Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Интратекальный иммунный ответ и его роль в патогенезе хронической формы вилюйского энцефаломиелита

На правах рукописи

СИВЦЕВА Татьяна Михайловна

ИНТРАТЕКАЛЬНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ И ЕГО РОЛЬ В ПАТОГЕНЕЗЕ ХРОНИЧЕСКОЙ ФОРМЫ ВИЛЮЙСКОГО ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в научно-исследовательском учреждении «Институт здоровья» Академии наук Республики Саха (Якутия)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор П Г Петрова Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор И.А Вальцева доктор биологических наук, профессор А А Чепурнов

Ведущая организация: Московская медицинская академия им ИМ Сеченова

Защита диссертации состоится «_»_2004 г. в _час. _

мин на заседании диссертационного совета Д 212 203 06 при Российском университете дружбы народов по адресу. 117198, г Москва, ул Миклухо-Маклая, Д. 8

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу 117198, г Москва, ул Миклухо-Маклая,

Д. 8

Автореферат разослан «_»_2004 г

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

ГА Дроздова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Изучение вилюйского энцефаломиелита (ВЭ) началось с 50-х гг XX века с признанием нозологической самостоятельности заболевания (Шаповал А Н , Сарманова Е С , 1955, Шаповал А Н , 1956, 1959). По клиническим и патоморфологическим признакам ВЭ представляет собой хроническую прогрессирующую дегенерацию центральной нервной системы (ЦНС) с продолжительным клиническим течением (Петров ПА., 1964, 1987, Владимирцев А И , 1964, Тазлова Р С , 1982, Авцын А П с соав , 1983; Владимирцев В А , 1993, 2000, Goldfarb LG , Gajdusek D С , 1992, Masters С. A etal., 1996) Отличительной чертой заболевания является этническая избирательность, ВЭ поражает только коренное население Республики Саха (Якутия): якутов, реже эвенков и эвенов По данным Института здоровья Академии наук Республики Саха (Якутия), в 2002 г на учете с диагнозом ВЭ состояло 192 человека В среднем по республике заболеваемость ВЭ составляет 5 человек на 10 тыс коренного населения

Актуальность проблемы ВЭ связана с особой тяжестью поражения ЦНС, приводящей к инвалидности с существенной или полной утратой физических и умственных способностей или смерти больного, распространением по территории Республики Саха (Якутия) в районы, ранее свободные от ВЭ, и отсутствием методов специфического лечения и профилактики заболевания Сложность ситуации усугубляется тем, что большинство больных проживает в сельской местности, небольших отдаленных поселках, а также отсутствием специфических лабораторных методов диагностики заболевания, что затрудняет своевременное выявление и учет пациентов

Природа заболевания до сих пор не известна Несмотря на особенности клинического течения, свидетельствующие об инфекционной природе ВЭ, не удается выявить этиологический агент заболевания (Сарманова Е С с соав , 1960, Караванов А.С. с соав., 1985,1996, Goldfarb L G., Gajdusek D.K , 1992; Янагихара Р. с соав , 2000) Роль наследственных и экологических факторов в происхождении ВЭ также остается неясной (Зубри Г.Л с соав , 1977, Гольдфарб Л.Г. с соав., 1979; Макаров В Н., Алексеев В П , 1996; Фефелова В В. с соав., 1996).

В последние годы большое внимание уделяется исследованию роли иммунологических нарушений в патогенезе хронической формы ВЭ Некоторыми авторами поддерживается точка зрения о наличии аутоиммунного компонента при

ВЭ (Тазлова PC, 1968; Аутеншпюс А.И

foc. НАЦИОНАЛЬНА« !

Шатунов А.Ю , 1999). Однако большинство i ^следврд^^^эти оЗЛасти направлено

, SbfZffS]

г---1QPR; ГУгИТ"""""' ВЛ, 1996;

на изучение состояния иммунитета в периферической крови больных (Дубов А В с соав , 1991, 1995; Ганкина Н Ю с соав , 1992, Кононова С К с соав , 1996) Между тем в исследовании патогенеза хронических инфекционных и аутоиммунных заболеваний, связанных с поражением ЦНС, большой научный интерес вызывает изучение реакций местного иммунитета и анализ иммуноглобулинов цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) (Thompson Е J and Keir G , 1990, McLean В N etal, 1990, Kaiser R , 1991, Lunding J et al, 2001; Verbeek M , 2002, Reiber H , 2001) Причиной этого интереса является возможность с помощью выявления интратекального, те локального, в пределах оболочек мозга, синтеза иммуноглобулинов определить специфическую иммунореактивность, направленную против антигенов, локализованных за гематоэнцефалическим барьером (Thompson Е J , 1995, Reiber Н et al, 1998, Correale J , 2002, Sindic С J M et al , 2003) Кроме того, выявление интратекального синтеза иммуноглобулинов класса G (IgG) является одним из наиболее чувствительных лабораторных методов дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний ЦНС (Andersson А etal, 1994; Reiber Н. et.al, 2003) Все вышеизложенное указывает на то, что исследование интратекального иммунного ответа при ВЭ имеет большое значение, как для изучения этиологии и патогенеза заболевания, так и для разработки дополнительных методов лабораторной диагностики ВЭ.

Цель исследования: раскрыть роль локальных иммунных реакций на уровне ЦНС в патогенезе хронической формы вилюйского энцефаломиелита и на этой основе обосновать принципы дифференциальной диагностики ВЭ с заболеваниями нервной системы невоспалительной природы

Задачи исследования:

1 Выявить у больных хронической формой ВЭ интратекальный синтез IgG на основе анализа клонального спектра иммуноглобулина G в ЦСЖ и сыворотке крови

2 Изучить взаимосвязь между выявлением интратекального синтеза IgG и рядом клинических характеристик заболевания ВЭ (продолжительность, наличие острого периода, возраст начала заболевания)

3 Исследовать специфичность интратекально синтезированных IgG у больных ВЭ к вирусным антигенам.

4 Выявить у больных ВЭ присутствие вируса, к антигенам которого проявляют специфичность интратекально синтезированные IgG

5 Оценить возможность использования метода изоэлектрофокусирования с иммуноблоттингом для лабораторной Диагностики ВЭ

Научная новизна работы Впервые показано участие локальных иммунных реакций гуморального типа на уровне мозга в патогенезе хронической формы ВЭ. Разработана схема развития локального иммунного ответа при ВЭ С помощью анализа клонального спектра IgG в ЦСЖ и сыворотке крови установлено, что у больных подострой и хронической формами ВЭ развивается интратекальный синтез олигоклональных IgG Оценка взаимосвязи между выявлением интратекального синтеза олигоклональных IgG и рядом клинических характеристик заболевания ВЭ выявило, что интратекальный гуморальный иммунный ответ обнаруживается у больных ВЭ вне зависимости от длительности заболевания (от 3 до 29 лет) и наличия острого периода.

Анализ антигенной специфичности олигоклональных IgG впервые выявил у больных ВЭ интратекальный синтез антител, специфичных к антигенам вируса простого герпеса (ВПГ) или Herpes Simplex 1 и 2 типа, что позволяет предположить участие вирусов семейства Herpesviridae в инициировании локального иммунного ответа при ВЭ Установлено, что интратекальная иммунореактивность при ВЭ не связана с репродукцией ДНК вируса простого герпеса в клетках биологических жидкостей и тканях мозга больных ВЭ, что свидетельствует о латентной форме вирусной инфекции, при которой зараженная клетка становится мишенью для разрушающего действия иммунной системы по причине изменения антигенной специфичности клеточной мембраны

Практическая значимость работы Патогенетически обоснованы принципы дифференциальной диагностики ВЭ и хронических невоспалительных заболеваний ЦНС В отличие от заболеваний ЦНС невоспалительной природы при ВЭ методом изоэлектрофокусирования с иммуноблоттингом обнаруживается интратекальный синтез олигоклональных IgG. Результаты исследования показывают, что метод изоэлектрофокусирования с иммуноблоттингом имеет высокую степень чувствительности (100%) и специфичности (80%) при исследовании больных ВЭ и может использоваться в качестве лабораторного теста в комплексе с клиническими данными для диагностики ВЭ.

