Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Информативность лабораторных технологий в формировании алгоритмов диагностики заболеваний коры надпочечников
- Ученая степень
- доктора биологических наук
- ВАК РФ
- 14.00.46
Автореферат диссертации по медицине на тему Информативность лабораторных технологий в формировании алгоритмов диагностики заболеваний коры надпочечников
На правах рукописи
ВЕЛИКАНОВА
Людмила Иосифовна
ИНФОРМАТИВНОСТЬ ЛАБОРАТОРНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В ФОРМИРОВАНИИ АЛГОРИТМОВ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ
14 00 46 - клиническая лабораторная диагностика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Санкт-Петербург 2005
Работа выполнена в научно-исследовательском отделе лабораторной диагностики НИИ эндокринологии Государственного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Научный консультант: доктор медицинских наук
профессор Ворохобина Наталья Владимировна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук
доктор медицинских наук
доктор биологических наук Ведущая организация -
■М
Зыбина Наталья Николаевна
Комаров Евгений Константинович
Алексеева Лидия Аркадьевна Санкт- Петер бургский Государственный медицинский университет им. академика И.П.Павлова
Л
УО
Защита состоится « 1 » мая 2005 Г. в «/ » часов на заседании Диссертационного совета Д 205.001.01 при Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины» МЧС России (194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 4/2).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины» МЧС России по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 4/2.
Автореферат разослан апреля 2005 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук
Алексанин С.С.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Развитие современных медицинских технологий расширило возможности ранней доклинической диагностики и привело к росту частоты выявления больных с патологией коры надпочечников, как с опухолями, так и с неопухолевыми формами [Баранов В.Г. и др. 1988; Дедов И.И., 2000; Fukata J. et al., 1993; Chidiac R.M. et al., 1997; Prise J.N. et al., 1998; Rossi R. et al., 2000; Nieman L. K. et al., 2002]. Несмотря на достигнутые успехи в этой области, клиницисты сталкиваются с трудностями в дифференциальной диагностике различных форм вирильного синдрома, органического и функционального эндогенного гиперкортицизма..
Отсутствие клинических маркеров стертых форм врожденной гиперплазии коры надпочечников (ВГКН), возможность развития вторичных форм ферментных нарушений биосинтеза стероидов, сочетание надпочечниковой гиперандрогении (НГА) с синдромом поликистозных яичников (СПКЯ) осложняют поиск источника гиперпродукции андрогенов [Комаров Е.К., 1993; Пищулин А.А. и др., 1999; Loughlin Т., 1986; Rodin A. et al., 1994; White P.C., Speiser P.W., 2000; Consensus PCOS, 2004; Azziz R. et al., 2004].
Определение базального уровня 17-гидроксипрогестерона в большинстве случаев не позволяет диагностировать стертую форму ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы [Серебрякова И.П., 2005; Bachega T.A. et al., 2000]. Нет единой точки зрения в отношении критериев диагностики недостаточности 21-гидроксилазы при проведении пробы с кортикотропином [Дзенис И.Г. и др., 1995; Huerta R. et al., 2000; Ozer G. et al., 2000; Consensus САН, 2002]. При стертых формах ВГКН с недостаточностью 11р-гидроксилазы биохимические критерии диагностики заболевания не разработаны [White P.C et al., 1994]. Альтернативный путь образования андростендиона из 11-дезоксикортизола и функциональное снижение активности 11р-гидроксилазы в условиях гиперандрогении любой этиологии создают определенные трудности при диагностике ВГКН с недостаточностью данного фермента [Auzeby A. et al., 1995; Kelestimur F., Sahin Y., 1999; Dolfmg J.D. et al, 2003].
В настоящее время недостаточно изучены нарушения надпочечникового стероидогенеза у больных с инциденталомами [Arnaldy G. et al, 2000; Angeli A. et al, 1997]. Ряд авторов отмечают, что случайно обнаруженные опухоли нередко выявляются у больных с врожденной гиперплазией коры надпочечников [Reincke M. et al, 1997; Chabre О. et al, 2000]. Показания к оперативному лечению при инциденталомах во многом зависят от обнаруженных у больных нарушений надпочечникового стероидогенеза [Meyers R.L, Grua J.R, 2000; Kurtoglu S. et al, 2003]. По данным литературы у 12-16% больных со случайно выявленными образованиями коры надпочечников встречается субклинический синдром Иценко-Кушинга (СИК) [Caplan R.N. et al, 1994; Nevell-Price J. et al, 1996; Terzolo M.et al 1998; Suda T. et al, 2002]. Диагностика на данном этапе заболевания вызывает определенные трудности и требует изучения не только секреции кортизола, но и промежуточных продуктов стероидогенеза [Гончаров Н.П. и др, 2000;
Шафигуллина З.Р., 2002; Fernandez Real J.M. et al., 1994; Crapo L, 1997]. Имеющиеся публикации в отношении диагностического значения определения экскреции свободного кортизола и свободного кортизона с мочой при эндогенном гиперкортицизме разрознены и противоречивы [Murphy B.E., 1999; Taylor R.L. et al., 2002; Turpeinen U. et al., 2003]. В связи с этим представляется актуальной разработка информативных биохимических критериев стертых форм ВГКН и субклинического СИК.
Методы иммуноферментного и радиоиммунологического анализа не позволяют одновременно проанализировать в одном образце биологического материала содержание различных кортикостероидов, что необходимо для диагностики субклинических форм заболеваний коры надпочечников.
Особое значение приобретают хроматографические методы анализа, которые наряду с качественным и количественным анализом индивидуальных компонентов, позволяют получать стероидные профили крови и мочи, являющиеся наиболее ценными диагностическими тестами для заболеваний, связанных с нарушением синтеза и метаболизма стероидных гормонов [Орлов Е.Н. и др., 1995; Королева Е.М. и др., 2001; Тогузов Р.Т. и др., 2004; Carpene G. et al., 1991; Lin C.L. et al., 1997; Stewart P.M. et al., 1999; Fernandes VT et al., 2003]. Безусловный научно-практический интерес имеет разработка методик качественного и количественного определения индивидуальных
кортикостероидов в крови и моче и оценка их дифференциально-диагностической значимости у больных с заболеваниями надпочечников [Jap В. К. et al., 1992; Volin. P., 1995; Ghulam A. et al., 1999; Miksik I. et al., 1999; Ohno M. et al., 2000; Stolker A.A.M. et al., 2000; Kao P.C. et al., 2001; Marwah A. et al., 2001].
Существующие в настоящее время клинико-лабораторные технологии определения стероидных профилей не адаптированы к диагностике субклинических форм заболеваний гипофизарно-надпочечниковой системы. Для оценки нарушений надпочечникового стероидогенеза отсутствуют четкие критерии выбора лабораторных методик, сведения о диагностической значимости исследуемых параметров, референтные значения для них. Решение данных вопросов необходимы для усовершенствования диагностики и выработки адекватной терапии пациентов с заболеваниями коры надпочечников.
Цель исследования.
Изучить информативность обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии кортикостероидов, иммуноферментного и радиоиммунологического анализа для оптимизации существующих и разработки новых алгоритмов клинико-лабораторной диагностики заболеваний коры надпочечников.
Задачи исследования.
1. Разработать способ определения кортикостероидов в крови и моче на основе метода обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной
хроматографии (ОФ ВЭЖХ) с учетом оптимизации регламента пробоподготовки и условий хроматографического анализа.
2. Изучить особенности надпочечникового стероидогенеза у больных с различными формами вирильного синдрома и у больных со случайно выявленными опухолями коры надпочечников на основании определения содержания кортикостероидов в крови и моче методом ОФ ВЭЖХ и в сопоставлении с традиционными методами иммуноферментного (ИФА) и радиоиммунологического анализа (РИА).
3. Установить информативные лабораторные биохимические критерии стертых форм ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы и 11р-гидроксилазы, синдрома поликистозных яичников и смешанных форм гиперандрогении.
4. Определить информативные биохимические критерии субклинического синдрома Иценко-Кушинга и функционального гиперкортицизма по данным ОФ ВЭЖХ кортикостероидов в крови и моче.
5. Разработать алгоритмы лабораторной диагностики различных форм вирильного синдрома и случайно обнаруженных опухолей коры надпочечников.
Научная новизна исследования. С использованием качественного и количественного определения кортикостероидов в крови и моче методом ОФ ВЭЖХ получены новые данные о механизмах нарушений этапов биосинтеза кортикостероидов на ранних стадиях заболевания при различных формах вирильного синдрома и опухолях коры надпочечников.
Впервые по данным ОФ ВЭЖХ установлены биохимические критерии для дифференциальной диагностики стертых форм ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы и ПР-гидроксилазы. Информативные лабораторные критерии недостаточности различных изоферментов гидроксилазы выявлены по динамике уровней в крови 11-дезоксикортизола, 11-дезоксикортикостерона, кортикостерона, соотношений кортизол/11-дезоксикортизол и кортизол/кортизон при проведении пробы с кортикотропином у больных с вирильным синдромом и у больных со случайно обнаруженными опухолями коры надпочечников.
Получены биохимические критерии, свидетельствующие о недостаточности 11|3-гидроксистероиддегидрогеназы-1 у больных с синдромом поликистозных яичников (увеличение экскреции свободного кортизона с мочой и снижение соотношения свободный кортизол/свободный кортизон).
Установлена информативность определения экскреции свободного кортизола и свободного кортизона с мочой на пробе с дексаметазоном, соотношений кортизол/кортизон в крови и свободный кортизол/свободный кортизон в моче для диагностики субклинического синдрома Иценко-Кушинга и для дифференциальной диагностики органического и функционального гиперкортицизма.
Впервые разработаны алгоритмы лабораторной диагностики стертых форм врожденной гиперплазии коры надпочечников у больных с вирильным синдромом и у больных с инциденталомами.
Практическая значимость работы.
Исследования качественных и количественных нарушений надпочечникового стероидогенеза методом ОФ ВЭЖХ позволяют на ранних стадиях диагностировать заболевания коры надпочечников. Разработаны информативные биохимические критерии диагностики стертых форм ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы и 11|3-гидроксилазы, функционального гиперкортицизма, синдрома поликистозных яичников, смешанных форм гиперандрогении и субклинического синдрома Иценко-Кушинга. Показано диагностическое значение определения динамики уровней 11-дезоксикортизола, 11-дезоксикортикостерона, кортикостерона и соотношений кортизол/ 11-дезоксикортизол и кортизол/кортизон при проведении пробы с кортикотропином для выявления недостаточности -гидроксилазы.
Разработан алгоритм оценки гормональной активности случайно обнаруженных опухолей коры надпочечников, позволяющий диагностировать субклинический синдром Иценко-Кушинга до проведения пробы с дексаметазоном и стертые формы ВГКН у больных с инциденталомами коры надпочечников. Алгоритм лабораторной диагностики различных форм вирильного синдрома позволяет диагностировать стертую форму ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы до проведения пробы с кортикотропином.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. Исследование качественного и количественного состава кортикостероидов в крови и моче методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии позволяет получить специфические хроматограммы стероидных профилей при различных заболеваниях коры надпочечников, установить на ранних стадиях нарушения надпочечникового стероидогенеза и метаболизма кортизола у больных с инциденталомами, дифференцировать стертые формы ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы и 11р-гидроксилазы, органический и функциональный гиперкортицизм и способствует оптимизации тактики лечения больных с вирильным синдромом и со случайно обнаруженными опухолями коры надпочечников.
2. Общими информативными лабораторными критериями стертых форм ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы и 11р-гидроксилазы по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии являются уменьшение экскреции свободного кортизола с мочой, снижение соотношения свободный кортизол / свободный кортизон, уменьшение соотношения кортизол / кортизон до и в результате стимуляции кортикотропином, качественные изменения стероидных профилей в крови и моче.
3. Недостаточность 11р-гидроксилазы диагностируется у больных с вирильным синдромом и у больных с инциденталомами при проведении пробы с кортикотропином на основании увеличения в крови уровней 11-дезоксикортизола, 11-дезоксикортикостерона, снижения прироста уровня кортикостерона и соотношений кортизол/11-дезоксикортизол и кортизол/кортизон, полученных по данным высокоэффективной
жидкостной хроматографии, и по снижению прироста в крови уровня альдостерона, полученного методом радиоиммунологического анализа.
4. Информативными биохимическими критериями синдрома поликистозных яичников по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии являются увеличение экскреции свободного кортизона с мочой и снижение соотношения свободный кортизол/свободный кортизон в моче, нормальные уровни в крови промежуточных продуктов стероидогенеза, а по данным традиционных методов анализа - снижение в крови уровня глобулина, связывающего половые гормоны и увеличение уровней инсулина и С-пептида.
5. Наиболее информативными лабораторными критериями субклинического синдрома Иценко-Кушинга по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии являются увеличение экскреции свободного кортизола и свободного кортизона с мочой, недостаточное понижение их экскреции на пробе с дексаметазоном, повышение соотношений кортизол/кортизон в крови и свободный кортизол/свободный кортизон в моче, качественные изменения стероидных профилей в крови и моче.
6. Алгоритмы лабораторной диагностики различных форм вирильного синдрома и случайно обнаруженных опухолей коры надпочечников на основании качественного и количественного определения кортикостероидов в крови и моче методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и информативных показателей, полученных методами иммуноферментного и радиоиммунологического анализа, позволяют дифференцировать стертые формы ВГКН и синдром поликистозных яичников, диагностировать субклинический синдром Иценко-Кушинга до проведения пробы с дексаметазоном, а стертую форму ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы до проведения пробы с кортикотропином.
Личный вклад автора. Участие автора в исследовании выразилось в определении основной идеи работы, личном участии в проведении лабораторных исследований, выполнении статистической обработки и анализа полученных данных.
Апробация работы.
Результаты исследования доложены на заседаниях ассоциации эндокринологов Санкт-Петербурга и Ленинградской области (1999, 2001,2004), Российской конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика АМН СССР В.Г. Баранова, «Актуальные вопросы эндокринологии» (Санкт-Петербург, 2000 г.), 1У Всероссийском конгрессе эндокринологов «Актуальные проблемы современной эндокринологии» (Санкт-Петербург, 2001), 1-ой и 2-ой Международных конференциях «Высокие медицинские технологии XXI века» (Испания, Бенидорм, 2002 и 2003), Всероссийской научно-практической конференции «Клиническая эндокринология-достижения и перспективы» (Санкт-Петербург, 2003), 111 Международном симпозиуме «100 лет хроматографии» (Москва, 2003 г.), 22-м Всемирном Конгрессе «Патология и
лабораторная медицина» (Южная Корея, Бусан, 2003), 2-ой Международной конференции «Врачи мира пациентам» (Санкт-Петербург, 2003).
Реализация результатов исследования. Результаты проведенного исследования внедрены в лечебно-диагностическую работу клиник ГОУ ДПО СПбМАПО Росздрава, эндокринного отделения больницы Св. Преподобномученицы Елизаветы (СПб), в педагогический и научно-исследовательский процессы кафедры эндокринологии им. акад. В.Г. Баранова ГОУ ДПО СПбМАПО Росздрава.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 56 работ, в том числе 10 - в центральных журналах, рекомендованных ВАК, в главе монографии «Синдром Иценко-Кушинга». Получены 3 патента на изобретение, 2 приоритета на изобретение.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 288 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя, содержащего 365 источников, из которых 113 на русском языке. Работа иллюстрирована 36 рисунками и 40 таблицами.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования
Всего обследовано 228 человек (179 женщин и 49 мужчин) с различными опухолями коры надпочечников в возрасте от 18 до 60 лет (средний возраст 44,7± 5,1 лет) и 220 женщин репродуктивного возраста с различными формами вирильного синдрома в возрасте от 16 до 44 лет (средний возраст 27,5±1,3 лет). Контрольную группу № 1 составили 30 здоровых женщин в возрасте от 22 до 40 лет (средний возраст 28,2±6,5 лет) с нормальным индексом массы тела (ИМТ) 23,6 ±1,1 кг/м2, контрольную группу №2 - 18 женщин с алиментарно-конституциональным ожирением в возрасте от 25 до 40 лет (средний возраст 30,9±9,3) и ИМТ 31,8±4,0 кг/м2. Для разработки критериев субклинического синдрома Иценко-Кушинга в качестве контрольной группы (№3) обследованы 54 человека (42 мужчины и 12 женщин) с ожирением с розовыми стриями в возрасте от 18 до 38 лет (средний возраст 25,6± 9,5 лет) и ИМТ 33,3±5,7 кг/м2.
Отбор больных проводился в клиниках и на клинических базах ГОУ ДПО СПбМАПО Росздрава.
Клиническими признаками избытка андрогенов являлись наличие гирсутизма (избыточное оволосение в андроген-зависимых зонах), вульгарных угрей и андрогенного облысения в лобно-теменной области.
Всем больным с опухолями коры надпочечников и с вирильным синдромом проводили общеклиническое, эндокринологическое и лучевое обследование. Больные с СПКЯ обследовались в совместной работе с сотрудниками кафедры функциональной диагностики СПб МАПО (зав. кафедрой - член-корр. РАМН, д.м.н. профессор Беляков НА., врач-исследователь - Глухов Н.В.). Для исключения андроген-секретирующих новообразований в яичниках, а также для подтверждения наличия поликистоза в яичниках всем пациенткам было проведено комбинированное трансабдоминально-трансвагинальное УЗИ
органов малого таза. В соответствии с рекомендациями согласительного симпозиума ультразвуковым критерием поликистозной картины яичников являлось наличие 12 или более фолликулов диаметром 2-9 мм и/или увеличение объема яичников (более 10 мл), причем достаточным являлось обнаружение таких изменений хотя бы в одном из яичников.
Для диагностики синдрома поликистозных яичников (СПКЯ) использовали критерии согласительного симпозиума 2003 года в г. Роттердам (Нидерланды) [The Rotterdam PCOS consensus, 2004]. Согласно этим критериям диагноз СПКЯ устанавливался при наличии двух из трех следующих условий:
1. Олиго- и/или ановуляция
2. Клинические и/или биохимические признаки гиперандрогении (ГА)
3. Ультразвуковая картина поликистоза яичников.
Диагноз стертой формы ВГКН вследствие дефекта 21-гидроксилазы устанавливали при проведении пробы с синтетическим аналогом кортикотропина пролонгированного действия (препарат «синактен-депо») в модификации, разработанной в Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН [Дзенис И.Г. и др., 1995].
Все больные с инциденталомами на момент обращения имели установленное при ультразвуковом исследовании (УЗИ) и/или комьютерной томографии (КТ) органов брюшной полости, предпринятых по поводу других заболеваний, опухолевое образование в проекции надпочечника при отсутствии клинических признаков гиперсекреции гормонов коры надпочечников, что соответствует общепринятым критериям инциденталомы надпочечника.
Субклинический синдром Иценко-Кушинга диагностировали у больных с инциденталомами без явных клинических проявлений гиперкортизолизма, имеющих не менее двух признаков нарушения регуляции гипофизарно-надпочечниковой системы (коэффициент ритма секреции кортизола >50, коэффициент подавления кортизола на пробе с дексаметазоном >50, АКТГ<10 пг/мл) [Price J.N., 1998; Suda T, 2002].
Для оценки системы гипофиз-кора надпочечников в сыворотке крови методом ИФА определяли уровни кортизола (К), тестостерона (Т), лютеинизирующего гормона (ЛГ), фолликулостимули- рующего гормона (ФСГ), дегидроэпиандростерона-сульфата (ДГЭА-С) стандартными тест-наборами фирмы Алкор-БИО (Россия). Свободный тестостерон (FT), 5а-дигидротестостерон (ДГТ), ДЭА, Д4-андростендион (А4), 17-гидроксипрогестерон (17-ОНП), глобулин, связывающий половые гормоны (ГСПГ), инсулиноподобный фактор роста-1 (ИФР-1) определяли стандартными наборами фирмы DRG International (США). Содержание в сыворотке крови альдостерона, адренокортикотропного гормона (АКТГ), инсулина и С-пептида, активность ренина плазмы (АРП) определяли радиоиммунологическим методом с помощью стандартных тест-наборов фирмы Cis Bio International (Франция).
Для изучения особенностей стероидогенеза использовали метод обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Хроматографический анализ кортикостероидов проводили на жидкостном
хроматографе НРР-4001 с ультрафиолетовым детектором LCD 2563 фирмы «Laboratorni Pristroje Praha» (Чехия) в режиме изократического элюирования с УФ-детектированием (254 нм); скорость элюирования - 0,3 мл/мин.; колонка Luna (5 мкм), ЮОА, 150 х 2 мм. В совместной работе с профессором химического факультета Государственного университета, д.х.н. Л.А.Карцовой была разработана хроматографическая методика количественного определения кортизола (F), кортизона (Е), кортикостерона (В), 11-дезоксикортикостерона (ДОК), 11-дезоксикортизола (S) в сыворотке крови и экскреции свободного кортизола и свободного кортизона с мочой.
Для оценки состояния системы гипофиз-кора надпочечников определяли уровни утреннего кортизола в крови в 8 час. (Ку) и вечернего кортизола в 20 час. (Кв), выполнялась проба на подавление выработки кортизола с 2 мг дексаметазона в течение 3 дней. Оценка показателя, отражающего отклонение циркадного ритма секреции кортизола, рассчитывалась по следующей формуле: коэффициент ритма (к ритма) = (Кв/ Ку) х 100. Для оценки степени подавления уровня кортизола дексаметазоном использовался показатель, вычисляемый по формуле: коэффициент подавления (к подавления) = (Кд / Ку) х 100, где Ку -уровень кортизола до пробы; Кя - уровень кортизола на фоне пробы с 2 мг дексаметазона. Значения Кд более 50 нмоль/л свидетельствовало о нарушении регуляции гипофизарно-адреналовой системы [Amaldy G., 2003].
Для оценки преимущественного источника синтеза андрогенов женщинам со стертой формой ВГКН проводили пробу с 2 мг дексаметазона. Снижение уровня тестостерона более, чем на 75% от исходного расценивалось как преимущественно адреналовое происхождение гиперандрогении [Манухин И.Б. и др., 2002].
Статистическая обработка данных осуществлялась с использованием программной системы STATISTICA for WINDOWS (версия 5.5.). Количественные показатели представлены в виде Me (LQ-UQ), где Ме-медиана, LQ-нижний квартиль, UQ-верхний квартиль. Сравнение средних значений количественных показателей осуществлялось с использованием непараметрических методов (критерия Манна-Уитни, Вилкоксона, корреляции Спирмена). Статистически значимым считался критерий достоверности р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Оптимизация условий хроматографического разделения стероидных гормонов. Оптимизацию условий хроматографического разделения проводили с использованием растворов стандартов стероидов. Для улучшения разделения стероидов, имеющих близкие параметры удерживания, применяли р-циклодекстрин ф-ЦЦ; 3,0 мМ), введение которого в состав элюента привело к увеличению разрешения для всех компонентов смеси и повышению эффективности разделения (рис.1). Отмечено, что присутствие ЦД не только улучшает разрешение стероидов, имеющих близкие параметры удерживания (кортизол и кортизон), но и значительно снижает факторы удерживания более гидрофобных стероидов (11-дезоксикортикостерона и 11-
дезоксикортизола), что приводит к сокращению времени анализа. Поскольку комплексообразование в системе стероидный гормон - Р-ЦД растет с повышением процентного содержания воды в составе элюента, нами была проведена специальная серия экспериментов с добавкой Р-ЦД в подвижную фазу СЫ3С№ Н2О (30:70 %, по объему) (рис.2).
В отсутствии р-ЦД для стероидных гормонов, отличающихся по гидрофобности, требовалось использование двух подвижных фаз ацетонитрил:вода в различных соотношениях. Для определения Б, Е и В (1 часть хроматограммы) СЫ3СК : Н2О - 26:74 % (по объему), а для определения ДОК и 8 (2 часть хроматограммы) СЫ3СК : Н2О -41:59 % (по объему).
О 0,5 I 1,5 2 2,5 } о 1 2 3 4
Рис. 1. Зависимость разрешения Rs(A) и эффективности разделения N (Б) кортизолаи кортизона от концентрации ß-циклодексгрина (ЦД). Элюент - ацетонитрил : вода 45:55 v/v.
Рис. 2. Зависимость относительных факторов удерживания стероидов от концентрации Р-циклодекстрина (элюент- ацетонитрил : вода 30 : 70 v/v).
