Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Интратекальный синтез иммуноглобулинов и дисфункциональные нарушения гематоэнцефалического/гематоликворного барьера при сифилитической инфекции

На правах рукописи

Пономарева Марина Владиславовна

ИНТРАТЕКАЛЬНЫЙ СИНТЕЗ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

И ДИСФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ НАРУШЕНИЯ ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКОГО/ГЕМАТОЛИКВОРНОГО БАРЬЕРА ПРИ СИФИЛИТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология (биологические науки)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 АПР 2014

Челябинск-2014

005547106

Работа выполнена в научном клиническом отделе сифилидологии и инфекций, передаваемых половым путем, и в научном экспериментально-лабораторном отделе Федерального государственного бюджетного учреждения «Уральский научно-исследовательский институт дерматовенерологии и иммунопатологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель кандидат медицинских наук Левчик Надежда Константиновна

Научный консультант доктор медицинских наук Зильберберг Наталья Владимировна

Официальные оппоненты

Базарный Владимир Викторович - доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра клинической лабораторной и микробиологической диагностики, профессор

Новиков Юрий Александрович - доктор медицинских наук, доцент, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра дерматовенерологии и косметологии, профессор

Ведущая организация

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской академии наук

Защита диссертации состоится «28» мая 2014 года в_часов на заседании Диссертационного

совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, на сайте www.chelsma.ru

Автореферат разослан «_»__2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, доцент

Шишкова Юлия Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Сифилитическое поражение центральной нервной системы (ЦНС) является частой причиной инвалидизирующих форм неврологических, психических, офтальмологических, слуховых, вестибулярных и других нарушений. Несмотря на значительное снижение заболеваемости сифилисом в Российской Федерации, по данным государственной статистической отчетности за последнее десятилетие (2002-2011 гг) количество зарегистрированных случаев нейросифилиса увеличилось в 2,1 раза (с 471 до 987 случаев). При этом результаты анализа качества лабораторной диагностики нейросифилиса позволяют предположить значительное превышение реальной распространенности нейросифилиса над официально зарегистрированной (Катунин, Г.Л. и др. Анализ заболеваемости и качества лабораторной диагностики нейросифилиса в Российской Федерации // Вестн. дерматол. и венерол. 2011. №3. С. 18-26.). Широкое применение антибактериальных препаратов привело к увеличению частоты случаев нейросифилиса с маловыраженной и неспецифической клинической симптоматикой, при которых диагноз основывается только на результатах анализа цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) (Красносельских, Т. В., Соколовский, Е. В. Нейросифилис: нерешенные проблемы и невыученные уроки (часть 1) // Современные проблемы дерматовенерологии, иммунологии и врачебной косметологии. 2011. № 5. С. 5-11.; Ghanem, K G. Neurosyphilis : a historical perspective and review // CNS Neuroscience and Therapeutics. 2010. № 16. P. 157-168.). В тоже время лабораторная верификация сифилитического поражения ЦНС до настоящего времени остается зоной общемировой полемики: констатируется явная недостаточная диагностическая точность имеющихся «классических» критериев (Красносельских, Т. В., Соколовский, Е. В. Нейросифилис: нерешенные проблемы ... С. 5-11.; Российское общество дерматовенерологов и косметологов. Ведение больных инфекциями, передаваемыми половым путем, и урогенительными инфекциями : клинические рекомендации. Сифилис // Москва. 2012. С. 34-68.; Ghanem, K.G. Neurosyphilis: A Historical Perspective and Review // CNS Neuroscience and Therapeutics. 2010. №16. P. 157-168.; Prange, H.W. Neurosyphilis. In: Sexually Transmitted Infections and Sexually Transmitted Diseases (Ed. Gross G, Tyring S.K.). Berlin.: Springer-Verlag, 2011. P. 163-171.), дополнительно предложенные критерии признаются требующими обоснований и пока не рекомендованы для широкого применения (Но, Е. L., Магга, С.М. Treponemal Tests for Neurosyphilis—Less Accurate Than What We Thought? // Sexually Transmitted Diseases. 2012. Vol. 39, № 4. P. 298 - 299.), появляются работы, подвергающие сомнению уже валидированные критерии (Harding, A. S., Ghanem, К. G. The Performance of Cerebrospinal Fluid Treponemal-Specific Antibody Tests in Neurosyphilis // A Systematic Review Sexually Transmitted Diseases. 2012. Vol. 39, №4. P. 291-297.).

В основе ликвородиагностики лежит детекция иммунного ответа в забарьерном пространстве ЦНС. На настоящий момент главным инструментом являются диагностические тесты, выявляющие присутствие в ЦСЖ сифилис-ассоциированных антител. Трудность

интерпретации результатов тестов и спорность критериев обусловлена возможностью двоякого происхождения детектируемых антител. Диагностическую значимость имеют только иммуноглобулины, синтезированные интратекально плазматическими клетками периваскулярных воспалительных инфильтратов в ЦНС. Однако теоретически существует вероятность, что высокое содержание в ЦСЖ иммуноглобулинов, происходящих из системного кровотока, способно имитировать интратекальный иммунный ответ. Это может быть следствием высокого уровня антител в крови и/или так называемой «дисфункции гематоэнцефалического/гематоликворного (ГЭБ/ГЛБ) барьера» (нарушение целостности ГЭБ/ГЛБ и/или расстройства циркуляции ЦСЖ). В литературе отсутствуют сведения об особенностях изменения иммуноглобулинового состава ЦСЖ вследствие влияния интратекального иммунного ответа и дисфункциональных нарушений ГЭБ/ГЛБ при сифилисе. _ Своевременная диагностика вовлечения ЦНС в инфекционный процесс при сифилисе имеет определяющее значение для благоприятного исхода заболевания и предупреждения развития осложнений. Поиск прогностических критериев нейросифилиса, основанных на исследовании периферической крови, является актуальным. Опубликованы данные, свидетельствующие о наличии связи между уровнем специфических антител в системном кровотоке и фактом установления диагноза «нейросифилис» (De Silva, Y. et al. The value of serum TPHA titres in selecting patients for lumbar puncture // Genitourin Med. 1991. № 67. P. 37-40.; Marra, С. M. et al.Cerebrospinal Fluid Abnormalities in Patients with Syphilis: Association with Clinical and Laboratory Features //The Journal of Infectious Diseases. 2004. № 189. P. 369-376.). Однако отсутствуют работы, посвященные особенностям иммуноглобулинового состава периферической крови больных сифилисом, ассоциированным с наличием интратекального гуморального иммунного ответа.

Установление закономерностей формирования иммуноглобулинового состава ЦСЖ и крови углубит понимание иммунного ответа при сифилитической инфекции и будет способствовать совершенствованию иммунодиагностики нейросифилиса.

Цель исследования: изучение интратекального синтеза иммуноглобулинов и дисфункции гематоэнцефалического/гематоликворного барьера как факторов влияния на иммуноглобулиновый состав цереброспинальной жидкости и выявление особенностей иммуноглобулинового состава крови, ассоциированных с наличием интратекального иммунного ответа, при сифилитической инфекции. Задачи исследования:

1. Охарактеризовать интратекальный синтез иммуноглобулинов и дисфункциональные нарушения гематоэнцефалического/гематоликворного барьера у серопозитивных по сифилису пациентов с подозрением на нейросифилис, и их особенности, ассоциированные с наличием в анамнезе противосифилитической терапии.

2. Определить влияние дисфункции гематоэнцефалического/гематоликворного барьера и интратекального синтеза иммуноглобулинов на количественный и качественный состав общих иммуноглобулинов в цереброспинальной жидкости.

3. Выявить особенности интратекального синтеза иммуноглобулинов, ассоциированные с активностью воспалительного заболевания центральной нервной системы.

4. Изучить взаимосвязь между выявлением интратекального синтеза иммуноглобулинов и дисфункции гематоэнцефалического/гематоликворного барьера и результатами диагностических тестов, рекомендованными в качестве критериев подтверждения/исключения диагноза «нейросифилис».

