Автореферат и диссертация по медицине (14.00.19) на тему:Методы прогнозирования эффективности лучевого и комплексного лечения онкологических больных и оценки индивидуальной радиочувствительности

За последние годы поиск клинически значимых прогностических факторов был сосредоточен на достижениях в области молекулярной биологии и иммунологии опухолей. Огромное количество работ было направлено на поиск молекулярных, иммунологических отличий, специфических для опухолевой ткани или для организма опухоленосителя (Давыдов М.И., Кушлинский Н.Е. 2005). Эти усилия привели к формированию практических рекомендаций по использованию таких показателей как иммунологические маркеры опухолей - онкомаркеры, широко применяемых в настоящее время в мониторинге опухолей, а также, для некоторых частных вопросов первичной диагностики например, использование альфа-фетопротеипа для диагностики рака печени. В настоящее время идет активная разработка методов диагностики опухолей, основанных на генетических отличиях опухолевых клеток от клеток ткани, из которых они происходят (Копнин Б.П. 2002, Георгиев Г.И., 2005). Большой спектр открытых мутаций в генах, получивших название онкогены или гены супрессоры опухолей, стали предпосылкой для разработки этих методов. Одним из практических приложений этого направления стало изучение индивидуальных свойств опухолевых клеток in vitro. Выделенные из опухолевого узла клетки исследуются на индивидуальную устойчивость к фармпрепаратам или радиационному воздействию (Владимирская Е.Б. 2005, Пелевина И.И., Дарьялова СЛ., и др. 2005, Орлова П.В., Замулаева И.А. и др. 2001). Перспективным направлением является также исследование характеристик клеток крови и поиск корреляций их индивидуальных реакций in vitro с такими важными клиническими показателями, как индивидуальная радиочувствительность, реакция опухоли на терапевтическое воздействие. Однако, до настоящего времени, попытки внедрения новых достижений в области молекулярной и клеточной биологии в клиническую практику не привели к появлению новых, эффективных методов диагностики и способов построения прогноза (Давыдов М.И. и др. 2000, Харченко и др. 2002,

Поддубная И.В., 2003). В то же время, в современной клинической онкологии, для ряда нозологических форм, разработаны международные прогностические индексы, основанные на результатах больших, межнациональных, мультицентрических исследований и объединяющих однородные данные, касающиеся нескольких тысяч больных и использующие комплекс клинических характеристик опухоли (Shipp et.al. 1993, Armitage, 2002). Эти прогностические показатели включают, как правило, набор данных о состоянии опухолевого процесса (например, стадия, распространенность н др.), состояние пациента, оцениваемое на основании различных полуколичественных шкал, а также включают один или несколько лабораторных показателей крови. Несомненная достоверность получаемых на их основе прогностических данных, сочетается с относительно низкой практической значимостью, па что указывает ряд авторов (Henderson et al. 2001, Bates et. al. 2001). Получаемая на их основе оценка параметра (время жизни или безрецидивногр периода) имеет очень высокую ошибку и не позволяет использовать данный критерий с необходимой эффективностью. В тоже время, несомненная достоверность изменения целого ряда лабораторных показателей, сопровождающая развитие злокачественной опухоли, с одной сюроны, и разработка новых, математических методов многопараметрического анализа таких данных с другой, создали предпосылки для получения важной и достоверной диагностической информации. Поэтому мы сформулировали следующую цель и задачи исследования.

Цель исследовании: построение модели индивидуальной радиочувствительности и прогноза для оценки эффективности лучевой терапии и мониторинга в процессе комбинированного и комплексного лечения онкологических больных.

Задачи исследовании:

1. Разработать методику, позволяющую достоверно оценивать уровень радиоиндуцированного апонтоза лимфоцитов in vitro.

2. Определить уровень спонтанного и радиоиндуцированного апоптоза у больных неходжкинскими лимфомами.

3. Установить возможные взаимосвязи между уровнем радиоиндуцированного апоптоза и терапевтическим эффектом у больных неходжкинскими лимфомами.

4. Оценить прогностическую ценность показателя радиоиндуцированного апоптоза периферических лимфоцитов крови.

5. Исследовать возможность прогпоза индивидуальной рпдиочувствитсльностн опухоли (ответа на лучевую терапию) на основании анализа клипико-лабораторных показателей методом распознавания образов.

6. Разработать метод объективной оценки общего состояния больного для использования сс в прогностических моделях.

7. Построение прогностической модели па основании клинико-лабораторных данных с использованием методов распознавания образов на примере группы больных неходжкинскими лимфомами.

8. Построение обобщенной модели оценки состояния онкологического больного в процессе лучевой терапии на основании использования методов распознавания образов.

Научная новизна Впервые разработан способ получения прогностических факторов для больных неходжкинскими лимфомами на основании анализа радиоиндуцированного апоптоза лимфоцитов in vitro.

Изучена эффективность различных методов распознавания образов для получения прогностической информации па основании клииико-лабораторных данных на примере большой группы больных неходжкинскими лимфомами (689 больных). Проведено фундаментальное исследование прогностической значимости анализа комплекса клинико-лабораторных показателей крови многомерными математическими методами для получения прогностических данных в онкологии.

Разработана математическая модель и создана оригинальная программа для количественной оценки индивидуального состояния здоровья у онкологических больных. Показано, что разработанные критерии могут использоваться для мониторинга эффективности лучевой терапии в процессе комбинированного и комплексного лечения.

Положения, выносимые па защиту:

1. Исследование радиоиидуцированной гибели периферических лимфоцитов in vitro у больных пеходжкинскими лимфомами позволяет прогнозировать чувствительность опухолевых клеток к планируемой терапии.

2. Использование методов распознавания образов для комплекса клинико-лабораторных данных, до начала лечения в группе больных пеходжкинскими злокачественными лимфомами позволят получить эффективную модель прогноза чувствительности к планируемой лучевой терапии.

3. Наиболее информативными оказались: метод дискримипаптного анализа -для прогноза эффекта лечения и метод искусственных нейронных сетей для оценки безрецидивного периода и общего времени жизни.

4. Использование методов распознавания образов позволяет построить модель адекватной оценки общего состояния онкологического больного на основании гематологических показателей крови.

5. Мониторинг общего состояния онкологического больного с помощью разработанного метода его автоматизированной оценки в процессе противоопухолевой терапии может служить дополнительным способом оценки адекватности проводимого лечения (прогноза эффективности терапии, коррекции курса проводимого лечения).

Публикации

По теме диссертации опубликованы 24 научные работы, среди которых 3 главы в монографиях.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Преобладающей тенденцией последних лет является использование лучевой терапии в едином комплексе с лекарственной терапией. В большинстве из предлагаемых новых программ лечения описывается применение классической лучевой терапии (Голдобенко Г.В. 1997, Андреев В.Г., Мардынский Ю.С. 1998, Ильин Н.В. 2002, Diehl V. et al. 2001,2003).

Современная тенденция уменьшения интенсивности лечебных программ для прогностически благоприятных групп больных злокачественными лимфомами (Харченко В.П. и др. 2002, Чехонадский и др. 2002) так же позволяет прогнозировать более широкое применение лучевой терапии в качестве самостоятельного метода лечения такого онкологического заболевания как "злокачественные неходжкинские лимфомы.

Трудности строгого обоснования правил лучевой терапии на основе данных радиобиологии объясняются все еще недостаточным знанием принципиальных соотношений радиочувствительности ткани с ее морфофункциональными особенностями и отсутствием надежных методов количественной оценки цитокинетических параметров различных опухолей и тканей, а тем более их динамики в процессе лечения (Акимов А.А., Ильин Н.В. 2003).

2.1.Оценка индивидуальной радиочувствительноси на основании исследования клеток in vitro.

В настоящее время большое внимание уделяется вопросам связанным с возможностью прогнозирования хода лечения (Голдобенко Г.В. и др. 2001, Henderson R. 2000, Henderson et al. 2001, Пелевина И.И. и др. 2005).

