Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Ионные механизмы, протеотоксичность и регуляция клеточной смерти в повреждающем действии ксенобиотиков

РГб од

. 9 ИЮП 1ЗД7

На правах рукописи

ЕГОРОВА Алла Борисовна

ИОННЫЕ МЕХАНИЗМЫ, ПРОТЕОТОКСИЧНОСТЬ И РЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОЧНОЙ СМЕРТИ В ПОВРЕЖДАЮЩЕМ ДЕЙСТВИИ КСЕНОБИОТИКОВ

14.00.16 — патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Томск — 1997

Работа выполнена на кафедре патофизиологии Красноярской государственной медицинской академии.

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор ИВАНОВ В. В,

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор НОВИЦКИЙ В. В.

доктор медицинских наук ХЛУСОВ И. А.

доктор медицинских паук СМОЛЬЯНИНОВ Е. С.

Ведущая организация — Научно-исследовательский институт кардиологии ТНЦ СО РАМН.

Защита состоится «............» ..................................................... 1997 г.

в «............» часов на заседании Диссертационного Совета Д.034.28.02

по присуждению ученой степени доктора медицинских наук в Сибирском государственном медицинском университете по адресу: 634050, г. Томск, Московский тракт, 2.

С диссертацией можно ознакомиться г, библиотеке Сибирского государственного медицинского университета по адресу: 634050, ул. Ленина, 107.

Автореферат разослан ......»

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

доктор медицинских паук, профессор БРАЖНИКОВА Н. А.

Актуальность проблемы. Исследование клеточных и молекулярных механизмов токсического действия. ксенобиотиков - одна из ■фиоритетных задач современной патофизиологии, токсикологии и физико-химической медицины. В качестве проявлений цитотоксичности i настоящее время рассматриваются обратимые или необратимые ювреждения структур клеток, приводящие к дезорганизации клеточного метаболизма и к нарушению функционирования органа или системы . Такого рода повреждения проявляются широким спектром апологических эффектов (мутагенный, канцерогенный и пр.) ( V. Foa, 1987; D.V. Parke/1987; L. Hightower, 1991).

Накапливающиеся в литературе данные о клеточно-молекулярной эснове действия различных ксенобиотиков позволяют предполагать :уществование неких единых механизмов цитоповреждающего действия химических веществ, реализуемых, в числе прочих, через изменение антегративных межклеточных и внутриклеточных сигнальных процессов. Рецептор-эффекторные взаимодействия и активация клеточных сигнальных систем являются основой жизнедеятельности всех 5ез исключения клеток про- и эукариотической природы. Регуляция зффекторных функций ( изменение активности ферментов метаболизма, ,юнных каналов, экспрессии генов ) занимает центральное место в процессах межклеточной коммуникации и интеграции. В настоящее время лишь в единичных исследованиях в о'бласти экспериментальной токсикологии учитываются возможность и важность модуляции экзогенными веществами различных этапов этой регуляции ; лиганд-рецепторных взаимодействий, дивергенции и/или конвергенции в системах "вторичных посредников", активации и/или ингибирования эффекторных молекул клеток ( M.D.Hollenberg, 1991; M.J. Benidge, 1993; G.Richter, 1993; I.Nakashima, 1994).

Проблема "рецепции" ксенобиотиков и возможность имитации ими естественных рецептор-эффекторных взаимоотношений остаются одними из наименее изученных в современной экспериментальной токсикологии. Недостаточно раскрыты механизмы альтерации клеточных структур -компонентов сигнальных систем, позволяющие разработать наиболее эффективную стратегию антитоксической защиты клетки и восстановления ее структурно-функционального гомеостаза.

Ионные механизмы в повреждающем действии факторов окружающей среды практически не рассматриваются с позиции их ключевой роли в нарушении гомеостаза клеток и индукции ряда компенсаторно-приспособительных процессов, приводящих к адаптации к воздействию ксенобиотиков или сопровождающихся развитием сублстальных и летальных повреждений. Особую актуальность эти механизмы приобретают в клетках, функционирование которых определяется в большей степени ион-транспортными процессами (электровозбудимые ткани), а также в клетках, активность ключевых ферментативных систем которых опосредуется ионными механизмами (R.S. Lewis, 1988; S. Orrenius, 1989; J. Alvvarez, 1992). Широкая распространенность катион-зависимых ферментов, обладающих протеазной, эндонуклеазной и фосфолипазной активностью, предопределяет важность процессов нарушения ионного гомеостаза и патогенезе патологической клеточной смерти (некроза) или запрограммированной клеточной смерти (апогиоза) при действии химических факторов окружающей среды (С. Dive. 1^91).

Физиологическая и патологическая регуляция клеточной никли представляет собой ключевое звено механизмов большинства конститутивных и индуцибельных реакций клетки, /[о сих пор внимание патофизиологов и токсикологов было в большей степени сконцентрировано на изучении особенностей индукции ксенобиотиками

некротически-дистрофических процессов в органах и тканях. Лишь в последние годы внимание исследователей привлекли механизмы апоптоза, обеспечивающего поддержание постоянства количественного состава клеточной популяции и являющегося объектом регуляции экзогенных и эндогенных факторов физической, химической и апологической природы (M.J. Arrends, 1990; G.T. Williams. 1993).

Одним из базовых механизмов цитотоксичности ряда ксенобиотиков является индукция ими окислительного стресса (H.Kappus, 1987; C.W. Olanow, 1993). Генерация свободных радикалов, сопровождающая физиологические и патологические внутриклеточные процессы, :тановится причиной альтерации биомакромолекул клеток - перекисного экисления липидов, свободно-радикального повреждения нуклеиновых <ислот, окисления белковых молекул и полисахаридов. До сих пор ювреждение белков клеток рассматривалось преимущественно в <ачестве побочного результата действия экзогенных факторов. Однако, в 1итературе накапливаются данные о пусковой роли аккумуляции гтруктурно и функционально модифицированных клеточных белков в îpoueccax индукции стресс-отвегга клетки, ее адаптации и, при ^благоприятном исходе, гибели ( K.J.A. Davies, 1987; J. Becker, 1994). Эта, так называемая протеотоксичность ксенобиотика может являться :ритерпем его обшей цитотоксичности, органотропности его юздействия и "мишенью" патогенетической коррекции. При этом »бщность патогенетических механизмов протеотоксичности при Физическом или химическом воздействии составляет теоретическую [редпосылку для индукции перекрестной толерантности к токсическим кзогенным веществам различной структуры ( M-J. Gething, 1992; A. De 4aio, 1993).

Цель работы. Исследовать роль нарушений ионного и окислительно-осстановительного гомеостаза клеток, изменения стабильности

клеточных белков в патогенезе цитотоксического действия ксенобиотиков, формирования реакций клеточной адаптации, регуляции запрограммированной клеточной смерти.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние ксенобиотиков-индукторов окислительного стресса-на процессы регуляции активности ионных каналов в клетках нейрональной природы. Установить характер взаимосвязи между механизмами окислительно-восстановительного и ионного гомеостаза клеток в условиях физиологической регуляции нейротрансмиггерными молекулами и в условиях окислительного стресса.

2. Изучить роль продуктов каталитической деградации никотинамидадениндинуклеотида в регуляции активности ионных каналов и процессов запрограммированной клеточной смерти в клетках нейрональной природы. Оценить возможность коррекции физиологической активности нейромедиаторов и цитотоксического действия ксенобиотиков субстратными ингибиторами ферментов трансформации никотинамидадениндинуклеотида.

3. Исследовать роль протеотоксического действия ксенобиотиков в их суммарном цитоповреждающем эффекте, в том числе через оценку значимости функционирования редокс-чувств'ительных центров белковых молекул - компонентов' рецептор-эффекторных сигнальных систем в электровозбудимых клетках и идентификацию места действия сульфгидрильных ядов.

4. Изучить особенности реакций активации и десенсибилизации рецепторов, сопряженных с ГТФ-связывающими белками, в условиях окислительного стресса и действия тиолотропных ксенобиотиков.

5. Оценить особенности и значимость нарушений ионных механизмов и конформационно-функционального состояния клеточных белков в патогенезе запрограммированной клеточной смерти при действии

ксенобиотиков. Исследовать зависимость проявления чувствительности клеток к действию экзогенных факторов химической н физическом природы от степени клеточной пролиферации и дифференцировки.

6. Изучить вклад генотоксического эффекта ксенобиотиков в реализацию механизмов запрограммированной клеточной смерти и разработать методы патогенетической коррекции возникающих нарушений.

7. Исследовать вклад нейротрансмиттерной регуляции в механизмы контроля пролиферативной активности и апоптоза в популяции гемопоэтических клеток в физиологических условиях, а также в присутствии индукторов окислительного стресса. Изучить вклад кальций- и НАД-зависимых механизмов в миелотоксический эффект ксенобиотиков и возможность его патогенетической коррекции.

8. Изучить возможность достижения "перекрестной термотолерантности" к протеотоксическим ксенобиотикам на модели теплового шока in vitro и in vivo в клетках нейрональной природы и гепатоцитах.

Научная новизна. Работа носит приоритетный характер, поскольку в ней впервые систематически изучено участие механизмов нарушения ионного гомеостаза клеток различной природы, нарушения конформационно-функциональной стабильности клеточных белков в процессах сублетального и летального повреждения клеток при действии экзогенных химических веществ.

1. Впервые установлено, что эффект действия ряда нейротрансмиттеров на клетки нейрональной природы определяется адекватным внутриклеточным уровнем н икоти на м идаден и ндш iy к л еоти д а и продуктов его каталитической деградации. Впервые доказано функционирование одного из таких продуктов - циклической аденозиндифосфатрибозы - в качестве "вторичного посредника" в нервных клетках млекопитающих при стимуляции холинэргических и

брадикининовых рецепторов и модуляции активности ионных каналов выходящего потенциал-зависимого калиевого тока М-типа.

2. Обнаружено, что снижение. уровня внутриклеточного никотинамидадениндинуклеотида ( в том числе ксенобиотиками-индукторами окислительного стресса) является одним из механизмов цитотоксического эффекта, реализуемым через нарушение передачи сигнала с активированных рецепторов, сопряженных с ГТФ-связывающими белками. Доказана возможность коррекции данного эффекта веществами - субстратными ингибиторами ферментов каталитической деградации никотинамидадениндинуклеотида.

3. Доказано существование редокс-чувствительных центров в белковых молекулах ионных каналов, являющихся объектом регуляции при интоксикации тиолотропными агентами и индукторами окислительного стресса в клетке, а также в физиологических условиях при активации рецептор-эффекторных систем.

4. Впервые обнаружено, что одним из механизмов цитотоксичности тиолотропных ядов является "имитация" естественного физиологического эффекта нейротрансмиттеров в отношении ионных каналов нервных клеток.

5. Установлено, что одним из факторов регуляции процессов запрограммированной клеточной смерти при действии ксенобиотиков является изменение активности калиевых и кальциевых ионных каналов и окислительно-восстановительного клеточного гомеостаза в клетках нейрональной природы.

