Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Индуцированная циклофосфаном иммуносупрессия и ее коррекция иммуномодулятором микробного происхождения

На правах рукописи

484884Ь

ЛОСЕВА Любовь Федоровна

ИНДУЦИРОВАННАЯ ЦИКЛОФОСФАНОМ ИММУНОСУПРЕССИЯ И ЕЕ КОРРЕКЦИЯ ИММУНОМОДУЛЯТОРОМ МИКРОБНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Л /

и !■)

2 ИЮН 2011

МОСКВА-2011

4848846

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научн исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук

доктор медицинских наук

Ирина Борисовна Семенова Ольга Витальевна Лебединская

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Борис Владимирович Пинегин

доктор медицинских наук

Наталия Евгеньевна Ястребова

Ведущее учреждение:

ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России

Защита диссертации состоится «23» июня 2011 г. в 12 часов на заседай диссертационного совета Д 001.035.01 при НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН адресу: 105064, Москва, Малый Казенный пер., д.5а. ? /

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИВС им. И.И. Мечнию РАМН

Автореферат разослан мая 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

с:-

Г'

И. В. Яковлева

Актуальность темы

В настоящее время цитостатические препараты широко используются в клинической практике: онкологии и трансплантологии, а также при лечении аутоиммунных заболеваний. Активное применение цитостатических препаратов приводит к развитию выраженных иммунодефицитов, поэтому изучение иммунологических нарушений и возможностей их коррекции является чрезвычайно актуальной проблемой. Одним из наиболее эффективных и широко применяемых цитостатиков является циклофосфан (ЦФ), который входит в различные схемы противоопухолевой химиотерапии, активно применяется в трансплантологии и клинике аутоиммунных заболеваний [Я.А. Вгос^ку е1 а1, 2008; А.Е. ЪеХегп а1, 2011].

Модель индуцированного ЦФ иммунодефицита является наиболее адекватной для изучения особенностей механизма иммунологических нарушений при действии цитостатиков. Детальное понимание воздействия препарата на различные субпопуляции клеток и сроки их восстановления при различных режимах введения цитостатиков представляет как практический, так и теоретический интерес. Особое значение данная модель иммунодефицита приобретает при изучении действия иммуномодуляторов в иммуносупрессированном организме, что наблюдается в клинической практике при терапии цитостатиками.

В единичных исследованиях показана способность иммуномодуляторов различной природы восстанавливать количественный и субпопуляционный состав клеток в лимфоидных органах после действия цитостатиков [Е.А.Лебединская с соавт., 2009]. В литературе обсуждаются возможности применения препарата полиоксидоний для коррекции индуцированных иммунодефицитов, а также приводятся данные о применении вакцины БЦЖ для коррекции иммунологических нарушений [М. ВаЬу'ик е! а!., 2011]. Однако многообразие иммуномодулирующих агентов лишь затрудняет задачу выбора оптимальных методов иммунокоррекции. Следует отметить, что нарушения иммунного статуса, вызванные применением цитостатиков, существенно повышают риск развития инфекционных осложнений, вызываемых условно-

патогенными антибиотикоустойчивыми микроорганизмами [J.Y.Song et ai., 2009]. Поэтому для оптимальной иммунокоррекции вторичных иммунодефицитов, вызванных цитостатиками, предпочтительны иммуномодуляторы, обладающие способностью стимулировать противоинфекционную резистентность организма [A. Custovic et al., 2009]. К таким препаратам относится бактериальная поликомпонентная вакцина Иммуновак-ВП-4® (ВП-4), содержащая в своем составе агонисты толл-подобных рецепторов, являющаяся активатором систем врожденного и адаптивного иммунитета против основных возбудителей внутрибольничных инфекций. Экспериментальные исследования показали, что ВП-4 обладает также противоопухолевой и антиметастатической активностью [Н.К. Ахматова и соавт., 2005]. В связи с выше сказанным целесообразна разработка модели стойкой иммуносупрессии для изучения особенностей механизма иммунологических нарушений при действии цитостатиков и дальнейшей оценки иммунокорригирующего действия иммуномодуляторов.

Цель. Выявление основных параметров иммуносупрессии, индуцированной циклофосфаном, и оценка эффективности иммунокорригирующего действия ВП-4 на фоне действия цитостатика.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности фармакокинетики циклофосфана при различных схемах введения для обоснования выбора оптимального режима стойкой индуцированной иммуносупрессии.

2. Исследовать морфологические изменения в органах гемоиммунопоэза при введении циклофосфана и возможность их коррекции с помощью ВП-4.

3. Оценить влияние ВП-4 на миелосупрессию, вызванную циклофосфаном.

4. Исследовать влияние индуцированной иммуносупрессии на продукцию цитокинов, иммунофенотип и функциональную активность мононуклеарных лейкоцитов мышей после введения циклофосфана и влияние на эти показатели ВП-4.

5. Изучить влияние ВП-4 на противоопухолевую активность циклофосфана.

Научная новизна

Получены новые данные, характеризующие параметры индуцированной ЦФ иммуносупрессии при трехкратном (с интервалом в 72 часа) введении цитостатика в дозе 100 мг/кг веса тела животных:

- морфологические изменения органов иммуногенеза: в красном костном мозге, а также в корковом и мозговом веществе тимуса и селезенки увеличивается

оличество эритроцитов, уменьшается количество дифференцирующихся клеток ритроидного ряда, резко снижается содержание молодых и зрелых форм ейкоцитов, нарушается строма органа и её сосудистая сеть;

- в периферической крови мышей отмечается выраженная лейкопения родолжительностью 10 суток, с наименьшим количеством лейкоцитов на 8-9 утки ((3,7-1,7)х103 в мм3), повышение сегментоядерных лейкоцитов, некоторое нижение лимфоцитов;

- определено существенное снижение продукции ИЛ-1/3, увеличение уровня упрессорного цитокина ТФР-/3, кратковременное уменьшение ИЛ-12 и ранзиторное повышение ИЛ-6 и ИНФ-у,

- снижено число клеток, экспрессирующих дифференцировочные - СБЗ+, 04+, СЭ19+, БХ5+ (Ж), С047СЭ25+ маркеры при уменьшении итотоксической активности МК-клеток.

Впервые исследовано влияние ВП-4 на фармакокинетику ЦФ. Показано, что ведение иммуномодулятора через 72 после воздействия цитостатика не влияет а процессы биораспределения и токсические свойства активных метаболитов Ф.

Впервые выявлено, что агонист толл-подобных рецепторов ВП-4 при едении мышам с индуцированной ЦФ иммуносупрессией обладает особностью корригировать нарушения в органах иммуногенеза и мунологические показатели:

- нормализует структуру красного костного мозга, тимуса и селезенки ышей, нормализует процессы иммуногенеза с появлением молодых клеток итроидного, миелоидного и лимфоидного рядов, нормализует соотношение рменных элементов периферической крови;

- активирует процесс миелопоэза, что проявляется в появлении моноцитов бластных форм клеток в периферической крови мышей;

- вызывает кратковременное снижение в сыворотке ИЛ-1(3, повышав содержание цитокинов ТЫ (ФНО-а, ИЛ-12, ИНФ-7), ТЬ2 (ИЛ-6, ИЛ-4, ИЛ-10) снижает продукцию супрессорного цитокина ТФР-/3 спленноцитами мышей восстанавливает экспрессию маркеров лимфоцитов СБЗ+, С&4+ СЮ19+,С04+/С025+, повышает активность ЫК-клеток на фоне снижения числ клеток, экспрессирующих молекулы ОХ5+ (№£) и СВЗ+/БХ5+ (№СТ);

- усиливает противоопухолевую активность ЦФ в отношении плазмоцитомь МОР8-21 в эксперименте на мышах.

Впервые дано экспериментальное обоснование возможност использования ВП-4 для иммунокоррекции нарушений, обусловленны индуцированной цитостатиками иммуносупрессией.

Практическая значимость

Установлено, что для достижения иммунокорригирующего эффекта ВП-следует вводить не ранее, чем через 72 часа после последнего введения ЦФ.

Полученные данные обосновывают целесообразность дальнейшего изучени иммунокорригирующего действия ВП-4 для коррекции индуцированно иммуносупрессии, вызванной цитостатиками.

Материалы диссертационной работы включены в научно-экспериментальну работу лаборатории терапевтических вакцин НИИВС им. И.И.Мечникова РАМ1 Результаты исследований используются в циклах лекций курса «Вакцинопрофила тика» и курса «Иммуноонкология» 1-ого МГМУ им. И.М. Сеченова.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработана модель индуцированной ЦФ стойкой иммуносупрессии пр трехкратном введении ЦФ в дозе 100 мг/кг с интервалом 72 ч, при которо выявлены морфологические нарушения структуры и функции органо иммуногенеза и выраженные иммунологические нарушения в организме мышеи.

2. Применение ВП-4 на фоне индуцированной ЦФ иммуносупресси приводит к нормализации структуры и функции органов иммуногенеза восстанавливает иммунологические показатели.