5. Исследовать взаимосвязь между пулами иммуноглобулинов системного кровотока и цереброспинальной жидкости, выявить особенности иммуноглобулинового состава крови, ассоциированные с наличием интратекального синтеза иммуноглобулинов.

Работа выполнена в рамках НИР ФГБУ «Уральский научно-исследовательский институт дерматовенерологии и иммунопатологии» Минздрава России (номер гос. регистрации 01201371572).

Методология и методы исследования. В работе применен комплекс иммунологических и общеклинических методов исследования цереброспинальной жидкости и крови при сифилитической инфекции.

Исследование проведено в соответствии с принципами доказательной медицины и одобрено Локальным этическим комитетом ФГБУ «УрНИИДВиИ» Минздарава России (протокол № 2 от 03.09.2010 г.)

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора. Достоверность результатов исследования обеспечена обоснованностью исходных теоретических позиций, достаточным количеством пациентов и формированием групп сравнения, использованием адекватных и апробированных лабораторных методов, соблюдением рекомендаций международного консенсуса неврологов и нейрохимиков для лабораторного исследования протеинов ЦСЖ (Reiber, H. et al. Quality assurance for cerebrospinal fluid protein analysis: international consensus by an Internet-based group discussion // Clin Chem Lab Med. 2003. Vol. 41, № 3. P. 331-337.), использованием сертифицированных наборов реагентов, и применением современной компьютерной программы для статистической обработки полученных данных. О достоверности полученных результатов также свидетельствует их биологическая правдоподобность и непротиворечивость ранее проведенным исследованиям и наблюдениям, опубликованным в научной литературе.

Основные результаты работы доложены и обсуждены на XI Всероссийском съезде дерматовенерологов и косметологов (Екатеринбург, 2010 г.), региональной междисциплинарной научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии» (Челябинск, 2010 г.), IX конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2011 г.), межрегиональной научно-практической конференции «Современные проблемы дерматовенерологии. Качество и доступность специализированной медицинской помощи» (Екатеринбург, 2011 г.), XII (Москва, 2012 г.) Всероссийском съезде дерматовенерологов и косметологов, региональной междисциплинарной научно-практической конференции

«Дерматология: вопросы повышения качества и доступности специализированной медицинской помощи» (Екатеринбург, 2013 г.).

Автором лично проведен научно-информационный поиск, заполнены оригинальные анкеты на основании анализа историй болезни пациентов, создан банк биологических образцов (ЦСЖ, сыворотка крови) пациентов. Семьдесят семь процентов лабораторных исследований выполнены автором лично. Статистический анализ и оценка результатов, написание глав диссертации выполнены лично автором, публикации по материалам диссертации подготовлены в соавторстве.

Положения, выносимые на защиту

Интратекальный синтез иммуноглобулинов при сифилитической инфекции характеризуется разнообразием изотопических вариантов с тенденцией к более низко-распространенности продуцирования иммуноглобулинов 04, редкой встречаемости изолированного синтеза иммуноглобулинов А и рестрикции изотопического спектра под влиянием специфической терапии.

При сифилитической инфекции интратекальный иммунный ответ оказывает существенно более значимое влияние на содержание иммуноглобулинов в цереброспинальной жидкости в сравнении с дисфункциональными нарушениями гематоэнцефалического/ гематоликворного барьера, которые характеризуются преобладанием форм незначимой, легкой и умеренной степени выраженности.

Интратекальный синтез иммуноглобулинов, ассоциированный с активным воспалительным процессом в центральной нервной системе, отличается более высокой частотой синтеза иммуноглобулинов М и большей интенсивностью синтеза иммуноглобулинов 03, в2 и в1.

Современные лабораторные критерии диагностики нейросифилиса являются различными инструментами оценки интратекального гуморального иммунного ответа: результаты тестов, подтверждающие диагноз «нейросифилис», ассоциированы с наличием признаков интратекального синтеза иммуноглобулинов, а результаты тестов, исключающие нейросифилис - с их отсутствием.

Интратекальный гуморальный иммунный ответ ассоциирован с высоким уровнем реагиновых и трепонемаспецифичных антител в системном кровотоке; содержание трепонемаспецифичных антител в крови в количестве превышающим титр реакции пассивной гемагглютинации 1:40960, может рассматриваться в качестве дополнительного прогностического критерия наличия поражения центральной нервной системы при сифилисе.

Научная новизна исследования

Впервые показана значительная изотипическая вариабельность интратекального гуморального иммунного ответа при сифилисе с более низкой вероятностью синтеза и редкой встречаемостью изолированного синтеза 1дА. Установлено, что интратекальный синтез иммуноглобулинов у пациентов, получавших терапию по поводу неневрологического сифилиса, отличается более узким спектром интратекально-синтезируемых изотопов.

Показано, что нарушения функционального состояния ГЭБ/ГЛБ при сифилисе носят невыраженный характер, с преобладанием дисфункций незначимой, легкой и умеренной степени выраженности.

Впервые представлены данные, свидетельствующие о том, что содержание иммуноглобулинов в ЦСЖ значительно возрастает в результате их интратекального синтеза (особенно класса М) и умеренно увеличивается при дисфункции ГЭБ/ГЛБ.

Впервые показано, что при активной воспалительной реакции в ЦНС у серопозитивных по сифилису пациентов наблюдается повышенная частота интратекального синтеза 1§М и значительное возрастание интенсивности интратекального синтеза 1§03, ^02 и ^О1.

Впервые доказано, что наличие в ЦСЖ детектируемого количества реагиновых антител и высокой концешрации трепонемаспецифических антител ассоциировано с интратекальным гуморальным иммунным ответом и маловероятно в его отсутствие и при изолированной дисфункции ГЭБ/ГЛБ.

Впервые продемонстрировано, что интратекальный гуморальный иммунный ответ при сифилитической инфекции ассоциирован с более высоким содержанием реагиновых и трепонемаспецифичных антител в системном кровотоке.

Теоретическая и практическая значимость работы. Проведенные исследования позволили расширить представление об интратекалыюм иммунном ответе и нарушении функционального состояния ГЭБ/ГЛБ при сифилисе, установить закономерности изменения качественного и количественного состава иммуноглобулинов ЦСЖ в результате интратекального синтеза иммуноглобулинов и нарушенной функции ГЭБ/ГЛБ и выявить связь между интратекальным гуморальным иммунным ответом и содержанием общих и сифилис-ассоциированных аитител в системном кровотоке. Полученные данные позволили уточнить иммунобиологическую основу существующих лабораторных критериев диагностики и прогнозирования нейросифилиса, привести аргументацию в отношении дискутабельных диагностических критериев и предложить новые прогностические критерии для дополнительного обоснования диагностической пункции (патент на изобретение №2449286, заявка на патент №2013131721).

Полученные данные могут быть использованы в работе клинико-диагностических лабораторий и отделений венерологии, неврологии, психиатрии лечебных учреждений, а также в процессе последипломной подготовки врачей-дерматовенерологов, неврологов и врачей клинической лабораторной диагностики

Внедрение результатов исследования в практику: результаты исследования внедрены в практику работы ФГБУ «Уральский научно-исследовательский институт дерматовенерологии и иммунопатологии» Минздрава России. Результаты работы включены в лекционный курс факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов по специальности «Дерматовенерология» ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, лекционный курс кафедры дерматовенерологии ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. академика Е.А. Вагнера» Минздрава России.

Публикации. Автор имеет 18 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликованы 9 научных работ общим объемом 1,7 печатных страниц, из них 6 статей в научных изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Минобрнауки России (5 статей в российских журналах, 1 статья в зарубежном научном журнале), 2 работы опубликованы в материалах всероссийского съезда и междисциплинарной научно-практической конференции, получен 1 патент на изобретение № 2449286 от 27.04.2012, оформлена заявка на изобретение № 2013131721 от 27.07.2013 года.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 133 страницах, содержит 26 таблиц и 2 рисунка, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 145 источников (52v отечественных и 93 зарубежных авторов).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

Проведенное научное исследование является: обсервационным аналитическим кросс-секционным.