6. Изучены закономерности изменения степени чувствительности нервных клеток к действию экзогенных факторов физической (тепловой шок) и химической природы (ксенобиотики) и развитию феномена спонтанной фрагментации ДНК в зависимости от пролнферативного

статуса клеток, плотности клеточной популяции и характера активации рецепторных молекул.

7. Исследованы особенности проявления мутагенной активности ксенобиотиков в прокариотических и эукариотических клетках, в том числе на фоне действия модификаторов репаративных процессов. Оценен вклад генотоксического эффекта ксенобиотиков в патогенез запрограммированной клеточной смерти в гемопоэтических клетках.

8. Экспериментально доказана возможность индукции "перекрестной резистентности" к действию нейро- и гепатотоксичных ксенобиотиков in vitro и in vivo путем предварительной гипертермической обработки (тепловой шок). Продемонстрирована возможность "отмены" индукции ферментов биотрансформации ксенобиотиков (фенобарбитал-индуцируемых подфракций цитохрома Р-450) умеренным гипертермическим воздействием.

9. Установлено влияние окислительного стресса в клетках на регуляцию серотонином процессов пролиферации и естественной гибели гемопоэтических клеток. Впервые оценены НАД-зависимые и кальций-зависимые механизмы в цитотоксическом действии акриламида в клетках костного мозга, продемонстрирована возможность коррекции этого действия препаратами - субстратными ингибиторами ферментов каталитической деградации НАД и блокаторами кальциевых каналов.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Данная работа является фрагментом тем " Патология органов и систем организма при действии акрилатов" ( ИК 216082) и "Ионные механизмы и протеотоксичность в повреждающем действии ксенобиотиков. Патогенетическое обоснование физико-химических методов диагностики и профилактики экзогенных интоксикаций" ( РК

071-01, РК 071-02), выполняющихся на кафедре патофизиологии Красноярской государственной медицинской академии с 1984 по 1995 г. и с 1996 г., соответственно, являющихся, в свою очередь, фрагментами программы ВОЗ/ООН/МОТ по безопасности химических веществ, программы Государственного комитета по науке и технике (номер государственной регистрации 0.69.07).

Научно-теоретическое значение работы заключается в том, что в ней исследованы клеточные и молекулярные механизмы цитотоксического действия ксенобиотиков различной химической структуры, имеющих разные токсикокинетические и токсикодинамические параметры, с позиции существования общих закономерностей проявления повреждающего эффекта в результате нарушения естественной межклеточной и внутриклеточной коммуникации, регуляции запрограммированной клеточной смерти.

Разработаны патогенетически обоснованные методы коррекции экзогенной интоксикации, обеспечивающие нормализацию клеточного ионного, окислительно-восстановительного, генетического гомеостаза.

Постулируется участие механизмов индукции синтеза белков теплового шока в развитии клеточного защитного эффекта при умеренной гипертермии и последующем воздействии ксенобиотиков. Продемонстрирована важность развития феномена протеотоксичности в патогенезе повреждения клеточных структур и формирования адаптационнь1х процессов при экзогенных интоксикациях.

В рамках работы получены патенты Российской Федерации на изобретения "Способ приготовления препаратов митотических метафазных хромосом" ( АС 1732222 ,1992 г.), "Способ определения сенсибилизирующих свойств ксенобиотиков" (Патент № 2012876, 1994 г.) и "Способ определения мембранотоксичных свойств ксенобиотиков" (Патент № 5054034/14, 1995 г.). V

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Всесоюзном координационном совещании "Гигиенические последствия загрязнения окружающей среды мутагенными факторами" Института общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН, Самарканд, 1990 г.; Всесоюзной научной конференции "Реактивность и регенерация тканей", Санкт-Петербург, 1990 г.; научно-практической конференции "Научно-технический прогресс и здоровье населения", Красноярск, 1990 г.; Пленуме Сибирского межобластного общества патофизиологов, Новокузнецк, 1991 г.; региональной научно-практической конференции "Профессиональная патология в Восточных регионах страны", Новокузнецк, 1991 г.; конференции молодых ученых Сибири, Красноярск, 1990 г., научной конференции "Профилактика и экспериментальная терапия экстремальных и терминальных состояний", Омск, 1992 г.; Японо-британской физиологической научной конференции, Нагоя (Япония), 1995 г.; 15-ой конференции Международного общества нейрохимиков, Киото (Япония), 1995 г.; Международной конференции "Оптика лазеров" , Санкт-Петербург, 1995 г.; Всероссийской научной конференции "Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии", Санкт-Петербург, 1995 г.; VII Всероссийском симпозиуме "Коррекция гомеостаза", Красноярск, 1996 г.; Первом Конгрессе Всероссийского общества патофизиологов (с международным участием), Москва, 1996 г.; 4-ом Симпозиуме Японо-Российского Фонда медицинского обмена, Иркутск, 1996 г.; нейрофармакологической конференции " Регуляция калиевых ионных каналов", Канадзава (Япония), 1996 г.; научной конференции Международного общества нейрофизиологов, Вашингтон (США), 1996 г.; научной сессии Президиума Красноярского научного центра СО РАН "Фундаментальные науки - медицине", Красноярск, 1996 г.; VIII Международном симпозиуме "Гомеостаз и окружающая среда",

Красноярск, 1997 г.; научных семинарах Института нейроинформационных исследований Медицинской школы Университета г.Канадзава (Япония), 1993-1994 гг.; заседаниях кафедры патофизиологии Красноярской государственной медицинской академии, Красноярских региональных отделений Российских обществ патофизиологов и токсикологов (1992-1997 гг.).

Положения, выносимые на защиту:

1. Ведущим механизмом цитотоксического действия ксенобиотиков-индукторов окислительного стресса является окислительное повреждение клеточных биомакромолекул, проявляющееся нарушением конформационно-функциональной стабильности клеточных белков, генотоксическим и мембранотоксическим эффектами.

2. Возникающее в условиях окислительного стресса нарушение клеточного окислительно-восстановительного гомеостаза ( вследствие ферментативной конверсии никотинамидадениндинуклеотида) имеет своим результатом нарушение никотинамидадениндинуклеотид-зависимых эффектов эндогенных регуляторных молекул, в том числе регуляции активности ионных каналов клеток.

3. Присутствие редокс-регулируемых центров в белках-компонентах клеточных рецептор-эффекторных систем определяет степень и характер чувствительности клеток к повреждающему действию тиолотропных ксенобиотиков и индукторов окислительного стресса, реализуемому в том числе через "имитацию" естественных эффектов трансмиттерных молекул и изменение реакций рецепторной десенсибилизации.

4. Аккумуляция структурно поврежденных клеточных белков, а также вызванное ксенобиотиками нарушение интра- и экстрацеллюлярных взаимодействий являются пусковыми механизмами реакций адаптации

клеточной системы или элиминации необратимо поврежденных клеток механизмом запрограммированной клеточной смерти. 5. Характер чувствительности клеток к повреждающему действию факторов физической и химической природы определяется степенью :охранносги рецептор-эффекторных регуляторных механизмов, особенностями пролиферативной активности клеток. 5. Протеотоксичность, являясь общим механизмом действия ряда экзогенных факторов химической или физической природы, обеспечивает формирование "перекрестной" резистентности клеток, в гом числе через изменение активности нуклеотид-сопряженных клеточных белков ( ГТФ-связывающие белки, белки теплового шока), выполняющих чаперонную ( облегчение реакций ренатурации белковых молекул) функцию.

7. Коррекция цитотоксического эффекта ксенобиотиков может быть эффективно осуществлена субстратными ингибиторами ферментов каталитической конверсии никотинамидадениндинуклеотида, модификаторами активности кальциевых ионных каналов, гиолопротекторными агентами.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 32 печатные работы, из них 12 - в международной печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 350 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы и приложений, иллюстрирована 33 таблицами и 38 рисунками. Библиографический указатель включает

470 литературных источников, из них 44 отечественных и 426 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на 500 животных (крысы, мыши), культуре гибридных клеток "нейробластома мыши х глиома крысы" клона NG 108-15, культуре микроорганизмов Photobacteria leiognathi. Подбор методов регистрации эффектов ксенобиотиков, а также моделирование острой и подострой экзогенной интоксикации in vitro и in vivo осуществлялись в соответствии с принципами биохимической токсикологии и рекомендациями Международной программы по химической безопасности. При культивировании клеток нейроналыюи природы ( гибридные клетки "нейробластома мыши х глиома крысы" клона NG 108-15) in vitro производилась их совместная с ксенобиотиками кратковременная ( до 1 часа) инкубация ( тяжелые металлы, тиолотропные вещества, форболовые эфиры) или долговременная ( 4-48 часов) инкубация (стр ептозотоцин, никотинамид, аминобензамид, ортованадат натрия). Исследование генотоксичности акрилатов в клетках костного мозга in vivo осуществлялось в острых опытах при однократном внутрибрюшинном введении акрилатов в виде раствора в 0,5 мл растительного масла в дозах 1/4, 1/3 и 1/2 LD 50 для метилметакрилата, что составляет 0,65; 0,9; 1,3 г/кг массы животного, и 1/4 и 1/2 LD 5о для бутилакрилата, что составляет 0,3 и 0,6 г/кг массы животного, за 24 часа до забоя животных. При подостром экспериментальном отравлении акрилаты вводились в дозе по 1/4 LD 50 в течение 8 недель, дважды в неделю, с забоем животных через 2, 4, 6 и 8 недель от начала эксперимента (через 24 часа после последнего введения ксенобиотика). Изучение мутагенной активности акрилатов в бактериальной тест-системе было произведено на штамме Photobacteria

leiognathi в концентрациях 8,4,2 и 1 мМ для бутилакрилата и 32,16,8 и 4 мМ для ММА. Про- и антимутагенная активность корректоров пострепликатнвной репарации ДНК изучена в двух сериях экспериментов: при добавлении их в инкубационную смесь сразу после внесения акрилатов (т.н. совместная инкубация) и в момент индукции SOS-ответа бактериальных клеток. Исследование нейро- и гсилтотокеичиости акриламида in vivo осуществлялось при однократном внутрибрюшинном его введении животным в дозе 2/3 LD50 (100 мг/кг) в физиологическом растворе через 6, 24 и 48 часов после гипертермической или нормотермической обработки ("тепловой шок" и "контроль", соответственно), за 24 часа до проведения "гексеналового теста" и забоя животных. Изучение токсического влияиня акриламида на клетки костного мозга in vivo производилось при совместной инкубации суспензии клеток костного мозга с ксенобиотиком ( 10"2 - Ю"4 М) в течение 30 минут, а также в условиях их предварительной инкубации (30 минут) в присутствии экзогенных корректоров .(никотинамид, изоптин в дозах 10"3 -10-4 м и 5 х 10_5 М, соответственно) и последующем культивировании (5 суток) в диффузионных камерах в перитонеальной полости животных-реципиентов.