Проведена сравнительная количественная оценка (по значениям степеней извлечения) жидкостно-жидкостной и твердофазной экстракции с использованием различных сорбентов и элюирующих систем. Эффективность жидкостной экстракции (степень извлечения) кортикостероидов составила 75,8 - 98,3%, наибольшая - для кортизола и наименьшая - для 11-дезоксикортикостерона, а эффективность твердофазной экстракции варьировала в диапазоне от 64,0 - 77,0%. Предпочтение было отдано варианту жидкостной экстракции с хлористым метиленом, использованным в качестве экстрагента для количественного определения кортикостероидов в сыворотке крови, и с хлороформом - для определения экскреции свободного кортизола и свободного кортизона с мочой. Была определена воспроизводимость, рассчитан коэффициент внутрисерийной вариации для каждого из определяемых стероидов: СУр=2,6%, СУЕ=4,6%, СУДос=4,9%, СУ5=5,6%, СУВ=5,5%. Предел обнаружения стероидных гормонов составил 1,5-2,0 нг/мл. В оптимизированных условиях осуществлен анализ реальных проб. Для анализа брали 1 мл сыворотки крови и 2 мл мочи. Полученные аналитические характеристики соответствовали необходимым требованиям, предъявляемым к количественному определению кортикостероидов.
2. Лабораторная диагностика различных форм вирильного синдрома с помощью метода иммуноферментного анализа. Основными клиническими проявлениями вирильного синдрома были гирсутизм (93,1%), нарушение менструального цикла (78,7%), аменорея (7,9%), бесплодие (6,9%), ожирение (15,7%) и умеренная артериальная гипертензия (7,4%).
Всем женщинам с вирильным синдромом проведена проба с кортикотропином. Стертая форма ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы на основании традиционных методов была установлена у 49 (22,7%) больных с вирильным синдромом (табл. 1). Уровень 17-ОНП в сыворотке крови при стимуляции кортикотропином был увеличен до 10,5/6,4-12,2 нг/мл, р<0,0001, Д=0,81/0,56-1,09, р<0,001. У 15 (6,8%) больных с вирильным синдромом проба на основании критерия «Д», равного 0,66/0,48-0,81, была положительная, но уровень 17-ОНП при стимуляции кортикотропином составил 7,15/5,2-7,8 нг/мл и не отличался от соответствующего показателя у здоровых (р=0,16). Наличие поликистозных изменений в яичниках и снижение подавления уровня тестостерона на пробе с дексаметазоном, которое составило 37,0/25-43%, позволило расценить характер гиперандрогении у данных больных, как смешанный. У остальных больных с вирильным синдромом проба с кортикотропином была отрицательная (табл.1).
Содержание андрогенов в крови у больных с вирильным синдромом представлены в таблице 2. У больных со стертой формой ВГКН в отличие от больных с СПКЯ были повышены в крови базальные уровни АКТГ, 17-гидроксипрогестерона, тестостерона и ДГЭА-сульфата (табл. 1 и 2). Уровни в крови свободного тестостерона, 5а-дигидротестостерона, ДГЭА и андростендиона были увеличены по сравнению с контрольной группой, как у больных со стертой формой ВГКН, так и у больных с СПКЯ, что
свидетельствует о неинформативности данных показателей в дифференциальной диагностике надпочечниковой и яичниковой гиперандрогении (табл.2). Снижение уровня ГСПГ, увеличение уровней
Таблица 1.
Содержание в крови кортизола и 17-гидроксипрогестерона при стимуляции кортикотропином у больных с различными формами вирильного синдрома
Группы АКТГ пг/мл К-1 нмоль/л К-2 нмоль/л 17-ОНП-1 нг/мл 17-ОНП-2 нг/мл
1. Здоровые (п-30) 25,5 15,0-35,0 344 257-465 1960 1575-2370 0,9 0,6-1,2 4,6 3,6-5,1
2. ВГКН-стертая форма (п=49) 45,1 15,0-55,0 р=0,019 499 236-585 р=0,78 1500 1200-1778 р=0,025 3,5 1,5-5,6 р<0,001 10,5 6,4-12,2 р<0,001
3. Смешанная форма гиперандрогении (п=15) 34,0 18,0-57,0 р=0,13 606 500-800 р<0,001 1200 992-1550 Р=0,018 1,4 1,2-3,4 р=0,016 7,2 5,2-7,8 р=0,16
4.Функциональный гиперкортицизм (п=29) 39,0 25,0-57,0 р=0,037 675 540-731 р<0,001 2000 1662-2300 р=0,95 1,2 0,9-1,5 р=0,078 4,5 2,9-5,0 р=0,087
5. Идиопатический гирсутизм (п=30) 23,0 15,9-27,5 р=0,48 501 404-657 р =0,001 1878 1050-2500 р=0,63 0,9 0,5-1,3 Р= 0,55 3,5 3,2-5,0 р=0,39
б.Синдром поликистозных яичников (п=62) 35,0 21,5-45,0 р=0,06 433 330-664 р=0,02 1598 1400-2063 р=0,13 1,2 0,8-2,0 р=0,07 5,1 4,3-5,6 р=0,19
К-1,17-ОНП-1- уровни кортизола и 17-гидроксипрогестерона в 9 час.
К-2, 17-ОНП-2 - уровни кортизола и 17-гидроксипрогестерона через 9 час. после введения
синактена-депо.
р - уровень статистической значимости различий по сравнению с контрольной группой здоровых
инсулина и С-пептида и отношения ЛГ/ФСГ отмечены только у больных с синдромом поликистозных яичников с ожирением (табл. 3). У больных с СПКЯ с нормальным ИМТ отмечено повышение уровня ИФР-1 до 317/195-439 нг/мл, р=0,002 по сравнению с соответствующим уровнем у здоровых 153/126-176 нг/мл. Полученные данные свидетельствовали о недостаточности биохимических критериев, полученных с помощью традиционных методов, для диагностики первичного поликистоза яичников и дали возможность предположить наличие в этой группе больных со смешанной формой гиперандрогении, для диагностики которой необходимы дополнительные биохимические критерии. Небольшая разница в гормональных показателях у
больных со стертой формой ВГКН и у больных с СПКЯ также вызывает трудности в дифференциальной диагностике данных форм вирильного синдрома.
Таблица 2.
Содержание в крови андрогенов при различных формах вирильного синдрома
Группы т нмоль/л Св. Т пг/мл ДГТ пг/мл ДГЭА нг/мл ДГЭА-С мкг/мл А< нг/мл
1. Здоровые (п=30) 1,8 1,4-2,4 0,6 0,5-1,5 250 175-290 7,1 6,0-8,4 1,9 1,4-2,5 1,6 1,3-2,0
2. ВГКН-стертая форма (и-49) 3,1 1,8-4,0 р=0,0002 2,9 1,1-4,4 р=0,008 486 441-560 р=0,005 14,5 13,0-18,0 р<0,001 2,8 2,0-4,0 р<0,001 4,2 3,2-6,2 р<0,001
3. Смешанная форма гиперандрогеиии (п=15) 2,9 2,5-3,9 р=0,016 1,4 1,0-1,8 р=0,036 390 330-520 р=0,038 15,0 13,8-21,3 р< 0,001 2,7 2,4-4,2 р=0,18 4,0 2,8-4,9 р=0,048
4. Функциональный гиперкортицизм (п=29) 2,1 1,9-3,3 р=0,14 1,7 1,5-3,5 р=0,055 385 325-550 р=0,045 17,5 13,0-19,0 р<0,001 2,8 1,9-3,5 р=0,006 4,4 2,7-5,4 р=0,001
5. Идиопатический гирсутизм (п=30) 1,9 1,6-2,3 р=0,79 1,6 1,3-2,4 р=0,059 375 320-600 р=0,018 10,9 9,9-12,2 р<0,001 1,9 1,8-2,7 р=0,42 2,2 1,9-3,2 р=0,97
6. Синдром полихи-стозных яичников <П=62) 2,3 1,6-2,9 р=0,095 3,7 1,6-5,7 р=0,004 410 350-499 р<0,001 13,0 10,0-15,5 р<0,001 2,3 1,5-3,1 р=0,17 4,2 2,9-4,8 р<0,001
р - уровень статистическом значимости различии по сравнению с контрольной группой здоровых
Таблица 3.
Содержание в крови уровней глобулина, связывающего половые гормоны, инсулина, С-пептида и отношения ЛГ/ФСГ у больных со стертой формой
Группы гспг Инсулин С-пептид ЛГ/ФСГ
нмоль/л мкед/мл нг/мл
1. Здоровые 84,0 7,0 0,61 0,75
(п=30) 72,0-98,0 4,0-10,1 0,36-1,10 0,52-1,07
2. ВГКН - 75,0 7,8 0,72 0,83
стертая форма 67,4-105,0 3,0-15,4 0,66-2,60 0,44-1,08
(п=49) р=0,91 р=0,83 р=0,40 р=0,70
3. СПКЯ 37,0 18,6 1,38 1,40
(п=62) 29,0-59,0 11,3-27,5 0,94-2,60 1,33-1,72
р<0,001 р <0,001 р <0,001 р <0,001
3.1. СПКЯ 74,0 11,0 0,80 1,29
ИМТ 25-30 38,4-83,0 9,0-16,8 0,70-2,10 0,94-1,34
(п=40) р=0,13 р = 0,05 р= 0,23 р=0,43
3.2. СПКЯ 32,0 20,6 1,40 1,40
ИМТ 30-35 24,0-43,3 14,8-32,0 1,10-2,70 1,34-1,72
(п=22) р <0,001 р <0,001 р<0,001 р =0,018
р - уровень статистической значимости различий здоровых
по сравнению с контрольной группой
У больных с функциональным гиперкортицизмом отмечено повышение в крови уровней АКТГ, кортизола, ДГЭА, ДГЭА-сульфата, дигидротестостерона и андростендиона по сравнению со здоровыми (табл.1 и 2). При проведении пробы с дексаметазоном уровни кортизола, тестостерона и ДГЭА снизились более, чем на 75%. Данные УЗИ органов малого таза соответствовали нормальным показателям. Недостаточность ферментов надпочечникового стероидогенеза не была установлена у больных с помощью традиционных методов лабораторной диагностики, что позволило расценить характер гиперандрогении у данных больных, как функциональный. У больных с идиопатическим гирсутизмом были повышены в крови уровни кортизола и ДГЭА, но в меньшей степени, чем у больных с функциональным гиперкортицизмом, достоверные различия были отмечены в уровнях тестостерона (р=0,045) и ДГЭА (р=0,0012).
3. Лабораторная диагностика различных форм вирильного синдрома с помощью метода обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Нарушения надпочечникового стероидогенеза по данным ОФ ВЭЖХ кортикостероидов крови у больных со стертой формой ВГКН были менее выражены, чем у больных с простой вирильной формой (табл.4). У больных со стертой формой ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы и у больных с простой вирильной формой были снижены уровень кортизола и соотношение кортизол/кортизон, повышен уровень 11-дезоксикортизола. Средние уровни кортизона, кортикостерона и 11-дезоксикортикостерона у больных со стертой формой ВГКН не отличались от соответствующих показателей у здоровых (табл.4). Однако, у 42,5% (21 чел.) больных со стертой формой ВГКН было отмечено повышение уровня кортикостерона, у 10,0% (4 чел.) - уровня 11-дезоксикортикостерона, у 15,0% (6 чел) - уровней 11-дезоксикортикостерона и 11-дезоксикортизола, увеличение уровня 11-дезоксикортизола отмечено у 34,7% (17 чел.). Нормальные уровни промежуточных продуктов стероидогенеза получены у 22,8% (11 чел.). Больные со стертой формой ВГКН были разделены на две группы. Группу 3.1. составили пациенты, у которых были повышены в крови уровни 11-дезоксикортизола и 11-дезоксикортикостерона, что могло быть связано с недостаточностью 11р--гидроксилазы. Остальные больные со стертой формой ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы составили группу 3.2. (табл.4).
У больных со стертой формой ВГКН с дефектами 21-гидроксилазы и 110-гидроксилазы были снижены соотношения Б/Е и ирр/ирв и уменьшена экскреция свободного кортизола с мочой (табл.5). Полученные данные являются общими критериями стертой формы ВГКН с различными ферментативными дефектами. Увеличение в крови уровня кортикостерона характерно для ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы, а увеличение уровней 11-дезоксикортизола и 11-дезоксикортикостерона - для недостаточности 11р-гидроксилазы (табл.4).
Биохимические критерии диагностики ВГКН с дефектом 11р-гидроксилазы были разработаны на основании динамики кортикостероидов
крови, полученных методом ОФ ВЭЖХ, и уровня альдостерона в крови при стимуляции кортикотропином у 40 больных с вирильным синдромом. У данных пациентов был увеличен базальный уровень 11-дезоксикортизола до 5,8/2,0-11,2 нг/мл, р=0,002. У 14 (35%) больных было отмечено повышение по сравнению со здоровыми уровня 11-дезоксикортизола и 11-дезоксикортикостерона, уменьшение соотношения F/S и уровня кортикостерона при стимуляции кортикотропином, что свидетельствовало о недостаточности 11р-гидроксилазы (табл. 6).
Таблица 4.
Данные ОФ ВЭЖХ кортикостероидов крови при различных формах вирильного синдрома
Наименование групп F нг/мл Е нг/мл В нг/мл DOC нг/мл S нг/мл F/E
1. Здоровые (п=30) 63,6 51,8-71,7 19,9 15,5-22,6 3,1 2,0-3,5 2,3 1,9-2,8 2,0 1,5-2,5 3,3 2,7-3,6
2. ВГКН-простая вирильная форма (п=16) 18,1 5,3-35,2 р< 0,001 24,2 7,4-43,5 Р=0,31 19,8 5,0-45,8 р=0,001 6,4 3,7-21,6 р=0,025 5,0 3,0-9,8 р=0,003 1,00 0,5-1,8 р=0,001
3. ВГКН - стертая форма (п=49) 48,4 34,7-63,4 р=0,009 17,7 14,0-25,5 р=0,86 3,1 2,1-7,0 р=0,56 2,3 1,0-3,2 р=0,2 4,7 2,0-9,6 р=0,004 2,4 1,9-3,3 р=0,002
3.1.ВГКН- стертая форма(дефект 11Р-ГД) (п=17) 51,3 31,5-65,0 р=0,01 17,1 13,6-26,9 р=0,96 3,0 2,0-5,0 р=0,76 10,0 3,0-17,0 р=0,037 9,5 3,0-15,9 р<0,001 2,3 1,8-3,1 р<0,001
3.2. ВГКН- стертая форма (дефект 21-ГД) (п=32) 58,8 37,5-72,0 р=0,27 21,1 18,0-27,0 р=0,068 8,5 7,0-11,1 р<0,001 3,0 2,0-4,8 р=0,6 2,4 2,0-3,0 р=0,24 2,6 1,8-3,4 р=0,006
4.Синдром полики-стозных яичников (п=49) 72,4 56,0-98,0 р=0,064 21,5 14,3-29,3 р=0,28 3,0 2,0-3,6 р=0,86 3,0 2,0-3,8 р=0,052 2,2 2,0-5,5 р=0,065 3,4 2,7-4,2 р=0,65
5. Смешанная форма гиперандрогении (п=22) 128,7 80,2-163,8 р=0,003 25,6 18,6-42,2 р=0,053 5,9 4,5-14,6 р=0,001 6,1 3,0-12,7 р=0,006 3,0 2,0-10,4 р=0,014 4,7 2,7-6,9 р=0,064
б.Функциональный гиперкортицизм (п=29) 108,1 89,3-153,5 р<0,001 28,7 23,6-32,7 р<0,002 7,9 3,2-10,3 р<0,001 2,0 1,0-3,9 р=0,29 2,4 2,0-4,4 р=0,19 4,5 3,0-5,6 р=0,056
7,Идиопатический гирсутизм (п=27) 84,5 63,3-109,7 р=0,009 21,1 16,5-30,0 р=0,25 3,0 2,14,0 р=0,13 3,0 2,0-3,5 р=0,59 3,0 2,0-3,9 р =0,055 3,4 2,8-3,8 р=0,21
р - уровень статистической значимости различий по сравнению с контрольной группой здоровых, ВГКН-СФ - стертая форма ВГКН, 21-ГД-21-гидроксилаза, 11р-ГД - 11р-гидроксилаза
Таблица 5.
Экскреция свободного кортизола (UFF) и свободного кортизона (UFE) с мочой при различных формах вирильного синдрома
Наименование групп Кол-во UFF мкг/с UFE мкг/с UFF/UFE
1. Здоровые 30 13,6 11,5-14,6 36,9 27,5-40,6 0,37 0,33-0,47
2. Алиментарно-конституциональное ожирение 18 18,8 14,5-21,9 р< 0,001 46,8 39,0-52,4 р =0,001 0,39 0,35-0,45 р = 0,51
3. ВГКН - стертая форма: 3.1. дефект 11 Р-гидроксилазы 17 6,6 5,0-9,3 р<0,001 23,6 15,0-37,4 р=0,022 0,30 0,23-0,38 р—0,019
3.2. дефект 21 -гидроксилазы 32 7,4 4,4-11,9 р=0,01 28,1 18,7-39,1 р=0,15 0,28 0,21-0,35 р=0,001
4. Синдром поликистозных яичников (ИМТ 30-35) 33 12,8 8,1-20,5 р=0,84 Р4-2=0,69 50,0 31,6-82,9 р=0,019 р4.2=0,16 0,29 0,19-0,34 р=0,001 р4.2=0,043
5. Синдром поликистозных яичников (ИМТ 25-30) 16 15,2 10,1-31,0 р=0,26 49,2 36,8-86,6 р =0,021 0,31 0,29-0,38 р = 0,048
6. Смешанная форма гиперандрогении 22 28,3 14,7-53,6 р=0,022 67,0 57,2-103,5 р=0,008 0,43 0,34-0,46 р=0,53
7. Функциональный гиперкортицизм 29 19,6 13,4-26,1 р=0,008 57,5 32,3-68,0 р=0,011 0,40 0,32-0,46 р=0,40
8. Идиопатический гирсутизм 27 17,8 12,5-24,0 р=0,03 46,2 31,8-63,1 р=0,026 0,40 0,25-0,47 Р=0,91
р - уровень статистической значимости различий по сравнению с контрольной группой здоровых
У 8 (20%) больных при стимуляции кортикотропином отмечено увеличение только уровня 11-дезоксикортизола и нормальный прирост уровня кортикостерона по сравнению со здоровыми, что может свидетельствовать о недостаточности изофермента ИР-гидроксилазы-1 (табл.6). У 15% больных с вирильным синдромом увеличение базального и стимулированного кортикотропином уровня 11-дезоксикортикостерона до 4,5/3,0-4,8 нг/мл, р=0,002 и снижение уровня кортикостерона по сравнению со здоровыми при
нормальном уровне 11-дезоксикортизола может указывать на недостаточность изофермента 11р-гидроксилазы-2 (табл.6). Снижение соотношения
Таблица 6.
Данные ОФ ВЭЖХ кортикостероидов крови при стимуляции кортикотропином у больных со стертой формой ВГКН с недостаточностью 11р-гидроксилазы
Группы F нг/мл В нг/мл DOC нг/мл s нг/мл F/S F/E
1. Здоровые (п=10) 295 272-307 34,9 28,8-38,8 1,5 1,0-2,0 1,0 1,0-1,0 295 272-307 9,3 5,0-11,50
2. ВГКН-стертая форма (11Р-ГД) (п=14) 181 144-210 р <0,001 15,1 10,8-17,3 р=0,017 3,0 1,0-6,1 р=0,008 17,0 7,7-25,3 р<0,001 8,9 6,2-13,9 р<0,001 4,6 4,1-5,1 р=0,042
3. ВГКН-стертая форма (Пр-ГД-1) (п=8) 193 168-212 р = 0,001 28,2 22,5-30,8 р = 0,06 1,9 1,0-2,5 р=0,088 11,6 6,0-23,5 р<0,001 14,1 7,3-20,3 р=0,001 4,2 2,6-4,9 р=0,014
4. ВГКН-стертая форма (11Р-ГД-2) (а=6) 217 179-243 р=0,009 19,0 18,5-19,3 р=0,002 4,5 3,0-4,8 р=0,002 1,0 1,0-1,0 р=0,86 169 160-217 р=0,018 4,4 2,5-5,9 р=0,034
5.Функциональный гиперкортицизм ОНО) 465 369-467 р=0,044 53,4 39,1-77,7 р=0,035 1,0 1,0-1,0 р=0,58 1,0 1,0-2,7 р=0,58 316 241-465 р=0,64 5,6 5,0-10,0 р=0,85
б.ГНО (ч=9) 168 130-176 р=0,003 15,7 9,8-18,1 р=0,028 2,9 2,0-5,1 р=0,013 23,2 7,7-28,7 р=0,003 7,6 6,2-13,9 р=0,003 3,9 3,5-4,1 р=0,009
р - уровень статистической значимости различий по сравнению с контрольной группой здоровых
кортизол/кортизон и уменьшение прироста уровня альдостерона по сравнению со здоровыми при стимуляции кортикотропином были общими критериями для недостаточности изоферментов 11р-гидроксилазы. Уменьшение прироста уровня альдостерона у больных с дефектом 11р-гидроксилазы до 104/90-200 m/мл, р=0,02, а у больных с недостаточностью 21-гидроксилазы увеличение прироста уровня альдостерона до 465/390-520 m/мл, р=0,026 по сравнению со здоровыми, у которых прирост уровня альдостерона составил 270/250-300 пг/мл, является дополнительным критерием при дифференциальной диагностике этих форм ферментативных нарушений надпочечникового стероидогенеза.
У 30% больных с вирильным синдромом при стимуляции кортикотропином не было отмечено повышения уровня 11-дезоксикортизола. Нормальный прирост уровня кортикостерона и соотношения кортизол/кортизон дал возможность исключить недостаточность 11р-гидроксилазы.
Таким образом, стертая форма ВГКН с дефектом 11р-гидроксилазы диагностируется на основании повышенных уровней в крови 11-дезоксикортизола, 11-дезоксикортикостерона, снижения соотношений F/S и F/E, уменьшения прироста уровней кортикостерона и альдостерона, полученных при стимуляции кортикотропином у больных с вирильным
синдромом. Недостаточность 11р--гидроксилазы была установлена у 10% больных с идиопатическим гирсутизмом, у 9,7% больных с первоначальным диагнозом СПКЯ и у больных с вирильным синдромом, у которых причина гиперандрогении традиционными методами не была установлена.
По данным ОФ ВЭЖХ кортикостероидов крови у 11,3% (7 чел.) больных с предварительным диагнозом СПКЯ увеличение уровней кортизола и промежуточных продуктов стероидогенеза (кортикостерона 11-дезоксикортикостерона и 11-дезоксикортизола), качественные изменения стероидного профиля дали основание расценить характер гиперандрогении у данных больных как смешанный. У 9,7% диагностирована стертая форма ВГКН с дефектом 11р-гидроксилазы. У остальных больных с СПКЯ средние уровни в сыворотке крови кортизола, кортизона, кортикостерона, 11-дезоксикортикостерона и 11-дезоксикортизола достоверно не отличались от соответствующих показателей в контрольной группе (табл.4).
Отмечено повышение экскреции свободного кортизона с мочой и уменьшение соотношения ирр/иРЕ как у больных с СПКЯ с ожирением, так и у больных с СПКЯ с нормальным ИМТ (табл.5), которые не были обнаружены в других группах больных с вирильным синдромом. У больных с СПКЯ с ожирением достоверность различий сохраняется при сравнении данных показателей с соответствующими показателями у больных с алиментарно-конституциональным ожирением. Полученные данные дают основание считать увеличение экскреции свободного кортизона с мочой и уменьшение соотношения ирр/ирЕ в моче дополнительным диагностическим признаком СПКЯ и свидетельствуют о дефекте фермента 110-гидроксистероиддегидрогеназы-1, который может играть определенную роль в развитии инсулинорезистентности у больных с СПКЯ.
