Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Использование 5-йод-2'дезокснуридина для количественной оценки ответа индивидуальной опухоли на облучение в биологических моделях Ин виво

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ИМ. Н.Н.БЛОХИНЛ

Р Г 5 О Д На правах рукописи

ГРИГОРЬЕВА Елена Юрьевна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ 5-Й0Д-2'-ДЕ30КСНУРИДИНА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ ОТВЕТА ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ОПУХОЛИ НА ОБЛУЧЕНИЕ В БИОЛОГИЧЕСКИХ МОДЕЛЯХ ИН ВИВО

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997г.

Работа выполнена в лаборатории радиоизотопных методов исследований Онкологического научного центра РАМН

Научные руководители:

кандидат биологических наук Р. А.Спрышкова

доктор медицинских наук, профессор А.С.Ягубов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук С. Е.Ульяненко

доктор биологических наук A.A.Вайнсон

Ведущая организация - Московский научно-исследовательский институт диагностики и хирургии Минздрава России

Защита диссертации состоится " 2, 199 на заседании специализированного Совета (К.001.17.01) в Онкологическом научном центре РАМН (Москва. Каширское ш. 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОНЦ Автореферат разослан "/<£ " О 99 т2 г.

Ученый секретарь специализированного Совета

- 1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы..

Эффективность противоопухолевой терапии, в тон числе лучевоП терапии во многом может зависить от возможности раннего прогнозирования реакции опухоли на воздеПствие. особенно в процессе лечения, благодаря коррекции ранее полеченной схемы. Разработка методов прогнозирования на основе, например, цитокинетических параметров- общее число клеток, фракция роста, распределение клеток по Фазам клеточного цикла и т. д. которые позволили бы осуществлять количественную оценку и прогнозирование ответа опухоли на воздействие, представляет з силу ряда причин значительные трудности. С одной стороны, имеет (есто большая вариабельность данных параметров даже для опухолей од-юго и того же типа, а с другой - динамика их в процессе лечения и ¡еобходиность частых биопсий практически не позволяет использовать )тн важные параметры для ранней оценки реакции опухоли на противоо-1ухолевое воздействие.

Применяющиеся в клинике нетравматичные рентгенологические, то-шграфические. эндоскопические и другие методы позволяет дать ответ > реакции опухоли на воздействие лишь через некоторое время после сурса терапии, когда оптимальное индивидуальное планирование уяе юключено. Поэтому актуальной задачей современной онкологии является юздание простого, нетравматичного метода получения своевременной гадежной количественной информации о параметрах, характеризующих ре-1кцию опухоли на воздействие.

. Цель н задачи исследования.

Цель диссертационной работы состояла в экспериментальном нзуче-!ии возможностей использования меченного гамма изотопами |-йод-2'-дезоксиуридина для ранней оценки эффективности лучевого оздействия и разработке количественных параметров изменения роста пухоли в ответ на облучение на ин виво модели.

В процессе достижения поставленной цели планировалось решение ледующих задач:

. Изучение кинетики выведения ЙДУР из опухоли, органов и тканей кспериментальных хивотных без облучения '

. Изучение кинетики выведения ЙДУР из опухоли при. различных режимах опального облучения опухоли рентгеновским излучением, тепловыми ейтронами и при комплексном воздействии тепловых нейтронов с В-10 эдержащим препаратом в моделях ин виво.

- г -

3. Создание математической модели, адекватно описывающей экспериментально установленное поведение ЙДУР в опухоли и отражающей количество ЙДУР. включенного в метаболизм опухолевых клеток.

4. Оценка возможности использования разработанной модели для оценки эффективности лучевого воздействия на опухоль у отдельных животных в первые 48 часов после облучения,

5. Изучение динамикн изменения размеров опухолей после облучения с выводом аналитических выражений, отражающих взаимосвязь мевду параметрами предложенной модели и экспериментально найденными параметрами роста опухоли.

Разработаны подходи к <раннпй оценке эффективности лучевой терапии индивидуальных опухолей на основе параметров, характеризующих скорость выведения из опухоли радиоактивной метки 131-I и '"-1 йдур после введения меченого ЙДУР. Предложена модель, характеризующая степень подавления синтеза ДНК в опухолевых клетках и функционально связанная с показателем эффективности противоопухолевого воздействия рентгеновского облучения, тепловых нейтронов и комбинированного действия тепловых нейтронов с Бор-10 содержалуш препаратом.

Научно-ппакшческая значимость работ».

Разработан в эксперименте методический подход к количественной оценка индивидуальной чувствительности опухоли на лучевое, воздействие по скорости выведения из ив£ гамыа-нзлучающих радиоактивных изотопов ЙДУР.

Диссертация апробирована на совместной научной конференции отдела ыолекулярно-бнологических и радионзотопных методов исследований. лаборатории клинической цитологам, отделения общей онкологии, лаборатории /»еханизмов канцерогенеза ОНЦ РАМН.

СТРУКТУРА И О^ьен работа-

Диссертационная работа изложена на/09 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, методов и техники экспериментов, трех глав, содержащих собственные экспериментальные рынные с обсуждением ий результатов, заключения, выводов и указател* цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 125 на именований отечественных и иностранных источников. Диссертация нл листриронана 20 рисунками и 5 таблицами.

- 3 -С0ДЕРХЛ1ШЕ РАБОТЫ

Материалы и методн.

Эксперименты выполнены па мышах-самцах линии C57BL/6. массой 20+1г. с подкожно привитой неланомой В-16. В исследованиях применяли 5-йод-2'-дезоксиуридин, меченный 1г51 или 1311 (ПДУР). Раствор ЯДУР вводили внутрибрюшинно в количестве 7.1-7. з мкг в объеме 0.2 мл. содержащем 0.7 + 0.9 ИБк. радиоактивного йода. Для снижения включения 125j п laij g щитовидную железу, образующихся в процессе метаболизма радиоактивного ЯДУР. за 3 дня до введения препарата и до конца эксперимента питьевую воду животным заменяли на раствор Hal.