Культивирование клеток NG 108-15 производилось при +37° С в атмосфере 10% СО2 ,в модифицированной Дульбекко среде Игла, содержащей 5% фетальную бычью сыворотку, 100 мкМ гипоксантина , 1 мкМ аминоптерина и 16 мкМ тимидина. Для проведения электрофизиологических и биохимических исследований клетки культивировались на покрытых полиорнитином чашках Петри (35 мм) и индукция их дифференцировки достигалась добавлением модифицированной Дульбекко среды Игла, содержащей 1% фетальную бычью сыворотку, гипоксантин и тимидин ( 100 мкМ и 16 мкМ, соответственно), дибутирил-цАМФ (0,25 мМ) и простагландин El (10

мкМ) в течение 7-21 дня. Клетки визуализировались фазово-контрастным микроскопированием, перфузировались модифицированной Дульбеккс средой Игла с 10 мМ Hepes при +35° С, 1-2 млУмин. Использовался мето,д patch-clamp для регистрации ионных токов клетки в непрерывном режиме подачи потенциала ( "Axoclamp 2А", Axon Instruments, Foster City, CA USA). Микроэлектроды содержали раствор, состоящий из (мМ): КООССНз, 90; КС1, 20; Hepes,40; MgCl2, 3; EGTA,3; CaCl2,l; pH 7,4; свободная концентрация кальция в клетке - 40 нМ. В серии экспериментов (микроионофорез веществ) раствор содержал 90 мМ цитрата калия и 15 мМ Hepes, рН 7,3. Сопротивление микроэлектрода 26 МОм, сопротивление контакта >2-3 ООм.

Мускарин-чувствительный выходящий потенциал-зависимый калиевый ток М-типа ( I К/М/) анализировался при гиперполяризующем сигнале (1 сек, -40 и -50 мВ от удерживающего потенциала -20 и -30 мВ). Оценивались тотальная амплитуда тока и релаксационная амплитуда тока. Запись ионных токов осуществлялась на регистрирующем устройстве "Nihonkonden", Model RTA-1100, Tokyo, Japan). Дополнительно производилась фильтрация сигнала (1 кГц) с помощью компьютерной программы ("DigiData" 1200, Axon Inst.). Запись зависимости силы тока от потенциала осуществлялась в диапазоне от -110 до -10 мВ. Аппликация веществ осуществлялась микродозатором в объеме 3 мкл, с максимальной приближенностью к поверхности анализируемой клетки. Экстрацеллюлярная перфузия веществ осуществлялась при их растворении в лерфузионной среде или фосфатном буфере (рН 7,4). Микроионофорез веществ осуществлялся с использованием микроэлектрода при подаче импульсов +10-40 нА в течение 0,1-1 сек.

Флуориметрическое определение внутриклеточной концентрации кальцин осуществлялось с использованием кальциевого индикатора Fura-

2. Для этого клетки выращивались на полиорнитиновой подложке в специальных камерах, визуализировались инвертирующим микроскопом ( OSP-PMU, "Olympus", Tokyo, Japan), обрабатывались 5 мкМ ацетоксиметилэфира индикатора (60-90 мин при +37°С). Ионные токи клеток оценивались методом patch-clamp , мнкроэлектрод содержал раствор с кальциевым индикатором. После возбуждения, достигаемого ультрафиолетовым облучением клетки (360 нм), эмиссионные спектры флуоресценции при 340 и 360 нм анализировались и использовались для вычисления концентрации внутриклеточного кальция с применением компьютерной программы (С-1901-МК2, Hamamatsu).

Для биохимических исследований клетки NG 108-15 собирались с поверхности чашки и гомогенизировались ультразвуком в течение 15 сек. Гомогенат выдерживался в кипящей водяной бане 5 мин и затем центрифугировался при 15 000 g , 5 мин при 0° С.

Концентрация НАД в супернатанте определялась спектрофотометрическим ультрамикрометодом с использованием алкогольдегидрогеназы и тиазолила синего. Инкубационная среда содержала (1 мл): 0,08 мг тиазолила синего, 0,3 мг феназина метасульфата, 0,25 мг алкогольдегидрогеназы, 0,065 M глицилглициновый буфер (pH 7,4), 0,065 M никотинамида, 0,33 M этанола и 0,1 мл клеточного экстракта (опытная проба). Оптическая плотность продукта реакции измерялась при 556 нм на спектрофотометре "UV-2100S", "Shimazu DU". Концентрация белка эпределялась с помощью "Bio-Rad Protein Assay Kit" (Hercules, CA, USA). Концентрация инознтолтрифосфата и цАМФ определялась с помощью 'Amersham Assay Kit" (USA).

Для регистрации апоптоза в клетках NG 108-15 в экспериментах in /itro использовался метод оценки межнуклеосомной фрагментации ДНК, шляющейся специфическим проявлением запрограммированной

клеточной смерти. Гомогенизация клеток осуществлялась в гомогенизирующем буферном растворе, содержащем 0,1 М NaCl, 0,01 М ЭДТА, 0,3 М трис-НС1, 0,2 М сукрозу (рН 8,0). Гомогенаг клеток инкубировался последовательно с 10 М додецилсульфатом натрия (+65° С, 30 мин) и 8 М ацетатом калия ( 0° С 60 мин), центрифугировался при 5000 g (Eppendorf Microcentrifuge, 5415-С, Fisher Scientific, С A, USA) при +4° С 10 мин, после чего осуществлялась экстракция ДНК из супернатанта с использованием смеси фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1) с повторной реэкстракцией смесью хлороформ:изоамиловый спирт (24:1). Надосадочная жидкость преципитировалась добавлением ледяного абсолютного этанола и инкубировалась при -70° С в течение 60 минут. Преципитат центрифугировался при 14000 g в течение 30 мин при +4°С , ресуспензировался в буфере ( 10 мМ трис-НС1, 1 мМ EDTA, рН 8,0) и подвергался обработке РНКазой (500 мкг/мл) с последующей инкубацией при +37° С в течение 60 минут. Образцы экстрагировались смесью фенол:хлороформ:изоамиловый спирт и реэксграгировались смесью хлороформ :изоамиловый спирт. Супернатант преципитировался добавлением ЗМ ацетата натрия и ледяного абсолютного этанола, с последующей инкубацией при -70° С 60 мин. Преципитат центрифугировался при 14000 g 30 мин при +4° С, отмывался 80% ледяным этанолом и высушивался вакуумом в течение 15 минут. Спекгрофотометрически (260 нм) в образцах определялась концентрация выделенной ДНК . Равные концентрации ДНК вносились в 2% агаровый гель и сепарировались электрофоретически. Визуализированные окраской бромидом этидия образцы фотографировались ("Polaroid").

Мутагенность ксенобиотиков в отношении соматических клеток млекопитающих (крыс) оценивалась при острой (24 часа) и подострой (8 недель) экспериментальной затравке животных методом анализа

митотичсских метафазных хромосом Приготовление препаратов митотических метафазных хромосом производилось по стандартной методике в нашей модификации (АС 1732222, 08.01.1992 г.) За 1 час 20 минут до забоя животным внутрибрюшинно вводился колхицин (2,5 мг/кг). Костный мозг из бедренной кости вымывали 0,5% раствором йодистого калия при +37° С, объемом 10 мл, тщательно суспензировали и культивировали на водяной бане при +37° С в этом же растворе в течение 10-15 минут. Суспензию центрифугировали (1000 об/мин) в течение 6 минут. Надосадочный раствор йодистого калия сливали и заменяли свежеприготовленным охлажденным фиксатором, состоящим из смеси метанол:ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1 в объеме 4 мл. Перед началом трехкратной фиксации клетки костного мозга тщательно суспензировали, выдерживали в фиксирующей смеси 10 мин., центрифугировали (1000 об/мин) в течение 10 минут. Препараты метафазных пластинок хромосом приготавливали путем раскапывания клеточной суспензии с высоты 20 см , последующего высушивания и окрашивания 0,1% красителем (азур II гэозин в соотношении 1:1) в течение 10 минут. Пригодными для цитогенетического анализа считались препараты с не менее 3-4 пластинками хромосом в поле зрения при увеличении хЗОО. Собственно кариотипический анализ производился при иммерсионной микроскопии (окуляр х 8, объектив х90). Анализировалось по 100 метафаз на каждое животное в серии. При этом оценивались хроматидные, хромосомные аберрации, анеуплоидия и полиплоидия клеток.

Изучение мутагенности ксенобиотиков в бактериальной тест-системе осуществлено в рамках "508-Ьих1е51", основой которого является феномен индукции пострепликативной репарации (БОБ-ответ клеток) при накоплении в геноме разрывов ДНК, индуцированных мутагенами. Визуализация феномена индукции БОБ-ответа достигалась внедрением в

геном клетки генов, кодирующих белки-компоненты люцифернзной системы, имеющих сайт связывания для продуктов генов ЗОБ-оперона.

Выделение постмитохондриального супернатанта (фракция 89) из печени интактных крыс производилось по стандартной методике. Белок в фракции печени определялся по (Ьои/гу, 1956). Микросомальная активирующая смесь ( приготовленная на 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,4) содержала 3 мг белка фракции 89, 4 мМ НАДФ, 5 мМ глкжозо-6-фосфата. При исключении из состава смеси НАДФН-генерирующей системы объем восполнялся адекватным количеством фосфатного буфера (рН 7,4). Соотношение объемов микроорганизмов (штамм РЬошЬаЛепа к^пагЫ) и инкубационной смеси в лунке стандартного планшета составляло 1:1. Регистрация мутагенного эффекта ксенобиотиков осуществлялась на аппарате "Ьшшпсисап" через каждый час инкубации (при +37° С) в течение 6-8 часов по увеличению люминесценции смеси по сравнению с изолированными микроорганизмами и всеми изолированно примененными компонентами смеси. Признаком геиотоксичности являлось увеличение люминесценции на порядок и более по сравнению с контролем.

Культивирование клеток костного мозга белых беспородных мышей (обоего пола, массой от 20 до 30 г.) осуществлялось следующим образом: клетки получали путем вымывания средой а-МЕМ ("СШсо") из 2 бедренных костей мыши-донора. Клетки в концентрации 1х10^/мл помещали в питательную среду (80% среды альфа-МЕМ, 20% лошадиной сыворотки, 100 мг/л ампициллина). Диффузионные камеры заполнялись суспензией клеток в объеме 0,1 мл. Диаметр пор фильтра камер 0,22 мкм. Камеры вшивали в брюшную полость мышей-реципиентов (по 2 на животное) под гексеналовым наркозом. Через 5 дней культивирования мышей забивали методом дислокации спинного мозга в шейном отделе, камеры извлекались, фильтры окрашивались гематоксилин-эозином.