У больных с функциональным гиперкортицизмом по данным ОФ ВЭЖХ отмечено увеличение в крови уровней кортизола, кортизона и кортикостерона и нормальное соотношение кортизол/кортизон. Экскреция свободного кортизола и свободного кортизона с мочой была повышена, а соотношение ирР/иРЕ не отличалось от соответствующего показателя у здоровых. При стимуляции кортикотропином отмечено увеличение прироста уровней в крови кортизола и кортикостерона по сравнению со здоровыми, а соотношение кортизол/кортизон было, как в контрольной группе (табл. 6). Повышение у данных больных в крови уровней АКТГ, кортизола и андрогенов, нормальное подавление уровней тестостерона и кортизола на пробе с дексаметазоном, увеличение уровней кортизола и кортикостерона при стимуляции кортикотропином свидетельствуют о функциональном гиперкортицизме, связанном с периферической резистентностью к глюкокортикоидам, что способствует развитию гиперандрогенемии.
У больных с идиопатическим гирсутизмом увеличение в крови уровней кортизола и ДГЭА, повышение экскреции свободного кортизола и свободного кортизона с мочой, нормальные соотношения р/Е и ирр/ирЕ дали основание считать характер гиперандрогении у данных больных функциональным.
При сопоставлении данных по количественному и качественному определению кортикостероидов в крови и моче методом ОФ ВЭЖХ и по содержанию гормонов в крови, полученного традиционными методами ИФА и РИА, произошло количественное перераспределение больных с вирильным синдромом. У 12,7% больных (при отрицательной пробе с кортикотропином по данным ИФА) выявлена недостаточность 11р-гидроксилазы, что привело к увеличению количества больных со стертыми формами ВГКН до 35,0% и уменьшению количества больных с первоначальным диагнозом СПКЯ до 25,5%, что имело значение для выбора тактики лечения данных больных. Выявление нарушений надпочечникового стероидогенеза у больных с СПКЯ привело к увеличению количества больных со смешанными формами гиперандрогении до 10%. У части больных с первоначальным диагнозом «идиопатический гирсутизм» установлен функциональный гиперкортицизм, что привело к увеличению числа больных с таким характером гиперандрогенемии до 18,2%, (рис. 3).
А
Рис 3. Распределение больных с различными формами вирильного синдрома А - по данным ИФА и РИА, Б - по данным ИФА, РИА и ОФ ВЭЖХ кортикостероидов в крови и моче
У больных с простой вирильной формой, у 31% больных со стертыми формами ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы и 11р--гидроксилазы и у 85% больных с опухолями коры надпочечников при хроматографическом исследовании кортикостероидов в сыворотке крови и моче детектированы дополнительные соединения с одинаковыми относительными параметрами удерживания: перед кортизолом - Х| (гр=0,84±0,08), между кортизоном и кортикостероном - Хг (гр=1,35±0,05) и Х3 (гр=1,87±0,11), перед 11-дезоксикортикостероном - Х4 (Г1х>с=0,80±0,04) и между 11-дезоксикортикостероном и 11-дезоксикортизолом - Х5 (гоос =1,48±0,02) (рис. 4,5,6). Полученные качественные изменения стероидных профилей являются дополнительными признаками нарушения надпочечникового стероидогенеза, что имеет значение при диагностике ранних стадий заболеваний коры надпочечников. В последнее время ряд авторов отмечают значение «обзорных» или «скрининговых» хроматограмм с оценкой всего профиля определяемых соединений для быстрой оценки общего состояния здоровья человека [Тогузов и др., 2004].
Рис. 4. Хроматограмма кортикостероидов крови больной Н. со стертой формой ВГКН с недостаточностью 11р-гидроксилазы. Х2, Х4 и Х5 -неидентифицированные соединения.
Рис. 5. Хроматограмма кортикостероидов крови больной К. с простой вирильной формой ВГКН. Х4 - неидентифицированное соединение.
4. Оценка гормональной активности аденом коры надпочечников.
На основании определения в сыворотке крови уровней АКТГ, кортизола утром и вечером, альдостерона, активности ренина плазмы и результатов пробы с дексаметазоном из 228 больных с аденомами коры надпочечников у 40 больных диагностирован синдром Иценко-Кушинга (СИК), у 28 больных -первичный гиперальдостеронизм. У 160 человек (70,2%) опухоли были гормонально-неактивными. Из них у 67,5% больных не были отмечены нарушения регуляции гипофизарно-надпочечниковой системы, у 22,5% диагностирован субклинический синдром Иценко-Кушинга, у 10% больных на основании гистологического анализа послеоперационного материала диагностирована адренокарцинома.
У больных с СИК отмечено значительное повышение уровней кортизола утром и вечером. При пробе с дексаметазоном уровень кортизола и коэффициент подавления кортизола были повышены в сравнении со здоровыми (табл. 7). У больных с СИК уровень АКТГ был снижен до 14,7/13-15,7 пг/мл, р=0,029 в сравнении со здоровыми. У 24 больных диагностирована БИК с повышением уровня АКТГ в 9 час. до 105/54-158 пг/мл, р<0,0001. Субклинический СИК диагностирован у 22,5% больных с инциденталомами на основании увеличения коэффициента ритма секреции кортизола и коэффициента подавления кортизола на пробе с 2 мг дексаметазона по сравнению с контрольной группой (табл.7). Уровни АКТГ, альдостерона и ангиотензина-1 не отличались от соответствующих показателей в контрольной группе (табл. 8).
Таблица 7.
Показатели нарушений регуляции гипофизарно-надпочечниковой системы у больных с органическим и функциональным гиперкортицизмом
Группы Ку нмоль/л Кв нмол/л (Кв/Ку) х100% Кд нмоль/л (Кд/Ку) х100%
1. Здоровые (п = 30) 368 316-463 128 106-178 33,6 25,8-39,6 40,0 25,0-48,0 14,3 10,7-18,6
2. Ожирение с розовыми стриями (п=54) 556 377-695 р<0,001 250 186-400 р<0,001 50,0 40,1-66,7 р<0,001 55,1 41,0-75,0 р=0,63 10,1 6,6-15,7 р=0,072
3. СИК-субклини-ческая форма (п=36) 530 380-690 р<0,001 256 184-380 р=0,002 69,8 33,4-78,8 р=0,001 260 118-325 р<0,001 49,1 33,1-53,5 р=0,018
4. Болезнь Иценко-Кушинга (п=24) 805 609-1100 р<0,001 810 500-900 р<0,001 81,8 68,7-101,4 р<0,001 561 387-827 р<0,001 63,5 32,1-85,1 р<0,001
5. Синдром Иценко-Кушинга (п=16) 703 600-830 р<0,001 636 505-840 р<0,001 92,9 58,5-109,9 р<0,001 403 250-500 р=0,006 64,2 34,1-66,7 р=0,038
Р2-3 РЗ-4 р=0,58 р=0,005 р=0,76 р=0,001 р=0,58 р=0,06 р=0,005 р=0,006 р=0,005 р<0,001
р - уровень статистической значимости различий по сравнению с контрольной группой.
Таблица 8.
Содержание в крови АКТГ, кортизола, альдостерона и ангиотензина-1 (АРП) у
больных с оп ухолями коры надпочечников
Группы АКТГ пг/мл Кортизол нмоль/л Альдостерон пг/мл АРП нг/мл/час
1. Здоровые (п = 30) 25,5 15,0-35,0 368 316-463 64 40-78 0,88 0,60-1,20
2. Гормонально-не активные опухоли (п=108) 22,5 10,2-34,0 р=0,95 446 299-560 р=0,31 78 34-132 р=0,39 0,40 0,20-0,70 р=0,14
3. СИК-субклини-ческая форма (п=36) 10,2 5,1-27,3 р=0,007 530 380-690 р=0,001 65 49-88 р=0,38 0,40 0,26-1,10 р=0,26
4. Альдостеромы (4=28) 16,0 5,0-21,0 р=0,67 417 358-609 р=о,и 234 147-450 р<0,001 0,20 0,10-0,36 р=0,002
р - уровень статистической значимости различии по сравнению с контрольной группой здоровых
У больных с субклиническим СИК и у больных с ожирением с розовыми стриями уровни кортизола в крови утром и вечером, коэффициент ритма секреции кортизола достоверно не отличались друг от друга. При проведении пробы с дексаметазоном у больных с субклиническим СИК коэффициент подавления кортизола был повышен в сравнении со здоровыми и с больными с ожирением с розовыми стриями. Однако, у 21,4% больных с ожирением с
розовыми стриями уровень кортизола на пробе с дексаметазоном был более 50,0 нмоль/л, а у 11,1% больных с субклиническим СИК отмечено подавление уровня кортизола на пробе с дексаметазоном более, чем на 50% и нормальный ритм секреции кортизола у 27,8%. Таким образом, дифференциальный диагноз функционального и органического гиперкортицизма на основании традиционных методов обследования в отдельных случаях вызывает трудности.
При хроматографическом анализе у больных с явным и с субклиническим СИК обнаружено увеличение в крови уровней кортизола, кортизона, кортикостерона, 11-дезоксикортикостерона, 11-дезоксикортизола, экскреции свободного кортизола и свободного кортизона с мочой, а также соотношений F/E и UFF/UFE по сравнению со здоровыми (табл. 9 и 10). Однако, у больных с субклиническим СИК уровни кортизола и кортикостерона не отличались от соответствующих показателей у больных с ожирением с розовыми стриями и нарушения надпочечникового стероидогенеза были менее выражены, чем у больных с явными формами СИК и БИК. Экскреция UFF и UFE у больных с явным СИК была увеличена более, чем в 10 раз, а у больных с субклиническим СИК- более, чем в 3 раза по сравнению с соответствующими показателями у здоровых и у больных с ожирением с розовыми стриями. При проведении пробы с дексаметазоном у больных с субклиническим СИК экскреции UFFI, UFEI и коэффициент подавления экскреции UFF (UFFI /UFF$x 100) были выше, чем у больных с ожирением с розовыми стриями. Коэффициент подавления экскреции UFF был более 55%, а экскреция UFFe превышала фоновую экскреции UFFe у больных с ожирением с розовыми стриями (табл. 11). У больных с функциональным гиперкортицизмом (ожирение с розовыми стриями) экскреция свободного кортизола и свободного кортизона с мочой была повышена менее, чем в 2 раза, а коэффициент подавления экскреции UFF при проведении пробы с дексаметазоном был менее 40%. У большинства больных с СИК отмечены качественные изменения стероидного профиля в крови и моче. Обнаружены дополнительные соединения перед кортизолом и между кортизоном и кортикостероном (рис. 6).
Таким образом, на основании анализа данных ИФА, РИА и ОФ ВЭЖХ кортикостероидов наиболее информативными критериями лабораторной диагностики субклинического СИК являются увеличение экскреции свободного кортизола и свободного кортизона с мочой более, чем в 3 раза, подавление данной экскреции при проведении пробы с дексаметазоном менее, чем на 55%, увеличение соотношений F/E и UFF/UFE, качественные изменения стероидного профиля в крови и моче.
При исследовании функции коры надпочечников с помощью традиционных методов анализа у 67,5% больных с инциденталомами уровни в крови АКТГ, альдостерона, активности ренина плазмы, кортизола, коэффициент ритма секреции кортизола (Кв/Ку х100%) и коэффициент подавления кортизола на пробе с 2 мг дексаметазона (Кд/Ку х100%) не отличались от соответствующих показателей в контрольной группе (табл. 7 и 8).
Таблица 9.
Данные ОФ ВЭЖХ кортикостероидов крови при различных опухолях коры
надпочечников
Группы Б нг/мл Е нг/мл В нг/мл БОС нг/мл Б нг/мл ¥!Е
1. Здоровые (п=30) 63,6 51,8-71,7 19,9 15,5-22,6 3,1 2,0-3,8 2,3 1,9-2,8 2,0 1,0-2,5 3,3 2,7-3,6
2. Ожирение с розовыми стриями(п=54) 93,6 70,3-121,6 р<0,001 25,3 18,0-31,8 р=0,024 4,4 3,1-7,3 р=0,002 2,5 1,5-6,8 р=0,55 3,0 1,0-5,7 р=0,29 3,9 3,2-4,4 р=0,05
3 Гормонально -неактивные опухоли(п=83) 67,9 56,1-89,3 р=0,053 17,9 15,6-27,0 р=0,20 4,0 2,6-5,6 р=0,06 3,5 1,0-7,9 Р=0,22 1,5 1,5-7,8 р=0,80 3,6 3,1-4,9 р=0,24
4 ГНО(ВГКН-стертая форма) (п=25) 56,3 51,6-80,6 р=0,90 22,4 15,2-30,8 р=0,08 3,9 2,8-9,2 р=0,001 9,1 3,0-15,0 р=0,002 4,8 2,0-11,5 р=0,002 2,6 2,1-2,9 р=0,002
5. СИК- субклиническая форма (п=36) 109,0 90,0-130,0 р<0,001 р5.2=0,056 21,8 16,9-29,6 р=0,038 р„=0,35 6,8 3,9-9,8 р<0,001 р5.2=0,072 8,9 5,0-11,8 р<0,001 Р5 2<0,001 5,0 3,0-13,1 р<0,001 р5.2=0,004 4,8 4,4-5,4 р<0,001 р5-2<0,001
6СИК (п=16) 142,0 111,0-170,0 р<0,001 23,9 20,0-47,2 р=0,009 15,6 7,0-25,5 р<0,001 18,6 8,4-26,7 р<0,001 11,7 5,0-20,7 р<0,001 5,1 4,2-6,6 р<0,009
7. БИК (п=24) 179,0 167,0-199,0 р<0,001 р? 6=0,03 25,0 15,0-32,4 р=0,06 р=0,15 14,2 7,0-20,8 р<0,001 р=0,52 9,9 6,7-14,8 р<0,001 р=0,11 5,0 3,7-12,5 р<0,01 р=0,13 8,2 6,6-11,2 р<0,001 р=0,006
8 Адренокар- циномы (п=16) 95,1 81,1-110,0 р<0,001 р8.7<0,001 23,3 16,0-32,5 р=0,03 р=0,85 12,8 4,5-26,0 р<0,001 р=0,21 20,6 15,0-25,9 р<0,001 р=0,004 48,3 33,0-55,5 р<0,001 р<0,001 4,3 2,9-6,1 р=0,07 р<0,001
р - уровень статистической значимости различий по сравнению с контрольной группой здоровых. ГНО - гормонально-неактивные опухоли
При анализе данных ОФ ВЭЖХ кортикостероидов у больных с инциденталомами без нарушения регуляции гипофизарно-надпочечниковой системы мы обратили внимание на неоднородность стероидных профилей сыворотки крови и мочи. У 23,1% больных найдено достоверное снижение экскреции свободного кортизола с мочой и соотношения UFF/UFE, что дало основание выделить данных больных в отдельную группу для поиска причины снижения экскреции свободного кортизола с мочой (табл. 10). У этих больных
Таблица 10.
Экскреция свободного кортизола и свободного кортизона с мочой у больных с _различными аденомами коры надпочечников_
№ Наименование группы UFF UFE UFF/UFE
п/п мкг/с мкг/с
1 Здоровые 13,60 36,9 0,37
(п=30) 11,5-14,6 27,5-40,6 0,33-0,47
2 Ожирение с розовыми 20,8 49,4 0,47
стриями 15,2-32,1 32,8-64,6 0,31-0,61
(п=54) р<0,001 р=0,006 р=0,29
3 Гормонально- 27,7 50,6 0,56
неактивные опухоли 17,0-39,2 36,6-61,2 0,46-0,72
(п=83) р<0,009 р=0,065 р<0,005
4 Гормонально- 6,8 28,4 0,23
неактивные опухоли 4,4-8,3 23,2-38,3 0,20-0,29
(ВГКН-СФ) (п=25) р <0,05 р=0,42 р=0,007
5 СИК-субклиническая 63,7 100,4 0,65
форма 40,7-90,6 60,1-153,0 0,52-0,84
(п=36) р<0,001 р<0,001 р<0,001
Р5 2<0,001 Рз 2 <0,001 р52<0,001
6 Синдром Иценко- 183,3 198,3 0,68
Кушинга 111,5-278,6 177,5-387,0 0,63-0,73
(п=40) р<0,001 р<0,001 р=0,001
р - уровень статистической значимости различии по сравнению с контрольной группой здоровых
Таблица 11
Экскреция свободного кортизола и свободного кортизона с мочой на пробе с дексаметазоном у больных с функциональным и органическим
Показатель гиперкортицизмо Ожирение с розовыми стриями (п=22) м Субклинический СИК (п=16) Р
UFFj, (мкг/с) 18,0/15,0-24,0 61,6/36,6-155,3 0,002
UFFd, (мкг/с) 33,9 / 26,-45,0 96,7/68,7-167,6 0,010
UFF4/UFF4 0,50/0,35-0,62 0,64 / 0,58-0,80 0,029
UFFj, (мкг/с) 2,8/1,6-8,5 105,6/34,4-143,5 <0,001
ЬТЕД (мкг/с) 12,7/6,5-19,7 64,5/33,3-110,9 0,003
UFFj/UFEJ, 0,30/0,15-0,48 1,21/0,93-1,63 <0,001
UFF.,/UFF,j, 26,5/9,0-40,4 110,3/54,6-282,4 0,002
x 100 (%)
UFEa /UFE,], 37,3 / 18,4-57,9 50,8/36,9-116,3 0,12
x 100 (%)
UFF,|„ иРЕф - фоновая экскреция UFF и UFE, UFFa, UFEj, - экскреция UFF и UFE на пробе с дексаметазоном, р - уровень статистической значимости различий по сравнению с больными с ожирением с розовыми стриями
Рис. 6. Хроматограмма кортикостероидов крови (А) и мочи (Б) больного М. с субклиническим СИК. Х|, Хг, Хз - неидентифицированные соединения.
отмечено повышение в сыворотке крови уровней 11-дезоксикортикостерона и 11-дезоксикортизола и нормальный уровень кортизола в крови по сравнению со здоровыми. Эти данные дали возможность предположить наличие дефекта 11р-гидроксилазы или 21-гидроксилазы в самой опухоли, или наличие неклассической формы ВГКН. У 85% больных этой группы найдены качественные изменения стероидного профиля, характерные для больных с ВГКН. Недостаточность ПР-гидроксилазы была подтверждена пробой с кортикотропином у 11 больных с инциденталомой, дефект 21-гидроксилазы диагностирован у пяти больных с инциденталомой. Пробу оценивали по динамике уровней кортизола, 17-гидроксипрогестерона и данных ОФ ВЭЖХ кортикостероидов крови, полученных при стимуляции кортикотропином. У 9 больных с недостаточностью 11р-гидроксилазы при стимуляции кортикотропином были увеличены уровни 11-дезоксикортизола и 11-дезоксикортикостерона, снижены прирост уровня кортикостерона и соотношений F/S и F/E по сравнению со здоровыми (табл. 6). Увеличение базального и при стимуляции кортикотропином уровня 11-
дезоксикортикостерона, снижение прироста уровня кортикостерона, обнаруженные у 2-х больных, указывали на недостаточность изофермента 11р--гидроксилазы-2. У 5 человек диагностирована стертая форма ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы на основании увеличения при стимуляции кортикотропином уровня 17-ОНП до 9,0/8,1-10,0 нг/мл, р=0,003 (Д= 1,07/0,83-1,45, р=0,001) и снижения соотношения кортизол/кортизон до 3,9/3,88-5,05, р=0,045 по сравнению с контрольной группой.
На основании наших данных можно предположить, что некоторые инциденталомы могут быть следствием длительного существования ВГКН. Ряд авторов отмечают, что случайно обнаруженные опухоли нередко выявляются у больных с ВГКН и ферментные нарушения могут способствовать их развитию [Шавладзе М.Д., 2003; Кетске М, 1997; СИаЪге О., 2000]. Большое значение для выбора тактики лечения больных с инциденталомами имеет диагностика стертых форм ВГКН, как причина образования данных опухолей .
У 76,9% (83 чел) больных с гормонально-неактивными опухолями надпочечников установлено увеличение экскреции свободного кортизола с мочой, повышение соотношения ирр/ирв по сравнению с контрольной группой (табл. 9 и 10). Повышение экскреции сободного кортизола с мочой было менее, чем в 2 раза, что характерно для больных с функциональным гиперкортицизмом. У данных больных средние уровни в крови кортизола, кортикостерона, 11-дезоксикортикостерона и 11-дезоксикортизола не отличались от соответствующих показателей в контрольной группе. Однако, у некоторых больных этой группы повышение уровня одного кортикостерона отмечено у 25 человек, уровней 11-дезоксикортикостерона и кортикостерона у 16 человек, уровня 11-дезоксикортизола у 15 человек. Увеличение содержания кортикостерона и 11-дезоксикортикостерона при нормальном уровне кортизола может указывать на раннюю стадию первичного гиперальдостеронизма. У 65% больных найдены качественные изменения стероидного профиля, т.е. появление дополнительных пиков на хроматограмме, которые не детектировались у здоровых. У части больных были отмечены только качественные изменения стероидного профиля при нормальных показателях глюкокортикоидной и минералокортикоидной функции коры надпочечников. На основании данных литературы можно предположить, что этими соединениями могут быть производные кортикостерона (18-ОН-В), 11-дезоксикортикостерона (18-ОН-БОС) или кортизола (18-ОН-Р или 18-ОКСО-Р).
Адренокарциномы были верифицированы при гистологическом исследовании удаленных опухолей. У данных пациентов обнаружено значительное повышение в крови уровня 11-дезоксикортизола, как при сравнении со здоровыми, так и при сравнении с соответствующими показателями у больных с СИК (р<0,001) и БИК (р<0,001) (табл. 9). Уровень в крови 11-дезоксикортикостерона был увеличен при сравнении с больными с БИК (р=0,004). Получены специфические хроматограммы стероидного профиля в крови с детектированием дополнительного соединения между кортикостероном и 11-дезоксикортикостероном. Таким образом, по данным ОФ ВЭЖХ кортикостероидов информативными лабораторными критериями
злокачественности опухоли коры надпочечников может быть повышение в крови уровня 11-дезоксикортизола больше 33,0 нг/мл, уровня 11-дезоксикортикостерона больше 15,0 нг/мл и качественное изменение стероидного профиля, полученного методом ОФ ВЭЖХ.
У больных с альдостеромами изменения в надпочечниках были выявлены в ходе диагностического поиска причин артериальной гипертензии. Диагноз был подтвержден при исследовании активности системы ренин-ангиотензин. Было выявлено значительное снижение в сыворотке крови активности ренина плазмы на фоне высокого уровня альдостерона (табл.8). При анализе данных ОЖ ВЭЖХ кортикостероидов установлено повышение в крови уровня кортикостерона до 11,5/3,2-23,2 нг/мл, р<0,001, уровня 11-дезоксикортикостерона до 18,2/4,5-38,4 нг/мл, р<0,001 при нормальном уровне кортизола в крови и экскреции свободного кортизола с мочой. У 20% больных с альдостеромами обнаружено увеличение в крови уровней 11-дезоксикортизола и 11-дезоксикортикостерона, снижение соотношения ирр/ирв и качественные изменения стероидных профилей, характерные для больных со стертыми формами ВГКН.
Таким образом, на основании традиционных методов диагностики гормональной активности опухолей коры надпочечников у 108 больных случайно обнаруженные аденомы коры надпочечников были гормонально неактивны. При изучении особенностей стероидогенеза методом ОФ ВЭЖХ у 18,5% (20 чел.) диагностирована стертая форма ВГКН с дефектом 11р-гидроксилазы, у 4,8% (5 чел) больных - стертая форма ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы, у 32,4% (35 чел.) были увеличены промежуточные продукты стероидогенеза, и только 44,4% (48 чел.) опухолей были гормонально-неактивны, как по данным ИФА и РИА, так и по данным ОФ ВЭЖХ кортикостероидов крови и мочи.
На основании данных, полученных при изучении особенностей стероидогенеза у больных с гормонально-неактивными опухолями коры надпочечников методом ОФ ВЭЖХ, ранними признаками нарушения гормональной активности инциденталом коры надпочечников является повышенный в сыворотке крови уровень предшественника кортизола - 11-дезоксикортизол, или увеличение уровней предшественников альдостерона -кортикостерона или 11-дезоксикортикостерона, а также качественные изменения стероидного профиля в виде дополнительных соединений, не детектируемых у здоровых, с одинаковыми относительными параметрами удерживания.