Радиометрию зоны опухоли проводили "ин виво" с помощью детектора со сшштилляционным кристаллом iialtTL] и многоканального анализатора типа BZ-27(фирма "Бертольд"). Мышей без анестезии фиксировали за лапки на тонкой (0.3 мм) пластмассовой подложке. Тело животного экранировали свинцовой пластиной толщиной 20мм с отверстием, над которым находилась только опухоль.

Расстояние от детектора до опухоли составляло 80-90 мм. Оно рассчитано на основании двух требованиий: 1. превышение результатов измерений над фоном не менее, чем в 4-5 раз: 2. максимальное уменьшение влияния геометрических факторов на реультаты радиометрии.

Время радиометрии выбирали так, чтобы в соответствии с таблицей Белла погрешность измерения за счет соотношения опыт/фон не превышала 10%. Радиоактивность N (имп/мин) измеряли через 0.25, 3 '6. 10. 24 ч и далее ежесуточно до 240 часов от момента введения ПДУР. Данные (Ht), полученные для каждой временной точки t. после вычитания фона и поправки на распад выражали как процент оставшейся ко времени t радиоактивности от фиксируемой в зоне опухоли через 0.25 ч после введения меченого ядур (Ног5).

Когда объем опухоли достигал приблизительно 900 мм3 (на 10-11 день после перевивки), ее подвергали локальному рентгеновскому, нейтронному, а также комбинированному воздействию бор-содержащего препарата и нейтронного облучения.

Рентгеновское облучение проводили на установке " Стабилипан" (мощность дозы 3.7 Гр в минуту. V=200 кВ. 1=18 мЛ, фильтр 2мм А1) в диапазоне доз 2 + 40 Гр. Для измерения поглощенной дозы использовали термолюминисцентнне дозиметры TLD -100. Животных неподвижно Фиксировали на подложке из оргстекла толщиной 6 мм. Экранировали мышей свинцовым коллиматором толщиной 10 мм с отверстием под зоной опухо-

ли, добиваясь тем самим облучения только опухолевой области.

Нейтронное и сочетанное бор-нейтронное облучение проводили на исследовательском реакторе ИР-8 РНЦ "Курчатовский институт". Поток тепловых нейтронов составлял 1.15*10" °п см"2 сек"1 .Опухоли облучали либо только тепловыми нейтронами в дозовом диапазоне от 0.5 до 7.5 Гр. либо тепловыми нейтронами в сочетании с бор-содержащим препаратом На2 10В,2 Ни SH. который вводили за 11.5 - 12 часов до нейтронного облучения, в диапазоне доз 0.2-9.5 Гр. Время облучения составляло 2-39 часов. Концентрацию 10В в зоне опухоли измеряли "ин виво" методом регистрации мгновенного гамма-излучения от реакции ,0B(n.a.v)7Ll . Поглощенная доза тепловых нейтронов контролировалась методом нейтронной дозиметрии. Мышь во время облучения находилась в специальной тефлоновой клетке н облучению подвергалась только зона опухоли.

Для оценки изменения роста опухоли проводили ежедневно измерения ее размеров от начала эксперимента до дня гибели кивотпого. Исходя из того.что форма опухолей близка к эллипсоиду вращения, их объемы вычисляли; как произведение константы 0.56 и размеров трех взаимно перпендикулярных осей эллипсоида. Оси измеряли с помощью измерителя непосредственно на опухоли животного, закрепленного неподвижно на подставке.Объем каждой опухоли (Vt) во время t нормировали на начальный объем в момент облучения (Vo) и далее строили кривые изменения относительных объемов опухолей (Vt/Vo) во времени. Влияние лучевого воздействия характеризовали продолжительностью задержки роста опухоли (Тз) - время дорастания относительного объема опухоли до своего первоначального значения в .момент облучения, и временем дорастания ее до двойного объема (Тдор) по сравнению с Vo. 00а параметра определяли графически по кривым изменения Vt/Vo от t для каждого И1В0ТН0Г4).

Нормальность распределения случайных ошибок измерения проверяли методом оценки митральных моментов третьего н четвертого порядков. Достоверность различий, наблюдаемых между двумя средними производили но оценке критерия достоверности t или по сравнению с доверительными границами случайных колебаний t*n\,. исходя из 95Х уровня доверительной вероятности. Для сравнительной оценки выборочных данных небольшого объема использовали непараметрический критерий Уайта, не требующий нормальности распределения исследуемых рядов.

Динамику связи между двумя признаками характеризовали с помощью регрессионного анализа методом наименьших квадратов при 95% уровне значимости. Степень зависимости между переменными оценивали с помощью коэффициента корреляции г в. соответствии со следующей градацией г: от 0.1 до 0.5 слабая связь меяду признаками, от 0.5 до 0.7 -средняя степень сопряженности, сомвв 0.7 - сильная, г - 1 означает функциональную св^зь незду перененпыии. Достоверность коэффициента корреляции определяли показателен Z преобразования.-*?. Фишера.

Площади под кривыми выведения радиоактивной метки из зо!ш опухоли рассчитывали аналитически. Пределы интегрирования задавались от

0.25 до 72 часов. Для характеристики изменения уровня накопления печеного соединения в опухоли при ее локальном облучении различными дозами в сравнении с необлученнымн. полученные значения площадей (Sa) нормировали на значения площадей (Sq) в контрольных группах (Sd/S0 ). Оценка параметров моделей для приближения экспериментальных данных производилась с помощью нелинейного метода наименьших квадратов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучен круг взаимосвязанных вопросов, относящихся к разработке метода ранней оценки и контроля эффективности лучевой терапии. С этой целью исследовали возможность использования 5-йод-2'-дезоксиу-ридина для ответа опухоли индивидуального животного на противоопухолевое действие рентгеновского облучения, теплового нейтронного облучения и бинарного действия нейтронного облучения с В-10 содержащим препаратом. Использование ЙДУР. меченного гамма-излучающими изотопами йода, дает возможность следить за его судьбой в организме с помощью внешних детекторов.