Методом световой микроскопии подсчитывали число образовавшихся солоний (скопления из 50 и более клеток) и кластеров (скопления менее >0 клеток) (увеличение хЮО). Процент клеток в состоянии апоптоза * уценивался при микроскопическом исследовании 200 клеток на фильтре увеличение х 400), при этом признаками апоптоза считали конденсацию сроматина, кариорексис и кариопикноз, уменьшение размеров клеток.

Индукция "теплового шока" в культивируемых клетках клона NG 108-15 в наших экспериментах осуществлялась при следующих условиях: I. Гипертермическое воздействие (+45° С) в течение 90 минут с юследугощим восстановительным периодом ( +37° С, от 12 до 20 часов в разных сериях) в отношении клеток, находящихся в щфференцированном состоянии ( модифицированная Дульбекко среда >1гла + 1% фетальная бычья сыворотка + 100 мкМ гипоксантина+ 16 *1кМ тимидина, в присутствии 0,25 мМ дибутирил-цАМФ). I. Гипертермическое воздействие ( +45° С, 90 минут) с последующим юсстановительным периодом (+37° С, от 12 до 20 часов в разных хриях) в отношении клеток, находящихся в условиях интенсивной 1ролиферации (модифицированная Дульбекко среда Игла + 5% Детальная бычья сыворотка+100. мкМ гипоксантина+ I мкМ шиноптерина + 16 мкМ тимидина).

Индукция "теплового шока" ¡n vivo осуществлялась в наших жспериментах на крысах-самцах, ранжированных по массе тела и [юновым показателям "гексеналового теста" (время засыпания и сна).

Животным предварительно вводился дроперидол (2,5%, 0,1 мл/кг), тосле чего они содержались в водяной бане при температуре +40,0° и 1-41,0° С в течение 25 минут (ректальная температура - +40,0° и +41,0° С, :оответственно, через 5 минут с момента начала гипертермической эбработки). Продолжительность восстановительного периода

стандартные условия содержания, комнатная температура) составляла (в

разных сериях экспериментов) 6, 24, 48 и 96 часов. Для исключения влияния неспецифических стрессовых реакции животные контрольных 'групп, а также животные опытных групп перед гипертермической обработкой, находились в аналогичных условиях водяной бани при температуре +37° С в течение 10 минут) ( ректальная температура не изменялась по сравнению с группой интактных животных).

Активность центральной нервной системы и состояние детоксикационной функции печени оценивались с помощью "гсксеиалового теста" как способа сочетанного изучения гепатотропных и нейротропных эффектов.

Изучение реакции ядрышкового аппарата гепатоцитов на гипертермическое воздействие осуществлялось гистохимическим методом (окраска депарафинизированных срезов печени 50% раствором нитрата серебра).

Статистическую обработку проводили методами математической статистики с использованием критерия Стьюдента, критерия Фишера и метода однофакторного дисперсионного анализа, непараметрических методов с применением критерия Т Уайта.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Моделирование окислительного стресса представляет собой экспериментальный подход к изучению клеточных и молекулярных механизмов токсического действия ксенобиотиков. В соответствии с нашими экспериментальными данными о действии индукторов окислительного стресса в клетках различной природы in vitro и in vivo, существенный вклад в патогенез повреждения клеток вносят нарушения калиевого и кальциевого ионного гомеостаза, а также изменения структурно-функциональной стабильности клеточных белков, приводящие к дисрегуляции рецептор-эффекторных клеточных сигнальных систем.

В экспериментах in vitro на inl-грансфектированных клетках NG 108-15 нами было впервые показано, что адекватный уровень внутриклеточного НАД является обязательным условием реализации ингибирующего влияния ряда нейротрансмиттеров (ацетилхолина, браднкинина, ингиотензина II, эндотелина 1, АТФ) в отношении потенциал-зависимого калиевого тока М-типа ( I KVM/), участвующего в регуляции процессов деполяризации и синаптической передачи. При совместной инкубации клеток с ксенобиотиком стрептозотоцином, в механизме цитотоксического действия которого важную роль играет формирование свободных радикалов и изменение, таким образом, внутриклеточной концентрации НАД в силу конверсии его в полиАДФР, необходимую для репарации ДНК, поврежденной свободными радикалами, специфическое подавление I К/М/ при связывании нейротрансмиттеров со своими рецепторами было значительно снижено, что коррелировало со степенью падения внутриклеточной концентрации НАД (Табл.1).

Вызванное стрептозотоцином нарушение сопряжения между рецептор-лигандным комплексом и модуляцией ионного канала ликвидировалось при восстановлении уровня внутриклеточного НАД (напрямую - через включение НАД в состав интрацеллюлярного микроэлектродного раствора, или опосредованно - через ингибирование активности полиАДФ-рибозилполимеразы никотинамидом или 3-аминобензамидом). С учетом того, что указанные изменения уровня внутриклеточного НАД не ' отражались на опосредованной нейротрансмиггерными рецепторами активации фосфолипаза С- и аденилатциклаза - зависимых механизмов, осуществляемых через тот же подкласс ГТФ-связывающих белков ( Gq), что и медиирующих подавление М-тока , мы сделали вывод о том, что НАД участвует в системе "рецептор- Gp- эффектор" на пострецепторном уровне.

Инкубация клеток со стрептозотоципом приводила к изменении: процессов гомологичной десенсибилизации, выражающемуся е удлинении ( в 2 раза и более) периода рефрактерное™ к повторному действию агонистов нейротрансмиттерных рецепторов, в том числе е клетках с предварительно редуцированным уровнем Gq.

Таблица 1

Нарушение стрептозотоципом агонист-ккдуцируемого

подавления калиевого тока М-типа в пП-трансфектнрованных клетках NG 108-15 in vitro

Агонист Ингибирование М-тока а)

К СТР СТР+НИК НИК

АТФ , 100 мкМ 41,0+3,1(14) 9,1+5,5***(10) 33,0+5,6(5) 51,0±5,5(4) Брадикинин,

10 нМ 43,0+6,1 (9) 19,0±6,2* (6) 38,0±7,2 (4) 50,0±8,4 (4) Ангиотензин 11,

100 нМ 37,0+3,6(11) 7,0±4,7*** (4) 52,0±2,8 (3) 41,0+4,2(3) Эндотелии I,

100 нМ 37,0+5,3(5) 15,0+4,6* (S) 27,0+4,0(4) 38,0±4,5 (5) Ацетилхолин,

10 мкМ 57,0±4,8 (6) 17,0+9,8* (5) 46,0±9,0 (5) 48,0+6,1 (4)

а) величина ингибирования М-тока рассчитана как (х-у)/х х 100, где х -амплитуда М-тока до аппликации вещества, у - амплитуда М-тока после аппликации вещества.

п - объем выборки; достоверность отличий по сравнению с контролем:

* Р < 0,05, ** Р < 0,02, *** Р < 0,01, **** Р < 0,001.

Обозначения: К - контроль, СТР - инкубация со стрептозотоцином (5мМ), СТР+НИК- совместная инкубация со стрептозотоципом (5мМ) и никотинамидом (5мМ), НИК - инкубация с никотинамидом (5мМ) в течение 15 часов.

Нами установлен факт наличия дозовой зависимости в характере цигоповреждающего действия ксенобиотика-индуктора окислительного

стресса в клетках NG 108-15: нарушение количественных и качественных характеристик внутриклеточного пула пиридиновых нуклеотидов при действии в умеренных дозах и неспецифический мембранотоксический эффект в больших дозах.

До сих пор существование вторичного посредника в рсцепгор-опосредованном подавлении потенциал-зависимого калиевого выходящего тока М-типа в клетках нейрональной природы не было подтверждено экспериментально. Нами впервые продемонстрировано участие циклической АДФ-рибозы (цАДФР) в регуляции активности мускарин-чувствительных калиевых каналов М-типа, а также рианодин-чувствительных внутриклеточных кальциевых депо в нервных клетках NG 108-15 и доказана специфичность сопряжения рецептор-опосредуемой активации синтеза этой регуляторной молекулы (Рис. 1 ).

Полученные данные подтверждают существование конкурентных путей ферментативной конверсии НАД в клетках (генерация цАДФР, моноАДФР и полиАДФР). Вызванная ксенобиотиком-индуктором окислительного стресса активация поли-АДФР-полимеразы приводит к истощению внутриклеточной концентрации НАД, тем самым блокируя альтернативные пути его метаболической деградации и сопряженные с ними клеточные сигнальные системы. Дезинтеграция регуляторных метаболических путей имеет своим результатом нарушение кальций-мобилизующей активности цАДФР и трансмембранных ионных процессов, сопряженных с функционированием каналов М-тока.

Принадлежность пиридиновых нуклеотидов к внутриклеточной редокс-буферной системе, а также экспериментальное доказательство наличия НАД - и цАДФР- зависимых эффектов нейротрансмиттеров, подавления этих эффектов в нервных клетках при индуцированном ксенобиотиками окислительном стрессе подтверждает значимость структурной или функциональной перестройки редокс-регулируемых

компонентов сигнальной системы "рецептор - эффектор" в патогенезе цитотоксического действия ксенобиотиков.

1

-50 мВ

контроль

5 10

200 мсек ВРЕМЯ (мин)

Рис.1. Эффект циклической АДФ-рибозы и ГТФ-7-S на -.наивность ионных каналов выходящего потенциал-зависимого калиевого тока М-типа в ml-трансфектированных клетках NG 108-15

Примечание: кривые, характеризующие динамику изменения амплитуды М-тока, представлены согласно уравнению: It=Io exp (-kt), где It и lo -амплитуды тока при значении времени t и 0, соответственно; к -константы (контроль: -0,025+0,0008 мин"1, цАДФР: -0,054+0,0007**** мин"1; ГТФ-y-S: -0,080+0,0013**** мин"1).

Нами впервые обнаружен факт имитации специфического клеточного эффекта ряда нейротрансмиттеров тиолотропными ксенобиотиками, что подтверждает участие процессов формирования поврежденных (аберрантных) белковых молекул в механизме реализации их цитотоксического потенциала. При действии на клетки NG 108-15 тяжелых металлов ( ED50 1-4 мкМ) (соединений ртути и серебра), органических сульфгидрильных ядов (р-хлоромеркуробензоат, N-метилмалеимид) и эндогенных тиолотропных агентов (восстановленного

и окисленного глутатиоиа) происходило избирательное подавление активности ионных каналов М-тока, приводящее к деполяризации клеток и развитию феномена "гетерологичной десенсибилизации".

Показана роль эндогенных продуктов окислительного метаболизма клеток (глутатиоиа и цисгеина) в ауторегуляции электровозбудимости нервной ткани через транзиторную индукцию тиол-дисульфидного обмена в редокс-чувствительных центрах трансмембранных белков, проявляющуюся избирательным подавлением калиевого тока М-типа и связанной с этим деполяризацией клеток.