Характеристика обследованных пациентов.

В исследование включались серопозитивные по сифилису пациенты, подвергшиеся люмбальной пункции в отделении венерологии клиники ФГБУ «УрНИИДВиИ» Минздрава России в период с мая 2006 года по ноябрь 2011 года. Показаниями для проведения диагностической пункции являлись: неврологическая симптоматика при любых формах сифилиса; нелеченые поздние формы сифилиса; неуточненный сифилис; отсутствие положительной динамики нетрепонемных серологических тестов в рекомендуемые сроки наблюдения после специфической терапии; контроль лечения нейросифилиса. Все пациенты были проконсультированы неврологом и подписали информированное согласие. Парные образцы ЦСЖ и крови были собраны в один день. Часть ЦСЖ и сыворотки крови использовалась для проведения стандартных тестов, утвержденных приказами МЗ РФ для диагностики нейросифилиса, остатки образцов аликвотировались и хранились при температуре минус 80°С. После завершения процесса набора образцы ЦСЖ и крови были подвергнуты углубленному исследованию. Из 140 пациентов, удовлетворяющих критериям включения, четырнадцать были исключены из исследования по одной из следующих технических причин: контаминация с кровью образцов ЦСЖ (6 человек), не было получено образцов крови в день проведения спинномозговой пункции (5 человек) и малый объем образца ЦСЖ (3 человека).

Окончательный объем выборки составил 126 пациентов (73 мужчины и 53 женщины). Длительность заболевания пациентов превышала 5 лет. В основном это были пациенты (103 из 126, 82%) со специфической терапией в анамнезе, в том числе 15 пациентов имели в анамнезе указание на терапию высокими дозами пенициллина, предусмотренную для лечения нейросифилиса. Двадцать два из 23 пациентов с отсутствием специфической терапии в

анамнезе поступили с диагнозом «поздний скрытый сифилис» (А 52.8) или «сифилис неизвестной длительности» (А 53.0).

На наличие в анамнезе черепно-мозговой травмы указывало 25 человек, ишемического инсульта - 6 пациентов, эпилепсии -3 человека, туберкулеза - 3 человека, лайм-боррелиоза -7 человек. У 2 пациентов диагностирована ВИЧ-инфекция.

При неврологическом обследовании у 85 пациентов были обнаружены те или иные отклонения: нарушение зрения (19 пациентов), слуха (6), головные боли (21), цереброваскулярные (6), нейропсихиатрические (29) нарушения, поражение черепно-мозговых нервов (48), нарушения двигательной функции (24), сенсорные (5), координаторные (8) расстройства, шаткость походки (4).

Лабораторное исследование ЦСЖ и сыворотки крови.

Оценка интратекального синтеза иммуноглобулинов проводилась по методологии, предложенной Н. Reiber (Reiber, Н., Peter, J.B. Cerebrospinal fluid analysis: disease-related data patterns and evaluation programs // J Neurol Sci. 2001 . Vol. 184, №2. P. 101- 122), путем сравнения фактического коэффициента иммуноглобулинов (Qig) и расчетного предельного коэффициента иммуноглобулинов (Qlim), определяемого индивидуально для каждого пациента и отдельно для изотипов А, М, Gl, G2, G3, G4.

фактическая когаиЕтрацяя Is ЦСЖ (—}

Qlg =-——

фактическая коктетравнк lg t сывсрстке (—)

QlimOgC) = 0,93 ■ jQalb1 + 6 ■ 10"» - 1,7 ■ 1(Г3

QlimOgA) = 0,77 • J Qalb2 +23-10"' - 3.1 • 1СГ3

QlimOgU) = 0,67 ■ jQalb2 + 120 ■ 10"» - 7,1 ■ 10"3

Наличие интратекального синтеза иммуноглобулинов констатировали, если фактический коэффициент иммуноглобулинов данного изотипа превышал соотвествующий показатель, характеризующий предельный уровень диффузии (Qlg>Qlim).

Оценка интенсивности интратекального синтеза производилась путем расчета значений минимальной интратекально-синтезируемой фракции иммуноглобулинов в абсолютном (Igloc) и относительном (IgiF) значении:

Igloc (мг/л)= [Qlg-Qlim] • IgcwBopoTKa

lg,F(%)=[ Igloc /Iguc«] • 100%

Состояние ГЭБ/ГЛБ оценивалось с помощью коэффициента альбумина (Qalb), равного отношению концентрации альбумина в ЦСЖ (мг/л) к концентрации альбумина в сыворотке (мг/л). Значения Qalb, превышающие возрастные нормы [Qalb = (4 + возраст/15) * 10"3], были расценены как дисфункция ГЭБ/ГЛБ (Reiber, Н., Peter, J.B. Cerebrospinal fluid analysis... P. 120) При выявлении дисфункции ГЭБ/ГЛБ, величину Qalb (*10 3) дополнительно оценивали на основании критериев Schliepand-Felgenhauer (Christenson, R. et al. Interpretation of cerebrospinal fluid protein assays in various neurologic diseases // Clin. chem. 1983. Vol. 29, №. 6. P. 1028-1030.): Qalb lO5 менее 9,0 - несущественные нарушения, 9,0-14,3 - небольшие нарушения, 14,3-33,3 -умеренные нарушения, 33,3-100,0 - тяжелые нарушения; больше 100,0 - «катастрофическое повреждение», также для характеристики дисфункции использовали показатель величины

превышения индивидуального значения Qalb над возрастной нормой (%), равный [((2фактический-<Знорма)/С>норма].

Определение содержание альбумина проводили турбидиметрическим методом, общих иммуноглобулинов различных изотипов (Gl, G2, G3, G4, M, А,) - методом иммуноферментного анализа. Для повышения надежности и точности соотношения концентраций альбумина и иммуноглобулинов образцы ЦСЖ и сыворотки были проанализированы в рамках одной аналитической серии, подбирая соответствующее разведение биологических жидкостей.

Наличие трепонемаспецифических антител в ЦСЖ и сыворотке крови определяли в

тестах:

- иммуноферментного анализа (ИФА) - качественное определение антител класса G

- реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) - количественная оценка суммарных антител (результаты РПГА для образцов ЦСЖ считались положительными в разведении 1:4 и больше, для сыворотки крови 1:80 и больше);

- реакции иммунофлюоресценции в двух модификациях: с цельным ликвором (РИФц) и с абсорбцией антител к культуральным непатогенным трепонемам (штаммы V, VII, VIII, IX, Рейтера) (РИФабс) (положительными считались образцы, которые давали свечение интенсивностью больше 1+ (трепонемы окрашены чуть интенсивнее фона);

- реакции связывания комплемента (РСКт) (методика постановки реакции Вассермана с ЦСЖ (О совершенствовании серологической диагностики сифилиса приказ М-ва здравоохранения Рос. Федерации №87 от 26 марта 2001 г. Москва, 2001. 63 с.)) - качественное определение суммарных антител.

Наличие реагиновых антител в ЦСЖ и сыворотке крови определяли в тестах:

- реакции микропреципитации с кардиолипиновым антигеном (РМП) (качественный количественный варианты для сыворотки крови и ЦСЖ);

- реакции связывания комплемента (РСКк) (методика постановки реакции Вассермана с ЦСЖ (приказ МЗ РФ № 87) - качественное определение суммарных антител;

-VDRL (по названию лаборатории разработчика Venereal Disease Research Laboratory) -качественное определение суммарных антител в ЦСЖ;

- RPR (Rapid Plasma Reagin) тест - качественное определение суммарных антител в

ЦСЖ.

Для проведения всех вышеуказанных исследований использовались зарегистрированные в Российской Федерации диагностикумы и тест-системы.