Особое внимание уделяется проблеме радиочувствительности и радиорезистентности опухолей, возможностью моделирования этими свойствами ткани (Schrek R., Stefani S. 1988, Dickson J. et al. 2002, Dikomey E. et al. 2003). В течение длительного времени радиобиологи, занимающиеся проблемами научного обоснования лучевой терапии злокачественных новообразований (в настоящее время это направление принято называть клинической радиобиологией), связывали проблему различий в радиочувствительности опухолей в основном только с двумя факторами: окснгенацией опухоли и способностью клеток опухоли к восстановлению от радиационных повреждений. В течение последних 10-15 лет значительно изменился взгляд на природу и механизмы радиационной гибели клеток, что связано, в первую очередь, с изучением генетических механизмов апоптотической формы клеточной гибели. Было обнаружено существование в клетке сигнальной системы, которая выявляет наличие повреждения генетических структур и может останавливать продвижение клеток по циклу для реализации восстановительных процессов возникших повреждений ( Kroemer G., Reed J.С. 2000). Эта же система контроля дает команду для запуска процессов, ведущих к апоптотической гибели клетки в случае неуспеха в реализации восстановительных процессов пли при исчерпании энергетических ресурсов клетки (Новиков B.C. 1996, Копнин Б.П. 2002). Работа этой сигнальной системы зависит от скоординированной деятельности группы генов, центральное место среди которых занимает ген р53. Оказалось, что большинство типов опухолевых клеток погибает после воздействия ионизирующей радиации в результате реализации аиоитоза. При этом обнаруживаются корреляции между индивидуальной радиочувствительностью опухоли, и показателями аиоитоза полученными при исследовании опухолевых клеток в краткосрочных культурах (обычно доля клеток, которая погибает без деления или после первого деления, если клетки были облучены в С2-фазе клеточного цикла, а также продолжительность общей задержки митоза или задержки в С2-фазе после облучения). Наличие таких корреляций свидетельствует о том, что индивидуальная радиочувствительность опухолевых клеток и радиочувствительность определенных форм опухолей зависят от состояния сигнальной системы клетки, принимающей решения о форме ее реакции на возникающие повреждения, куда входят также такие факторы как: активность репарационных ферментов, определяющих восстановление радиационных повреждений; выраженность гипоксии; наличие эндогенных радиопротекторов и др. Комплексное изучение деятельности эюй системы может привести к разработке принципиально новых методов управления радиочувствительностью и резистентностью злокачественных опухолей и нормальных тканей и к совершенствованию методов лучевой и комбинированной терапии онкологических больных (Thompson С.В. 1995.).

Известно, что облученные в условиях in vitro нестимулировапные к делению лимфоциты периферической крови людей гибнут путем апоптоза и эта гибель увеличивается с дозой облучения (Schrek R., Stefani S. 1988). Зависимость гибели лимфоцитов периферической крови от * дозы облучения у разных доноров различается, что дает основание рассматривать количественные данные об апоптотической гибели облученных лимфоцитов в качестве возможного показателя индивидуальной радиочувствительности (Орлова Н.В. и др. 2001). У люден с наследственными дефектами в генах, контролирующих апонтоз, устойчивость лимфоцитов к облучению значительно изменяется, что позволяет выявлять индивидуумов с мутациями в этих генах, например в антиопкогене р53, предрасположенных к развитию злокачественных новообразований. Поэтому можно предполагать, что уровень апоптотической гибели при облучении in vitro лимфоцитов здоровых людей и больных различными онкологическими заболеваниями будет различаться. Этот показатель может быть полезным для формирования групп риска в отношении радиогенных новообразований и прогнозирования исхода лучевого лечения опухолей (Орлова Н.В.и др. 2001).

Для идентификации апоптоза используется несколько методов: иммуногистохимическое выявление апоптоза, основанное на 2 критериях (определение нуклеосомальных фрагментов ДНК; выявление совокупности морфологических изменений ядра и клетки). Однако необходимо учитывать, что нуклеосомальные фрагменты появляются на поздних стадиях апоптоза, а более его ранние этапы связаны с высокомолекулярной фрагментацией ДНК и не выявляются данными методами. Для иммупогистохимической оценки апоптоза и основных механизмов, ответственных за его развитие, исследуются такие основные показатели как уровень р53, Bcl-2, Вах, Rb, Fas (Apo-l/CD95), циклинов (Ewers S.B, et al. 1993., Kumar S. 1999., Wijsman J.H. et al. -1994.).

Метод проточной цитофлуорометрии позволяет идентифицировать апоптоз, используя несколько специфических маркеров. В апоптопических клетках происходит переорентация фосфолипида фосфатидилсерина (ФС), который в норме локализуется па внутренней поверхности клеточной мембраны. Локализация фосфолигшда па поверхности мембраны наблюдается с ранней стадии апоптоза до полной деградации клетки. Использование рекомбппантного белка - аппексин V, обладающего высокой афиниостыо к ФС, конъюгированного с флуорохромом, позволяет идентифицировать апоптопические клетки (Manon van Engeland, 1998). Причем, использование аппекенпа V в комбинации с пропидием иодидом (PI) позволяет одновременно определять интактные клетки (отрицательные по аннексииу V и по PI), клетки находящиеся в раннем апоптозе (положительные по аннексину V и отрицательные по PI), и клетки находящиеся в позднем апоптозе или некрозе (положительные и по аннексину, и по PI) (55). Об уровне апоптоза можно судить и по уровню активности внутриклеточных ферментов, реализаторов апоптоза - каспаз (Kumar S. 1999,52). Предрасположенность клеток к спонтанному апоптозу можно оценить методом проточной цитофлуорометрии или флуоресцентной микроскопии (Погорелов В.М., Козинец Г.И. 1995) по уровню экспрессии рецепторов FASL с использованием моноклональных антител к CD95 и CD95L (Nagata S., Goldstein P. 1995, Аббасова С.Г и др. 2001).

Известно общее положение, что индивидуумы отличаются по уровню радиочувствительности. Оно лежит в основе интереса в измерении уровня радиочувствительности нормальных тканей для разработки меюда, позволяющего индивидуализировать противоопухолевую терапию. Большая часть исследований в этой области посвящена использованию краткосрочных культур фибробластов кожи и исследованию клоногенности после лучевого воздействия. Например (Alsbeih G. et al., 1999, 2000) оценивали фракцию выживших фибробластов после облучения 2 Гр нн витро. Сравнивали осложнения после радикальных курсов лучевой терапии со стороны нормальных тканей у пациентов с различной онкологической патологией, включая и XJIJI. Показали достоверную корреляцию между этими процессами. Результаты, по-мпению авторов, доказывают наличие генетических факторов, определяющих предрасположенность к осложнениям (характеру повреждений) в нормальных тканях. В тоже время в статье (Dikomey Е. et al. 2003.) больные раком молочной железы делились на группы в зависимости от наличия или отсутсвня местных лучевых осложнений после комбинированного лечения. Исследовалась связь образования радиоиндуцированпых двойных разрывов в ДНК фибробластов полученных у пациентов после биопсии кожи. Подтверждение корреляции этих процессов авторами не получено.

В целом ряде работ авторов показано соответствие таких параметров и поздних лучевых реакций (Brock W.A et.al.,1995, Burnet N.G. et.al., 1994,

Johansen J. Et.al., 1996), в то время как в других работах такого соответствия найдено не было (Peacock J., et al. 2000, Russell N.S., et.al. 1998). Исследования, проведенные в последнее время, позволяют заключить, что клеточные реакции ин витро отражают радиочувствительность клеток ин виво, но не отражают всего комплекса реакций, происходящих на тканевом уровне в целостном организме (Schrek R., Stefani S. 1988). Даже учет изменения спектра синтеза цитокинов не позволяет провести достаточно адекватных аналогий (Tucker S.L., 1992, Turreson I., 1996 ). Автор делает вывод, что, возможно, измерение клеточной гибели или повреждения ДНК ин витро, никогда не будет доспи очно чувствительно для предсказания реакции нормальных тканей на облучение пока дополнительные факторы (например, изменение уровня цитокинов и др.местных регуляторов клеточных реакций) не будут учитываться.

В обзоре (Twardella D., Chang-Claude J., 2002) рассматриваются вопросгл разработки тестов индивидуальной радиочувствительности ин витро. Отмечается, что эта важная задача, до настоящего времени не решена. Большинство данных, опубликованных до настоящего времени и связывающие индивидуальную радиочувствительность и риск развития осложнений должны быть пересмотрены. Это обосновывается обнаруженным авторами отсутствием достоверности отличия в индивидуальной радиочувствительности для групп пациентов, получавших лучевую терапию в комплексной программе лечения рака молочной железы, отличающихся различным риском развития поздних осложнений (Dickson J. et al., 2002) (Dickson J. et al., 2002).

Повышенную радиочувствительность можно описать как внутреннюю характеристику, которая связана с увеличенной реакцией человека на ионизирующую радиацию. Она наблюдается в форме ряда побочных эффектов возникающих в процессе стандартных курсов лучевого лечения. Обнаружение усиленных реакций на лучевую терапию у пациентов страдающих рядом наследственных заболеваний (атаксия телеаигиоэктазия

AT)) определяет, что генетическая предрасположенность имеет существенное значение в этом процессе. На клеточном уровне увеличение реакции на радиационное воздействие, как было показано, связано с рядом генетических нарушений, включая AT (Scott D., et.al. 1998, Scott D. 2000) Более того, было показано, что у пациентов, имеющих гетерозиготный мутантный AT ген увеличен не только уровень радиочувствительности, но и риск развития онкологических заболеваний (Swift М., et.al. 1986) Однако эти данные дискутируются до настоящего времени (Scott et al.1998., Twardella, Chang-Cloude 2002). В тоже время, вопрос может быть поставлен так, как эти пациенты могут быть защищены ог побочных эффектов лучевой терапии. Можно ли этих пациентов выделить из общей группы пациентов. Остается открытым вопрос об индивидуализации лучевой терапии, необходимо ли снижение дозы пациентам, имеющим повышенную радиочувствшельносчь, и можно ли повысить дозу остальным пациентам. Для решения всех этих вопросов необходимо разработка методов оценки индивидуальной радиочувствительности (Burnet N.G., et.al. 1996, Norman A., et.al. 1998, Tucker S.L., et.al.).