Путем направленного воздействия (активирующего или ингибирующего) на отдельные звенья цепи "рецептор- Ср-эффектор" нами идентифицирован сайт действия тиолотропных соединений в нервных клетках млекопитающих - редокс-чувствительные участки экстрацеллюлярных доменов ионных каналов. Установлено, что кинетические параметры ионной проводимости каналов при действии нейротрансмиттеров и тиолотропных ксенобиотиков, с одной стороны, и блокаторов поровых участков ионных каналов, с другой стороны, различны (Табл. 2). При использовании нами алкилирующего агента (йодацетамид) в составе перфузирующего раствора происходило подавление М-тропной активности глутатиоиа, брадикинина и ацетилхолина в клетках N0 108-15, что подтверждает существование механизма "насильственной имитации" эффектов активации регуляторных молекул в цитоповреждающем действии веществ экзогенной природы.

Таким образом, присутствие редокс-чувствительных центров в молекулах трансмембранных белков является одним из условий проявления рег'уляторной активности нейротрансмиттеров и реализации цитотоксического потенциала ксенобиотиков-индукторов

окислительного стресса. Развитие последнего имеет своим результатом

изменение чувствительности клеточных белков к реакциям посттрансляционной модификации, что лежит в основе нарушения рецептор-опосредованной регуляции активности ионных каналов и их GAP-подобной функции (Рис.2).

Одним из механизмов, значимо изменяющим структурно-функциональную стабильность клеточных белков, является фосфорилирование, осуществляемое семейством прогеинкиназ с различной субстратной специфичностью. Включение е состав внутриклеточного раствора поли-Ь-лизина (0,05-0,5 мкМ), обеспечивающего увеличение чувствительности клеточных белков к реакциям фосфорилирования, вызывало в наших экспериментах на клетках NG 108-15 подавление М-ток-регуляторной активности брадикинина и глутатиона. ■ Ортованадат натрия (ксенобиотик, вызывающий накопление в клетке продуктов свободно-радикальной природы и обладающий фосфотирозинфосфатаза-ингибирующей активностью ) модулировал индуцируемое глутатионом и брадикинином подавление М-тока в клетках NG 108-15, вызывая снижение эффективности действия веществ в первые 18 часов инкубации клеток с ортованадатом и стимуляцию - в последующие 60 часов инкубации.

При включении ортованадата натрия в состав микроэлектродного раствора он значимо подавлял М-ток-ингибирующую активность в клетках с предварительно сниженным уровнем Gq ( пролонгированная инкубация с карбахолом и циклогексимидом). При инкубации ш1-трансфектированных клеток NG 108-15 со стрептозотоцином в течение 6,5, 15 и 24 часов происходило последовательно нарастающее подавление каналотропной активности глутатиона и снижение чувствительности клеток к его действию. Предварительная инкубация стептозотоцин-обработанных клеток с ортованадатом натрия (60 часов) частично восстанавливала эффект глутатиона в отношении 1 КУМ/.

Нарушение адгезивной способности клеток, максимальное при изолированном применении ингибитора фосфотирозинфосфатаз, полностью предотвращалось совместной инкубацией с ортованадатом натрия и индуктором окислительного стресса - стрептозотоцином.

Рис. 2. Модификация редокс-чувствительных центров компонентов рецептор-эффекторных клеточных сигнальных систем в патогенезе цитотоксичности ксенобиотиков

Обозначения: * - активация, Gp - ГТФ-связывающий белок, GAP -ГТФ-аза-активирующий белок

Таким образом, нарушение ионного гомеостаза нервных клеток при

действии ксенобиотиков носит вторичный характер и обусловлено

первичным дисбалансом окислительно-восстановительных процессов

при накоплении поврежденных белковых молекул. Полученные нами

зо

данные позволяют сделать вывод о возможном реципрокном влиянии экстра- и интрацеллюлярных структурно-конформационных перестроек (индуцированных, соответственно, окисляющими/алкилирующими веществами и реакциями фосфорилирования), в механизмах регуляции активности ионных каналов в физиологических условиях и в состоянии окислительного стресса клетки (Рис. 3). Исходя из этого, именно

протеотоксичность может являться критерием цитоповреждающего действия факторов физической и химической природы, а качественные характеристики протеотоксичности вещества - определять специфичность поражения клеточных структур.

Таблица 2

Кинетические параметры калиевого тока М-типа в т1-трансфектированных клетках N0 108-15

Серия g max V 1/2 (мВ) k n t деактивации (мсек)

Контроль 0,99±0,02 -60,4±3,1 9,7+0,95 17 121,0±7,0

АХ 0,59±0,25*** -59,0+13,4 9,0+4,1 3 137,0±23,0

HgCl2 0,71+0,15*** -67,5+7,0 7,4+1,6 4 138,0±19,0

AgN03 0,78+0,12*** -54,3+9,2 7,5±1,9 4 126,0+19,0

п-ХМБ 0,72+0,12*** -54,9±6,4 10,0±2,5 3 107,0+21,0

BaCl 2 0,61+0,13*** -45,9±9,3* 16,9±5,9* 4 72,9±14,0*

а) Обозначения: g max - относительная проводимость ионного канала, вычисленная на основании уравнения Больцмана :

й = £ тах/(1+ехр(( V 1/2 - V с) I к ); V 1/2 - полупотенциал, к - параметр релаксации, п - объем выборки, I деактивации - время, определяемое для остаточных токов при потенциале мембраны -50 мВ.

_ Рецептор (ml, m3, т5; БК) Туг

X

Фосфолнпаза С

ИФч

ДАГ

ПК С

цАДФР-синтетаза ТПК

(CD38) \

цАДФР

Г

Туг

1 II Г

/ А"/Д//

>

->

Cys

Cys

>

IK/CaJ

Рис. 3. Механизм регуляции активности ионных каналов в гибридных клетках "нейробластома мыши х глиома крысы" клона NG 108-15 при стимуляции мускариновых ацетилхолиновых и брадикининовых рецепторов

- указаны места действия ксенобиотнков-индукгоров окислительного стресса и тиолотропных агентов Обозначения: цАДФР - циклическая АДФ-рибоза, ПК С - протеинкинаэа С, ТПК -гирозннпротеинкиназа, ИФ 3 - инозитолтрифосфат, ДАГ - днацилглицерол, 'ЭПР -)НД0плазматический ретикулум, Gq - подтип ГТФ-связывающих белков, I К/М/ -потенциал-зависимый выходящий калиевый ток М-типа, I К /Са/ - к-алышй->ависимый калиевый ток

Использование экспериментальной модели"теплового шока" in vitro и in vivo (классическая модель протеотоксичности) позволило установить, что подобно окислительному стрессу, гипертермическое воздействие на клетки NG 108-15 приводит к выраженному неспецифическому подавлению ион-транспоршых процессов, выражающемуся в потере канал-регуляторной активности ряда нейротрансмитгеров с максимумом эффекта к 6 часу восстановительного периода. Обратная динамика процесса характеризуется разобщением времени восстановления калиевых и кальциевых ионных механизмов, что косвенно свидетельствует о преобладании нарушений гомеостаза кальция и работы кальций-депонирующих структур клеток в патогенезе прогеотоксического поражения. По мере увеличения

продолжительности восстановительного периода после "теплового шока" нарастают явления дивергенции протеотоксичных и мембранотоксичных эффектов гипертермии. -

При изучении особенностей патогенеза "теплового шока" in vivo доказана возможность индукции перекрестной резистентности к ксенобиотику, токсифицируемому в системе микросомальных оксигеназ печени, при умеренном "тепловом шоке" in vivo. Показано, что достижение такой толерантности возможно не ранее 6 часа восстановительного периода после гипертермического воздействия, эффект перекрестной резистентности сохраняется, по крайней мере, в течение 48 часов после "теплового шока". Обнаружен феномен отмены индукции ферментов метаболизма ксенобиотиков (фенобарбитал- , но не мегилхолантрен-индуцируемых подфракций цитохрома Р-450) умеренным гипертермическим воздействием (Табл. 3). Характер реструктурирования ядрышкового аппарата гепатоцитов перицентральных и перипортальных зон печени свидетельствует об изменении метаболизма рРНК в постгипертермическом периоде и

косвенно доказывает участие белков теплового шока в процессах формирования "перекрестной термотолерантности".

Таблица 3

Изменение параметров токсичности акриламида (однократное внутрибргошинное отравление, 100 мг/кг) в восстановительном периоде после теплового шока in vivo

Серия

Время засыпания, мин Время сна, мин

Контроль ФБ- Р-450* А А (I) а), 100 мг/кг +40,0° С - 25 мин +38,00 с - 6 часов (ДА (I), 100 мг/кг +40,0° с - 25 мин +38,00 с - 24 часа А А (1),100 мг/кг (+40,0° С - 25 мин +38,00 С-48 часов АА (1),100 мг/кг (+41,0° С - 25 мин +38,00 С - 24 часа АА (1), 100 мг/кг

МХ-Р-450* АА (II) б), Ю0 мг/кг (+41,0° С-25 мин +38,0°С - 24 часа [АА (II), 100 мг/кг

2,25+0,12** 2,69±1,73 1,60+0,21

2,05±0,14

2,73±0,10***

2,62±0,32*

2,18+0,05

1,95+0,07 1,97±0,11

1,97+0,20

17,7±1,67***

12,6±2,67*

33,5+3,69

31,1±1,2

20,25±2,46**

19,5±2,87**

9,0+0,94**

26,0±9,89 28,0+4,50

23,75+7,49

а) введение акриламида на фоне предварительной индукции фенобарбитал-индуцируемых подфракций цитохрома Р-450;

б) введение акриламида на -фоне предварительной индукции метилхолантрен-индуцируемых подфракций цитохрома Р-450 Примечание: указана достоверность отличия по сравнению с изолированным применением АА, 100 мг/кг.

Примечательным является развитие в постгипертермическом периоде в гибридных клетках "нейробластома х глиома" реакций,

соответствующих классической рецепторной гетерологичной десенсибилизации: потеря клетками чувствительности к действию нейротрансмиттеров после теплового шока. Подобный механизм, вероятно, может быть основой эффекта "отмены индукции" цитохрома и снижения чувствительности гепатоцитов к действию субстратов цитохрома Р-450 в посггипертермический период, что соответствует современным представлениям о рецепторной активности цитохрома Р-450 в отношении ксенобиотиков (О.Ш.ЫеЬей, 1992). Это подтверждает функциональную схожесть процессов клеточной рецепции и активации сигнальных систем при действии эндогенных регуляторных молекул и ксенобиотиков.

Нами было обнаружено, что в т1 (но не ш2 и т4) -трансфектированных клетках Ыв 108-15 , тепловой шок вызывает развитие межнуклеосомной фрагментации ДНК (специфического признака апоптоза), чувствительной к модулирующему действию агонистов мускариновых рецепторов, а также НАД-деплетирующего агента (стрептозотоцин) и НАД-восстанавливающих агентов (никотинамид и аминобензамид). Стрептозотоцин (2-5 мМ) подавлял специфическую деградацию ДНК, индуцированную гипертермическим воздействием, применение субстратных ингибиторов поли-АДФР-полимеразы никотинамида и аминобензамида (5 мМ) блокировало указанный эффект ксенобиотика. Никотинамид, будучи примененным изолированно, индуцировал межнуклеосомную фрагментацию ДНК, вместе с тем этот агент радикально не влиял на выживаемость клеток.