Алгоритмы лабораторной диагностики различных форм вирильного синдрома и инциденталом коры надпочечников разработаны на основании определения содержания кортикостероидов в крови и моче методом ОФ ВЭЖХ и определения в крови уровней гормонов методами иммуноферментного и радиоиммунологического анализа (рис. 7 и 8). В алгоритме лабораторной диагностики различных форм вирильного синдрома представлены информативные биохимические критерии, позволяющие диагностировать стертые формы ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы и 11р--
гидроксилазы, функциональный гиперкортицизм, СПКЯ и смешанную форму гиперандрогении (рис.7). Показана возможность диагностики стертой форы ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы до проведения пробы с синактеном при уровне в крови 17-ОНП больше, чем 3,5 нг/мл по данным ИФА, а по данным ОФ ВЭЖХ - при увеличении в крови уровня кортикостерона (больше 7,0 нг/мл), уменьшении экскреции свободного кортизола с мочой, соотношений ирР/иРЕ и Р/Е и качественных изменениях стероидного профиля в крови и моче.
На рисунке 8 представлен алгоритм лабораторной диагностики инциденталом коры надпочечников: гормонально-неактивных опухолей, субклинического СИК и стертых форм ВГКН у больных со случайно обнаруженными опухолями коры надпочечников. Показана возможность диагностики субклинического СИК у больных с инциденталомами до проведения пробы с дексаметазоном на основании информативных биохимических критериев, полученных по данным ОФ ВЭЖХ кортикостероидов - увеличение экскреции свободного кортизола и свободного кортизона с мочой более, чем в 3 раза, снижение подавления данной экскреции на пробе с дексаметазоном менее, чем на 50%, повышение соотношений Р/Е и иРР/иРЕ.
Рис.7. Алгоритм лабораторной диагностики различных форм вирильного
синдрома
снижение или увеличение показателя в сравнении со здоровыми, 14-норма, Хг, Х4, ИЛИ Х5 - неидентифицированные соединения)
Рис. 8. Алгоритм лабораторной диагностики случайно обнаруженных опухолей
коры надпочечников снижение или увеличение показателя в сравнении со здоровыми, М- норма X), Х2 - неидентифицированные соединения)
выводы
1. Разработан способ количественного определения в сыворотке крови пяти кортикостероидов и экскреции свободного кортизола и свободного кортизона с мочой методом ОФ ВЭЖХ, определены его аналитические характеристики (точность, воспроизводимость, предел обнаружения). Оптимизированы регламент пробоподготовки биологических жидкостей с использованием жидкостной экстракции и условия хроматографического разделения стероидных гормонов в изократическом режиме элюирования с введением 3 мМ р-циклодекстрина в состав элюента, что привело к увеличению селективности и эффективности разделения стероидов.
2. На основании определения содержания кортикостероидов в крови и моче методом ОФ ВЭЖХ установлены общие диагностические критерии стертых форм ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы и Пр-гидроксилазы -уменьшение экскреции свободного кортизола с мочой и соотношений свободный кортизол/свободный кортизон в моче и кортизол/кортизон в крови, а при стимуляции кортикотропином снижение прироста в крови уровня кортизола и соотношения кортизол/кортизон по сравнению со здоровыми.
3. Дифференциально-диагностическими критериями стертой формы ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы являются увеличение в крови базального уровня кортикостерона и повышение прироста уровня альдостерона при стимуляции кортикотропином. Недостаточность 11р-гидроксилазы характеризуется увеличением в крови базальных уровней 11-дезоксикортизола и 11-дезоксикортикостерона, а при пробе с кортикотропином - повышением в крови уровня 11-дезоксикортизола более, чем в 5 раз, снижением соотношения кортизол/11-дезоксикортизол более, чем в 10 раз, уменьшением прироста уровней кортикостерона и альдостерона по сравнению со здоровыми. Увеличение в крови при стимуляции кортикотропином только уровня 11-дезоксикортикостерона и снижение уровня кортикостерона указывают на недостаточность 11р--гидроксилазы-2.
4. У больных с синдромом поликистозных яичников установлено снижение в крови уровня глобулина, связывающего половые гормоны, увеличение уровней инсулина и С-пептида, нормальные уровни кортикостерона, 11-дезоксикортикостерона и 11-дезоксикортизола. Повышение экскреции свободного кортизона с мочой и уменьшение соотношения свободный кортизол/свободный кортизон в моче указывают на недостаточность 11р-гидроксистероидцегидрогеназы-1. При смешанной форме гиперандрогении увеличена экскреция свободного кортизола и свободного кортизона с мочой при нормальном их соотношении, повышены в крови уровни кортизола и промежуточных продуктов стероидогенеза.
5. У больных с вирильным синдромом, обусловленным функциональным гиперкортицизмом, повышены в крови уровни АКТГ, кортизола, кортизона, кортикостерона и андрогенов, повышена экскреция свободного кортизола и свободного кортизона с мочой, нормальные соотношения кортизол/кортизон
в крови и свободный кортизол/свободный кортизон в моче, нормальное подавление уровней тестостерона и кортизола на пробе с дексаметазоном. В результате стимуляции кортикотропином увеличены в крови уровни кортизола и кортикостерона при нормальном соотношении кортизол/кортизон.
6. Использование метода ОФ ВЭЖХ при сравнении с традиционными методами позволило повысить точность диагностики заболеваний с вирильным синдромом : увеличилось количество больных со стертыми формами ВГКН с 22,3% до 35,0%, со смешанной формой гиперандрогении с 6,8% до 10%, с функциональным гиперкортицизмом с 13,2% до 18,2%, уменьшилось количество больных с синдромом поликистозных яичников с 28,2% до 22,3%.
7. Нарушения надпочечникового стероидогенеза, характерные для стертых форм ВГКН, методом ОФ ВЭЖХ установлены у 23,3% больных со случайно выявленными опухолями коры надпочечников. У 4,8% больных установлена стертая форма ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы, а у 18,5% обнаружена недостаточность 11р-гидроксилазы.
8. Диагностическими критериями субклинического синдрома Иценко-Кушинга при использовании ОФ ВЭЖХ являются увеличение экскреции свободного кортизола и свободного кортизона с мочой более, чем в 3 раза, снижение ее на пробе с дексаметазоном менее, чем на 50%, увеличение соотношений кортизол/кортизон в крови и свободный кортизол/свободный кортизон в моче, повышение в крови уровней 11-дезоксикортикостерона и 11-дезоксикортизола.
9. У больных с адренокарциномой установлены наиболее высокие уровни 11-дезоксикортизола (более 33,0 нг/мл) и 11-дезоксикортикостерона (более 15,0 нг/мл) по сравнению с больными с синдромом Иценко-Кушинга, качественные изменения стероидного профиля в крови, которые являются информативными лабораторными критериями злокачественности опухолей коры надпочечников.
10. Разработаны алгоритмы лабораторной диагностики стертых форм врожденной гиперплазии коры надпочечников у больных с вирильным синдромом и у больных со случайно обнаруженными опухолями коры надпочечников на основании определения содержания кортикостероидов в крови и моче методом ОФ ВЭЖХ и определения в крови информативных показателей методами иммуноферментного и радиоиммунологического анализа, позволившие дифференцировать стертые формы ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы и 11р-гидроксилазы и синдром поликистозных яичников, диагностировать стертую форму ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы до проведения пробы с кортикотропином, а субклинический синдром Иценко-Кушинга до проведения пробы с дексаметазоном.
11. Наличие неидентифицированных соединений с одинаковыми относительными параметрами удерживания при хроматографическом исследовании кортикостероидов в крови и моче у больных с простой
вирильной формой ВГКН, у 31% больных со стертыми формами ВГКН и у 55% больных с аденомами коры надпочечников указывают на идентичный характер надпочечникового стероидогенеза, что свидетельствует о значении патогенетических механизмов ВГКН в формировании опухолей коры надпочечников у части больных.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Для дифференциальной диагностики стертых форм ВГКН и синдрома поликистозных яичников целесообразно определять в крови методом иммуноферментного анализа глобулин, связывающий половые гормоны, инсулин и 17-гидроксипрогестерон (в раннюю фолликулярную фазу менструального цикла), а методом ОФ ВЭЖХ определять в крови кортикостерон, 11-дезоксикортизол и 11-дезоксикортикостерон, а также экскрецию свободного кортизола и свободного кортизона с мочой.
2. У больных с вирильным синдромом и у больных с инциденталомами коры надпочечников при обнаружении в крови увеличения базальных уровней 11-дезоксикортизола или 11-дезоксикортикостерона и при снижении экскреции свободного кортизола с мочой, уменьшении соотношений кортизол/кортизон в крови и свободный кортизол/ свободный кортизон в моче рекомендуется проводить пробу с кортикотропином для выявления стертых форм ВГКН.
3. Для диагностики стертой формы ВГКН с дефектом 11р-гидроксилазы проба с кортикотропином оценивается по уровням в крови 11-дезоксикортизола, 11-дезоксикортикостерона, кортикостерона и альдостерона, а также по соотношениям кортизол/11-дезоксикортизол и кортизол/кортизон.
4. Для диагностики субклинического синдрома Иценко-Кушинга при проведении пробы с дексаметазоном, кроме определения в крови уровня кортизола, необходимо исследовать экскрецию свободного кортизола и свободного кортизона с мочой.
5. При определении стероидных гормонов методом ОФ ВЭЖХ рекомендуется использование в составе подвижной фазы в качестве комплексообразователя р-циклодекстрина, что приводит к увеличению селективности и эффективности разделения стероидов.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Баранов В.Г. Общность и различие патогенеза форм синдрома Иценко-Кушинга. / В.Г. Баранов, А.И. Нечай, В.М. Трофимов, А.С. Савушкина, СА Калашников, Л.И. Великанова//Пробл. эндокринол. - 1986. -№ 6. -С.3-11.
2. Шабанова Л.Ф. Иммунологические показатели при болезни и синдроме Иценко-Кушинга. / П.А. Сильницкий, Е.Р. Георгадзе., В.В. Сиротина, Л.М. Краснов, Л.И. Великанова // Пробл. энд. - 1987. - № 5. - С.30-36.
3. Великанова Л.И. Гормоны коры надпочечников и их влияние на обмен веществ. / В книге «Синдром Иценко-Кушинга» // Под ред. В.Г. Баранова и А.И. Нечая. - СПб:Медицина. - 1988. - С.51-72.
4. Гампер Н.Л. Определение шести кортикостероидов в плазме крови методом микроколоночной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. / Н.Л. Гампер, Е.Н. Королева, Л.И. Великанова // Тезисы 7-го Всероссийского симпозиума по молекулярной жидкостной хроматографии. - Москва, 1996. - С.91.
5. Gamper N.L. Determination of six corticosteroids in plasma by RP microcolumn HPLC. / N.L. Gamper, L.I.Velicanova, E.M. Korolyova // International symposium On capillary Chromatography. 18-th: Proceedings. - Riva Del Garda, 1996.-P. 1655-1663.
6. Великанова Л.И. Особенности метаболизма кортизола при различных формах гиперкортизолизма. / Л.И. Великанова, Н.В. Ворохобина, Н.Л. Гампер, Е.М. Королева, И.Г. Чурина // Актуальные проблемы эндокринологии: Тез. III Всерос. Съезда эндокр. - Москва, 1996. - С.209.
7. Великанова Л.И. Метаболизм кортикостероидов у больных с эндогенным гиперкортицизмом. / Л.И. Великанова, Н.В. Ворохобина, Е.Р. Шаффигулина, Е.В. Арефьева, Н.Л. Гампер // Актуальные вопросы эндокринологии: Тезисы Всероссийской научно-практич. конференции. - Пермь, 1999. - С. 100.
8. Ворохобина Н.В. Гормональные показатели системы гипофиз-гонады у больных женским транссексуализмом. / Н.В. Ворохобина, В.В. Михайличенко, Л.И. Великанова, В.Н. Фесенко, В.А. Косинова // Актуальные вопросы эндокринологии: Тезисы Всероссийской научно-практической конференции. - Пермь, 1999. - С. 120.
9. Трофимова Т.Н. Особенности диагностики и тактики введения больных с некоторыми опухолями надпочечников. / Т.Н. Трофимова, Н.В. Ворохобина, Л.И. Великанова, Ю.В. Надинкина, Н.В. Смоленцева, З.Р. Шафигуллина // Сборник статей «Лучевая диагностика на рубеже столетий» под ред. проф. Т.Н. Трофимовой. - СПб, 1999. - С. 149-151.
10. Ворохобина Н.В. Новые аспекты диагностики и тактики лечения у больных с различными опухолями эндокринных желез (опыт работы эндокринологического центра) / Н.В. Ворохобина, Л.И. Великанова, Е.В. Арефьева, А.Н. Бубнов, А.Е. Борисов, Е.М. Трунин, З.Р. Шафигулина, И.А. Гончарова // Вестник Ассоциации эндокринологов. - СПб, 1999. - №3 (6). -С.2.
11. Gasparian E. Thyroid Function in Patients with Central Obesity ./ E. Gasparian, K. Pokhis, L. Velikanova // 9th European Congress on Obesity. - Milan, Italy, 1999.-P. 253.
12. Сильницкий ПА Особенности диагностики и лечения некоторых опухолей коры надпочечников. / П.А. Сильницкий, Н.В. Ворохобина, Л.И. Великанова, З.Р. Шафигулина, В.Р. Слободской // Материалы ХХП научно-практич. конференции хирургов Республики Карелии совместно с СПб НИИ Скорой помощи им. проф. Ю.Ю.Джанелидзэ. - Петрозаводск, 1999. - С.137.
13. Ворохобина Н.В. Метаболизм кортикостероидов у больных женским транссексуализмом. / Н.В. Ворохобина, Л.И. Великанова, ВА. Косинова, Е.В. Арефьева, В.Р. Слободской // Материалы ХХП научно-практической конференции хирургов Республики Карелии совместно с СПб НИИ Скорой помощи им. проф. Ю.Ю.Джанелидзэ. - Петрозаводск, 1999. - С. 138.
14. Ворохобина Н.В. Гормональные факторы как одна из причин женского транссексуализма. / Н.В. Ворохобина, Л.И. Великанова, ПА. Сильницкий, ВА. Косинова // Актуальные вопросы эндокринологии: Тезисы Российской конференции, посвященной 100-летию академика АМН СССР В.Г. Баранова. - СПб, 2000. - С. 215.
15. Великанова Л.И. Гормональная функция инциденталом надпочечников. / Л.И. Великанова, А.Е. Борисов, Л.М. Краснов, В.П. Земляной, З.Р. Шафигуллина, П.А. Сильницкий // Актуальные вопросы эндокринологии: Тезисы Российской конференции, посвященной 100-летию академика АМН СССР В.Г. Баранова. - Санкт-Петербург, 2000. - С. 262.
16. Silnizkij P.S. Changres of plasma Corticosteroids in insulin-dependent diabetic men with sexual dysfunction. / P.S Silnizkij, N.V. Vorokhobina, L.I. Velikanova, EA. Volkova, E.V. Arefeva, V.R. Slobodskoy // Тезисы 1 European Congress of Andrology. - Andrology. - Италия, 2000. - №.2 - P. 11.
17. Vorokhobina N.V. Metabolism of corticosTeroids in fimale-to-male transecualis./ N.V. Vorokhobina, V.A. Kosinova, P.A. Silnizkij, V. Mikhailichenco, L.I. Velikanova. // Тезисы 1 European Congress of Andrology. - Andrology. -Италия, 2000.-№2.-P. 12
18.Великанова Л.И. Диагностическое значение ВЭЖХ кортикостероидов при различной патологии системы гипофиз-кора надпочечников. / Л.И. Великанова, ЛА. Карцова, ЕА. Бессонова, З.Р. Шафигуллина, И.П. Серебрякова, О.Л. Милютина // Клиническая лабораторная диагностика. -2001.-№10.-С. 34-35.
19. Великанова Л.И. Диагностическое значение ВЭЖХ у больных с патологией надпочечников. / Л.И. Великанова, Е.В. Арефьева, Е.А. Бессонова, Л.А. Карцова, Н.Л. Егорова // Актуальные проблемы современной эндокринологии: Материалы 1У Всероссийского конгресса эндокринологов. - СПб,2001.-С.483.
20.Ворохобина Н.В. Некоторые особенности стероидогенеза у больных с сольтеряющей формой врожденной гиперплазии коры надпочечников коры надпочечников. / Н.В. Ворохобина, Л.И. Великанова. И.П. Кораблина, Е.А.
Бессонова, И.О. Крихели, Е.В. Арефьева // Актуальные проблемы современной эндокринологии: Материалы 1У Всероссийского конгресса эндокринологов. - СПб, 2001. - С. 487.
21.Шафигуллина З.Р. Некоторые аспекты диагностики гормонально-неактивных аденом надпочечников. / З.Р. Шафигуллина, Н.В. Смоленцева, Т.Н. Трофимова, Н.В. Ворохобина, Л.И. Великанова // Материалы ХХХУ1 научно-практической межрегиональной конференции, посвященной 200-летию Ульяновской клинической больницы №1. - Ульяновск, 2001. - С. 579-580.
22.Королева Е.М. Высокоэффективная жидкостная и газовая хроматография в клинической лабораторной практике. / Е.М. Королева, Л.И. Великанова, В.Г. Саар, А.С. Лапшина, В.В. Добродумова, Е.Л. Похелайнен, Т.Г. Никитина // Клиническая лабораторная диагностика. - 2001. - № 10. - С. 3.
23. Серебрякова И.П. Некоторые особенности стероидогенеза у больных с различными формами врожденной гиперплазии коры надпочечников. / И.П. Серебрякова, Е.А. Бессонова, Н.В. Ворохобина, Л.И. Великанова // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: Материалы научно-практической конференции молодых ученых. - СПб, 2001.-С. 40-42.
24. Карцова Л.А. Определение кортикостероидов в сыворотке крови методом ВЭЖХ. / Л.А. Карцова, Л.И. Великанова, ЕА. Бессонова // Международная конференция по теоретическим вопросам адсорбции и адсорбционной хроматографии: Тез. докладов. - СПб, 2001.-С. 55.
25.Ворохобина Н.В. Болезнь и синдром Иценко-Кушинга: Пособие для врачей / Н.В. Ворохобина, П.А. Сильницкий, Л.И Великанова. // СПб: Издательский дом СПб МАЛО, 2002. - С. 19.
26. Великанова Л.И. Высокоэффективная жидкостная хроматография кортикостероидов биологических жидкостей в ранней диагностике патологии коры надпочечников. / Л.И. Великанова, Л.А. Карцева, Л.А. Бессонова, Е.А. Павлова, З.Р. Шафигуллина // Матер. Первой международной конференции «Высокие медицинские технологии XXI века». - Испания, Бенидорм, 2002. - Москва, 2002. - С.62.
27. Velikanova L.I. High performance liquid chromatography of corticosteroids in differential diagnosis of the adrenal adenomas. / L.I. Velikanova, Z. Shafigullina // 15 IFCC-FESEC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. Euromed LAB, Barselona, Spain, 1-5 June 2003. SI 14-Poster Abstracts (M-123). Clinical Chemistry Laboratory Medicine. - Spain, 2003. - S1-S608. -P.41.
28.Борисов А.Е. Предоперационная подготовка больных с тяжелыми формами эндогенного гиперкортицизма. / А.Е. Борисов, Л.М. Краснов, Н.В. Ворохобина, С.Л. Непомнящая, Л.И. Великанова, Н.Э. Заркуа, И.О. Крихели, Э.Г. Вердиев, М.Д. Шавладзе, И.Х. Баталов // Клиническая эндокринология
- достижения и перспективы: Матер. Всеросс. научно-практ. конф., посвященной 80-летию со дня рождения проф. Д.Я. Шурыгина. - СПб, 2003.
- С. 290-292.
29.Л.И.Великанова. Оценка гормональной активности опухолей коры надпочечников по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии. / Л.И. Великанова, Н.В. Ворохобина, З.Р. Шафигуллина //Клиническая эндокринология - достижения и перспективы: Матер. Всероссийской научно-практ. конф., посвященной 80-летию со дня рождения проф. Д.Я.Шурыгина. - СПб, 2003. - С. 299-300.
30. Ворохобина Н.В. Особенности стероидогенеза у больных с первичным гиперальдостеронизмом. / Н.В. Ворохобина, Л.И. Великанова, О.Л. Жижина //Клиническая эндокринология - достижения и перспективы: Матер. Всероссийской научно-практ. конф., посвященной 80-летию со дня рождения проф. Д.Я.Шурыгина. - СПб, 2003. - С. 305-306.
31. Ворохобина Н.В. Опыт применения пробы с синактеном у пациенток с синдромом гиперандрогении. / Н.В. Ворохобина, И.П. Серебрякова, Л.И. Великанова // Матер. Всероссийской научно-практ. конф. «Клиническая эндокринология - достижения и перспективы», посвященной 80-летию со дня рождения проф. Д.Я.Шурыгина. - СПб, 2003. - С. 306-307.
32.Карцова Л.А. Анализ кортикостероидов в сыворотке крови методом ОФ ВЭЖХ и исследование хроматографических стероидных профилей при различных дисфункциях коры надпочечников. / Л.А Карцова, Л.И. Великанова, Е.А. Бессонова, Е.Г. Павлова // Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. 21-26 сентября. - Казань, 2003 . - С. 244.
33.Kartsova L.A. The Investigation of Steroidogenic Characters and Corticosteroids Metabolism by RP HPLC. / Kartsova LA., Velikanova L.I. , Pavlova E.G., Bessonova EA. // 100 years of chromatography: 3 rd Int. Symposium on Separations in BioSciencies. - Moscow, 2003. - P-10. - C. 118.
34.Ворохобина Н.В. Особенности метаболизма кортикостероидов при болезни и синдроме Иценко-Кушинга. / Н.В. Ворохобина, П.А. Сильницкий, Л.И. Великанова, Л.М. Краснов, И.О. Крихели, Н.Э. Заркуа // Актуальные проблемы нейроэндокринологии: Матер. 111 Всероссийской научно-практической конференции. - Москва, 2003. - С. 257-258.
35. Ворохобина Н.В. Особенности метаболизма кортикостероидов у больных с различными формами гиперкортизолизма. / Н.В. Ворохобина, Л.И. Великанова, Л.М. Краснов, И.О. Крихели, Н.Э. Заркуа, Е.Г. Павлова // Актуальные проблемы нейроэндокринологии: Матер. 111 Всерос. научно-практ. конф. - Москва, 2003. - С.284-285.
36. Shafigullina Z. Chromatography profiles of blood and urine corticosteroids in diagnosis of adrenal incidentalomas. / Shafigullina Z, Velikanova L., Voroxobina N.V. // Abstracts of the 22 World Congress of Patology and Laboratory Medicine. -Korea,Busan, 2003.-p-135.-P. 153.
37. Velikanova L.I. High performance liquid chromatography of blood and urine corticosteroids in the diagnostics ofhypophysis-adrenal system. / Velikanova L.I., Vorohobina N., Serebryakova I., Shafigullina Z., Pavlova E., Glukhov N // Abstracts of the 22 World Congress of Pathology and Laboratory Medicine. -Korea,Busan, 2003.-p-134.-P. 153.
38. Великанова Л.И. Диагностическое значение хроматографических профилей кортикостероидов при различных формах надпочечниковой гипераидрогении / Л.И. Великанова, Н.В. Ворохобина, И.П. Серебрякова, Е.Г. Павлова, ЕА. Бессонова // Материалы международной конференции «Врачи мира пациентам». - Санкт-Петербург, 2003. - С. 15-16.
39. Серебрякова И.П. Диагностическое значение ВЭЖХ кортикостероидов в оценке степени компенсации больных с врожденной гиперплазией коры надпочечников. / И.П Серебрякова, Н.В. Ворохобина, Л.И. Великанова, Е.Г. Павлова // Материалы международной конференции «Врачи мира пациентам». - Санкт-Петербург, 2003.-С. 13-14.
40. Velikanova L.I. High Performance Liguid Chromatography of Corticosteroids in the Diagnosis of Adrenal Steroidogenesis Abnormalities in Different Forms of Hyperandrogenism. / L.I. Velikanova, L.A. Kartsova, I.P. Serebryakova, N.V. Gloukhov, E.A. Bessonova, E.G. Pavlova // Материалы Второй международной конференции «Высокие медицинские технологии XXI века». Испания, Бенидорм, 1-8 ноября, 2003. - Москва, 2003. - С. 43.