Внедрение в практику здравоохранения. По результатам исследования в практику клинического отделения Института здоровья Академии наук Республики Саха (Якутия), являющегося специализированным лечебно-профилактическим учреждением для больных ВЭ, внедрены два метода для лабораторной диагностики ВЭ 1) изоэлектрофокусирование ЦСЖ и сыворотки крови и 2) диагностика вируса Herpes Simplex -1,2 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1 Важным звеном патогенеза хронической формы ВЭ является развитие локального иммунного ответа в пределах ЦНС, о чем свидетельствует интратекальный синтез 1дО

2 Интратекальный синтез 1дО при ВЭ связан с иммунореактивностью к вирусу простого герпеса 1, 2 типа, при этом репликация ДНК этого вируса в клетках крови, ЦСЖ и тканях мозга больных ВЭ не выявляется

3 Метод изоэлектрофокусирования с иммуноблоттингом имеет большое значение в верификации диагноза ВЭ в вероятных и сомнительных случаях для дифференцирования ВЭ от невоспалительных заболеваний ЦНС

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены на клиническом семинаре Института здоровья АН РС (Я) (Якутск, 2000), 10-й научно-практической конференции «Нейроиммунология» (С-Петербург, 2001), на 3-й итоговой научно-практической конференции Белорусского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии (Минск, 2002), заседании республиканского общества неврологов (Якутск, 2002), на 10-м Российско-Японском международном медицинском симпозиуме (Якутск, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав (обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения), заключения, выводов и списка использованной литературы Диссертация содержит 87 страниц текста, 7 таблиц и 10 рисунков Библиографический указатель включает 153 источника, из них 89 отечественных и 64 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Материалом исследования служили ЦСЖ и плазма крови 42 пациентов с различными неврологическими заболеваниями, проживающих в различных районах Республики Саха (Якутия) Обследование пациентов, забор крови и получение ЦСЖ путем люмбарной пункции проводили в стационаре Института здоровья АН РС (Я), в неврологическом отделении Республиканского центра экстренной медицинской помощи в г. Якутске и во время экспедиций в Вилюйский и другие районы Республики Саха (Якутия).

Все пациенты осмотрены врачами-неврологами Института здоровья АН РС (Я) Диагноз ВЭ устанавливался в соответствии с критериями, предложенными на II

Международной конференции по проблеме вилюйского энцефаломиелита и других нейродегенеративных заболеваний нервной системы (Владимирцев В А с соав, 2000) Согласно этим критериям, больные были распределены на три группы по достоверности диагноза ВЭ' с достоверным, вероятным и возможным (сомнительным) диагнозом ВЭ (табл 1)

Таблица 1

Распределение обследованных больных по диагнозу

Диагноз Количество пациентов

Больные ВЭ

Достоверный ВЭ 17

Вероятный ВЭ 8

Возможный ВЭ 2

Всего 27

Контрольная группа

Боковой амиотрофический склероз 2

Спастическая параплегия Штрюмпеля 1

Отогенный менингит 1

Стволовой энцефалит 1

Инсульт 4

Хореоакантоцитоз 1

Энцефалопатия разного генеза 5

Всего 15

Большинство (26 из 27) больных ВЭ были представителями якутской национальности, один пациент - эвенк Средний возраст больных на момент забора материала составлял 51,7±11,1 лет (от 29 до 73 лет) Возраст к началу развития болезни в среднем был равен 35±10,2 годам, продолжительность заболевания на момент обследования -17,1±8,3 года (от 3 до 34 лет).

В качестве контроля исследовались лица с другими неврологическими заболеваниями, что обусловлено тем, что интратекальный синтез IgG наблюдается при заболеваниях ЦНС и в норме не отмечается у здоровых людей (Thompson Е J and Keir 6, 1990, McLean BN etal, 1990) Контрольную группу составили 15 больных с различными неврологическими заболеваниями (табл 1) Средний возраст составил 47,7±18,3 лет (от 17 до 71 года) Все пациенты в этой группе якутской национальности

Для выявления интратекального иммунного ответа исследовали клональный спектр IgG в 42 образцах ЦСЖ и 37 образцах плазмы крови, взятых одновременно у тех же пациентов Наиболее чувствительным методом для выявления интратекального иммунного ответа является определение в ЦСЖ олигоклональных (продуктов 2 и более клонов плазматических клеток) полос IgG методом изоэлектрофокусирования с иммуноблоттингом (Delmotte Р, 1972, Walker RWH et al, 1983, Thompson E J and Keir G., 1990, McLean В N , et al, 1990, Lunding J et al., 2000; Verbeek MM et al, 2002) Данный метод используется как лабораторный тест в диагностике рассеянного склероза, подострого склерозируюицего панэнцефалита и других хронических воспалительных заболеваний нервной системы (McLean В N et al, 1990, Thompson EJ and Keir G, 1990; Andersson A etal, 1994) Основы метода изоэлектрофокусирования ЦСЖ и сыворотки крови с иммуноблоттингом разработаны Kier G. etal (1990) Принцип метода заключается в электрофоретическом разделении белков ЦСЖ и сыворотки крови по градиенту pH в агарозном геле (изоэлектрофокусирование) с последующим переносом белков на нитроцеллюлозную мембрану и выявлении IgG с помощью инкубации с антителами к человеческому IgG

Изоэлектрофокусирование производили в 1 % агарозном геле с добавлением амфолинов с рН=3-10 и рН=8-10,5 на оборудовании, включающем в себя источник питания EPS 3501, электрофорезную камеру Multiphor II, водяной циркуляционный термостат MultiTemp III (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция,). Разделенные иммуноглобулины пассивно переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad, США) в течение 30 минут под прессом около 3 кг Иммуноглобулины класса G идентифицировали инкубацией мембраны сначала с козьими антителами к человеческому IgG (DAKO, Дания), а затем кроличьими антителами к козьим иммуноглобулинам, конъюгированными с пероксидазой хрена (DAKO, Дания). Пероксидазную активность определяли колориметрически с помощью проявителя З-амино-9-этилкарбозола и перекиси водорода Повышенный уровень синтеза IgG отдельными клонами плазматических клеток проявлялся на электрофореграмме в виде поперечных полос на общем поликпональном фоне Наличие двух и более полос обозначалось термином «олигоклональные полосы» (Kier G. etal, 1990) Обнаружение полос в ЦСЖ при отсутствии в параллельно исследованной сыворотке крови интерпретировалось как интратекальный синтез олигоклональных IgG

Олигоклональные IgG исследовали на специфичность к антигенам трех вирусов' Herpes simplex -1 и 2, Varicella zoster и Cytomegalovirus Для этого

олигоклональные иммуноглобулины, разделенные изоэлектрофокусированием, переносили на нитроцеллюлозную мембрану, предварительно инкубированную с антигенами Herpes simplex -1 и 2, Varicella zoster или Cytomegalovirus соответственно (Virion, Швейцария) Специфичные антитела, перенесенные на мембрану, идентифицировали с помощью антител, конъюгированных с пероксидазой хрена по методу, описанному выше

Для диагностики вируса у тех же больных ВЭ исследовали 15 проб ДНК, выделенных из венозной крови фенольно-хлороформным методом, 9 проб ЦСЖ и образец замороженной ткани мозга умершего больного, любезно предоставленный лабораторией патоморфологии Института здоровья АН PC (Я) Выявление вируса проводили методом ПЦР Для этого выделяли ДНК из образцов ЦСЖ и тканей мозга с использованием коммерческого набора «ДНК-сорб-В» (Центральный НИИ эпидемиологии МЗ РФ, Москва) Все процедуры по выделению ДНК производили в соответствии с прилагаемой инструкцией ПЦР проводили при помощи коммерческого диагностического набора «АмплиСенс-100-R HSV-430» для амплификации участка ДНК 430 п н gB-гена вируса простого герпеса 1 и 2 типов (Центральный НИИ эпидемиологии МЗ РФ, Москва) на амплификаторе DNA Thermo Cycler 480 (Perkin Elmer, США) Продукты ПЦР анализировали методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием Разделение ПЦР-продуктов визуализировали в УФ-излучении.