Также был произведен расчет индексов, предложенных для оценки специфического интратекального синтеза Ig: Treponema pallidum haemagglutination assay индекс (ТРНА индекс) и Intrathecally produced Т. pallidum antibody (ITpA) индекс. Расчет ТРНА и ITpA индексов производили по формулам:

, А _ титр РПГА » цсж

ТРНА индекс--,-

ITpA индекс = [(РПГА ЦСЖ (титр) / РПГА сыворотки (титр)/ QIgG].

За пороговую величину были приняты значения ТРНА индекса выше 70 (French, Р. et al. IUSTI: 2008 European Guidelines on the Management of Syphilis // International Journal of STD & AIDS. 2009. №20. P. 300-309.); ITpA индекса - выше 3 (Prange, H.W. Neurosyphilis ... P. 163171.).

Статистические методы анализа

Статистический анализ данных проведен согласно общепринятым методам (Гланц, С. Медико-биологическая статистика // М.: Практика, 1999. 500 е.; Ланг, Т.А., Сесик, М. Как описывать статистику в медицине : рук. для авторов, редакторов, рецензентов. М.: Практическая медицина, 2011. 477 с.) с использованием лицензионной программы Medcalc 12.2 (MedCalcSoftvvarebvba, Бельгия).

Поскольку распределение большинства количественных признаков не являлось нормальным, данные приведены в виде медианы и границ межквартильного интервала (25-75 перцентиль). Для бинарных признаков приведены абсолютное количество и доля с 95%-доверительным интервалом (95%ДИ) для доли.

Сравнительный анализ количественных признаков выполнен с помощью критерия Манн-Уитни для двух, Краскела-Уоллиса - для трех и более сравниваемых групп, качественных признаков - критерием Хи-квадрат (х2); с корректировкой уровня значимости для выявления существенно различных пар при множественном сравнении с помощью процедуры Бонферрони-Холма. Для выявления взаимосвязи между двумя непрерывными переменными использовался метод ранговой корреляции Спирмена (rs). Для тестирования внутригрупповых различий между частотами различных критериев был применен Кохран (Cochran) Q тест. Оценка предикторов по изучаемому признаку производилась с расчетом отношения шансов (OLU) с 95% ДИ. Для всех статистических критериев ошибка первого рода устанавливалась равной 0,05. Нулевая гипотеза (отсутствие различий) отвергалась, если вероятность (р) не превышала ошибку первого рода.

Результаты собственных исследований

Для решения первой задачи был проведен анализ структуры интратекального синтеза Ig и дисфункциональных нарушений ГЭБ/ГЛБ в целом по группе пациентов с выявленными отклонениями и в зависимости от наличия специфической терапии в анамнезе.

Признаки интратекального синтеза Ig были обнаружены у 55 пациентов. Различия в частоте выявления интратекального синтеза каждого из изотипов IgGl, IgG2, IgG3, IgM, IgA не были статистически значимы и составили 47-56%, за исключением G4, синтез которого регистрировали вдвое реже (Кохран тест QdR=25,3; р<0,001) (рисунок 1а). Изолированный синтез Ig только одного из классов А, М, G встречался достоверно реже, при этом частота моносинтеза Ig класса А была значимо ниже, чем классов G и М (х2 ¿а- 8,0; р=0,018) (рисунок 1 б). Наблюдалось значительное разнообразие сочетаний одновременного синтеза различных изотипов (было выявлено 23 различные комбинации), без преобладания какого-либо из вариантов.

а)

18С1

1вс;2 Я 18СЗ 18С4 1ем

18А

(29-60%)

--1 54%

-1 (38-70%)

24% (12-40%)

-1 54%

-' (38-70%)

51% —1 (35-67%)

20% ЗОН ■»%

б)

40% 20%

74% 70%

5 — 97%

в в

26% 30% а.

(¡¡С | п 46) 1еМ (и 27) (и 31)

□ ИТС класса соиместно с другими классами

□ ИТС класса 1£ моносннтеч

Рисунок 1 - Интратекальный синтез иммуноглобулинов у серопозитивных по сифилису пациентов ' (п=55) а) частота выявления синтеза ^ разной изотипической принадлежности; в скобках 95% ДИ для доли; б) сочетаемость синтеза отдельных классов с другими классами иммуноглобулинов; Кохран- (3 тест, * х2лп -тест.

При наличии в анамнезе проведенной ранее терапии по поводу неневрологического сифилиса интратекальный синтез 1§ отличался более узким спектром синтезируемых Одновременный синтез 1-2 изотопов встречался достоверно чаще, чем 3-6 изотипов (рисунок , 2). 1

р=0,048

25%

75%

68%

32%

36%

64%

не1 специфической есть сиеиифоческая кошроль .1

терапии I) анамнсте терапия в ишикю непросифн.лиса

ненееролотическото (п-14) сифилиса (п=25)

□ олповремсипмй снате) 1-2 птолнпон 1°

I 3-6

Рисунок 2 - Особенности интратекального синтеза иммуноглобулинов в зависимости от наличия специфической терапии в анамнезе: удельный вес случаев с различным количеством одновременно 5 синтезируемых изотипов ^ (х211с, р=0,016).

Признаки дисфункциональных нарушений ГЭБ/ГЛБ были обнаружены у 36 пациентов ; (11 пациентов с отсутствием специфической терапии в анамнезе, 24 пациента со специфической : терапией неневрологического сифилиса в анамнезе, 1 пациента, поступившего для контроля | лечения нейросифилиса). Анализ индивидуальных показателей <За1Ь показал, что по | классификации ЗсЬНерапй-Ре^епЬаиег выявленные случаи относились к незначимым (12 или 33%), легким (19 или 53%) и умеренным (5 или 14%) нарушениям. Случаев тяжелых и «катастрофических» нарушений не было выявлено. Различия по выраженности дисфункции ГЭБ/ГЛБ между пациентами с наличием и отсутствием специфической терапии в анамнезе неневрологического сифилиса не являлись статистически значимыми (х2<|Г2=1.8; р=0,397) (рисунок 3). :

(2-52%)

64 %

(31-89%)

Р.УЪ)

13%

шт

46%

(26-67%)

42%

(23-64%)

□ умеренное нарушение да1Ь 14.4-33.3

Р легкое нарушение (¿аИ» 9.0-14.3

а)

нет есть

специфическом специфическая

терапии в терапия в

анамное п-11 анамнезе п-24

200 180 160 140 120 100

X

б)

пецмфическая тера!

Рисунок 3 - Влияние факта наличия специфической терапии в анамнезе на выраженность дисфункции ГЭБ/ГЛБ а) доля незначимых, легких и умеренных нарушений (х2 ¿12=1,8, р=0,397); б) превышение индивидуального значения С>а1Ь над возрастной нормой (%) (критерий Манн-Уитни и=90,5, р=0,140)

Для решения второй задачи был проведен сравнительный анализ содержания в ЦСЖ каждого из шести исследуемых изотипов (01, С2, ОЗ, 04, М, А) в трех группах:

1) с отсутствием признаков дисфункции ГЭБ/ГЛБ и интратекального синтеза (группа, рассматриваемая как условная «норма», п=51);

2) с наличием признаков только дисфункции ГЭБ/ГЛБ (группа «ДФ ГЭБ/ГЛБ», п=20);

3) с наличием признаков интратекального синтеза вне зависимости от функционального состояния ГЭБ/ГЛБ (группа «ИТС \р>, п=55).

В группе «ИТС 1§» статистический анализ проводился отдельно по каждому из изотипов. В расчет принимались только те пробы, где присутствовали признаки синтеза анализируемого изотипа. В группе «норма» содержание иммуноглобулинов в ЦСЖ было минимальным; это наблюдение относилось ко всем изученным изотипам. В сравнении со значениями этой группы в группах «ДФ ГЭБ/ГЛБ» и «ИТС уровень иммуноглобулинов в ЦСЖ был существенно выше. В группе «ДФ ГЭБ/ГЛБ» медиана концентрации была выше в два-три раза для всех изотипов (р<0,05): для ^ 1 в 1,7 раза, для ^02 в 1,9 раза, для ^йЗ в 2,2 раза, для в 2,1 раза, для 1§М в 2,9 раза, для 1§А в 2,0 раза. Влияние интратекального

синтеза было более значительно и неоднородно. В группе «ИТС медиана концентрации изотипа 01 была выше в 8,7 раза, 02 - в 7,7 раза, 03 - в 6,0 раза, й4 - в 4,4 раза, М - в 20,8 раз, А - в 8,4 раз (рисунок 4).