41. Великанова Л.И. Диагностическое значение высокоэффективной жидкостной хроматографии кортикостероидов при заболеваниях гипофизарно-надпочечниковой системы. / Л.И. Великанова, Н.В. Ворохобина, И.П. Серебрякова, И.О. Крихели, О.Л. Жижина, Н.В. Глухов, Е.А. Бессонова, Е.Г. Стрельникова // Вестник Ассоциации эндокринологов Санкт-Петербурга и Ленинградской области. - 2003. - № 1 (21) - С. 1 -2.
42. Карцова Л.А. Определение лекарственных стероидных препаратов в сыворотке крови и моче. / Л А Карцова, Л.И. Великанова, Е.Г. Стрельникова, Ю.С. Дмитриева // Хроматография и хроматографические приборы: Тез. Всероссийского симпозиума. - Москва, 2004. - С. 289.
43. Карцова Л.А. Определение кортикостероидов в сыворотке крови методом мицеллярной электрокинетической хроматографии. / Л.А. Карцова, ЕА Бессонова, Л.И. Великанова. // Хроматография и хроматографические приборы: Тез. Всероссийского симпозиума. - Москва, 2004. - С. 239.
44..Великанова Л.И. Способ диагностики стертых форм врожденной гиперплазии коры надпочечников. / Л.И. Великанова // Приоритет изобретения № 2004127999,22.09.2004.
45.Великанова Л.И. Способ диагностики недостаточности Пр-гидроксилазы. / Л.И. Великанова, Н.В. Ворохобина, И.П. Серебрякова, Е.А. Бессонова // Приоритет изобретения № 2004136346,15.12.2004 г.
46.Печерский А.В. Способ диагностики частичного возрастного андрогенного дефицита (PADM) / А.В. Печерский, В.И. Мазуров, В.Ф. Семиглазов, А.И. Карпищенко, В.В. Михайличенко, Л.И. Великанова, А.В. Удинцев // Патент РФ № 2231289 27.06.04 г., зарегистрирован в Госреестре изобретений 02.04.2002, заявка № 2002108658.
47.Печерский А.В. Способ профилактики инсулинорезистентности у мужчин с частичным возрастным андрогенным дефицитом (PADM) / А.В. Печерский, В.И. Мазуров, В.Ф. Семиглазов, А.И. Карпищенко, Л.И. Великанова //
Патент РФ № 2236173, 20.09.04 г., зарегистрирован в Госреестре изобретений 12.04.2002 г., заявка №2002110391.
48.Печерский А.В. Способ профилактики ожирения у мужчин с частичным возрастным андрогенным дефицитом (РАОМ) / А.В. Печерский, В.И. Мазуров, В.Ф. Семиглазов, А.И. Карпищенко, Л.И. Великанова // Патент РФ №2235502, 10.09.04 г., зарегистрирован в Госреестре изобретений 20.05.02 г., заявка № 2002113529.
49.Жижина О.Л. Первичный гиперальдостеронизм в общей врачебной практике./ О.Л. Жижина, Н.В. Ворохобина, Л.И. Великанова // Российский семейный врач. - 2004. - Т.8, №2. - С. 76-79.
50. Великанова Л.И. Лабораторная диагностика идиопатического гирсутизма. / Л.И. Великанова // Российский семейный врач. - 2004. - Т.8, №4. - С.44-46.
51. Карцова Л.А. Определение адреналина, норадреналина и дофамина методом капиллярного электрофореза с масс-спектрометрическим определением. / Л.А. Карцова, Л.И. Великанова, ЕА Бессонова, АА. Сидорова, ВА Казаков, И.А. Тверьянович // Аналитическая химия. - 2004. - Т.59. - С.815-823.
52. Карцова Л.А.. Изучение особенностей стероидогенеза больных с различными заболеваниями коры надпочечников. / Л.А. Карцова, Л.И. Великанова, Е.Г. Павлова, Е.Г. Бессонова // Аналитическая химия. - 2004. -Т. 59.-С. 976-982.
53.Великанова Л.И. Информативность определения экскреции свободных кортизола и кортизона с мочой методом ОФ ВЭЖХ при различных формах ожирения. / Л.И. Великанова, Н.В. Ворохобина, И.О. Крихели, З.Р. Шафигуллина, Н.В. Глухов, Ю.С. Дмитриева // Ожирение: Материалы научно-практической конференции. Бюллетень Санкт-Петербургской ассоциации врачей-терапевтов. - Санкт-Петербург, 2005. - Т.2, №2. - С. 2627.
54.Великанова Л.И. Особенности нарушений надпочечникового стероидогенеза при ожирении с розовыми стриями. / Л.И. Великанова, Н.В. Ворохобина, З.Р. Шафигуллина, И.О. Крихели, ЕА Бессонова // Ожирение: Материалы научно-практической конференции. Бюллетень Санкт-Петербургской ассоциации врачей-терапевтов. - Санкт-Петербург, 2005. - Т.2, №2. - С. 2728.
55.Великанова Л.И. Особенности диагностики гормональной недостаточности у больных с опухолями коры надпочечников. / Л.И. Великанова // Вестник хирургии. - 2005. - №3.
56.Беляков Н.А. Метаболические нарушения при синдроме поликистозных яичников у женщин репродуктивного возраста. / Н.А.Беляков, СЮ. Чубриева, Н.В.Глухов, Л.И.Великанова, И.П.Серебрякова, З.Р.Шафигуллина, И.В.Чубкин // Медицинский академический журнал. -2005.-Т.5,№1.-С. 74-87.
Список сокращений и условных обозначений
АКТГ - адренокортикотропный гормон АРП - активность ренина плазмы A4 - Д4-андростендион БИК - болезнь Иценко-Кушинга
ВГКН-СФ - стертая форма врожденной гиперплазии коры надпочечников ВГКН-ПВФ - простая вирильная форма ВГКН ГА - гиперандрогения
ГСПГ - глобулин, связыающий половые гормоны
ГНО - гормонально-неактивная опухоль
ДГТ - 5а-дигидротестостерон
ДГЭА-дегидроэпиандростерон
ИФА - иммуноферментный анализ
ИФР-1 - инсулиноподобный фактор роста -1
ИМТ - индекс массы тела
ЛГ - лютеинизирующий гормон
НГА - надпочечниковая гиперандрогения
ОЖ- ожирение с розовыми стриями
ОФ ВЭЖХ - обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография
РИА - радиоиммунологический анализ СИК - синдром Иценко-Кушинга СПКЯ - синдром поликистозных яичников CV - коэффициент вариации Т - тестостерон
УЗИ - ультразвуковое исследование
ФСГ - фолликулостимулирующий гормон
llß-ГД -llß-гидроксилаза
21 -ГД - 21 -гидроксилаза
ß-ЦД - ß-циклодекстрин
F - кортизол
Е - кортизон
В - кортикостерон
DOC - 11-дезоксикортикостерон
S -11-дезоксикортизол
UFF - свободный кортизол мочи
UFE - свободный кортизон мочи
Тип."Издательский дом СП6МАПО". Зак.420. Тираж 100 экз. Подписано в печать 05.04.05 г.
1145
22 да ж
Оглавление диссертации Великанова, Людмила Иосифовна :: 2005 :: Санкт-Петербург
Список сокращений и условных обозначений.
Введение.
Глава 1. Обзор литературы.
1.1. Гормоны коры надпочечников, их биосинтез и метаболизм.
1.2. Методы количественного определения стероидных гормонов.
1.2.1. Подготовка биологических объектов к анализу.
1.2.2. Методы иммуноферментного и радиоиммунологического анализа.
1.2.3. Количественное определение кортикостероидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
1.3. Лабораторная диагностика различных заболеваний гипофизарнонадпочечниковой системы.
1.3.1. Дифференциальная диагностика различных форм гиперкортицизма.
1.3.2. Лабораторная диагностика больных с аденомами коры надпочечников.
1.3.3. Лабораторная диагностика различных форм вирильного синдрома.
Глава 2. Материалы и методы исследования.
2.1. Характеристика групп больных.
2.2. Методы исследования.
Глава 3. Определение закономерностей хроматографического разделения стероидных гормонов и оптимизация регламента пробоподготовки.
Глава 4. Особенности лабораторной диагностики различных форм вирильного синдрома.
4.1. Лабораторная диагностика различных форм вирильного синдрома с помощью методов иммуноферментного и радиоиммунологического анализа.
• 4.2. Информативность хроматографического исследования нарушений надпочечникового стероидогенеза при лабораторной диагностике различных форм вирильного синдрома.
4.2.1. Особенности стероидогенеза у больных с врожденной гиперплазией коры надпочечников с дефектом 21-гидроксилазы (простая вирильная форма).
4.2.2. Особенности стероидогенеза у больных со стертой формой врожденной гиперплазии коры надпочечников с дефектом 21-гидроксилазы.
4.2.3. Особенности стероидогенеза при стертой форме ВГКН с дефектом 1 lp-гидроксилазы.
4.2.4. Особенности стероидогенеза при идиопатическом гирсутизме.
4.2.5. Особенности стероидогенеза у больных с синдромом поликистозных яичников.
4.2.6. Критерии лабораторной диагностики недостаточности 11 р— гидроксилазы по данным ОФ ВЭЖХ кортикостероидов крови, полученных при стимуляции кортикотропином.
4.2.7. Качественные характеристики стероидных профилей крови и мочи при вирильном синдроме.
Глава 5. Лабораторная диагностика гормональной активности различных аденом коры надпочечников.
5.1. Оценка гормональной активности аденом коры надпочечников методами иммуноферментного и радиоиммунологического анализа.
5.2. Оценка гормональной активности аденом коры надпочечников методом ОФ ВЭЖХ.
Обсуждение результатов.
Выводы.
Введение диссертации по теме "Клиническая лабораторная диагностика", Великанова, Людмила Иосифовна, автореферат
Заболевания, протекающие с нарушением функции гипофизарно-надпочечниковой системы, всегда привлекали пристальное внимание эндокринологов ввиду сложности их диагностики и лечения [31,39,50,55,64,108]. В последние годы в связи с развитием современных технологий и диагностических возможностей отмечается значительный рост частоты выявления больных с патологией коры надпочечников, как с опухолями, так и с неопухолевыми формами. Несмотря на достигнутые успехи в этой области, клиницисты часто сталкиваются с трудностями в дифференциальной диагностике различных форм вирильного синдрома и в ранней диагностике органического эндогенного гиперкортицизма.
Определение источника гиперпродукции андрогенов представляется трудной и важной задачей лабораторной диагностики. Отмечают многообразие форм гиперандрогении: надпочечниковая гиперандрогения (НГА), овариальная гиперандрогения (ОГА), смешанные формы гиперандрогении [53,55,71]. НГА наблюдается как самостоятельная патология и как сочетание с синдромом поликистозных яичников (СПКЯ). Одной из причин НГА является явная или стертая форма врожденной гиперплазии коры надпочечников (ВГКН), которая встречается чаще, не имеет клинических маркеров и может протекать как синдром поликистозных яичников (СПКЯ). Авторы отмечают как врожденные формы ферментной недостаточности надпочечникового стероидогенеза, обусловленные генетическим дефектом, так и вторичные формы ферментных нарушений биосинтеза стероидов [342,347]. У значительной части больных НГА может быть не связана с ферментными нарушениями биосинтеза стероидов [55].
Отсутствие клинических маркеров стертых форм врожденной гиперплазии коры надпочечников, возможность развития вторичных форм ферментных нарушений биосинтеза стероидов, сочетание надпочечниковой гиперандрогении (НГА) с синдромом поликистозных яичников (СПКЯ) осложняют поиск источника гиперпродукции андрогенов.
Определение базального уровня 17-гидроксипрогестерона в большинстве случаях не позволяет диагностировать стертую форму ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы [83,131]. Нет единой точки зрения по диагностическим критериям стертой формы ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы [42,131,160,218,282,354,357]. Особую сложность представляет диагностика дефекта 11 р-гидроксилазы [304,355]. При стертых формах ВГКН с недостаточностью 11 Р-гидроксилазы биохимические критерии диагностики заболевания не разработаны. У гетерозиготных носителей недостаточности 11 Р-гидроксилазы не отмечено каких-либо биохимических критериев, даже при стимуляции кортикотропином [355]. Альтернативный путь образования андростендиона из 11-дезоксикортизола и функциональное снижение активности 11 Р-гидроксилазы в условиях гиперандрогении любой этиологии создают определенные трудности при диагностике дефекта lip-гидроксилазы [130,175,232,294]. Дифференциальная диагностика дефекта 21-гидроксилазы от других форм ВГКН возможна только с помощью получения полного стероидного профиля [291].
На основании согласительного симпозиума в 2003 году в г. Роттердаме по диагностическим критериям СПКЯ диагноз его ставится при исключении других причин гиперандрогении, в том числе ВГКН и синдрома Иценко-Кушинга (СИК) [301]. Повышение экскреции свободного кортизола с мочой и уровня кортизола в крови при различных формах функционального гиперкортицизма и сохранение в некоторых случаях регуляции гипофизарно-надпочечниковой оси при субклиническом СИК вызывает определенные трудности в диагностике на данном этапе заболевания и требует изучения не только секреции кортизола, но и промежуточных продуктов стероидогенеза [111,334,343]. В настоящее время недостаточно изучены нарушения надпочечникового стероидогенеза у больных с инциденталомами. Ряд авторов отмечают, что случайно обнаруженные опухоли нередко выявляются у больных с ВГКН и ферментные нарушения могут способствовать их развитию [168,223,300]. Показания к оперативному лечению при инциденталомах во многом зависят от обнаруженных у больных нарушений надпочечникового стероидогенеза [19,110,336,346].
В связи с этим представляется актуальной разработка дополнительных биохимических критериев стертых форм ВГКН и субклинического СИК. Особую актуальность приобретает поиск дополнительных маркеров недостаточности 11 p-гидроксилазы для выбора тактики лечения данных больных. Методы иммуноферментного и радиоиммунологического анализа не позволяют одновременно проанализировать в одном образце биологического материала содержание различных кортикостероидов, что необходимо для диагностики субклинических форм заболеваний коры надпочечников. Функциональные тесты могут давать как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты.
В последнее время подчеркивается значение мультифакторного анализа сложных биологических образцов в норме и при патологии и его связь с нарушениями, возникающими на уровне генома [94]. В связи с этим, особое значение приобретают хроматографические методы анализа, которые наряду с качественным и количественным анализом индивидуальных компонентов, позволяют получать стероидные профили крови и мочи, являющиеся наиболее ценными диагностическими тестами для заболеваний, связанных с нарушением синтеза и метаболизма стероидных гормонов [73,335,345,350,353,359,364]. Для быстрой оценки общего состояния здоровья человека разрабатываются методы получения «обзорных» или «скрининговых» хроматограмм с оценкой всего профиля определяемых соединений [94]. Безусловный научно-практический интерес имеет разработка методов количественного определения и качественных характеристик индивидуальных кортикостероидов и оценка их дифференциально-диагностической значимости. Существующие в настоящее время клинико-лабораторные технологиим определения стероидных профилей не адаптированы к диагностике субклинических форм заболеваний гипофизарно-надпочечниковой системы. Для оценки нарушений надпочечникового стероидогенеза отсутствуют четкие критерии выбора лабораторных методик, сведения о диагностической значимости исследуемых параметров, референтные значения для них. Решение данных вопросов необходимы для усовершенствования диагностики и выработки адекватной терапии пациентов с заболеваниями коры надпочечников.
Цель исследования.
Изучить информативность обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии кортикостероидов, иммуноферментного и радиоиммунологического анализа для оптимизации существующих и разработки новых алгоритмов клинико-лабораторной диагностики заболеваний коры надпочечников.
Задачи исследования.
1. Разработать способ определения кортикостероидов в крови и моче на основе метода обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) с учетом оптимизации регламента пробоподготовки и условий хроматографического анализа.
2. Изучить особенности надпочечникового стероидогенеза у больных с различными формами вирильного синдрома и у больных со случайно выявленными опухолями коры надпочечников на основании определения содержания кортикостероидов в крови и моче методом ОФ ВЭЖХ и в сопоставлении с традиционными методами иммуноферментного (ИФА) и радиоиммунологического анализа (РИА).
3. Установить информативные лабораторные биохимические критерии стертых форм ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы и 11 (З-гидроксилазы, синдрома поликистозных яичников и смешанных форм гиперандрогении.
4. Установить информативные биохимические критерии субклинического синдрома Иценко-Кушинга и функционального гиперкортицизма по данным ОФ ВЭЖХ кортикостероидов в крови и моче.
5. Разработать алгоритмы лабораторной диагностики различных форм вирильного синдрома и случайно обнаруженных опухолей коры надпочечников.
Научная новизна исследования. С использованием качественного и количественного и определения кортикостероидов в крови и моче методом обращенно-фазовой ВЭЖХ получены новые данные о механизмах нарушений этапов биосинтеза кортикостероидов на ранних стадиях заболевания при различных формах вирильного синдрома и опухолях коры надпочечников.
Впервые по данным ОФ ВЭЖХ установлены биохимические критерии для дифференциальной диагностики стертых форм ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы и 11 Р-гидроксилазы. Информативные лабораторные критерии недостаточности различных изоферментов 11 Р-гидроксилазы выявлены по динамике уровней в крови 11-дезоксикортизола, 11-дезоксикортикостерона, кортикостерона, соотношений кортизол/11-дезоксикортизол и кортизол/кортизон при проведении пробы с кортикотропином у больных с вирильным синдромом и у больных со случайно обнаруженными опухолями коры надпочечников.
Получены биохимические критерии, свидетельствующие о недостаточности 11р-гидроксистероиддегидрогеназы-1 у больных с синдромом поликистозных яичников (увеличение экскреции свободного кортизона с мочой и снижение соотношения свободный кортизол/свободный кортизон).
Установлена информативность определения экскреции свободного кортизола и свободного кортизона с мочой на пробе с дексаметазоном, соотношений кортизол/кортизон в крови и свободный кортизол/свободный кортизон в моче для диагностики субклинического синдрома Иценко
Кушинга и для дифференциальной диагностики органического и функционального гиперкортицизма.
Впервые разработаны алгоритмы лабораторной диагностики стертых форм врожденной гиперплазии коры надпочечников у больных с вирильным синдромом и у больных с инциденталомами.
Практическая значимость работы.
Исследования качественных и количественных нарушений надпочечникового стероидогенеза методом ОФ ВЭЖХ позволяют на ранних стадиях диагностировать заболевания коры надпочечников. Разработаны информативные биохимические критерии диагностики стертых форм ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы и 11 Р-гидроксилазы, функционального гиперкортицизма, синдрома поликистозных яичников, смешанных форм гиперандрогении и субклинического синдрома Иценко-Кушинга. Показано диагностическое значение определения динамики уровней 11-дезоксикортизола, 11-дезоксикортикостерона, кортикостерона и соотношений кортизол/ 11-дезоксикортизол и кортизол/кортизон при проведении пробы с кортикотропином для выявления недостаточности 11 р-гидроксилазы. Разработан алгоритм оценки гормональной активности различных аденом коры надпочечников, позволяющий диагностировать субклинический синдром Иценко-Кушинга до проведения пробы с дексаметазоном и стертые формы ВГКН у больных с инциденталомами коры надпочечников. Алгоритм лабораторной диагностики различных форм вирильного синдрома позволяет диагностировать стертую форму ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы до проведения пробы с кортикотропином.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. Исследование качественного и количественного состава кортикостероидов в крови и моче методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии позволяет получить специфические хроматограммы стероидных профилей при различных заболеваниях коры надпочечников, установить на ранних стадиях нарушения надпочечникового стероидогенеза и метаболизма кортизола у больных с инциденталомами, дифференцировать стертые формы ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы и 11 р-гидроксилазы, органический и функциональный гиперкортицизм и способствует оптимизации тактики лечения больных с вирильным синдромом и со случайно обнаруженными опухолями коры надпочечников.
2. Общими информативными лабораторными критериями стертых форм ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы и 11 p-гидроксилазы по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии являются уменьшение экскреции свободного кортизола с мочой, снижение соотношения свободный кортизол / свободный кортизон, уменьшение соотношения кортизол / кортизон до и в результате стимуляции кортикотропином, качественные изменения стероидных профилей в крови и моче.
3. Недостаточность 11 Р-гидроксилазы диагностируется у больных с вирильным синдромом и у больных с инциденталомами при проведении пробы с кортикотропином на основании увеличения в крови уровней 11-дезоксикортизола, 11-дезоксикортикостерона, снижения прироста уровня кортикостерона и соотношений кортизол/11-дезоксикортизол и кортизол/кортизон, полученных по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии, и по снижению прироста в крови уровня альдостерона, полученного методом радиоиммунологического анализа.
4. Информативными биохимическими критериями синдрома поликистозных яичников по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии являются увеличение экскреции свободного кортизона с мочой и снижение соотношения свободный кортизол/свободный кортизон в моче, нормальные уровни в крови промежуточных продуктов стероидогенеза, а по данным традиционных методов анализа
- снижение в крови уровня глобулина, связывающего половые гормоны и увеличение уровней инсулина и С-пептида.
5. Наиболее информативными лабораторными критериями субклинического синдрома Иценко-Кушинга по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии являются увеличение экскреции свободного кортизола и свободного кортизона с мочой, недостаточное понижение их экскреции на пробе с дексаметазоном, повышение соотношений кортизол/кортизон в крови и свободный кортизол/свободный кортизон в моче, качественные изменения стероидных профилей в крови и моче.
6. Алгоритмы лабораторной диагностики различных форм вирильного синдрома и случайно обнаруженных опухолей коры надпочечников на основании качественного и количественного определения кортикостероидов в крови и моче методом обрагценно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и информативных показателей, полученных методами иммуно ферментного и радиоиммунологического анализа, позволяют дифференцировать стертые формы ВГКН и синдром поликистозных яичников, диагностировать субклинический синдром Иценко-Кушинга до проведения пробы с дексаметазоном, а стертую форму ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы до проведения пробы с кортикотропином.
Личный вклад автора. Участие автора в исследовании выразилось в определении основной идеи работы, личном участии в проведении лабораторных исследований, выполнении статистической обработки и анализа полученных данных.
Апробация работы.
Результаты исследования были доложены на заседаниях ассоциации эндокринологов Санкт-Петербурга и Ленинградской области (1999, 2001,
2004), на Российской конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика АМН СССР В.Г. Баранова, «Актуальные вопросы эндокринологии» (Санкт-Петербург, 2000 г.), 1У Всероссийском конгрессе эндокринологов «Актуальные проблемы современной эндокринологии» (Санкт-Петербург, 2001), 1-ой и 2-ой Международных конференциях «Высокие медицинские технологии XXI века» ( Испания, Бенидорм, 2002 и 2003), Всероссийской научно-практической конференции «Клиническая эндокринология-достижения и перспективы» (Санкт-Петербург, 2003), 111 Международном симпозиуме «100 лет хроматографии» (Москва, 2003 г.), на 22-м Всемирном Конгрессе «Патология и лабораторная медицина» (Южная Корея, 2003), 2-ой Международной конференции «Врачи мира пациентам» (Санкт-Петербург, 2003).
Реализация результатов исследования. Результаты проведенного исследования внедрены в лечебно-диагностическую работу клиник ГОУ ДПО СПбМАПО Росздрава, эндокринного отделения больницы Св. Преподобномученицы Елизаветы (СПб), в педагогический и научно-исследовательский процессы кафедры эндокринологии им. акад. В.Г.Баранова ГОУ ДПО СПбМАПО Росздрава.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 56 работ, в том числе 10 - в центральных журналах, рекомендованных ВАК, в главе монографии «Синдром Иценко-Кушинга». Получены 3 патента на изобретение, 2 приоритета на изобретение.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 288 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя, содержащего 365 источников, из которых 113 — на русском языке. Работа иллюстрирована 36 рисунками и 40 таблицами.
Заключение диссертационного исследования на тему "Информативность лабораторных технологий в формировании алгоритмов диагностики заболеваний коры надпочечников"
ВЫВОДЫ
1. Разработан способ количественного определения в сыворотке крови пяти кортикостероидов и экскреции свободного кортизола и свободного кортизона с мочой методом ОФ ВЭЖХ, определены его аналитические характеристики (точность, воспроизводимость, предел обнаружения). Оптимизированы регламент пробоподготовки биологических жидкостей с использованием жидкостной экстракции и условия хроматографического разделения стероидных гормонов в изократическом режиме элюирования с введением 3 мМ p-циклодекстрина в состав элюента, что привело к увеличению селективности и эффективности разделения стероидов.
