Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Роль индукторов цитохрома Р-450 в регуляции активности белков детоксикации ксенобиотиков и пролиферации клеток гепатом

/

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

ГУЖАЕВА Екатерина Львовна

РОЛЬ ИНДУКТОРОВ ЦИТОХРОМА Р-450 В РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ БЕЖОВ ДЕТОКСИКАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ И ПРОЛИФЕРАЦИИ КЛЕТОК ШПАТОМ

14.00.14- ОНКОЛОГИЯ

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор В.А.КОБЛЯКОВ

Москва 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

1.ВВЕДБНИВ .......................................................................................5

П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ферменты I и II фазы метаболизма: структура, функция регуляция

1.1 Место и роль цитохрома Р-450 в организме.........................9

1.2 Индукция ферментов I фазы метаболизма ксенобиотиков.......................................................................12

1.2.1 Фенобарбитальный тип индукции...................................13

1.2.2 Индукторы пролифераторов пероксисом........................14

1.2.3 Метилхолантреновый тип индукции...............................15

1.3 Индукция ферментов II фазы метаболизма ксенобиотиков......................................................................................18

1.4 Клеточные линии с нарушениями в передаче индукционного сигнала..................................................................21

2. Цитохром Р-450 и Р-гликопротеин как компоненты системы МЛУ

2.1 Р-гликопротеин-опосредованная МЛУ................................23

2.2 Координированное функционирование изоформцитохрома Р-450 и Р-гликопротеина.....................24

3. Влияние индукторов цитохрома Р-450 на пролиферацию клеток................................................................................26

3.1 Митогенное действие активных форм кислорода...............27

3.2 Взаимодействие лиганда с А1г рецептором -возможный механизм клеточной пролиферации................30

3.3 Физиологическая роль АЬ рецептора в организме..............32

3.4 " Фосфатидилинозитол-З-киназа и ее роль в

пролиферативном ответе клетки..........................................33

Ш.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Характеристика используемых клеточных линий..................36

2. Индукция ферментов метаболизма ксенобиотиков................37

3. Биохимические методы исследования

3.1 Определение активности бензапиренгидроксилазы...........37

3.2 Определение активности 7 этоксирезору-финдэетилазы........................................................................38

3.3 Определение НАДФ(Н)-хиноноксидоредуктазы................38

3.4 Определение концентрации белка.......................................39

4. Измерение активности Р-гликопротеина.................................40

5. МТТ-тест...................................................................................40

6. Оценка пролиферативного действия индукторов цитохрома Р-450.............................................................................41

6.1 Изучение митогенного действия индукторов по включению 3Н тимидина......................................................42

6.2 Определение скорости размножения клеточных культур по приросту количества клеток..............................43

6.3 Подсчет количества митозов................................................43

7. Определение уровня обмена фосфолипидов по включению 32Р......................................................................................44

8. Определение количества фосфатидилинозитол-3-киназы.......................................................................................44

9. Оценка экспрессии изоформ цитохрома Р-450 с помощью моноклональных антител................................................45

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Выбор моделей и условий эксперимента. Изучение функционирования ферментов I фазы метаболизма

ксенобиотиков...........................................................................47

2. Изучение функционирования ферментов II фазы метаболизма ксенобиотиков............................................................54

3. Изучение способности к индукции цитохрома Р-450 в сублиниях гепатомы МсА RH 7777 с различной степенью устойчивости к колхицину. Колхицин как индуктор изоформ цитохрома Р-450.................................................58

4. Действие индукторов цитохрома Р-450 на клеточную пролиферацию..........................................................................67

5. Влияние индукторов цитохрома Р-450 на обмен фос-фолипидов и уровень фосфатидилинозитол-3-киназы...........75

6. Влияние индукторов цитохрома Р-450 на активность Р-гликопротеина в клетках гепатомы 27....................................79