Многие группы исследователей делали попытки разработать подобные тесты, основанные па различных вариантах исследования клеточных процессов нн витро. Однако до настоящего времени пет ни одного достаточно убедительного теста, способного предсказывать осложнения лучевой теаргши, так же как нет единственного теста, способного предсказать чувствительность к лучевой терапии.

При разработке таких тестов должна учитываться сложная концепция радиочувствительности. Лежащая в основе генетическая база, в настоящее время, не достаточно изучена и поэтому не может быть использована напрямую, т.е. посредством, например исследования генетического полиморфизма генов мишеней.

Различные показатели клеточных популяций и внутриклеточных характеристик, такие как выживаемость клеток, формирование хромосомных аббераций, апоптоз могут определять индивидуальную радиочувствительность. Поэтому, ин витро тест должен использовать эти показатели как отправные точки для оценки индивидуальной радиочувствительности.

Для пациента, кроме непосредственно противоопухолевого эффекта, точками интереса являются осложнения острые, отдаленные, включающие также и индукцию вторичных опухолей. Частота и интенсивность этих реакций определяются не только генетической предрасположенностью, но и интенсивностью лучевого воздействия, и другими модифицирующими факторами. «Ожидаемые» клинические реакции, поэтому, должны выводиться из статистического моделирования информации по лучевой терапии и другим негенетическим факторам. В тоже время, для практики, важно понимать, что наблюдаемая клиническая реакция, при исключении влияния вариантов лучевой терапии и других модифицирующих факторов, является, генетически детерминированной. Делая заключение о генетической компоненте лучевых реакций необходимо сказать, что связь между наблюдаемыми и ожидаемыми клиническими лучевыми реакциями должна использоваться, и это называется клинической радиочувствительностью.

Поэтому тесты на радиочувствительность ии витро должны прежде всего определять корреляцию между ин витро радиочувствительностью и клинической радиочувствительностью, а не количеством клинических лучевых реакций.

В работе (А.И. Свирновский и др. 2004) исследовалась возможность использования индукции апоптоза ин витро в образцах периферических лифоцитов для оценки эффективности терапии у больных системной красной волчанкой. Работа интересна изложенной в ней идеей вычисления относительного индекса апоптоза некоего эмпирического соотношения уровня индуцированного и спонтанного процесса программированной клеточной гибели. Для установления взаимосвязи спонтанного и индуцированного апоптоза лимфоцитов вычислен относительный апоптотический индекс (ОАИ) по формуле:

ОАИ = [(Х1ШД>1, - Хспоит.)/Хспо„т.] х100%, где ХИ1!дуц— процент апоптотических клеток (абсолютный апоптотический индекс) для индуцированного апоптоза, а ХСП01П. — аналогичный показатель для спонтанного апоптоза. Показано, что такой индекс может быть чувствителен к эффективности терапии.

Отмечена обратная зависимость величин ОАИ от степени активности процесса у больных системной красной волчанкой. Улучшение в результате проведенного лечения соответствует большей величине ОАИ, а отсутствие изменений— его меньшему значению. Следовательно, лимфоциты больных, более чувствительных к традиционной терапии, в большей степени отвечают на действие лекарственных препаратов in vitro интенсификацией апоптотических процессов.

Несмотря на то, что работа посвящена исследованию процессов апоптоза при системной красной волчанке, основные идеи могут быть перенесены и на другие патологические процессы, включая онкологическую патологию.

В работе (М.П. Потаннев и др. 2004) целью было изучение общих и отличительных черт спонтанного апоптоза лейкемических клеток в зависимости от их линейной принадлежности (вида экснрессируемых поверхностных маркеров (CD)) и степени днфферепцировкн. Уровень спонтанного апоптоза опухолевых клеток больных острыми лейкозами оценивали после культивирования in vitro в течение 24 ч. Экспрессию апоптоз ассоциированных молекул (FasR, FasR, Bcl-2 и р53) выявляли па свежевЕ.щеленных опухолевых клетках костного мозга 115 пациентов с первичным острым миелоидным (ОМЛ) или острым лимфобластпым лейкозом (ОЛЛ).

При сравнительном анализе пяти методов определения апоптотических клеток установлено, что наибольшей чувствительностью обладают методы, детектирующие ранние/промежуточные стадии апоитотических процессов: выявление морфологических изменений ядра апоптотических клеток с окрашиванием акридиновым оранжевым в присутствии бромистого этидия с использованием флуоресцентной микроскопии; определение апоптотических клеток по детекции фосфатидилсерипа па внешней поверхности мембраны клетки с помощью AnnexinV-FITC-kit; выявление потери мембранного митохондриального потенциала с помощью катионного зонда JC-1; выявление разрывов ДНК с использованием APO-BrdU-kit. Как было выявлено далее в ходе исследования, ленкемические клетки при ОМЛ по сравнению с ОЛЛ обладают сниженной способностью к спонтанному апоптозу, сниженной экспрессией Вс1-2 и повышенной экспрессией Fas-R. В свою очередь опухолевые клетки при Т-линейном ОЛЛ характеризовались более высокой экспрессией Fas-R и меньшей экспрессией Вс1-2 по сравнению с таковыми при В-лннейном ОЛЛ. Уровень спонтанного апоптоза также связан со степенью дифференцировки клеток при В-линейном ОЛЛ. 'Гак. в ряду опухолевых клеток при Common-Pre-B-Mature-B-субтипах ОЛЛ наблюдали возрастание уровня спонтанного апоптоза и снижение экспрессии Вс1-2. Па опухолевых клетках различных субтипов ОМЛ наблюдали увеличение экспрессии Fas-R и снижение экспрессии Вс1-2 в ряду М0/М1-М2-МЗ-М4/М5. Среди субтинов ОМЛ минимальный уровень апоптоза установлен для варианта МЗ.

В работе (Дедюля Н.И. 2004) проводилась оценка реакции нммунокомпетентных клеток (ИКК) на воздействие антител различной природы у реципиентов гемопоэтических клеток (ГК) в период восстановления кроветворения и иммунного ответа.

Мероприятия по нормализации гомеостаза организма у больных, в комплексной терапии которых используются аллогеипые трансплантации гемопоэтических клеток (ТГК), предусматривают как функциональную оценку активности отдельных систем его жизнедеятельности на разных этапах посттрансплантацнонного периода, так и поиск средств, модулирующих этот уровень. В исследование были включены реципиенты ГК. Оценивался уровень спонтанного и индуцированного апоптоза мононуклеаров периферической крови (МПК) до начала режима кондиционирования (собственно МПК больного; данная постановка исключается из протокола для пациентов с диагнозом апластической анемии) и в различные сроки после ТГК, т.е. на разных стадиях восстановления гемопоэза. У больных в период до и после ТГК уровень апоптоза был повышен (24,2 ±1,2) но сравнению с аналогичными показателями для здоровых доноров (5,8 ±1,5). Максимальный уровень апоптоза регистрировался в ранние сроки после ТГК (21,5 ±1,3), а затем по мере восстановления гемо- и иммунопоэза наблюдалось его снижение (16,3 ±1,1) до показателей, сравнимых с аналогичными для здоровых людей, что позволяет рекомендовать использование показа1еля апоптоза в качестве дополнительного критерия приживления трапсилантата. Регистрируемые в различные сроки . после ТГК уровни апоптоза МПК реципиента коррелировали с пролиферативной активностью этих клеток, что выражалось в изменении распределения по фазам клеточного цикла с увеличением доли клеток в S-фазе в сроки, характеризующиеся максимально высоким уровнем апоптоза. Обработка МПК реципиентов ГК препаратами иммуноглобулинов (лимфоглобулин и тимоглобулип) приводила к уменьшению числа аноптотических клеток независимо от срока с момента трансплантации. Интересный подход для оценки индивидуальной радиочувствительности предложен в работах А.В.Шафиркнпа и соавтров (Shafirkin AV, Nosovskii AM. 2001, Shafirkin AV. 2000, Shafirkin AV, Korotkevich AO, Shtemberg AS. 2000). Ими вводится генерализованный индекс, основанный на несложном математическом преобразовании показателей крови (включающий такие характеристики как: кортикостерон, уровни электролитов крови и т.п.) и позволяющий оценивать уровень радиационного повреждения у экспериментальных животных (мыши, крысы). Исследование динамики такого индекса в процессе хронического облучения позволяет предсказать реакцию при следующих сеансах облучения.

Rzeszowska-Wolny J. 2005) исследовал связь образования двойных разрывов ДНК, уровня апоптоза после облучения лимфоцитов ин витро в дозе 2 ГР и полиморфизма генов репарации ДИК (XPD codon 312Asp --> Asn and 751Lys --> Gin, XRCC1 399Arg -> Gin, and MGMT 84Leu --> Phe). Было показано, что уровень повреждения ДНК отличается более чем в 10 раз у различных индивидуумов. При этом связи с полом или курением не обнаружено.

