Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Роль нарушений межклеточных взаимодействий в патогенезе миелотоксического действия ксенобиотиков антрациклинового ряда

г

На правагрукописи

УСПЕНСКАЯ ЮЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

РОЛЬ НАРУШЕНИЙ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В ПАТОГЕНЕЗЕ МИЕЛОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ КСЕНОБИОТИКОВ АНТРАЦИКЛИНОВОГО РЯДА

14.00Л6 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Иркутск - 2007

ООЗОВ1Т18

003061718

Работа выполнена на кафедре анатомии и физиологии сельскохозяйственных животных ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет», в Межкафедральной научно-исследовательской биохимической лаборатории при кафедре биохимии с курсом медицинской химии ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и Международном научном центре исследований экстремальных состояний организма при Президиуме Красноярского научного центра СО РАН.

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Салмина Алла Борисовна

Константинов Юрий Михайлович Хышиктуев Баир Сергеевич Явербаум Павел Моисеевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», г. Томск

Ж Сли^ЗД^ 2007 года в « о »

Защита состоится «с*.к?» ЧдНЛ их/Ш»-*- 2007 года в « » часов на заседании диссертационного совета Д 001^054.01 при ГУ «Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения Российской академии медицинских наук» по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения РАМН».

«ДО» О^АЛ1

Автореферат разослан « года.

1

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук л 7 Шолохов Л.Ф.

/у

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование клеточных и молекулярных, механизмов межклеточных взаимодействий - одна из приоритетных задач современной биологии и медицины. Тесная интеграция тканей и сложная система межклеточной коммуникации, включающая механизмы внутриклеточной передачи регуляторных сигналов, лежат в основе развития многоклеточного организма и поддержания его нормального функционирования.

Хотя в настоящее время основные механизмы внутриклеточной передачи сигналов с участием цитоплазматических и ядерных рецепторов гормонов, рецепторов, сопряженных с ГТФ-связывающими белками и регулируемых ионных каналов изучены, недостаточно исследованной и наиболее сложной частью проблемы межклеточной коммуникации является разъяснение механизмов согласованного взаимодействия различных лигандов, позволяющих клеткам адекватно реагировать на постоянно изменяющиеся условия среды внутри организма и вне его [Пальцев М.А., 1995]. Особую актуальность исследование механизмов межклеточных контактов приобретает в костном мозге, где коммуникация и интеграция важны для обеспечения жизнеспособности, роста и дифференцировки гетерогенной популяции клеток, а также в силу влияния большого количества регуляторных молекул гемопоэзиндуцирующего микроокружения, обеспечивающих регуляцию гемопоэза в физиологических и патологических условиях [Дыгай A.M., 1989; Гольдберг Е.Д., 2000].

Большинство имеющихся в литературе работ в области гематологии посвящены изучению роли цитокинов, которые рассматриваются как важнейшие специализированные средства межклеточного сообщения, позволяющие клеткам обмениваться информацией [Dinarello СЛ., 1991; Kishimoto Т., 1994; Heldin С.-Н., 2001; Zhou X.Y., 2005]. Вместе с тем, в последние годы все больший интерес представляет изучение влияния клеточных метаболитов как лигандов клеточных рецепторов на пролиферативные, дифференцировочные процессы, а также модуляции ими механизмов естественной (запрограммированной) клеточной гибели - апоптоза и патологической клеточной смерти - некроза. Однако в литературе лишь в единичных работах рассматриваются клеточные и субклеточные механизмы такого рода регуляции [Dubyak G.R., 1993; Di Virgilio F., 2001; Kim M., 2001; Kawamura H., 2005].

Одним из приоритетных направлений современной патофизиологии является исследование механизмов межклеточных взаимодействий в условиях токсического действия ксенобиотиков антрациклинового ряда, способных индуцировать окислительный стресс и нарушать привычные клеточные

/

кооперации и регуляторное влияние естественных метаболитов на клеточные функции, необходимые для нормального функционирования органов и тканей. При этом наименее изученной остается проблема изменения чувствительности клеток костного мозга к действию эндогенных лигандов в условиях окислительного стресса. Это обстоятельство не позволяет разработать новые высокоэффективные лекарственные препараты для восстановления структурно-функционального гомеостаза клетки. Вместе с тем, понимание особенностей сигнальной трансдукции в клетках, находящихся в состоянии окислительного стресса, может стать основой для разработки принципиально новых технологий фармакологической коррекции патологических процессов, ассоциированных с увеличением прооксидантной активности.

Известно, что одним из базовых механизмов цитотоксичности ряда ксенобиотиков является индукция ими окислительного стресса [Halliwell В., 2003; Toler S.M., 2004; Wells P.G., 2005]. Генерация свободных радикалов, сопровождающая физиологические и патологические процессы, становится причиной альтерации биомакромолекул клеток - перекисного окисления липидов, свободнорадикалыюго повреждения нуклеиновых кислот, окисления белковых молекул и полисахаридов, а также изменения интегративных межклеточных и внутриклеточных сигнальных процессов. До сих пор проявления миелотоксичности ксенобиотиков - индукторов окислительного стресса рассматривались преимущественно в качестве обратимых или необратимых повреждений структур клеток, приводящих к дезорганизации клеточного метаболизма и нарушению функционирования органа или системы. Однако в литературе накапливаются данные о роли индукции дизрегуляторных процессов в механизме клеточной гибели [Barisic К., 2003; Parrish A.B., 2006].

В этой связи патогенез многих патологических процессов и гематологических заболеваний может быть раскрыт с принципиально новых позиций - в аспекте межклеточных взаимодействий. Отсутствие на сегодняшний день сведений о веществах - протекторах угнетающего эффекта индукторов окислительного стресса на гемопоэз и неполное раскрытие механизмов альтерации клеточных структур — компонентов сигнальных систем делает актуальным разработку патогенетически обоснованной эффективной стратегии антитоксической защиты клетки путем направленной модуляции рецептор-активируемых механизмов межклеточной коммуникации.

Цель работы. Изучить патогенетическую роль нарушения внутриклеточного гомеостаза НАД+, пуринергической регуляции, коннексин-опосредованной коммуникации в клетках костного мозга в реализации цитотоксического потенциала ксенобиотика антрациклинового ряда (доксорубицина).

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние ксенобиотика антрациклинового ряда на внутриклеточный пул пиридиновых нуклеотидов и метаболизм НАД* в клетках костного мозга.

2. Исследовать влияние ксенобиотика на уровень АТФ в клетках костного мозга и внеклеточном пространстве. Оценить роль различных подтипов пуринергических рецепторов в реализации апоптогенной активности АТФ и модуляции этих процессов доксорубицином в клетках костного мозга мышей in vitro и in vivo.

3. Исследовать развитие запрограммированной и патологической клеточной гибели в клетках костного мозга, подвергнутых действию доксорубицина in vivo и in vitro. Изучить вклад повреждения мембран клеток костного мозга при действии АТФ и НАД+ на фоне применения миелотоксического ксенобиотика доксорубицина in vitro и in vivo в реализацию механизмов запрограммированной клеточной смерти.

4. Изучить влияние ксенобиотика антрациклинового ряда на АТФ- и НАД-зависимые процессы регуляции пролиферации и апоптоза клеток костного мозга. Оценить угнетающий эффект доксорубицина на различные ростки кроветворения.

5. Оценить уровень экспрессии молекул межклеточной коммуникации (пуринергического рецептора Р2Х7, С038/НАД+-гликогидролазы, коннексина 43) в клетках костного мозга мышей в физиологических условиях, а также при действии миелотоксического ксенобиотика доксорубицина in vivo.

6. Изучить особенности регуляции функциональной активности клеток костного мозга эндогенными регуляторами гемопоэза АТФ и НАД в норме и в условиях окислительного стресса.

7. Установить вклад НАД-зависимых механизмов в миелотоксический эффект ксенобиотика и возможность его патогенетической коррекции субстратными ингибиторами ферментов трансформации никотинамидадениндинуклеотида.

Научная новизна.

Установлено, что одним из значимых клеточных механизмов токсического действия ксенобиотика антрациклинового ряда в клетках костномозгового происхождения является индукция дизрегуляторных процессов в механизмах межклеточной коммуникации и интеграции.

Впервые установлена роль нарушения Р2Х7-ассоциированных сигнальных механизмов в реализации действия миелотоксических ксенобиотиков и изучены некоторые механизмы пуринергической дизрегуляции.

Доказано, что клеточные механизмы миелотоксического действия доксорубицина ассоциированы с нарушением экспрессии и функциональной

активности НАД+-гликогидролазы/С038. Изучена роль НАД+-гликогидролазы/СВ38 в регуляции метаболизма НАД+ в гемопоэтических клетках в условиях окислительного стресса.

Впервые обнаружено, что нарушение экспрессии и функциональной активности коннексина 43 является одним из механизмов цитотоксического эффекта доксорубицина.

Исследованы механизмы паракринной и аутокринной регуляции функциональной активности клеток в костном мозге аденозинтрифосфатом и никотинамидадениндинуклеотидом. Изучены закономерности изменения степени чувствительности клеток костного мозга к присутствующим во внеклеточном пространстве естественным метаболитам при действии ксенобиотика антрациклинового ряда.

Приоритетное значение имеют данные о том, что нарушение гомеостаза АТФ и НАД при действии ксенобиотика антрациклинового ряда (доксорубицина) модифицирует процессы межклеточных взаимодействий и регуляторную активность сигнальных молекул.

Выявлено, что поддержание гомеостаза НАД+ в клетках костного мозга является условием нормальной межклеточной коммуникации и внутриклеточной сигнализации. Экспериментально доказано, что применение субстратных ингибиторов НАД-конвертирующих ферментов позволяет эффективно блокировать вызванное ксенобиотиком истощение клеточного пула НАД+ и связанное с этим изменение пролиферативной активности клеток и программы клеточной смерти в гемопоэтических клетках.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Данная работа является фрагментом тем «Биохимия и патобиохимия апоптоза», «Исследование гомеостаза при экстремальных воздействиях: механизм, пути коррекции при нарушениях» (номер государственной регистрации 01970007696) и «Структурно-функциональные основы гомеостаза животных при экстремальных состояниях», выполняющихся на базе кафедры биохимии с курсом медицинской химии ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» с 2002 г., Международного научного центра исследований экстремального состояния организма при Президиуме Красноярского научного центра СО РАН с 1995 г. и на кафедре анатомии и физиологии сельскохозяйственных животных ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» с 1998 г., соответственно.

Научно-теоретическое значение работы заключается в том, что в ней исследованы новые клеточные механизмы миелотоксического действия ксенобиотика антрациклинового ряда с позиции нарушения регуляторной

функции АТФ и НАД+ и межклеточной коммуникации в гемопоэтических клетках, следствием чего является изменение чувствительности клеток к действию эндогенных лигандов.

Патогенетически обоснован способ коррекции миелотоксического действия доксорубицина никотинамидом - субстратным ингибитором ферментов каталитической деградации НАД+, обеспечивающий нормализацию клеточного пула НАД+ и связанное с этим восстановление процессов пролиферации и естественной гибели гемопоэтических клеток, что может являться основой для разработки новой терапевтической стратегии в лечении нарушений гемопоэза.

Постулируется нарушение в условиях окислительного стресса регуляторного влияния естественных метаболитов на клеточные функции, что подразумевает возможность его коррекции путем направленной модуляции рецептор-активируемых механизмов межклеточной коммуникации, представляющей собой мощный современный инструмент для создания новых высокоэффективных лекарственных препаратов, строго избирательно воздействующих на определенные биологические мишени и обладающих как агонистическим или антагонистическим, так и модуляторным действием.

Основной научно-технической задачей, решенной в ходе выполнения работы, явилось формирование современных представлений о роли дизрегуляции межклеточных взаимодействий и возможности се коррекции при цитотоксическом действии ксенобиотика антрациклинового ряда.

В рамках работы оформлена заявка на патент «Способ диагностики системного воспалительного ответа организма при критических состояниях» (2007 г.) (Регистрационный № 2007109001).

Результаты диссертационного исследования внедрены в научно-исследовательскую работу ООО «Лаборатория иммунохимических методов исследования» (г. Красноярск), НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», Международного научного центра исследований экстремальных состояний организма при Президиуме Красноярского научного центра СО РАН и учебный процесс кафедры анатомии и физиологии сельскохозяйственных животных ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет», кафедры биохимии ГОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», кафедры фундаментальной и клинической биохимии с курсом лабораторной диагностики ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», кафедры фармакологии с курсами клинической фармакологии,

фармацевтической технологии и последипломного образования ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на VII Всероссийском симпозиуме «Коррекция гомеостаза», Красноярск, 1996 г.; VIII Всероссийском симпозиуме (с международным участием) «Гомеостаз и окружающая среда», Красноярск, 1997 г.; 3-ем съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока, Новосибирск, 1997 г.; научной конференции профессорско-преподавательского состава КрасГАУ «Технологии неистощительного землепользования», Красноярск, 1997 г.; IX Международном Симпозиуме Российско-Японского медицинского обмена, Канадзава (Япония), 2001 г.; городской научно-практической конференции, посвященной 40-летию Центральной научно-исследовательской лаборатории СГМУ «Современные аспекты биологии и медицины», Томск, 2002 г.; XI Международном симпозиуме «Гомеостаз и экстремальные состояния организма», Красноярск,

2003 г.; межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии», Санкт-Петербург, 2003 г.; X Российско-Японском международном медицинском симпозиуме «Якутия - 2003», Якутск, 2003 г.; XI Международном Симпозиуме Российско-Японского медицинского обмена, Ниигата (Япония), 2004 г.; XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова, Екатеринбург, 2004 г.; X Юбилейной межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии», Санкт-Петербург,

2004 г.; Всероссийской конференции молодых ученых, Красноярск, 2004 г.; XI межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии», Санкт-Петербург, 2005 г.; V Сибирском физиологическом съезде, Томск, 2005 г.; XII Симпозиуме Российско-Японского медицинского обмена, Красноярск, 2005 г; научных семинарах Межкафедральной биохимической научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (2004-2007 гг.); заседаниях кафедры анатомии и физиологии сельскохозяйственных животных ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» (1998-2007 гг.).