2. На основании определения содержания кортикостероидов в крови и моче методом ОФ ВЭЖХ установлены общие диагностические критерии стертых форм ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы и 11р-гидроксилазы - уменьшение экскреции свободного кортизола с мочой и соотношений свободный кортизол/свободный кортизон в моче и кортизол/кортизон в крови, а при стимуляции кортикотропином снижение прироста в крови уровня кортизола и соотношения кортизол/кортизон по сравнению со здоровыми.
3. Дифференциально-диагностическими критериями стертой формы ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы являются увеличение в крови базального уровня кортикостерона и повышение прироста уровня альдостерона при стимуляции кортикотропином. Недостаточность 110-гидроксилазы характеризуется увеличением в крови базальных уровней 11-дезоксикортизола и 11-дезоксикортикостерона, а при пробе с кортикотропином - повышением в крови уровня 11-дезоксикортизола более, чем в 5 раз, снижением соотношения кортизол/11-дезоксикортизол более, чем в 10 раз, уменьшением прироста уровней кортикостерона и альдостерона по сравнению со здоровыми. Увеличение в крови при стимуляции кортикотропином только уровня 11-дезоксикортикостерона и снижение уровня кортикостерона указывают на недостаточность 11р-гидроксилазы-2.
У больных с синдромом поликистозных яичников установлено снижение в крови уровня глобулина, связывающего половые гормоны, увеличение уровней инсулина и С-пептида, нормальные уровни кортикостерона, 11-дезоксикортикостерона и 11-дезоксикортизола. Повышение экскреции свободного кортизона с мочой и уменьшение соотношения свободный кортизол/свободный кортизон в моче указывают на недостаточность 11 р-гидроксистероиддегидрогеназы-1. При смешанной форме гиперандрогении увеличена экскреция свободного кортизола и свободного кортизона с мочой при нормальном их соотношении, повышены в крови уровни кортизола и промежуточных продуктов стероидогенеза.
У больных с вирильным синдромом, обусловленным функциональным гиперкортицизмом, повышены в крови уровни АКТГ, кортизола, кортизона, кортикостерона и андрогенов, повышена экскреция свободного кортизола и свободного кортизона с мочой, нормальные соотношения кортизол/кортизон в крови и свободный кортизол/свободный кортизон в моче, нормальное подавление уровней тестостерона и кортизола на пробе с дексаметазоном. В результате стимуляции кортикотропином увеличены в крови уровни кортизола и кортикостерона при нормальном соотношении кортизол/кортизон.
Использование метода ОФ ВЭЖХ при сравнении с традиционными методами позволило повысить точность диагностики заболеваний с вирильным синдромом : увеличилось количество больных со стертыми формами ВГКН с 22,3% до 35,0%, со смешанной формой гиперандрогении с 6,8% до 10%, с функциональным гиперкортицизмом с 13,2% до 18,2%, уменьшилось количество больных с синдромом поликистозных яичников с 28,2% до 22,3%.
7. Нарушения надпочечникового стероидогенеза, характерные для стертых форм ВГКН, методом ОФ ВЭЖХ установлены у 23,3% больных со случайно выявленными опухолями коры надпочечников. У 4,8% больных установлена стертая форма ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы, а у 18,5% обнаружена недостаточность lip-гидроксилазы.
8. Диагностическими критериями субклинического синдрома Иценко-Кушинга при использовании ОФ ВЭЖХ являются увеличение экскреции свободного кортизола и свободного кортизона с мочой более, чем в 3 раза, снижение ее на пробе с дексаметазоном менее, чем на 50%, увеличение соотношений кортизол/кортизон в крови и свободный кортизол/свободный кортизон в моче, повышение в крови уровней 11-дезоксикортикостерона и 11-дезоксикортизола.
9. У больных с адренокарциномой установлены наиболее высокие уровни 11-дезоксикортизола (более 33,0 нг/мл) и 11-дезоксикортикостерона (более 15,0 нг/мл) по сравнению с больными с синдромом Иценко-Кушинга, качественные изменения стероидного профиля в крови, которые являются информативными лабораторными критериями злокачественности опухолей коры надпочечников. ,
10. Разработаны алгоритмы лабораторной диагностики стертых форм врожденной гиперплазии коры надпочечников у больных с вирильным синдромом и у больных со случайно обнаруженными опухолями коры надпочечников на основании определения содержания кортикостероидов в крови и моче методом ОФ ВЭЖХ и определения в крови информативных показателей методами иммуноферментного и радиоиммунологического анализа, позволившие дифференцировать стертые формы ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы и lip-гидроксилазы и синдром поликистозных яичников, диагностировать стертую форму ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы до проведения пробы с кортикотропином, а субклинический синдром Иценко-Кушинга до проведения пробы с дексаметазоном.
11. Наличие неидентифицированных соединений с одинаковыми относительными параметрами удерживания при хроматографическом исследовании кортикостероидов в крови и моче у больных с простой вирильной формой ВГКН, у 31% больных со стертыми формами ВГКН и у 55% больных с аденомами коры надпочечников указывают на идентичный характер надпочечникового стероидогенеза, что свидетельствует о значении патогенетических механизмов ВГКН в формировании опухолей коры надпочечников у части больных.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Для дифференциальной диагностики стертых форм ВГКН и синдрома поликистозных яичников целесообразно определять в крови методом иммуноферментного анализа глобулин, связывающий половые гормоны, инсулин и 17-гидроксипрогестерон (в раннюю фолликулярную фазу менструального цикла), а методом ОФ ВЭЖХ определять в крови кортикостерон, 11-дезоксикортизол и 11-дезоксикортикостерон, а также экскрецию свободного кортизола и свободного кортизона с мочой.
2. У больных с вирильным синдромом и у больных с инциденталомами коры надпочечников при обнаружении в крови увеличения базальных уровней 11-дезоксикортизола или 11-дезоксикортикостерона и при снижении экскреции свободного кортизола с мочой, уменьшении соотношений кортизол/кортизон в крови и свободный кортизол/ свободный кортизон в моче рекомендуется проводить пробу с кортикотропином для выявления стертых форм ВГКН.
3. Для диагностики стертой формы ВГКН с дефектом 11 р-гидроксилазы проба с кортикотропином оценивается по уровням в крови 11-дезоксикортизола, 11-дезоксикортикостерона, кортикостерона и альдостерона, а также по соотношениям кортизол/11-дезоксикортизол и кортизол/кортизон.
4. Для диагностики субклинического синдрома Иценко-Кушинга при проведении пробы с дексаметазоном, кроме определения в крови уровня кортизола, необходимо исследовать экскрецию свободного кортизола и свободного кортизона с мочой.
5. При определении стероидных гормонов методом ОФ ВЭЖХ рекомендуется использование в составе подвижной фазы в качестве комплексообразователя p-циклодекстрина, что приводит к увеличению селективности и эффективности разделения стероидов.
248
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2005 года, Великанова, Людмила Иосифовна
1. Андрусенко А.Б. Эндокринные заболевания и синдромы. Классификация. // Москва. 1998. - 177 с.
2. Балаболкин М.И., Клебанова Е.М. Гипоталамический синдром пубертатного периода: Эндокринология. // М. 1998. - С. 176- 178.
3. Баранов В.Г., Зарипова З.Х. Синдром Иценко-Кушинга. В кн. «Руководство по клинической эндокринологии» под ред. В.Г. Баранова. //Лен. 1977.-С. 299-334.
4. Баранов В.Г., Трофимов В.М. Этиология и патогенез. В кн. «Синдром Иценко-Кушинга» под. ред. В.Г.Баранова, А.И. Нечая. // Л.: Медицина. -— 1988.-С. 72-90.
5. Баранов В.Г., Нечай А.И. Синдром Иценко Кушинга. // Л.: Медицина. - 1988.-222 с.
6. Бельгов А.Ю. Гормональные расстройства у юношей с ожирением. / Актуальные вопросы эндокринологии. Тез. докл. науч.- практ. конф., посвященной 80-летию проф. Д.Я. Шурыгина. // СПб. 1993. - С. 23 -24.
7. Бельгов А.Ю. Особенности гипоталамического синдрома пубертатного периода у юношей // Актуальные проблемы современной эндокринологии. Материалы IV Всеросс. конгр. эндокринологов. -СПб.-2001.-С. 578.
8. Бельгов А.Ю. Особенности патогенеза артериальной гипертензии у юношей с ожирением (гемодинамические и обменно-гормональные механизмы). Автореф. дисс. канд. мед. наук. СПб. - 1994. - 16 с.
9. Бельгов А.Ю., Строев Ю.И. Гормональный профиль юношеского ожирения. // Избр. вопр. внутренней патологии подростков. Сб. научн. тр. под ред. Л.И. Левиной. СПб. - 1993. - С. 99-103.
10. Бельгов А.Ю., Строев Ю.И. Эндокринно-обменные нарушения у подростков с гипоталамическим синдромом пубертатного периода
11. Сохранение репродуктивного потенциала подростков: Сб. науч. статей; ред. Ю.А. Гуркина. СПб. - 2001. - С. 140-141.
12. П.Бельченко JI.B. Клинико-биохимические и компьютерно-томографические критерии диагностики и лечения болезни Иценко-Кушинга. Автореф. дис. канд. мед. наук. // Всесоюзный эндокринологический научный центр АМН СССР. М., 1991. - 25 С.
13. Беляков Н.А., Чубриева С.Ю., Глухов Н.В. Инсулинорезистентность и синдром поликистозных яичников. Часть 1. // Эфферентная терапия. -2002. Т.8, № 2. - С. 3-11.
14. Безверхая Т.П., Рыбаков О.И., Комиссаренко И.В., Верхоглядова JI.M. Исследование глюкокортикоидов у больных с опухолями коры надпочечников // Пробл. Эндокринологии. 1989. - Т.35, №1.-С. 11-15.
15. Безверхая Т.П., Марков В.В. Первичная резистентность к кортизолу, опосредованная нарушением рецепции глюкокортикоидов: Обзор // Пробл. Эндокринологии. 1991. - Т. 37, №3. - С. 61-65
16. Берштейн JI.M. Гормональный канцерогенез: СПб.: Наука. - 2000. -199 с.
17. Блохин В.Ю. Сравнительная оценка информативности различных диагностических методов при гормонально-неактивных опухолях надпочечников: Автореф. дис. канд. мед. наук. -М., 1998.-24 с.
18. Болезни Иценко Кушинга, некоторые вопросы диагностики и терапии // Методические рекомендации. - Ташкент, 1999. - 16 с.
19. Борисов А.Е., Ворохобина Н.В., Краснов JI.M. Хирургическая тактика при инциденталомах надпочечников. И Вестник ассоциации эндокринологов Санкт-Петербурга. 2000. - №5 (12). — С.З.
20. Боровиков В .П, Боровиков И.П. STATISTICA -Статистический анализ и обработка данных в среде Windows. М.: Филин. - 1997. - С. 110.
21. Бугрова С.А. Ожирение: Руководство по клинической эндокринологии // Под ред. Н.Т. Старковой. СПб. - 1996. - С. 486-498.
22. Ветшев П. С., Ипполитов JI. И., Лотов А. Н. и др. Инциденталомы надпочечников. // Проблемы эндокринологии. 1998. - Т.44, №5. -С. 20-26.
23. Ветшев, Л.И. Ипполитов и др., Инциденталомы надпочечников // Пробл. Эндокринологии. 1998. - Т. 44, №5. - С. 42-46.
24. Виц М., Виц Ш., Лобик Л., Цитрон Ш. Современный подход к диагностике и лечению надпочечниковой опухоли, случайно обнаруженной при обследовании больного (The Incidental Adrenal Mass) // Международный медицинский журнал. 1999. - №3-4. - С. 192-193.
25. Воронцов А.В. Магнитно-резонансная томографии в диагностике патологии гипоталамо-гипофизарной системы и надпочечников. // Автореферат дисс. докт. мед. наук. Москва, 2001. - 45с.
26. Гельман В.Я. Компьютерный анализ медицинских данных для аспирантов. Учебное пособие. СПб.: СПб МАПО. - 1999. - 59 с.
27. Герег Ш. Количественный анализ стероидов. М.: Мир. - 1985. - 220 с.
28. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. М.: Практика. - 1998. - 459 с.
29. Глазкова О.И. Оптимизация диагностики и лечения бесплодия у пациенток с хронической ановуляцией и гиперандрогенией.// Автореф. дис. канд. мед. наук. М., 1999. - 22 с.
30. Гончаров Н.П. Методы определения гормонов // Материалы VII (VIII) Российского симпозиума по хирургической эндокринологии
31. Современные аспекты хирургической эндокринологии". Казань. -1999.-С. 109-114.
32. Гончаров Н.П., Колесникова Г.С., Воронцов В.И. и др. Стероидогенез у больных с различными дисфункциями надпочечниковых и половых желез // Вестник Российской АМН. 1995. - №6. - С. 30-37.
33. Гончаров Н.П., Добрачева А.Д., Пищулин А.А. и др. Стероидогенез в надпочечниках и гонадах у больных поликистозом яичников при пробе с бусерелином.// Проблемы Эндокринологии. 2003. - Т.49, №4. - С. 12-16.
34. Давыдова И.В. Глюкокортикоидные рецепторы II типа как маркеры злокачественных гормонально-активных опухолей надпочечников // Материалы 5-го Рос. симпоз. по хирургии и эндокринологии "Хирургия эндокринных желез". Ульяновск. - 1996. - С. 169-171.
35. Дедов И.И., Дедов В.И. Биоритмы гормонов: — М.: Медицина. — 1992.-256 с.
36. Дедов И.И. и др. Алгоритмы диагностики и лечения болезней эндокринной системы: Москва. 1995. - 86 с.
37. Дедов И.И., Марова Е.И., Вакс В.В. Надпочечниковая недостаточность (этиология, патогенез, клиника, диагностика, лечение). Методическое пособие для врачей: М.: Колор Ит Студио. - 2000. - 56 с.
38. Дедов И.И., Мельниченко Г.А., Фадеев В.В. Эндокринология: Учебник. М.: Медицина. - 2000. - 632 с.
39. Дзенис И.Г., Бахарев В.А., Фанченко Н.Д. и др. Стероидогенез в надпочечниках при синдроме поликистозных яичников.// Проблемы Репродукции. 1997. - № 3. - С. 18-22.
40. Дзенис И.Г., Брыкова Е.К., Гертц Г., Корсаков С.Г. Особенности функции коры надпочечников у гетерозиготных носителей недостаточности 21-гидроксилазы.// Проблемы Эндокринологии. —1991. —Т.37, №1. С. 34-37.
41. Дзенис И.Г., Евграфов О.В., Брыкова Е.К. и др. Врождённая дисфункция коры надпочечников обнаружение новой мутации гена 21-гидроксилазы.// Вестник РАМН. - 1994. - №12. - С. 29-33.
42. Дзенис И.Г., Юдина Т.Н., Брыкова Е.К., Бахарев В.А., Фанченко Н.Д. Диагностика гетерозиготного носительства мутантного гена 21-гидроксилазы // Акушерство и гинекология. 1995. - №1. - С. 21-23.
43. Димова М.Н., Васьков В.М., Игумнова Ю.Э. Диагностика и лечебная тактика при гормонально-неактивных опухолях надпочечников // Хирургия надпочечников : Материалы 1-го Всерос. симпоз СПб. —1992.-С. 13-15.
44. Добрачева А.Д., Гончаров Н.П., Тодуа Т.Н., Нижарадзе И.Д. Состояние стероидогенеза в надпочечниках и гонадах у больных поликистозом яичников при ингибировании гонадотропной функции.// Проблемы Эндокринологии. 1999. - Т.45, №1. - С. 34-37.
45. Довганюк B.C. Гормонально-неактивные опухоли надпочечников (диагностика и лечение): Автореф. дис. канд.мед.наук. СПб. - 1996. — 23 с.
46. Жаркин Н.А., Кузьмина С.А. Клинико-гормональные и эхографические параллели при синдроме гиперандрогении.// Проблемы Репродукции. -2001.- №6. С.27-32.
47. Кация Г.В., Гончаров Н.П. Взаимодействие систем гипоталамус-гипофиз-кора надпочечников и гипоталамус-гипофиз-гонады // Вестник РАМН. 1994. - №12. - С.44-47.
48. Колесникова Г.С., Гончаров Н.П., Воронцов В.И. и др. Сравнительная характеристика стероидогенеза и его биоритма в коре надпочечников в условиях их гиперфункции. // Вестник РАМН. 1994. - №12. - С. 3944.
49. Комаров Е.К. Особенности функции коры надпочечников у больных с гиперандрогенией различного генеза.// Акушерство и гинекология. -1991.- №12. — С.41-43.
50. Комаров Е.К. Особенности гипоталамической моноаминергической регуляции функции коры надпочечников у больных с гиперандрогенемией. // Проблемы Эндокринологии. 1993. - Т.39, №2. - С. 24-28.
51. Комаров Е.К. Нарушение регуляции функции надпочечников и яичников у женщин с гиперандрогенемией (Патогенез, диагностика, лечение): Автореф. дисс. докт. мед. наук. СПб. - 1993. - С. 44.
52. Комиссаренко И.В., Безверхая Т.П., Беникова Е.А. и др. Нарушение функции надпочечников при эндокринных заболеваниях: — Киев: Здоров'я.- 1984.-240 с.
53. Котляров Н.М., Власов П.В. Лучевая диагностика заболеваний надпочечников //Медицинская визуализация. 1999. -№10. - С. 31-36.
54. Кузнецов Н.С., Серпуховитин С.Ю., Гончаров Н.П. и др. Диагностика и лечение гормонально-неактивных опухолей надпочечников.// Материалы 8-го Российского симпозиума по хирургической эндокринологии. Саранск. - 1997. - С. 34-35.
55. Кузнецов Н.С., Ягельский В.П., Кулезнева Ю.В. Сравнительная оценка различных методов диагностики при заболеваниях надпочечников // Хирургия. 1994. - №1. - С. 37-39.
56. Крылин В.В. Состояние симпато-адрениловой системы у больных с нарушениями надпочечникового стероидогенеза и жирового обмена / Автореф. канд.дисс., ЭНЦ РАМН. Москва. - 1996. - 22 с.
57. Кэттайл В.М., Арки Р.А. Патофизиология эндокринной системы: пер. с англ. — СПб. М.: «Невский Диалект», «Издательство БИНОМ». -2001.-336 с.
58. Левин Л. Врождённая гиперплазия коры надпочечников // Эндокринология. Москва: Практика. - 1999. - С. 222-242.
59. Левина Л.И., Щеглова Л.В. Нейроциркуляторная дистоция у подростков(лекция) // Санкт Петербургские врачебные ведомости. — 1996.-№3-4.-С. 14-18.
60. Лисс В.Л., Николаева Л.В., Нагорная И.И., Плотникова Е.В., Скородок Ю.Л., Шабалов Н.П. Лабораторная диагностика и функциональные пробы в детской эндокринологии. — СПб.: Специальная литература. — 1996.- 136 с.
61. Мамаева В.Г. Инциденталомы надпочечников (клиника, диагностика и тактика ведения больных): Автореф. дис. канд. мед. наук. М. - 1997. -21 с.
62. Марова Е.И. Достижения в диагностике и лечении болезни Иценко-кушинга / В кн. Нейроэндокринология. Клинические очерки. // Под ред. Е.И.Маровой. Ярославль: Диа-пресс. 1999. - С. 81-144.
63. Марова Е.И., Арапова С.Д., Бельченко JI.B. Болезнь Иценко-Кушинга // Методическое пособие для врачей. Москва. — 2000. - 40 с.
64. Майстренко Н.А., Довганюк B.C., Фомин Н.Ф., Ромащенко П.Н. Гормонально-неактивные опухоли надпочечников. СПб.: Издательство ЛБИ. - 2001. - 171 с.
65. Морозова М.Г., Гампер Н.Л., Дубинина Е.Е. и др. Высокоэффективная жидкостная хроматография кортикостероидов у больных с депрессией и деперсосонолизацией.// Клиническая лабораторная диагностика. — 2000.-№4.-С. 14-16.
66. Натмеладзе К.В. Диагностика и лечение женского бесплодия при стёртой форме адрено-генитального стндрома: Автореф.дис. канд. мед. наук. Тбилиси. - 1990. - 22 с.
67. Овсянникова Т.В, Фанченко Н.Д., Сперанская Н.В., Глазкова О.И. Особенности функции коры надпочечников у больных с хронической ановуляцией и гиперандрогенией.// Проблемы Репродукции. 2001. -№1. - С. 30-35.
68. Орлов Е.Н., Антипов Е.М., Николаев Н.Н. Некоторые аспекты получения стероидных профилей мочи // Вопросы мед. химии. 1993. - №3. - С. 7-9.
69. Орлов Е.Н., Н.Н.Николаев, Е.М.Антипов, Л.А.Чмож, О.В.Макаров. Диагностическое значение стероидных профилей мочи // Вопросы мед. химии. 1995. - №5. - С. 35-38.
70. Панфилова Л.В., Вотякова О.И., Прусова К.М. и др. К вопросу о диагностике пубертатно-юношеского диспитуитаризма. /Актуальныепроблемы современной эндокринологии. Матер. IV Всерос. конг. эндокринологии. СПб. - 2001. - С. 615.
71. Пищулин А.А., Бутов А.В., Удовиченко О.В. Синдром овариальной гиперандрогении неопухолевого генеза.// Проблемы репродукции. — 1999. Т.5, №3. - С. 6-16.
72. Плотникова Е.В. Клинические варианты недостаточности 21-гидроксилазы у детей: Автореф. дис. канд. мед. наук. JI. - 1991. —19 с.
73. Резников А.Г. Методы определения гормонов. // Киев. 1980. — С. 266267.
74. Ромазанович И.Г., Гинчерман Е.З., Голубева И.В. Исследование пролактина у больных с врождённой дисфункцией коры надпочечников.// Проблемы Эндокринологии. 1980. -№3. - С. 37-40.
75. Савушкина А.С. Клиническая картина и диагностика / В кн. Синдром Иценко-Кушинга // Под. ред. В.Г.Баранова, А.И. Нечая. — Лен., Медицина. 1988. - С. 90-114.
76. Сергеев П.В. Стероидные гормоны. //М. Наука. 1984.-239 с.
77. Сергиенко В.И., Бондарева И.Б. Математическая статистика в клинических исследованиях. М.: Гэотар, Медицина. — 2000. - 256 с.
78. Сильницкий П.А., Веденеева Л.Ф., Соломина Е.А. К вопросу о диагностике и лечебной тактике при опухолях надпочечников // Сборник научных трудов. СПб. - 1998. - С. 237-241.
79. Серебрякова И.П. Функциональное состояние систем гипофиз-надпочечники и гипофиз-гонады у больных с врожденной гиперплазией коры надпочечников вследствие дефекта 21-гидроксилазы: Автореф. дисс. канд. мед. наук. — СПб. 2004. -22 с.
80. Семин В.Е., Трунин Ю.К. Кортикотропиномы. Ранняя диагностика и лечение (лекция) // Пробл эндокринол. 1994. - Т.40., № 1. - С. 31-35.
81. Сергиенко В.И., Бондарева И.Б. Математическая статистика в клинических исследованиях. М.: Гэотар, Медицина. - 2000. - 256 с.
82. Старкова Н.Т. Клиническая эндокринология (проблемы фармакотерапии) М.: Медицина. - 1983. - 288 с.
83. Строев Ю.И., Бельгов А.Ю., Капитонова Н.В., Кирьянова Д. Р. Артериальная гипертензия у подростков призывного возраста с различной массой тела // Всерос. конф. Кардиология XX век. Сб. тез. докл. - СПб. - 2001. - С. 53-54.
84. Строев Ю.И., Чирилов Л.П., Чернова Л.А., Бельгов А.Ю. Ожирение у подростков. СПб. - 2003. - С. 91-177.
85. Теппермен Дж., Теппермен X. Физиология обмена веществ и эндокринной системы. Вводный курс: Пер. с англ. М.: Мир. - 1989. -656 с.