3. Введение ВП-4 после введения ЦФ усиливает противоопухолевое действие в отношении плазмоцитомы MOPS-21 у мышей.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены и обсуждены: на X Всероссийском научном Форуме, 29 мая-1 июня, 2006, г. Санкт-Петербург, на VIII Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», 27-29 июня 2007, г. Москва; на XI Всероссийском научном Форуме, 28-31 мая 2007, г. Санкт-Петербург; на Международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине», 26 ноября - 4 декабря 2008, г. Пекин; на VII Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», 2729 октября 2010, г. Москва; на Первом конгрессе Евро-Азиатского общества по инфекционным болезням 1-3 декабря 2010, г. Санкт-Петербург; на Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» 21-22 декабря 2010, г. Санкт-Петербург; на IX Международной германо-российской научно-практической конференции Форума им. Р.Коха и И.И.Мечникова «Инновации и сотрудничество в медицине и здравоохранении» 8-9 декабря 2010, г. Новосибирск; на конференции молодых ученых НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН 15-16 марта 2011 г (2-е призовое место), г. Москва; на XVII Россиийском национальном конгрессе «Человек и лекарство» 11-15 апреля 2011, г. Москва; Апробация диссертации состоялась на конференции отдела иммунологии НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН, 18 апреля 2011, г. Москва.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано J5 печатных работ, в том числе 7 в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Материалы работы изложены на 141 странице компьютерного текста и состоят из введения, обзора литературы, глав «материалы и методы», «результаты исследований», обсуждения, выводов, списка литературы - 238 источников (23 отечественных и 215 зарубежных авторов). Диссертация иллюстрирована 6 таблицами, 31 рисунком.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лабораторные животные. Исследование проведено на мышах линий СВА и Balb/c, самцах, массой 22-24 г (возраст 2-3 месяца), полученных из питомника «Столбовая» Московской области. Работа выполнена на 440 животных в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Препараты. Циклофосфан (Лэнс-Фарм, Россия). По химическому составу препарат представляет собой Ы-бис-(Ь-хлорэтил)-К-0-триметиленовый эфир диамида фосфорной кислоты. В крови препарат неактивен, но при проникновении в клетки-мишени разлагается под влиянием фосфатаз на бис-(Ь-хлорэтил)-амина и другие фосфорсодержащие активные метаболиты ЦФ, обладающие терапевтическим действием.

Иммуномодулятор Иммуновак-ВП-4® (ФГУП «НПО «Микроген») и антигенов условно патогенных микроорганизмов (Klebsiella pneumoniae, Proteu vulgaris, Escherichia eoli и Staphylococcus aureus), предназначен дл иммунотерапии хронических воспалительных и аллергических заболеваний. ВП 4 представляет собой сложный липополисахаридно-белковый комплекс содержащий ЛПС, ассоциированный с белком наружной мембрань грамотрицательных микроорганизмов, а также пептидогликан и тейхоевы кислоты S. aureus. Препарат содержит агонисты толл-подобных рецепторов (ТП -1/2, 4, 5/6, 9).

Биохимические методы исследования. Содержание фосфорсодержащи активных метаболитов ЦФ определяли в плазме крови у мышей-самцов линии СВ/ по методу О.М. Friedman et al., (1963), модифицированному D.S. Alberts (1976).

Оценку субпопуляционного состава лимфоцитов проводили методо1 проточной цитометрии с использованием моноклональных антител (Calta Laboratories, США) против клеточных антигенов.

Определение спонтанной и индуцированной продукции цитокино спленоцитами мышей осуществляли методом ИФА с использованием тест систем фирмы Biosource (Бельгия).

Цитотоксическую активность МЛ селезенки мышей определяли в цитотоксическом тесте (МТТ) на линии опухолевых клеток К-562 [G. Zund et al., 1999].

Противоопухолевую активность ЦФ и ВП-4 в комбинации с ЦФ оценивали по выживаемости мышей с перевитой плазмоцитомой MOPS-21.

Морфологические и гистохимические методы исследования красного костного мозга, тимуса и селезёнки мышей проводили после фиксации материала в спирт-формол-уксусной кислоте с дальнейшим окрашиванием полученных срезов.

Подсчитывали лейкоцитарную формулу в мазках периферической крови, окрашенных по Романовскому-Гимза.

Анализ изображения и фотографирование. Прижизненную флуоресцентную микроскопию клеток выполняли с использованием люминесцентного микроскопа Axioplan 2, а также цифровой системы регистрации и анализа изображения AxioVision 4.2 (Carl Zeiss, Германия).

Статистические методы. Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стыодента, критерия Вилкоксона при помощи стандартного пакета статистических программ Windows 2003 (StatSoft 6.0).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Фармакокинетика циклофосфана при различных схемах введения

Для исследования метаболизма ЦФ1 при введении мышам и влияния на этот процесс ВП-4 оценивали концентрацию активных метаболитов ЦФ, обладающих цитостатическим и иммуносупрессивным действием, в сыворотке крови и их кумуляцию в организме животных. ЦФ вводили мышам внутрибрюшинно в разовой дозе 100 мг/кг массы тела однократно, двукратно и трехкратно с интервалом 72 часа.

При однократном введении концентрация активных метаболитов ЦФ в плазме крови мышей повышается сразу после введения препарата, достигая максимума через 10 мин, и снижается до нулевых значений через 5 часов (рис.1).

1 Примечание - терапевтическая активность и токсические свойства ЦФ обусловлены активными метаболитами, образующимися в результате биотрансформации цитостатика в печени.

При двукратном введении наблюдаются различия в динамике образования активных метаболитов ЦФ. После повторного введения максимальная концентрации активных метаболитов ЦФ также регистрируется через 10 мин., но уровень ниже и достигает нулевых значений так же, как и после первого введения через 5 часов после введения цитостатика. По-видимому, снижение уровня активных метаболитов ЦФ после его повторного введения можно объяснить замедленным метаболизмом в клетках печени, действие ферментных систем которых нарушается после первого введения ЦФ. Иными словами, при первом введении ЦФ, когда активность ферментов печени максимальна, концентрация активных метаболитов ЦФ наиболее высокая за счет быстрого ферментативного разложения ЦФ на активные метаболиты.

Трехкратное введение ЦФ приводит к дальнейшему снижению максимальной концентрации активных метаболитов, которая регистрируется через 15 мин после последнего введения цитостатика.

Рисунок 1. Концентрации активных метаболитов ЦФ в плазме крови мышей при однократном (1), двукратном (2) и трехкратном (3) введении ЦФ.

Примечание. ЦФ вводили внутрибрюшинно в разовой дозе 100 мг/кг массы тела мышей линии СВА; в каждой группе по 10 животных.

Это соответствует той тенденции, которая наблюдается после второго введения

ЦФ. Полное исчезновение активных метаболитов ЦФ в плазме крови наблюдается

через 6 часов. Таким образом, замедление метаболизма ЦФ в организме мышей

10

коррелирует с увеличением кратности его введения. В связи с этим, целесообразно было выяснить возможность кумуляции активных метаболитов ЦФ в организме мышей и влияние на этот процесс введения иммуномодулятора. Для этого определяли период полуэлиминации активных метаболитов ЦФ. При однократном введении ЦФ период полуэлиминации составляет 11,3+0,8 минуты, при двукратном введении - 12,4+0,7 минут, при трехкратном введении - 15,1+0,8 минут. Различия между группами при однократном и трехкратном введении ЦФ статистически значимы (р<0,05) (табл.1).

Таблица 1

Период полуэлиминации активных метаболитов ЦФ _

Препарат и кратность введения Разовая доза Время введения ВП-4 после ЦФ, ч Период полуэлиминации, мин Р*

ЦФ 1-кратно (контроль) 100 мг/кг 11,3+0,8

ЦФ 2-кратно -«- - 12.4+0,7 >0,05

ЦФ 3-кратно -«- _ 15,1+0,8* <0,05

ЦФ+ Иммуновак-ВП-4 100 мг/кг+ 200 мкг/мышь 1 15,4+0,7* <0,05

-«- -«- 24 12,3+0,8 >0.05

-«- -«- 48 11,9+0,7 >0,05

-«- 72 11.4+0,8 >0,05

Примечание. * - Разность достоверна с контролем при Р<0,05

При введении ЦФ в разные сроки после инъекции ВП-4 установлено, что при интервале введения препаратов в 1 час период полуэлиминации ЦФ увеличивается до 15,4+0,7 мин. Увеличение интервала между введением ВП-4 и ЦФ сокращает период полуэлиминации ЦФ, и через 72 часа этот показатель приближается к контрольным значениям. Эти данные свидетельствуют о том, что ЦФ не следует применять совместно с ВП-4, так как происходит кумуляция активных метаболитов ЦФ и, возможно, усиление побочных эффектов цитостатика.

Морфологические изменения иммунокомпетентиых органов

Морфологические исследования центральных (красный костный мозг,

тимус) и периферического (селезенка) органов иммуногенеза были проведены для определения характеристики иммуносупрессии, индуцированной ЦФ, и воздействия на этот процесс ВП-4.