V. ОБСУЖДЕНИЕ.............................................................................85

VI. ВЫВОДЫ......................................................................................94

VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................95

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БА- бенз/а/нтраден

БП- бенз/а/пирен

БПГ- бенз/аЛшренгидроксилаза

7ЭОР- 7 этоксирезоруфин

7ЭРОД- 7 этоксирезоруфин-О-дэетилаза

ФБ- фенобарбитал

{3-НФ- (3-навтофлавон

а-НФ- а-навтофлавон

МФС- монооксигеназная ферментная система

ПАУ- полициклические ароматические углеводороды

ТФ А- 12-О-тетрадеканоилфорбол-13 -ацетат

ТХДД- 2,3,7,8-тетрахлордибегоо-р-диоксин

ГТКС- протеинкиназа С

КХ- колхицин

Р-гл,- Р-гликопротеин

МЛУ- множественная лекарственная устойчивость

PI3K- (phosphatidylinositol 3 kinase)- фосфатидипинозитол-З-киназа

I. ВВЕДЕНИЕ

Основным этиологическим фактором возникновения рака у человека принято считать контакт с канцерогенами окружающей среды. При этом многие канцерогены исходно являются химически инертными соединениями и требуют активации ферментными системами организма. Как правило, первый этап активации - окисление в МФС, ключевым ферментом которой является цитохром Р-450.

Под термином "цитохром Р-450" понимается большое число изоформ гемсодержащих ферментов, определяемых в восстановленном состоянии при длинне волны 450 нм в присутствии СО, обладающих различной субстратной специфичностью и различной регуляцией экспрессии.

Уже на ранних стадиях изучения цитохрома Р-450 было обнаружено, что предварительное введение животным, некоторых субстратов резко увеличивает скорость их метаболизма. Дальнейшими исследованиями было показано, что этот эффект обусловлен индукцией ферментов метаболизма ксенобиотиков, в частности цитохрома Р-450. Было показано, что существует несколько, а именно 3, основных группы индукторов, действующих по разным механизмам. Сравнительно недавно еще считалось, что эффекты индукторов цитохрома Р-450 на функции клеток обусловлены только их способностью индуцировать ферменты метаболизма ксенобиотиков. Однако, в последнее время, появляются публикации, в которых показано, что эти соединения вызывают и другие изменения в функционирование клеток (так называемые "быстрые" эффекты) (32,33,74). Механизмы и феноменология эффектов индукторов цитохрома Р-450, не связанных с синтезом ферментов метаболизма ксенобиотиков, практически не изучена. Поэтому

целью нашей работы было исследовать влияние индукторов цитохрома Р-450 на функции клетки помимо индукции изоформ цитохрома Р-450.

Для этого в качестве моделей мы использовали клеточную линию крысиной гепатомы МсА RH 7777, в которой присутствует как конститутивный, так и индуцированный уровень активности изоформ цитохрома Р-450; и клетки гепатомы 27, в которой таковые отсутствуют. Однако, предыдущими исследованиями было показано, что при перевивке клеток гепатомы 27 в печень способность к индукции при введении различных индукторов восстанавливается, что свидетельствует об отсутствии мутаций в структуре белков, участвующих в передаче индуцирующего сигнала (58).

Таким образом, мы могли сравнивать две клеточные линии: с нормально функционирующей системой передачи индукционного сигнала, и линию с обратимыми нарушениями в таковой.

Целью нашей работы было выяснить, какие эффекты могут вызывать индукторы цитохрома Р-450 в клетке помимо собственно индукции ферментов метаболизма ксенобиотиков.

Для достижения поставленной цели мы предполагали решить ряд задач, а именно:

- выяснить корреляцию в активации ферментов I и II фазы метаболизма ксенобиотиков при действии моно- и бифункциональных индукторов

- определить, существует ли корреляция в работе Р-гл. и изоформ цитохрома Р-450 1А

- установить, влияют ли индукторы цитохрома Р-450 на функции Р-гл. в клетках, в которых отсутствует активность изоформ цитохрома Р-450.

- выяснить влияние индукторов различных классов на клеточную пролиферацию

- исследовать возможные механизмы митогенного действия индукторов цитохрома Р-450

Итак, наша работа является одной из первых попыток понять, какие эффекты вызывают индукторы цитохрома Р-450 при попадании в клетку помимо индукции характерных изоформ этого фермента, а так же попытаться объяснить природу этих эффектов.

В работе впервые продемонстрировано, что индукторы различных типов вызывают пролиферацию клеток по разным механизмам. В связи с этим, обсуждается ряд возможных путей передачи митогенного сигнала от индукторов цитохрома Р-450.

Показано, что существует корреляция в работе различных ферментных систем защиты клетки от токсического действия чужеродных агентов.