Рисунок 4 - Уровень иммуноглобулинов в ЦСЖ (мг/л) в зависимости от условий формирования: «норма» - нет признаков дисфункции ГЭБ/ГЛБ и ИТС «ДФ ГЭБ/ГЛБ» - повышенный <За1Ь, «ИТС 1р> - признаки интратекального синтеза данного изотипа а) абсолютные значения медианы (25-75 процентиль); б) относительное повышение медианы в сравнении с группой «норма».

Для решения третьей задачи был проведен сравнительный анализ показателей, характеризующих интратекальный синтез Ig, в двух группах:

]) группа с признаками активности воспалительного процесса в ЦНС (сочетание интратекального синтеза Ig с плеоцитозом ЦСЖ и/или дисфункцией ГЭБ/ГЛБ (Reiber, Н„ Peter, J.B. Cerebrospinal fluid analysis... P. 107));

2) группа с отсутствием признаков активности воспалительного процесса в ЦНС, признаки паст-инфекции (интратекальный синтез Ig на фоне нормоцитоза ЦСЖ, без признаков дисфункции ГЭБ/ГЛБ (Там же)).

Был проведен анализ следующих показателей: частота синтеза отдельных изотипов Ig, абсолютная и относительная величины минимальной интратекально-синтезируемой фракции и достигаемая общая концентрация иммуноглобулинов в ЦСЖ (таблица 1).

Таблица 1 - Сравнительный анализ показателей, характеризующих интратекальный синтез иммуноглобулинов в зависимости от наличия/отсутствия признаков активности

Показатели Признаю! активности воспалительного процесса* Межгрупповое сравнение dfl

нет п=29 есть п=26

Частота ИТС (%) IgA 16(55) 15(58) р"=0,933

IgM 10(34) 17 (65) р"=0,044

IgGl 11 (38) 16(62) р"=0,139

IgG2 11(38) 15(58) р"=0,232

IgG3 14(48) 15(58) р'=0,669

IgG4 4(14) 8(31) р"=0,232

Абсолютная интратекально синтезируемая фракция (мг/л) IgA 0,8(0,4- 1,3) 1,5 (0,7-3,2) р1—0,138

IgM 1,9(1,5-2,6) 1,6 (0,4-2,1) р"=0,364

IgGl 5,8 (4,4 - 8,2) 16,5(11,9-36,8) р"=0,003

IgG2 2,3(1,5-6,0) 16,1(3,5-23,0) рг—0,005

IgG3 0,3 (0,1 - 0,8) 2,4(1,2- 5,8) р"=0,000

IgG4 0,4 (0,2 - 0,7) 1,0 (0,8 - 1,4) рб=0,131

Относительная интратекально синтезируемая фракция (%) IgA 33 (22 - 53) 26(19- 54) р°=0,782

IgM 75 (81- 85) 58 (21 - 27) р°=0,083

IgGl 35(24 -38) 50 (19 - 66) р°=0,154

lgG2 22 (15 - 35) 40(19-62) р°=0,097

IgG3 17 ( 8-27) 44(18-57) р"=0,016

IgG4 14 ( 9- 17) 39 (27 - 54) р"=0,087

Концентрация в ЦСЖ (мг/л) IgA 2,7(1,7-3,7) 5,2 (3,8 - 8,8) р"=0,000

IgM 2,5 (0,3-2,9) 3,0 (2,0 - 3,4) р°=0,219

IgGl 16,3(13,9-24,0) 47,4 (35,3 - 70,2) рь=0,000

IgG2 12,6(8,8-17,8) 29,2 (22,1 -51,9) р"=о,ооо

lgG3 2,3(1,7-2,6) 8,8 (5,0 - 9,9) р"=0,000

IgG4 2,1 (1,5-3,2) 3,1 (2,2-3,9) р°=0,307

* признаки активности воспалительного процесса (цитоз>5 клеток/мкл и/или (}а1Ь> возрастной нормы); а критерий /2 ;11 критерий Манн-У итни

Статистически значимые отличия в частоте интратекального синтеза были получены только в отношении ^М: в группе с признаками активности воспалительного процесса удельный вес таких случаев был в 1,9 раза выше. Хотя в сравниваемых группах частота интратекального синтеза 1% класса О достоверно не отличалась, при наличии признаков

активности воспаления количество интратекально-синтезированных иммуноглобулинов изотипов Gl, G2, G3 было значимо выше. Медиана данных, характеризующих минимальную интратекально-синтезированную фракцию Ig, была выше для изотипа G3 в 8,0 раз, G2 - в 7,0 раз, Gl- в 2,8 раза по сравнению с группой без признаков активности воспалительного процесса. При этом в наибольшей степени увеличивалась интратекапьная продукция изотипа G3, что подтверждается достоверно большей долей интатекально-синтезируемой фракции данного изотипа при воспалении. Соответственно, была значимо выше и общая концентрация в ЦСЖ этих изотипов lg. Кроме того, наблюдались отличия в отношении Ig класса А. При наличии признаков воспаления концентрация IgA в ЦСЖ была достоверно выше, несмотря на отсутствие различий в интенсивности интратекального синтеза Ig.

Для решения четвертой задачи были изучены результаты нетрепонемных (VDRL, RPR, РМП, РСКк) и трепонемных (РИФабс, РИФц, РПГА, ИФА, РСКт) тестов в ЦСЖ во всех вышеперечисленных группах и выполнено сравнительное исследование: было проанализировано их соответствие критериям, используемым в настоящее для подтверждения/исключения диагноза «нейросифилис».

Общепринятыми критериями подтверждения диагноза «нейросифилис» являются положительные результаты нетрепонемных тестов в ЦСЖ (Российское общество дерматовенерологов и косметологов. Ведение больных инфекциями, передаваемыми половым путем, и урогенительными инфекциями : клинические рекомендации. Сифилис. Москва: Деловой Экспрес, 2012. С. 34-68.; IUSTI: 2008 European Guidelines ... P. 300-309.; Centers of Disease Control and Prevention. Sexually Transmitted Disease Treatment Guidelines. Syphilis. Atlanta. USA. 2010. Vol. 59, № RR-12. -P. 28-35.). На рисунке 5 представлены результаты исследования результатов нетрепонемных тестов (НТТ) в ЦСЖ.

2% 0-11%

98% 89-100-/1

норма

10%

1-32%

40%

68-49%

"Дф ГЭБ/ГЛБ"

Х2<1Г2=7.9 р=0,(>20

75% .1-86%

25%

14-39%

"ИТС lg"

38% 21-58%

ИТС 1ц нет при шакиь

■ VDRL+RPR+РМП+РСКк-I т+РМГЬРСКк+

■ VDRL+PMn+PCKï+

■ РММСКк+ RPR+PMTI+ VDRL+PMD+

■ VDRL+PCK+

1 RPR+

VDRb РСКк+

□ отрицательный комплекс НТТ

восна.нлшм

Рисунок 5 - Результаты нетрепонемных тестов (VDRL, RPR, РМП, РСКк) в ЦСЖ в зависимости от наличия признаков дисфункции ГЭБ/ГЛБ и ИТС Ig, признаков активности воспалительного процесса

Между группами «норма» и «ДФ ГЭБ/ГЛБ» удельный вес проб, позитивных в каком-либо из НТТ статистически не различался и составил 2% и 10% соответственно. В группе «ИТС Ig» доля положительных результатов всех НТТ была достоверно выше и составила: для VDRL -41%, для RPR - 39%, для РМП - 51%, для РСКк - 51%. В целом по группе «ИТС Ig»

позитивация какого-либо (каких-либо) из НТТ была выявлена у 41 из 55 человек (75%), что было достоверно чаще в сравнении с группами «норма» и «ДФ ГЭБ/ГЛБ» (у2 df2=64; р<0,0001). При наличии признаков активности воспалительного процесса достоверно чаще выявлялась позитивация РСКк (85% против 41%; р=0,003) и RPR (76% против 28%; р=0,002), чаще регистрировались положительные результаты по всем НТТ и реже - отрицательные (42% и 12% против 14% и 38% соответственно, р=0,02). Кроме того, был выше титр позитивации РМП (1:4 (ц -1:8) против ц (ц - 1:2), Манн-Уитни U=44,5; р=0,017).