Красный костный мозг интактных мышей имеет типичное строение и включает в себя стромальный остов, заполненный стволовыми, созревающими и зрелыми клетками миелоидного ряда и предшественниками В-лимфоцитов (рис.2А). Через 4, 24 часа после трехкратного введения ЦФ в дозе 100 мг/кг выявляется большое количество зрелых эритроцитов при почти полном отсутствии молодых и зрелых форм лейкоцитов, а также дифференцирующихся клеток эритроидного ряда. Остается лишь некоторое количество мегакариоцитов. Нарушается также строма органа и её сосудистая сеть (рис. 2Б, 2В). Даже через 120 часов после последней инъекции ЦФ не происходит полного возврата к нормальной структуре костного мозга (рис. 2Г). Хотя в этот период происходят более активные процессы миелопоэза, чем в начальные сроки эксперимента, клетки промежуточных стадий гемопоэза немногочисленны и преобладают зрелые эритроциты. Более заметно восстанавливается строма органа со всеми её компонентами - ретикулярными и жировыми клетками, фибробластами и макрофагами, сосудистой сетью и выстилающими её эндотелиоцитами (рис. 2В, 2Г).

ВП-4, в отличие от ЦФ, вызывает активацию гемопоэза в красном костном мозге, не нарушая взаимоотношения ростков миелопоэза (рис. ЗА, ЗБ). Выявляется большое количество мегакариоцитов и других промежуточных клеточных форм миелоидного ряда. Аналогичные эффекты отмечены при действии ВП-4 и в других органах. В селезёнке и тимусе происходит значительное разрастание лимфоидной ткани. Через 4 часа после введения ВП-4 красная пульпа селезенки имеет вид узких прослоек между расширенными лимфатическими фолликулами. В селезёнке активизируется тромбоцитопоэз, так как в красной пульпе обнаруживаются обширные скопления мегакариоцитов. В дальнейшем (через 24, 96, 168 часов после введения ВП-4) в селезёнке мышей постепенно восстанавливается соотношение красной и белой пульпы и продолжается активный лимфопоэз:-выявляются хорошо развитые реактивные центры и периартериальные муфты, в маргинальных зонах определяются все виды активированных лимфоцитов и макрофагов. В последний срок исследования селезёнка мышей ничем не отличается от данного органа у интактных животных: имеется чёткое разделение

на белую и красную пульпу, фолликулы правильной овальной формы, в них можно выделить все зоны - периартериальную (Т-зависимую), реактивный центр, В-зависимую и маргинальную зоны, содержащие все виды клеток лимфоидного ряда и макрофаги. Введение ВП-4 через 24 часа после последней инъекции ЦФ заметно нормализовывает процесс миелоидного кроветворения: в костномозговой полости появляются молодые клетки эритроидного ряда и лейкоциты, находящиеся на различных стадиях дифференцировки, наблюдается восстановление стромальных ретикулярных и жировых клеток, фибробластов и костных балок, полностью восстанавливается сосудистая система костного мозга с её эндотелиальной выстилкой (рис. 4А, 4Б). Введение ВП-4 мышам с иммуносупрессией, вызванной ЦФ, приводит к восстановлению структуры тимуса и селезенки.

Таким образом, при введении ЦФ происходят значительные изменения в морфологии как центральных, так и периферических органов гемоиммунопоэза, восстанавливающиеся под действием ВП-4.

Влияние ВП-4 на миелосупрессшо, индуцированную ЦФ

Одним из показателей иммуносупрессорного действия ЦФ является его влияние на изменение числа лейкоцитов периферической крови мышей.

При однократном введении ЦФ наблюдается непродолжительное токсическое действие препарата на организм животных, которое проявляется лейкопенией с 3 по 5 дни после введения ЦФ по сравнению с контрольными животными (табл.2). Количество лейкоцитов снижается с 11,4х103 до (3,7-6,7)х103 в мм3. При двукратном введении ЦФ наблюдается более продолжительная лейкопения с 3 по 8 сутки, минимальные значения отмечаются на 6 сутки (2,3x103) в мм . Трехкратное действие препарата приводит к выраженной лейкопении с 3 по 12 день при минимальных значениях (3,7-1,7)х103 в мм3 на 6-8 сутки. Следовательно, трехкратное введение ЦФ мышам в дозе 100 мг/кг веса тела животных с интервалом 72 часа приводит к выраженной лейкопении, продолжительность которой достигает 10 суток. Это является основанием для использования трехкратной схемы введения ЦФ в качестве модели для воспроизведения индуцированной ЦФ иммуносупрессии.

Рисунок 2. Красный костный мышей после трехкратного введения ЦФ в дозе 100 мг/кг: А — интактные мыши; Б — 4 часа после введения ЦФ; В — через 24 часа после введения ЦФ; Г - через 120 часов после введения ЦФ; А,Г - окр. по Ван Гизону; Б,В - окр. гематоксилином-эозином; ув. 400.

Рисунок 3. Красный костный мозг мышеи через 24 часа после введения ВП-4 в дозе 200 мкг/мышь: А

контроль - интактные, Б - после введения Им^новак-ВП-4; окр, по Ван Гизону; ув. 400

5*

- .4 . ,

3*»

Риунок .4. Красный костный мозг мышей через 24 часа после комбинированного введения ЦФ -трехкратно в дозе 100 мг/кг и ВП-4 в дозе 200 мкг/мышь: А - контрольная группа, получившая ЦФ, Б - группа, ^ получившая ЦФ и ВП-4, окр. гематоксилином-эозином; А — ув. 200; Б - ув. 400.

Таблица

Влияние ВП-4 на количество лейкоцитов периферической крови мышей

Число лейкоцитов 103/мм3

Сутки" ЦФ ВП-4 ЦФ+ ВП-4 Контроль

1 -кратно 2-кратно 3-кратно (интактные

0 11,4+1,8 11,9+1,9 11,5+2.3 11,2+1,1 11,3+1,9 11,7+2,1

1 11,3+1,7 11,1+2,6 11,8+2.2 Н.о. 11,3+1,0 11,1+1,9

2 10,2+2,0 10,8+1,7 10,7+1,9 Н.о. 10,0+1,1 12,0+1,8

3 7,1+0,3 7,7+0,6 7,9+0,8 11,7+1,6 7,6+1,3 11,6+1,9

4 3,7+0,8 4,1+0,9 3,7+0,8 12,1+0,7 6,5+1,6* 11,5+1,8

5 6,7+1,8 4,6+0,3 4,5+0,8 12,6+0,7 6,8+1,2* 11,8+1,9

6 10,7+2,2 2,3+0,2 3,7+0,3 12,3+0,6 5,7+1,1* 12,7+1,6

7 10,3+1,8 4,9+0,7 2,9+0,3 11,9+1,7 4,6+1,1* 11,6+1,5

8 11,1+1,8 6,3 + 0,8 1,7+0,2 11,3+0,9 3,9+0,7* 11,4+1,7

9 13,7+1,8 8,7+1,1 1,3+0,2 11,7+1,0 3,7+0,9* 12,7+1,9

10 11,5+1,2 9,7+1,3 2,7+0,1 11,2+1,1 3,9+0,4* 11,9+1,8

И 11,4+1,6 10,7+2,8 4,9+0,4 10,7+2,8 6,6+1,7 11,6+1,9

12 11,7+1,8 11,3+2,9 6,7+0,6 11,1+2,1 8,5+1,3 11,5+1,7

13 11,3+1,9 11,4+2,1 9,1+1,1 11,4+2,0 10,9+1,4 11,9+1,6

14 11,7+1,8 11,7+1,8 10,7+2,1 11,4+1,7 11,3+1,7 11,8+1,9

15 11,7+1,8 11,7+1,8 12,7+1,9 11,1+1,0 11,6+1,8 11,6+1,8

Примечание. '' после введения ЦФ; Н.о. - не определяли; * различия достоверны с группой, получавшей ЦФ трехкратно.

Введение ВП-4 однократно в дозе 200 мкг/мышь не приводит к изменени количества лейкоцитов в периферической крови мышей в течение 15 сут наблюдения. Показатели не имеют различий по сравнению с контролем.

Для оценки действия ВП-4 использовали отработанную модель индуцированно иммуносупрессии при трехкратном введении ЦФ в дозе 100 мг/кг с интервалом 7 часа с последующим однократным введением ВП-4 в дозе 200 мкг/мышь через 24 ча после последнего введения ЦФ. При этом по сравнению с контролем снижает количество лейкоцитов в крови мышей, однако, оно менее выражено, чем пос. трехкратного введения ЦФ в монорежиме. Этот факт можно рассматривать ка проявление корригирующего действия ВП-4 на миело- и лимфопоэз.

Изучение клеточного состава периферической крови мышей показало, что через часа после трехкратного введения ЦФ происходит повышение сегментоядерных йкоцитов, некоторое снижение лимфоцитов, отсутствие моноцитов (рис. 5).

Рисунок 5. Содержание лейкоцитов в периферической крови интактных и экспериментальных мышей, получавших ЦФ и ВП-4.

Примечание. Контроль - интактные мыши; ЦФ - через 24 часа после трехкратного введения в е 100 мг/кг; ВП-4 - через 24 часа после введения в дозе 200 мкг/мышь; ЦФ+ВП-4 - через 24 часа ле трехкратного введения ЦФ в дозе 100 мг/кг и ВП-4 в дозе 200 мкг/мышь; Н.с. — нейтрофилы лентоядерные, Н.п. — нейтрофилы палочкоядерные, Л. — лимфоциты, М. — моноциты, Б — стные клетки; Различия достоверны (р<0,05) - * ЦФ и контроль, ЦФ и ЦФ+Иммуновак ВП-4

При введении ВП-4 различий с контрольной группой выявлено не было, за Ьпочением появления 4% бластных клеток. Введение ВП-4 после ЦФ приводит к шению содержания сегментоядерных нейтрофилов, появлению моноцитов и повы-нию до 18% бластных форм клеток, что свидетельствует об активации миелопоэза.