Карбахол (агонист ацетилхолиновых рецепторов) и кофеин (агонист внутриклеточных рианодиновых рецепторов - мест связывания цАДФР) вызывали индукцию межунклеосомной фрагментации ДНК, которая

эффективно подавлялась стрептозотоцином (Рис. 4). Эти данные позволяют рассматривать нарушения внутриклеточного ионного (прежде всего кальциевого) гомеостаза в качестве одного из пусковых механизмов суицидальной клеточной программы, являющегося объектом рецептор-опосредованной регуляции или одной из составляющих индуцируемых ксенобиотиками летальных клеточных повреждений.

01 23456789 10 11 12

Рис.4. Межнуклеосомная фрагментация ДНК т1-трансфектированных клеток N0 108-15

Представлены визуализированные данные гель-электрофореза (2% агар) ДНК, выделенной из клеток следующих серий (1-12):

0 - Стандарт Мг ДНК

1 - Контроль

2 - Тепловой шок (+45°С, 90 мин.) с восстановительным периодом

(+37°С, 16,5 часов)

3 - Инкубация со стрептозотоцином (5 мМ, 18 часов)

4 - Инкубация с никотинамидом ( 5 мМ, 18 часов)

5 - Тепловой шок (см. серию № 2) и инкубация со стрептозотоцином (5

мМ, 18 часов)

6 - Совместная инкубация со стрептозотоцином и никотинамидом (по 5

мМ, 18 часов)

7 - Инкубация скарбахолом ( 1 мМ, 15 часов)

8 - Инкубация со стрептозотоцином (5 мМ, 18 часов) и карбахолом (1

мМ, 15 часов)

9 - Тепловой шок (см.серию № 2) и инкубация с карбахолом (1 мМ, 15 ч.)

10- Инкубация с кофеином ( 5 мМ, 5 часов)

11- Инкубация со стрептозотоцином (5 мМ, 18 часов) и кофеином (5 мМ, 5 часов)

12-Тепловой шок (см. серию № 2), инкубация со стрептозотоцином (5 мМ, 18 часов) и кофеином (5 мМ,„5 часов)

Мало изученный феномен спонтанной фрагментации ДНК, развитие которого связывают обычно с истощением запаса циготрофнческих факторов в условиях высокой плотности культуры, является уникальной моделью для изучения чувствительности клеток к индукции в них ксенобиотиками механизмов апоптоза. Нами установлено, что в гп1 и тЗ - трансфектированных гибридных клетках "нейробластома х глиома" спонтанная фрагментация ДНК развивается при высокой плотности клеточной популяции,а также при исключении из состава питательной среды необходимых для пролиферации гибридных клеток тимидина и гипоксантина (даже при низкой плотности культуры и достаточном количестве полипептидных факторов роста).

Рассматривая апоптоз в качестве аберрантной формы митоза и признавая ключевую роль процессов тирозинфосфорилирования в регуляции клеточного цикла, с учетом полученных нами данных о роли тирозинфосфорилирования в регуляции активности ионных каналов М-типа, мы предположили, что чувствительность клеточных сигнальных систем, сопряженных с тирозинкиназной и тирозинфосфатазной^ активностью, к летальному и сублетальному повреждающему действию ксенобиотиков может зависеть отпролиферативного статуса клеток.

Нами установлено, что эффекты стрептозотоцина, никотинамида, аминобензамида, а также теплового шока в отношении специфического типа деградации ДНК принципиально отличаются в культурах с разной степенью пролиферативной активности. В том случае, когда значительное увеличение плотности культуры было связано с высоким пролиферативным потенциалом клеток (регулируемым через концентрацию облигатных ростовых факторов в питательной среде) клетки были чувствительны не только к развитию спонтанной фрагментации ДНК, но и к индукции апоптоза гипертермическим воздействием и подавлению ее сгрептозотоцином. Если же высокая

плотность культуры достигалась исходным внесением большого количества клеток в чашку для культивирования, а не модификацией состава питательной среды, развивалась спонтанная фрагментация ДНК и клетки теряли чувствительность к специфическому действию стрептозотоцина, никотинамида и аминобензамида. Индукция дифференцировки таких клеток не отменяла феномен спонтанной фрагментации ДНК.

Все эти эффекты эндогенных и экзогенных агентов были максимально выражены в клетках, экспрессирующих т1-подтип ацетилхолиновых рецепторов, что свидетельствует о внутриклеточной конвергенции передачи сигнала при действии естественных лигандов этих рецептороа (карбахол), протеотоксических НАД-деплетирующих ксенобиотиков ( стрептозотоцин) и модуляторов репаративной функции клеток (кофеин, никотинамид, р-аминобензамид).

Блокирование стрептозотоцином межнуклеосомной фрагментации ДНК, индуцированной при пролонгированном действии агониста ацетилхолиновых рецепторов - карбахола - или гипертермической обработке клеток представляет собой один из механизмов нарушения митогенной активности лигандов рецепторов, сопряженных с ГТФ-связывающими белками. Это, в свою очередь, может приводить к накоплению в популяции клеток с нерепарабельными повреждениями (аберрации ДНК, модифицированные белки-эффекторы (ферменты и ионные каналы), что приобретает особое значение в прогрессировании острой или формировании хронической экзогенной интоксикации.

Таким образом, мы предполагаем, что формирование аберрантных клеточных белког» (-флнзиторное или пролонгированное) является механизмом ауторегуляции клеточных функций в физиологических условиях или при действии протеотоксических факторов химической или физической природы. При этом малые дозы ксенобиотиков или

активация сигнальных систем клеток при действии естественных регуляторных факторов ( гормоны и пр.) вызывают обратимые изменения белковых молекул, что способствует увеличению их чувствительности к реакциям посггрансляционной модификации (фосфорилирование) и лежит в основе феномена рецепторной десенсибилизации, регуляции активности ферментов и ионных каналов клеток. Выраженный окислительный стресс вызывает необратимое повреждение биомакромолекул, нарушение механизмов посггрансляционной модификации белков-эффекторов ( в том числе ионных каналов) и регуляции запрограммированной клеточной смерти.

Подтверждением полученных нами данных о высокой чувствительности активно пролиферирующих клеток к воздействиям, изменяющим активность клеточных сигнальных систем, явилось обнаружение нами в гемопоэтических клетках, обладающих сходными с клетками нейрональной природы компонентами рецептор-эффекторных систем, одного из механизмов цитотоксического действия ксенобиотика-индуктора окислительного стресса (акриламида), связанного с нарушением физиологической регуляции пролиферации и гибели клеток костного мозга. Нами установлено, что вещество нейротрансмиттерной природы - серотонин - оказывает ингибирующее влияние на колоние- и (преимущественно) кластерообразующую способность гемопоэтических клеток в концентрациях от 10-7 до ю-9 м. Акриламид в концентрациях 10-3 . ю-4 м

в дозо-зависимой манере эффективно подавлял колоние- и кластерообразующую активность клеток костного мозга при совместной инкубации с ними в прединмплантационный период (Табл. 4).

При совместной инкубации клеток с акриламидом и серотонином происходило восстановление пролиферативной активности клеток, свидетельствующее о нарушении акриламидом некоторых внутриклеточных процессов, сопряженных с активацией рецепторов

серотонина. Предварительная инкубация клеток с никотинамидом, являющимся субстратным ингибитором поли-АДФ-рибозилполимеразы , частично "отменяла" эффект акриламида и серотонина в отношении кластерообразующей способности гемопоэтических клеток.

Таблица 4

Влияние изоптина и никотннамида па серотонинэргнческую регуляцию пролиферации клеток костного мозга (в диффузионных камерах) при действии ксенобиотика-индуктора окислительного стресса

Серия КОС КлОС Апоптоз,%а

Контроль 30,33+3,06 162,55±13,06 2,38+0,67

АА, 10-3 М 5,70±1,3**** 38,25+4,16*** 10,90±1,6****

СТ, 10-8 М 25,75±3,53* 118,4±22,14* 2,71±0,39

ИЗО, 5x10-5 М 19,0+4,0*** 77,25+17,06** 9,50±2,06**** АА, Ю-3 М +ИЗО, 5хЮ"5М 9,67±2,07**** 157,75+19,16 7,50±0,45**** СТ, 10-8 М + ИЗО, 5x10-5 М 12,33±4,59**** 163,0±34,0 2,71±1,21

НИК, Ю-3 М 6,14±1,22**** 49,17±4,56**** 8,42±0,93****

АА, Ю-3 М + НИК, 10-3 м 8,50±0,65** 66,00+2,88** 8,83±0,95****

СТ, Ю-8 М + НИК, Ю-3 м 16,25+4,05**** 108,0±1,5*** 1,25±0,48*

АА,10-3М+СТ,10"8М 38,25+6,73 141,50+25,08 7,74±1,28****

АА,10-Зм+И30,5х10"5м+

СТ, 10-8М 14,25+2,25**** 129,2±15,43*** 6,33±1,09**** АА,10"3М +НИК.10-ЗМ+

+СТ,10"8м 26,33+4,06 101,0+10,35 2,80+0,63

Обозначения: а) Представлено относительное количество клеток с морфологическими признаками апоптоза; п в разных сериях от 5 до 16.

Лптимитогенная активность серотонина и акриламида эффективно подавлялась блокатором кальциевых каналов - изоптином, хотя сам изоптин ингибировал пролиферацию клеток костного мозга, будучи примененным изолированно. При этом изоптин преимущественно подавлял колониеобразующую способность клеток, но инвертировал эффект серотонина и акриламида в отношении кластерообразующей активности. Изоптин блокировал "инверсию" эффекта серотонина в клетках, прединкубированных с акриламидом, более того, потенцируя вызванное серотонином подавление колониеобразующей активности, тогда как никотинамид обладал аналогичным действием в отношении кластерообразующих клеток. Изоптин эффективно блокировал вызванное акриламидом увеличение относительного количества клеток с морфологическими признаками апоптоза в популяции клеток костного мозга, при этом сам изоптин, как и никотинамид, будучи примененным изолированно, стимулировал процессы запрограммированной клеточной гибели (Табл.4).

Эти данные в совокупности с результатами экспериментов, выполненных на клетках N0 108-15, являются подтверждением значимости кратковременной и долгосрочной модуляции ион-транспортных механизмов в клетках различной природы в процессах регуляции митотической активности и обеспечения жизнеспособности клеток при действии экзогенных факторов. Коль скоро нарушения ионного и окислительно-восстановительного гомеостаза обусловлены индукцией компенсаторных репаративных процессов при окислительном повреждении биомакромолекул, генотоксичность ксенобиотика может являться одним из ведущих факторов, определяющем особенности реализации его суммарного цитотоксического потенциала.