Полученные нами данные могут иметь немаловажное практическое значение. Так результаты, полученные в разделе по выяснению корреляции в работе Р-гл. и цитохрома Р-450 открывают заманчивую перспективу по разработке комплексных подходов в химиотерапии на основе использования цигостатиков, обладающих цитохром Р-450 индуцирующей активностью.

Полученные нами данные о способности индукторов цитохрома Р-450 стимулировать пролиферацию клеток в отсутствие конститутив-

ного и индуцируемого цитохрома Р-450 изменяет существующее представление о канцерогенной опасности таких соединений как ПАУ. Классическое представление о канцерогенном действиии этих соединений ассоциируется с их метаболизмом и с образованием электро-фильных метаболитов, взаимодействующих с онкогенами или антионкогенами, вызывая в них мутации с последующим неконтролируемым размножением потомков этих клеток. Стимуляция пролиферации является необходимым этапом промоции канцерогенеза. Наличие "пол-

• | у.

ных канцерогенов, не треоующих дополнительного воздействия промоторов, ставит вопрос о существовании двух типов канцерогенеза: нуждающегося в стадии промоции и канцерогенеза, в котором эта стадия отсутствует. Если механизм общий, то какой из метаболитов канцерогена играет роль промотора? В 70-ые годы эта проблема широко дискутировалась. Было исследовано промоторное действие всех метаболитов бенз/а/пирена, но подходящего кандидатами роль промотора выявить не удалось. Вопрос до сих пор остается открытым. Исследовать промоторное действие исходной молекулы ПАУ весьма затруднительно, поскольку для этого необходимо иметь модель, в которой отсутствовал бы метаболизм этого класса веществ, но сохранились бы свойства, характеризующие промоторное действие. В первую очередь способность стимулировать деление инициированных клеток. Наши данные, в которых показано пролиферативное действие самой немета-болизированной молекулы ПАУ в клетках гепатомы 27, свидетельствует, что промоторная стадия при канцерогенном действии ПАУ может обеспечиваться исходной молекулой вещества.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ферменты I и II фазы метаболизма: структура, функция, регуляция.

1.1.Место и роль цитохрома Р-450 в организме

Все известные к настоящему моменту канцерогены можно разделить на две большие группы: прямого и непрямого действия. Первые, для взаимодействия с компонентами клетки, не нуждаются в предварительной активации ферментными системами организма. К таким соединениям можно отнести эпоксиды, лактоны, хлорэтиламины и.т.д. Канцерогены непрямого действия - это, как правило, инертные соединения,не способные при физиологических условиях взаимодействовать с макромолекулами клетки. При воздействии клеточных ферментов организма эти соединения превращаются в химически активные вещества, способные взаимодействовать с макромолекулами клетки и являющиеся истинными канцерогенами. Процесс активации канцерогенов может проходить в одну или несколько стадий, но обязательным звеном этого процесса является окисление в МФС. Схематически этот процесс можно представить следующим образом:

канцероген ок{ ающей среды

МФС

конечный канцероген^

промежуточный канцероген

взаимодействие с ДЬ

малигнизация

детоксикация

Как видно из приведенной схемы, в результате окисления в МФС из химически инертного образуется высокоактивное электрофильное соединение, для которого далее имются две возможности. Первая - взаимодействовать с нуклеофильными центрами клеточных макромолекул, инициируя процесс трансформации клетки. Второй возможный путь, это взаимодействие с ферментами конъюгации: сульфотрансферазой, УДФ-глюкуронилтрансферазой, глутатион-8-трансферазой, алкоголь- и аль-дегиддегидрогеназой; с соединениями типа глутатиона и серной кислотой с образованием водорастворимых соединений, выводящихся из организма. Эта стадия известна как II фаза метаболизма и, как правило, является детоксицирутощим процессом. Строго говоря, возможность канцерогенного действия обусловлена изменением соотношения в протекании реакций окисления в МФС и процесса детоксикации.

МФС представляет собой две цепи переноса электронов -НАД* Н- и НАД(Ф)*Н-зависимую. Схема функционирования этих цепей представлена на рис.1. Часто стадию окисления в МФС называют I фазой метаболизма канцерогенов.