Постановка экспериментов.

Введение радиоактивного ЙДУР после облучения позволяет по сни-аеиию включения РМ в опухоль по сравнению с контролем, оценить степень ингибироваиия синтеза ДНК пролиферирующих клеток. При этом учитывалось. что максимальный блок синтеза ДИК развивается в интервале 2 + 4 часов после облучения. Эксперименты проводили по двум схемам:

1. Использовали ЙДУР. меченный только ,г51. В данном случае изменение включения ЙДУР в опухоль в опыте и в контроле определялось по средним значениям в группах мышей. 2. Использовали при последовательном введении одному и тому же животному ЙДУР. меченный 131I(до облучения) и ,г51 (через 3 часа после облучения).

- 6 -

Выведение 5-йод-2'-дезоксиурндкна из опухолевой и нормальной ткани.

Способность 5-йод-2'-дезоксиуридина (ЙДУР) встраиваться в ДНК пролиферирующих клеток является определяющим фактором для использования этого соединения как маркера реакций опухоли на противоопухолевое воздействие. На рис.1 представлены результаты ин виво измерений радиоактивности в зоне опухоли и аналогичной области другой лапки животного, не несущей опухоль. Кривые зависимости Nt/TT от t даны для групп однородных животных и представляют собой динамику отношений уровней РМ (имп/мин) в момент времени t (Ht) и через 0.5 кинут после введения ЙДУР. меченного lî5I (H*).

Кривая 2 изменения РМ в лапке, не несущей опухоль. lie содержит участка накопления РМ и спустя уже 10 часов значение РМ уменьшается на порядок. Зарегистрированная в здоровой лапке радиоактивность преимущественно локализована в ДНК красного костного мозга бедра. (PorshenW.. Felnendegen L. F.. .1969) Это. по-видимому, и обусловливает медленный спад кривой в дальнейшем.

время (час)

Рис.1. Изменение радиоактивности во времени над зоной опухоли (1) и над зоной конечности без опухоли (2) мышей С57В1/6. NtЛГ - отношение уровней радиоактивностей (имп/мин) в момент времени t и через 0.5 мин после введения 1851-ЙДУР.

Кривая 1 изменения радиоактивности в опухоли характеризуется 4-мя выраженными участками: быстрое увеличение радиоактивной метки (РН). как правило от 0 до 0.25 часа, спад до 24-48 час. значительное замедление скорости выведения -"плато" (24-48 - 70-80 часов), затем некоторое увеличение скорости выведения.

Ранее показано (Hofer К.G..Hughes W.L..1970), что через 15 минут после введения. ЙДУР ухе претерпевает в основном все биохимические превращения и к этому времени около 90% связывающегося с ДНК опухоли ЙДУР находится в ней. Учитывая вывеизложенное. в последующих экспериментах по оценке характера динамики выведения ПДУР из опухолей в качестве начального момента времени было выбрано to - 0.25 часа.

Спад радиоактивности в опухоли в первые сутки обусловлен выведением из организма радиоактивных продуктов метаболизма ЙДУР, главным образом. Яодида на Фоне включенного ЙДУР в ДНК опухолевых клеток. Возникающее затем "плато" отражает, как будет показано Hiise. уровень этого включения в ДНК и остаток выводимого йодида. "Плато" присутствует на всех кривых изменения РН в зоне опухоли и,отражая уровень включения ПДУР в ДНК,может характеризовать способность, опухолевых ¡теток синтезировать ДНК. Дальнейший медленный спад кривой, по-видимому. вызывается гибелью кпеток опухоли с соответствующим высвобождением РМ. которая практически не реутилизируется опухолью.

Согласно результатам ин витро исследований, к 30 часам после введения меченого ЙДУР, в опухоли зарегистрировано, наибольшая величина РН. КДН (коэффициент дифференциального накопления) .составлял 29%, что в несколько раз превышает КДН в других органах и тканях.

Влияние рентгеновского облучения на кинетику выведения 125I-ЯЛУР из опухоли.

Динамика изменения отношений уровней радиоактивности в зоне опухоли в момент времени t (Mt) и в момент первого измерения to через 0.25 часа после введения ,251-ЙДУР (Н0.25) для усредненных по группам однородных аивотных ( 40 значений на точку) показана на рис.2. При однообразии формы кривых Nt/Ho от t для необлученных опухолей и для оггухолей, подвергнутых воздействию рентгеновского излучения. скорости выведения РМ различны. При t более одних суток различия в скорости выведения РМ становятся достоверными (доверительные интервалы не пересекаются) при этом с увеличением подводимой к опухоли дозы падает уровень оставшейся к этому времени радиоактивности.

время (час)

Рис.2. Изменение радиоактивности во времени над зоноП опухоли после введения 1851-ЙДУР в зависимости от дозы рентгеновского облучения.

(1-К0НТр0ЛЬ. 2 - 2 Гр. 3 - 10 Гр. 4 - 20 Гр. 5 - 40 Гр) Ш/Но - отношение уровней радиоактивности Ошл/иин) о момент времени X. и черцз 0.25 часа посла введения 1851-ЙДУР

Наличие зависимости радиометрических параметров о? дозы позволяет предположить возможность использования динамики РМ ЙДУР дли установления количественной связи между дозой облучения и пролиферативной способностью индивидуальной опухоли. Для оценки реакции опухоли на воздействие для одного н того же животного применение ЙДУР. меченного только одним изотопом йода (и51). невозможно нз-за наложения радиометрических данных. Решить эту проблему позволяет дополнительное использовавание ЙДУР. меченного 1311. который вводится животным до облучения и уровень намеренной радиоактивности в зоне опухоли будет соответствовать "нормальному" состоянию данной опухоли (контроль). Введенный же после облучения 1251-ЙДУР позволит охарактеризовать ее реакции в ответ на облучение

- 9 -

Сравнительная кинетика выведения 12 51-ЯЛУР и

1311-ЯДУр из необлученных опухолей н опухолей

после локального лучевого воздействия.