Ш1Ч11ПИП ЧТО nnnmmniliin»» ггчтглп прпптмии ПН!/" (пп. iriniiupij *4f»r\r» rciia

Itu JMIIO) llU Iiu.illiuvjy Vp Il^lli 1 Vll IJ 1111 J ' 114. ^11 t» Ivpul illvll lilCpv 1 WllU

XPD) может быть нричпиой индивидуальной реакции повреждаемости ДНК. Обращается внимание, что реакция лимфоцитов па облучение может отличаться о реакции других клеток организма.

В статье (Иванов С.Д. 1999) обсуждается проблема такого осложнения противоопухолевой терапии как лейкопения, которая, представляет собой основной фактор риска развития инфекций у больных, лимфогранулематозом (ЛГМ) при интенсивных режимах лечения, а сопутствующая лейкопении иммуносупрессия может приводить к развитию вторичных опухолей. В обзоре рассматриваются различные подходы прогнозирования индивидуальной радиочувствительности (РЧ) и чувствительности к химиотерапии (XT) больных ЛГМ. Показатели периферической крови, в частности, уровень лейкоцитов, коррелируют с глубиной лейкопении лишь у первичных больных ЛГМ, которым проводилась лучевая терапия (ЛТ). Определение гематологической толерантности в последние годы было связано как с углубленным математическим анализом исходных клинико-бпохимических показателей, так и с выявлением факторов прогноза на основании учета более широкого круга исходных данных пациента. Оба этих подхода представляются более точными, чем метод, базирующийся па определении только числа лейкоцитов, но для оценки возможности проведения ЛТ или XT полностью в запланированном объеме они не всегда достаточно информативны. Определение радиочувствительности фибробластов in vitro коррелировало со степенью поражения нормальных тканей пациентов при JIT, но такой подход ограничен количеством материала для исследования и временем анализа (2-3 месяца). Лимфоциты крови являются более предпочтительным материалом для анализа, по вариабильность теста между субъектами не позволила применять его для прогнозирования радиочувствительности организмов. Анализ хромосомных повреждений достаточно информативен, но трудоемок и длителен. Микроядерный тест, примененный для прогнозирования реакции пппмотп iir iv TiroiuiM ттг>т* тт\П1аили Ani^vniwiu IK* notvp /^'vo ^иш ш iv / hi i m»

H^>plVlUVlliUlU/V 1 IXUllVU liptl JLJ IVUUll \J 11J AUJ iv^tl, 1 1S^ ^/iUUHJUJll ui/v Jlbilll wu при его клиническом применении. Определение уровня радиочувствительности CD4- и С08-содержащих Т-лимфоцитов к индуцированному облучением апоптозу с помощью проточной цитометрии ipe6yei дорогоеюяще!о оборудования и реактивов и 24-часовой инкубации клеток. Кометный тест требует небольшого количества клеток, но .необходимо проведение процедуры электрофореза и программного анализа микроскопических изображений окрашенных флуорохромом ДИК.

Определение степени деградации ДНК лейкоцитов у больных ЛГМ до начала лечения пациентов после облучения пробы крови in vitro и последующей краткосрочной инкубации позволило в течение 4 ч выявить взаимосвязь измерявшегося параметра (S-ипдекс) с уровнем развития лейкопении. Отрицательная корреляция наблюдалась для изменений S-индекса в случае ЛТ и положительная корреляция - при XT. Сопоставление с цитогеиетическимн показателями свидетельствовало о том, что изменения S-индекса отражали количество хромосомных аберраций нестабильного типа (число дицептриков). Таким образом, автор предлагает новую методику быстрого определения биохимического показателя прогноза лейкопении в процессе ЛТ и XT у первичных больных ЛГМ до начала лечения. Этот индекс может быть также использован для более эффективного использования лейкостимуляторов при необходимости проведения соответствующей поддерживающей терапии у пациентов с ЛГМ.

На недостаточность одной генетической информации для оценки клинической радиочувствительности указывается в работе ( M'kacher R. et. al. 2003). Авторы показали, что опухолевые клетки у пациентов с лимфомой мантийной зоны могут отличаться радиочувствительностью от нормальных лейкоцитов, независимо от статуса р53. Повышенная радиочувствительность этого типа клеток может быть использована при планировании терапии. Аналогичные данные получены (Oppitz U., 1999), который исследовал связь мутаций генов ATM и радиочувствительность. Несмотря на использование самых современны методов корреляции уровня мутаций и постлучевых осложнений обнаружено не было.

В тоже время в работе (Dubray В. et. al 1998) обнаружена связь между уровнем радиоиндуцированпого апоптоза лимфоцитов ин витро и непосредственным ответом па лучевую терапию у больных неходжкппскими лимфомами. Авторы показали, что уровень спонтанного и радиоиндуцированпого апоптоза клеток, полученных в результате игловой биопсии у больных злокачественными неходжкппскими лимфомами могут служит эффективными факторами прогноза для непосредственных эффектов лучевой терапии. Аналогично (Tamminga RY, et al. 2002) показали, что оценка радиочувствительности и химиочувствнтельности к доксорубицину ии витро корелнрует с клиническими данными. Поэтому авторы предлагают интенсифицировать протоколы лучевого и химиотераиевтичского лечения на основании исследования ин витро тестов па фибробластах. Интересные результаты по исследованию индивидуальной радиочувствительности приводятся в статье авторов (Орлова Н.В. и др. 2001). Авторы подчеркивают, что облученные в условиях in vitro нестимулированные к делению лимфоциты периферической крови людей гибнут путем апоптоза и эта гибель увеличивается с дозой облучения. Зависимость гибели лимфоцитов периферической крови от дозы облучения у разных людей отличается, что дает основание рассматривать об апоптотической гибели облученных лимфоцитов в качестве возможного показателя индивидуальной радиочувствительности. Авторы не обнаружили различий в коэффициенте радиочувствительности в группе здоровых доноров и обследованных онкологических больных. В тоже время, ими подчеркивается, что исследование показателей радиоиндуцированного апоптоза - как индикатор интерфазной гибели может быть альтернативным подходом к определению индивидуальной радиочувствительности.

Таким образом, па основании анализа литературы можно констатировать, что исследования in vitro показателй радиочувствительности нормальных и опухолевых клеток с использованием как показателей пролпфсративпой, так и интерфазной гибели клеток является перспективным напрвлепием для оценки индивидуальной радиочувствительности. Несмотря на то, что большинство классических результатов радиобиологии основаны на исследовании изменения свойств клоногенности, исследование показателей интерафазной гибели, основанные на последних достижениях молекулярной биологии и лабораторной техники позволяют говорить о перспективности разработки этого направления. Кроме того, анализ литературы позволяет сделать вывод о предпочтительном использовании лифоцитов периферической крови для разработки тестов индивидуальной радиочувствительности.

4.2. Нсходжкннскнс лимфомы. Факторы прогноза.

Т.к. наибольшую группу исследованных пациентов составили больные злокачественной неходжкинской лимфомой мы сочли целесообразным рассмотреть современное состояние проблемы прогноза для этой патологии.

Неходжкинские лимфомы (HXJI) - это гетерогенная группа злокачественных лимфопролиферативных опухолей, отличающихся по биологическим свойствам, морфологическому строению, клиническим проявлениям, ответом на терапию и прогнозу (Rai K.R. et al. 1975, Kalil N., Cheson B.D. 1999, Kay N.E. et al. 2002, Поддубная И.В. 2000, Поддубная и др.

2001). Для лечения HXJI применяются все виды противоопухолевой терапии. Основными факторами, влияющими на выбор терапевтической тактики, являются: морфологический вариант опухоли, распространенность процесса (клиническая стадия - I-II или III-IV), первичная или преимущественная локализация опухолевого поражения, факторы прогноза. Выделение различных вариантов IIXJ1, основанное изначально только на морфологических особенностях опухолей, в настоящее время базируется на иммунофенотипических характеристиках опухолевых клеток и является комплексным, учитывающим клиническую картину и другие биологические особенности.

Это нашло отражение в изменении классификаций HXJI: REAL (1994 г.), ВОЗ (1999 г.). Точное определение морфоиммунологического варианта опухоли в соответствии с современными требованиями необходимо клиницисту для определения лечебной тактики. Пятилетняя выживаемость при HXJI широко варьирует в зависимости от морфологического варианта. При В-клеточных лимфомах маргинальной зоны, MALT, фолликулярных она превышает 70%, что трактуется как хороший прогноз, тогда как при Т-лимфобластпых, периферических Т-клеточных HXJI этот показатель ниже 30%. Кроме того, опухоли весьма разнообразны по прогнозу. К благоприятным вариантам (5-летняя выживаемость выше 60%) относятся первичные IIXJI желудочно-кишечного тракта, кольца Пирогова-Вальдейера, орбиты, слюнных желез, легких. В противоположность этому, высокой злокачественностью течения отличаются первичные лимфомы яичка и яичников, костей, молочной железы, ЦНС.