Основным каталитическим звеном МФС является цитохром Р-450. Этот фермент является консервативным белком и обнаруживается у всех видов животных, а так же в растениях, микроорганизмах. Наибольшее количество цитохрома Р-450 в организме животных определяется в печени, почках, легких. Основным местом локализации цитохрома Р-450 в клетке является эндоплазматический ретикулум. В настоящий момент известно более 480 генов, кодирующих изоформы

Рис. 1. Схема функционирования МФС (Р^аЬгоок, 1982)

КАБ*Н-►|Т1]-

е 02 -»©5-► Р-450-БЩ

Г* Л

-*яон+н2о

02

у

Р-450

ЫЛОР^Н —*|Т1а, Р1Ь]-► Т-450-Ш^<-Ш

В5 — цитохром В5 Р-450 - цитохром Р-450 [ Р1 ] - флавопротеид КН — субстрат реакции

Рис. 2. Схема процесса окисления субстрата на цитохроме Р-450 (\¥еп*т§1оег, 1982).

Бе - гемовое железо цитохрома Р-450 К — субстрат окисления

цитохрома Р-450, с различной, иногда перекрывающейся субстратной специфичностью (3,85). Такое обилие изоформ объясняется тем, что практически все органические липофильные соединения являются субстратами цитохрома Р-450.

Процесс окисления субстрата на цитохроме Р-450 представлен на рис.2. Липофильный субстрат взаимодействует с цитохромом Р-450 с образованием железосубстратного комплекса, который, получая электрон через НАД(Ф)*Н-зависимую цепь, восстанавливается. Восстановленный комплекс реагирует с 02 с образованием трехкомпо-нентного комплекса. При основном пути, окси-цитохром-субстратный комплекс, получая второй электрон, предположительно от НАД(Ф)*Н-зависимой цепи МФС, восстанавливается и распадается с образованием продукта реакции, воды и окисленной формы цитохрома Р-450, который снова может взаимодействовать с субстратом. Однако окси-цитохром-субстратный комплекс может реорганизоваться в комплекс, содержащий Бе+3 и супероксид. Этот комплекс распадается с образованием активной формы кислорода и исходного комплекса Ее+31Ш. Это побочный путь функционирования цитохрома Р-450, ведущий к образованию активных форм кислорода в цитоплазме.

1.2. Индукция ферментов I фазы метаболизма ксенобиотиков

Еще в 1954 году при изучении метаболизма ароматических аминов было замечено, что предварительное введение животным полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) резко увеличивает скорость их превращения в организме. В дальнейшем было показано, что этот эффект обусловлен индукцией ферментов метаболизма ксенобиотиков, в том числе цитохрома Р-450. К настоящему моменту все известные индукторы можно разделить на 3 основные группы: фе-

нобарбитального типа, метилхолантренового типа и индукторы про-лифераторов пероксисом. Исследования, направленные на изучение механизма индукции показали, что индукторы увеличивают синтез компонентов de novo, поскольку ингибирование процессов транскрипции и трансляции вызывает блок процесса индукции ферментов (2). Индукторы изоформ цитохрома Р-450, кроме этого гемопротеина, стимулируют синтез и других белков. Индукторы всех вышеперечисленных типов вызывают синтез ферментов второй фазы метаболизма ксенобиотиков (64,123):эпоксидгидролазы, УДФ-глюкуронил-трансферазы, глутатион-Б-трансферазы.

Индукторы, способные вызывать синтез ферментов как I так и II фазы метаболизма ксенобиотиков, называются бифункциональными. Однако, ферменты конъюгации могут быть индуцированы рядом гидрофильных соединений без индукции изоформ цитохрома Р-450. Эти индукторы называются монофункциональными.

1.2.1 .Фенобарбитальный тип индукции.

Наиболее изученным классом соединений, вызывающих индукцию изоформ 2В, 2С6, ЗА2, являются соединения барбитурового ряда. Основным представителем этого класса является фенобарбитал (ФБ), поэтому этот тип индукции и называется фенобарбитальный. Механизм этой индукции до сих пор не ясен. Одни исследователи высказываются в пользу существования некоего рецептора, который при проникновении лиганда в клетку взаимодействует с ним по типу рецептора стероидных гормонов (123). Однако все попытки найти и выделить этот рецептор не увенчались успехом. Другая точка зрения предполагает, что существование таког