Данные статистически обрабатывали с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 (StatSoft, USA). Для анализа частот внутри одной группы и сравнения частот качественного признака в двух несвязанных группах использовали точный критерий Фишера (Реброва О Ю, 2002) Вычисление чувствительности и специфичности метода изоэлектрофокусирования с иммуноблоттингом производили по методу, описанному Флеттчер Р ссоав (1998)

Результаты исследования и их обсуждение Интратекальный синтез IqG у больных ВЭ и пациентов группы контроля При параллельном анализе ЦСЖ и сыворотки крови больных ВЭ и пациентов группы контроля методом изоэлектрофокусирования с иммуноблоттингом было получено пять типов образцов электрофореграммы IgG

1 Поликлональный спектр IgG в ЦСЖ и сыворотке крови (треки на электрофореграммах были равномерными, без полос) - образец, соответствующий норме (Thompson Е J , Keir G , 1990, Andersson M et.al, 1994; Reiber H et al, 2003)

Такие образцы были получены у 14 пациентов (шести больных ВЭ и восьми больных из группы контроля) Типичная электофореграмма представлена на рис 1 (б)

2 Олигоклональные полосы (ОП) присутствуют на треках IgG в ЦСЖ и отсутствуют в параллельно исследованной сыворотке крови (рис 1, а) В этом случае наличие ОП только в ЦСЖ, но не в сыворотке крови является показателем интратекального синтеза IgG (Thompson Е J , Keir G , 1990, McLean В N etal, 1990, Andersson M etal, 1994, Reiber H etal, 2003) Подобные образцы выявлены у 16 больных ВЭ и двух больных из группы контроля

а б

Рис.1. Результаты изоэлектрофокусирования ЦСЖ и сыворотки крови а - больной ВЭ с олигокпональными IgG в ЦСЖ,

б - больной из группы контроля с поликпональным спектром IgG в ЦСЖ и сыворотке крови, ц - ЦСЖ, с - сыворотка крови Стрелками обозначены ОП IgG

3 Идентичные по расположению полосы IgG в ЦСЖ и сыворотке крови, которые являются отражением полос в сыворотке крови и не являются локально синтезированными Такая картина наблюдалась у трех больных из контрольной группы и является свидетельством системной инфекции (Thompson Е J , Keir G , 1990; Reiber Н etal., 2003),

4 Идентичные полосы в ЦСЖ и сыворотке крови с дополнительными полосами в ЦСЖ у одного пациента из контрольной группы Этот образец

свидетельствует о системном воспалении, но с дополнительным неврологическим компонентом (Thompson Е J , Keir G , 1990, Reiber H et al, 2003)

5 Монокпон (одна полоса) в ЦСЖ Выявление моноклона отражает высокую чувствительность метода изоэлектрофокусирования и может указывать, что в образце другие полосы полностью не проявились либо об активации одного клона плазматических клеток в ЦНС, например, при лимфоме (Andersson М et al, 1994) Монокпон был выявлен у одного больного с вероятным диагнозом ВЭ и одного больного из контрольной группы с диагнозом хореоакантоцитоз

Анализ полученных электрофореграмм в соответствии с международным соглашением по интерпретации результатов изоэлектрофокусирования (Andersson A et.al., 1994, Reiber Н, et al, 2003), показал, что интратекальный синтез олигоклональных IgG обнаружен у больных, у которых ОП присутствуют в ЦСЖ и не являются отражением полос в сыворотке крови (образцы 2 и 4 типа) Среди больных ВЭ интратекальный синтез олигоклональных IgG выявлен у 16 из 22 (72,7%) пациентов, у которых исследовалась ЦСЖ и сыворотка крови (табл 2) Олигоклональные полосы также выявлены у 4 больных ВЭ, от которых была только ЦСЖ Всего, таким образом, у 20 из 27 (74,1%) больных ВЭ наблюдаются олигоклональные полосы IgG в ЦСЖ.

Таблица 2

Частота выявления интратекального синтеза IgG в группах больных ВЭ и

неврологического контроля

ВЭ Контроль

Частота выявления олигоклональных 1дС, % 72,7" 20

Количество обследованных пациентов 22 15

Статистическая значимость частоты, р 0,0039 0,0027

* - статистически значимое различие с группой контроля р=0,0025

В группе контроля интратекальный синтез 1дй выявлен у 3 из 15 (20%) больных, которые имели следующие диагнозы отогенный менингит, энцефалопатия неясного генеза и токсическая энцефалопатия Сравнение полученных частот выявления интратекального синтеза 1дй среди больных ВЭ и другими неврологическими патологиями с помощью точного критерия Фишера для малых выборок показало, что среди больных ВЭ частота статистически значимо выше (р=0,0025) (табл. 2).

Распределение результатов выявления интратекального синтеза 1дв среди больных ВЭ трех клинических групп по достоверности диагноза ВЭ показало, что олигоклональные 1дв наблюдаются в ЦСЖ всех 17 больных с достоверным диагнозом ВЭ Тогда как в группе больных с вероятным диагнозом ВЭ ОП выявлены у трех из восьми пациентов (37,5%) У одного пациента из этой группы в ЦСЖ выявлен моноклон, что свидетельствует о том, что другие полосы 1дв еще не проявились и иммунный ответ имеет слабую интенсивность Ни у одного из двух больных с возможным (сомнительным) диагнозом ВЭ олигоклональные 1дв в ЦСЖ не обнаружены Распределение результатов выявления интратекального синтеза 1дв по клиническим группам представлено на рис. 2

100%

100% 80% 60% 40% 20% 0%

Достоверный ВЭ Вероятный ВЭ Возможный ВЭ Контроль

Клиническая группа

Рис. 2. Частота выявления интратекального синтеза 1дС у больных ВЭ различных клинических групп и контрольных лиц

Таким образом, исследование клонального спектра 1дв у больных ВЭ показывает развитие интратекального синтеза олигокпональных 1дС, причем частота выявления ОП среди больных ВЭ статистически значимо выше, чем среди больных с другими неврологическими патологиями, распространенными в Якутии Данный факт имеет большое практическое и теоретическое значение как для разработки лабораторного метода диагностики ВЭ, так и для исследования патогенеза хронической формы заболевания

Оценка чувствительности и специфичности метода изоэлектрофокусирования с иммуноблоттингом для диагностики ВЭ

Выявление интратекального синтеза 1дО с наибольшей частотой среди больных ВЭ с достоверным диагнозом ВЭ указывает на возможность использования метода в лабораторной диагностике ВЭ Оценка диагностической значимости теста с использованием метода, описанного Флеттчер Р с соав (1998), показала, что тест имеет 100% чувствительность (доля лиц с положительным результатом, те с ОП в

имеет 100% чувствительность (доля лиц с положительным результатом, те с ОП в ЦСЖ, среди больных с достоверным диагнозом ВЭ) и 80% специфичность (доля лиц с отрицательным результатом, те. без интратекального синтеза олигоклональных 1дС, в контрольной группе) Несмотря на высокий уровень специфичности метода по отношению к ВЭ, ОП могут выявляться и при других воспалительных заболеваниях ЦНС Тем не менее, метод может использоваться в комплексе с клиническими данными для дифференцирования ВЭ от невоспалительных заболеваний нервной системы и верификации диагноза у больных с вероятным или возможным (сомнительным) диагнозом ВЭ Например, выявление ОП у трех больных с вероятным диагнозом ВЭ подтверждает воспалительную природу заболевания в этих случаях и позволяет при отсутствии симптомов другого воспалительного заболевания ЦНС, с большей уверенностью диагностировать ВЭ. Высокая степень чувствительности теста олигоклональных 1дС для ВЭ указывает на ценность отрицательного результата в диагностике заболевания Так, отсутствие ОП в ЦСЖ у четырех больных с вероятным и двух больных с возможным диагнозами ВЭ свидетельствует о невоспалительной природе заболевания и не подтверждает диагноз ВЭ у этих больных.