Общепринятыми критериями исключения диагноза «нейросифилис» являются отрицательные результаты трепонемных тестов (Российское общество дерматовенерологов и косметологов. Ведение больных инфекциями... - С. 34-68.; 1USTI: 2008 European Guidelines ... -P. 300-309.; Centers of Disease Control and Prevention... P. 28-35.). На рисунке 6 представлены результаты исследования трепонемных тестов (ТТ) в ЦСЖ. Отрицательные результаты тестов РИФц, ИФА, РПГА чаще (р<0,001) наблюдались в группе «норма» (43%, 43%, 55% соответственно), чем в группе «ДФ ГЭБ/ГЛБ» (5%. 10% и 20% соответственно), или в группе «HTCIg» (0%, 0%, 0%, соответственно). Удельный вес проб с отрицательными результатами РИФабс или РСКт статистически не различался между группами «норма» и «ДФ ГЭБ/ГЛБ», и был существенно выше (78%, 60% для РИФабс. 98%, 100% для РСКт, соответственно), чем в группе «ИТС Ig» (5% для РИФабс, 47% для РСКт) (р<0.05). В целом, отрицательные результаты всего исследованного комплекса ТТ (РИФабс, РИФц, РПГА, ИФА, РСКт) выявлялись только в группе «норма» (29% против 0%, р<0,001), у остальных пациентов регистрировали положительный результат того или иного (тех или иных) ТТ, при этом позитивация всего комплекса ТТ чаще отмечалась в группе «ИТС Ig», особенно при наличии признаков активного воспаления.

100% 80% 2%

_

60% шш^ш

40%

20% 0% 29% 1 7-43%

"норма"

о%

0-17-.» *2Й|2

X2.1I2 р-=О.ПО!

р<0,001 53% 39-67°/

0% 0-17%

ДФ Г'ЭБ ГЛБ

ИТС Ig нет ИТС Ig есть прщнаков приэнакп воспаления воспаления

РИФэдс + РПФи+РПГА + ИФА+РСКт

РНФа6г*РНФп4РПГА« ИФА-»

РИФЛ+РПГА+ ПФА +

РПФя5с+РПГА+ ИФА-»

РПГА+НФА+

Р11Ф|1+ПФ\+

РПФп+РПГА +

РНФЧ +

РПГА*

Г) комплжс ТТ

Рисунок 6 - Результаты трепонемных тестов (РИФабс, РИФц, РПГА, ИФА, РСКт) в ЦСЖ в зависимости от наличия дисфункции ГЭБ/ГЛБ и ИТС признаков активности воспалительного процесса.

Кроме того, специалистами предложены критерии подтверждения/исключения диагноза «нейросифилис» на основе результатов РПГА, однако, данные критерии не получили широкого распространения и признаны требующими дальнейшей валидации. В качестве критериев

подтверждения диагноза рекомендованы «титр РПГА-ЦСЖ > 1:320», «ТРНА индекс > 70» (IUSTI: 2008 European Guidelines ... P. 300-309.) и «ITpA индекс >3» (Prange, H.W. Neurosyphilis... P. 163-171.), в качестве критерия исключения - «титр РПГА-ЦСЖ < 1:320» (1USTI: 2008 European Guidelines ... P. 300-309.).

На рисунке 7 представлены данные по удельному весу проб, удовлетворяющих этим критериям в сравниваемых группах. Большинство проб (91%) в группе «ИТС Ig» соответствовало критериям подтверждения диагноза в разных сочетаниях («титр РПГА-ЦСЖ > 1:320» (76%) и/или «ТРНА индекс > 70» (78%) и/или «ITpA индекс >3» (67%). Различия, связанные с наличием/отсутствием признаков активности воспалительного процесса в ЦНС, были выявлены в отношении ITpA индекса: при наличии признаков воспаления повышенные значения данного индекса встречались достоверно реже (р=0,003). В группах с отсутствием ИТС Ig титры РПГА выше 1:320 и значения ТРНА индекса больше 70 наблюдались редко, в то время как ITpA индекс выше 3 отмечался в значительном числе случаев (27% в группе «норма», 70% в группе «ДФ ГЭБ/ГЛБ»), Низкие титры РПГА (< 1:320) редко регистрировались в группе «ИТС Ig» (16%), тогда как в группе «норма» их удельный вес был значительно выше (47%), а в группе «ДФ ГЭБ/ГЛБ» они выявлялись в большинстве случаев (80%).

¡КО,<1(11

78°/

р<0,001

р-=0,05

80%

76%„

6% 5%

p=l),003

79% 83 %

т69%

50%

17% 15%

РПГЛ пир > 1:320 ТРНАшшекс >70 ПРЛи критерии подтверждения

>3 РПГА тшр* 1:320

□ "норма" ПДФ ГЭБ/ГЛБ DHTCIg

РПГА титр >1:320 ТРНА индекс >70 ITPA индекс >3 РША тнтр< 1:320

кршерпи niui нерл теннн критерий

„,... некдюченнк

□ ИТС Ig nef признаков воспаления о HTClgecTb прншаки воспаления

Рисунок 7 - Удельный вес повышенных значений титра РПГА, ТРНА- и 1ТрА индексов в зависимости от наличия признаков дисфункции ГЭБ/ГЛБ и ИТС I% и признаков активного воспаления.

При анализе сопоставимости оценок, произведенных с использованием различных критериев, было установлено, что в большинстве случаев пробы ЦСЖ, позитивные по какому-либо из нетрепонемных тестов, также удовлетворяли одному или более критериям подтверждения диагноза на основе РПГА. Индексы, рассчитываемые на основе РПГА и предлагаемые в качестве индикаторов специфического интратекального синтеза, не находились в лучшем согласии с доказанными случаями интратекального иммунного ответа, чем РПГА титр. Результаты, полученные при использовании критериев «титр РПГА-ЦСЖ > 1:320» и «ТРНА индекс > 70» совпадали в подавляющем числе случаев (122 из 126), тогда как 1ТрА индекс > 3 часто (30 из 65) выявлялся в моноварианте, особенно при изолированной дисфункции ГЭБ/ГЛБ.

В целом полученные данные свидетельствуют в пользу гипотезы, что присутствие в ЦСЖ реагиновых антител и повышенное содержание трепонемаспецифических антител является следствием интратекального иммунного ответа, и позволяют рекомендовать критерий

«титр РПГА-ЦСЖ > 1:320» и «ТРНА-индекс > 70» для использования при диагностике нейросифилиса у пациентов с подозрением на нейросифилис, ранее не получавших противосифилитической терапии.