86. Тиц Н.У. Энциклопедия клинических лабораторных тестов: Пер. с англ. М.: Издательство "Лабиннформ". — 1997. - 960 с.
87. Тогузов Р.Т., Яшин Я.И., Яшин А.Я. и др. Биомаркеры заболеваний человека как проблема аналитической химии //Всероссийский симпозиум «Хроматография и хроматографические приборы». — Москва. 2004. - С. 72.
88. Трофимов В.М., Калинин А.П. Современные представления о тактике хирурга при гормонально-неактивных опухолях надпочечников // Хирургия. 1994. - №7. - С. 38-41.
89. Трофимова Т.Н., Назинкина Ю.В., Голимбиевская Т.А., Смоленцева Н.В. Лучевая диагностика инциденталом надпочечников // Материалы рос. конф., посвящ. 100-летию со дня рожд. академика АМН СССР
90. B.Г.Баранова "Актуальные вопросы эндокринологии". СПб. - 2000.1. C. 254.
91. Тюльпаков А.Н. Ренин-ангиотензиновая и гипофизарно-надпочечниковая системы у детей, страдающих врождённой гиперплазией коры надпочечников вследствие дефицита 21-гидроксилазы: Автореф. дис. канд. мед. наук. М. - 1991. - 24 с.
92. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях // М.: Медицина. 1975. - С. 116-120.
93. Фелиг Ф., Бакстер Дж.Д., Бродус А.Е., Фромен JI.A. Эндокринология и метаболизм: Пер. с англ. М.: Медицина, 1985. - 520 с.
94. Филаретов А.А. Принципы и механизмы регуляции гипофизарно-адренокортикальной системы. JL: Наука. 1987. - 165 с.
95. Фофанова О.В., Панкова С.С., Колесникова Г.С. Методические подходы к определению уровней стероидных гормонов в различных биологических жидкостях при врождённой дисфункции коры надпочечников.// Педиатрия. 1989. - № 11. — С. 72-75.
96. Фофанова О.В. Клиническая оценка роли суточных ритмов содержания гормонов в крови и слюне у детей с врождённой дисфункцией коры надпочечников.// Педиатрия. 1989. - № 11. — С. 38-42.
97. Халимова З.Ю., Наримова Г.Ж., Абдурахманова A.M. Клинико-гормональная оценка больных с гипоталамическим ожирением // Актуальные проблемы современной эндокринологии: Материалы IV Всерос. конгр. эндокринологов. СПб. - 2001. - С. 689.
98. А. Хеншен, К.-П. Хуле, Ф. Лотшпайх, В. Вельтер. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. М. Мир. 1988.-С. 580.
99. Холодова Е.А., Мохорт Т.В., Гиткина Л.С. Справочник по клинической эндокринологии . Минск: Беларусь - 1998. - 510 с.
100. Хроматография. Практическое применение метода. Под ред. Хефтмана Э. М. М.:Мир. - 1986. - 336 с.
101. Шкроб О.С., Ветшев П.С., Беличенко О.И. и др. Информативность различных диагностических методов при синдроме Иценко-Кушинга // Хирургия. 1995. — №1. - С. 4-7.
102. Шустов С.Б., Краснов Л.М., Калашников С.А., Вавилов А.Г. Смешенная аденома коры надпочечника, секретирующая кортизол и дезоксикортикостерон. // Вопросы онкологии. 1989. - Т.35, №12. -С. 1485-1487.
103. Шустов С.Б., Халимов Ю.Ш. Функциональная и топическая диагностика в эндокринологиии // СПб.: ЭЛБИ. СПб. - 2001. - 239 с.
104. Шавладзе М.Д. Эффективность хирургического лечения больных со случайно выявленными опухолями надпочечников: . Автореф. дисс. канд. мед. наук. СПб. - 2003. -21 с.
105. Шафигуллина З.Р. Состояние гипофизарно-адреналовой системы у больных с инциденталомами коры надпочечников. Автореф. дисс. канд. мед. наук. — СПб. 2002. -21 с.
106. Эндокринные заболевания и синдромы. Вирилизм./ Под ред. М.С. Бирюковой. М.: Знание. - Москва. - 1999. - 198 с.
107. Юнкеров В.И., Григорьев С.Г. Математико-статистическая обработка данных медицинских исследований. Лекции для адъюнктов и аспирантов. СПб.: ВмедА. - 2002. - 266 с.
108. Angeli A., Osella G., Ali A., Terzolo M. Adrenal incidentaloma: an overview of clinical and epidemiological data from the National Italian Study Group//| Hormone Research. 1997. - Vol. 47. - P. 279-283.
109. Appelblad P., Irgum K. Review. Separation and detection of neuroactive steroids from biological matrices.// J. Chromatogr. A. — 2002. -Vol. 955.-P. 151-182.
110. Arlt W., Callies F., van Vlijmen J.C. et al. Dehydroepiandrosterone replacement in women with adrenal insufficiency.//N.Engl.J.Med. 1999. -Vol. 341.-P. 1013-1020.
111. Arnaldy G , Angeli A, Atkinson A.B. et.al. Diagnosis and complications of Cushing's syndrome: a consensus statement. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2003. - Vol.88. - P.5593-5602.
112. Arnaldy G., Masini A., Giacchetti G. Adrenal incidentaloma // Braz J.Med. Biol. Res. 2000. - Vol. 33. - P. 1177.
113. Asuncion M., Calvo R.M., san Millan J.L.et al. A prospective study of the prevalence of the polycystic ovary syndrome in unselected Caucasian women from Spain.// J.Clin.Endocrinol.Metab. 2000. - Vol. 85. - P. 24342438.
114. Atkinson AB., Kennedy AL., Carson D.J., Hadden D.R., Weaver J.A., Sheridan B. Five cases of cyclical Clashing's syndrome // Br. Med. J. -1985. Vol. 291 - P. 1453-1457.
115. Azziz R., Black V., Hines G.A. et al. Adrenal androgen excess in the polycystic ovary syndrome: sensivity and responsivity of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis.// J.Clin.Endocrinol.Metab. 1998. - Vol. 83, №7. -P.2317-2323.
116. Azziz R., Carmina E., Sawata ME. Idiopathic hirsutism.// Endocr. Rev. 2000. - Vol. 21. - P. 347-362.
117. Azziz R., Dewailly D., Owerbach D. Clinical review 56. Nonclassical adrenal hyperplasia: current concspts.// J. Clin.Endocrinol.Metab. 1994. -Vol. 78, №4.-P. 810-815.
118. Azziz R., Sanchez L.A., Knochenhauer E.S. et al. Androgen excess in women: experience with over 1000 consecutive patients.// J. Clin.Endocrinol.Metab. 2004. - Vol. 89, №2. - P. 453-462.
119. Azziz R., Zacur H.A. 21-hydroxylase deficiency in female hyperandrogenism: screening and diagnosis.// J.Clin.Endocrinol.Metab. -1989.-Vol. 69.-P. 577-583.
120. Baird A., Kan K., Solomon S. Androstenedione mediated inhibition of 1 lp-hydroxylation in monolayer cell cultures of fetal calf adrenals.// j. Steroid biochem.- 1983.-Vol. 18.-P. 581-584.
121. Balsamo A., Cicognani A., Baldazzi L. et al. CYP21 genotype, adult height, and pubertal development in 55 patients treated for 21-hydroxylase deficiency.// J.Clin.Endocrinol.Metab. 2003. - Vol. 88, №12. - P. 56805688.
122. Barbat В., Bogyo A., Raux-Demay M.C. et al. Screening of CYP21 gene mutations in 129 French patients affected by steroid 21-hydroxylase deficiency.// Hum.Mutat. 1995. - Vol. 5, №2. - P. 126-130.
123. Barrou Z., Abecassis J.P., Guilhaume В., Thomopoulos P., Bertagna X., Derome P., Bonnin A., Luton J.P. Magnetic resonance imaging in Cushing disease. Prediction of surgical results. French. // Presse Med. -1997. Vol. 26. - P. 7-11.
124. Baumgartner-Pazzer S.M., Nowotny P., Waldhausl W., Vierhapper H. A rare duplicated 21- hydroxylase haplotype and a de novo mutation: a family analysis.// J.Clin.Endocrinol.Metab. 2003. - Vol.88, №6. - P.2794-2796.
125. Beuschlein F., Schulze E., Mora P. et al. Steroid 21- hydroxylase mutations and 21- hydroxylase messenger ribonucleic acid expression inhuman adrenocortical tumors. // J.Clin. Endocrinol. Metab. 1998. - Vol. 83, №7.-P. 2585-2588.
126. Biasson-Lauber A., Suter SL., Shackleton CH, Zachmann M. Apparent cortisone reductase deficiency: a rare cause of hyperandrogenemia and hypercortisolism.// Horm. Res. 2000. - Vol. 53. - P. 260-266.
127. Bickler S.W., McMahon T.J., Campbell J.R., Mandel S., Piatt J.H., Harrison M.W. Preoperative diagnostic evaluation of children with Cushing's syndrome // J. Pediatr. Surg. 1994. - Vol. 29. - P. 671-676.
128. Bornstein S.R., Tajima Т., Eisenhofer G., Haidan A., Aguilera G. Adrenomedullary function in severely impaired 21-hydroxylase deficiency mice.// FASEB J. 1999. - Vol. 13, №10. - P.l 185-1194.
129. Boyar R.M., Witkin M., Carruth A., Ramsey J. Circadian Cortisol secretory rhythms in Cushing's disease // J. Clin. Endocrinol. Metab. -1979. Vol. 48. - P. 760-765.
130. Caplan R.N., Strutt P.J., Wickus G.G. Subclinical hormone secretion by incidentally discovered adrenal masses // Arch.Surg. 1994. - Vol. 129. -P. 291-296.
131. Carbera M., Vogiatzi M.G., New M.I. Long term outcome in male with classic congenital adrenal hyperplasia.// J. Clin.Endocrinol.Metab. — 2001. Vol. 86. - P. 3070-3078.
132. Carpene G., Vettoretti A., Pedini F., Rocco S. Hypertensive congenital adrenal enzymatic defects detected by high performance liquidchromatography of corticosteroids // J. Chromatogr. B. 1991. - Vol. 553. -P. 201-204.
133. Charmandari E., Hindmarsh P.C., Jonston A., Brook CJ.D. Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency: alterations in Cortisol pharmacokinetics at puberty.// J. Clin.Endocrinol.Metab. 2001. -Vol. 86.-P. 2701-2708.
134. Charmandari E., Eisenhafer G., Mehlinger S.L.et al. Adrenomedullary function may predict phenotype and genotype in classic 21-hydroxylase deficiency.// J. Clin.Endocrinol.Metab. 2002. - Vol. 87. - P. 3031-3037.
135. Chetkowsky R.J., DeFazio J., Shamonki I. et al. The incidence of late-onset congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency among hirsute women.// J. Clin.Endocrinol.Metab. 1984. - Vol. 58. - P. 595-598.
136. Cirimele V., Kintz P., Dumestre V. et al. Identification of ten corticosteroids in human hair by liquid chromatography-ionospray mass spectromrtry.// Forensic Sci.Int. 2000. - Vol. 107. - P. 381-388.
137. Cisternino M., Dondi E., Martinetti M. et al. Exaggerated 17-hydroxyprogesterone response to short-term adrenal stimulation and evidence for CYP21 gene point mutations in true precocious puberty.// Clin.Endocrinol. 1998. - Vol. 48. - P. 555-560.
138. Chidiac R.M., Aron D.C. Incidentaloma. A disease of modern technology. // Endocrin. Metab. Clin. North Am. 1995. - Vol. 24. - P. 663-710.
139. Chidiac R.M., Aron D.C. Incidentalomas. A disease of modern technology // Epidemiology and clinical decision making. 1997. - Vol. 26, №1. -P. 233-253.
140. Cleland S.J., Connel J.M. Endocrine hypertension // J. Roy. Coll. Physicians London. 1998. - Vol. 32,№2. - P. 104-108.
141. Connors K.A. The stability of cyclodextrin complexes in solution.// Chem. Rev. 1997. - Vol. 97. - P. 1325-1357.
142. Consensus statement on 21-hydroxylase deficiency from The European Society for paediatric endocrinology and The Lawson Wilkins Paediatric endocrine society. Joint ESPE/LWPES САН working group.// Horm.Res. 2002. - Vol. 58. - P. 188-195.
143. Contreras P., Araya V. Overnight dexamethasone pre-treatment improves the performance of the lysine-vasopressin test in the diagnosis of Cushing's syndrome.// Clin. Endocrinol. 1996. - Vol. 44. - P. 703-710.
144. Crapo L. Cushing's syndrome: a review of diagnostic tests // Metabolism. 1997. - Vol. 9. - P. 955-977.
145. Cronin C., Igoe D., Duffy M.J., Cunningham S.K., McKenna T.J. The overnight dexamethasone test is a worthwhile screening procedure // Clin. Endocrinol. 1990. - Vol. 33. - P. 27-33.
146. Csehati Т., Forgacs T. Effect of P-cyclodextrin derivatives on the retention of steroidal drugs.// J. Chromatogr. B: Biomed. Appl. 1996. -Vol. 68, №1 -P. 205-211.
147. Corsello S.M., Delia Casa S. et al. Incidentally discovered adrenal masses: a functional and morphological study // Exp Clin Endocrinol. -1993.- Vol. 101-P. 131-137.
148. Del Monte P., Bernasconl D. et al. Increased 17 a-hydroxyprogesterone response to ACTH in silent adenoma: cause or effect? // Clinical Endocrinology. 1995. - Vol. 42. - P. 273-277.
149. Dewailly D. Nonclassical 21-hydroxylase deficiency.// Seminars in reproductive medicine. 2002. - Vol. 20, №3. - P. 243-248.
150. Dimaraki E. V. and C. A. Jaffe Troglitazone Induces CYP3A4 Activity Leading to Falsely Abnormal Dexamethasone Suppression Test // J. Clin. Endocrinol. Metab.-2003.-Vol. 88, №7.-P. 3113-3116.
151. Dolfing J.G., Tucker K.E., Lem C.M. et al. Low 11-deoxycortisol to Cortisol conversion reflects extra-adrenal factors in the majority of women with normo-gonadotrophic normo-estrogenic infertility.// Hum. Reprod. -2003. Vol. 18, №2. - P. 333-337.
152. Duck S.C. Malignancy associated with congenital adrenal hyperplasia.//J.Pediatr. 1981. - Vol. 99, №3. - P. 423-425.
153. Fallon A., Booth R.F.G., Bell L.D. Applications of HPLC in biochemistry. Elsevier Science Publishers B.V. 1987. - P. 410.
154. Fassnacht M., Schlenz N., Schneider S.B. et al. Beyond adrenal and ovarian androgen generation: increased peripheral 5a-reductase activity in women with polycystic ovary syndrome.// J. Clin.Endocrinol.Metab. — 2003. -Vol. 88.-P. 2760-2766.
155. Fernandez Real J.M., Ricart Engel W., Simo R. Pre-Clinical Cushing's Syndrome: Report of Three Cases and Literature Review // Hormone Research. 1994. - Vol. 41, №5. - P. 230-235.
156. Feuillan P., Pang S., Schurmeyer T. et al. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis in partial (late-onset) 21-hydroxylase deficiency.// J. Clin.Endocrinol.Metab. 1988. - Vol. 67. - P. 154-160.
157. Findling J.W., Doppman J.L . Biochemical and radiologic diagnosis of Cushing's syndrome. // Endocrinol. Metab. Clin. North Am. 1994. - Vol. 23.-P. 511-537,
158. Findling J.W., Raff H. Newer diagnostic techniques and problems in Cushing's disease. // Endocrinol. Metab. Clin. North Am. 1999. - Vol. 28. -P. 191-210.
159. Flood K.G., Reynolds E.R., Snow N.H. Characterization of inclusion complexes of dexamethasone related steroids with cyclodextrins using high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. A. - 2000. — Vol. 903.-P. 49-65.
160. Forgacs Т., Csehati T. Interaction of some steroid drugs with cyclodextrin polymer. // J. Chromatogr. A. 1999. - Vol. 845. - P. 447-453.
161. Freda P. U., Wardlaw S.L. Diagnosis and Treatment of Pituitary Tumors //J. Clin. Endocrinol. Metab. 1999. - Vol. 84, №11. - P. 3859 -3866.
162. Fukata J., Nakai Y., Imura H., Abe К., Aono T. et al. Human corticotropin-releasing hormone test in normal subjects and patients with hypothalamic, pituitary or adrenocortical disorders // Endocrinol. Jpn. -1988.-Vol. 35.-P. 491-502.
163. Fukata J., Shimizu N., Imura H., Hibi I., Tanaka K. et al. Human corticotropin-releasing hormone test in patients with hypothalamo-pituitary-adrenocortical disorders // Endocr. J. 1993. - Vol. 4. - P. 597-606:
164. Gicquel C., Bertagna X., Le Bouc Y. Recent advances in the pathogenesis of adrenocortical tumors // Evr. J. Endocrinol. 1995. — Vol. 133.-P. 133-144.
165. Glass A.R., Zavadil III A.P, Halberg F., Cornelissen G., Schaaf M. Circadian rhythm of serum Cortisol in Cushing's disease // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1984. - Vol. 59. - P. 161-165.
166. Groote Veldman R., Meinders A.E. On the mechanism of alcohol-induced pseudo-Cushing's syndrome // Endocr. Rev. 1996. - Vol. 17. — P. 262-268.
167. Guido M., Romualdi D., Suriano R. et al. Effect of pioglitasone treatment on the adrenal androgen response to corticotrophin in obese patients with polycystic ovary syndrome.// Hum.Reprod. 2004. - Vol. 19., №3. - P. 534-539.
168. Guerrero L.A. Diagnostic and therapeutic approach to incidental adrenal mass // Urology. 1985. - Vol. 26. - P. 435-440.
169. Hague W.M., Honour J.W., Adams J. et al. Steroid responses to ACTH in women with polycystic ovaries.// Clin.Endocrinol. 1989. - Vol. 30.-P. 355-365.
170. Hariharan M., Naga S., VanNoord Т., Kindt E.K. Simultaneous assay of corticosterone and Cortisol in plasma by reversed-phase liquid chromatography.// Clin. Chem. 1992. - Vol. 38, № 3. - P. 346-352.
171. Hartmann S., Steinhart H. Simultaneous determination of anabolic and catabolic steroid hormones in meat by GC-MS.// J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl. 1997. - Vol. 704. - P. 105-117.
172. Hariharan M., Naga S., VanNoord Т., Kindt E.K. Assay of human plasma cortison by LC, normal plasma concentrations (between sand 10a.m.) of cortisone and corticosterone.// J. Chromatogr. 1993. - Vol. 613. — P. 195-201.
173. Harr R. Mersurement of adrenal corticosteroids by high-performance liquid chromatography.// Clin. Lab. Sci. 1994. - Vol. 7. - P. 50-56.
174. Helleday J., Siwers В., Ritzen E.M., Carlstorm K. Subnormal androgen and elevated progesterone levels in women treated for congenital virilizing 21-hydroxylase deficiency.// J. Clin.Endocrinol.Metab. 1993. -Vol .76.-P. 933-936.
175. Hellman L., Weitzman E.D., Roffwarg H., Fukushima D.K., Yoshida K. Cortisol is secreted episodically in Cushing's syndrome // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1970. - Vol. 30. - P. 686-689.
176. Herera M.F., Grant C.S., van Heerden J.A., et al. Incidentally discovered adrenal tumors: an institutional perspective. // Surgery 1991. -Vol. 110.- P. 1014-1021.
177. Hill.M., Lapcik O., Hampl R. et al. Radioimmunoassay of three deoxycorticoids in human plasma following HPLS separation.// Steroids. -1995. Vol. 60, №9. - P. 615-620.
178. Hirasawa G., Takeyama J., Sasano H.et al. 11 p-hydroxysteroid dehydrogenase type2 and mineralocorticoid receptor in human placenta // J.Clin. Endocr. Metab. 2000. - Vol. 85, №3. - P. 1306-1309.
179. Hirwitz A., Brautbar C., Milwidsky A. et al. Combined 21- and 11 beta-hydroxylase deficiency in familial congenital adrenal hyperplasia.// J Clin Endocrinol Metab. 1985. - Vol. 60. - P. 631-638.
180. Hoeppfner W., Schulze E., Bennek J. et al.Pregnancies in patients with congenital adrenal hyperplasia with complite or almost complite impairment of 21-hydroxylase activity.// Fertil. Steril. 2004. - Vol. 81, №5. -P.1314-1321.
181. Honour J.W. Steroid profiling.// Ann. Clin. Biochem. 1977. - Vol. 34.-P. 32-44.
182. Hughes G., Green B. Urinary excretion rates of 15 free steroids, potential utility in defferential diagnosis of Cushing's syndrome.// Clin Chem. 1986. - Vol. 32, №.1. - P. 93-96.
183. Jap В. K., Johnston G.A.R., Kazlauskas R. Routine screening and quantitation of urinary corticosteroids using bench-top gas chromatography mass-selective detection.// J. Chromatogr. B. 1992. - V. 573. - P. 183-190.
184. Jaaskelainen J., Hippelainen M., Kiekara O., Voutilainen R. Child rate, pregnancy outcome and ovarian function in female with classical 21-hydroxylase deficiency.// Acta Obstet.Gynecol.Scand. 2000. - Vol. 79, № 8.-P. 687-692
185. Jaresch S., Kornely E., Kley H., Schlaghecke R. Adrenal incidentaloma and patients with homozygous or heterzygous congenitaladrenal hyperplasia // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1992. - Vol. 74. - P. 658-689.
186. Jeffcoate W. Alcohol-induced pseudo-Cushing's syndrome // Lancet. 1993. - Vol. 341. - P. 676-677.
187. Ji-qing W., Xian-teng Z., Ji-lu W. Simultaneous measurement of eight corticosteroids by liquid chromatography and application of the procedure to diagnosis of congenital adrenal hyperplasia. // Clin. Chem. 1987. - Vol. 33, №8.-P. 1354-1359.
188. Jockenhovel F., Kuck W., et al. Prognosis of untreated incidentally discovered adrenal tumors (incidentalomas) // Clin Res. 1991. -Vol. 39.-P. 26.
189. Kamel N., Tonyukuk V., Emral R. et al. The prevalence of late onset congenital adrenal hyperplasia in hirsute women from central anatolia.// Endocr. J. 2003. - Vol. 50, №6. - P. 815-823.
190. Kao P.C., Machacek M.D., Magera M.J. Diagnosis of adrenal cortical disfunction by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.// Ann.Clin.Lab.Sci. 2001. - Vol. 31, №2. - P. 199-204.
191. Kaye T.B., Crapo L. The Cushing's syndrome: an update on diagnostic tests // Ann Intern Med. 1990. - Vol. 112. - P. 434-444.
192. Kelestimur F., Sahin Y. Alternate pathway 17,20-lyase enzyme activity in the adrenals is enhanced in patients with polycystic ovary syndrome.// fertile. Steril. 1999. - Vol. 71, № 6. - P. 1075-1078.
193. Kelestimur F., Sahint Y., Ayata D., Tutus A. The prevalence of non-classic adrenal hyperplasia due to 11 (^-hydroxylase deficiency among hirsute women in a Turkish population.// Clin. Endocrinology. 1996. - Vol. 45. -P. 381-384.
194. Kievit J., Haak H., Klaassen M. Approach to adrenal incidentaloma: A cost-effective-ness analysis abstract. // Med Decision Making. 1994. — Vol. 14. - P. 59.
195. King D.R., Lack E.E. Adrenal cortical carcinoma: a clinical and pathologic study of 49 cases // Cancer. 1979. - Vol. 44. - P. 239-244.
196. Kloos R.T., Gross M.D., et al. Incidentally discovered adrenal masses // Endocrine Reviews. 1995. - Vol. 16, №4. - P. 460-477.
197. Kopelman P.G. Hormones and obesity // Baillieres J. Clin. Endocrinol. Metab. 1994. - Vol. 8. - P. 549-575.
198. Kuronen P., Volin P., Laitalainen T. Reversed-phase HPLC screening method for serum steroid using retention index and diod-array detection. // J. Chromatogr. B: Biomed. Appl. 1998. - Vol. 718, №. 2. - P. 211-224.