На основании тщательного изучения всех проявлений HXJI было установлено, что наиболее значимыми факторами неблагоприятного прогноза являются: возраст старше 60 лет, повышение уровня ЛДГ, общее состояние больного, соответствующее 2-4 степени (ECOG), III-IV стадия болезни, наличие более одного экстраподал ыюго очага поражения, вовлечение костного мозга. Это было положено в основу Международного прогностического индекса - МНИ (IPI). На основании количества имеющихся неблагоприятных факторов прогноза выделяют 4 степени риска раннего прогрессировать болезни:

• низкая - отсутствие или присутствие лишь одного неблагоприятного признака,

• низкая/промежуточная - наличие 2 факторов,

• промежуточная/высокая - наличие 3 факторов,

• высокая - наличие 4 факторов. Наличие двух и более факторов отчетливо отрицательно сказывается па прогнозе заболевания независимо от морфологического варианта опухоли. Именно это, в определенной мере, и объясняет условность принятого разделения HXJI по степени злокачественности, так как прогноз существенно изменяется внутри одного варианта опухоли в зависимости or факторов риска. Например, при диффузной крупноклеточной В-клеточпой HXJI 5-лстняя выживаемость при низкой степени риска равна 72%, а при высокой -22%, что значителыюотличается отусредненного- показателя - 45%. Убедительно продемонстрировано влияние на 5-летнюю выживаемость неблагоприятных факторов прогноза отрицательное значение которых отмечается при всех морфологических вариантах HXJI. Эта зависимость прослеживается и при оценке эффективности лечения.

Снижение результативности терапии отмечено и при дополнительных факторах прогноза: высокого уровня экспрессии Вс1-2, что уменьшает частоту 5-летних ПР с 68 до 45%. Определение группы риска не является в настоящее время стандартным критерием для выбора терапии, но предполагает возможность ее интенсификации на всех этапах развития болезни (Харчепко В.П., Панынип Г.А, Сотников В.М. 2002). Разделение всех морфологических вариантов по степени злокачественности остается обоснованным требованием клиницистов. Опухоли низкой степени злокачественности характеризуются медленным прогрессированием, длительной выживаемостью (годы), умеренной чувствительностью к химиотерапии и отсутствием возможности излечения при использовании стандартной химиотерапии. Высоко агрессивные лимфомы быстро прогрессируют, выживаемость составляет лишь месяцы, они умеренно- и высокочувствительны к химиотерапии и могут быть излечены стандартными методами химиотерапии. Однако внутри этой группы IIXJI выявляются весьма значимые различия в продолжительности жизни: 5-летняя выживаемость колеблется от 78% при анапластической крупноклеточной лимфоме до 14% при лимфоме зоны мантии, в то время как при диффузной В-крупноклеточной лимфоме и Ш степени фолликулярной лимфомы этот показатель равен 38% и 68%. (соответственно).

Таким образом, можно констатировать,что существующие методы прогноза не дают достоверных оценок. Очевидно, необходима разработка новых методов, для формирования гомогенных групп при планировании программ лечения.

Montillo М. et. al., 2005) обращает внимание, что клинически и прогностически группа больных XJIJI очень гетерогенна. В то время как одни пациенты могут иметь удовлетворительную продолжительность жизни даже без какого либо специального лечения, другие погибают от резистентных вариантов в течении 2 лет. В тоже время, ситуация с факторами прогноза для XJIJI противоположная группе пациентов неходжкинской лимфомой. Для этой группы нет общепризнанного прогностического индекса. В тоже время идентифицировано ряд прогностических факторов, которые могут быть перспективны для добавления их в классическую систему стаднровапия. Они включают клинические характеристики: возраст, пол, PS, и ряд лабораторных показателей: количество лимфоцитов, ЛДГ, инфильтрацию костного мозга, активность пролиферации лимфоцитов (or lymphocyte doubling time.). В последнее время более информативные показатели были обнаружены: растворимый CD23, бета 2 микроглобулин или тимидинкиназа, генетические маркеры опухолей (хромосомные абберации, нарушения генов р53, ATM), и др. Автор подчеркивает, что оценка прогноза больных XJIJI претерпела революционные изменения. Так, было показано, что, кроме классических клинических параметров, некоторые биологические особенности также коррелируют с прогнозом и могут повысить прогностическую ценность систем клинического стадирования Rai и Binet (Binet 1981). Клинические классификации, внедренные около 30 лет назад, эффективны относительно сортирования пациентов на большие прогностические группы, обеспечивая информацию как для выбора терапии, так и для проведения клинических исследований с возможностью сравнения тшюитпч г> ПТЩЦПУППЧЧ ппогипчОЧ Т^М ur> мриоп ТГЧ <"■ I'РТ^*' чг> г'пП'^оПч1 1

1 lit ■ I 11VII 1 l.> V 111 Lll V О 11 114 upul 1 1 1.1 J 1.1 111. JL Vlli 11V 1'IVllVVj -J 111 bnvlvltiul 11V Vliv/vm'lllll точно предсказать течение заболевания индивидуального пациента без включения новых знаний о молекулярной патологии XJIJI. Вывод автора-стратификация новых эффективных методов терапии (включая трансплантацию костного мозга, Мабтеру и т.п.) требует внедрения более адекватных прогностических маркеров.

Авторы работ (Hans СР., et al. 2004, Rosenwald A., et al 2003, Dybkaer К. et al. 2004, Rosenwald A., et al 2003 ) также обосновывают использование новых~молекулярных методов (биочипыдля определения трапслокацпй и™ спектра других молекулярных нарушений в клетках ) для построения диагностических и прогностических систем классификации для группы неходжкинских лимфом .

Новые прогностические факторы XJIJI

Аберрации генома

Цитогепетика является одним из самых мощных прогностических инструментов у больных острыми лейкозами (Norman A. et al. 1998). Цитогепетические исследования больных XJIJI не применялись широко вплоть до недавнего времени. Обычные группирующие методики у больных XJIJI затруднены из-за низкого митотического индекса и субонтимального качества метафазы опухолевых клеток. Внедрение метода исследования интерфазы - FISH - значительно повысило чувствительность цитогенетических исследований (Scott D. 2000). FISH имеет два преимущества по сравнению с обычными цитогенетическими методами: 1) позволяет определять специфические повреждения хромосом неделящихся клеток, что было бы исключено при анализе метафазы, и 2) делает возможным определить потерю хромосомного материала до ста килобаз; потеря таких размеров находится далеко за пределами разрешающей способности классических цитогенетических методов. С помощью FISH нарушения могут быть обнаружены у 80% больных при использовании 4-пробной панели для определения трисомнн 12q 13 и делении 13qI4, 17р13 и 1 lq22-23. Вще у 10% больных могут быть делеция 6q21, транслокация 14q32, и частичная трисомия 3q или 8q. Частота этих цитогенетических повреждений, определенная в большом исследовании, была следующей: 13q, 36%; трисомия 12q, 14%; llq-, 17%; 17р~, 7%; другие повреждения, 8%; отсутствие определяемых повреждений, 18%.

Вышеупомянутое прогностическое значение цитогенетических факторов имеет отношение к XJIJI: медиана выживаемости больных с 13q- составляет 133 мес., пациентов с трисомией 12q - 114 мес., у пациентов с неопределяемыми отклонениями - 111 мес., с llq- -- 79 мес., и, наконец, с 17р- - 32 мес (Новик А.Д. и др. 2002).

Серологические параметры.

Некоторые серологические параметры, такие, как Р2-микроглобулин ф2-MG), тимидиновая киназа (ТК), и растворимый CD23 являются независимыми прогностическими факторами, имеющими важное значение. (32-MG является внеклеточным протеином, нековалентно связанным с а-цепыо большого комплекса гистосовместимости (МНС) класса 1, определяемого в сыворотке. [32-MG связан с плохим прогнозом при первичном диагностировании, и с повышенными его значениями у больных с короткой выживаемостью. Оцененный в контексте с другими прогностическими параметрами, P2-MG , по-видимому, имеет самостоятельное прогностическое значение (Hallek М. Et al. 1996).

Активность сывороточной ТК (s-TK) у больных XJIJI, возможно, связана с количеством делящихся опухолевых клеток, отражая опухолевую массу и уровень клеточной пролиферации. Способность уровня s-TK определять подгруппы пациентов с ранним XJIJI и высоким риском быстрого прогрессирования кажется особенно полезным. По результатам CCL1-исследования Германской Группы Изучения XJIJI уровень s-TK оказался среди 4-х наилучших параметров, предсказывающих короткий период безрецидивной выживаемости.

CD23 является функциональной молекулой на поверхности B-XJIJI клеток. Повышенный сывороточный уровень ее расщепленной формы (sCD23) означает худший прогноз. Тем не менее, это не утверждено в качестве независимого прогностического признака. Значимость некоторых серологических маркеров в настоящее время ограничена из-за недостатка стандартных методов их оценки, использования разных лабораторных методик в различных сериях, отсутствия оценок в проспективных исследованиях. Представляется привлекательным включить разные серологические маркеры, каждый из которых вносит свой вклад в определение прогноза, в прогностические модели, подразумевая, что их совместное использование, объединяющее различные биологические аспекты XJIJI, позволит получать большую, чем при отдельном применении, информацию (Roue G et al. 1999).

Мутационный статус генов иммуноглобулина и другие маркеры.

В 1999 г. две группы исследователей показали, что у пациентов с иммунофепотипом клеток памяти наличие мутированных генов иммуноглобулина (IGVH) связано с наиболее благоприятным течением и малой вероятностью прогрессирования заболевания, в то время как отсутствие этих мутаций сопряжено с высоким риском прогрессировать и короткой выживаемостью.