Изменения цитокинового профиля и иммунофенотипа лимфоцитов мышей с ^уцированной иммуносупрессией и их коррекция ВП-4

Показателем функциональной активности клеток-эффекторов врожденного и .птивного иммунитета является продукция ими цитокинов, которые обеспечивают кклеточные взаимодействия и определяют направленность активации Т-^фоцитов по ТЫ и ТЬ2 пути.

При трехкратном введении ЦФ в сыворотке крови мышей происходит резкое !:жение ИЛ-1/? во все сроки наблюдения, через 24 часа транзиторно повышается ержание ИЛ-6 и ИНФ-7при снижении ИЛ-12 (табл.3).

Таблица 3

Динамика содержания цитокинов у мышей после трехкратного введения циклофосфана

Группа мышей Срок наблюдения, часы Содержание цитокинов, пкг/мл

ИЛ-1Р ИЛ-6 ФНО-а ИЛ-12

сыв. спон. инд. сыв. спон. инд. сыв. спон. инд. сыв. спон. инд.

Интакг- ные 4 78,2 100,4 470,9 0 0 88 13 14 33 500 47 75

24 80,1 101 465 0 0 89 13 13 35 505 46 78

96 81,2 102 467 0 0 88 12 13 30 502 47 74

ЦФ 4 2,01 Ш* 500 И* 0 Ш* 0 0 0 Ш* 12 14 10 300 75 20 Ф

24 4,6 Ш* 630 11* 2001 10 н 50 т 0 Ш* 13 16 22 2001 890 т 110

96 17 Ш* 840 П 980 Т 0 0 ю и* 13 18 28 220 65 1501

ЦФ+ВП-4 4 0 Ш* 0 Ш* 1900 М*" 121 т** 0 0 Ш* 90 т*" 16 14 ЗОООТТ*" 1151 60

24 80" 1780111*" 9151 53 т* 0 0 Ш* 18 18 14 13001* 1051 85

96 72" 170 0 0 28 * 13 16_ 43 50 Ш* 35 90

ИНФ-7 ИЛ-4 ИЛ-10 ТФР-Р

Интакт-ные сыв. спон. инд. сыв. спон. инд. сыв. спон. инд. сыв. спон. инд.

4 10 18 290 5 11,5 37 0 0 50 1400 75 40

24 9 18 292 4 10,9 39 0 0 49 1385 73 41

96 12 19 283 5 12,0 38 0 0 52 1398 75 41

ЦФ 4 10 10 10Ш* 2,6 12 И 0 0 0 1450 1801* 1401*

24 _, 1370 т* 20 20Ш* 1,8 10 12 0 0 0 1480 155 Т 1301

96 10 20 380 4 13 100 Т 0 0 70 920 20 * 40

ЦФ+ВП-4 4 30 Т 23 37 Ш* 4,6 12 18 340 т** 0 0 Ш* 1000 27 * 35

24 10 19 ЗОШ* 39 И** 18 16 87 И*" 0 ОШ* 420 1 125 1701

96 10 19 370 61т*' 9,7 27 0 5,211* 181 380 * 35 1 45

Примечание. ЦФ вводили в дозе 100 мг/кг с интервалом 72 часа; Тили I - повышение или снижение от 2 до 4 раз; f Т или 1 * от - 5 до 9 раз; Т Т Т или Н1 - более, чем в 10 раз; спон. - спонтанная; инд. - ФГА индуцированная; ВП-4 вводили в дозе 200 мкг/мышь через 24 ч после последнего введения ЦФ. В таблице представлены медианные значения. р<0,05 - достоверность разности между * - ЦФ и контроль,ЦФ и ЦФ+ВП-4

Введение ВП-4 на фоне индуцированной ЦФ иммуносупрессии приводит к изменению продукции цитокинов. В отличие от ЦФ снижение ИЛ-1/3 является кратковременным и восстанавливается до контрольных значений через сутки. Снижается уровень супрессорного цитокина ТФР-/3 через 24 и 96 часов наблюдения, отмечается повышение ИЛ-6 и ИЛ-12 через 4 и 24 часа после введения иммуномодулятора, а также ИНФ-у, ФНО-а и ИЛ-10 с постепенным снижением через 24 ч, ИЛ-4 повышается в период с 24 до 96 часов. Спонтанная и индуцированная ФГА продукция цитокинов спленоцитами мышей носит разнонаправленный характер. Полученные данные свидетельствуют о восстановлении межклеточных взаимодействий под влиянием ВП-4.

Количество и структура поверхностных маркеров лимфоцитов - важный показатель состояния иммунной системы: ее активации или супрессии. Эти показатели были изучены для оценки возможности коррекции индуцированной ЦФ иммуносупрессии с помощью иммуномодулятора микробного происхождения - ВП-4.

При трехкратном введении ЦФ существенно снижается количество основных субпопуляций лимфоцитов (СОЗ+, С04+) по сравнению с контрольной группой (рис. 6, табл. 4). Регистрируется уменьшение в 3 раза (р<0,05) доли В-лимфоцитов (СП194). ЦФ оказывает супрессивное на СБ4+ Т-хелперы, содержание которых уменьшается в 2,1 раза по сравнению с контролем (р<0,05). Введение ЦФ приводит к достоверному снижению (в 4 раза) доли ]Ж-клеток (ОХ5+) с 12,4±2,6 до 3,0±0,1% (р<0,01). Наряду с перечисленными данными, наблюдается тенденция к снижению уровня МКТ (СОЗ+ЮХ5+) и Т-регуляторных клеток (СГ34+/СЭ25+). В меньшей степени подвержены действию ЦФ СБ8+-имфоциты. Восстановление исходных показателей иммунофенотипа в данных словиях регистрируется на 5-7-е сутки после последнего введения цитостатика.

Введение ВП-4 приводит к нормализации основных нарушений иммунного татуса, вызванных цитостатиком. В группе мышей, получавших ВП-4 после ведения ЦФ, уже на 2-е сутки содержание СБ19+-клеток в селезёнке риближается к их количеству у интактных животных и составляет 19,0±5,2%, а одержание С04+-лимфоцитов увеличивается с 17,2±3,1 до 28,4±9,5%.

I

I

I

I

10' 10= 103 10' СЙ8-ПТС

1

10° 10' 103 103 10' С08-ПТС

о

% ш ш т-, см о - 3

"Ц о ' Ц

10° 10' 10- 10э С04-Р1ТС 10* 10° 10' 102 103 С04-ПТС

о

10° 10' 10- 103 10' С04-Р1ТС

10° 10' 102 103 10' СОЗ-ПТС

10° 10' 102 103 10' соз-птс

| Щ'Р 7

10° 10' 102 103

Контроль

ЦФ

ЦФ+ВП-4

Рисунок 6. Распределение субпопуляций лимфоцитов селезенки

Примечание. Двойное прижизненное окрашивание моноклональными антителами, меченными флюоресциинизотиоционатом (ИТТС) и фикоэритрином (РЕ).

Таблица 4

Иммунофенотип мононуклеарных лейкоцитов периферической крови мышей на фоне индуцированной иммуносупрессии и под влиянием ВП-4

Маркер Контроль,% Циклофосфан,% ЦФ+ВП-4,%

СОЗ+ 56,4±4,1 25,1+5,2* 51,3±4,8**

СР4+ (ТЬ) 37,0±4,1 17,2±3,1* 28,4+9,5

С08+ (СТЬ) 21,3±3,0 18,9±2,0 19,3±1,5

СО 19+ (В-клетки) 22,0±2,4 7,0±1,8* 19,0±5,2**

С04+/СП25+(Тгея) 9,0±2,0 3,1+1,5* 8,3±3,0**

ИХ5+ (Ж) 12,4±2,6 3,0±0,1* 2,8±0,1

ЦХ5+/ СОЗ (ЫКТ) 6,5±2,2 2,0±2,6 2,6+2,4

Примечание; Различия достоверны (р<0,05 между группами), * - ЦФ и контроль, ** - ЦФ и ЦФ+ ВП-4

Функциональная активность натуральных киллеров у мышей с индуцированной ЦФ иммуносупрессии н ее коррекция ВП-4

Выявленное 4-кратное снижение ИК-клеток под действием ЦФ явилось основанием для изучения их функциональной активности.

Для этого мышам линии СВА трехкратно вводили ЦФ, а через 24 часа после последнего введения ЦФ - ВП-4 в дозе 200 мкг на мышь. Через 24 часа исследовали цитотоксическую активность спленоцитов мышей (табл.5).