Использование двух ЙДУР. меченных различными радиоизотопами йода. для оценки индивидуальной реакции опухолей на облучение требует доказательства корректности проводимых сравнений радиометрических данных. С этой целью трем группам наблюдаемых животных, каждая из которых включала по 12 мышей, вводили соответственно: ,3,1-ЙДУР - 1-ая группа 1251-ЯДУР - 2-ая группа

1311-ЙДУР и спустя 24 часа 1251-ЯЦУР - 3-я группа. Анализ полученных данных показал, что при ин виво исследованиях массовое число метящего изотопа Пода достоверно не оказывает влияния на кинетику выведения ЯДУР из зоны опухоли и лапки, не несущей опухоль. Т.о. выведение РМ 1311-ЯДУР и ,г51-ЯДУР из зоны опухоли у необлученных животных и их поведение в организме можно считать идентичным.

У 3 группы экспериментальных животных через сутки после внут-рибрюшинного введения 1311-ЯДУР локально облучали опухоли дозой 10 Гр и спустя 3 часа вводили 1251-ЯДУР. На рис.3 представлены характерные кривые зависимости'N4/110.25 от х. для отдельных животных. Параметры кривых выведения РМ 1311-ЙДУР (до облучения) и 1241-ЯДУР (после облученния) из зоны опухоли существенно различаются даже при наличии вариабельности уровней радиоактивности, отражающей индивидуальную реакцию организма. Оценка различий, проведенная .с помощью критеря Фишера Г. • между.совокупностями параметров этих кривых показала достоверность различий их парных вариант начиная с 24 часов (Г-=4.28 при ГЕрнт.»2.12 для Р=0.05 и п»20). Это дает возможность определения изменения уровня ЙДУР в опухолевой зоне индивидуальных организмов при противоопухолевом воздействии.

Сравнительное изучение вьтаелешш На1251 и ,251 ЙДУР из зоны ОПУХОЛИ

Особенности метаболизма ЯДУР указывают на то. что в первые 70*80 часов после его инъекции имеет место суперпозиция двух основных процессов: выведение продуктов метаболизма ЙДУР (главным образом Ходила) и включение ЯДУР в опухолевые клетки. Выведение свободного 1одида (в основном в форме На*Г), оказывает значительное влияние на результаты ин виво измерений. Разделение этих процессов, а также оп-

М(1)/М(ОЫОО»

время (час)

Рис.3. Изменение радиоактивности во времени над зоной опухоли для отдельных животных в контроле (|311-ЙДУР) и после рентгеновского облучения дозой 10 Гр 151-ЙДУР). N животного в эксперименте: 2 —. 3 -+-. 9 10 -«Иг/Ко - отношение уровней радиоактивности. (имп/шт) в момент времени С и через 0.25 час. посла введения ЯДУР.

ределение параметров включения ЙДУР в опухолевые клетки, позволило нам дать кол шственную оценку изменеши синтеза ДНК при противоопухолевом воздействии.

1. Выведение меченого болида

Для оценки влияния свободного йодида. образующегося в процессе метаболизма ЙДУР, были изучены кривые выведения нз организма мышей радиоактивного Иа,151. Математический анализ кривых выхода РЫ Еа! (Ы1/ Н0.гз от и из опухолей как для контроля, -так и для различных режимов облучения показал, что эти ' кривые хорошо Аппроксимируются функцией вида У-А*е'*х + в*е*|,х (коэффициент детерминации 1^-93-98). Ход кривой определялся по 10+11 точкам при 8+12 значениях

на каждую. Такое двухфазное падение величины Nt/N0-25 отражает процесс выведения из зоны опухоли свободного йодида (быстрая - 2 -экспонента) и выведение йодида "условно связанного", т.е. вступившего, по всей видимости, в обменные процессы (медленная - 1 - экспонента).

Для оценки количественного содержания Яодкда в зоне опухоли мы вычислили площади S под кривой выхода РМ Nal от времени в интервале от 0.25 до 72 часов по формуле:

72 72

S"a,(X) - / A»e*at dt + / B*e"bt dt - S"al(l) + S"a,(2).

.25 .23

где 3И4,(£) - площадь под суммарной кривой Nt/H0.25 от t

S"e,(l) - площадь под медленной экспонентой. характеризует коли-' чество еыводнмой РМ "условно связанного" йодида.

S*a,(2) - площадь под быстрой экспонентой. отражает количество выходящего из зоны опухоли свободного йодида.

Для дальнейших оценок, вместо абсолютной величины площади под кривой выхода РМ, использовали условный коэффициент ОИП (относительное изменение площади), что позволяет нивелировать вклад в радиометрические данные от тканей в зоне видимости детектора: ОИП £(d/0) - S(I)d /S(I)0 -ОИП 1(d/0) » S(l)d /S(l)0 -ОИП 2(d/0) - S(2)d /S(2)0 -отношение площади под общей кривой выхода РМ [S(I)d], под первой [S(l)dJ или под второй tS(2)d] экспонентой при облучении опухоли дозой 2. 10. 20 и 40 Гр к соответствующей площади контроля. Для того, чтобы оценить вклад РМ. связанной с медленной экспонентой, в измеряемую в зоне опухоли радиоактивность при воздействии каждой дозы, использовали отношение площади под первой экспонентой к площади под суммарной кривой выхода РМ .

ОИПй [0. 2. 10. 20. 40) ПД) -S(l) /S(I)

Вычисленные коэффициенты ОИП показали, что при введении в организм только Nal. процент "условно связанного" йодида и процент РМ свободного йодида. находящихся в опухолевой зоне, по отношению к общему количеству йодида в радиометрируемой области, являются постоянными величинами, не зависящими от дозы облучения: ОИП(0.г.10.го.40) И^) Nal = 17* °ИП(0. г-.'ю.го. 40) <2/Е) Nal = 83% Следовательно. 83% йодида быстро выводится из зоны опухоли и 17% на

некоторое время задерншаются в ней, вступая, повидимому, в различные биохимические реакции.