Хотя существует тенденция появления негативных изменений кариотипа главным образом в подгруппе больных с не мутированным IGVH, эта связь пе абсолютна, а отклонения кариотипа и статус мутации гена иммуноглобулина являются самостоятельными прогностическими факторами. Медиана выживаемости пациентов с не мутированными генами Ig и делецнями 17р составляет всего около 3 лет. К сожалению, изучение IGVH трудно воспроизводимо в обычной лаборатории, поэтому этот аспект в настоящее время упускается у большинства больных XJIJI.

CD38 является белком мембраны, обозначающим клеточную активацию и созревание, и обладающим сигнальной активностью. Экспрессия CD38 связана с наличием атипичной морфологии неопластичееких клеюк, наличием диффузной инфильтрации костного мозга, высоким периферическим лимфоцитозом и. менее благоприятным прогнозом 1б. В других исследованиях обнаружено частое совмещение наличия экспрессии CD38 и наличие мутационного статуса IGVH, хотя и не всегда, при этом CD38 может экспрессироваться периодически. CD38 в настоящее время рассматривается как независимый прогностический маркер с самостоятельной клинической значимостью (Shanafefelt T.D et al. 2004).

Применение новых прогностических факторов дли припиши клинических решений: определение групп риска.

XJIJI является комплексным заболеванием с довольно различным исходом. Согласно последним исследованиям, больные с прогрессированием заболевания умирают преимущественно от его осложнений, чаще всего инфекционных.

Как было отмечено, стратификация пациентов XJIJI на прогностические группы с использованием новых молекулярных маркеров имеет возрастающее значение, позволяя рационализировать терапевтическую стратегию. В преддверии разработки прогностического индекса, текущая прогностическая информация для выявленных впервые больных XJIJI включает в себя определение стадии, ЛДГ (LDH), CD38, идентификация генетических аберраций с помощью FISH, изучение мутационного статуса IgVH, и ZAP-70 (Durig J. et al. 2002).

Внедрение новых более точных прогностических факторов может способствовать проведению рандомизированных клинических исследований влияния раннего интенсивного лечения пациентов с небольшой опухолевой массой и илохими прогностическими признаками на увеличение сроков выживаемости (Solary Е., et al.). Более того, они могут влиять на выбор первичной и последующей терапии пациентов с генерализованным или рецидивирующим процессом.

4.3.Математнческне методы анализа медицинской информации для получения новых факторов прогноза.

Планирование исследования и адекватный анализ полученных данных составляет непременную часть научной деятельности, а статистические методы являются математическим аппаратом, применяемым для этого. Достижения в области технического обеспечения (на компьютерах первых поколений некоторые задачи с применением итерационного алгоритма могли решаться несколько дней) и создание современных математических и статистических пакетов, оснащенных большинством новейших методов обработки, позволили значительно расширить области применения и внедрения этих методов в медицине. Одним из главных направлений работы исследователей стало не только изучение информационной ценности новых методов диагностики и лечения, но возможность по-новому оценить информативность традиционных (рутинных) показателей. В современных исследованиях в начальный список изучаемых признаков входят практически все клинические и лабораторные показатели, доступные исследователю. Так, например, в работе были исследованы более 200 клинических и лабораторных показателей для оценки их прогностической важности при раке легкого (Buccheri, Ferrigno, 1994). Неудивительно, что при таком объеме информации па первое место стали выходить методы, применимые для обработки многопараметрических данных. Даже такой традиционный метод, как критерий Стыодента - метод сравнения достоверности отличия средних, из-за этих отличий (особенностей) уступает место методу анализа дисперсий, позволяющему работать с многопараметрнческнмп таблицами (М A NOV А) и в большинстве зарубежных журналов, результаты, обработанные без использования этого метода, не принимаются к публикации.

Рассматривая применение методов многомерного анализа при разработке методов прогноза в медицине необходимо отметить ряд принципиальных ограничений имеющихся у них. Т.к. основные принципы в методах прогноза основаны на методах линеаризации, то для них свойственна чувствительность к размерности выборки (количеству исследуемых объектов, которое зависит уже не только от дисперсии анализируемого признака, как это было при сравнении средних). Линейные методы аппроксимации (регрессии, прогноза) требуют, чтобы на каждый анализируемый признак (переменную) в группе было около 10 объектов ( в случае клинических исследовании - пациентов). Т.е. если исследуется 10 показателей, например 10 биохимических показателей крови, то в группе должно быть 100 пациентов (Бейли, 1970, Боровиков, Боровиков, 1997, Боровиков, Ивченко 1999, Denne, 2001). Это ограничение является принципиальным не только для методов линейной регрессии (и других методов линеаризации), но и таких методов, как дискримипантиый и факторный анализ. Хотя в ряде работ говорится, что кластерный анализ менее чувствителен к размерности выборки, при его использовании также надо учитывать это ограничение (Боровиков, Ивченко, 1999, Гланц, 1999, Gould, 2001).

Внедрение в медицину современных молекулярных технологий также сталкивается с проблемой размерности. Например, одно из важных применений метода анализа профиля экспрессии генов с использованием микрочипов - создание новых подходов в классификации опухолей (Bustin, Golub, 2000, Park et al., 2002). Возможность измерять большое количество генов приводит к тому, что количество переменных (генов) значительно превосходит количество образцов. Т.е. наступает условие, когда стандартные статистические методы классификации не работают пли имеют существенные ограничения. Т.е. возникает необходимость разработки новых методов для анализа таких данных при решении задач классификации и предсказания.

Проблемы такого рода называются проблемами размерности и могут быть решены с помощью специальных методов. К таким методам можно отнести методы факторного анализа, многомерного шкалирования, генетического алгоритма - одного из алгоритмов, использующихся в методе искусственных нейронных сетей, а также некоторые варианты кластерного анализа.

Подходы для получения прогностической информации могут существенно отличаться как по набору анализируемой информации, так по способу получения окончательной информации. Они могут быть организованы в виде таблиц, опросников, простых или сложно организованных компьютерных программ (Сусликов 1999, Batchelor, Dua, 1995, Мэйидоналд 1988). Большинство распространенных прогностических индексов, пытается ориентироваться на широкий круг потребителей, который может включать кроме врачей также и пациентов. Распространенный вариант построения прогностического признака - таблица или текст, включающие соответствие набора качественно описанных свойств с определенной количественной величиной - примером таких прогностических величин может быть индекс физического состояния пациента - индекс Карновского, оценка этого же свойства на основании классификации ECOG.

Высокая субъективность оценки состояния больного по анкетам приводит к низкой достоверности получаемых результатов. В исследовании Национального противоракового института Канады (National Cancer Institute of Canada) приводятся результаты сравнения оценки функционального состояния пациентов на основании различных шкал (Physical functioning item of the subjective significance scale and the physical functioning scale of the QLQ-C30). Полученный коэффициент корреляции между ними имел величину 0.23 п являлся совершенно неудовлетворительным (Special Paper Methodological and Statistical Issues of Quality of Life (QoL) 1998). Приведенные результаты иллюстрирую г существующую проблему объективности информации при использовании анкетных (или табличных) методологий получения количественных оценок.

Решение похожих задач, в других областях медицины (оценка общего состояния больного и прогноз заболевания) достигается с использованием несколько других подходов. Хотя окончательные оценки также получаются па основании табличных данных, исходная информация включает существенно большее количество показателей, основанных большом количестве функциональных и лабораторных исследований. Такие индексы прогноза широко распространены, например, в медицине неотложных состояний (APACHI, TISS, ASA, CRIB). При этом индексы могут быть ориентированы на конкретный тип патологии (например черепно-мозговой травмы) (Знльбер, 1995, Knaus et.al. 1991, Cockburn et.al. 1993, Cullen et.al. 1974). Эти индексы имеют высокую стенепь предсказательной способности. Например, APACHE позволяет с вероятностью более 95% предсказать исход травмы.

Возвращаясь к способам оценки физического состояния онкологического больного на основании индексов Карновского или ECOG (н других подобных), следует подчеркнуть, что несмотря на всю их простоту они продолжают оставаться адекватным инструментом в руках врача. В большом количестве работ, посвященных прогностической значимости различных признаков у онкологических больных они остаются одними из наиболее информативных (Ship et al. 1993, Mendenhall et al. 1994, Maritinow et al. 1998, Mori et al. 1999, Montoto et al. 2002, Bierman et al., 2002). Таким образом, индексы, основанные па несложных математических принципах, занимают важное практическое место в клинической практике и, в тоже время, имеющиеся методологические проблемы при их определении ставят задачи по повышению объективизации способов их регистрации. Па перспективность использования просто организованных интегральных показателей крови указывают авторы работы (Вельских и др. 1996). Они использовали два варианта такой оценки: лйкоцитарпый индекс интоксикации Кальф-Калифа (Кальф-Калиф, 1941) и показатель, названный авторами - энтропия лейкоцитарной формулы (Номограммы для определения некоторых шпегральных показа1елей крови человека / Борисов и др., 1989). Оба показателя оказались информативными в оценке прогноза развития патологического процесса. Авторы делают вывод, что использование интегральных показателей крови в диагностическом мониторинге позволяет повысить информативность традиционных диагностических тестов, улучшить, оценку эффективности терапии, наметить пути прогнозирования исхода и индивидуализации лечения. Использование интегральных показателей крови перспективно при компьютерной оценке результатов лабораторных исследований и разработке экспертных диагностических систем .