Положения, выносимые на защиту:

1. Одним из значимых механизмов миелотоксического действия ксенобиотиков антрациклннового ряда является индукция дизрегуляторных процессов в системе межклеточной коммуникации и интеграции, проявляющаяся изменением экспрессии молекул межклеточной коммуникации (пуринергических рецепторов Р2Х7, НАД+-гликогидролазы/С038 и коннексина 43) и сопровождающаяся нарушением

мембран-цитоскелетных взаимодействий, пролиферативного и дифференцировочного статуса клеток костного мозга и их чувствительности к действию апоптогенных стимулов и эндогенных регуляторов гемопоэза.

2. Ксенобиотики антрациклинового ряда регулируют механизмы пролиферации и запрограммированной клеточной смерти (апоптоза) в клетках костномозгового происхождения за счет нарушения внутриклеточного гомеостаза НАД+ и пуринергической регуляции гемопоэза.

3. АТФ и НАД+, присутствуя во внеклеточном пространстве при действии миелотоксического ксенобиотика доксорубицина, модулируют процессы паракринной и аутокриннои регуляции функциональной активности клеток костного мозга.

4. Патогенетическая коррекция миелотоксического эффекта ксенобиотиков антрациклинового ряда эффективно достигается применением субстратных ингибиторов ферментов каталитической конверсии никотинамидаденнндинуклеотида.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работ, из них 12 - в центральной печати (в реферируемых ВАК журналах), 2 - в международной печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 245 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, иллюстрирована 13 таблицами и 39 рисунками. Библиографический указатель включает 462 литературных источника, в том числе 86 отечественных и 376 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на 510 белых беспородных мышах-самцах (Рис. 1). Культивирование клеток костного мозга in vitro в концентрации 1х10б клеток в 1 мл проводилось в термостате при +37°С в питательной среде (а-МЕМ («Gibco», Великобритания), среде 199 с L-глутамином («Вектор», Россия), растворе Хенкса («Вектор», Россия), сбалансированном фосфатном буфере (Sigma, США) в течение 1 ч с последующей регистрацией эффектов ксенобиотика, а также модуляторов острой и подострой экзогенной интоксикации in vitro и in vivo методами диффузионных камер, спектрофотометрическими, биолюминесцентными, микроскопическими и иммуноцитохимическими методами.

Рис. 1. Общая структура исследований

Изучение токсического влияния доксорубицина гидрохлорида (далее по тексту - доксорубицин, ДОК) («Ферейн», Россия) на клетки костного мозга in vitro производилось при совместной инкубации суспензии клеток костного мозга с ксенобиотиком (5х10"7 - 10~б - 5x1o"6 М) в течение 60 минут при +37°С, а также в условиях его предварительной инкубации (15 минут) в присутствии экзогенного корректора никотинамида в концентрации 1 мМ и последующем культивировании (5 суток) в диффузионных камерах в перитонеальной полости животных-реципиентов и эндогенных регуляторов АТФ и НАД.

Исследование влияния доксорубицина на клетки костного мозга in vivo проводилось при остром однократном введении мышам в максимально переносимой дозе (МПД - б мг/кг) внутрибрюшинно в физиологическом растворе, а также подостром внутрибрюшинном введении в дозе 1/10 LD50 (0,95 мг/кг) в течение 10 дней с интервалом 24 ч.

Исследование влияния АТФ и НАД на костномозговые клетки in vitro проводилось при совместной инкубации суспензии клеток с АТФ (Reanal, Венгрия) и НАД (Reanal, Венгрия) в концентрациях 0,1, 1, 10 мМ и 1 мМ, соответственно, в течение 1 ч при +37°С, а также на фоне применения доксорубицина in vitro в дозе 10~б М, который добавляли в среду

и

культивирования костномозговых клеток на 15 минуте инкубации, или in vivo при остром однократном введении мышам в МПД (6 мг/кг) внутрибрюшинно в физиологическом растворе, а также подостром введении в дозе 1/10 LD50 (0,95 мг/кг) в течение 10 дней с интервалом 24 ч.

Предиикубация клеток с никотинамидом (Мосхимфармпрепараты, Россия) в концентрации 1 мМ проводилась в течение 15 минут с последующим добавлением в среду НАД и совместным инкубированием клеток в течение 1 ч.

Предиикубация клеток с блокаторами пуринергических рецепторов PPADS (пиридоксальфосфат-6-азофенил-2',4'-дисульфоновая кислота) (Sigma, США) в концентрации 100 мкМ и сурамииом (Sigma, США) в концентрации 100 мкМ проводилась в течение 15 минут с последующим добавлением в среду АТФ или доксорубицина и совместным инкубированием клеток в течение 1 ч.

Для исследования пролифератнвиого статуса клеток костного мозга методом диффузионных камер in vivo клетки получали путем вымывания питательной средой (80% среды а-МЕМ («Gibco», Великобритания), 20% лошадиной сыворотки, 100 мг/л ампициллина) из 2 бедренных костей мыши-донора. Клетки в концентрации 1х106/мл добавляли в питательную среду и заполняли ею диффузионные камеры (по 0,1 мл на камеру). Диаметр пор фильтра камер 0,22 мкм. Камеры имплантировали в перитонеальную полость мышей-реципиентов (по 2 камеры на животное) хирургическим путем под гексеналовым наркозом. Через 5 дней культивирования мышей выводили из эксперимента методом дислокации спинного мозга в шейном отделе, камеры извлекали, фильтры окрашивали гематоксилин-эозином. Методом световой микроскопии подсчитывали число образовавшихся колоний (скопления из 50 и более клеток) и кластеров (скопления менее 50 клеток) (х 400).

Определение продуктов перекисного окисления лнпидов (ПОЛ) в суспензии клеток костного мозга проводили путем измерения содержания малонового диальдегида (МДА) в реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) по стандартной методике, включающей в себя инкубацию с ТБК исследуемой пробы, экстракцию продуктов реакции бутанолом и спектрофотометрическое измерение их содержания.

Определение концентрации АТФ в клетках костного мозга и внеклеточном пространстве проводили с помощью биолюминометра 8802 (СКТБ «Наука», Россия) по методу Угаровой H.H. (1981).

Определение концентрации НАД4" в клетках костного мозга и внеклеточном пространстве проводили спектрофотометрически с использованием алкогольдегидрогеназы по методу Асатиани B.C. (1969).

Оценка цитотокснчностн доксорубицина в МТТ-тесте проводилась с использованием тетразольной соли МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-

дифенилтетразолия бромид) (Sigma, США) в дозе 5 мг/мл, которую добавляли по 50 мкл в каждую пробу. Клетки костного мозга инкубировали с МТТ в течение 1,5 ч при +37°С. В конце инкубационного периода кристаллы формазана растворяли путем добавления 500 мкл 0,1 н HCl-изопропанола. Оптическую плотность исследуемых проб определяли на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 570 нм, фоновую плотность - при длине волны 640 нм, и по разности двух измерений находили искомую величину.

Изучение процессов апоптоза клеток, культивируемых в диффузионных камерах, проводилось методом световой микроскопии. Под иммерсией (х 900) анализировалось по 200 клеток на каждом фильтре, окрашенном гематоксилин-эозином. При этом морфологическими признаками апоптоза считали наличие «карликовых» клеток, кариопикноз, кариорексис, наличие апоптотических телец.

Исследование миелограммы по мазкам костного мозга проводилось методом световой микроскопии. Под иммерсией (х 900) анализировалось по 500 клеток на каждом препарате, окрашенном по Папенгейму. При выведении миелограммы выделяли следующие клеточные формы: недифференцированные бласты, промиелоциты, миелоциты, юные нейтрофилы, палочкоядерные нейтрофилы, сегментоядерные нейтрофилы, эозинофилы, моноциты, лимфоциты, плазматические клетки, эритробласты, пронормобласты, нормобласты базофильные, нормобласты полихроматофильные, нормобласты оксифильные, мегалобласты, мегакариоциты. По полученным данным рассчитывали лейкоэритробластическое соотношение и индекс созревания эритробластов.

Детекция апоптоза и некроза в препаратах клеток костного мозга

проводилась по оценке экспрессии фосфатидилсерина на наружной стороне цитоплазматической мембраны путем регистрации связывания ФИТЦ-меченого аннексина V и проницаемости мембран для пропидия йодида (Annexin V Apoptosis Detection Kit, Caltag Laboratories, США), соответственно, согласно протоколу фирмы-производителя и последующей флуоресцентной микроскопии. Под иммерсией (х 900) анализировали по 200 клеток на каждом стекле. Определяли относительное количество клеток 4 популяций: жизнеспособные (неокрашенные ни аннексином V, ни пропидия йодидом), находящиеся на ранней стадии апоптоза (положительные по аннексину V при отсутствии окрашивания ядра пропидия йодидом и дающие зеленое свечение), находящиеся в состоянии вторичного некроза (положительные и по аннексину V и по пропидия йодиду и дающие зелено-красное свечение) и собственно некротические клетки (положительные только по пропидия йодиду и дающие красное свечение).

Регистрация блеббинга плазматической мембраны клеток костного мозга осуществлялась методом фазово-контрастной микроскопии при инкубации клеток в течение 60 мин при +37°С. Под иммерсией (х 900) анализировалось по 200 клеток в каждом препарате, приготовленном через 5, 15, 30, 45 и 60 минут инкубации клеток костного мозга (1х106/мл) в среде 199. По морфологии цитоплазматической мембраны дифференцировали следующие виды клеток костного мозга: интактные клетки (морфологически неизмененные клетки, имеющие четкую, контрастирующуюся светло-желтым ободком плазматическую мембрану); клетки в состоянии начального блеббинга (образование небольших пузырей на поверхности мембраны); клетки в состоянии терминального блеббинга (образование крупных, 'Л и более от диаметра клетки пузырей); некротические клетки (в 1,5-2 раза крупнее интактных клеток, отсутствует свечение в виде светло-желтого ободка по периметру клетки, имеют неровную мембрану).

Оценка экспрессии CD38 на клетках костного мозга проводилась с помощью прямого метода иммунофлуоресцентного анализа с использованием Р-фикоэритрин-меченых моноклональных антител к CD38 (Caltag Laboratories, США) по стандартной методике. Под иммерсией (х 900) подсчитывали относительное количество клеток, несущих флуоресцентную метку на 200 клеток. CD38+ клетки костного мозга, дающие желто-оранжевое свечение по периметру клетки, определяли по наличию иммунопозитивного материала.

Оценка экспрессии Р2Х7 на клетках костного мозга проводилась с помощью двойного непрямого метода иммунофлуоресцентного анализа с использованием моноклональных антител к рецептору Р2Х7 (Sigma, США) по стандартной методике. Под иммерсией (х 900) подсчитывали относительное количество клеток, несущих флуоресцентную метку на 200 клеток. Р2Х7+ клетки костного мозга, дающие зеленое свечение по периметру клетки, определяли по наличию участков связывания антител с Р2Х7, экспрессируемым на плазматической мембране клеток.

Оценка экспрессии коннекенна 43 (Сх43) на клетках костного мозга

проводилась с помощью двойного непрямого метода иммунофлуоресцентного анализа с использованием моноклональных антител к Сх43 (Chemicon International, США). Под иммерсией (х 900) подсчитывали относительное количество клеток, несущих флуоресцентную метку на 200 клеток. Сх43+ клетки костного мозга, дающие зеленое свечение по периметру клетки, определяли по наличию участков связывания антител с Сх43, экспрессируемым на плазматической мембране клеток.

Статистическую обработку результатов проводили методами математической статистики с применением пакетов прикладных программ

«Биостатистика для Windows, версия 4.03» и «Microsoft Excel 2002». Для каждого исследуемого признака определяли показатели среднего арифметического (М) и стандартной ошибки среднего арифметического (ш). Нормальность распределения проверяли с использованием теста Колмогорова-Смирнова. При условии соответствия нормальности распределения достоверность полученных различий сопоставляемых величин оценивали с использованием /-критерия Стыодента. Сопряженность между признаками устанавливали путем проведения корреляционного анализа с вычислением коэффициента корреляции (г) Пирсона. Различия считались достоверными при уровне значимости, равном либо менее 5% (Р<0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Ксенобиотики антрациклинового ряда занимают одно из ведущих мест в арсенале современных лекарственных средств, используемых при лечении злокачественных новообразований различных локализаций и прежде всего при химиотерапии опухолей кроветворного аппарата. Одним из типичных представителей группы антрациклиновых антибиотиков, относящимся к числу наиболее эффективных и перспективных цитостатических средств, является доксорубицин (адриамицин). Накопленные к настоящему времени сведения о клеточных «мишенях» действия доксорубицина позволяют предположить высокую значимость механизмов окислительного стресса в повреждении клеток этим ксенобиотиком, а моделирование окислительного стресса представляет собой экспериментальный подход к изучению клеточных механизмов его токсического действия.