Результаты проведенных нами экспериментальных исследований в клетках костного мозга при воздействии бутилакрилата и

метилметакрилата in vivo, а также изучение нами закономерности индукции или подавления межнуклеосомной фрагментации ДНК в клетках нейрональной природы подтверждают точку зрения на апоптоз как на аберрантную форму митоза и свидетельствуют об индукции адаптивных процессов в клеточной популяции в условиях подострой экзогенной интоксикации. Установлено, что при острых и хронических интоксикациях ксенобиотиками с алкилирующим и окислительным механизмами действия (производные акриловой и метакриловой кислот -бутилакрилат и метилметакрилат) in vivo изменение плоидности клеточной популяции костного мозга коррелирует с эффективностью элиминации хроматидных и хромосомных аберраций. Увеличение дозы ксенобиотиков до 1/2 LD50 сопровождается резким снижением относительного количества полиплоидных клеток и увеличением клеток с гиподиплоидией ( признак аберрантных форм митоза, т.е. одно из проявлений запрограммированной клеточной гибели).

Установление нами принципиально различных механизмов ДНК-повреждаюицего эффекта бутилакрилата (БА) и метилметакрилата (ММА) позволило оценить значимость молекулярных механизмов генотоксичности в формировании эффективных компенсаторных клеточных механизмов. Так, при воздействии одноцентрового ММА на протяжении 8 недель в костном мозге вплоть до 6 недели происходило прогрессирующее увеличение количества гиподиплоидных клеток и снижение количества клеток, несущих хроматидные или хромосомные аберрации. Пик количества гиподиплоидных клеток совпадал с почти полным исчезновением клеток в состоянии полиплоидии и несущих аберрации хромосомного типа, что косвенно свидетельствует об интенсификации процессов клеточной гибели. При действии полицентрового БА относительное количество гиподиплоидных' клеток сохранялось на стабильном уровне, что позволяет сделать вывод о

неэффективности элиминации поврежденных клеток, судя по увеличению количества аберрантных клеток к 8 неделе отравления (Табл. 5). Вероятно, механизм некротической элиминации клеток с признаками выраженной мембранотоксичносги более значим для хронического отравления БА, тогда как активная (путем апоптоза) элиминация клеток более характерна для интоксикации моноцентровым ММА .

Таблица 5

Влияние острого и подострого отравления акрилатами на хромосомный аппарат клеток костного мозга крыс

Препарат, доза, Полиплоидия Гиподиплои- Хроматидные Хромосомны«

время ДИЯ аберрации аберрации

Контроль 0,4±0,26 0,8±0,4 1,0+0,45 0,8+0,61

БА, 1/4 ЬЭ50

однократно 4,4±2,67 0,8+0,4 2,4+0,67 3,6+0,67

Б А, 1/4 ЬЭ50

подостро:

- 2 недели 9,2±3,0* 6,4±0,75*** 7,2±1,49***

- 4 недели 4,4±1,17*** 8,0±2,82** 2,4±0,748 2.8+1,36

- 6 недель 8,8±2,42**** 6,0±1,09*** 3,6±0,75*

- 8 недель 4,8+2,05 7,2±2,0** 6,8±1,02*** 6,8±1,62**

ММА,1/4Ь050, 0,8+0,44 0,8±0,4 0,8±0,44 0,8±0,44

однократно

ММА, 1/41Л}50,

подостро:

- 2 недели 3,6+0,98*** 8,4±1,72*** 3,6±0,4***

- 4 недели 2,8+0,79* 3,2±1,2 - 2,4±0,98 4,8±0,49***

- 6 недель 7,6+1,93*** 1,6±0,75 2,8±1,01

- 8 недель 0,4+0,39 15,6+3,6*** 2,0±0,89 0,4±0,39

Сравнительное изучение мутагенной активности алкилирующих ксенобиотиков в тест-системах с индуктивной пострепликативной репарацией ( ЯесА-зависимые процессы в прокариотических клетках) и эксцизионной репарацией (полиАДФ-рибозилполимераза-регулируемые процессы в эукариотических клетках) позволило оценить характер взаимосвязи генотоксичности веществ с их способностью индуцировать адаптивные и аутолитические механизмы в клеточной популяции. Показано,что биотрансформация бутилакрилата и метилметакрилата ферментн1.ши системами микросом печени значительно увеличивает их мутагенный потенциал, однако, обуславливает антагонистический характер комбинированного действия ксенобиотиков.

Доказана модуляция индуцируемого акрилатами ЯесА-зависимого типа пострепликативной репарации прокариотических клеток тиолотропным агентом (унитиол), "внутриклеточным чапероном" (гепарин) , стимуляторами немутагенных путей репарации (никотинамид, цианокобаламин).

В экспериментах в бактериальной тест-системе при совместной инкубации протекторов с акрилатами наибольшей антимутагенной активностью обладали тиолотропные вещества и агенты, модифицирующие активность каталитических путей деградации НАД (унитиол и никотинамид, соответственно). При добавлении веществ в момент индукции БОБ-ответа антимутагенная активность была более свойственна гепарину и цианокобаламину.

Для всех тестируемых веществ существовала инверсия их исходного анти- или промутагенного эффекта в отношении мутагенеза, индуцированного акрилатами. Так, для гепарина и цианокобаламина, добавленных в систему в момент индукции БОБ-ответа, исходно антимутагенный эффект трансформировался в промутагенный к 80-100 минуте инкубации, для унитиола же наблюдалась обратная эволюция

эффекта к 35 минуте инкубации. Интересно, что никотннамид проявлял свою антимутагенную активность лишь при совместной инкубации с тестируемыми ксенобиотиками в присутствии или в отсутствие ферментов метаболической биотрансформации, но обладал выраженной промутагенной активностью , будучи добавленным в инкубационную среду в момент индукции БОБ-ответа клеток. В отличие от унитиола эта промутагенная активность не трансформировалась в антимутагенную на протяжении всего периода инкубации. В силу того, что собственный эффект всех тестируемых корректоров мутагенеза в отношении спонтанного уровня БОБ-ответа в наших экспериментах отсутствовал, логично предположить, что эти вещества оказывают влияние на индуцибельные процессы в клетках, подобно тому, как в клетках эукариот никотинамид ингибирует предварительно активированную поли-АДФР-полимеразу.

Полученные экспериментальные данные подтверждают возможную функциональную аналогию в работе стресс-индуцируемых репаративных систем клеток различной природы. Продемонстрированное нами участие НАД- и ион-зависимых процессов в реализации цитотоксических эффектов ряда ксенобиотиков подтверждает возможность

трансформации генетического стресса в стресс метаболический, обеспечивающий самоуничтожение клеток, имеющих значительные повреждения генома, и адаптацию клеточной популяции в целом.

Постулируемое принципиальное единство механизмов естественной (опосредованной эндогенными трансмиттерными ■ молекулами) и патологической (опосредованной ксенобиотиками) регуляции клеточных функций подразумевает возможность коррекции экзогенных интоксикаций путем направленной модуляции рецептор-активируемых механизмов межклеточной коммуникации.

В совокупности результаты нашей работы дают право предложить тедующую схему патогенеза повреждения клеток и формирования омпенсаторных реакций при действии ксенобиотиков (Рис.5).

Рис. 5. Схема патогенеза повреждения клеток и формирования компенсаторных реакций при действии ксенобиотиков

ВЫВОДЫ

1. В патогенезе цитотоксического действия ксенобиотиков-индукторо окислительного стресса важную роль играет нарушение клеточног ионного (кальциевого и калиевого) и окислительно-восстановительног гомеостаза, связанное как с прямым повреждением биомакромолеку клетки ( нарушение конформационно-функциональной стабильност трансмембранных клеточных белков, неспецифически; мембранотоксический эффект), так и с дисрегуляцией в рецептор эффекторных сигнальных клеточных механизмах ("имитация естественных эффектов трансмиттерных молекул, изменение реакци] рецепторной и пострецепторной десенсибилизации).

2. Протеотоксичность является ведущим механизмом реакцш альтерации и адаптации при действии тиолотропных ксенобиотиков i индукторов окислительного стресса. Чувствительность клеток к и: действию определяется наличием редокс-регулируемых сайтов белковы; молекул-компонентов клеточных сигнальных систем ( в том чиог рецепторов и ионных каналов).

3. В клетках нейрональной природы эффекты ряда нейротрансмиттеро] (ацетилхолина, брадикинина, АТФ, ангиотензина 11 , эндотелина 1) npi активации соответствующего класса рецепторов контролируютс: адекватным уровнем внутриклеточного НАД и продуктами егс каталитической конверсии (моно-АДФ-рибоза, цикло-АДФ-рибоза поли-АДФ-рибоза). цАДФ-рибоза постулируется в качестве вторичноп мессенджера, ответственного за селективное подавление потенциал зависимых калиевых ионных каналов М-типа в этих клетках.

4. Возникающее в условиях окислительного стресса истощени! клеточного пула НАД имеет своим результатом нарушение НАД зависимых эффектов эндогенных регуляторных молекул, в том числ« регуляции активности ионных каналов. Модификация редокс

увствигельных участков белков ионных каналов, трансмембранных ерментов и рецепторов тиолотропными агентами экзогенной (тяжелые еталлы, органические сульфгидрильные яды) и эндогенной (глутатион, истеин) природы является, соответственно, основой протеотоксического ействия этих ксенобиотиков и одним из механизмов клеточной егуляции в физиологических условиях, сопряженной с активностью еакций тирозинфосфорилирования.

. Чувствительность клеток к действию экзогенных протеотоксических )акторов химической и физической природы определяется степенью легочной пролиферации и дифференцировки, эффективностью ¡итоадаптивных процессов (синтез "белков теплового шока"), а также ффективностью элиминации необратимо поврежденных клеток юпуляции механизмом запрограммированной клеточной смерти апоптоз).

». Суммарное токсическое действие ксенобиотиков-индукторов жислителыюго стресса может включать в себя, в числе прочих, механизм, обусловленный нарушением НАД- и кальций-зависимых фоцессов в опосредованной серотонином регуляции пролиферативной 1ктивности клегок костномозгового происхождения. К Ксенобиотики регулируют механизмы запрограммированной слеточной смерти (апоптоза) в клетках костномозгового происхождения 1 нейрональной природы путем нарушения энергозависимых звеньев патогенеза клеточной гибели, дисрегуляции ионного гомеостаза клеюк, тзменения физиологических процессов регуляции апоптоза эндогенными иитогенными и антимитогенными факторами. Активация ксенобиотиком индуцибельных репаративных систем, с одной стороны, и собственно генотоксическое воздействие, с другой стороны, являются условиями проявления эффекта вещества в отношении механизмов апоптоза.

8. Умеренное гипертермическое воздействие обеспечивает индукцию "перекрестной резистентности" к действию нейро- и гепатотоксичных ксенобиотиков, биотрансформация которых осуществляется на фенобарбитал-индуцируемых подфракциях цитохрома Р-450.