Для решения пятой задачи были проанализированы показатели общих иммуноглобулинов и уровня сифилис-ассоциированных антител (титр РМП и РПГА) в системном кровотоке у пациентов с признаками ИТС (п=55) и без (п=71), изучены особенности, ассоциированные с активностью воспалительного процесса в ЦНС и проведен корреляционный анализ между значениями содержания общих иммуноглобулинов в крови и ЦСЖ, а также показателями, характеризующими выраженность системного антителообразования (результаты тестов РПГА и РМП в сыворотке крови) и интенсивность ИТС (абсолютное и относительное содержание интратекально-синтезированной фракции ^ в ЦСЖ). Были выделены критические значения показателей периферической крови, ассоциированные с ИТС их прогностический потенциал оценен посредством расчета отношения шансов с 95% ДИ. Полученные данные свидетельствовали, что факт наличия ИТС не был ассоциирован с увеличением пула общих в системном кровотоке, более того, наблюдалось статистически значимое снижение уровня ^М (1,3 (0,93-2,2) г/л против 1,7 (1,22,4) г/л у пациентов без признаков ИТС р=0,023) (рисунок 8а). Тогда как уровень сифилис-ассоциированных антител в системном кровотоке был достоверно выше при выявлении лабораторных признаков ИТС Ig (р<0,0001) (рисунок 86), особенно при наличии признаков активности воспалительного процесса в ЦНС.

Рисунок 8 - Показатели периферической крови (медиана (межквартильный диапазон)): а) уровень общих иммуноглобулинов различной изотипической принадлежности и б) результатов РПГА и РМП в зависимости от отсутсвия/напичия лабораторных признаков ИТС I% (критерий Манн-Уитни)

Так, медиана (межквартильный диапазон) титра РПГА в крови составила в группе с отсутствием признаков ИТС 1:2560 (1:640 - 1:5120), тогда как в группе ИТС без признаков активности воспаления в ЦНС - 1:20480 (1:10240 - 1:40960), в группе ИТС с признаками воспаления - 1:163840 (1:20 480 - 1:327680).

Подобные закономерности отмечались и в отношении реагиновых антител. В группе без признаков ИТС у каждого пятого пациента результаты РМП в крови были отрицательными, в случае выявления присутствия антител, титр (медиана и межквартильный диапазон) равнялся 1:4 (1:2 - 1:8). В группе «ИТС без признаков активности воспаления в ЦНС» медиана

(межквартильный диапазон) титра РМП в крови равнялась 1:8 (1:4-1:8), в группе «ИТС 1$ с признаками воспаления» - 1:32 (1:16 - 1:64).

Корреляционный анализ между значениями содержания общих в крови и ЦСЖ выявил наличие слабой прямой взаимосвязи данных показателей в группе «норма» в отношении ^А, ^3 и 1§в4 (г5 равен 0,36, 0,33, 0,46 соответственно, р<0,021), прямых связей средней силы для всех изотипов в группе «ДФ ГЭБ/ГЛБ» (г5 изменялся в диапазоне 0,44 - 0,57, р < 0,024), и отсутствие статистически значимой корреляции в группе «ИТС

Исследование взаимосвязи между результатами РПГА и РМП в сыворотке крови с одной стороны и показателями минимальной интератекально-синтезируемой фракции иммуноглобулинов разных изотипов с другой стороны, выявило наличие прямой связи с различными подклассами иммуноглобулинов класса О (рисунок 9).

РПГА титр РМП титр

Рисунок 9 - Взаимосвязь результатов тестов РПГА и РМП с сывороткой крови и минимальной интератекально-синтезируемой фракцией (в абсолютном (мг/л) и относительном содержании (%)) ^ разной изотипической принадлежности. Темным цветом выделены показатели имеющие статистическую значимость (р<0,05).

Таким образом, наблюдается взаимосвязь между пулами иммуноглобулинов системного кровотока и ЦСЖ, и такие показатели периферической крови как титры РМП и РПГА, а также уровень общих ^М могут выступать в качестве предикторов гуморального иммунного ответа на территории ЦНС у пациентов с подозрением на нейросифилис (рисунок 10).

ЛАБОРАТОРНЫЕ ПРИЗНАКИ ИНТРАТБКАЛЬНОГО СИНТЕЗА

РМП

отр. результат РМП >1: 32 РПГА < 1 : 5120 РПГА> 1 : 40960 1вМ >1,0 г/л

ОШ 0,07 (0.01 - 0,05) р=0,010 011110,1(2,8-36,8) р<0,001 ОШ 0,05 (0,02 -0,16) р<0,001 011121,6(6,9-67,7) р<0,001 01113,4(1,4-8,2) р-0,008

0,001 0,01 0,1 1 10 100 ОТНОШЕНИЕ ШАНСОВ

Рисунок 10 - Оценка показателей периферической крови в качестве предикторов обнаружения лабораторных признаков ИТС (данные представлены в виде отношение шансов (ОШ) и 95% доверительного интервала (в скобках).

Так, вероятность выявления лабораторных признаков интратекального иммунного ответа в ЦНС возрастает при обнаружении в крови пациента титров РМП > 1:32 в 10,1 раза (95%ДИ 2,8-36,8; р=0,0004), титров РПГА > 1:40960 в 21,6 раза (95%ДИ 6,9-67,7; р<0,001), значений общих ^М<1,0 г/л в 3,4 раза (95%ДИ 1,4-8,2; р=0,008). При отрицательных результатах РМП в сыворотке крови или титрах РПГА меньше, чем 1:5120 вероятность обнаружения лабораторных признаков ИТС ^ при проведении диагностической пункции крайне низка (ОШ 0,07 (0,01-0,5); р=0,010 и ОШ 0,05 (0,02-0,16); р<0,001 соответственно). Учитывая высокий прогностический потенциал выявления патологии ЦНС, содержание трепонемаспецифичных антител в крови в количестве, превышающем титр РПГА 1:40960, может рассматриваться в качестве нового прогностического критерия наличия поражения ЦНС при сифилисе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящем исследовании охарактеризованы процессы интратекального синтеза иммуноглобулинов и дисфункции ГЭБ/ГЛБ при сифилитической инфекции, определена степень их влияния на содержание иммуноглобулинов в ЦСЖ и результаты диагностических тестов, выявлены особенности иммуноглобулинового состава крови, ассоциированные с высокой вероятностью воспалительного поражения ЦНС. Полученные в результате проведенного исследования научные факты, сформулированные в виде выводов, углубляют понимание иммунного ответа при сифилитической инфекции и являются теоретической доказательной базой для практических рекомендаций по совершенствованию иммунодиагностики нейросифилиса.

ВЫВОДЫ

1. У серопозитивных по сифилису пациентов с подозрением на нейросифилис выявляются разнообразные варианты сочетанного и изолированного интратекального синтеза иммуноглобулинов С1, С2, ОЗ, С4, М, А. Синтез всех изотипов равновероятен, за исключением Б4, который синтезируется вдвое реже. В отличие от иммуноглобулинов классов М и О изолированный синтез иммуноглобулинов класса А маловероятен. Влияние ранее проведенной терапии по поводу неневрологического сифилиса проявляется в преобладании 1-2 изотипной реакции над 3-6 изотипной.

2. Дисфункциональные нарушения гематоэнцефалического/гематоликворного барьера у серопозитивных по сифилису пациентов с подозрением на нейросифилис носят невыраженный характер с преобладанием дисфункций незначимой, легкой и умеренной степени выраженности. Влияние ранее проведенной терапии по поводу неневрологического сифилиса на степень выраженности дисфункции статистически незначимо.

3. Интратекальный иммунный ответ приводит к значительному увеличению концентрации иммуноглобулинов в цереброспинальной жидкости, наиболее выраженный относительный прирост наблюдается в отношении иммуноглобулинов М. Среднее значение в распределении

концентраций иммуноглобулинов возрастает в 20,8 раза для изотипа М, в 8,7 раза для Gl, в 7,7 раза для G2, в 6,2 раза для G3, в 6,0 раза для G4, в 8,4 раза для А.

4. Изолированное нарушение функционирования гематоэнцефалического/ гематоликворного барьера сопровождается повышением содержания иммуноглобулинов в цереброспинальной жидкости в два-три раза: среднее значение в распределении концентраций возрастает в 2,9 раза для иммуноглобулинов М, в 1,7 раза для Gl, в 1,9 раза для G2, в 2,2 раза для G3, в 2,1 раза для G4, в 2,0 раза для А.