Интересный подход предложен в статье белорусских исследователей (Смолякова P.M., 2005). Па этане предлучевой подготовки с целыо прогнозирования адекватности лучевой терапии разработан базовый вариант экспертной системы определения индивидуальной радиочувствительности первичной опухоли у больных лимфогранулематозом (ЛГМ). Индивидуальное прогнозирование радиочувствительности ЛГМ предусматривает отнесение больного к одному из двух различных классов: к первому классу (К1) относятся больные, у которых прогнозируется полная

100%) постлучевая резорбция первичной опухоли; ко второму классу (К2) относятся больные с прогнозируемой неполной (менее 100%) резорбцией опухоли.

Для определения принадлежности больного ЛГМ к одному из двух различных по прогнозу радиочувствительности классов используются формулы -являющиеся линейными комбинациями таких показателей как: абсолютное число лейкоцитов, абсолютное число нейтрофилов, абсолютное число лимфоцитов, СОЭ, абсолютное число моноцитов, индекс лимфоциты/ пейкоциты, диаметр наибольшего периферического пораженного лимфоузла, максимальная ширина средостения,

Используется следующее решающее правило: пациент относится к тому классу, для которого значение К больше. Если К1 > К2, то больной относится к классу К1, где лучевая терапия может явиться адекватным методом лечения. Если К2 > К1, то больной относится к классу К2, где одной лучевой терапии для полной резорбции, опухоли недостаточно и необходимо использование радиомодификаторов. Ошибка данной классификации составляет 10% для женщин и 13% для мужчин.

Авторы (Pauler, Laird, 2002) указывают на то, что внедрение новых лабораторных показателей в клиническую практику расширяет круг биомаркеров, динамические исследования которых (приводится пример использования гематологического показателя MCV (средний объем эритроцитов) на фоне применения фармпрепаратов могут быть источником важной информации для предсказания осложнений и коррекции программы лечения. Именно математический анализ динамики изменений на этапе проведения испытаний нового препарата позволяет сделать адекватные выводы о наступлении нежелательных осложнений. В работе (Fumagalli, 2003) показано, что именно мониторинг содержания лейкоцитов в процессе лечения IL-2 больных раком почки является независимым фактором прогноза как для общей выживаемости, так и для оценки ответа на проводимую терашпо. Таким образом, использование динамических исследований па фоне тестирующего (примером может служить "провокационные пробы") или лечебного воздействия может дать существенно более ценную информацию для построения прогностических моделей и такого рода подходы необходимо более интенсивно внедрять в клиническую практику.

Построение прогноза (развитие болезни, различные исходы) (наступление события через конкретный момент времени) можно попытаться описать на основании известных, на настоящий момент, данных. Решение таких задач осуществляется в рамках различных моделей регрессии. Наиболее изученной являе!ся модель линейной peipeccim (McCullagh, Nekier, 1989), однако ее использование для описания большинства, клинических важных показателей (продолжительности жизни и других событий) неприменимо из-за нелинейной природы изучаемых явлений. Неудовлетворенность линейными методами для построения предсказательных моделей привела к разработке альтернативных подходов. Например, в работе (Batchelor, Dua, 1995) показано, что комбинация линейных моделей существенно снижает ошибку оценки.

Поскольку наиболее важным показателем при сравнении различных схем лечения является продолжительность жизни, способы ее описания и сравнения играют принципиальную роль. Наиболее важны следующие семейства распределений, которые используются для описания продолжительности жизни экспоненциальное (в том числе, линейное экспоненциальное) распределение, распределение Вейбулла экстремальных значений и распределение Гомперца. В принципе, для описания средних времен жизни и сравнения нового метода лечения, со старыми, можно было бы использовать стандартные параметрические и пепараметрические методы. Па проблемы, возникающие при использовании методов регрессии, основанных на модели Кокса указывается в ряде работ (Henderson, 2000, Hendersson et al. 2001). В тоже время, очень часто оценка продолжительности жизни пациента осуществляется на основании индивидуального опыта врача. Оценка точности таких оценок была темой ряда исследований общий вывод которых - предсказательная ценность таких оценок низка. (MacKillop, Quirt, 1997, Christakis, Lamont, 2000, Parkers, 1972, Heyes-Moore, Johnson-Bell, 1987, Forster, Lynn, 1988). В частности (Christakis, Lamont, 2000) указывают, что только 33% оценок продолжительности жизни пациентов при такой оценке адекватны. Почему же формальные статистические модели не используются более часто в практике оценки продолжительноси жизни? В тоже время анализ выживаемости очень широко используется для определения прогностических факторов (ковариат), сравнения различных групп пацептов, построения прогностических индексов. В работах (Henderson, 2000, Hendersson et al. 2001) приводится две основные причины, обуславливающие низкую практическую значимость используемых моделей оценки продолжительности жизни. Существующие модели регрессии (сравнивались модели регрессии Кокса, Всйбулла, логнормальная и Аалена) на основании используемых предикторов (например таких как пол, возраст, те или иные клинические. симптомы, стадия процесса) также дают большую ошибку оценки абсолютной величины продолжительности жизни. Эта ошибка сравнима с величиной получаемой при экспертной оценке продолжительности жизни. Математическим отражением низкой практической значимости общепринятых моделей является низкий уровень объясняемой дисперсии отмечаемый в большинстве работ. Автор подчеркивает, что даже знание статистически высоко значимых ковариат не может повысить нрсдсказателг.пую способность на практически значимую величину. Таким образом, по мнению автора, на основании имеющихся моделей врач может сказать больному "прошу прощения, Вы проживете 3 месяца, но есть 60% вероятность, что я ошибаюсь" или "есть 80% шансы, что Вы умрете между 2 неделями и 2 годами". Автор делает вывод, что хотя много усилий затрачивается на сбор материала, общепринятые модели полезны для сравнения групп и анализа предикторов, адекватной оценки абсолютной величины периода жизни они дать не могут и предполагает, что возможно, это является необходимым (обязательным) следствие реальных данных используемых при анализе выживаемости.

В последнее время происходит внедрение в медицинскую практику новых методов анализа информации. Искусственные нейронные сети, отличаются от других методов математического анализа тем, что при поиске решения не следуют строго фиксированному набору математических методов, а повторяют дедуктивные методы поиска решения, свойственные работе эксперта (Боровиков 2001). Более того, нейронные сети могут включать практически неограниченное число факторов для построения прогноза, и эти факторы можно добавлять в модель, если экспериментатор решит, что новые факторы будут полезны для улучшения результата. Метод может также оценить степень прогностической значимости и взаимодействие новых факторов с уже имеющимся набором. Это отличает его от традиционных статистических методов. Особенностью метода ИНС является то, что освоить и применять технологии .нейронных сетей значительно проще, чем изучать математическую статистику или нечеткую логику. (Ежов, 1977, Круглов, Борисов, 2001, Haykin, 1994, Ripley, 1996) (Основные принципы метода искусственных нейронных сетей рассматриваются в главе "Материалы и методы".).

Количество публикаций по применению нейротехнологии в медицине трудно оцепить точно. Однако если в 1988-89 годах их были единицы, то с 1995 года ежегодно появляются сотни. Пейросети уже довольно давно активно применяются в анализе геномных последовательностей ДНК, в частности для распознавания промоторов - участков, предшествующих генам и связываемых с белком РПК-полимераза, который инициирует транскрипцию. Их используют для дифференциации кодирующих и некодирующих участков ДНК (экзонов и нитронов) и предсказания структуры белков (Ripley 1996).

Диагностика и лечение онкологических заболеваний, а также разработка новых медикаментозных средств несомненно представляют собой важнейшую область применения нейросетевых технологий. Диагностика одной из форм меланомы была реализована с помощью нейросетевого симулятора Multineuron, разработанного в ВЦ СОАН в Красноярске под руководством А.Н.Горбаня (Горбань, Россиев, 1996, Горбапь и др. 1998) Одно из главных направлений, в котором сейчас идут работы по использованию нейронных сетей, - диагностика рака молочной железы. Ряд групп использует метод нейронных сетей дифференцировать рентгенологические изображения для постановки диагноза на основе особенностей, с которыми обычно имеют дело радиологи. Оказалось, что ИПС способны решать поставленную задачу более эффективно (Jiang 2001, Tourassi 2001, Brake 2000). В работе авторов (Shia et al., 1999) сравнивается эффективность метода искусственных нейронных сетей с другими методами прогноза и с традиционными линейными моделями. Полученные выводы позволяют авторам сказать, что ИН, как правило, дает лучшее предсказание, чем традиционные методы и могут использоваться вместо них, а также как часть сложных экспертных систем для повышения предсказательной эффективности.

