных 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата при сердечно-сосудистых заболеваниях сопровождающихся ЭД.

ВЫВОДЫ

1. Локальное ишемическое прекондиционирование и дистантное ишемическое прекондиционирование за 30 минут до моделирования коронароокклюзионного инфаркта миокарда, приводит к достоверному уменьшению относительной площади некротизированного миокарда до 11,0±0,8% и 9,1±0,5% соответственно, (в контрольной группе животных 26,6±1,2%).

2. Введение 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата в дозе 40 мг/кг достоверно, относительно контрольной группы животных уменьшило распространенность зоны некроза миокарда левого желудочка при моделировании коронароокклюзионного инфаркта миокарда до 20,2±0,3%, (в контрольной группе животных 26,6±1,2%).

3. Предварительная блокада КАТФ-каналов, неселективная блокада еИОБ и селективная блокада ¡N08 полностью нивелируют протекторное действие дистантного ишемического прекондиционирования и 3-(2,2,2-триметилгидра-зиния) пропионата при моделировании коронароокклюзионного инфаркта миокарда. Защитное действие 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата осуществляется за счет активации системы синтеза оксида азота и через КдтФ-каналы. Эффекты 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионата реализуются по механизму, схожему с механизмами дистантного ишемического прекондиционирования.

4. Производные 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата (в дозе СТК 733 -84,1 мг/кг, СТК 734 - 105,5 мг/кг, СТК 735 - 88,5 мг/кг, СТК 61К - 71,0 мг/кг) на модели коронароокклюзионного инфаркта миокарда проявляют выраженное противоишемическое действие, выражающееся в наиболее эффективном уменьшении площади некротизированного миокарда и уменьшении уровня Тп1 в плазме крови, относительно препарата сравнения - милдронат (40 мг/кг).

5. 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионат (90 мг/кг) и его производные (СТК 733 - 189,0 мг/кг, СТК 734 - 237,3 мг/кг, СТК 735 - 199,1 мг/кг, СТК 61К -159,6 мг/кг) проявляют эндотелио- и кардиопротекторное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота, выражающееся в снижении

коэффициента эндотелиальной дисфункции до уровня диапазона 1,6-2,0 у производных и 2,8 у 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата, положительной динамике результатов нагрузочных проб, биохимических и морфологических исследований. Установлен наиболее выраженный эндотелио- и кардиопротекторный эффект среди производных 3-(2,2,2-триметилгидра-зиния) пропионата у СТК 735

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Противовоспалительные эффекты дистантного ишемического прекондиционирования в сочетании с рекомбинантным эритропоэтином / JI.M. Даниленко, М.В. Покровский, ... О.В. Харитонова [и др.] // Научные ведомости БелГУ. - 2011. - № 4, вып. 13/2. - С. 49-53.

2. Изучение противоишемической активности в ряду производных 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата при моделировании коронаро-оклюзионного инфаркта миокарда / JI.M. Даниленко, М.В. Покровский, О.В. Харитонова [и др.] // Научные ведомости БелГУ. - 2011. - № 22, вып. 16/2.-С. 5-8.

3. Эндотелиопротекторное действие милдроната и его производных при моделировании дефицита оксида азота / JI.M. Даниленко, О.В. Харитонова, М.В. Покровский [и др.] // Научные ведомости БелГУ. - 2011. — № 22, вып. 16/2.-С. 58-62.

4. Защитный эффект дистантного прекондиционирования при ишемии миокарда и роль АТФ-зависимых калиевых каналов / JI.M. Даниленко, М.В. Покровский, О.В. Харитонова [и др.] // Современные аспекты разработки и совершенствования состава и технологии лекарственных форм : материалы всерос. науч.-практ. интернет-конф. с междун. участием, Курск, 27 апр. 2011 г. / Курский гос. мед. ун-т ; [редкол.: Т. А. Панкрушева и др.] - Курск, 2011. -С. 47-49.