5. Выявление признаков активности воспалительного заболевания центральной нервной системы ассоциировано с повышенной частотой интратекального синтеза иммуноглобулинов М, более высокой концентрацией иммуноглобулинов G1, G2, G3, А в цереброспинальной жидкости, большим количеством интратекально синтезированных иммуноглобулинов Gl, G2, G3.

6. В случае интратекального гуморального иммунного ответа значительно выше вероятность результатов диагностических тестов в цереброспинальной жидкости, удовлетворяющих критериям подтверждения диагноза «нейросифилис»: положительные нетрепонемные тесты, высокие титры антител в реакции пассивной гемагглютинации и повышенные значения Treponema pallidum haemagglutination assay - и Intrathecally produced Т. pallidum Antibody -индексов. Активность воспалительного процесса в центральной нервной системе сочетается с более высокой частотой позитивации реакции связывания комплемента и Rapid Plasma Reagin - теста, более высокими титрами реакции микропреципитации, одновременной позитивацией нескольких нетрепонемных тестов.

7. Отрицательные результаты трепонемных тестов и низкие титры антител в реакции пассивной гемагглютинации, рекомендуемые в качестве критериев исключения диагноза «нейросифилис», ассоциированы с отсутствием признаков интратекального синтеза иммуноглобулинов: наличие изолированной дисфункции гематоэнцефалического /гематоликворного барьера снижает вероятность отрицательных результатов реакции пассивной гемагглютинации, иммуноферментного анализа, реакции иммунофлюоресценции с цельным ликвором, и повышает вероятность низких титров антител в реакции пассивной гемагглютинации и повышенных значений Intrathecally produced Т. pallidum Antibody -индекса.

8. Корреляция между значениями содержания общих иммуноглобулинов в цереброспинальной жидкости и системном кровотоке наиболее выражена при наличии дисфункции гематоэнцефалического/гематоликворного барьера, статистически незначима в случае интратекального синтеза иммуноглобулинов и минимальна при отсутствии данных патологий. При доказанной интратекальной продукции иммуноглобулинов наблюдается более низкое содержание общих иммуноглобулинов М и более высокое содержание сифилис-ассоциированных антител в системном кровотоке. Степень повышения уровня трепонемаспецифичных и реагиновых антител в крови выше при выявлении признаков активности воспалительного процесса в центральной нервной системе и коррелирует с интенсивностью интратекального синтеза иммуноглобулинов класса G.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для ликвородиагностики нейросифилиса рекомендуется использование количественных вариантов РПГА в ЦСЖ

2. Критерии «титр РПГА в ЦСЖ выше 1:320» и «ТРНА-индекс выше 70» могут использоваться для лабораторного подтверждения диагноза «нейросифилис» у пациентов, ранее не получавших специфической терапии.

3. Критерии «титр RPR (РМП) в крови выше 1:32» и «титр РПГА в крови выше 40960» могут применяться для оценки вероятности воспалительного поражения ЦНС у пациентов с сифилитической инфекцией.

4. Для практического использования критерия «ITpA-индекс выше 3» требуются дальнейшие обоснования.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пономарева, М.В. Исследование цереброспинальной жидкости у пациентов с подозрением на поздний нейросифилис / М.В. Пономарева, Н.К. Левчик, В.И. Сурганова // XI Всероссийский съезд дерматовенерологов и косметологов: тез. науч. работ. - Екатеринбург, 912 ноября 2010, с. 10-11.

2. Пономарева, М.В. Применение ТРНА-индекса в ликвородиагностике нейросифилиса / М. В. Пономарева, Н. К. Левчик // IV междисциплинарная научно-практическая конференция: сб. науч. трудов. - Казань, 24 марта 2011. - С. 256-260.

3. Пономарева, М.В. Интратекальный синтез иммуноглобулинов у больных поздним сифилисом / М.В. Пономарева, Н.К. Левчик // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - №2/1, (35). - С. 191-192.

4. Пономарева, М.В. Результаты изучения изотнпов иммуноглобулинов у больных сифилисом / М.В. Пономарева, Н.К. Левчик, В.И. Сурганова, В.А. Гирш, Ю.А. Медведева // Вестник дерматологии и венерологии. -2011. - №1. - С. 54-58.

5. Пат. № 2449286 Российская Федерация, мпк7 G 01 N 33/53. Способ прогнозирования нейросифилиса |Текст] / Пономарева М.В., Левчик Н.К.; заявитель и патентообладатель ФГУ Уральский науч.-исслед. ин-т дерматовенерологии и иммунопатологии Мииздравеоцразвития России. -№ 2011115021; заявл.15.04.2011; опубл. 27.07.12, Еюл~\«12. -5с.

6. Кунгуров, Н.В. Функциональное состояние гематоэпцефалического/ гематоликворного барьера у больных сифилисом / Н.В. Кунгуров, Н.К. Левчик, М.В. Пономарева, Н.В. Киселева, В.И. Сурганова, Н.В. Зильберберг // Современные проблемы дерматовенерологии, иммунологии и врачебной косметологии. - 2012. - №4. - С. 14-21.

7. Левчик, Н. К. Интратекальный синтез иммуноглобулинов у больных нейросифилисом / Н. К. Левчик, М. В. Нономарева, Н. В. Зильберберг// Современные проблемы дерматовенерологии, иммунологии и врачебной косметологии. - 2012. -№4. -С. 23-29.

8. Левчик, Н.К. Результаты изучения взаимосвязи между интратекальным гуморальным иммунным ответом и содержанием сифилис-ассоциированных антител в системном кровотоке при сифилитической инфекции / Н. К. Левчик, М. В. Пономарева, Н. В. Зильберберг// Современные проблемы дерматовенерологии, иммунологии и врачебной косметологии. -2013. - №26, Т. VIII. - С. 12-17.

9. Levchik, N. Criteria for the Diagnosis of Neurosyphilis in Cerebrospinal Fluid: Relationships With Intrathecal Immunoglobulin Synthesis and Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier Dysfunction /N. Levchik, M. Ponomareva, V. Surganova, N. Zilberberg, N.Kungurov // Sexually Transmitted Diseases. - 2013.-Vol. 40, Issue 12. - P. 917-922.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

абс. - абсолютное число

ГЭБ/ГЛБ - гематоэнцефалический/гематоликворный барьер

ДФ ГЭБ/ГЛБ - дисфункциональные нарушения ГЭБ/ГЛБ

ИТС Ig - интратекапьный синтез иммуноглобулинов

ИФА - иммуноферментный анализ

НС - нейросифилис

НТТ - нетрепонемные тесты

ОШ - отношение шансов

РИФабс - реакция иммунофлюоресценции с абсорбцией РИФц - реакция иммунофлюоресценции с цельным ликвором РМП - реакции микропреципитации РИГА - реакция пассивной гемагглютинации

РСКк - реакция связывания комплемента с кардиолипиновым антигеном

РСКт - реакция связывания комплемента с трепонемным антигеном

TT - трепонемные тесты

ц - цельный ликвор

ЦСЖ - цереброспинальная жидкость

ЦНС - центральная нервная система

df- число степеней свободы для статистических критериев

RPR - Rapid Plasma Reagin

ITpA индекс - Intrathecally produced T. pallidum Antibody индекс

Ig - иммуноглобулины

rs- коэффициент корреляции

TPHA индекс - Treponema pallidum haemagglutination assay индекс

VDRL - Venereal Disease Research Laboratory

Qaib - альбуминовый коэффициент

X2 - критерий хи-квадрат

95% ДИ - 95 %-й доверительный интервал

/

На правах рукописи

Пономарева Марина Владиславовна

ИНТРАТЕКАЛЬНЫЙ СИНТЕЗ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ И ДИСФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ НАРУШЕНИЯ ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКОГО/ГЕМАТОЛИКВОРНОГО БАРЬЕРА ПРИ СИФИЛИТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология (биологические науки)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 25.03.2014. Формат 60x84 1/|б Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №. 101. Отпечатано в типографии ГБОУ ВПО УГМУ Минздрава России, г. Екатеринбург, ул. Репина, д. 3