В экспериментах in vitro нами установлено, что при внесении доксорубицина в концентрациях 5x10"7 М, 10"6 М, 5x10"6 М в костномозговую суспензию in vitro происходило дозо-зависимое увеличение продукции МДА, свидетельствующее об интенсификации процессов ПОЛ мембран клеток костного мозга, что позволяет отнести данный ксенобиотик к группе индукторов окислительного стресса. Введение ксенобиотика in vivo также приводило к нарастанию концентрации МДА в клетках костного мозга к 24 часу до 12,92 ± 0,56 мкмоль/л (Р<0,001), с последующим снижением до 8,24 ± 1,11 мкмоль/л после 2 суток введения и 4,97 ± 0,94 мкмоль/л (Р<0,02) после 10 суток введения доксорубицина.

Одним из обязательных компонентов патогенеза окислительного стресса является изменение количественных и качественных параметров пула внутриклеточных пиридиновых нуклеотидов в результате их окисления и гидролиза и нарушение АТФ-синтетических процессов в клетке. Действительно, в экспериментах, выполненных нами с использованием биолюминесцентного и спектрофотометрического методов определения

внутри- и внеклеточного содержания АТФ и НАД , установлено, что острое и подострос введение доксорубицина мышам in vivo и инкубация клеток костного мозгасдоксорубинином в концентрации Ю^Ми vitro приводили к изменению внутри- и внеклеточного содержания АТФ и НАД" в клетках костного мозга.

Так, через 24 ч и 48 ч после острого введения ксенобиотика концентрация АТФ внутри клеток достоверно уменьшилась. Однако к 10 суткам подострого воздействия доксорубицина уровень внутриклеточной и внеклеточной АТФ в костном мозге достоверно увеличился (Рис. 2).

Q Е|[)триклсточИйс яадержвнне внеклеточное содержит

□ впутрнклеточию Содфнвне É3 ьн М£Л ст iriH'Ji1 содержат it_|

Китпроль ДОК, Яч ДОК,4*4 AUK, [О

KqitrtBML ДОК.)0-6 М ДОК.Ыч Д(Ж,4Нч ДОК, 19

Л К

Рис, 2, Концентрация АТФ (А) и НАД (В) в клетках костного мозга и во внеклеточном пространстве при остром и нодостром введении доксорубицнпа (ДОК) in vivo и инкубации клеток с доксорубицнном

(Ш* М) in vitro

Примечание. Здесь и далее: Р - уровень значимости; достоверность отличий но сравнению с контролем: ' Р<0,05; " Р<0,02; P<0.0h "" Р<0,001.

Воздействие ксенобиотика на клетки костного мозга in vitro и in vivo сопровождалось также нарушением количественных параметров пула НАД+: через 24 ч и 4íj ч после острого введения доксорубицина уровень НЛД+ внутри клеток достоверно не изменился, тогда как во внеклеточной жидкости его концентрация повысилась по сравнению с исходным значением. Аналогичная ситуация наблюдалась при предварительной инкубации клеток костного мозга С доксорубишшом в дозе 10'4 М т vitro. К 10 суткам подострого воздействия доксорубицина in vivo уровень внутриклеточного и внеклеточного 11АД" в костном мозге достоверно увеличился (Рис. 2).

Мы считаем, что нарушение гомеостаза АТФ и ПАД при действии ксенобиотика антрациклинового ряда значимо модифицирует процессы межклеточных взаимодействий и регуляторную активность сигнальных молекул за счет изменения их экспрессии, чти вызывает нарушение процессов передачи информации н клетке или запрограммированной клеточной гибели.

Нами впервые обнаружено, что доксорубицин изменяет экспрессию Р2Х? и клетках костного мозга. Воздействие ксенобиотика ¡n vivo ч течение 1 суток значительно снижало коли част пи Р?.Х7 клеток костного мозга. Однако к 10 суткам введения их количество практически вернулось к контрольным значениям (Рис. 3). г>го соответствовало уменьшению уровня внутриклеточной ЛТФ при остром курсе введения доксорубицина и его увеличению при под остром курсе введения ксенобиотика, соответственно.

Контроль ДОК, 24 ч ДОК, 10¡B«fi

Рис, 3. Особенности экспрессии Р2Х7, CD38 ti Сх43 в клетках костного мод га в норме и при остром и подострим введении доксорубицина (ДОК) /и vivo

Выявленная нами альтерация уровня пиридиновых нуклеотидов (НАД"), вызванная дейстанем индуктора окислительного стресса, может быть связана с активацией НАД -гликогидролаз, принимающих участие в передаче сигналов и некоторых метаболических проводящих путях. В связи с этим интересным представлялось изучение особенностей экспрессии CD38 (как одного из типичных представителей класса НАД+-гликогидролаз, использующих НАД4) в клетках костного мозга мышей при действии м и елото кеи ■ ¡ ее ко го ксенобиотика доксорубицина in vivo.

Нами впервые установлено, что клеточные механизмы миелотоксического действия доксорубицина ассоциированы с нарушением экспрессии и функциональной активности НАД~-гликог'идролазы/С038. Продемонстрировано, что острое и подострое воздействие ксенобиотика приводило к снижению экспрессии CD38 в клетках костного мозга мышей, сопровождающемуся уменьшением его суммарной ферментативной активности (Рис. 3). Понижение количества СШо клеток соответствовало увеличению уровни внутри- w внеклеточного НАД+. Кроме того, вероятна и обратная связь: избыток субстрата (НАД) приводил к уменьшению экспрессии CD38. Следовательно, нарушение экспрессии CD3ÍÍ характеризуется значимыми изменениями метаболизма НАД в гемопоэтических клетках (Рис. 4).

Рис. 4. Схема нарушения метаболизма НАД1" в гемопоэтическнх клетках под действием доксорубицина

Обозначения. Здесь и далее: серым цветом указаны собственные оригинальные результаты.

Коль скоро доказано, что АТФ и НАД+, действуя через пуринергические рецепторы, локализованные на плазматической мембране и обладающие функциональной активностью для обоих эндогенных регуляторов, и НАД+-гликогидролазу/С038, высвобождаются во внеклеточную среду посредством щелевых контактов, сформированных коннексинами и выполняющих аутокрннную и паракринную регуляцию клеточной активности, следующим этапом наших исследований явилась оценка степени экспрессии коннексина 43 (Сх43), как основного коннексина кроветворной ткани, в клетках костного мозга мышей при действии миелотоксического ксенобиотика доксорубицина /л vivo.

Нами установлено, что острое введение ксенобиотика in vivo увеличивало экспрессию Сх43 в костном мозге. К 10 дшо подострого введения

доксорубицина in vivo степень экспрессии возвращалась к контрольным значениям (Рис. 3).

Таким образом, доксорубицин нарушает лнганд-рецепторные взаимодействия, призванные осуществлять сигнально-временную координацию важнейших тканевых процессов, что, в свою очередь, является причиной формирования внутрипопуляционных изменений количественного или качественного плана. Последствия изменения лиганд-рецепторных взаимодействий подразумевают как краткосрочные, так и долговременные перестройки клеточного метаболизма и нарушения регуляции пролиферативного или дифференцировочного статуса клетки, как, впрочем, и клеточной смерти.

Известно, что основными механизмами поражения костного мозга, возникающего при действии цитостатиков, являются миелосупрессия в результате глубокого подавления пролиферативной деятельности костного мозга, связанного, в свою очередь, с гибелью значительной части пролиферирующих клеток и блокированием митотического цикла гемопоэтических элементов, а также свободнорадикальные механизмы, приводящие к индукции окислительного стресса, повреждению липидов и белков мембран и цитоскелета.

Действительно, нами установлено, что угнетающему эффекту доксорубицина подверглись как эритроидный (индукция пролиферации мегалобластов), так и миелоидный (увеличение количества миелоцитов) ростки гемопоэза при отсутствии изменений со стороны тромбоцитарного ростка. Выявленное нами отчетливое повышение числа мегалобластов как при остром, так и подостром введении ксенобиотика отражает развитие анемии, о чем свидетельствует также уменьшение индекса созревания эритробластов, являющегося критерием нарушения созревания нормобластов. Причем процент мегалобластов при однократном воздействии доксорубицина в МПД был выше, чем после 10-ти дневного курса введения ксенобиотика, что соответствует литературным данным о том, что ингибирующий эффект антибиотиков-антрациклинов на кроветворение более отчетливо проявляется при их однократном введении в массивных (LD50, МПД) дозах, чем при курсовом введении в терапевтических дозах.

Миелоингибирующий эффект доксорубицина проявлялся в виде повышенной гибели костномозговых элементов. В экспериментах, выполненных нами с использованием техники культивирования клеток костного мозга мышей в диффузионных камерах в перитонеалыюй полости мышей-реципиентов, установлено, что доксорубицин в концентрациях 5x10"7, 10"6, 5x10'6 М в дозо-зависимой манере эффективно подавлял колоние- и кластерообразующую способность клеток костного мозга при совместной

инкубации с ним в предимплантационный период (Табл. 1). При этом ксенобиотик в равной степени ингибировал образование как колоний, так и кластеров, что подтверждает неспецифический характер цитотоксичности последнего в отношении клеток, находящихся на разных стадиях диффереицировки.

Таблица 1. Влияние прединкубацнн клеток костного мозга с доксорубицином (ДОК) на колонне- (КОС) и кластерообразующую (КлОС) способность н процессы запрограммированной клеточной смерти при культивировании в диффузионных камерах

Серия КОС КлОС Апоптоз, %

Контроль 16,08 + 2,67 121,38 ± 13,46 2,19 ±0,33

ДОК, 5x10"7 М 15,0 ±3,83 107,25 ± 10,88 5,83 ± 0,95**"

ДОК, 10"6 М 7,44+1,15*" 68,69 ±5,15"*' 4,14 ±0,30""

ДОК, 5x1o-6 М 6,33 ± 1,38"" 56,25 ±5,91"" 3,25 ± 0,43*"'

Обозначения. Здесь и далее КОС и КлОС представлены как абсолютное количество колоний и кластеров, соответственно, на 10 имплантированных клеток. Примечание, п (объем выборки) в разных сериях от 5 до 16.

Таким образом, обнаруженное нами гемопоэзповреждающее действие доксорубицина, сопровождающееся внутрипопуляционными изменениями в костном мозге, происходит на фоне нарушения экспрессии молекул межклеточной коммуникации, что, в конечном итоге, отражается на развитии неэффективного гемопоэза как болезни дизрегуляции в механизме регуляции клеточной пролиферации и диффереицировки (Рис. 5).

Механизмы поражения клеток костного мозга в условиях применения цитостатиков связаны, помимо нарушения пролиферативного статуса, с индукцией окислительного стресса. Признавая ключевую роль нарушения работы дыхательной цепи митохондрий в цитотоксическом действии доксорубицина, мы оценили выраженность окислительного стресса в клетках костного мозга при внесении в среду инкубации АТФ или НАД+ на фоне введения доксорубицина in vitro и in vivo.

АТФ при внесении в инкубационную среду не влияла на продукцию МДА интактными клетками, проявляя при этом дозо-зависивый эффект. Однако она тормозила этот процесс в клетках костного мозга, подвергнутых действию доксорубицина в течение 24 часов in vivo, и потенцировала его в клетках, выделенных от животных после 10-дневного введения ксенобиотика (Рис. 6). Выраженность окислительного стресса в клетках костного мозга соответствовала направленности изменений концентрации внутриклеточной АТФ: снижение концентрации АТФ после острого введения доксорубицина и ее повышение в результате подострого введения ксенобиотика согласуется со

Рис. 5. Схема нарушения экспрессии молекул межклеточной коммуникации в развитии неэффективного гемопоэза

способностью АТФ подавлять и стимулировать продукцию реактивного кислорода, соответственно, при действии на гемопоэтические клетки.

Совместная инкубация клеток костного мозга с доксорубицином и АТФ ш vitro либо не оказывала влияния на индукцию процессов ПОЛ (при первоначальном воздействии на клетки ксенобиотика), либо снижала продукцию МДА в среде инкубации по сравнению с изолированным действием АТФ или цитостатика (при первоначальном воздействии на клетки эндогенного регулятора) (Рис. 6).

Таким образом, АТФ, присутствуя во внеклеточном пространстве, оказывает модулирующее влияние на процессы ПОЛ в гемопоэтических клетках в состоянии окислительного стресса.