Анализ зависимости выявления интратекального синтеза олигоклональных 1дв от некоторых клинических характеристик заболевания ВЭ Нами проанализирована зависимость выявления интратекального синтеза олигоклональных 1дв у больных ВЭ от ряда клинических характеристик заболевания типа течения, продолжительности, наличия острого периода в начале заболевания, возраста начала и степени проявления некоторых типичных симптомов ВЭ Нами получены данные, свидетельствующие о том, что выявление интратекального синтеза 1дв у больных ВЭ не зависело от типа течения, наличия или отсутствия острого начала, возраста начала и продолжительности заболевания Большинство исследованных нами больных ВЭ имели хроническую форму заболевания и два пациента - подострую Больные заболели в основном в трудоспособном возрасте от 19 до 59 лет. У 12 из 20 пациентов (60%), у которых выявлен интратекальный синтез 1д6, заболевание начиналось с острого периода продолжительностью от 2 до 36 недель, у остальных наблюдалось постепенное развитие симптомов хронического ВЭ. Длительность заболевания составляла от 3 до 29 лет У 19 из 20 пациентов, у которых наблюдался интратекальный синтез 1дС, на момент исследования продолжительность заболевания была свыше 10 лет, из них 9 человек болели более 20 пет Таким образом, при ВЭ интратекальный синтез

лет и не может быть остаточным явлением после перенесенного острого заболевания, т к. у 40% больных с ОП хроническая форма заболевания развилась постепенно

Выявление интратекального синтеза IgG у больных ВЭ свидетельствуют о значительной роли локальной иммунной реакции на уровне ЦНС по гуморальному типу в патогенезе хронической стадии ВЭ По данным ряда авторов интратекальный синтез олигокпональных иммуноглобулинов - характерная черта многих воспалительных заболеваний ЦНС и развивается в ответ на иммунную стимуляцию вирусным патогеном, либо в результате аутоиммунной активации иммунной системы мозга (Thompson Е J , Keir G , 1990, Reiber H , Peter В , 2000, Correale J , 2002) Для выявления роли интратекального синтеза IgG в патогенезе заболевания большое значение имеет исследование антигенной специфичности олигоклональных IgG Олигоклональные IgG проявляют специфичность к этиологическому агенту заболевания при герпетическом энцефалите, подостром склерозирующем панэнцефалите, нейроборрелиозе и других инфекционных заболеваниях ЦНС (Thompson Е J , Keir G., 1990, Mehta PD etal, 1994; Sindic С J M et. al., 2001) Обнаружение иммунореактивности к нескольким вирусам свидетельствует о полиспецифической активации иммунной системы мозга, например, при рассеянном склерозе (Reiber Н etal, 1998) Для выявления специфичности олигоклональных IgG, наблюдаемых в ЦСЖ больных ВЭ, нами были предприняты исследования иммунореактивности этих IgG к антигенам вирусов, к которым проявляют специфичность олигоклональные IgG при других заболеваниях ЦНС.

Исследование олигоклональных IgG у больных ВЭ на реактивность к вирусным антигенам

Исследование специфичности олигоклональных иммуноглобулинов ЦСЖ к антигенам нейротропных вирусов проводилось с помощью иммуноблоттинга разделенных изоэлектрофокусированием IgG на нитроцеллюлозную мембрану, предварительно инкубированную с вирусными антигенами Нами была исследована специфичность олигокпональных IgG к антигенам вирусов Herpes simplex - 1 и 2, Varicella zoster и Cytomegalovirus

У больных ВЭ была выявлена иммунореактивность только к антигенам Herpes simplex - 1 и 2 Олигоклональные IgG проявляли специфичность к Herpes Simplex -1, 2 у 14 из 21 больного ВЭ, что составляет 66,7% и является статистически значимой частотой (р=0 033) В контрольной группе реактивность к антигенам Herpes

Simplex - 1, 2 проявил только моноклон, выявленный в ЦСЖ больного с хореоакантоцитозом

Сравнение частот выявления иммунореактивности интратекальных антител у больных ВЭ и группы контроля с помощью двухстороннего критерия Фишера показало статистическую незначимость разности частот выявления ОП, специфичных к Herpes Simplex - 1 и 2, среди больных ВЭ и пациентов контрольной группы (р=0,267) Полученный результат объясняется тем, что частота этого признака в контрольной группе статистически незначима из-за малого количества пациентов, имеющих интратекальный синтез IgG в этой группе (р=0,207)

В табл 3 представлены результаты выявления иммунорективности олигоклональных IgG к антигенам Herpes simplex - 1 и 2 больных ВЭ различных клинических групп и контроля В группе больных с достоверным диагнозом ВЭ иммунореактивность к этому вирусу выявлена у 12 из 17 (70,6%) больных Из четырех больных с вероятным диагнозом ВЭ, у которых были обнаружены ОП в ЦСЖ, иммунореактивность к ВПГ наблюдалась у двух

Таблица 3

Частота выявления специфичности интратекально синтезированных IgG к антигенам Herpes Simplex 1, 2 у больных ВЭ различных клинических групп и

контрольных лиц

Группа больных Количество обследованных больных Частота выявления иммунореактивности к Herpes Simplex 1, 2, % Статистическая значимость, р

Достоверный ВЭ 17 70,6 0.02

Вероятный ВЭ 4 50 1

Контроль 4 25 0,207

Таким образом, полученные результаты показывают, что в развитии локального иммунного ответа у больных ВЭ может участвовать вирус простого герпеса 1 или 2 типа или вирус, антигены которого сходны с антигенами ВПГ Отсутствие иммунореактивности к двум другим вирусам показывает, что олигоклональные 1дв при ВЭ не являются полиспецифическими На основании полученных данных предложена схема развития иммунного ответа при ВЭ Так как этиологический агент ВЭ до сих пор неизвестен, то фактор, инициирующий иммунный ответ при этом заболевании, остается неясным Тем не менее, нами выдвинуто предположение что в качестве инициатора локального иммунного ответа

при ВЭ может выступать вирус, антигены которого сходны с антигенами ВПГ, или сам вирус простого герпеса (рис. 3)

Рис. 3. Схема развития локального гуморального иммунного ответа у больных ВЭ

Для уточнения возможной роли ВПГ в патогенезе ВЭ дальнейшие исследования были направлены нами на попытки выявить вирус Herpes Simplex - 1, 2 в различных биологических средах больных ВЭ методом ПЦР.

Выявление ДНК Herpes Simplex -1. 2 у больных ВЭ методом ПЦР Для выявления вируса Herpes Simplex -1,2 нами были исследованы лица как С интратекальным синтезом олигоклональных IgG, специфичных к ВПГ (девять больных с достоверным и один больной с вероятным диагнозом ВЭ), так и с интратекальным синтезом олигоклональных IgG, неспецифичных к этому вирусу (трое больных с достоверным диагнозом ВЭ) и двое больных с вероятным диагнозом ВЭ не имеющие олигоклональных IgG Всего 15 человек Диагностику проводили в образцах ЦСЖ, ДНК лимфоцитов крови и тканях мозга одного умершего больного ВЭ

Для лабораторной диагностики герпетической инфекции ЦНС в настоящее время наиболее чувствительным методом является ПЦР (Rowley, А Н etal, 1990,

Aureüus E et al 1991 Anderson, N E et al 1993 Kessler H H et al, 1994, Lakeman FD, Whitley RJ, 1995 Zunt JR Marra CM 1999) Однако нам не удалось обнаружить ДНК вируса Herpes Simplex -1, 2 этим методом ни в образцах ДНК лимфоцитов крови, ни в тканях мозга больных ВЭ (рис 4)

Рис. 4. Результаты электрофореза продуктов амплификации ДНК вируса Herpes Simplex - 1, 2 в образцах ЦСЖ и мозга больных ВЭ (негатив) Треки справа налево 1 - отрицательный контроль, 2, 7 - положительный контроль, 3 - 6 -образцы ЦСЖ больных ВЭ, 8,9- ткани мозга больного ВЭ