Таблица 5

Влияние ВП-4 на ЫК-активность мононуклеарных клеток селезенки мышей линии СВА на фоне ЦФ-индуцированного иммунодефицита

Время после введения, ч №№ группы Препарат ЫК-активность при соотношении клетка мишень/эффектор

1:5 1:2 1:1

0 1 Интактные мыши 73.4±5,6 39,3±1,2 27,9±0,8

48 2 ЦФ 34,1±3.4 20,1±2,2 14,5±0,6

3 ЦФ+ВП-4 63,2±2,9* 40,8±2,7 22,3±1,2

96 4 ЦФ 39.6±1.2 27,1±3,1 9.3±0,1

5 ЦФ+ ВП-4 57,3±2,4* 35,4=Ы,8 12,9±0,1

168 6 ЦФ 45,9±1,9 41,4±2,0 35,4±1,5

7 ЦФ+ ВП-4 52,7±3,1* 43,6±0,9 33.9±2,7

Примечание. * - Достоверность различий между группой ЦФ/группой ЦФ+ВП-4 на каждый срок наблюдения; в качестве клеток-мишеней использована опухолевая линия клеток К-562.

У интактных мышей исходный индекс цитотоксичности при соотношении мишень-эффектор 1:5 составляет 73,4%, что свидетельствует о высокой спонтанной МС-активности спленоцитов. Воздействие ЦФ приводит к снижению этого показателя более чем в 2 раза по сравнению с контролем, и уже через 48 часов она составляет 34,1%. Этот показатель возрастает до 45,9% в течение периода наблюдения (7сут.).

Применение ВП-4 на фоне действия ЦФ хотя и не позволяет достичь исходных значений, приводит к достоверному увеличению киллерной активности мононуклеарных лейкоцитов до 52,7-63,2% в течение всего периода наблюдения.

Возможность существенного увеличения киллерной активности ЫК-клеток, сниженной под действием ЦФ, чрезвычайно важна, поскольку именно .эта.

популяция лимфоцитов играет центральную роль в противоопухолевом иммунитете. Иммуномодулятор ВП-4, содержащий агонисты толл-подобых рецепторов, обеспечивает усиление киллерной активности NK-клеток даже при однократной аппликации.

Влияние ВП-4 на противоопухолевую активность при совместном введении с ЦФ

. Заключительным этапом исследования действия ЦФ и возможности коррекции его супрессивного действия при введении ВП-4 явились эксперименты по изучению продолжительности жизни мышей с перевиваемой опухолью. Опыты проводили на мышах линии Balb/c с плазмоцитомой MOPS-21 (табл.6). Средняя продолжительность жизни (СПЖ) мышей с плазмоцитомой MOPS-21 в контрольной группе составляет 18,1 ±0,8 суток. На фоне однократного введения ЦФ в дозе 50 мг/кг массы тела животных отмечается увеличение СПЖ мыши до 25,4±0,7 суток. Увеличение дозы ЦФ до 100 мг/кг массы тела животных приводит к увеличению СПЖ до 37,3±0,9 суток. Введение ЦФ в дозе 150 мг/кг массы тела животных вызывает наиболее выраженный терапевтический эффект, и СПЖ мышей с плазмоцитомой MOPS-21 составляет 43,4±2,1 суток. Дальнейшее повышение дозы ЦФ до 200 и 250 мг/кг массы тела животных сокращает СПЖ мышей до 34,0±2,2 и 28,1 ±2,4 суток соответственно за счет проявления токсичности цитостатика.

Таблица 6

Средняя продолжительность жизни мышей с плазмоцитомой MOPS-21

Препарат №№ Разовая доза ЦФ, Средняя продолжительность

группы мг/кг массы тела жизни, сутки

Контроль (интактные) 1 - 18,1±0,8

ЦФ 2 50 25,4±0,7

-«- 3 100 37,3±0,9

-«- 4 150 43,4±2,1

-«- 5 200 34,0±2,2

-«- 6 250 28,1±2,4

ВП-4+ЦФ 7 50 40,0±0,9*

-«- 8 100 45,8±1,9*

-«- 9 150 36,4±1,9

-«- 10 200 25,3±1,8

-«- 11 250 7,8±0,5

Примечание. 1) ЦФ вводили в разных дозах через 1 час после введения ВП-4 в дозе 200

мкг/мышь. *Различия достоверны между группами ЦФ и ЦФ+ВП-4 (р<0,05)

Комбинированное воздействие ЦФ в дозе 50 мг/кг и ВП-4 в дозе 200 мкг/мышь вызывает статистически значимое увеличение СПЖ мышей с плазмоцитомой MOPS-21 по сравнению с группой мышей, получающих только ЦФ: 25,4±0,7 и 40,0±0,9 суток соответственно (р<0.05). Максимальный эффект при комбинированном воздействии ЦФ с ВП-4 отмечается при использовании ЦФ в дозе 100 мг/кг массы тела животного, в этих условиях СПЖ мышей составляет 45,8±1,9 суток. Этот эффект сопоставим с действием ЦФ в дозе 150 мг/кг массы тела животного в режиме монотерапии (43,3±2,1 суток). Так как введение ВП-4 усиливает противоопухолевый эффект ЦФ, его применение может способствовать снижению дозы ЦФ, и тем самым снижению его токсического эффекта.

Дальнейшее увеличение дозы ЦФ приводит к снижению СПЖ: 150 мг/кг массы тела животных - 36,4±1,9 суток, 200 мг/кг массы тела животных -25,3±1,8, 250 мг/кг массы тела животных- 7,8±0,5 суток.

Таким образом, описаны фармакокинетические, морфологические, и иммунологические характеристики индуцированной ЦФ иммуносупрессии. На основе разработанной модели индуцированной иммуносупрессии была показана эффективность агониста толл-подобных рецепторов - вакцины Иммуновак-ВП-4 в качестве иммунокорригирующего средства.

Выводы

1. Разработана модель стойкой (7-10 дней) иммуносупрессии при трехкратном внутрибрюшинном введении ЦФ мышам в дозе 100 мг/кг с интервалом 72 часа с учетом фармакокинетики активных метаболитов ЦФ, морфологии органов иммуногенеза, состава форменных элементов периферической крови, продукции цитокинов, содержания основных субпопуляций лимфоцитов селезенки мышей и цитотоксической активности NK-клеток.

2. Фармакокинетика ЦФ при трехкратном введении по сравнению с однократным характеризуется снижением концентрации активных метаболитов ЦФ, увеличением времени достижения их максимальной

концентрации с 10 до 15 мин, периода полуэлиминации с 11,3 до 15,1 мин и периода полного выведения из организма с 5 до 6 часов.

3. Показано, что при морфогистологическом исследовании органов иммуногенеза (красный костный мозг, тимус, селезенка) трехкратное введение ЦФ угнетает миело- и лимфопоэз, уменьшает количество молодых, зрелых и дифференцирующихся форм клеток, нарушает строму и сосудистую сеть органов с последующим неполным восстановлением в течение 120 часов преимущественно элементов стромы, а в периферической крови наблюдается выраженная лейкопения с 3 по 12 сутки при минимальном количестве лейкоцитов на 8-9 сутки (3,7-1,7)х103 в мм3, повышение содержания сегментоядерных лейкоцитов и отсутствие моноцитов.

4. Установлено, что при трехкратном введении ЦФ в сыворотке крови мышей существенно снижается уровень ИЛ-1/3, кратковременно уменьшается уровень ИЛ-12 и транзиторно повышается ИЛ-6 и ИНФ-у, уменьшается содержание Т- (СБЗ+ ,С04+) и В клеток (С019+), Т регуляторных лимфоцитов (СБ4+/СВ25+), №С (БХ5+) и снижается цитотоксическая активность натуральных киллеров.

5. ВП-4 восстанавливает нарушения, вызванные ЦФ в органах миело- и лимфопоэза, что проявляется в появлении молодых клеток, находящихся на различных стадиях дифференцировки, нормализации сосудистой сети кроветворных и лимфоидных органов, а в периферической крови повышением уровня лимфоцитов, моноцитов и появлением до 18% бластных форм клеток.

6. Установлено, что при введении ВП-4 на фоне индуцированной ЦФ иммуносупрессии, в сыворотке крови кратковременно снижается ИЛ-1(3, повышается продукция ИЛ-6, ФНО-а, ИЛ-12, ИНФ-7, ИЛ-4, ИЛ-10 при снижении уровня супрессорного цитокина ТФР-/3, в селезёнке мышей повышается число СЭ4+ Т- лимфоцитов с 17 до 28,4% и В-клеток с маркером СО!9+ с 7 до 19%.

7. Комбинированное применение ВП-4 (200 мкг/мышь) и ЦФ (50-100 мг/кг) способствует усилению противоопухолевого действия цитостатика у мышей с плазмоцитомой MOPS-21, что проявляется в увеличении СПЖ животных с 25,4±0,7 до 40,0±0,9 суток и с 37,3±0,9 до 45,8±1,9 суток соответственно при 50 и 1 ООмкг/кг ЦФ.

8. Введение ВП-4 на фоне индуцированной ЦФ иммуносупрессии позволяет корригировать иммунологические нарушения, обусловленные супрессивным действием цитостатика.

Список публикаций по теме диссертации

1. Лосева Л.Ф Влияние вакцин бактериального и растительного происхождения на морфогистохимические особенности и клеточный состав селезёнки мышей / Лебединская Е.А., Лебединская О.В., Кунягина О.В., Ахматова Н.К., Русскова А.Н., Масленникова М.И., Пудилова Э.В., Киселевский М.В.// Фундаментальные исследования. — 2008. — №10, — С.77.