При оценке выраженности окислительного стресса в клетках костного мозга при воздействии НАД+ нами обнаружено, что он вызывал значительное усиление продукции свободных радикалов. Внесение в среду инкубации НАД+ на фоне острого введения доксорубицина in vivo и инкубации клеток с ксенобиотиком in vitro приводило к подавлению процессов перекисного окисления липидов мембран клеток костного мозга, что может быть связано с нарушением окислительно-восстановительного потенциала пула НАД+ в условиях окислительного стресса. Однако подострое применение доксорубицина в течение 10 дней не влияло на степень выраженности ПОЛ, вызванного НАД+ (Рис. 6).

МКМОЛИ/л мкмель/л

Г д

Рис. 6. Влияние ЛТФ (Л, Б) и НАД+ (В, Г) на доксорубицин-индуцируемое перскисное окисление липидов в клетках костного мозга при его остром и подостром введении in vivo ti инкубации клеток с доксорубицнном (ДОК, 10"* М) in vitro

Примечание. Здесь и на рис. 8-. достоверность отлитой па сравнению с изолированным действием АТФ/НАД: * Р<0,05; ** F<0,02;т Р<0,01,#es* Р<0,001.

Модулирующее влияние НАД" на продукцию свободных радикалов при действии ксенобиотика - индуктора окислительного стресса можег быть связано с активностью НАД'-утилизирующих ферментов, в том числе НАД-гл и ко г идро л азы/С Ш 8.

На рис. 7 представлена патогенетическая схема развития неэффективного гемопоэза при действии ксенобиотиков антрациклнпового ряла.

Хорошо известно, что состояние окислительного стресса сопровождается снижением концентрации в клетке НАД(Ф)Н и изменением соотношения восстановленной и окисленной форм ни котикам и дных ко ферментов. Инкубация клСпок костного мозга с доксорубицином вызывала снижение параметров М'П'-теста, являющегося индикатором уровня НАД(Ф)Н в клетке и сохранности функции митохондрий. Инкубация с НАД* приводила к достоверному увеличению показателей МТТ-теста по сравнению с контролем,

Модуляция активности рецептор* эффективных сцггеи

Днзрсгулицпя межклеточной коммуникации

11

Неэффективный гемопоэз

Рис. 7. Патогенетическая схема развития неэффективного гемошша при действии ксенобиотиков антрацнклишвого ряда

и снижала токсичность доксорубицнна, Протектитгое действие внеклеточного НАД1 в отношений ну к леотид-деп легирующей активности доксорубицтш подтверждав! возможность транспорта НАД в клетки, опосредованное активностью мембранных моно-АДФР-трансфераз или НАД -гликогидролаз. а также свидетельствует о нормализации процессов генерации восстановленных коферментов и/или митохондриалышй функции в клетках.

Принимая но внимание данные о тесной взаимосвязи патогенеза окислитель но 10 стресса с феноменом запросам миро ванной клеточной смерти (апоптоза), представлялось интересным изучение роля нарушений межклеточных взаимодействий п условиях окислительного стресса и связанного с этим изменения чувствительности гемопоэтических клеток к действию эндогенных регуляторов в необратимом повреждении клеток и их гибели.

При подсчете относительного количества гемопштичсских клеток с морфологическими признаками апоптоза (при культивировании их в диффузионных камерах) было выявлено, что апоптогенный эффект доксорубицина зависит от используемой дозы ксенобиотика: чем меньшая концентрация препарата применялась в экспериментах, тем вероятнее была

гибель клеток по механизму апоптоза (Табл. 1). При этом степень подавления пролиферации клеток также зависела от дозы доксорубицина. Следовательно, нами установлен факт наличия дозовой зависимости в характере цитоповреждающего действия ксенобиотика антрациклинового ряда в клетках костного мозга.

Одним из современных методов оценки ранних стадий апоптоза и некроза является обнаружение экспрессии фосфатидилсерина на наружной стороне цитоплазматической мембраны и проницаемости мембран для пропидия йодида, соответственно.

Инкубация клеток костного мозга с доксорубицином в концентрации 10"6 М in vitro приводила к возрастанию числа клеток в состоянии апоптоза, а также индукции некроза с одновременным сокращением популяции жизнеспособных клеток. Острое введение доксорубицина мышам in vivo не оказывало апоптоз-индуцирующего эффекта, однако в клетках, подвергнутых 10-дневому воздействию ксенобиотика, нами было обнаружено увеличение количества клеток, находящихся на ранней стадии апоптоза (клетки с экстернализированным фосфатидилсерином), и, соответственно, уменьшение количества жизнеспособных клеток. При этом доксорубицин в обоих случаях не проявлял некрозогенную активность.

Предполагается, что уровень АТФ является важным фактором внутриклеточной регуляции процессов апоптоза и некроза, а также определяет чувствительность клеток к действию индукторов апоптоза. В связи с этим мы исследовали экстернализацию фофатидилсерина под влиянием АТФ в клетках костного мозга, подвергнутых острому и подострому действию доксорубицина.

При инкубации клеток костного мозга in vitro в течение 1 часа с АТФ в концентрации 1 мМ нами было обнаружено увеличение количества клеток, находящихся на ранней стадии апоптоза и в состоянии некроза, и, соответственно, уменьшение количества жизнеспособных клеток (Рис. 8).

Предварительная инкубация клеток костного мозга с доксорубицином в концентрации 10"6 М in vitro значительно изменяла чувствительность клеток костного мозга к действию АТФ. Добавление ксенобиотика отменяло апоптоз-индуцирующее действие АТФ и усиливало некрозогенный эффект АТФ (Рис. 8).

Однократное и 10-дневное введение доксорубицина in vivo также модулировало процессы апоптоза и некроза под действием АТФ. Воздействие доксорубицина в течение 24 часов уменьшало апоптогенную активность АТФ, а 10-дневный курс введения ксенобиотика тормозил индукцию некроза под действием АТФ. Однако количество клеток с экстернализированным фосфатидилсерином при подострой затравке ксенобиотиком возрастало по сравнению с острой. При этом относительное количество жизнеспособных

клеток в популяции в обоих случаях возвращалось к контрольным значениям, что свидетельствует об отсутствии эффекта индукции альтернативного механизма клеточной гибели при невозможности реализовать программу алоптоза (Рис. 8).

□ жиные Ститлюз АвтирвчкыНнекроз G |: г т|: о;

50 4Л 10 10 tí 8

Ко^тро.ть АТФ. 1 мМ ДОК.ЮЛМ т

ЛТФ

□ живые tí но птоз ■ вторивший некроз ^некроз

1^.1 три п.. ЛТФ. 1 мМ ДОК, 24 ч + ДОК. ЮдекП-т-ЛТФ ЛТФ

%

В I! Т' |Г,|Ч н кекроз '-i ИГ К |:-Т 1

А

□ жньме Л * -|Т!' (!В н итричный кекроз И некроз

rí- •-Т-. _i

— —i

^Йи. ess

Kntnjm.n. НАЛ I жМ ДОК,1(1-£М +

НАД

В

rSn

- - -ф-] —

щ

ж

KoKipruih КЛД1 кМ ДОК. 24 ч +■ ДОК. Юлией НАД + НАД

Г

Рис. 8. Влияние доксорубицина (ДОК, инкубация клеток in vitro, острое и подо строе ьнеденне in vivo) на апоптоз- и нскрщ-инду пирующее действие АТФ (1 мМ) (А, Б) и НАД" (1 мМ) (В, Г) в клетках костного мозга

Таким образом, отмена а! юптоз-индуцирующего действия АТФ под действием однократного введения доксорубицина сопровождалась снижением экспрессии Р2Хт в клетках костного мозга на фоне падения уровня внутриклеточного ЛТФ, что может служить доказательством снижения чувствительности гемо поэтических клеток к действию АТФ.

Иная ситуация наблюдалась при под остром введении доксорубицина: к 10 дню воздействия ксенобиотика отмечалась экстернализация фосфатаднлсерйна на фоне повышения уровня внеклеточной АТФ и восстановления экспрессии рецептора Р2Х7, что может свидетельствовать о восстановлении чувствительности клеток костного мозга к действию АТФ.

Следовательно, обоснованным представляется предположение о том, что апоптогенная и некрозогенная активность АТФ в костном мозге реализуегся через пуринергическне рецепторы Р2Х типа, в частности Р2Х7.

Действительно, при использовании нами сурамшш (антагонист P2Y рецепторов) не происходило модификации апоптогеяной или не&розогенной активности АТФ. Вместе с тем, предварительная инкубация клеток с PPADS (антагонист Р2Х рецепторов) отменяла апопто генной действие А ТФ. снижая процент хяеток, нахоляшихся на ранней стадии апгашна » г> состоянии вторичного некроза, но в то же время потенцировала нскрозогенную активность А ТФ.

Таким образом. АТФ, присутствуя но внеклеточном пространстве. индуцирует апоптоз в клетках костного мозга, действуя преимущественно через Р2Х подтип пуринерги чееких рецепторов. Oerpoe и подострое ьиеденис доксорубицина I» vivo и применение ксенобиотика in vitro снижает чувствительность клеток коечного мозга к ап о п гоген ному и некроз ore иному действию ЛТФ. Такой эффект доксорубицина имеет важное патофизиологическое значение, коль скоро может быть компонентом м йел ото кеичес кого действия ксенобиотика, связанным с нарушением механизмов пурин ерш чеекой регуляции активности гем он оптических клеток (Рис. 9).

| Дощ

С

Доксорубнцня

I

Моду линия якшнт oviUDoii vi HtKpoi-ai енкнй нктнвпостн АТФ через uypuiiepiичсские рецептор].!

Р2Х

Отмена япопггогеяного н гттенциронянне нскрозо генного действия АТФ

P2Y

Суряини

Отсутствие индукции аншггоза и нскрша под действием АТФ

Неэффективный гемощт

Рис. 9. Схема участия различных типов пуринергических рецепторов в индукции клеточной гибели под действием доксорубицина

Следовало ожидать, что экстерн адизаци я фосфатидилсерина под действием АТФ может сопровождаться нарушением мембранной асимметрии лйнидов, изменяющим физико-химические свойства мембраны и проявляющимся образованием на клеточной поверхности пузырено Лобных выпячиваний (блеббикг).

Мы обнаружили, что инкубация клеток костного мозга с АТФ в концентрациях 0,1; 1 и 10 мМ приводила к динамическим изменениям плазматической мембраны, проявляющимся образованием мелких пузыреподобных выпячиваний по периметру клетки (начальный блеббинг) и формированием более крупных пузырей (терминальный блеббинг). В физиологической концентрации 0,1 мМ АТФ индуцировала процессы начального блеббинга в первые минуты воздействия, что не сопровождалось значительным увеличением числа клеток с признаками терминального блеббинга, т.е. свидетельствовало об обратимости процесса. При увеличении концентрации до 1 мМ, которая соответствует реально существующей в межклеточном пространстве концентрации АТФ при ряде патологических состояний (цитолиз, воспаление), наибольшей интенсивности блеббинг достигал после 30 минут инкубации и также носил обратимый характер. В максимальной из тестируемых концентраций (10 мМ) АТФ оказывала выраженное цитотоксическое действие, проявляющееся развитием некроза.

Воздействие доксорубицина in vitro характеризовалось дозо-зависимым усилением процессов начального и терминального блеббинга плазматической мембраны клеток костного мозга к 30-45 минуте инкубации, в максимальной из использованных концентраций ксенобиотик индуцировал выраженный некроз клеток. Острое и подострое введение доксорубицина in vivo сопровождалось индукцией блеббинга и некроза с первых минут воздействия.

Совместная инкубация клеток костного мозга с доксорубицином и АТФ (1 мМ) in vitro либо не влияла на развитие блеббинга плазматической мембраны, индуцированного АТФ (при первоначальном воздействии на клетки ксенобиотика), либо потенцировала как процессы начального, так и терминального блеббинга по сравнению с изолированным действием АТФ (при первоначальном воздействии на клетки эндогенного регулятора). Развитие некроза под действием АТФ в первом случае усиливалось, а во втором -тормозилось (Табл. 2).

Введение доксорубицина in vivo в течение 1 и 10 суток значительно модулировало чувствительность клеток к АТФ, что выражалось в изменении динамики блеббинга. Так, индукция начального блеббинга проявлялась при аппликации АТФ на клетки костного мозга, выделенные от животных, подвергнутых действию доксорубицина в течение 1 суток, однако не наблюдалась при 10-дневном курсе введения ксенобиотика (Табл. 2). Эти изменения развивалось на фоне изменений продукции МДА и АТФ в клетках, что свидетельствует о нарушении биологических эффектов АТФ при окислительном стрессе и митохондриальной дисфункции.