Таким образом, ВПГ не выявляется у больных хронической формой ВЭ методом ПЦР, даже при наличии интратекального синтеза антител, специфичных к этому вирусу Следует отметить, что больные имели хроническую форму ВЭ и большую продолжительность заболевания свыше 3 лет

С одной стороны, отрицательный результат ПЦР диагностики может объясняться тем, что при хронической стадии заболевания не происходит активной репродукции вируса Как известно, метод ПЦР используется для выявления ВПГ при герпетическом энцефалите (ГЭ) и наиболее эффективен в первые дни заболевания тогда как олигоклональные антитепа, специфичные к ВПГ выявляются в ЦСЖ на более поздних стадиях (Vandvik В et al, 1985, Sauerbrei А , et al, 2000, Sindic С J M et al, 2003) В хронической стадии заболевания установление этиологического агента более затруднено, однако и при хронической форме ГЭ, в отличие от ВЭ, все же удается выявить репродукцию вируса тем или иным методом, в том числе ПЦР (Протас И И , 2000)

С другой сторонь. нельзя исключать возможность объяснения результатов ПЦР диагностики ВПГ тем что иммунную реакцию в мозге больных ВЭ вызывает неизвестный вирус, имеющий сходную с вирусом простого герпеса антигенную структуру Однако попытки обнаружить ранее вирусный агент у больных ВЭ с помощью вирусологических, микробиологических методов также оказывались

1 2 3456789

безуспешными (Сарманова ЕС с соав, 1960, Караванов АС с соав, 1985; Гайдушек Д К с соав , 2000) В мозге больных ВЭ методом электронной микроскопии не выявляются вирусы или вирусные частицы (McLean, С A et а!, 1997) По нашему мнению феномен обнаружения специфической иммунореактивности в мозге больных ВЭ при отсутствии активной репродукции вируса может свидетельствовать о том, что интратекальный иммунный ответ в хронической стадии заболевания направлен не против чужеродного агента а против собственных клеток По данным ряда авторов интратекальный иммунный ответ при хронических воспалительных заболеваниях в отсутствии вируса может развиваться в форме полиспецифического иммунного ответа тогда, когда какой-либо микроорганизм или антиген, вызывая ч иммунный ответ, активирует продукцию антител разной специфичности, в том числе аутоантител (Reiber Н , et а!, 1998, 2001 Sindic С J М et а', 2001) Роль ВПГ или вируса, сходного с ним, при ВЭ может заключаться в инициировании патологического иммунного ответа, который является одним из важных механизмов, определяющих патогенез хронической формы ВЭ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема ВЭ является одной из актуальных и социально значимых в Якутии в силу ранней инвалидизации больных и высокой летальности среди коренного населения в очагах ВЭ Сложность ситуации по изучению заболевания связана с небольшим количеством больных, которые проживают в отдаленных селениях значительной части территории Республики Саха (Якутия) Неясность в вопросах этиологии и патогенеза ВЭ обуславливают трудности в разработке методов лабораторной диагностики и специфического лечения Исследование участия локальной иммунной системы в развитии патологического процесса в ЦНС при ВЭ в настоящее время является одним из перспективных направлений изучения патогенеза хронической формы заболевания В наших исследованиях впервые у больных с клинически достоверным диагнозом в 100% случаев установлено развитие интратекального гуморального иммунного ответа В контрольной группе больных с другими неврологическими заболеваниями из того же региона, что и больные ВЭ, интратекальный синтез IgG обнаруживается у 20% обследованных лиц Анализ зависимости выявления интратекального синтеза олигоклональных IgG от клинических характеристик заболевания показывает, что интратекальный иммунный ответ при ВЭ развивается в подострой и хронических стадиях и может наблюдаться при большой длительности заболевания, при этом он не является остаточным

ответом после перенесенного острого заболевания Локальный иммунный ответ может наблюдаться при многих воспалительных заболеваниях ЦНС, таких как, рассеянный склероз, подострый скперозирующий панэнцефалит, нейроборрелиоз, герпетический энцефалит и других (McLean В N et al, 1990; Thompson Е J and Keir G , 1990, Andersson A etal, 1994) В патогенезе этих заболеваний интратекальный синтез IgG отражает не только иммунный ответ на чужеродный антиген, но и развитие аутоиммунной полиспецифической реакции

При анализе специфичности олигоклональных IgG к антигенам вирусов простого герпеса 1 и 2 типа, Varicella zoster и Cytomegalovirus методом иммуноблоттинга была установлена иммунореактивность к антигенам вируса простого герпеса 1, 2 типа, которая была выявлена у 70,6% больных с достоверным диагнозом ВЭ. Данный факт свидетельствует о возможности участия герпетической инфекции в патогенезе ВЭ. При этом попытки выявить ДНК ВПГ методом ПЦР в крови, ЦСЖ и тканях мозга больных ВЭ дали отрицательный результат Однако участие этого вируса или сходного с ним в патогенезе заболевания не исключается По нашему мнению участие ВПГ в патогенезе ВЭ может заключаться в инициировании локального иммунного ответа, который при хронической стадии заболевания приобретает характер полиспецифической аутоиммунной реакции и персистирует в течение долгого времени. Следует отметить, что развитие аутоиммунной реакции при ВЭ были показаны ранее другими авторами (Аутеншлюс А И. с соав, 1996; Шатунов АЮ, 1999) Однако причина и механизм развития аутоиммунной реакции при ВЭ до сих пор оставались неясными. Учитывая, что герпетическая инфекция ЦНС может иметь различное течение в зависимости от состояния иммунитета больного (Price R etal, 1973, Fodor PA etal, 1998), одним из звеньев патогенеза ВЭ, вероятно, может являться генетическая предрасположенность иммунного статуса больных ВЭ к развитию аутоиммунного процесса в ЦНС при инфицировании герпесвирусом

Полученные в ходе работы результаты имеют важное практическое значение Выявление олигоклональных IgG в ЦСЖ может использоваться в качестве лабораторного теста для дифференцирования ВЭ от невоспалительных хронических неврологических заболеваний и верификации диагноза ВЭ в сомнительных случаях.

ВЫВОДЫ

1 У больных хронической и подострой формами ВЭ методом изоэлектрофокусирования с иммуноблоттингом показано развитие интратекального синтеза олигоклональных иммуноглобулинов класса G.

2. Олигоклональные IgG в ЦСЖ наблюдаются у больных с достоверным диагнозом ВЭ в 100% случаев, в то время как у больных с вероятным диагнозом ВЭ в 37,5%.

3 Выявление олигоклональных IgG не зависит от продолжительности, возраста начала и типа течения заболевания Интратекальный синтез может наблюдаться при длительности заболевания до 29 лет как при наличии острого периода в начале заболевания, так и при постепенном развитии хронической формы ВЭ

4 Установлена иммунореактивность олигоклональных IgG к антигенам вируса Herpes Simplex 1 и 2 типа у 70,6% больных с достоверным диагнозом ВЭ, при этом иммунореактивность к антигенам вирусов Varicella zoster и Cytomegalovirus в ЦСЖ больных ВЭ не выявлена.

5 Показано отсутствие репликации ДНК вируса Herpes Simplex 1 и 2 типа в клетках крови, ЦСЖ и тканях мозга больных хронической и подострой формами ВЭ.