2. Виведенне нечеиого ЙДУР

Кривая изменения N,/N0.2S от-времени в опухолевой зоне при введении меченого ЯДУР имеет более сложную форму (наличие "плато"), чем аналогичная зависимость, полученная при введении Kai. Как показал анализ экспериментальных данных, в интервале от 0.25 до 72 часов также проявляются две основные фазы и оба эти участкавппроксимируют-ся экспоненциальными функциями с высокой степенью соответствия (г2-96+98 при 9555 достоверности). Эмпирические формулы при обработке результатов каждого эксперимента находились по 8-10 значениям на каждую из 11+12 пар зависимых величии.

Показано, что параметры быстрых экспонент кривых выхода РИ ПДУР и Kai для одних и тех же доз облучения идентичны. Коэффициенты ОИП 2(d/0) (средние по 5 экспериментам) для ЙДУР и Nal приведены в табд. 1. .

Табл.1 Относительное изменение площади (0ИП2) под быстрой (2) экспонентой при рентгеновском облучении

0ИП2 (d/o)X 2 Гр 10 Гр 20 Гр 40 Гр

Kai 98.7*4.3 84.3*3.8 77.9*2.1 75.4*1.5

ЙДУР 97 13.6 83 +2.5 78.9*2 76 ±2.8

Таким образом., площадь под быстрой экспонентой может является условной характеристикой количества свободного йодида, возникающего при метаболизме ЙДУР. При этом величина эта является дозо-независи-мой (0ИП<] 12/1) Nal-const.-83%).

Для нас наибольший интерес представляет участок, описываемый медленной экспонентой, поскольку именно он отражает динамику уровня радиоактивности в опухали, связанную с ДНК, аБЙД1ГГ(1). соответственно - количество включенного в ДНК опухолевых клеток ЙДУР. При этом, если в экспериментах с применением Nal. коэффициент 0ИП(1/1) Nal является величиной постоянной, равной 17%, то при использовании

ЙДУР существует зависимость коэффициента ОИП(1/1)ЙДУР от дозы радиационного воздействия, который достоверно (при уровне значимости р<0.05) уменьшается с 48% в контроле до 34%.29%. 22%. 173 при облучении дозами 2.10.20,40 Гр соответственно.

Поскольку при дозе 40 Гр синтез днк полностью блокирован, то блокирован и процесс включения в нее ЙДУР. Следовательно, надо полагать. что 17% -это фоновый вклад, который не связан с синтезом ДИК. а является результатом метаболизма того йодида. который образуется в процессе распада ЙДУР. Таким образом, в случае использования ЙДУР медленная экспонента отражает совокупную РИ как ЙДУР включенного в ДНК. так \{ фоновое количество РИ возникающего йодида (или его метаболитов) . задерживающегося в радионетрируемой области.

Количественная оценка вкличенпя ЯПУР в лт опухолевых клеток.

Если уровень изменения количества ЙДУР в ДНК опухолевых клеток модельно можно представить через изменение площади под первой экспо-нентой кривой Н(/Н0.г5 от Ь. то необходимо выполнение двух основных условий:

1- значение подинтегральной функции не долкно меняться в интервале 0.25-72 часов, поскольку не долгно существенно меняетея количество ЙДУР.включенного в ДНК. на протяжении первых 70+80 часов поело введения ЙДУР (в дальнейшем возможно увеличение выведения РН за счет дейодирования ДНК при гибели клеток в ответ на облучение}; .

2- существование зависимости величины коэффициента 0ШИ((1/0) ЙДУР от дозы подобно тому, как зависит от дозы изменение синтеза ДНК при радиационном воздействии.

1. Из формулы Лаграняа известно, что функция является постоянной на определенном интервале, если ее первая производная на этом .'штервале рарна 0. Скорость убывания функции медленной экспоненты у=а»е~Ь1 равна ее приращению ¿1у/(К - - а*Ь«е"Ь1 - -У*Ь. Полученное нами максимальное значение первой производной <Зу/сН - 0.2. Таким образом. можно считать скорость убивания несущественной и рассматривать значение подинтегральной Функции медленной экспоненты в заданном временном интервале как приближающееся к постоянной величине.

2. Второе условие также выполняется, поскольку здесь прослеживается четкая закономерность снижения коэффициента 0ИП1(<1/О)ЙДУР о увеличением подводимой к опухоли дозы. В табл.2 даны значения доз и соответствующие им значения коэффициентов 0ИП1 (с1/0). усредненных по

5 экспериментам, для рентгеновского; нейтронного и комбинированного бор-нейтронного облучения.

Табл.2 Относительнее изменение площади (0ИП1) под медленной (1) экспонентой

РЕНТГЕНОВСКОЕ НЕЙТРОННОЕ ,0В ♦ НЕЙТРОННОЕ

(0.025 еУ) (0.025 еУ)

ДОЗА 0НЛ1 (0/0) ДОЗА ОИП.1(<1/0) ДОЗА ОИП1(<1/0)

(Гр) (X) (Гр) (X) (Гр) (X)

О 100

2 78. Ш. 1

10 53.9t3.44

20 35.7*3.13

40 19.9*1.04

0 100

0.51 84.66*4.9

1.19 68.2013

2.04 49.25*3.2

2.93 41.28*3.8

5.44 31.47*1.7

7.5 27.79*2.0

0 100

0.21 62.41*3.1

0.79 51.32*3.2

1.09 49.78*1.3

1.55 44.60*1.4

2.76 32.24*2.1

5.39 12.38*1.2

6.07 12.15*1.3

9.62 ll.80i.93

Таким образом, значения коэффициентов 0ИП1 («3/0) отвечают двум основным требованиям, предъявляемым к модельным параметрам, характеризующим уровень изменения синтеза ДНК в опухоли.