Следовательно, восстановление чувствительности клеток костного мозга к действию АТФ, выявленное по экстернализации фосфатидилсерина, при

Таблица 2. Модуляция эффектов АТФ в клетках костного мозга при их инкубации с доксорубнцином (ДОК, 10"6 М) in vitro и при остром н подосгром введении доксорубицина (ДОК) in vivo (в % от общего количества клеток)

Серия Показатель Время инкубации, мин

5 15 30 45 60

Контроль Начальный блеббинг 1,50 + 0,0 1,50 + 1,06 6,33 + 0,82 1,88 ± 0,79 1,0 ± 0,47

Терминальный блеббинг 0,50 + 0,33 1,25 + 0,29 2,50 + 0,35 2,0 + 0,53 1,58 ± 0,43

Некроз 7,38 + 1,57 8,38 + 0,92 10,17 ± 1,14 10,25 ± 1,46 11,50 ± 1,55

АТФ, 1 мМ Начальный блеббинг 7,0 ± 0,53"** 7,80 ± 1,35" 12,38 ± 1,85* 10,33 ± 1,0"" 5,63 ± 0,72*"

Терминальный блеббинг 0,83 ± 0,27 1,08 ± 0,26 1,40 ± 0,27* 1,14 ± 0,10 1,20 + 0,14

Некроз 19,17 ± 1,14"* 19,17 + 2,35*" 19,83 ± 4,13 21,67 ± 5,94 22,67 ± 5,02

АТФ, 1 мМ + ДОК, ю^м Начальный блеббинг 18,0 ± 2,32'"*** 19,63 ± 2,43*""" 17,38 + 2,65" 13,25 ± 0,50""" 14,10 ± 1,49**"SSÍ

Терминальный блеббинг 0,50 + 0,24 1,38 + 0,36 1,63 + 0,36 1,75 + 0,37 2,25 + 0,17""*

Некроз 12,50 ± 1,27е" 12,67 ± 2,41 14,83 + 0,89* 16,67 + 2,41 16,17 + 2,68

док, 10"6М + АТФ, 1 мМ Начальный блеббинг 10,33 ± 1,34**' 9,17 ± 1,95* 9,50 ± 2,45 7,0 ± 1,87 6,25 ± 0,95***

Терминальный блеббинг 0,83 + 0,20 1,17 ± 0,20 2,0 ± 0,35 1,17 ± 0,20 0,95 + 0,18

Некроз 30,33 ± 1,74*"'**« 28,50 ± 3,37*" 32,50 ± 2,67'" 32,50 + 4,34*** 33,0 + 3,85"'

ДОК, 24 ч + АТФ Начальный блеббинг 14,38 + 0,86****** ии 12,13 ± 1,09*"** 12,88 + 1,04"' 11,38 + 1,92*" 10,88 + 1,55*"*"

Терминальный блеббинг 1,25 + 0,29 1,75 + 0.50 2,0 + 0,47 2,25 + 0,50 1,50 ± 0,24

Некроз 17,88 ± 2,Об"* 19,50 ± 1,25 21,75 ± 1,09'*** 22,13 + 0,83"" 23,0 + 1,58*"

ДОК, 10 дней + АТФ Начальный блеббинг 1,33 ± 1,03 - - - 0,33 + 0,11

Терминальный блеббинг 0,83 + 0,20 - - - 2,17 ± 0,54

Некроз 20,83 ± 3.21" ■ ■ ■ 30,17 ± 3,05*"

Примечание. Достоверность отличий по сравнению с изолированиям действием АТФ: * Р<0,05; Р<0,02; ш Р<0,01; №' Р<0,001.

подостром введении доксорубицина сопровождалось снижением блеббинг-индуцирующего эффекта АТФ.

Таким образом, весьма логично предположить, что процессы блеббинга и экстернализации фосфатидилсерина опосредуются различными механизмами при действии АТФ (Рис. 10).

Модуляция активности пурннергнческнх рецепторов

X

Нарушение : мембран- { цитоскелетных взаимодействия

Нарушение активное™ ферментов, регулирующих обмен фосфолипидов в

мембране »

Потеря асимметрии клеточных мембран

Нарушение активности рецеятор-регулнрующих клеточных сигнальных путей

3

Нарушение клеточного гомеоетаза Саг+

Нарушение структуры цитоскелета

Изменение проницаемости мембраны

Нарушение активности

мембрап-ассоциированных белков

Изменение внутри-и внеклеточного уровня АТФ

Изменение чувствительности клеток к АТФ

Модуляция экспрессии ; фосфатидилсерина

Модуляция процессов блеббинга

Рис. 10. Предполагаемые механизмы реализации процессов блеббинга и экстернализации фосфатидилсерина под действием АТФ

Обозначения. - указаны места действия ксенобиотика

антрациклинового ряда доксорубицина.

Известно, что регуляция чувствительности клеток к действию индукторов апоптоза осуществляется не только уровнем АТФ, но и НАД+. В связи с этим

мы исследовали развитие запрограммированной клеточной гибели (по экстернализации фофатидилсерина) под влиянием НАД+ в клетках костного мозга в состоянии окислительного стресса.

При инкубации костномозговых клеток in vitro в течение 1 часа с НАД+ в концентрации 1 мМ нами было обнаружено увеличение количества клеток, находящихся в состоянии некроза, и, соответственно, уменьшение числа жизнеспособных клеток, однако процент клеток на ранней стадии апоптоза (клетки с экстернализированным фосфатидилсерином) соответствовал контрольным значениям (Рис. 8).

Предварительная инкубация клеток костного мозга с доксорубицином в концентрации 10"6 М in vitro модулировала чувствительность гемопоэтических клеток к действию НАД : ксенобиотик значительно снижал апоптоз-индуцирующее действие НАД+, однако достоверно усиливал процессы некроза в популяции клеток. При этом количество жизнеспособных клеток достоверно уменьшалось по сравнению с изолированным действием метаболита (Рис. 8).

Однократное и 10-дневное введение доксорубицина in vivo также изменяло действие НАД+, связанное с преимущественной индукцией некроза. Воздействие доксорубицина в течение 24 часов уменьшало апоптогенную активность НАД+, а 10-дневный курс инъекций ксенобиотика отменял индукцию некроза под действием НАД+ (Рис. 8).

Таким образом, отмена апоптоз- и некроз-индуцирующего действия НАД+ при остром и подостром введении доксорубицина сопровождалась снижением экспрессии CD38 в клетках костного мозга на фоне возрастания уровня внутри- и внеклеточного НАД+, что подтверждает существующие предположения о необходимости поддержания адекватного уровня НАД+ в клетках для реализации программы апоптоза. Полученные экспериментальные данные могут свидетельствовать о снижении чувствительности гемопоэтических клеток к действию НАД+.

С учетом выявленного нами индуцирующего влияния НАД+ на клеточную гибель, а также того факта, что одним из проявлений апоптоза является блеббинг плазматической мембраны, мы изучили особенности повреждения мембран клеток костного мозга при окислительном стрессе в присутствии НАД+ in vitro.

Инкубация клеток костного мозга с НАД+ приводила к изменениям плазматической мембраны, сопровождающимся индукцией преимущественно начального блеббинга, который проявлялся с первых минут аппликации метаболита, тогда как клетки с признаками терминального блеббинга регистрировались во второй половине инкубационного периода. На протяжении всей инкубации ПАД+ оказывал выраженное цитотоксическое действие, проявляющееся развитием некроза (Табл. 3).

Таблица 3. Модуляция эффектов НАД+ в клетках костного мозга при их инкубации с доксорубицнном (ДОК, 10"6 М) in vitro и при остром и подостром введении доксорубицина (ДОК) in vivo (в % от общего количества клеток)

Серия Показатель Время инкубации, мин

5 15 30 45 60

Контроль Начальный блеббинг 1,50 ± 0,0 1,50 + 1,06 6,33 ± 0,82 1,88 ± 0,79 1,0 + 0,47

Терминальный блеббинг 0,50 + 0,33 1,25 ± 0,29 2,50 + 0,35 2,0 ± 0,53 1,58 ± 0,43

Некроз 7,38 ± 1,57 8,38 + 0,92 10,17 ± 1,14 10,25 ± 1,46 11,50 ± 1,55

НАД, 1 мМ Начальный блеббинг 10,67 ± 1,95*" 12,0 ± у» 2,32 5,50 ± 0,35 5,67 ± 1,24' 4,0 ± 1,22

Терминальный блеббинг 1,50 + 0,61 2,0 + 0,35 2,33 + 0,89 4,83 + 1,08 2,50 + 0,71

Некроз 19,17 ± 2,01"* 21,17 ± 2,01*" 24,17 + 1,67*" 26,33 ± 0,89"" 29,50 + 0,35*"*

НАД, 1 мМ + ДОК, 10* М. Начальный блеббинг 10,25 ± 1,50"' 11,0 ± 1,87" 13,63 + 2,60*" 7,13 + 1,61* 4,33 + 1,43

Терминальный блеббинг 0,83 ± 0,34 0,67 ± 0,21s 2,17 + 0,54 1,83 ± 0,41* 1,25 ± 0,17

Некроз 19,88 ± 1,92"' 20,38 ± 1,92*" 20,83 + 2,41" 21,63 ± 1,82"* 23,13 ± 1,21*"™

ДОК, 24 ч + НАД Начальный блеббинг 13,13 ± 0,76"" 10,13 ± 0,95*" 8,63 ± 0,83й 6,38 + 0,28*" 5,50 ± 0,41""

Терминальный блеббинг 0,88 ± 0,43 2,13 + 0,49 2,0 ± 0,24 1,50 ± 0,41# 1,38 ± 0,36

Некроз 20,25 ± 2,03"* 21,0 + 2,39"* 22,88 ± 2,62 23,38 ± 2,14"* 25,38 ± 1,44""*

ДОК, 10 дней + НАД Начальный блеббинг 1,83 + 0,54м - - - 1,33 + 0,20

Терминальный блеббинг 1,33 ± 0,20 - - - 1,0 ± 0,35

Некроз 18,0 ± 2,81* - - - 28,50 ± 2,15"*

Примечание. Достоверность отличий по сравнению с изолированным действием НАД: * Р<0,05;м Р<0,02;ш Р<0,01;Р<0,001.

Воздействие доксорубицина in vitro и in vivo изменяло динамику блеббинга по сравнению с изолированным действием НАД+. Инкубация клеток с ксенобиотиком in vitro ослабляла НАД+-индуцированные процессы терминального блеббинга и некроза. Острое и подострое введение ксенобиотика in vivo также сопровождалось снижением выраженности

б л сбои ига. и ндуци ровашого НАД1 (Табл. 3). Это соответствовало характеру совместного влияния НАД+ и ксенобиотика на с но бод пор апикальное окисление липидон биомембран, проявляющегося подавлением его интенсивности.

Полученные нами экспериментальные данные подтверждают вероятность нарушения процессов блеббннга клеточных мембран в условиях изменения концентрации внутриклеточного НАД' при окислительном стрессе.

С ледова' гсльно. эффекты НАД . связанные с нивелированием его апоптоз-и нежроз-ииду циру ющей активности И мембран-цитоскелетаых перестроек в состоянии окислительного стресса, имели однотипную направленность, что предполагает опосредованность этих процессов одним механизмом (Рис. ! !),

1 над:

С 1)38

л

АДФ-рибознлнра-вавие Р2Х 7

Модуляция ие к Г) ран -цнтоскелегных перестроек

Повышение внутриклеточного Саг+

—£--

Экспрессии фосфати-днДСернва

Индукция блев&Щга

Нарушение гомеостяза Са3+

Снижение продукции цАДФР

Индукция клеточной гибели

Сицжекке экспрессии С1Ш

Изменение чувствительности клеток к НАД"

1

Изменение внутри-ц внеклеточного уровня НАД1

Отмена лпоптпз- и некроз-индуцирующего действия НАД*, подавление про нем он блеббннга

Рис. 11. Механизмы реализации эффектов НАД+ в клетках костного мозга

Обозначения — указаны места действия ксенобиотика

ан трацикл и нового ряда доксорубицина.

Таким образом, НАДТ, присутствуя во внеклеточной среде в концентрациях, реально достижимых при явлениях интенсивного цитолиза, потенцирует процессы некроза и блеббннга в гемопоэтических клетках in vitro, а также продукцию реактивного кислорода, что может являться одним из

механизмов паракринной и аутокринной регуляции функциональной активности клеток в костном мозге. Применение доксорубицина - индуктора окислительного стресса - модулирует чувствительность гемопоэтических клеток к действию эндогенного регулятора, вероятно, за счет изменения СБ38-опосредованных механизмов трансмембранного транспорта НАД+.

Принимая во внимание тот факт, что поддержание стабильного уровня НАД+ в клетках необходимо для координации клеточного метаболизма, регуляции активности сигнальных каскадных путей, модуляции процессов пролиферации и апоптоза, в то время как применение ксенобиотиков, индуцирующих окислительный стресс, нарушает внутриклеточный пул пиридиновых нуклеотидов и АТФ вследствие активации полиАДФ-рибозилполимеразы, обоснованным представляется предположение, что поддержание энергетического уровня в поврежденных клетках костного мозга путем подавления активности полиАДФ-рибозилполимеразы может играть решающую роль в восстановлении их функциональной активности, в том числе нормализации процессов пролиферации и запрограммированной клеточной гибели.

Действительно, никотинамид, являющийся субстратным ингибитором НАД-конвертирующих ферментов, в наших экспериментах восстанавливал пролиферативную способность клеток костного мозга, нарушенную доксорубицином. При этом сам никотинамид, будучи примененным изолированно, ингибировал пролиферацию клеток (Табл. 4).