6 Метод изоэлектрофокусирования с иммуноблоттингом имеет высокую степень чувствительности (100%) и специфичности (80%) среди больных с различными неврологическими заболеваниями, проживающих в Якутии и может служить в качестве лабораторного теста для диагностики ВЭ в комплексе с клиническими данными.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Осаковский В Л К вопросу патогенеза вилюйского энцефаломиелита / В Л Осаковский, Т М Сивцева // Проблемы вилюйского энцефаломиелита, нейродегенеративных и наследственных заболеваний нервной системы Тез докл II Междунар науч.-практ конф - Якутск, 2000 - С 61-65. Вирус простого герпеса и вилюйский энцефаломиелит / В Л Осаковский, Т М Сивцева, А Грин, Л Г Гольдфарб//Неврология-Иммунология Мат 10-й конф «Нейроиммунология» - СПб., 2001. - С. 208-208

Сивцева Т М Выявление олигоклональных иммуноглобулинов в спинномозговой жидкости как лабораторный тест в диагностике заболеваний нервной системы / Т М Сивцева, В Л Осаковский // Актуальные проблемы клинической неврологии Тез докл Республ науч-практ конф. - Якутск, 2001 - С.28-29

Обнаружение герпесвирусного антигена в спинномозговой жидкости больных вилюйским энцефаломиелитом I В Л. Осаковский, Т М Сивцева, А П Данилова, В А Владимирцев // Достижения и перспективы медицинской науки в Республике Саха (Якутия)' Мат. науч.-практ конф, посвящ. 5-летию Института здоровья - Якутск, 2002 - С 53-54

Осаковский В Л Сравнение нозологических форм хронического герпетического и вилюйского энцефалитов / В Л Осаковский, Т М Сивцева II Наука и образование.-2002. - №1 (25) - С 77-81.

Интратекальный синтез иммуноглобулина G, специфичного к антигенам Herpes Simplex 1 и 2 типов, у больных с хронической формой вилюйского энцефаломиелита / Т.М Сивцева, А Грин, В Л Осаковский и др // Иммунология. - 2002. - №5 - С.303-305

Сивцева Т.М. Ценность метода определения подоболочечного IgG синтеза в лабораторной диагностике вилюйского энцефаломиелита / Т.М. Сивцева, А П Данилова, В А Владимирцев // Сибирь-Восток - 2003 - №3. - С. 16-22. Сивцева Т М Иммунологический компонент патогенеза вилюйского энцефаломиелита IТ М. Сивцева, В Л Осаковский, А П Данилова II Тез докл 10-го Российско-Японского международного медицинского симпозиума «Якутия - 2003». - Якутск, 2003. - С 248-249.

Viliuisk encephalomyelitis' intrathecal synthesis of oligoclonal IgG / A J E. Green, T.M. Sivtceva, A P Danilova et al //Journal of the Neurological Sciences. - 2003 -№212 -P 69-73

СИВЦЕВА Татьяна Михайловна (Россия)

«Интратекальный иммунный ответ и его роль в патогенезе хронической

формы вилюйского энцефаломиелита»

В диссертации представлены результаты комплексных исследований интратекального синтеза иммуноглобулинов класса G у больных хронической и подострой формами вилюйского энцефаломиелита На основании исследований клонального спектра иммуноглобулинов класса G методом изоэлектрофокусирования с иммуноблоттингом показано, что у больных с достоверным диагнозом ВЭ в 100% случаев выявляется интратекальный синтез олигоклональных -fgG С помощью анализа специфичности к антигенам нескольких нейротропных вирусов установлено что интратекально синтезированные иммуноглобулины проявляют иммунореактивность к антигенам вируса простого герпеса 1 и 2 типа у 70,6% больных с достоверным диагнозом ВЭ При этом репликация вируса простого герпеса 1 и 2 типа у этих же больных не выявляется Полученные данные свидетельствуют о значительной роли локальной гуморальной иммунной реакции в патогенезе хронической формы ВЭ Показано, что метод изоэлектрофокусирования с иммуноблоттингом имеет высокую степень чувствительности (100%) и специфичности (80%) при исследовании больных ВЭ и может использоваться в качестве лабораторного теста в комплексе с клиническими данными для диагностики ВЭ

SIVTSEVA Tatiana (RUSSIA)

«Intrathecal immune response and its role in pathogenesis of viliulsk encephalomyelitis».

Results of complex investigation of intrathecal synthesis of oligoclonal IgG in patients with chronic and subacute forms of viliuisk encephalomyelitis are presented in this Ph D thesis We established for the first time that 100% of patients with definite VE show evidence for intrathecal IgG synthesis correlating with the clinical manifestations of the disease Analysis of virus specific antigens associated with oligoclonal IgG shows that in 70,6% of patients with definite viliuisk encephalomyelitis intrathecally sinthesed IgG reacted strongly and exclusively with Herpes Simplex -1, 2 But DNA replication of Herpes Simplex -1, 2 in this patients was not observed Results indicates that local gumoral immune response is the important part of pathogenesis of chronic form of viliuisk encephalomyelitis Test of intrathecal synthesis of oligoclonal IgG may be helpful for VE diagnosis since a high level of sensibility (100%) and specificity (80%).

Список использованных сокращений

АН РС (Я) - Академия наук Республики Саха (Якутия)

ВПГ - вирус простого герпеса,

ВЭ - вилюйский энцефаломиелит,

ГЭ - герпетический энцефалит;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота,

НИИ - научно-исследовательский институт,

ОП - олигокпональные полосы,

пн- пара нуклеотидов,

ПЦР - полимеразная цепная реакция,

УФ - ультрафиолетовый свет;

ЦНС - центральная нервная система,

ЦСЖ - цереброспинальная жидкость,

1дв - иммуноглобулины класса в

Подписано в печать 30 09.2004. Формат 60х 84/16. Бумага тип. №2 Гарнитура «Тайме». Печать офсетная.

Печ. л. 1,5. Уч.-изд. л. 1,87. Тираж 100 экз. Заказ /'4" Издательство ЯГУ, 677891, г. Якутск, ул Белинского, 58

Отпечатано в типографии издательства ЯГУ

»-6695

РНБ Русский фонд

2006-4 5541

Актуальность проблемы

Изучение вилюйского энцефаломиелита (ВЭ) началось с 50-х гг. ХХ-го века с признанием нозологической самостоятельности заболевания (Шаповал А.Н., Сарманова Е.С., 1955; Шаповал А.Н., 1956, 1959). По клиническим и патоморфологическим признакам ВЭ представляет собой хроническую прогрессирующую дегенерацию центральной нервной системы (ЦНС) с продолжительным клиническим течением (Петров П.А., 1964, 1987; Владимирцев А.И., 1964; Авцын А.П. с соав., 1983; Тазлова Р.С., 1982; Владимирцев В.А., 2000, 2003; Goldfarb L.G., Gajdusek D.C., 1992; Masters С. A. et.al., 1996). Отличительной чертой заболевания является этническая избирательность, ВЭ поражает только коренное население Республики Саха (Якутия): якутов, реже эвенков и эвенов. По данным Института здоровья Академии наук Республики Саха (Якутия) в 2002 г. на учете с диагнозом ВЭ состояло 192 человека. В среднем по Республике заболеваемость ВЭ составляет 5 человек на 10 тыс. коренного населения.

Актуальность проблемы ВЭ связана с особой тяжестью поражения ЦНС, приводящей к инвалидности с существенной или полной утратой физических и умственных способностей или смерти больного, распространением по территории Республики Саха (Якутия) в районы ранее свободные от ВЭ и отсутствием методов специфического лечения и профилактики заболевания. Сложность ситуации усугубляется тем, что большинство больных проживает в сельской местности, небольших отдаленных поселках, что затрудняет своевременную диагностику и учет пациентов.

Природа заболевания до сих пор не известна. Несмотря на особенности клинического течения, свидетельствующие об инфекционной природе ВЭ, не удается выявить этиологический агент заболевания (Сарманова Е.С. с соав., 1960; Караванов А.С. с соав., 1985, 1996; Goldfarb L.G., Gajdusek D.K., 1992; Янагихара Р. с соав., 2000). Роль наследственных и экологических факторов в происхождении ВЭ также остается неясной (Зубри Г.Л. с соав., 1977; Гольдфарб Л.Г. с соав., 1979; Макаров В.Н., Алексеев В.П., 1996; Фефелова В.В. с соав., 1996). Неопределенность в вопросах этиологии и патогенеза ВЭ обусловливает трудности в разработке методов лабораторной диагностики заболевания.