На основании вышеизложенного коэффициент 0ИП1 (й/0) можно рассматривать как условную характеристику подавления синтеза ДНК индивидуальной опухоли, а зависимость 0ИП1 (¿1/0) от дозы - как зависимость ДОЗА - ЭФФЕКТ. Следовательно, коэффициент 0ИП1 (¿1/0) правомерно использовать для характеристики индивидуального ответа опухоли на облучение.

Однако, вычисление коэффициента 0ИП1 достаточно громоздко для получения экспресс-информации о реакции индивидуальной опухоли на противоопухолевое воздействие. Целесообразнее использовать параметры суммарного процесса, прямо регистрируемого нами внешним детектором, найдя связь между ними.

- 15 -

Папаматш выведения 5-1-2'-йДУР и степень

иэненения подавления синтеза ДНИ в опухоли

Поскольку количество РН. измеряемой в зоне опухоли, может быть

выражено как площадь под кривой Ht/No от времени:

Ц

(1) S-/N(t)dt . t.

где зависимость N от t (K»Nt/Ho) носит экспоненциальный характер, сохраняющийся при всех изученных нами видах облучения опухоли (Рис.4). В такой случае N(t) можно выразить через ее производную по времени IH*3 я угловой коэффициент кривой ttg(a)J. поскольку в полулогарифмическом масштабе экспонента представляет собой прямую линию с углом наклона к оси абсцисс, равным ai:

(2) tg(a) - dY/dt - d lnN(t)/dt - l/If*dH(tj/dt - l/N*H'(t) Данный параметр функционально связан с количеством РН в опухолевой зоне и. кроне того, просто и легко вычисляется в процессе радиометрии по формуле:

tg(a) - [In H(t,)-ln NU*)] / (t,-tt).

время (час)

Рис.4. Изменение радиоактивности по времени над зоной опухоли

после облучения в дозе 2 Гр рентгеновским излучением (1). тепловыми нейтронами (2) и В-10 + тепловые нейтроны (Э). Ht/Ho - отношение уровней радиоактивности (имп/мин) в момент времени t и через 0.25 ч. после введения ЙДУР.

где N(t,) и (Nt2) - величина измеряемой радиоактивности для времени 0.25 и соответственно 24 или 48 часов. Далее, взяв отношения угловых коэффициентов ltg(a)l кривых выведения РМ у животных с облученной опухолью к их контрольным значениям до облучения и обозначив его через К, мы получаем параметр, который отражает уровень изменения включения ЙДУР в опухоль под влиянием противоопухолевого воздействия.

Графическое исследование корреляционных полей значений 0ИП1(d/О) и К. полученных по результатам различных опытов с рентгеновским облучением опухоли дозами 2. 10. 20. 40 Гр выявило, что эти ¡поля концентрируются вокруг линии связи, которая на графике в полулогарифмическом масштаба - прямая линия и. следовательно, наиболее целесообразно регрессионное уравнение выразить в виде экспоненциальной функции. Степень соответствия индивидуальных значений 0ИГ11 (d/0) и К линии регрессии, определяющаяся коэффициентом корреляции Пирсона Г. стандартная ошибка оценки (Stnd. Error of Est.), а также расчетное значения коэффициентов регрессии для каждой из указанных доз воздействия приведены в таблице 3:

Табл.3 Коэффициенты уравнений регрессии между коррелирующими признаками 0ИГК1) и К для рентгеновского облучения

при Р-0.05 п- 15-18 ОЙПКО/О) - е (а*ь'К)

Лоза(Гр) а в г S.E.of Е

Монотонность зависимости факторов, показанных для отдельных еи-вотных. как для крайних точек так и для точек внутри дозового диапазона. позволяет интерполировать данную зависимость на весь изучаемый диапазон. Ка рис.5 представлено корреляционное поле индивидуальных значений 0ИП1(<3/0) и К для 68 животных в диапазоне доз 2 - 40 Гр.

2 10 20 40

5.6 -1.02 .89

5:6 -1.02 .94

5.2 -0.94 .92

6.1 -1.2 .97

0.03 0.05 0.056 0.06

Еычислетше коэффициенты уравнений регрессии ыенду коррелированными признаками для рентгеновского, нейтронного и сочвтанного бор-нейтронного облучения (Табл.4) указывают на сильную, близкую к функциональной. связь этих признаков, причем, независимую от вида радиационного воздействия.

Независимость параметра К от типа облучения дает возможность заключить, что он может быть применен при любом противоопухолевом воздействии.

сип I,

К На а / Ьв о)

Рис. 5. Корреляционное полз .индивидуальных парацотроь 1Л11 1 (Л/о) ц К при рентгеновском облучении.

линия регрессии, ----- доверительные границы линии

регрессии.Л * облучение опухоли в дозах 2, 10,'

20. 40 Гр соотвэтствешт.

- 18 -

Табл.4 Коэффициенты уравнений регрессии между коррелирующими признаками 0ИП(1) и К

ДИАПАЗОН 01Ш1((1/0)«=е<а*ь,К) ВИД ОБЛУЧЕНИЯ ДОЗ (Гр) а Ь г std.e.of с

РЕНТГЕНОВСКОЕ 2 - 40 5.6 -1. Ol .99 0.054

НЕЙТРОННОЕ

(0.025 eV) .51 - 7.5 5.7 -1. 2 .99 0.059

»°B +

НЕЙТРОННОЕ .21 - 9.52 5.8 -1. 1 .97 0.035

(0.025 cV)

Для более точного определения отношений параметров К и 0ИП1(d/О) проведены несложные математические вычисления. Определив N из уравнения 2 и подставив его в уравнение 1 получим: t*

S(Z) - l/tß(a)»; H'(t)«dt t,

Тогда.учитывая проведенный ранее анализ, отношение площади под суммарной кривой выведения РМ из облученной опухоли к аналогичной площади контроля будет иметь вид:

tg(a)„ *[(A*e"at,+B»e"l)U )-(A*e"at2+B*e"bt2 )]d

^(D/Sod)-------

tg(a)0 *[(A*e"aU+B»e"bt1 )-(A*e~at2+B*e~btz )]0

где t'g(a)0/tg(a)d -1/K. и. так как S(I)=S(l)+S(2). после некоторых преобразований мы получаем следующее выражение:

(3) Sd(l)/S0(l)- Sd(Z)/So(Z) * S0(Z)/S0(1) *

* (1 - bo/ba * К * tl - S0(1)/S0(Z)}}

Заменив отношения площадей на коэффициент ОИП и учитывая, что отношение контрольных значений площадей является величиной постоянной IS0(l)/S0(Z) - L - 0.48] уравнение (3) можно представить следую-

щим образон:

(4) ОИПШ/О) - ОИПЕ(«3/0) * 1/1 - (1 - Ъд/Ь,, * К * (1-Ь)] Отсюда, получаемый при радиометрии, суммарный (0ИЛ1) линейно зависит от параметра (0ИП1). характеризующего степень подавления синтеза ДНК в опухоли.

ОГРАНИЧЕНИЕ использования параметров модели при определении степени подавления синтеза ДНК.

Поскольку при полностью блокированном синтезе ДНК.0ИПа11/1) составляет 17%.что соответзтвует количеству метаболически связанного йодида. и отношение скоростей выведения свободного йодида Ьо/Ьй (при данном условии) для всех аппроксимирующих функций равняется 0.8. га можем вычислить предельное значение К. при котором модельная характеристика 0ИП1(с1/0) становится нечувствительной к противоопухолевому воздействию. Из уравнения 4 следует.что

К - [1- 0ИП<1(1/Х)]«Ьа/Ьо«1/(1-1) - (1-0.17).1/0.8*1/0.52 - 2 Для оцени! доз облучения, соответствующих критическому значению параметра К. была определена описывающая их зависимость при различных видах облучения. Анализ полученных данных показал, что в исследуемых нами диапазонах доз отношение угловых коэффициентов К с приемлемой для практической цели точностью находится в степенной зависимости от дозы (г2 для рентгеновского, нейтронного и сочетанного облучения равны 973^ 98%. 98%). -что можно записать следующим образом: К -С«0Г Рассчет эмпирических констант С и Г. позволил определить пороговые значения доз облучения, для которых К будет равно 2 и модельный параметр 0ИП1(<1/о) перестает отражать степень противоопухолевого воздействия:

для рентгеновского облучения - 1У ГР

для нейтронного - 8.4 Гр

для комплексного воздействия борсодер-жащего препарата с нейтронным облучением - 5.8 Гр Следует отметить, что с ростом дозы зависимость К - Э меняет свой характер и становится линейной, однако это относится к более высоким значениям параметра К. привышающим его критическое значение для данного метода определения подавления синтеза ДНК при облучении опухоли.

Действие облучения на пост кодельнмх опухолей.

Кинетика роста опухоли является важным показателем э^ктив-ности терапии, в том числе лучевой, опухолевых новообразований.

Для оценки реакции опухоли на Лучевое воздействие были использованы такие параметры как продолжительность задержки роста опухоли Т(э, и время дорастания опухоли до двойного обьема Т(лор). Используя эти критерии строили соответствующие кривые доза - эффект.

При всех трех видах воздействия, для зависимости Т(з) от дозы отмечается их нелинейный характер, т.е. кривые Т,3) - ДОЗА содергат плечо с отрицательным начальным наклоном и дальнейшей экспоненциальной зависимостью (Рис.6). Аналогичная зависимость имеет место »'для кривых Т(дор)-Доза.

Взаимосвязь роста опухоли с нодолшиш параметрам выведения ЯПУР.

При оценке эффективности применения лучевой терапии для индивидуальных яивотны:-:. количественную взаимосвязь иеаду параметрами Т(э) или Т(Я0Р). характеризующими реакцию опухоли на облучение, с параметром К; характеризующим скорость выведения РИ ЯДУР из зоны опухоли, определяли с помощью регрессионного анализа. На Рис.7 приведено корреляционное поле значений Т(з) и К для 68 животных, с опу-

Т а

доза (Гр)

Рис.6. Время задержки роста опухоли (Тз) при облучении тепловыми нейтронами (1). В-10 + тепловые нейтроны (2) и рентгеновским облучением (3) в зависимости от дозы воздействия.

т»

1С ив а / 1& о)

Рис.7. Корреляционное поло индивидуальных параметров задержки роста опухолей Тз и К при рентгеновском облучении.

.----линия рогрессин.----доверительные границы линии

регрессии.д. » облучение опухоли в дозах 2.10.20.40 Гр

хольв. подвергнутой локальному рентгеновскому облучешт. Графическоа исследование корреляционных полей значений Тиор),Т(1) и К показало, что наиболее точно условия связи параметров отражает регрессионное уравнение в виде экспоненциальной Функции

(5) Т(дор)[Т(з)1 - е**ь'к. где а.в - регрессионные коэффициенты. На рис. 8 приведены линии регресаш для совокупности значений К и Т(ДОр, при облучении опухоли рентгеновским, нейтронным облучением и при воздействии нейтронного облучения в совокупности с бор-содержа-шш препаратом. При высокой степени соответствия (г- 0.36-0.99 для Р«0.05) зависимости для рентгеновского, нейтронного и Сор-неб л ршч-п-го облучения практически не различаются, все ?£и вида зависимостей шызвт одинаковый угол наклона, что еще раз указывает на показатель К. как на параметр, отражающий изменение опухолевой реакции при любом типе воздействия

Рис.8. Линии регрессии корреляционных зависимостей времени удвоения объема опухоли (Т дор) от параметра К при воздействии на опухоль рентгеновского излучения (1). тепловых нейтронов (2). и В-10 + тепловые нейтроны (3).