Таблица 4. Влияние пикотинамида (НИК, 1 мМ) на пролиферацию клеток костного мозга и процессы доксорубиции (ДОК)-индуцируемого апоптоза при культивировании в диффузионных камерах

Серия КОС КлОС Апоптоз, %

Контроль 16,08 ± 2,67 121,38 + 13,46 2,19 + 0,33

НИК, 1 мМ 6,14 ± 1,22"' 49,17 ±4,56*"* 8,42 + 0,93*'"

ДОК, 10"" М 7,44 ±1,15*" 68,69 ±5,15'"* 4,14 ±0,30*"*

ДОК, 10"6 М + НИК, 1 мМ 22,67 ±2,9 Г"'* 117,33 ±0,88* 2,17 ± 0,70*

Примечание. * — достоверное отличие по сравнению с изолированным применением доксорубицина (ДОК) при Р<0,001.

Эффективность никотинамида проявлялась и в плане предотвращения доксорубицин-индуцируемого апоптоза, в то время как сам никотинамид потенцировал развитие запрограммированной клеточной гибели. Причем индукция апоптоза под действием экзогенного корректора коррелировала с подавлением им колонне- и кластерообразующей способности клеток костного мозга (/=0.90 и г= 0.95 (Р<0,01), соответственно). Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о прямом участии НАД-

зависимых процессов в модуляции ксенобиотиком механизмов клеточной смерти и/или репарации.

В то же время предполагаемая терапевтическая эффективность ингибиторов полиАДФ-рибозилполимеразы может носить относительный характер, проявляющийся в потенцировании летального эффекта при окислительном стрессе.

Известно, что под действием НАД+-гликогидролазы/С038 внеклеточный НАД+ быстро деградирует до никотинамида и АДФ-рибозы. Логично предположить, что дополнительное воздействие никотинамида должно сопровождаться повышением уровня НАД+ и усилением его эффекта. Действительно, совместная инкубация клеток костного мозга с никотинамидом и НАД+ сопровождалась увеличением некроз-индуцирующей активности метаболита. Однако количество клеток в состоянии апоптоза (клетки с экстернализированным фосфатидилсерином) и вторичного некроза достоверно снижалось по сравнению с эффектом НАД+

Таким образом, никотинамид обладает цитопротекторным действием при применении в физиологических концентрациях, однако оказывает цитотоксический эффект при воздействии в высоких дозах. Следовательно, соблюдение баланса реакций, модулятором которых является никотинамид, является условием нормальной межклеточной коммуникации и внутриклеточной сигнализации. Кроме того, подавление активности полиАДФ-рибозилполимеразы никотинамидом и связанная с этим активация специфических эндонуклеаз, обеспечивающих интернуклеосомную фрагментацию ДНК, обеспечивает раннюю элиминацию клеток, наиболее чувствительных к запрограммированной клеточной гибели, что на уровне популяции выражается в последующем увеличении устойчивости клеток к действию ДНК-повреждающих агентов.

Таким образом, применение никотинамида - субстратного ингибитора полиАДФ-рибозилполимеразы позволяет эффективно блокировать вызванное ксенобиотиком истощение клеточного пула НАД* и связанное с этим изменение пролиферативной активности клеток и программы клеточной смерти в гемопоэтических клетках in vivo, что может являться новой патогенетически обоснованной терапевтической стратегией в лечении нарушений гемопоэза.

Полученные нами данные дают право сделать вывод о том, что одним из значимых клеточных механизмов токсического действия ксенобиотиков антрациклинового ряда в клетках костномозгового происхождения является индукция дизрегуляторных процессов в механизме межклеточной коммуникации и интеграции. Являясь индуктором митохондриальной дисфункции, доксорубицин реализует свое миелотоксическое действие, в числе прочих механизмов, за счет нарушения метаболизма НАД+ и АТФ,

опосредованного изменением экспрессии молекул межклеточной коммуникации, модуляции процессов пролиферации и

запрограммированной/патологической клеточной смерти, следствием чего является изменение чувствительности клеток костного мозга к действию эндогенных лигандов.

Постулируемое нами нарушение в условиях окислительного стресса регуляторного влияния естественных метаболитов на клеточные функции подразумевает возможность его коррекции путем направленной модуляции рецептор-активируемых механизмов межклеточной коммуникации, что представляет собой мощный современный инструмент для создания новых высокоэффективных лекарственных препаратов, строго избирательно воздействующих на определенные биологические мишени и обладающих как агонистическим или антагонистическим, так и модуляторным действием.

В совокупности результаты нашей работы позволяют предложить следующую схему патогенеза нарушения межклеточных взаимодействий при действии ксенобиотиков антрациклинового ряда (Рис. 12).

Рис. 12. Схема патогенеза нарушения межклеточных взаимодействий при действии ксенобиотиков антрациклинового ряда

ВЫВОДЫ

1. Доксорубицин реализует свое миелотоксическое действие, в числе прочих механизмов, за счет снижения концентрации в клетке НАД(Ф)Н, изменения соотношения восстановленной и окисленной форм никотинамидных коферментов, и связанным с этим нарушением метаболизма НАД+ и АТФ в гемопоэтических клетках. Это проявляется выраженными сдвигами во внутри- и внеклеточном уровнях естественных метаболитов как при остром и подостром введении ксенобиотика in vivo, так и при инкубации с ним клеток костного мозга in vitro.

2. Воздействие доксорубицина на гемопоэтические клетки in vivo нарушает механизмы регуляции функциональной активности клеток костного мозга, ассоциированные с пуринергической сигнализацией, активностью НАД-конвертирующих ферментов и коннексинов: ксенобиотик уменьшает экспрессию Р2Х7 в клетках костного мозга через 24 ч и восстанавливает ее к 10 суткам; уменьшает количество CD38+ клеток костного мозга при остром и подостром воздействии; увеличивает экспрессию Сх43 в костном мозге при остром введении с последующим ее восстановлением до исходного уровня.

3. Гемопоэзповреждающее действие доксорубицина сопровождается подавлением пролиферативной активности клеток, угнетающим эффектом на эритроидный и миелоидный ростки гемопоэза, потенцированием клеточной гибели по пути апоптоза, динамическими изменениями плазматической мембраны клеток костного мозга (блеббингом), отражающими степень выраженности нарушений мембран-цитоскелетных взаимодействий, и - при увеличении дозы ксенобиотика - разрушением мембраны (некроз), что ассоциировано с нарушением экспрессии молекул межклеточной коммуникации.

4. Метаболиты с регуляторной активностью (АТФ, НАД+) регулируют характер мембран-цитоскелетных взаимоотношений, свободнорадикальные процессы и чувствительность клеток костного мозга к действию некрозогенных и апоптогенных стимулов: АТФ, присутствуя во внеклеточном пространстве, индуцирует апоптоз и обратимый блеббинг плазматической мембраны клеток костного мозга in vitro, а также оказывает модулирующее влияние на процессы генерации свободных радикалов в клетках в состоянии окислительного стресса. Присутствие НАД+ во внеклеточной среде потенцирует некроз и начальный блеббинг плазматической мембраны гемопоэтических клеток in vitro, а также продукцию реактивного кислорода.

5. Реализация активности АТФ в популяции клеток костного мозга осуществляется через Р2Х7 подтип пуринергических рецепторов. Острое и

подострое воздействие миелотоксического ксенобиотика доксорубицина нарушает уровень внутри- и внеклеточной АТФ, уменьшая концентрацию АТФ внутри клеток через 24 ч и достоверно увеличивая уровень внутриклеточной и внеклеточной АТФ в костном мозге к 10 суткам, модулирует процессы запрограммированной клеточной смерти и перекисного окисления липидов, что сопровождается отменой апоптоз-индуцирующего действия АТФ, свидетельствующей о снижении чувствительности клеток к апоптогенному эффекту метаболита.

6. Важным компонентом регуляции пролиферативной и функциональной активности клеток костного мозга является внутриклеточный гомеостаз НАД+, регулируемый ИАД-конвертирующими ферментами: снижение экспрессии и активности НАД-гликогидролазы (CD38) в клетках костного мозга при действии доксорубицина сопровождается отменой апоптоз- и некроз-индуцирующего действия НАД4 на фоне возрастания уровня внутри-и внеклеточного НАД+, что свидетельствует о снижении чувствительности гемопоэтических клеток к регуляторным эффектам эндогенного лиганда НАД+.

7. Патогенетически значимым механизмом миелотоксического действия доксорубицина является изменение экспрессии молекул коннексиновых контактов в клетках костного мозга, что сопровождается модуляцией процессов запрограммированной клеточной гибели и альтерацией чувствительности клеток к регуляторному влиянию эндогенных лигандов (АТФ, НАД+), транспортируемых коннексинами.

8. Применение никотинамида - субстратного ингибитора НАД-конвертирующих ферментов - является патогенетически обоснованным способом коррекции миелотоксического действия доксорубицина: никотинамид эффективно блокирует вызванное ксенобиотиком нарушение пролиферативной активности клеток, способствуя возрастанию количества колонне- и кластерообразугощих клеток костного мозга в 3 и 1,7 раза, соответственно, и программы клеточной смерти в гемопоэтических клетках in vivo, снижая уровень доксорубицин-индуцируемого апоптоза в 1,9 раза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, могут быть положены в основу разработки новой фармакологической стратегии, основанной на направленной модуляции рецептор-активируемых механизмов межклеточной коммуникации (применение антагонистов пуринергических рецепторов, модулирующих апоптогенное действие АТФ в

отношении гемопоэтичееких клеток; подавление активности НЛД-конвертирующих ферментов, сопровождающейся нормализацией процессов пролиферации и запрограммированной клеточной гибели), а также использоваться в диагностике и оценке побочных эффектов действия доксорубицина на гемопоэтические клетки.

2. Комплексная оценка мембранной дисфункции в клетках костного мозга может быть использована в качестве маркера нарушения физико-химических свойств мембраны при окислительном стрессе, модулирующего активность мембран-ассоциированных белков и приводящее к снижению чувствительности клеток к действию лигандов рецепторов.

3. Миелотоксическое действие доксорубицина может быть эффективно блокировано применением никотинамида - субстратного ингибитора НАД-конвертирующих ферментов, восполняющего клеточный пул НАД+ и восстанавливающего, таким образом, пролиферативную активность клеток и программу клеточной смерти в гемопоэтичееких клетках.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Применение диффузионных камер для изучения гемопоэтичееких клеток / В.В. Нефедова, Ю.А. Успенская, Т.А. Романова, О.В. Щеглова // Коррекция гомсостаза: Матер. VII Всерос. симпоз. - Красноярск, 1996. - С. 86-87.

2. Нарушение серотонинергических механизмов регуляции гемопоэза in vivo при острой экзогенной интоксикации / Ю.А. Успенская, А.Б. Егорова, О.В. Круглик, В.П. Нефедов // Гомеостаз и окружающая среда: Матер. VIII Всерос. симпоз. (с междунар. участием). - Красноярск, 1997. - С. 119-124.

3. Успенская, Ю.А. Нарушение ксенобиотиком — индуктором окислительного стресса серотонинергической регуляции пролиферации клеток костного мозга / Ю.А. Успенская, А.Б. Егорова, В.П. Нефедов // Тез. докл. 3-го съезда физиологов Сибири и Дальнего Востока. - Новосибирск, 1997. - С. 239.

4. Успенская, Ю.А. Влияние серотонина и ксенобиотика на пролиферацию костномозговых клеток и процессы запрограммированной клеточной смерти / Ю.А. Успенская, А.Б. Егорова, JI.H. Лапшина // Технологии неистощительного землепользования: Матер, науч. конф. профессорско-преподавательского состава КрасГАУ. - Красноярск, 1997. - С. 55-56.

5. Нарушение серотонинергической регуляции пролиферации клеток костного мозга при действии ксенобиотика - индуктора окислительного стресса / А.Б. Егорова, Ю.А. Успенская, О.В. Круглик и др. // Эксперим. и клинич. фармакология. - 1998. - Т. 61. - № 4. - С. 34-37.

6. Нарушение клеточных сигнальных систем в патогенезе экзогенных интоксикаций / А.Б. Егорова, C.B. Михуткина, Е.Ю. Ставицкая, Ю.А. Успенская // Вестн. Красноярского регионального отд-ния РАЕН. -Красноярск, 1999.1.-С. 99-109.

7. Pathogenesis of plasma membrane blebbing induced by chemical and physical agents / S.V. Mikhutkina, E.Yu. Stavitskaya, Yu.A. Uspenskaya et al. // Proc. IX Intern. Symp. of the Japan-Russia Medical Exchange. - Kanazawa, Japan, 2001. -P. 213.

8. Егорова, А.Б. NAD и глутатион модулируют чувствительность клеток костного мозга к окислительному стрессу / А.Б. Егорова, Ю.А. Успенская,

B.П. Нефедов // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2001. - Т, 132. - № 7. - С. 34-37.

9. Повреждение цитоскелета и клеточных мембран при апоптозе / А.Б. Егорова, Ю.А. Успенская, C.B. Михуткина, Е.Ю. Ставицкая // Успехи соврем, биологии. - 2001. - Т. 121. - № 5. - С. 502-510.

Ю.Успенская, Ю.А. Модуляция доксорубицином биологических эффектов АТФ в клетках костного мозга in vitro / Ю.А. Успенская, А.Б. Егорова, В.П. Нефедов // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2002. - Т. 133. - № 5. -

C. 487-491.

П.Успенская, Ю.А. АТФ, НАД и глутатион модулируют чувствительность клеток костного мозга в условиях окислительного стресса / Ю.А. Успенская // Современные аспекты биологии и медицины: Матер, городской науч.-практ. конф., посвященной 40-летию Центральной научно-исследовательской лаборатории СГМУ. - Томск, 2002. - С.19-21.