В настоящее время большое внимание уделяется изучению иммунологического компонента патогенеза ВЭ. У больных хронической формой ВЭ выявлен дефицит Т-клеточного звена при сохранении поликлональной продукции иммуноглобулинов в сыворотке крови и нарушение функций интерфероногенеза и фагоцитоза лейкоцитов (Дубов А.В. с соав., 1991, 1995; Ганкина Н.Ю. с соав., 1992; Кононова С.К. с соав., 1996). В некоторых работах высказывается мнение о важной роли аутоиммунных реакций в патогенезе ВЭ (Тазлова Р.С., 1968; Аутеншлюс А.И. с соав., 1996; Осаковский В.Л., 1996; Шатунов А.Ю., 1999). Однако многие вопросы участия иммунной системы в развитии патологического процесса в мозге больных ВЭ остаются неясными. В связи с тем, что ВЭ характеризуется поражением ЦНС, важным аспектом изучения патогенеза заболевания является исследование особенностей интратекального, т.е. локального на уровне ЦНС, иммунного ответа и его специфичности. В настоящее время развитие методов анализа иммуноглобулинов цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) позволяет с высоким уровнем чувствительносыти выявлять локальный синтез IgG при воспалительных заболеваниях ЦНС (McLean B.N. et.al., 1990; Thompson E.J. and Keir G., 1990; Andersson A. et.al., 1994). Подобные исследования имеют и большое практическое значение, т.к. анализ локально синтезированных иммуноглобулинов

ЦСЖ может быть использован в разработке методов лабораторной диагностики ВЭ.

Цель работы. Раскрыть роль локальных иммунных реакций на уровне ЦНС в патогенезе хронической формы вилюйского энцефаломиелита и на этой основе обосновать принципы дифференциальной диагностики ВЭ с заболеваниями нервной системы невоспалительной природы. Задачи исследования

1. Выявить у больных хронической формой ВЭ интратекальный синтез IgG на основе анализа клонального спектра иммуноглобулина G в ЦСЖ и сыворотке крови.

2. Изучить взаимосвязь между выявлением интратекального синтеза IgG и рядом клинических характеристик заболевания ВЭ (продолжительность, наличие острого периода, возраст начала заболевания).

3. Исследовать специфичность интратекально синтезированных IgG у больных ВЭ к вирусным антигенам.

4. Выявить у больных ВЭ присутствие вируса, к антигенам которого проявляют специфичность интратекально синтезированные IgG.

5. Оценить возможность использования метода изоэлектрофокусирования с иммуноблоттингом для лабораторной диагностики ВЭ.

Научная новизна

Впервые показано участие локальных иммунных реакций гуморального типа на уровне мозга в патогенезе хронической формы ВЭ. Разработана схема развития локального иммунного ответа при ВЭ. С помощью анализа клонального спектра IgG в ЦСЖ и сыворотке крови установлено, что у больных подострой и хронической формами ВЭ развивается интратекальный синтез олигоклональных IgG. Оценка взаимосвязи между выявлением интратекального синтеза олигоклональных IgG и рядом клинических характеристик заболевания ВЭ выявило, что интратекальный гуморальный иммунный ответ обнаруживается у больных ВЭ вне зависимости от длительности заболевания (от 3 до 29 лет) и наличия острого периода.

Анализ антигенной специфичности олигоклональных IgG впервые выявил у больных ВЭ интратекальный синтез антител, специфичных к антигенам вируса простого герпеса (ВПГ) или Herpes Simplex 1 и 2 типа, что позволяет предположить участие вирусов семейства Herpesviridae в инициировании локального иммунного ответа при ВЭ. Установлено, что интратекальная иммунореактивность при ВЭ не связана с репродукцией ДНК вируса простого герпеса в клетках биологических жидкостей и тканях мозга больных ВЭ, что свидетельствует о латентной форме вирусной инфекции, при которой зараженная клетка становится мишенью для разрушающего действия иммунной системы по причине изменения антигенной специфичности клеточной мембраны.

Практическая значимость работы

Патогенетически обоснованы принципы дифференциальной диагностики ВЭ и хронических невоспалительных заболеваний ЦНС. В отличие от заболеваний ЦНС невоспалительной природы при ВЭ методом изоэлектрофокусирования с иммуноблоттингом обнаруживается интратекальный синтез олигоклональных IgG. Результаты исследования показывают, что метод изоэлектрофокусирования с иммуноблоттингом имеет высокую степень чувствительности (100%) и специфичности (80%) при исследовании больных ВЭ и может использоваться в качестве лабораторного теста в комплексе с клиническими данными для диагностики ВЭ.

Внедрение в практику здравоохранения

Впервые в практику клинического отделения Института здоровья Академии наук Республики Саха (Якутия), являющегося специализированным лечебно-профилактическим учреждением для больных ВЭ, внедрены два метода для лабораторной диагностики ВЭ: 1) изоэлектрофокусирование ЦСЖ и сыворотки крови и 2) диагностика вируса Herpes Simplex -1,2 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Важным звеном патогенеза хронической формы ВЭ является развитие локального иммунного ответа в пределах ЦНС, о чем свидетельствует интратекальный синтез IgG.

2. Интратекальный синтез IgG при ВЭ связан с иммунореактивностью к вирусу простого герпеса 1, 2 типа, при этом репликация ДНК этого вируса в клетках крови, ЦСЖ и тканях мозга больных ВЭ не выявляется.

3. Метод изоэлектрофокусирования с иммуноблоттингом имеет большое значение в верификации диагноза ВЭ в вероятных и сомнительных случаях для дифференцирования ВЭ от невоспалительных заболеваний ЦНС.

Апробация работы: Материалы диссертационной работы были изложены на клиническом семинаре Института здоровья АН PC (Я) (Якутск, 2000), 10-й научно-практической конференции

Нейроиммунология» (С-Петербург, 2001), на 3-й итоговой научно-практической конференции Белорусского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии (Минск, 2002), заседании республиканского общества неврологов (Якутск, 2002), на 10-м Российско-Японском международном медицинском симпозиуме «Якутия - 2003» (Якутск, 2003).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 9 научных работ. Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, трех глав (обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения), заключения, выводов и списка использованной литературы.

ВЫВОДЫ

1. У больных хронической и подострой формами ВЭ методом изоэлектрофокусирования с иммуноблоттингом показано развитие интратекального синтеза олигоклональных иммуноглобулинов класса G.

2. Олигоклональные IgG в ЦСЖ наблюдаются у больных с достоверным диагнозом ВЭ в 100% случаев, в то время как у больных с вероятным диагнозом ВЭ в 37,5%.

3. Выявление олигоклональных IgG не зависит от продолжительности, возраста начала и типа течения заболевания. Интратекальный синтез может наблюдаться при длительности заболевания до 29 лет как при наличии острого периода в начале заболевания, так и при постепенном развитии хронической формы ВЭ.

4. Установлена иммунореактивность олигоклональных IgG к антигенам вируса Herpes Simplex 1 и 2 типа у 70,6% больных с достоверным диагнозом ВЭ, при этом иммунореактивность к антигенам вирусов Varicella zoster и Cytomegalovirus в ЦСЖ больных ВЭ не выявлена.

5. Показано отсутствие репликации ДНК вируса Herpes Simplex 1 и 2 типа в клетках крови, ЦСЖ и тканях мозга больных хронической и подострой формами ВЭ.

6. Метод изоэлектрофокусирования с иммуноблоттингом имеет высокую степень чувствительности (100%) и специфичности (80%) среди больных с различными неврологическими заболеваниями, проживающих в Якутии и может служить в качестве лабораторного теста для диагностики ВЭ в комплексе с клиническими данными.

Автор выражает благодарность д-ру Р. Виллу, д-ру Р. Найту, д-ру А.Грин за предоставленную возможность стажировки для выполнения работ по изоэлектрофокусированию в лаборатории Национального центра исследования болезни Крейцфельда-Якоба в г. Эдинбурге (Великобритания).

Автор выражает благодарность врачам-неврологам Института здоровья АН PC (Я) к.м.н. Владимирцеву В.А., Даниловой А.П., руководителю отдела нейрогенетики Национального института неврологических заболеваний и расстройств Национальных институтов здоровья США д-ру Гольдфарбу Л.Г. за предоставление клинических данных.