199. Kurtoglu S., Atabek M.E., Keskin M., Patiroglu Т.Е. Adrenocortical adenoma associated with inadequately treated congenital adrenalhyperplasia.// J Pediatr Endocrinol Metab. 2003. - Vol. 16, №9. — P. 13111314.
200. Lacroix A., N. N'Diaye, J. Tremblay, P. Hamet Ectopic and Abnormal Hormone Receptors // Adrenal Cushing's Syndrome Endocr. Rev. 2001. — Vol. 22, №1.-P. 75- 110.
201. Lejeune-Lenain C., S. Kina, D. Bosson. Preparative HPLC for analysis of mineralocorticoids in human plasma/// Chromatographia. -1987.-Vol. 24.-P. 333-336.
202. Lin C.L., Wu T.J., Machacek D.A., Jiang N.S., Kao P.C. Urinary free Cortisol and cortisone determined by high performance liquid chromatography in the diagnosis of Cushing's syndrome // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1997. - Vol. 82. - P. 151-155.
203. Loughlin Т., Cunningham S., Moore A. et al. Adrenal abnormalities in polycystic ovary syndrome.// J.Clin.Endocrinol.Metab. 1986. - Vol. 62, №1. - P. 142-147.
204. Mantero F., Terzolo M., Arnaldi G. et. al. // J. Clin. Endocrinol. Metabol. 1999. -Vol. 85. -P. 637-644.
205. Marwah A., Marwah P., Lardy H. Liguid chromatography -electrospray ionization mass spectrometric analysis of corticosterone in rat plasma using selected ion monitoring. // J. Chromatogr. B. 2001. - Vol. 757.-P. 333-342.
206. Masatoki Katayata. Determination of corticosteroids in plasma by HPLC after pre-column derivatization with 2-(4-carboxyphenyl)-5,6-dimethylbenzimidazole.// J. Chromatogr. B. 1993. - Vol. 612. - P. 33-39.
207. Maschler I., Salzberger m., Finkelstein M. 11 ^-Hydroxylase with affinity to С-21-deoxysteroids from ovaries of patients with polycystic ovary syndrome.// J. Clin.Endocrinol. 1975. - Vol. 41, № 6. - P. 999.
208. McLEOD M.K., Thompson N.W. et. al. Sub-clinical Cushing's syndrome in patents with adrenal gland incidentalomas. Pitfalls in diagnosis and management // Am Surg. 1990. - Vol. 56. - P. 398-403.
209. Medeiros L.J., Lewandorowski K.B., Viskary A.L. Adrenal pseudocyst: a clinical and pathologic study of eight cases // Hum.Pathol. -1989. Vol. 20, № 7. - P. 660-665.
210. Meikle A.W., Daynes R.A., Araneo B.A. Adrenal androgen secretion and biologic effects.// New aspects of adrenal cortical deseases.// Endocr. Metab. Clinics N. Am. 1991. - Vol.20, №2. - P. 381-400.
211. Melby J.C., Azar S.T. Adrenal syeroids and hypertension: new aspects // The Endocrinologist. 1993. - Vol. 3. - P. 344-351.
212. Mellon S.H., Miller W.L. Extraadrenal steroid 21-hydroxylation is not mediated by P450c21.// J.Clin.Invest. 1989. - Vol. 84. - P. 1497-1502.
213. Mericq M. V. and G. B. Cutler Jr. High Fluid Intake Increases Urine Free Cortisol Excretion in Normal Subjects // J. Clin. Endocrinol. Metab. -1998. Vol. 83, №2. - P. 682 - 684.
214. Meyers R.L./Grua J.R. Bilateral laparoscopic adrenalectomy: A new treatment for difficult cases of congenital adrenal hyperplasia. // J. Pediatr. Surg. 2000. - Vol. 35. - P. 1586-1590.
215. Midorikaawa S., Sanada H., et al. Analysis of Cortisol secretion in hormonally inactive incidentalomas: stydy of in vitro steroid and immunohistochemical localization of steroidogenic enzymes // Endocr J. -2001.-Vol. 48, №2,- P. 167-174.
216. Miksik I., Vylitova M., Pach J., Deyl Z. Separation and identification of corticosterone metabolites by liquid chromatography electrospray mass spectrometry. // J. Chromatogr. B. - 1999. - Vol. 726. - P. 59-69.
217. Morioka M., Tanaka H, Ohashi Y. et al. The analysis of steroidogenic activity in non-hyperfunctioning adrenocortical adenoma.// Endocr. J. — 1997. Vol. 44. - P. 647-653.
218. Morioka M., Ohashi Y., Komatsu F., et al. Prenclinical Cushing's syndrome: report of four cases and analysis of steroid contents in adenomas //Horm Res.-1996.-Vol. 46.-P. 117-123.
219. Murphy B.E. //How much « UFC » is really Cortisol?// Clin. Chem. -2000. Vol. 46. - P. 793-794.
220. Nagasaka S., Kubota K., Motegi T. et al. A case of silent 21-hydroxylase deficiency with persistent adrenal insufficiency after removal of an adrenal incidentaloma.// Clin. Endocrinol. 1996. - Vol. 44. - P. 111116.
221. Nayak K.G., Signh S.R., Shetty R. et al. Non Functional adrenal cortical carcinoma: A case report // The antiseptic. 1989. - Vol. 86, № 12. - P. 675-677.
222. Ness-Abramof R., D. Nabriski, С. M. Apovian, M. Niven, E. Weiss, M. S. Shapiro, and L. Shenkman Overnight Dexamethasone Suppression Test: A Reliable Screen for Cushing's Syndrome // J. Clin. Endoc. Metabol. -2002.-Vol. 10, №12.-P. 1217-1221.
223. New M.I., Wilson L.C. Steroid disorders in children: congenital adrenal hyperplasia and apparent mineralocorticoid access.// PNAS. — 1999. Vol. 96, №22. - P. 12790-12797.
224. Nevell-Price J., Grossman A. Adrenal incidentaloma: Subclinical Cushing's syndrome // Postgrad Med J. 1996. - Vol. 72. - P. 207-210.
225. Newell-Price J., Trainer P., Perry L., Wass J., Grossman A., Besser M. A single sleeping midnight Cortisol has 100% sensitivity for the diagnosis of Cushing's syndrome // Clin. Endocrinol. 1995. - Vol. 43. - P. 545-550.
226. Nieman L. K. Diagnostic Tests for Cushing's Syndrome // Ann. N.Y. Acad. Sci.-2002.-Vol. 970, №1.-P. 112-118.
227. Nieman L.K., Cutler Jr. G.B. The sensitivity of the urine free Cortisol measurement as a screening test for Cushing's syndrome.// Program of the 72nd Annual Meeeting of The Endocrine Society. 1990. - Abstract P-822.
228. Nimkarn S., Cerame B.I., Wei J.-Q. et al. Congenital adrenal hyperplasia (21-hydroxylase deficiency) without demonstrable genetic mutations.// J. Clin. Endocrinol. Metabol. 1999. - Vol. 84. - P. 378-381.
229. Nomura S., Fujitaka M., Sakuka N., Ueda K. Circadian rhythms in plasma cortisone and Cortisol and the cortisone/cortisol ratio.// Clinica Chemica Acta. 1997. - Vol. 266. - P. 83-91.
230. Nozaki O. Steroid analysis for medical diagnosis. Review. // J. Chromatogr. A. 2001. - Vol. 935. - P. 267-278.
231. Oekers W. Diagnostic puzzle of the adrenal "incidentaloma" // Europen Journal of Endocrinology. 1995. - Vol. 132. - P. 419-420.
232. Ohno M., Yamaguchi I., Saiki M., Yamamoto I., Azuma J. Specific determination of urinary 6p-hydroxycortisol and Cortisol LC-MS. // J. Chromatogr. B. 2000. - Vol. 746. - P. 95-101.
233. Ока К., Noghi М., Kitamura Т., Shima S. Liquid chromatography and radioimmunoassay compared for determination of Cortisol and corticosterone in plasma after a dexamethasone suppression test. // Clin. Chem. 1987. - Vol. 33, № 9. - P. 1639-1642.
234. Oriola J., Plensa I., Machuca I., Pavia C., Rivera-Fillat F. Rapid screening method for detecting mutations in the 21-hydroxylase gene // Clin.Chem. 1997. - Vol. 43, №4. -P. 557-561.
235. Osella G., Terzolo M., Krestin G.P. et al. // Endocrine evaluation of incidentally discovered adrenal masses (incidentalomas).// J. Clin.Endocr.Metab. 1994. - Vol. 79. - P. 1532-1539.
236. Ozer G., Mungan N.O., Yiiksel B. et al. Evaluation of patients with congenital adrenal hyperplasia.// Ann. Med. Sci. 2000. - Vol. 9. - P. 108112.
237. Pang S., Lerner A.J., Stoner E. et al. Late-oncet adrenal steroid 30-hydroxysteroid dehydrogenase deficiency. A cause of hirsutism in pubertal and postpubertal women.// J.Clin.Endocrinol.Metab. 1985. - Vol.60, №3. -P. 428-439.
238. Pang S., Levine S.L., Lorenzen F. et al. Hormonal studies in obligate heterozygotes and siblings of patients with 1 lB-hydroxylase deficiency congenital adrenal hyperplasia.// J Clin Endocrinol Metab. 1980. - Vol. 50.-P. 586-589.
239. Papanicolaou D. A., N. Mullen, I. Kyrou, and L. K. Nieman Nighttime Salivary Cortisol: A Useful Test for the Diagnosis of Cushing's Syndrome // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2002. - Vol. 87, №10. - P. 4515 - 4521.
240. Pasquali R., B. Ambrosi, D. Armanini, F. Cavagnini, E. D. Uberti, G. Del Rio, G. de Pergola, Maccario M., Mantero F., Marugo M., Rotella C.
241. M., and Vettor R. Cortisol and ACTH Response to Oral Dexamethasone in Obesity and Effects of Sex, Body Fat Distribution, and Dexamethasone Concentrations: A Dose-Response Study // J. Clin. Endocrinol. Metab. -2002.-Vol. 87, №1.-P. 166- 175.
242. Peeke P.M., Chrousos G.P. Hypercortisolism and obesity // Ann. N.Y. Acad Sci. 1995. - Vol. 771. - P. 665-676.
243. Popovic V., Micic D., Nesovic M., Howlett Т., Doniach I., Kendereski A., Djordjevic P., Manojlovic D., Micic J., Besser M. Cushing's disease cycling over ten years // Exp. Clin. Endocrinol. 1990. - Vol. 96. - P. 143— 148.
244. Phillipov G., Palermo M., Shackleton CH. Apparent cortisone reductase deficiency: a unique form of hypercortisolism.// J. Clin. Endocrinol. Metabol. 1996. - Vol. 11. - P. 3855-3860.
245. Pirkko Volin. High- performance liquid chromatographic analysis of corticosteroids.// J. Chrom. B. - 1995. - Vol. 671. - P. 319-340.
246. Pirkko Volin. Simultaneous determination of serum Cortisol and cortisone by reversed-phase liquid chromatography with ultraviolet detection.// J. Chromatogr. В. - 1992. - Vol. 584. - P. 147-155.
247. Prise JN., Trainer P., Besser M., Grossman A. The diagnosis and differential diagnosis of Cushing's syndrome and pseudo-Cushing's states.// Endocr. Rev. 1998. - Vol. 195. - P. 647-672.
248. Ramsay В., Alaghband-Zadeh J., Carter J. et al. Raised serum 11-deoxycortisol in men with persistent acne vulgaris.// Clin.Endocrinol. -1995.-Vol.43.-P. 305-310.
249. Reincke M. Steroid secretion in patients with adrenal incidentalomas // J. Clin Endocrinol Metab. 1996. - Vol. 81. - P. 3811-3812.
250. Reincke M. Mutations in adrenocortical tumors // Horm Metab Res. — 1998. Vol. 30. - P.447-455.
251. Reincke M., Nieke J., Krestin G.P. et al. Preclinical Cushing's syndrome in adrenal "incidentaloms" comparison with adrenal Cushing's syndrome // J.Clin.Endocrinol.Metab. 1992. - Vol. 75, № 3. - P. 826-832.
252. Reincke M., Peter M., Sippel W.G., Allolio B. Impairment of lip hydroxylase but not 21-hydroxylase in adrenal "incidentalomas".// Europ.J.Endocrinol. 1997. - Vol. 136. - P. 196-200.
253. Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome (PCOS). // The Rotterdam ESHRE/ASRM-sponsored PCOS consensus workshop group.// Hum.Reprod. 2004. - Vol.19. - P. 41-47.
254. Rodin A., Thakkar H., Taylor N., Clayton R. Hyperandrogenism in polycystic ovary syndrome. Evidence of dysregulation of 11P-hydroxysteroid dehydrogenase.// N.Engl.J.Med. 1994. - Vol. 330. - P. 460-465.
255. Ross N.S., Aron D.C. Hormonal evaluation of the patient with an incidentally discovered adrenal mass see comments. // N Engl J Med. -1990.-Vol. 323.-P. 1401-1405.
256. Rosier A., Cohen H. Absence of steroid biosynthetic defects in heterozygote individuals for classic 1113-hydroxylase deficiency due to a R448H mutation in the CYP11B1 gene.// J Clin Endocrinol Metab. 1995. -Vol. 80.-P. 3771-3773.
257. Rossi R., Tauchmanova L., et al. Subclinical Cushing's syndrome in Patients with Adrenal Incidentaloma: Clinical and Biochemical Features // J. Clin Endocrinol Metab. 2000. - Vol. 85, №4. - P. 1440-1448.
258. Rossi R., Tauchmanova L. Author's response: metabolic abnormalities in patients with adrenal incidentaloma // J. Clin Endocrinol Metab. 2001. -Vol. 86.-P. 951-952.
259. Russell R.P., Masi A.T., Richter E.D. Adrenal cortical adenomas and hypertension. A clinical pathologic analysis of 690 cases with matched controls and a review of the literature // Medicine (Baltimore). 1972. -Vol. 51.-P. 211-225.
260. Russel D.W., Wilson J.D. Steroid 5a-reductase: two genes, two enzymes.//Ann. Rev. Biochem. 1994. - Vol. 63. - P. 25-61.
261. Sahin Y., Kelestimur F. The frequency of late-onset 21-hydroxylase and lip- hydroxylase deficiency in women with polycystic ovary syndrome.// Eur. J. Endocrinol. 1997. - Vol. 137. - P. 670-674.
262. Schoneshofer M.,Weber В., Oelkers W. et al.// Urinary excretion rates of 15 free steroids: potential utility in differential diagnosis of Cushing's syndrome.// Clin. Chem. 1986. - Vol. 32. - P. 93-96.
263. Shacleton C., Malunowicz E. Apparent pregnene hydroxylation deficiency (APHD): seeking the parentage of an orphan metabolome.//Steroids. 2003. - Vol. 68. - P. 707-718.
264. Sharma D., Forchielli E., Dorfman R. Inhibition of enzymatic 110-hydroxilation by androgens.//J.Biol.Chem. 1963. - Vol. 238. - P. 572-575.
265. Shibasaki H., Arai I., Furuta T. and Kasuya Y. Simultaneous determination of serum Cortisol and cortisone in humane plasma by stable-isotope dilution mass-spectrometry.// J. Chromatogr. B. 1992. - Vol. 576, № 1. - P. 47-52.
266. Shibasaki H., Furuta Т., Kasuya J. Quantification of corticosteroids in human plasma by liquid chromatography termospray mass spectrometry using stable isotope dilution.// J. Chromatogr. B. - 1997. - Vol. 692,№ 1. -P. 7-14.
267. Shibata H., Suzuki H., Ogushima T/ Significance of steroidogenic enzymes in the pathogenesis of adrenal tumor // Actor Endocrinologica. -1993.- Vol. 128.-P. 35-42.
268. Shneiderman E., Stalcup A.M. Review. Cyclodextrins: a versatile tool in separation science. // J. Chromatogr. B. 2000. - Vol. 745. - P.83-102.
269. Shoneshofer M., Weber В., Dulche H.J. Estimation of free urinary aldosterone and 18-hydrocorticisterone by a combination of automatic high-performance liquid chromatography and radioimmunoassay.// J. Chromatogr. 1982. - Vol. 227. - P. 492-496.
270. Siren J., Tervahartiala H., Sivula F. Natural course of adrenal incidentalomas: seven years follow-up study // World J. Surg. 2000. -Vol. 24.-P. 579.
271. Snyder L.R., Glajch J.L., Kirkland J.J. Practical HPLC method development. US. 1988. - P. 320.
272. Speiser P.W., Serrat J., New M.I., Gertner J.M. Insulin insensivity in adrenal hyperplasia due to nonclassic steroid 21-hydroxylase deficiency.// J. Clin.Endocrinol.Metab. 1992. - Vol. 75. - P. 1421-1424.
273. Steffenrud S. and Maylin G. Termospray liquid chromatography -mass spectrometry of corticosteroids.// J. Chromatogr. B. 1992. - Vol. 577.-P. 221-227.
274. Steinberger E., Smith K.J., Rodriguez-Rigau L.J. Testosterone, dehydroepyandrosterone, and dehydroepyandrosterone-sulfate in hyperandrogenic women.// J. Clin.Endocrinol.Metab. 1984. - Vol. 59, №3. - P. 471-476.
275. Stewart PM, Boulton A, Kumar S. et al.// Cortisol metabolism in human obesity: impairerd cortison—> Cortisol conversion in subjects with central adiposity // J.Clin.Endocr.Metab. 1999. - Vol. 84. - P. 1022-1027.
276. Stewart PM, Corrie JET, Shackleton CHL, Edvards CRW // Syndrome of apparent mineralocorticoid excess: a difect in the cortisol-cortison shuttle.// J.Clin. Invest. 1988. - Vol. 82. - P. 340-349.
277. Stocco D.M., Clark В.J. Regulation of the acute production of steroids in steroidogenic cells. // Endocr. Rev. 1996. - Vol. 17. - P. 221-244.
278. Stolker A.A.M., Schwillens P.L.W.J., van Ginkel L.A., Brinkman U.A.Th. Comparison of different liquid chromatography methods for the determination of corticosteroids in biological matrices. // J. Chromatogr. A. 2000. - Vol. 893. - P. 55-67.
279. Stoner E., Loche S., Mirth A.M., New M.I. Clinical utility of adrenal steroid measurement by high-performance liquid chromatography in pediatric endocrinology. // J. Chromatogr. 1986. - Vol. 374. - P. 358-362.
280. Suda T. Adrenal preclinical Cushing s syndrome //JMAJ. 2002. -Vol. 45.-P. 172-174.
281. Suzuki Т., Sakuta H., Nakagawa K., et al. Unidentified steroid hormone of Cushing's syndrome and disease. // Nippon Naibunpi Gakkai Zasshi. — 1993. Vol. 69. - P. 1139-1152.
282. Suzuki H., Shibata H., Maruyama T. et al. //Significance of steroidogenic enzymes in the pathogenesis of hyperfunctioning and non-hyperfunctioning adrenal tumor.// Steroids. 1995. - Vol. 60. - P. 42-47.
283. Taylor A.E. Polycystic ovary syndrome.// Gonadal disorders.// Endocrinol.Metab.Clinics N.Amer. 1998. - Vol. 27, №4. - P. 877-902.
284. Taylor RL., Machacek D., Singh RJ. // Validation of high-throughput liguid chromatography-tandem mass spectrometry method for urinary Cortisol and cortisone.//Clin. Chem. 2002. - Vol. 48. -P. 1511-1519.
285. Terzolo M., Osella G., Ali A. et al. Different patterns of steroid secretion in patients with adrenal incidentalomas // J. Clin. Endocrinol Metab. 1996. - Vol. 81. - P. 740-744.
286. Terzolo M., Osella G., Ali A. Subclinical Cushing's syndrome in adrenal incidentaloma // Clinical Endocrinology. 1998.- Vol.48.- P.89-97.
287. Torok D. Limited value of serum steroid measurement in identification of mild form of 21-hydroxylase deficiency. // Experimental Clin. Endocrinol. Diab. 2003. - Vol. Ill, №1. - P. 27-33.
288. Trakakis E., Chryssikopoulos A., Sarandakou A., et al. Hypothalamic-pituitary-thiroidal axis dysfunction and Cortisol secretion in patients with nonclassic congenital adrenal hyperplasia.// Int. J. Fertil. Women Med. 2001. - Vol. 46, № 1. - P. 3 7-41.
289. Tsilchorozidou Т., Honour J.W., Conway G.S. Altered Cortisol metabolism in polycystic ovary syndrome: Insulin enhances 5a-reductation, but not the elevated adrenal steroid production rates.// J. Clin.Endocrinol.Metab. 2003. - Vol. 88. - P. 5907-5913.
290. Turpeinen U., Stenman UH. Determination of urinary free Cortisol by liquid chromatography-tandem mass spectrometry // Scand. J.Clin.Lab. Invest. 2003. - Vol. 63. - P. 143-150.
291. Ueshiba H., Segawa M., Hayashi Т., Miyachi Y., Irie M.I I Serum profiles of steroid hormones in patients with Cushing s syndrome determined by a new HPLC/RIA method // Clin. Chem. 1991. - Vol. 37. -P. 1329-1333.
292. Van Wyk J.J., Gunther D.F., Ritzen E.M. et al. The use of adrenalectomy as a treatment of congenital adrenal hyperplasia.// J. Clin.Endocrinol.Metab. 1996.-Vol. 81.-P. 3180-3190.
293. Vermesh M., Silva P.D., Rosen G.F. et al. Effect of androgen on adrenal steroidogenesis in normal women.// J. Clin.Endocrinol.Metab. -1988.-Vol. 66, №1.-P. 128-130.
294. Virkkala A., Valimaki M., Pelkonen R., et al. Endocrine abnormalities in patients with adrenal tumours incidentally discovered on computed tomography // Acta Endocrinol. 1989. - Vol. 121. - P. 67-72.
295. Volin P. High performance liquid chromatographic analysis of corticosteroids // J. Chrom. B. - 1995.- Vol. 671.-P. 319-340.
296. W.Ji-Qing, Z. Xian-teng, W. Ji-lu. Simultaneous measurement of eight corticosteroids by liquid chromatography, and application of the procedure to diagnosis of congenital adrenal hyperplasia.// Clin. Chem. -1987. Vol. 33.-P. 1354-1359.
297. Whinney B.C., Ward G., Hickman P.E. Improved HPLC method for simultaneous analysis of Cortisol, 11-deoxycortisol, prednisolone, methylprednisolone, dexamethasone in serum and urine.// Clin. Chem.1996. Vol. 42, № 6. - P. 979-981.
298. White P.C,. Speiser P.W. Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency // Endocr.Rev. 2000. - Vol.21, №3. - P. 245-291
299. White PS, Curnow KM, Parcoe L. Disorders of steroid llp-hydroxylase isozymes.// Endocr. Rev. 1994. - Vol. 15. - P. 421-438.
300. White PS, Mune Т., Agarwal AK. 11 (3-hydroxysteroid dehydrogenase and the syndrome of apparent mineralocorticoid excess.// Endocr. Rev.1997.-Vol.18.-P. 135-156.
301. Willenberg H.S., Mansmann G., Fritzen R. et al. The short synacthen test in the evaluation of adrenal masses in patients with malignancies.// J.Clin.Endocr.Metab. 2002. - Vol. 28. - P. 793-797.
302. Wudy S. A., Harmann M., Homoki J. Hormonal diagnosis of 21-hydrolxylase deficiency in plasma and urine of neonates using benchtop gas chromatography mass spestrometry. // Journ. of Endocrin. - 2000. - Vol. 165.-P. 679-683.
303. Yamakita N., Saitoh M., Mercado-Asis L. Asymptomatic adrenal tumor: 386 cases in Japan including our 7 cases // Endocrinol Jpn. — 1990. -Vol. 37.-P. 671-684.
304. T. Yoshitake, S. Нага, M. Yamaguch, Y. Ohkura, S. Gorog. Measurement of 21 -hydroxy corticosteroids in human and rat sera by high-performance liquid chromatography with fluorimetric detection.// J. Chromatogr. 1989. - V. 489, № 2. - P. 364-369.
305. Zwermann O., Beuschlein F., et al. The MEN1 gene expression is normal in sporadic adrenocortical tumors // European J. of Endocrinology. -2001.-Vol. 55.-P. 106.