12.Успенская, Ю.А. Изменение чувствительности клеток костного мозга при окислительном стрессе связано с модулирующим влиянием НАД / Ю.А. Успенская, А.Б. Салмииа // Гомеостаз и экстремальные состояния организма: Тез. докл. XI Междунар. симпоз. - Красноярск, 2003. - С. 153154.

13.Модулирующее влияние глутатиона на чувствительность гемопоэтических клеток к воздействию доксорубицина / Ю.А. Успенская, C.B. Михуткина, С.К. Антонова, J1.JI. Петрова // Актуальные проблемы патофизиологии: Матер, межвузовской конф. молодых ученых. - Санкт-Петербург, 2003. - С. 92-94.

14.Механизмы экстернализации фосфатидилсерина и блеббинга при алоптозе, индуцированном действием мембранотоксических ксенобиотоков / А.Б. Салмина, C.B. Михуткина, Ю.А. Успенская и др. // Тез. докл. X Российско-Японского междунар. медицинского симпоз. «Якутия - 2003». - Якутск, 2003.-С. 146-147.

15.Блеббинг плазматической мембраны тимоцитов и апоптоз связаны с нарушением емкостного входа Са2+ в клетки / C.B. Михуткина, А.Б. Салмина, A.B. Сычев и др. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2004. -Т. 137.-№6.-С. 628-632.

16.Role of purinergic receptors in realization of ATP effects in bone marrow cells / Ya.A. Uspenskaya, S.V. Mikhutkina, E.A. Pozhilenkova et al. // Proc. XI Intern. Symp. of the Japan-Russia Medical Exchange. -Niigata, Japan, 2004. - P. 395.

17.Успенская, Ю.А. Эффекты АТФ в клетках костного мозга реализуются через Р2Х подтип пуринергических рецепторов / Ю.А. Успенская // Матер. XIX съезда физиологического о-ва им. И.П. Павлова. - Екатеринбург, 2004. - С. 220-222.

18.Индукция апоптоза в клетках костного мозга опосредуется активностью пуринергических рецепторов / Ю.А. Успенская, C.B. Михуткина, Е.И. Таксанова и др. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2004. - Т. 138. -№8. -С. 135-138.

19.Коннексины в коже / В.И. Прохоренков, А.Б. Салмина, Т.Г. Рукша и др. // Клинич. дерматология. - 2004. - № 3. - С. 16-20.

20.Кальций-зависимые механизмы апоптоза в патогенезе токсичности ксенобиотиков - индукторов окислительного стресса / C.B. Михуткина, O.J1. Лопатина, Ю.А. Успенская, Е.А. Пожиленкова // Актуальные проблемы патофизиологии: Матер. X Юбилейной межвузовской конф. молодых ученых. - Санкт-Петербург, 2004. - С. 70-72.

21.Успенская, Ю.А. Роль CD 38 и НАД в регуляции чувствительности клеток костного мозга к миелотоксическому действию доксорубицина / Ю.А. Успенская // Матер. Всерос. конф. молодых ученых. - Красноярск, 2004. - С. 183-186.

22.Успенская, Ю.А. Изменение метаболизма НАД+ и CD38 в клетках костного мозга в условиях окислительного стресса / Ю.А. Успенская // Актуальные проблемы патофизиологии: Матер. XI межвузовской конф. молодых ученых. - Санкт-Петербург, 2005. - С. 81-83.

23.Успенская, Ю.А. Участие НАД+-гликогидролазы в регуляции чувствительности клеток костного мозга к токсическому действию ксенобиотиков / Ю.А. Успенская, А.Б. Салмина / Тез. докл. V Сибирского физиологического съезда // Бюл. Сибирской медицины. - 2005. - Т. 4. -Приложение 1.-С. 121.

24.Успенская, Ю.А. Особенности экспрессии CD38 в клетках костного мозга мышей при действии миелотоксического ксенобиотика доксорубицина in vivo / Ю.А. Успенская, А.Б. Салмина // Тез. докл. XII Симпозиума Российско-Японского медицинского обмена. — Красноярск, 2005. — С. 637639.

25.Нарушение экспрессии CD38 и метаболизма НАД+ в клетках костного мозга при действии доксорубицина / А.Б. Салмина, Ю.А. Успенская, C.B. Михуткина и др. // Эксперим. и клшшч. фармакология. - 2006. - Т. 69. - № З.-С. 50-52.

26.Успенская, Ю.А. Нарушение метаболизма АТФ и НАД+ и межклеточной коммуникации в гемопоэтических клетках при окислительном стрессе / Ю.А. Успенская // Вестник КрасГАУ. - 2006. - № 13. - С. 235-239.

27.Успенская, Ю.А. Нарушение экспрессии молекул межклеточной коммуникации в клетках костного мозга при действии доксорубицина in vivo / Ю.А. Успенская, А.Б. Салмина, Е.Ф. Вайс // Сибирское медицинское обозрение,- 2007. -№ 1.-С. 10-13.

28.0собенности экспрессии и функциональной активности Р2Х7 рецепторов в клетках костного мозга при действии доксорубицина / Ю.А. Успенская, А.Б. Салмина, Н.А. Малиновская и др. // Эксперим. и клинич. фармакология. -2007.-Т. 70.-№ 1.-С. 52-56.

29.Успенская, Ю.А. Роль нарушений экспрессии коннексинов в развитии апоптоза клеток костного мозга при действии миелотоксического ксенобиотика / Ю.А. Успенская, А.Б. Салмина // Сибирский медицинский журнал. - 2007. - № 1. - С. 51-54.

30.Успенская, Ю.А. Роль межклеточных взаимодействий в регуляции гемопоэза в условиях окислительного стресса / Ю.А. Успенская // Матер. XX съезда физиологического о-ва им. И.П. Павлова. - Москва, 2007. - С. 455.

Список сокращений

АТФ — аденозиптрифосфорная кислота

ДНК- дезоксирибонуклеиновая кислота

док- доксорубицин

КлОС- кластерообразующая способность

кос- колониеобразующая способность

МДА - малоновый диальдегид

МПД- максимально переносимая доза

мтт- 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид

НАД- никотинамидадениндинуклеотид

НАДФН- восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфоефат

НИК- никотинамид

ПОЛ- перекисное окисление липидов

ТБК- тиобарбитуровая кислота

ФИТЦ- флуоресцеин-изотиоцианат

CD- кластер дифференцировки (cluster of differentiation)

Сх43 - коннексин 43

ld5„- доза, вызывающая гибель 50% животных

PPADS- пиридоксальфосфат-6-азофенил-2',4'-дисульфоновая кислота

Исследование клеточных и молекулярных механизмов межклеточных взаимодействий - одна из приоритетных задач современной биологии и медицины. Тесная интеграция тканей и сложная система межклеточной коммуникации, включающая механизмы внутриклеточной передачи регуляторных сигналов, лежат в основе развития многоклеточного организма и поддержания его нормального функционирования.

Хотя в настоящее время основные механизмы внутриклеточной передачи сигналов с участием цитоплазматических и ядерных рецепторов гормонов, рецепторов, сопряженных с ГТФ-связывающими белками и регулируемых ионных каналов изучены, недостаточно исследованной и наиболее сложной частью проблемы межклеточной коммуникации является разъяснение механизмов согласованного взаимодействия различных лигандов, позволяющих клеткам адекватно реагировать на постоянно изменяющиеся условия среды внутри организма и вне его [53]. Особую актуальность исследование механизмов межклеточных контактов приобретает в костном мозге, где коммуникация и интеграция важны для обеспечения жизнеспособности, роста и дифференцировки гетерогенной популяции клеток, а также в силу влияния большого количества регуляторных молекул гемопоэзиндуцирующего микроокружения, обеспечивающих регуляцию гемопоэза в физиологических и патологических условиях [29, 34].

Большинство имеющихся в литературе работ в области гематологии посвящены изучению роли цитокинов, которые рассматриваются как важнейшие специализированные средства межклеточного сообщения, позволяющие клеткам обмениваться информацией [178, 233, 261, 357]. Вместе с тем, в последние годы все больший интерес представляет изучение влияния клеточных метаболитов как лигандов клеточных рецепторов на пролиферативные, дифференцировочные процессы, а также модуляции ими механизмов естественной (запрограммированной) клеточной гибели - апоптоза и патологической клеточной смерти - некроза. Однако в литературе лишь в единичных работах рассматриваются клеточные и субклеточные механизмы такого рода регуляции [186,321,332,358].

Одним из приоритетных направлений современной патофизиологии является исследование механизмов межклеточных взаимодействий в условиях токсического действия ксенобиотиков антрациклинового ряда, способных индуцировать окислительный стресс и нарушать привычные клеточные кооперации и регуляторное влияние естественных метаболитов на клеточные функции, необходимые для нормального функционирования органов и тканей. При этом наименее изученной остается проблема изменения чувствительности клеток костного мозга к действию эндогенных лигандов в условиях окислительного стресса. Это обстоятельство не позволяет разработать новые высокоэффективные лекарственные препараты для восстановления структурно-функционального гомеостаза клетки. Вместе с тем, понимание особенностей сигнальной трансдукции в клетках, находящихся в состоянии окислительного стресса, может стать основой для разработки принципиально новых технологий фармакологической коррекции патологических процессов, ассоциированных с увеличением прооксидантной активности.

Известно, что одним из базовых механизмов цитотоксичности ряда ксенобиотиков является индукция ими окислительного стресса [228, 295, 433]. Генерация свободных радикалов, сопровождающая физиологические и патологические процессы, становится причиной альтерации биомакромолекул клеток - перекисного окисления липидов, свободнорадикального повреждения нуклеиновых кислот, окисления белковых молекул и полисахаридов, а также изменения интегративных межклеточных и внутриклеточных сигнальных процессов. До сих пор проявления миелотоксичности ксенобиотиков -индукторов окислительного стресса рассматривались преимущественно в качестве обратимых или необратимых повреждений структур клеток, приводящих к дезорганизации клеточного метаболизма и нарушению функционирования органа или системы. Однако в литературе накапливаются данные о роли индукции дизрегуляторных процессов в механизме клеточной гибели [123, 339].

В этой связи патогенез многих патологических процессов и гематологических заболеваний может быть раскрыт с принципиально новых позиций - в аспекте межклеточных взаимодействий. Отсутствие на сегодняшний день сведений о веществах - протекторах угнетающего эффекта индукторов окислительного стресса на гемопоэз и неполное раскрытие механизмов альтерации клеточных структур - компонентов сигнальных систем делает актуальным разработку патогенетически обоснованной эффективной стратегии антитоксической защиты клетки путем направленной модуляции рецептор-активируемых механизмов межклеточной коммуникации.

Цель работы. Изучить патогенетическую роль нарушения внутриклеточного гомеостаза НАД+, пуринергической регуляции, коннексин-опосредованной коммуникации в клетках костного мозга в реализации цитотоксического потенциала ксенобиотика антрациклинового ряда (доксорубицина).

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние ксенобиотика антрациклинового ряда на внутриклеточный пул пиридиновых нуклеотидов и метаболизм НАД+ в клетках костного мозга.

2. Исследовать влияние ксенобиотика на уровень АТФ в клетках костного мозга и внеклеточном пространстве. Оценить роль различных подтипов пуринергических рецепторов в реализации апоптогенной активности АТФ и модуляции этих процессов доксорубицином в клетках костного мозга мышей in vitro и in vivo.

3. Исследовать развитие запрограммированной и патологической клеточной гибели в клетках костного мозга, подвергнутых действию доксорубицина in vivo и in vitro. Изучить вклад повреждения мембран клеток костного мозга при действии АТФ и НАД+ на фоне применения миелотоксического ксенобиотика доксорубицина in vitro и in vivo в реализацию механизмов запрограммированной клеточной смерти.

4. Изучить влияние ксенобиотика антрациклинового ряда на АТФ- и НАД-зависимые процессы регуляции пролиферации и апоптоза клеток костного мозга. Оценить угнетающий эффект доксорубицина на различные ростки кроветворения.

5. Оценить уровень экспрессии молекул межклеточной коммуникации (пуринергического рецептора Р2Х7, С038/НАД+-гликогидролазы, коннексина 43) в клетках костного мозга мышей в физиологических условиях, а также при действии миелотоксического ксенобиотика доксорубицина in vivo.

6. Изучить особенности регуляции функциональной активности клеток костного мозга эндогенными регуляторами гемопоэза АТФ и НАД+ в норме и в условиях окислительного стресса.

7. Установить вклад НАД-зависимых механизмов в миелотоксический эффект ксенобиотика и возможность его патогенетической коррекции субстратными ингибиторами ферментов трансформации никотинамидадениндинуклеотида.

Научная новизна.

Установлено, что одним из значимых клеточных механизмов токсического действия ксенобиотика антрациклинового ряда в клетках костномозгового происхождения является индукция дизрегуляторных процессов в механизмах межклеточной коммуникации и интеграции.