Используя параметр К. достаточно просто определить характер з^исимости 0ИП1(<3/0) - Т,э) - величин, характеризуют решению опухоли. При этом, если Т(;>, является результатом непосредственного измерения размеров опухоли во время проведения экспериментальной работы. то 0ИП1 (б/О) - модельная характеристика, отражающая степень подавления синтеза ДНК. Обе эти величины.связаны экспоненциальными зависимостями с параметром К и. следовательно, решив совместно эти два уравнения получим:

ООДМй/О) - Т;э)-Ь,'ьг • 1п[Ь1*(а2/Ь2+а1)]. где bl.b2.al.в2- эмпирические константы, не зависящие от К. Подставив р уравнение полученные в ходе работа значения констант кы нашли, что для трех исследованных видов облучения связь между 'модельным параметром 0ИП1 и параметром, получаемым при непосредственном измерении размеров опухоли,практичвеки идентична:

рентгеновское ОИП1(<1/0) - Т(а)"в в • 1п 6.8

нейтронное (0.025 еУ) 0ип1(<1/0) - Т,э)-° ® * 1п 7.8

В-10 + нейтронное (0.025 еУ) ОИПШ/О) - Т,,,"0-* ♦ 1п 6.9 Таким образом, доказана возможность использования параметра К. характеризующего скорость выведения РМ из опухоли в первые двое оу-ток после введения изотопа, в качестве показателя, характеризующего ответ индивидуальной опухоли на облучение. Для использования К в качестве такого параметра необходимо осуществить следующий порядок действий: 1. для отдельного животного, исходя из данных радиометрии до н после облучения, определить К по формуле

£1п Ш, )-1п Н(1аН (»"1-ЙДУР)

К---

Пп Н(1,)-1п Н(Ц)1 ("Ч-ЙДУР)

2. подставить вычисленное значение К в уравнение регрессии 5 и, о учетом ее доверительной зоны, определить оаидаенуп величину Т,э) ист вычислить через 011П1 (с!/0) степень изменения пролиФеративной способности опухолевых клеток

В и В О Д И

1. ЙДУР. нзчешшЗ радиоактивным йодом, преимущественно вклнчаотся я опухолевуя ткань. Массовое число радиоактивных изотопов йода но влияет на характер поведения кривых динамики радиоактивности (РИ) а зоне опухоли, измеренной внешним детектором в течение 0.25 - 240 часор после введения '"ИЭДУР и ,3|1-ЙДУР.

2. Наклоны кривых выведения Р!1 из зоны опухоли зависят от дозы рентгеновского. нейтронного (0.025еУ) и комбинированного (иеЯтропн * Оор-содервэдиП препарат) облучения, что позволяет оценить ин пипа решению индивидуальной опухоли на облучение при последовательно!! введении ,311-ПДУР (до облучения) и 1г61-ЙДУР (после облучения).

3. Характер вшедекия РМ ПДУР из зоны опухоли соответствует, но крайней пера совокупности двух процессоз: выведению свободного Полила (быстрая экспонента) и метаболически "связанного" йодида и ПДУР, включенного в ДНК опухолевых клеток (медленная экспонента).

4. Площадь под медленной зкенонентой (предложенный нами цодолышЯ параметр 0Ш11(<3/0)) связан с количеством ЙДУР. [шшченного в Д1Ш опухолевых клеток, и отражает степень изменении пролиферативной активности злокачественного новообразования в зависимости от сблуче-

ния. Значения доз. для которых характеристика 0ИП1(<3/0). становится нечувствительной к противоопухолевому воздействию, составляют: 19 Гр-для рентгеновского облучения. 8.4 Гр-для нейтронного облучения. 5.6 Гр-для бинарного действия нейтронного облучешш с В-10 содержащим препаратом.

5. Параметр 0fflll(d/0) коррелирует с коэффициентом К (отношения угловых коэффициентов кривых выведения РН у животных с облученной опухолью к их контрольным значениям до облучения), который может бить рассчитан непосредственно по данным радиометрии ин виво.

6. Коэффициент К коррелирует с параметрами роста опухоли Тзвд и Тдвр И может быть использован в качестве показателя индивидуального ответа опухоли на облучение.

7. Параметр К не зависит от типа облучения,

что. повидимоиу. дает возможность его применения при любом противоопухолевом воздействии.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ПМССЕРТАШП1

1. R.A. Spryshkova. Е.У. Grigorleva. M.G. Haldenov. A.S.Yagu-bov. The use of 5-lodo-2'-deoxyurldlne for evaluation of Individual tumour In response to Irradiation In biological models In vivo..

IX Internat. SyropBposlum on laboratory animals and experimental medicine. Riga. 1991. pp 2-4

2. R.A. Spryshkova. E.Y. Grigorleva. H.G. Haldenov. A.S.Yagu-bov. The use or radlolabelled 5-lodo-2'-deoxyurldlne for In vivo evaluation of Individual tumour response to Irradiation. - Lab. Zyvot-nye. 1991, vol. 1. N3. pp 53-57

3. P.А.Спрышкова. E.D.Григорьева. В.А. Братцев. А.И.Севастьянов. 5-йод-2'-дезоксиуридин в оценке индивидуальной реакции опухоли на облучение. - Вопросы онкологии. 1992. НЗ стр.327-334

4. Р. А. Спрышкова. Е.Ю. Григорьева. Е. D. Колдаева. а.С.Ягубов Настоящее положение бор-нейтронно захватной терапии опухолей.- Вопросы онкологии. 1995. 41. Н2< стр. 100-107

5. E.Y. Grigorleva. R.A'. Spryshkova. Hethodologlcal principles of use of 5-lodo-2-desoxyurldlne labelfed with radioactive Iodine for in vivo evaluation of individual tumour responses to Irradiation. -• VII International symposium on Neutron Capture Therapy for Cancer. 1996. B-26. p 43

6. R. A. Spryshkova. E. Y. Grigorleva. G. I. Borisov.' Biological effecacy of BStf-thertnal neutron irradiation estimated with different methods on the model of melanoma B-16. - VII International symposlun on Neutron Capture Therapy for Cancer. 1996, B-26. pp 43-44