2. Лосева Л.Ф Морфогистохимические изменения тимуса и иммунофенотипа лимфоцитов под действием иммуномодулирующих препаратов бактериальной природы / Лебединская Е.А., Лебединская О.В., Кунягина О.В., Ахматова Н.К., Русскова А.Н., Киселевский М.В.// Фундаментальные исследования. — 2008. — №10. — С.78.

3. Лосева Л.Ф. Морфогистохимические аспекты изменений в тимусе мышей под влиянием иммуностимулирующих препаратов на фоне индуцированной иммуносупрессии / Лебединская Е.А., Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Старцев Д.А., Киселевский М.В. // Фундаментальные исследования. — 2008. — №10. — С.78.

4. Лосева Л.Ф. Морфогистохимические изменения селезёнки мышей и иммунофенотипа составляющих её лимфоцитов под влиянием иммуностимулирующих препаратов на фоне индуцированной иммуносупрессии / Лебединская Е.А., Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Кунягина О.В., Старцев Д.А., Киселевский М.В. // Фундаментальные исследования. — 2008. — №10. — С.79.

5. Лосева Л.Ф. Влияние вакцины ВП-4 на фенотипические и функциональные характеристики мононуклеарных лейкоцитов в условиях индуцированной иммуносупрессии / Лебединская Е.А., Гусин Д.Н., Ахматова Н.К., Семёнова И.Б., Лебединская О.В., Киселевский М.В. // Российский биотерапевтический журнал. — 2009. — Т.8. — №4, — С.69-73.

6. Лосева Л.Ф. Влияние циклофосфана на уровень противовоспалительных цитокинов у мышей / Лебединская Е.А., Лебединская О.В., ГодоваловА.П., Ахматова Н.К., Киселевский М.В. // Цитокины и воспаление. — 2010. — Т.7. — №7. — С.94-95.

7. Лосева Л.Ф. Эффект влияния циклофосфана на уровень провоспалительных цитокинов в эксперименте у мышей / Лебединская Е.А., Лебединская О.В., ГодоваловА.П., Ахматова Н.К., Киселевский М.В. // Цитокины и воспаление. — 2010. — Т.7. — №7. — С.96-97.

8. Лосева Л.Ф. Возможности коррекции цитокинового профиля при индуцированной иммуносупрессии у мышей / Лебединская Е.А, Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Годовалов А.П., Киселевский М.В. // Материалы YII Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» — 2010. — С.113-114.

9. Лосева Л.Ф. Молекулярно-клеточные механизмы коррекции индуцированной введением циклофосфана иммуносупрессии / Лебединская Е.А., Лебединская О.В, Тройнич Я.Н., Годовалов А.П.,, Ахматова H.K. // Казанская наука. Сборник научных статей. Изд-во: Казанский издательский дом. — 2010. — №9. — вып. 2. — С.289-293.

10. Лосева Л.Ф. Вариант создания экспериментальной модели индуцированной иммуносупрессии Лебединская Е.А., Лебединская О.В., Тройнич Я.Н., Годовалов А.П.,., Ахматова Н.К. // Материалы IX международной германо-российской научно-практической конференции Форума им.Р.Коха и И.И.Мечникова «Инновации и сотрудничество в медицине и здравоохранении» 8-9 декабря 2010 г.Новосибирск. — С.185-187.

11. Лосева Л.Ф. Морфогистохимические изменения органов гемиммунопоэза и периферической крови мышей на фоне индуцированной иммуносупрессии и её коррекции /Лебединская О.В., Лебединская Е.А., Ахматова Н.К., Семёнова И.Б., М.В. Киселевский // Морфологические ведомости. — 2010. — №4. — С.49-59.

12. Лосева Л.Ф. Анализ влияния вакцины ВП-4 на фенотипические и функциональные характеристики мононуклеарных лейкоцитов в условиях индуцированной иммуносупрессии / Лебединская Е.А., Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Годовалов А.П., Киселевский М.В. // «Медицинский академический журнал». — 2010. — №12. — С. 23-24.

13. Лосева Л.Ф. Изучение иммуномодулирующего действия поликомпонентной бактериальной вакцинв в условиях индуцированной иммуносупркссии / Лебединская Е.А., Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Годовалов А.П., Киселевский М.В. // Материалы III Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням, Москва 28-30 мартаа 2011, —С. 208-209.

14. Лосева Л.Ф. Коррекция изменений цитокинового профиля мышей с индуцированной имуносупрессией / Лебединская Е.А., Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Семёнова И.Б., Годовалов А.П., Киселевский М.В. // Цитокины и воспаление. — 2011. — Т. 10. — №2. — С.23-26.

15. Лосева Л.Ф. Некоторые особенности фармакодинамики циклофосфана у экспериментальных животных / Доненко Ф.В., Лебединская О.В., Ахматов Э.А., Лебединская Е.А., Годовалов А.П., Мелехин C.B. // Медицинская иммунология. —2011. — Т.13,—№.4-5. —С.52.

Подписано в печать 18.05.2011. Формат 60x84/16. Бумага офисная «БуеЮСору». Тираж 100 экз. Заказ № 472.

Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24

В настоящее время цитостатические препараты широко используются в клинической практике: онкологии и трансплантологии, а также при лечении аутоиммунных заболеваний. Активное применение цитостатических препаратов приводит к развитию выраженных иммунодефицитов, поэтому изучение иммунологических нарушений и возможностей их коррекции является чрезвычайно актуальной проблемой. Одним из наиболее эффективных и широко применяемых цитостатиков является циклофосфан (ЦФ), который входит в различные схемы противоопухолевой химиотерапии, активно применяется в трансплантологии и клинике аутоиммунных заболеваний [Д.А. Вгос^ку е! а1, 2008; А.Е. гп et а1, 2011].

Модель индуцированного ЦФ иммунодефицита является наиболее адекватной для изучения особенностей механизма иммунологических нарушений при действии цитостатиков. Детальное понимание воздействия препарата на различные субпопуляции клеток и сроки их восстановления при различных режимах введения цитостатиков представляет как практический, так и теоретический интерес. Особое значение данная модель иммунодефицита приобретает при изучении действия иммуномодуляторов в иммуносупрессированном организме, что наблюдается в клинической практике при терапии цитостатиками.

В единичных исследованиях показана способность иммуномодуляторов различной природы восстанавливать количественный и субпопуляционный состав клеток в лимфоидных органах после действия цитостатиков [Е.А.Лебединская с соавт., 2009]. В литературе обсуждаются возможности применения препарата полиоксидоний для коррекции индуцированных иммунодефицитов, а также приводятся данные о применении вакцины БЦЖ для коррекции иммунологических нарушений [М. ВаЬ]ик е1 а1., 2011]. Однако многообразие иммуномодулирующих агентов лишь затрудняет задачу выбора оптимальных методов иммунокоррекции. Следует отметить, что нарушения иммунного статуса, вызванные применением цитостатиков, существенно повышают риск развития инфекционных осложнений, вызываемых условно-патогенными антибиотикоустойчивыми микроорганизмами [ХУ.8ог^ е1 а1., 2009]. Поэтому для оптимальной иммунокоррекции вторичных иммунодефицитов, вызванных цитостатиками, предпочтительны иммуномодуляторы, обладающие способностью стимулировать противоинфекционную резистентность организма [А. Сиз1:оую е1 а1., 2009]. К таким препаратам относится бактериальная поликомпонентная вакцина Иммуновак-ВП-4® (ВП-4), содержащая в своем составе агонисты толл-подобных рецепторов, являющаяся активатором систем врожденного и адаптивного иммунитета против основных возбудителей внутрибольничных инфекций. Экспериментальные исследования показали, что ВП-4 обладает также противоопухолевой и антиметастатической активностью [Н.К. Ахматова и соавт., 2005]. В связи с выше сказанным целесообразна разработка модели стойкой иммуносупрессии для изучения особенностей механизма иммунологических нарушений при действии цитостатиков и дальнейшей оценки иммунокорригирующего действия иммуномодуляторов.

Цель. Выявление основных параметров иммуносупрессии, индуцированной циклофосфаном, и оценка эффективности иммунокорригирующего действия ВГТ-4 на фоне действия цитостатика.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности фармакокинетики циклофосфана при различных схемах введения для обоснования выбора оптимального режима стойкой индуцированной иммуносупрессии.

2. Исследовать морфологические изменения в органах гемоиммунопоэза при введении циклофосфана и возможность их коррекции с помощью ВП-4.

3. Оценить влияние ВП-4 на миелосупрессию, вызванную циклофосфаном.

4. Исследовать влияние индуцированной иммуносупрессии на продукцию цитокинов, иммунофенотип и функциональную активность мононуклеарных лейкоцитов мышей после введения циклофосфана и влияние на эти показатели ВП-4.

5. Изучить влияние ВП-4 на противоопухолевую активность циклофосфана.