Автор выражает благодарность профессору И.И. Протас, а также директору Белорусского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии профессору Л.П. Титову за приглашение выступить с докладом по данной работе и консультативную помощь освещения патогенеза герпетического энцефалита.

Часть работ выполнена с привлечением финансирования по гранту РФФИ № 01-04-96208.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проблема ВЭ является одной из актуальных и социально значимых в Якутии в силу ранней инвалидизации больных и высокой летальности среди коренного населения в очагах ВЭ. Сложность ситуации по изучению заболевания связана с небольшим количеством больных, которые, как правило, проживают в небольших селениях, расположенных в отдалении от крупных населенных пунктов, водных и сухопутных путей и разбросанных по обширной территории Республики Саха (Якутия).

Исследование патогенеза ВЭ тесно связано с разработкой многих теоретических аспектов проблемы патогенеза хронических заболеваний ЦНС, таких как рассеянный склероз, хронический герпетический энцефалит и других. В настоящее время значительную роль в развитии хронического воспалительного процесса в ЦНС отводят иммунологическим факторам, в частности важной составляющей патологического процесса в мозге больных хроническими инфекционными и аутоиммунными заболеваниями нервной системы является интратекальный гуморальный иммунный ответ. Существует несколько методических подходов к исследованию иммунного ответа, ограниченного оболочками мозга. Основной задачей этих методов является выявление интратекального синтеза иммуноглобулинов, при этом обязательным условием является демонстрация локального характера иммунного ответа. Тест также должен обладать достаточно высоким уровнем чувствительности. Этим требованиям отвечает метод изоэлектрофокусирования с иммуноблоттингом, который был использован нами для анализа иммуноглобулинов класса G ЦСЖ больных с хронической формой ВЭ. В результате нами было выявлено наличие у больных ВЭ олигоклональных полос IgG в ЦСЖ и отсутствие синтеза IgG в периферической крови. Полученные данные впервые установили у больных хронической и подострой формами ВЭ развитие гуморального иммунного ответа, имеющего локальный характер. Сравнение с группой контроля, в которую вошли больные с другими неврологическими заболеваниями, распространенными в Якутии, показало, что частота выявления интратекального синтеза IgG у больных ВЭ статистически значимо выше (р<0,0001).

Исследование взаимосвязи выявления интратекального синтеза IgG с клиническими характеристиками ВЭ показано, что олигоклональные IgG в ЦСЖ выявляются у больных с клинически достоверным диагнозом ВЭ в 100%, тогда как у больных с вероятным диагнозом ВЭ - в 37,5% случаев. У больных с возможным диагнозом олигоклональные полосы не обнаружены, что позволило исключить воспалительное заболевание и соответственно диагноз ВЭ в этих случаях. Таким образом, показана возможность использования метода изоэлектрофокусирования с иммуноблоттингом для дифференциальной диагностики ВЭ с невоспалительными заболеваниями ЦНС. На основе этого метода разработан и внедрен в практику стационара Института здоровья АН PC (Я) лабораторный тест для диагностики хронической формы ВЭ. Оценка чувствительности и специфичности метода показала, что тест имеет 100% чувствительность и 80% специфичность.

Анализ клинических характеристик больных ВЭ, имеющих олигоклональные IgG, показал, что интратекальный иммунный ответ при ВЭ сохраняется при длительности заболевания свыше 20 лет и не зависит от наличия острого периода в начале заболевания. Полученные данные свидетельствуют о длительном сохранении синтеза олигоклональных антител в мозге больных при хронической форме ВЭ. Однако факторы, поддерживающие продукцию антител, остаются неизвестными.

Для выявления антигенной специфичности интратекально синтезируемых IgG у больных ВЭ был проведен иммуноблоттинг олигоклональных иммуноглобулинов ЦСЖ с антигенами трех вирусов

Herpes Simplex -1,2, Varicella zoster и Cytomegalovirus. Показано, что олигоклональные полосы IgG у больных ВЭ проявляют иммунореактивность только к антигенам Herpes Simplex -1,2, которая была выявлена у 70,6% больных с достоверным диагнозом ВЭ. Данный факт свидетельствует о возможном участии вируса Herpes Simplex -1,2, либо неизвестного вируса, антигены которого схожи с антигенами Herpes Simplex -1, 2, в инициировании интратекального синтеза IgG при ВЭ.

Для подтверждения возможности участия герпетической инфекции в патогенезе ВЭ нами была предпринята попытка выявить ДНК Herpes Simplex - 1, 2 в крови, ЦСЖ и тканях мозга больных ВЭ методом ПЦР. Установлено, что репликация ДНК вируса Herpes Simplex - 1, 2 у больных ВЭ с продолжительностью заболевания свыше 3 лет не обнаруживается. Однако не исключаются иные, чем при герпетическом энцефалите, механизмы участия этого вируса или сходного с ним в патогенезе заболевания.

Сравнительный анализ патогенетических особенностей хронических форм ВЭ и ГЭ показывает, что при ВЭ в отличие от ГЭ иммунореактивность к антигенам ВПГ развивается и поддерживается длительное время в отсутствии репродукции самого вируса. При этом больные имеют прогрессирующие течение заболевания и интратекальный иммунный ответ, вероятно, не является остаточным явлением после перенесенной острой инфекции, а скорее отражает феномен полиспецифического иммунного ответа. Полиспецифический гуморальный ответ при хронических воспалительных процессах возникает, когда какой-либо микроорганизм или антиген, вызывая иммунный ответ, активирует продукцию антител разной специфичности, в том числе аутоантител.

Следует отметить, что развитие аутоиммунной реакции при ВЭ была ранее показано при исследовании уровня мозгоспецифических антител в крови [88]. Однако механизм развития аутоиммунитета при ВЭ до сих пор оставался неясным. Основываясь на выявлении факта интратекального синтеза IgG, специфичных к ВПГ, можно предположить, что ВПГ или неизвестный вирус, сходный с ним по антигенной структуре, инфицирует клетки мозга больных ВЭ и вызывает локальный иммунный ответ. В дальнейшем вирус-инициатор иммунного ответа элининируется, вследствие чего не удается обнаружить признаки его репродукции у больных ВЭ. Вследствие неизвестных в настоящее время механизмов реакция иммунной системы в хронической стадии ВЭ, приобретая характер полиспецифического аутоиммунного ответа, персистирует в течение долгого времени. По литературным данным герпетическая инфекция ЦНС может иметь различные клинические проявления в зависимости от состояния иммунной системы больного [111, 95]. Проблема патогенеза ВЭ, вероятно, заключается в генетически обусловленных особенностях иммунного статуса больных ВЭ, при которых ВПГ может вызывать иммунопатологический процесс аутоиммунного характера. В условиях генетической предрасположенности иммунный ответ в ЦНС больных ВЭ продолжается и в отсутствии вирусного агента, приобретая в хронической стадии заболевания полиспецифический аутоиммунный характер. На основе этих данных нами разработана концептуальная схема участия локальных иммунных реакций в патогенезе хронической формы ВЭ (рис. 10).

Выявление интратекального синтеза IgG существенно меняет представление о патогенезе ВЭ. Впервые показано, что локальная иммунная реакция является важным звеном патогенеза хронической формы ВЭ. Если ранее основной версией этиологии ВЭ считалась вирусная инфекция, в настоящее время большее внимание уделяется роли иммунных механизмов в развитии заболевания.

Рис. 10. Концептуальная схема участия локальных иммунных реакций в патогенезе хронической формы ВЭ.

Полученные в ходе работы результаты также имеют важное практическое значение. Выявление олигоклональных IgG в ЦСЖ может использоваться в качестве лабораторного теста для дифференцирования ВЭ от невоспалительных хронических неврологических заболеваний. Следует отметить, что до сих пор лабораторного метода диагностики ВЭ не существовало, что затрудняло установление объективного диагноза ВЭ в клинической практике.

Для дальнейших исследований роли локального гуморального иммунного ответа в патогенезе ВЭ являются необходимыми поиски антигенов - мишеней и изучение генетической предрасположенности необходимого условия развития патологической иммунной реакции.

87