Впервые установлена роль нарушения Р2Х7-ассоциированных сигнальных механизмов в реализации действия миелотоксических ксенобиотиков и изучены некоторые механизмы пуринергической дизрегуляции.

Доказано, что клеточные механизмы миелотоксического действия доксорубицина ассоциированы с нарушением экспрессии и функциональной активности НАД+-гликогидролазы/СБ38. Изучена роль НАД+-гликогидролазы/СБЗ 8 в регуляции метаболизма НАД+ в гемопоэтических клетках в условиях окислительного стресса.

Впервые обнаружено, что нарушение экспрессии и функциональной активности коннексина 43 является одним из механизмов цитотоксического эффекта доксорубицина.

Исследованы механизмы паракринной и аутокринной регуляции функциональной активности клеток в костном мозге аденозинтрифосфатом и никотинамидадениндинуклеотидом. Изучены закономерности изменения степени чувствительности клеток костного мозга к присутствующим во внеклеточном пространстве естественным метаболитам при действии ксенобиотика антрациклинового ряда.

Приоритетное значение имеют данные о том, что нарушение гомеостаза АТФ и НАД^ при действии ксенобиотика антрациклинового ряда (доксорубицина) модифицирует процессы межклеточных взаимодействий и регуляторную активность сигнальных молекул.

Выявлено, что поддержание гомеостаза НАД+ в клетках костного мозга является условием нормальной межклеточной коммуникации и внутриклеточной сигнализации. Экспериментально доказано, что применение субстратных ингибиторов НАД-конвертирующих ферментов позволяет эффективно блокировать вызванное ксенобиотиком истощение клеточного пула НАД+ и связанное с этим изменение пролиферативной активности клеток и программы клеточной смерти в гемопоэтических клетках.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Данная работа является фрагментом тем «Биохимия и патобиохимия апоптоза», «Исследование гомеостаза при экстремальных воздействиях: механизм, пути коррекции при нарушениях» (номер государственной регистрации 01970007696) и «Структурно-функциональные основы гомеостаза животных при экстремальных состояниях», выполняющихся на базе кафедры биохимии с курсом медицинской химии ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» с 2002 г., Международного научного центра исследований экстремального состояния организма при Президиуме Красноярского научного центра СО РАН с 1995 г. и на кафедре анатомии и физиологии сельскохозяйственных животных ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» с 1998 г., соответственно.

Научно-теоретическое значение работы заключается в том, что в ней исследованы новые клеточные механизмы миелотоксического действия ксенобиотика антрациклинового ряда с позиции нарушения регуляторной функции АТФ и НАД+ и межклеточной коммуникации в гемопоэтических клетках, следствием чего является изменение чувствительности клеток к действию эндогенных лигандов.

Патогенетически обоснован способ коррекции миелотоксического действия доксорубицина никотинамидом - субстратным ингибитором ферментов каталитической деградации НАД+, обеспечивающий нормализацию клеточного пула НАД+ и связанное с этим восстановление процессов пролиферации и естественной гибели гемопоэтических клеток, что может являться основой для разработки новой терапевтической стратегии в лечении нарушений гемопоэза.

Постулируется нарушение в условиях окислительного стресса регуляторного влияния естественных метаболитов на клеточные функции, что подразумевает возможность его коррекции путем направленной модуляции рецептор-активируемых механизмов межклеточной коммуникации, представляющей собой мощный современный инструмент для создания новых высокоэффективных лекарственных препаратов, строго избирательно воздействующих на определенные биологические мишени и обладающих как агонистическим или антагонистическим, так и модуляторным действием.

Основной научно-технической задачей, решенной в ходе выполнения работы, явилось формирование современных представлений о роли дизрегуляции межклеточных взаимодействий и возможности ее коррекции при цитотоксическом действии ксенобиотика антрациклинового ряда.

В рамках работы оформлена заявка на патент «Способ диагностики системного воспалительного ответа организма при критических состояниях» (2007 г.) (Регистрационный № 2007109001).

Результаты диссертационного исследования внедрены в научно-исследовательскую работу ООО «Лаборатория иммунохимических методов исследования» (г. Красноярск), НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», Международного научного центра исследований экстремальных состояний организма при Президиуме Красноярского научного центра СО РАН и учебный процесс кафедры анатомии и физиологии сельскохозяйственных животных ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет», кафедры биохимии ГОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», кафедры фундаментальной и клинической биохимии с курсом лабораторной диагностики ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», кафедры фармакологии с курсами клинической фармакологии, фармацевтической технологии и последипломного образования ГОУ ВПО

Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на VII Всероссийском симпозиуме «Коррекция гомеостаза», Красноярск, 1996 г.; VIII Всероссийском симпозиуме (с международным участием) «Гомеостаз и окружающая среда», Красноярск, 1997 г.; 3-ем съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока, Новосибирск, 1997 г.; научной конференции профессорско-преподавательского состава КрасГАУ «Технологии неистощительного землепользования», Красноярск, 1997 г.; IX Международном Симпозиуме Российско-Японского медицинского обмена, Канадзава (Япония), 2001 г.; городской научно-практической конференции, посвященной 40-летию Центральной научно-исследовательской лаборатории СГМУ «Современные аспекты биологии и медицины», Томск, 2002 г.; XI Международном симпозиуме «Гомеостаз и экстремальные состояния организма», Красноярск,

2003 г.; межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии», Санкт-Петербург, 2003 г.; X Российско-Японском международном медицинском симпозиуме «Якутия - 2003», Якутск, 2003 г.; XI Международном Симпозиуме Российско-Японского медицинского обмена, Ниигата (Япония), 2004 г.; XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова, Екатеринбург, 2004 г.; X Юбилейной межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии», Санкт-Петербург,

2004 г.; Всероссийской конференции молодых ученых, Красноярск, 2004 г.; XI межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии», Санкт-Петербург, 2005 г.; V Сибирском физиологическом съезде, Томск, 2005 г.; XII Симпозиуме Российско-Японского медицинского обмена, Красноярск, 2005 г; научных семинарах Межкафедральной биохимической научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (2004-2007 гг.); заседаниях кафедры анатомии и физиологии сельскохозяйственных животных ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» (1998-2007 гг.).

Положения, выносимые на защиту:

1. Одним из значимых механизмов миелотоксического действия ксенобиотиков антрациклинового ряда является индукция дизрегуляторных процессов в системе межклеточной коммуникации и интеграции, проявляющаяся изменением экспрессии молекул межклеточной коммуникации (пуринергических рецепторов Р2Х7, НАД+-гликогидролазы/СБ38 и коннексина 43) и сопровождающаяся нарушением мембран-цитоскелетных взаимодействий, пролиферативного и дифференцировочного статуса клеток костного мозга и их чувствительности к действию апоптогенных стимулов и эндогенных регуляторов гемопоэза.

2. Ксенобиотики антрациклинового ряда регулируют механизмы пролиферации и запрограммированной клеточной смерти (апоптоза) в клетках костномозгового происхождения за счет нарушения внутриклеточного гомеостаза НАД+ и пуринергической регуляции гемопоэза.

3. АТФ и НАД+, присутствуя во внеклеточном пространстве при действии миелотоксического ксенобиотика доксорубицина, модулируют процессы паракринной и аутокринной регуляции функциональной активности клеток костного мозга.

4. Патогенетическая коррекция миелотоксического эффекта ксенобиотиков антрациклинового ряда эффективно достигается применением субстратных ингибиторов ферментов каталитической конверсии никотинамидадениндинуклеотида.

15

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работ, из них 12 - в центральной печати (в реферируемых ВАК журналах), 2 - в международной печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 245 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, иллюстрирована 13 таблицами и 39 рисунками. Библиографический указатель включает 462 литературных источника, в том числе 86 отечественных и 376 иностранных авторов.

ВЫВОДЫ

1. Доксорубицин реализует свое миелотоксическое действие, в числе прочих механизмов, за счет снижения концентрации в клетке НАД(Ф)Н, изменения соотношения восстановленной и окисленной форм никотинамидных коферментов, и связанным с этим нарушением метаболизма НАД+ и АТФ в гемопоэтических клетках. Это проявляется выраженными сдвигами во внутри- и внеклеточном уровнях естественных метаболитов как при остром и подостром введении ксенобиотика in vivo, так и при инкубации с ним клеток костного мозга in vitro.

2. Воздействие доксорубицина на гемопоэтические клетки in vivo нарушает механизмы регуляции функциональной активности клеток костного мозга, ассоциированные с пуринергической сигнализацией, активностью НАД-конвертирующих ферментов и коннексинов: ксенобиотик уменьшает экспрессию Р2Х7 в клетках костного мозга через 24 ч и восстанавливает ее к 10 суткам; уменьшает количество CD38+ клеток костного мозга при остром и подостром воздействии; увеличивает экспрессию Сх43 в костном мозге при остром введении с последующим ее восстановлением до исходного уровня.

3. Гемопоэзповреждающее действие доксорубицина сопровождается подавлением пролиферативной активности клеток, угнетающим эффектом на эритроидный и миелоидный ростки гемопоэза, потенцированием клеточной гибели по пути апоптоза, динамическими изменениями плазматической мембраны клеток костного мозга (блеббингом), отражающими степень выраженности нарушений мембран-цитоскелетных взаимодействий, и - при увеличении дозы ксенобиотика - разрушением мембраны (некроз), что ассоциировано с нарушением экспрессии молекул межклеточной коммуникации.

4. Метаболиты с регуляторной активностью (АТФ, НАД+) регулируют характер мембран-цитоскелетных взаимоотношений, свободнорадикальные процессы и чувствительность клеток костного мозга к действию некрозогенных и апоптогенных стимулов: АТФ, присутствуя во внеклеточном пространстве, индуцирует апоптоз и обратимый блеббинг плазматической мембраны клеток костного мозга in vitro, а также оказывает модулирующее влияние на процессы генерации свободных радикалов в клетках в состоянии окислительного стресса. Присутствие НАД+ во внеклеточной среде потенцирует некроз и начальный блеббинг плазматической мембраны гемопоэтических клеток in vitro, а также продукцию реактивного кислорода.

5. Реализация активности АТФ в популяции клеток костного мозга осуществляется через Р2Х7 подтип пуринергических рецепторов. Острое и подострое воздействие миелотоксического ксенобиотика доксорубицина нарушает уровень внутри- и внеклеточной АТФ, уменьшая концентрацию АТФ внутри клеток через 24 ч и достоверно увеличивая уровень внутриклеточной и внеклеточной АТФ в костном мозге к 10 суткам, модулирует процессы запрограммированной клеточной смерти и перекисного окисления липидов, что сопровождается отменой апоптоз-индуцирующего действия АТФ, свидетельствующей о снижении чувствительности клеток к апоптогенному эффекту метаболита.

6. Важным компонентом регуляции пролиферативной и функциональной активности клеток костного мозга является внутриклеточный гомеостаз НАД+, регулируемый НАД-конвертирующими ферментами: снижение экспрессии и активности НАД-гликогидролазы (CD38) в клетках костного мозга при действии доксорубицина сопровождается отменой апоптоз- и некроз-индуцирующего действия НАД* на фоне возрастания уровня внутри- и внеклеточного НАД+, что

196 свидетельствует о снижении чувствительности гемопоэтических клеток к регуляторным эффектам эндогенного лиганда НАД+.

7. Патогенетически значимым механизмом миелотоксического действия доксорубицина является изменение экспрессии молекул коннексиновых контактов в клетках костного мозга, что сопровождается модуляцией процессов запрограммированной клеточной гибели и альтерацией чувствительности клеток к регуляторному влиянию эндогенных лигандов (АТФ, НАД+), транспортируемых коннексинами.

8. Применение никотинамида - субстратного ингибитора НАД-конвертирующих ферментов - является патогенетически обоснованным способом коррекции миелотоксического действия доксорубицина: никотинамид эффективно блокирует вызванное ксенобиотиком нарушение пролиферативной активности клеток, способствуя возрастанию количества колоние- и кластерообразующих клеток костного мозга в 3 и 1,7 раза, соответственно, и программы клеточной смерти в гемопоэтических клетках in vivo, снижая уровень доксорубицин-индуцируемого апоптоза в 1,9 раза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, могут быть положены в основу разработки новой фармакологической стратегии, основанной на направленной модуляции рецептор-активируемых механизмов межклеточной коммуникации (применение антагонистов пуринергических рецепторов, модулирующих апоптогенное действие АТФ в отношении гемопоэтических клеток; подавление активности НАД-конвертирующих ферментов, сопровождающейся нормализацией процессов пролиферации и запрограммированной клеточной гибели), а также использоваться в диагностике и оценке побочных эффектов действия доксорубицина на гемопоэтические клетки.

2. Комплексная оценка мембранной дисфункции в клетках костного мозга может быть использована в качестве маркера нарушения физико-химических свойств мембраны при окислительном стрессе, модулирующего активность мембран-ассоциированных белков и приводящее к снижению чувствительности клеток к действию лигандов рецепторов.

3. Миелотоксическое действие доксорубицина может быть эффективно блокировано применением никотинамида - субстратного ингибитора НАД-конвертирующих ферментов, восполняющего клеточный пул НАД+ и восстанавливающего, таким образом, пролиферативную активность клеток и программу клеточной смерти в гемопоэтических клетках.