Приведенные результаты исследований продемонстрировали применимость метода ИПС для решения задач классификации в случае оценивания прогноза, а также показали, что принципиальное ограничение для методов классической статистики - "кошмар размерности", не так строг в случае алгоритма нейронных сетей. Оценивая результаты, подчеркивается, что традиционные статистические методы: анализ Кокса (Cox's proportional hazards) и метод логлинейной регрессии (logistic regression) (Erlichman et. al., 1990) применимы, однако в ситуации, когда анализируются данные, зависящие от времени, и когда прогностические факторы взаимодействуют сложным образом и эти зависимости сложно оцепить и выявить, обычные статистические методы могут иметь сильные ограничения на стадии оценки полученных результатов.

Следует заметить, что авторы не рекомендуют совсем отказаться от статистическим методов, однако считают, что метод нейронных сетей хороший дополнительный метод для более аккуратного построения прогноза как эффекта лечения, так и продолжительности жизни.

Boracchi et. al., 2001) также сравнивали информативность стандартных методов статистики и метода нейронных сетей для решения задач прогноза на группе 2233 больных раком легкого. Авторы показали, что стандартные методы проигрывают в эффективности.

В работе (Shi et al. 1999) авторы разбирают важную проблему ограничения методов линейной регрессии, встающих при решении сложных задач прогнозирования. Они подчеркивают, что линейная комбинация очень часто не может описать сложные временные зависимости, особенно если анализируемые переменные содержат большую ошибку. Именно с такими данными приходится иметь исследователю - клиницисту. Авторы убедительно доказывают, что применение методов искусственных нейронных сетей часто оказываются более информативными для решения такого рода задач. По мнению авторов, повышение качества прогнозирования можно добиться комбинацией метода ИНС (искусственных нейронных сетей) и других методов прогнозирования ( Markov Gated Expert, high order statistics, fuzzy logic).

Большое количество работ по нейронным сетям подчеркивают их преимущество в решении проблемы уменьшения размерности входных данных. В качестве таких методов могут быть предложены компоненты нейронных сетей как анализ чувствительности (Engelbrecht et. al. 1998) сети Кохонепа (Sung 1998). Важным механизмом формирования и выбора информативных параметров, разработанных в последнее время, является генетических алгоритм. Следует подчеркнуть, что большинство авторов считает, что особую важность для выбора информативных, прогностических факторов для построения модели, особенно на первых, разведочных этапах играет мнение эксперта. Однако бывают случаи, когда его знания неполны по объективным причинам, а также варианты, когда построение экспертной системы может быть очень сложным и дорогостоящим.

Хотелось бы также отметить перспективность применения метода нейронных сетей для решения задач прогноза, связанных с определением таких величин как продолжительность жизни. Как уже отмечалось (Henderson, 2001) использование стандартных подходов регрессии дает неудовлетворительные результаты, характеризующиеся большой ошибкой. В ряде работ показано, что ИНС могут решать подобные задачи регрессии лучше традиционных методов. Так в работе (Lundin, 1999) на большом клиническом материале (951 случай) исследовалась возможность предсказания продолжительности жизни у больных раком молочной железы. В качестве предикторов использовались 8 стандартных характеристик: размер опухоли, местная распространенность, гистологический тип, митотнчеекпй нпдскс, ядерный полиморфизм, формирование тубулярных структур, уровень некроза в опухоли, возраст пациентов. Получаемые оценки выживаемости были выше чем получаемые на основании стандартного метода логистической регрессии. Количество ошибок в контрольной выборке составляло 40 из 300 (13%). Важной особенностью полученного решения была его низкая чувствительность к уменьшению количества предикторов. Выбрасывание даже наиболее информативных показателей (например, местной распространенности) только незначительно снижало предсказательную эффективность. Авторы также указывают на устойчивость во времени полученной модели и интерпретируют свои вывод одинаковой эффективностью предсказания для 5, 10 и 15 - летнего периода. Они также делают вывод о перспективности применения метода нейронных сетей для оценки продолжительности жизни у онкологических больных. К недостаткам данной работы можно отнести тот факт, что производилось предсказание интервала (5,10 или 15 лет) а не более точная оценка величины продолжительности жизни. Другим примером использования метода нейросетей может быть работа (De Laurentiis et. al. 1999) посвященная оценке величины периода ремиссии и риска рецидива. Авторам удалось получить модель, позволяющую более эффективно предсказывать наступления рецидива, чем стандартные методы. Авторы подчеркивают, что такой подход позволяет дифференцировать пациентов по уровню риска рецидива внутри групп с одинаковой стадией по TNM.

Таким образом, анализ литературы показал, что использование многомерных методов становится обязательной процедурой анализа медицинских и биологических данных. Использование таких методов является источником дополнительной информации для прогноза и новых методов классификации в медицине и, в частности, в онкологии.

Суммируя данные литературного обзора можно констатитровать,что имеется два основных направления при исследовании новых методов прогноза в онкологии. Одно из них разработка новых прогностических показателей на основании молекулярно-биологических и клеточных технологий, второе - использование новых информационных технологий для получения дополнительной прогностической информации на основании традиционных клинико-лабораторных данных. В нашей работе мы исследовали оба направления для получения новых прогностических моделей оценки индивидуальной радиочувствительности у онкологических больных.

У1.Выводы

1. Использование методов дискриминантного и кластерного анализа клинико-лабораторпых данных больного до лечения позволяет с высокой достоверностью (более 95%) прогнозировать эффективность лучевого этапа лечения у больных злокачественными иеходжкинскими лнмфомами. При этом показателями, определяющими эффективность лучевой терапии, являются количество зон поражения, коэффициент ECOG, количество лимфоцитов в периферической крови и симптомы интоксикации.

2. Использование метода искусственных нейронных сетей позволяет на основании клинико-лабораторных данных создать удовлетворительную модель прогностической оценки продолжительности жизни (ошибка оценки для времени жизни 200 недель ± 20) .

3. Разработаны математические методы и создана компьютерная программа (per. № Минздрава 29/04061299/1595-01 от 20.03.01)," позволяющая объективизировать и автоматически оценивать состояние здоровья онкологического больного на основании комплекса гематологических показателей крови. Разработанный метод имеет коэффициент корреляции с экспертной оценкой состояния по шкале Карповского до 93 % для разных групп обследованных.

4. Количественный мониторинг состояния здоровья пациента, с помощью разработанного метода, проводимый в процессе комбинированного и комплексного лечения, позволяет оцепить реакцию па проводимую терапию для своевременной коррекции.

5. Обнаружено, что уровень радиоиндуцированного апоптоза в группе больных иеходжкинскими лимфомами достоверно выше, чем в группе здоровых доноров - (р=0,045). Различия в уровне спонтанного апоптоза у пациентов с иеходжкинскими лимфомами (11,88%) и здоровых доноров (12,25%) достоверны р=0,08.

6. Показатели уровня радиоиндуцированного апоптоза и доли выживших клеток у больных неходжкинскими лимфомами коррелируют с ответом больного на проводимую терапию (р=0,002 - радиоиндуцированный апоптоз;р=0,003 - для доли живых клеток ). В подгруппе больных с хорошим терапевтическим эффектом (ремиссия или стабилизация состояния) на проведенное комплексное лечение (химиотерапия + лучевая терапия), уровень апоптоза достоверно выше, чем в подгруппе с плохим терапевтическим эффектом (р=0,008).

7. Достоверных отличий в уровне спонтанного и радиоиндуцированного некроза между группами здоровых доноров и больными неходжкинскими лимфомами не получено (р=0,759; р=0,091).

8. Установленная зависимость между уровнем радиоиндуцированного апоптоза и ответом на проводимую терапию у пациентов с нехождкинскими лимфомами позволит использовать данный показатель как фактор прогноза при составлении индивидуальных программ лечения больных неходжкинскими лимфомами.

УП.ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Практическому здравоохранению для повседневного использования предлагаются новые высокоэффективные методики получения прогностической информации. Разработан метод оценки индивидуальной чувствительности клеток организма к лучевой терапии.

Описаны удобные, с точки зрения практического применения, модели анализа клинико-лабораторных данных, даны практические рекомендации по применению различных математических методов анализа для получения прогностической информации.

Предложенный методический подход в построении прогностических моделей, реализованный на группе больных неходжкинекпми злокачественными лимфомами, может быть применен и для других нозологических групп онкологических больных. Его отличает использование гематологических показателей в динамике противоопухолевого лечения и анализ большого спектра статистических и нестатистических методов для выбора наиболее адекватной и информативной модели. Так, для прогноза эффективности лучевого этапа лечения оптимальным является метод дискриминантного анализа. В тоже время, прогноз временных интервалов, безрецпднвного периода, предполагаемой продолжительности жизни наиболее эффективно осуществляется с помощью моделей, построенных на основе метода искусственных нейронных сетей.

На основании проведенного исследования создана компьютерная программа для оценки состояния здоровья и мониторинга эффективности лечения онкологических больных (Per. № Министерства здравоохранения РФ 29/04061299/1595-01 от 20.03.01).

Материалы исследований использовались в специализированных курсах лекций и на семинарах с врачами-онкологами в ФГУ РНЦРР Росздрава, ГУ РОНЦ РАМН.