Научная новизна

Получены новые данные, характеризующие параметры индуцированной ЦФ иммуносупрессии при трехкратном (с интервалом в 72 часа) введении цитостатика в дозе 100 мг/кг веса тела животных:

- морфологические изменения органов иммуногенеза: в красном костном мозге, а также в корковом и мозговом веществе тимуса и селезенки увеличивается количество эритроцитов, уменьшается количество дифференцирующихся клеток эритроидного ряда, резко снижается содержание молодых и зрелых форм лейкоцитов, нарушается строма органа и её сосудистая сеть;

- в периферической крови мышей отмечается выраженная лейкопения продолжительностью более 10 суток, с наименьшим

3 3 количеством лейкоцитов на 8-9 сутки ((3,7-1,7)х10 в мм ), повышение сегментоядерных лейкоцитов, некоторое снижение лимфоцитов; определено существенное снижение продукции ИЛ-1Р, увеличение уровня супрессорного цитокина ТФР-Р, кратковременное уменьшение ИЛ-12 и транзиторное повышение ИЛ-6 и ИНФ-у;

- снижено число клеток, экспрессирующих дифференцировочные -СВЗ+, СТ)4+, СБ19+, БХ5+ (ЫК), СБ4+/С025+ маркеры при уменьшении цитотоксической активности 1ЧК-клеток.

Впервые исследовано влияние ВП-4 на фармакокинетику ЦФ. Показано, что введение иммуномодулятора через 72 после воздействия цитостатика не влияет на процессы биораспределения и токсические свойства активных метаболитов ЦФ.

Впервые выявлено, что агонист толл-подобных рецепторов ВП-4 при введении мышам с индуцированной ЦФ иммуносупрессией обладает способностью корригировать нарушения в органах иммуногенеза и иммунологические показатели:

- нормализует структуру красного костного мозга, тимуса и селезенки мышей, нормализует процессы иммуногенеза с появлением молодых клеток эритроидного, миелоидного и лимфоидного рядов, нормализует соотношение форменных элементов периферической крови;

- активирует процесс миелопоэза, что проявляется в появлении моноцитов и бластных форм клеток в периферической крови мышей;

- вызывает кратковременное снижение в сыворотке ИЛ-1Р, повышает содержание цитокинов ТЫ (ФНО-а, ИЛ-12, ИНФ-у), ТЬ2 (ИЛ-6, ИЛ-4, ИЛ-10) и снижает продукцию супрессорного цитокина ТФР-р спленноцитами мышей, восстанавливает экспрессию маркеров лимфоцитов СБЗ+, СБ4+, С019+,СБ4+/СБ25+, повышает активность Ж-клеток на фоне снижения числа клеток, экспрессирующих молекулы БХ5+ (Ж) и СБЗ+ЛЖ5+ (№СТ);

- усиливает противоопухолевую активность ЦФ в отношении плазмоцитомы МОРС-21 в эксперименте на мышах.

Впервые дано экспериментальное обоснование возможности использования ВП-4 для иммунокоррекции нарушений, обусловленных индуцированной цитостатиками иммуносупрессией.

Практическая значимость

Установлено, что для достижения иммунокорригирующего эффекта ВП-4 следует вводить не ранее, чем через 72 часа после последнего введения ЦФ.

Полученные данные обосновывают целесообразность дальнейшего изучения иммунокорригирующего действия ВП-4 для коррекции индуцированной иммуносупрессии, вызванной цитостатиками.

Материалы диссертационной работы включены в научно-экспериментальную работу лаборатории терапевтических вакцин НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН. Результаты исследований используются в циклах лекций курса «Вакцинопрофилактика» и курса «Иммуноонкология» 1-ого МГМУ им. И.М. Сеченова.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработана модель индуцированной ЦФ стойкой иммуносупрессии при трехкратном введении ЦФ в дозе 100 мг/кг с интервалом 72 ч, при которой выявлены морфологические нарушения структуры и функции органов иммуногенеза и выраженные иммунологические нарушения в организме мышей.

2. Применение ВП-4 на фоне индуцированной ЦФ иммуносупрессии приводит к нормализации структуры и функции органов иммуногенеза и восстанавливает иммунологические показатели.

3. Введение ВП-4 после введения ЦФ усиливает противоопухолевое действие в отношении плазмоцитомы МОРС-21 у мышей.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены и обсуждены: на X Всероссийском научном Форуме, 29 мая-1 июня, 2006, г. Санкт-Петербург; на VIII Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», 27-29 июня 2007, г. Москва; на XI Всероссийском научном Форуме, 28-31 мая 2007, г. Санкт-Петербург; на Международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине», 26 ноября - 4 декабря 2008, г. Пекин; на VII Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», 27-29 октября 2010, г. Москва; на Первом конгрессе Евро-Азиатского общества по инфекционным болезням 1-3 декабря 2010, г. Санкт-Петербург; на Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» 21-22 декабря 2010, г. Санкт-Петербург; на IX Международной германо-российской научно-практической конференции Форума им. Р.Коха и И.И.Мечникова «Инновации и сотрудничество в медицине и здравоохранении» 8-9 декабря 2010, г. Новосибирск; на конференции молодых ученых НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН 15-16 марта 2011 г (2-е призовое место), г. Москва; на XVII Россиийском национальном конгрессе «Человек и лекарство» 11-15 апреля 2011, г. Москва; Апробация диссертации состоялась на конференции отдела иммунологии НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН, 18 апреля 2011, г. Москва.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 15 печатных работ, в том числе 9 в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Материалы работы изложены на 141 странице компьютерного текста и состоят из введения, обзора литературы, глав «материалы и методы», «результаты исследований», обсуждения, выводов, списка литературы - 238 источников (23 отечественных и 215 зарубежных авторов). Диссертация иллюстрирована 6 таблицами, 31 рисунком.

1. Обзор литературы.

Иммунодефицитные состояния в онкологии

Иммунодефицитные состояния являются актуальной проблемой современной медицины [27, 40, 49, 58, 74, 87, 88, 106, 108, 115, 122, 124, 130, 167, 182, 221, 230]. Распространенность иммунодефицитов ежегодно растет. В мире, по данным ВОЗ, число ВИЧ инфицированных пациентов составляет более 40 миллионов человек, из которых ежегодно погибает более 2 миллионов больных. Отмечена взаимосвязь между наличием иммунодефицитов и развитием опухолей [54]. Распространенность онкологических заболеваний в России в 2009 году составила 3587,5 на 100000 населения; в России в 2009 году было более 5 миллионов больных онкологическими заболеваниями. По данным минздравсоцразвития, патология иммунной системы имеет место почти у 2 миллионов человек.

С учетом высокой распространенности патологии иммунной системы, в литературе широко обсуждаются вопросы диагностики иммунодефицитов и рассматриваются возможные маркеры иммунодефицитных состояний, которые позволили бы определять степень выраженности иммунодефицита и прогноз пациента [20, 69, 126, 128, 174, 189, 229, 235]. Иммунодефицит как неадекватный ответ иммунной системы на действие факторов внешней и внутренней среды приводит к развитию комплекса заболеваний, в том числе инфекционных процессов, онкологических заболеваний. Ключом для создания эффективных методов лечения и профилактики иммунодефицитных состояний в таком случае является ответ на вопрос, какие факторы оказывают влияние на развитие патологического процесса, каковы механизмы развития иммунных нарушений. Многообразие патологических состояний иммунной системы указывает на разнообразие факторов, участвующих в процессе регуляции ее нормальной деятельности.

Описание распространенных патологий и редких заболеваний проливает свет на нормальную и патологическую работу иммунной системы. Наличие врожденных и приобретенных иммунодефицитов позволяет лучше понять тонкие механизмы регуляции иммунного ответа на клеточном и генетическом уровне. Становится очевидным, что неадекватные иммунные реакции можно рассматривать как нарушение тонкого взаимодействия клеточных субпопуляций и их медиаторов между собой.

Старение человека и животных также сопровождается развитием иммунодефицита клеточного звена иммунитета [86], [205]. Увеличение частоты опухолевых заболеваний всех локализаций у пожилых людей может являться доказательством существованием связи между иммунодефицитом и онкологическими заболеваниями [206] [90, 138] [48] [209] [217].

Следует отметить, что среди исследователей нет единого мнения о наличии связи между нарушением иммунного статуса организма и наличием опухоли. Наличие такой закономерности между изъяном в иммунном статусе и ростом опухоли без сомнения могло стать ценной находкой, которую можно было бы использовать для диагностики опухолевого процесса. Так, при раке молочной железы, меланоме вообще не отмечается никаких изменений в иммунитете больных. В то же время при плоскоклеточном раке легкого и других отделов дыхательной системы, опухолях головы и шеи, раке шейки матки исследователи говорят о супрессии иммунной системы, которая предшествовала онкологическому заболеванию.

Согласно современным представлениям, иммунная система участвует в регуляции клеточного гомеостаза организма. Рост опухоли в этом случае может наблюдаться на фоне развития иммунодефицитных состояний. Иммунная система по каким-то причинам не препятствует клеточной пролиферации, что приводит к возникновению в организме опухолевого массива клеток [168]. Причины отсутствия иммунного ответа на опухоль ассоциированные антигены до конца не изучены. Обсуждается роль большого количества факторов, например: факторы, которые выделяет опухоль, чтобы подавить иммунный ответ; опухоль-ассоциированные лимфоциты, содержащие супрессорную СВ4+СБ25+РохрЗ+субпопуляцию; факторы сыворотки крови, в присутствии которых наблюдается блокирование цитотоксических иммунных реакций лимфоцитов против опухолевых клеток.