5. Влияние индуцибельной, эндотелиальной NO-синтазы и АТФ-зависимых калиевых каналов на эффекты 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата и дистантного прекондиционирования при моделировании коронарооклюзионного инфаркта миокарда / К.А. Беляев, A.B. Хаванский, О.В. Харитонова [и др.] // Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии : материалы III всерос. науч.-практ. семинара для молодых ученых. - Волгоград, 2011. - С. 24-25. - (Вестник ВолГМУ. Прил.).

6. Сравнительное исследование противоишемического эффекта 3-(2,2,2-триметилгидразиния) пропионата и его производных при моделировании коронарооклюзионного инфаркта миокарда / О.В. Харитонова, JI.M. Даниленко, М.В. Покровский [и др.] // Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии : материалы III всерос. науч.-практ. семинара для молодых ученых. - Волгоград, 2011. - С. 76-77. - (Вестник ВолГМУ. Прил.).

7. Даниленко, JI.M. Кардиопротективные эффекты эритропоэтина при ишемии/реперфузии миокарда в сочетании с ишемическим прекондиционированием / Л.М. Даниленко, М.В. Покровский О.В. Харитонова [и др.] // Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология : сб. материалов V науч. конгр., [Санкт-Петербург, октябрь 2010 г.] / Проф. мед. Ассоц. клинических фармакологов Санкт-Петербурга. - СПб., 2010. -С. 101-103.

8. Влияние дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэтина на воспаление / Л.М. Даниленко, М.В. Покровский, ... О.В. Харитонова [и др.] // Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология : сб. науч. материалов V конгр., [Санкт-Петербург, октябрь 2010 г.] / Проф. мед. Ассоц. клинических фармакологов Санкт-Петербурга. - СПб., 2010. - С. 98-101.

9. Ацетилизочистозид перспективный флавоноидный гликозид для фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции / C.B. Буравлева, М.С. Брусник, О.В. Харитонова (О.В. Мамонова) [и др.] // Молодежная наука и современность : материалы 75-й всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием, посвящ. 75-летию КГМУ, Курск, 20-21 апр. 2010 г. : в 3 ч. / Центр.-Чернозем, науч. центр. РАМН, Рос. акад. естеств. наук. -Курск, 2010. - Ч. 1. - С.286.

10. Разработка устройства для дистантного прекондиционирования, как новый подход профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний / О.В. Харитонова (О.В. Мамонова), C.B. Буравлева, Л.М. Даниленко [и др.] // Молодежная наука и современность : материалы 75-й всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием, посвящ. 75-летию КГМУ, Курск, 20-21 апр. 2010 г. : в 3 ч. / Центр.-Чернозем. науч. центр. РАМН, Рос. акад. естеств. наук. - Курск, 2010. - Ч. 1. - С. 293-294.

11. Устройство для дистантного прекондиционирования : пат. 97615 Рос. Федерация : МПК7 А16 В17/12 / О.О. Новиков, М.В. Покровский ... О.В. Харитонова (О.В. Мамонова) [и др.]; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «БелГУ». - № 2010110708/22 ; заявл. 23.03.2010 ; опубл. 20.09.2010, Бюл. 26. - 2 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - артериальная гипертензия

АМ - аминогуанидин

АХ - ацетилхолин

АТФ — аденозинтрифосфат

ГБ - глибенкламид

ГББ - гамма-бутиробетаин

ДАД - диастолическое артериальное давление

ДИП - дистантное ишемическое прекондиционирование

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ИП - ишемическое прекондиционирование

КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции

К(атф) - АТФ-зависимые калиевые каналы

ЛИП - локальное ишемическое прекондиционирование

ЛЖД - левожелудочковое давление

МД - милдронат

НС - нагрузка сопротивлением

САД - систолическое артериальноедавление

ЧСС - частота сердечных сокращений

ЭД - эндотелиальная дисфункция

е1Ч08 - эндотелиальная 1ЧО-синаза

¡N08 — индуцибельная ЫО-синтаза

Ь-\Л1У1Е - Ы-нитро-Ь-аргинин метиловый эфир

N0 - оксид азота

1ЧОх - сумма нитратов и нитритов

Подписано в печать 03.04.2012. Гарнитура Times New Roman. Формат 60x84/16. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 118. Оригинал-макет подготовлен и тиражирован в ИПК НИУ «БелГУ» 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85