9. Коррекция цитотоксического эффекта ксенобиотиков может быть эффективно осуществлена субстратными ингибиторами ферментов каталитической конверсии НАД, модификаторами активности кальциевых ионных каналов, тиолопротекторными агентами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Изменение реактивности костного мозга при отравлении акрилатами по мутагенному эффекту и активности ферментов-маркеров субклеточных структур лейкоцитов в периферической крови //Реактивность и регенерация тканей: Тез. докл. научн. конф. - С-Петербург, 1990. - С.72 (соавт. Л.В.Федюкович, И.К.Григорьева).

2. Генетические и энзиматические нарушения в клетках крови при отравлении акрилатами //Научно-технический прогресс и здоровье населения : Тез.докл. научно-практ.конф. - Красноярск, 1990. - С.140 (соавт. Л.В.Федюкович, И.К.Григорьева).

3. Мутагенный эффект акрилатов в эксперименте //Генетические последствия загрязнения окружающей среды мутагенными факторами: Сб. мат. Всесоюзн. координационного совещания. - Москва-Самарканд, 1990. - С. 181-183 (соавт. Л.В.Федюкович).

4. Мутагенный эффект акрилатов // Механизмы патологических реакций: Тез.докл. на Пленуме Сибирского об-ва патофизиологов. -Новокузнецк, 1991.-С. 194-196 (соавт. Л.В.Федюкович).

5. Влияние отравления акрилатами на генетический и метаболический гомеостаз клеток // Профессиональная патология в восточных регионах

страны: Тез.докл. регион, научно-практ. конф. - Новокузнецк. 1991. - Т.1. -С.64-74 (соавт. Л .В.Федюкович, И.К.Григорьева).

6. Мутагенный эффект и цитохимические реакции клеток крови при отравлении акрилатами //Пути и методы снижения заболеваемости рабочих: Сб. научн. тр. - Красноярск, 1990. - C.I15-119 (соавт. JI.В.Федюкович, И.К.Григорьева).

7. Изучение мутагенеза, индуцированного производными акриловой и метакриловой кислот //Профилактика и экспериментальная терапия экстремальных и терминальных состояний: Мат. научн.конф. - Омск, 1992. - С.109-111 (соавт. Л.В.Федюкович, В.Б.Гуревич, Т.Ф.Силинская).

8. Влияние акрилатов на иммунный статус организма в эксперименте //Профилактика и экспериментальная терапия экстремальных и терминальных состояний:-Мат. научн. конф. - Омск, 1992. - С.128-129 (соавт. Л.В.Федюкович, Е.Г.Дивногорцева).

9. The genotoxic effect of acrylates II Ecogen. - 1992. - № 2. - P. 13 (соавт. Л.В.Федюкович).

10.The immunotoxicology of acrylates// Ecogen. - 1992. - № 2. - P. 28 (соавт. Л.В.Федюкович, В.В.Иванов).

1 ГГенотоксический эффект акрилатов // Гигиена и санитария. - 1991. - № 12. - С. 62-64 (соавт. Л.В.Федюкович).

12. Акрилаты: мутагенез и иммунотоксикология. Пути патогенетической коррекции //Творчество длиною в полвека: Сб. научн.тр. Красноярского государственного медицинского института. - Красноярск, 1992. - С. 115120 (соавт. Л.В.Федюкович, В.В.Иванов).

13. Способ приготпши'нНи "{"'нфитов митотических метафазных хромосом//АС 1732222,08.01.1992. (соавт. Л .В.Федюкович).

14. Endothelin induces phosplnino- • 11 • t > metabolite-dependent cellular responses in NG 108-15 hybrid cells // Ann. i-lew-York Acad. Sei. - 1993. - V. 707. - P. 482-485 (coauthors M.Noda, Y.Okano, Y.Nozawa, H.Higashida).

15. Endothelin induces phosphoinosotide metabolite-dependent cellular responses in NG 108-15 hybrid cells // Quaternary Arch. Neuroinform. Res. Inst. Univ. of Kanazawa School of Medicine. - Kanazawa, Japan, 1993. - № 6. - P. 482-485 (coauthors M.Noda, Y. Okano, Y. Nozawa, H.Higashida).

16. Способ определения сенсибилизирующих свойств ксенобиотиков II Патент РФ № 2012876, 1994 (соавт. Л.В.Федюкович, В.В.Иванов).

17. Nicotinamide-adenosine dinucleotide regulates muscarinic receptor-coupled K+ /М/ channels in rodent NG 108-15 cells // J.Physiology (UK). -1995. - V. 482.2. - P. 317-323 (coauthors H.Higashida, J.Robbins, M. Noda ).

18. NAD and cADPR as endogenous regulators of muscarinic receptor-coupled potassium M channels II Proc. 2nd UK.-Japan Physiol. Joint Meet. Physiol. Soc. Japan, UK and Eire, Nagoya, Japan, 1-2 April, 1995. - Nagoya, Japan, 1995. - P. 8 (coauthors H.Higashida, J.Robbins, M.Noda).

19. NAD. and cADPR as endogenous regulators of muscarinic receptor-coupled potassium M channels II Proc. 15th ISN Meet. - Kyoto, Japan, 2-7 July, 1995. - Kyoto, Japan, 1995. - P. S31 (coauthors H.Higashida, J. Robbins, M. Noda).

20. Pathophysiological aspects of laser application // Proc. Intern, conf. "Laser Optics". - S-Peterburg, 1995. - P. 130-135 (coauthors E.Yu.Stavitskaya, V.V.Salmin, L.V.Fedyukovich).

21. Морфологическая изменчивость отдельных органов и тканей при воздействии акрилатов // Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии: Тез.докл. 1 Всеросс. конф. токсикологов. - С-Петербург, 1995. - T.l. - С.65. (соавт. С.В.Михуткина, А.В.Меняйло, Е.Ю.Ставицкая).

22. Повреждающее действие лазеротерапии на клеточное звено иммунитета и показатели периферической крови в эксперименте //Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии:

Тез.докл. 1 Всеросс. конф. токсикологов. - С-Петербург, 1995,- Т. 4. С.62 (соавт. Л.В.Федюкович, Л А.Торопова, М.В.Шапраи).

23. Никотинамидадениндинуклеотид - эндогенный регулятор мускарин-чувствительных калиевых каналов в гибридных клетках "нейробластома х глиома" // Сиб.медицин.журнал. - 1995. - № 3. - С. 13-17 (соавт. Х.Хигашида, Дж.Роббинс, М.Нода).

24. Способ определения мембранотоксичных свойств ксенобиотиков // Патент РФ № 5054034/14, 1995 (соавт. Л.В.Федюкович, В.В.Иванов).

25. Streptozotocin, an inducer of NAD decrease, attenuates M-potassium current inhibition by ATP, bradykinin, angiotensin II, endothelin 1 and acetylcholine in NG 108-15 cells // FEBS Lett. - 1996. - V.379. - P. 236-238 (coauthors H.Higashida, N.Hoshi, M.Noda).

26. The role of nicotinamide-adenine dinucleotide in the regulation of muscarinic receptor-coupled potassium I КУМ/ channels in neuronal cells: the possible contribution to the control of excitability // Homeostasis: new facts and hypotheses. - AMSE Transactions, Krasnoyarsk (Russia) - Tassin (France), 1996. - V. 13, Part II. - Chapter 7. - P. 85-96 (coauthor H.Higashida).

27. Взаимосвязь ионного и окислительно-восстановительного гомеостаза в клетках нервной системы // Коррекция гомеостаза: Мат. VII Всеросс. симп., Красноярск, 17-22 марта, 1996. - Красноярск, 1996. - С. 130-131 (соавт. Х.Хигашида).

28. Влияние акриламида на процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в изолированной печени // Коррекция гомеостаза: Мат. VII Всеросс. сими., Красноярск, 17-22 марта, 1996. - Красноярск, 1996. - С. 148-149 (соавт А.П.Винокуров, А.П Рупсико, Т.А.Романова).

29. НАД и цикло-АДФ-рибоза - эндогенные регуляторы мускарин-чувствительных калиевых каналов в гибридных клетках "нейробластома х глиома" // Патофизиология органов и citi км Типшн-к- патологические

процессы :'Гез.докл. 1 Росс, конгресса по патофизиологии (с междун.участием), Москва, 17-19 окг.1996. -С.15-16 (соавт. К.Хигашида).

30. Патоморфологические и патофизиологические аспекты хронического действия акрилатов //Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процесськТез.докл. 1 Росс, конгресса по патофизиологии ( с междун. участием), Москва, 17-19 окт. 1996. - Москва, 1996. - С.243 (соавг. С.В.Михуткина, А.В.Меняйло, А.С.Пуликов).

31. Inositol trisphosphate/Ca2+ as messengers of bradykinin B2 and muscarinic acetylcholine ml-m4 receptors in neuroblastoma-derived hybrid cells // J.Lipid Mediators Cell Signalling. - 1996. - V.14. - P. 175-185 (coauthors M.Noda, N.Ishizaka, S.Yokoyama).

32. Sulfhydryl modification inhibits K.+ (M) current with kinetics close to acetylcholine in rodent NG 108-15 cells // Neurosci. Res. - 1997 (in press) (coauthors N.Hoshi, R.Knijnik, M.Shahidullah).

Список сокращении:

ЛЛ - акриламид

ДДФР - аденозиндифосфорибоза

ЛТФ - аденозинтрифосфат

АХ - ацетилхолин

БА - бутилакрилат

БК - брадикинин

БТШ - белки теплового шока

ГТФ- у - S - тетралитиум гуанозин 5'-0-(3-тио) - трифосфаг ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИЗО - изоптин

КОС - колониеобразующая способность КлОС - кластерообразующая способность ММА - метилметакрилат

МХ-Р-450* - метилхолантрен-индуцируемые изоформы цитохрома Р-450

НАД - никотинамидадениндинуклеотид

НИК - никотинамид

11АДФР - полиаденозиндифосфатрибоза

р-ХМБ - пара-хлоромеркуробензоат

РНК - рибонуклеиновая кислота

CT - серотонин

СТР - стрептозотоцин

ТШ - тепловой шок

ФБ-Р-450* - фенобарбитал-индуцируемые изоформы цитохрома Р-450

ФДБ - форбол-12,13-дибутират

цАДФР - циклическая аденозипдифосфатрибоза

цЛМФ - циклический аденозинмонофосфат

ED50 - доза, вызывающая 50%-ный эффект

GAP - ГТФаза-активирующий белок (Gp-activating protein)

Gp - ГТФ-связывающий белок (GTP-hinding protein)

Gq/Gi - подфракции ГТФ-связывающих белков

GSH - восстановленный глутатион

GSSG - окисленный глутатион

I К/М/ - потенциал-зависимый выходящий калиевый ток М-типа LD50 - доза, выбывающая гибель 50% животных

ml, m2, m3. in4, т5 подтипы мускариновых ацетнлхолиновых рецепторов

NG 108-15 - клон гибридных клеток "нейробластома мыши х глиома крысы"