Сывороточные факторы получили название - блокирующие антитела [162] [200, 224] [218] [103] [226], [109], [60], [201], [90, 138], [117], [93], [36] [100]. Это название не совсем точное, так как не удалось доказать, что данные сывороточные факторы являются антителами. Полученные данные позволяют утверждать, что это молекулы белковой природы, так как разрушаются трипсином с молекулярным весом выше 6 кДа. Тем не менее, их роль в развитии иммуносупрессии была неоднократно подтверждена в экспериментах на животных [109].

В настоящее время в сыворотке крови онкологических больных определяются циркулирующие опухоль-ассоциированные антигены [[41], [139], [156]] . Некоторые из этих антигенов используются для диагностики и мониторинга онкологических заболеваний в процессе лечения пациентов. Функциональное значение этих антигенов в процессе роста опухоли или в иммуносупрессии остается неизвестным.

Развитию опухоли может способствовать не только отсутствие активной цитотоксической реакции иммунных клеток, но и способность иммунных клеток ускорять рост опухоли в организме. Подобное предположение основано на том факте, что все опухоли инфильтрированы опухоль-ассоциированными лимфоцитами [226] [32] [178] [225]. Для таких лимфоцитов характерны: слабый пролиферативный ответ на митогены и незначительная исходная цитотоксичность против аутологичных опухолевых клеток. Эти признаки также могут являться показателями нарушения функциональной активности иммунокомпетентных клеток.

В 60-80 годы прошлого столетия было показано иммуносупрессивное воздействие иммунных комплексов сыворотки крови онкологических больных на Т-клеточное звено иммунитета и сформулировано антагонистическое представление о влиянии Тклеточного и В-клеточного звеньев иммунитета на рост опухоли [103]. Считается, что активация В-клеток приводит к ускорению роста опухоли и торможению Т-клеточной противоопухолевой активности.

Комплекс антиген-антитело связывается с поверхностным ¥с рецептором моноцитов и других Бс презентирующих клеток. Такое связывание комплекса с рецептором вызывает активацию клеток, которые в ответ синтезируют простагландины и простоциклины [99], [207]. Эти биологические активные вещества подавляют функциональную активность Т-клеточного звена иммунитета. Поэтому комплекс антиген-антитело можно рассматривать как важное звено в патогенезе индуцируемой иммунитетом иммуносупрессии и уклонения опухоли от иммунного надзора [162]. В литературе описана роль активированных моноцитов или макрофагов в продукции простагландинов и в развитии иммуносупрессии [99], [207]. Ингибирование синтеза простагландинов нестероидным противовоспалительным препаратом индометацином приводит к увеличению средней продолжительности жизни мышей опухоленосителей.

Взаимодействие опухоли и организма сопровождается синтезом и взаимодействием многих факторов с участием Т-клеток и реактивных моноцитов. Синтез некоторых неспецифических иммуносупрессивных факторов можно подавить, что приводит к увеличению продолжительности жизни животных-опухоленосителей, что указывает на перспективность иммунокоррекции для лечения онкологических заболеваний.

Ключевым звеном в индуцировании опухолей у мышей является супрессия Т-лимфоцитов [[80], [125]]. В частности, иммуносупрессия, вызванная ультрафиолетовым облучением, приводит к возникновению меланом у мышей [[184], [219]]. В этой мышиной модели прогрессия опухоли наблюдается на фоне возрастания супрессорной активности Т-клеток. Подавление супрессорной активности Т-клеток любым из следующих используемых методов: облучение с последующей трансплантацией клеток костного мозга, введение ЦФ или облучение до перевивки опухоли или инфузия Т-клеток, приводит к регрессии опухоли.

Было бы неверно утверждать, что только Т-клеточное звено иммунитета участвует в иммунных реакциях при росте опухоли в организме. Имеются доказательства участия в этом процессе В-клеточного звена. Были описаны антитела против опухоль-ассоцированых антигенов и комплексы антиген-антитело в сыворотке крови и в почечных клубочках онкологических больных [24], [162], [170], [179], 192]http://w\vw.sciencedirect.com/science? ob=ArticleURL& udi=B6W7N-484078H-1 &user=6451018&co verDate=08%2F31 %2F2003&alid=l 193549701 &rdoc=l &fmt =high&orig=search&cdi=6631 &sort=r&docanchor=&view=c&ct=6& acct=C00006 9879&vers io n= 1 &ur 1 Vcrsio n=%20, [224]. Описаны единичные эксперименты, когда индуцирование антительного ответа против опухоль-ассоциированного антигена приводило к торможению роста карциномы яичника мышей. Клинические исследования клеточного и гуморального ответов на опухоль также позволили идентифицировать как серологические, так и Т-клеточные антигены опухолей человека. К этим антигенам были получены моноклональные антитела, некоторые из которых используются для диагностики онкологических заболеваний [129], [180], [157]. Активное использование этих технологий в настоящее время связано с серией неудач, так как опухолевые антигены представлены на нормальных клетках организма, и терапия имеет непродолжительный клинический эффект [48], [209].

Другим механизмом уклонения опухоли от иммунологического надзора является переключение типов иммунного ответа с ТН1 на ТН2 клеточный ответ. Подобный дисбаланс сопровождается развитием анергии и уменьшением цитолитической активности Т-клеток и может опосредоваться через продукцию супрессорного цитокина ИЛ-10[148].

Среди метаболических нарушений некоторые исследователи выделяют нарушения, которые связаны с недостатком цинка. Цинк крайне важен для нормального функционирования клеточного звена иммунной системы [104] [98]. В тимусе цинк образует комплекс с тимулином, который дальше функционирует как гормон тимуса в формировании клеточного звена иммунитета и в усилении реакции клеток на ИЛ. Отсутствие или недостаток цинка приводит к атрофии тимуса, Т-клеточной лимфоцитопении и СПИД-подобному заболеванию. Цинк дефицитные состояния часто встречаются при плоскоклеточных раках и онкологических заболеваниях дыхательной и пищеварительной систем [53]. У пациентов с плоскоклеточным раком чаще всего отмечаются нарушения в клеточном звене иммунитета с клеточной анергией и дисфункцией лимфоцитов. Нельзя сказать, какие изменения носят первичный характер: изменение метаболизма или недостаток цинка, так как никаких специальных исследований в этом направлении не проводилось [53], [104]. При опухолях других локализаций подобные изменения в иммунной системе не отмечаются или отмечаются лишь после химиотерапии или при опухолях значительного размера, на фоне развития кахексии у пациентов [53], [75], [98]].

Опухоль выделяет факторы, способные влиять на функционирование иммунной системы. Трансформирующий фактор роста опухоли Р (ТФР-р) был идентифицирован в среде инкубации клеточных линий глиобластомы, рабдомиосаркомы, линий клеток рака эндометрия, молочной железы, колоректального рака и аденокарциномы [203]. ТФР-р обладает супрессивным действием на лимфоциты и моноциты человека и экспериментальных животных [147], [197].

Простагландины (ПГ), в частности, ПГЕ2, по мнению исследователей, можно отнести к иммуносупрессивным агентам, которые секретирует опухоль [[116], [99], [207]]. ПГЕ2 является мощным супрессором Т-лимфоцитов, ингибируя их пролиферацию, секреторную и цитотоксическую активность.

Колоний-стимулирующие факторы также обладают иммуносупрессорным действием на иммунокомпетентные клетки. Они были выделены не только из среды инкубации многих опухолевых линий, но также определены в сыворотке крови онкологических больных [107], [173], [214] [232]. Разнообразные ИЛ (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-10, ФНО-а) также определяются в среде инкубации клеточных опухолевых линий [103] [175].

Развитие опухолей часто происходит на фоне нарушений нормальной работы иммунной системы под действием вирусов [215, 237]. Для некоторых заболеваний определен вирус, провоцирующий развитие опухолевого процесса, например, вирус герпеса у, вирус герпеса человека-8 (ВГЧ-8). По некоторым данным, вирусами вызвано до 20% всех онкологических заболеваний, развивающихся в мире [188]. Известно, что вирусы, вызывающие развитие опухолей, активизируются на фоне недостаточной активности иммунной системы, в частности, вирус Эпштейн-Барр, вирус папилломы человека, цитомегаловирус [149, 215]. Наличие вируса папилломы человека существенно повышает риск развития рака шейки матки [97].

У онкологических больных множество факторов оказывает супрессивное действие на иммунную систему: опухолевый процесс (особенно, В- и Т- клеточные гемобластозы), химиотерапевтические агенты и кортикостероиды. Вероятно, совокупность факторов позволяет опухоли уклоняться от иммунного надзора. При этом неконтролируемая пролиферация может наблюдаться даже для иммунокомпетентных клеток — Т- и В-лимфоцитов, что характерно для лейкозов и лимфом.

Опухолевые клетки обладают способностью вырабатывать разнообразные иммуномодуляторы. Можно только предполагать, что иммуносупрессорные факторы подавляют иммунный ответ организма хозяина против опухоли, тогда как иммуностимулирующие факторы способствуют опухолевой прогрессии и формируют анергию Т-клеток. Эти данные о факторах, которые синтезируются опухолью, важно учитывать при разработке подходов к лечению иммунодефицитных состояний в организме-опухоленосителе.

Иммуносупрессия на фоне проводимого лечения

При лечении злокачественных новообразований супрессивное действие на иммунную систему больных оказывают множество факторов, включая сам опухолевый процесс, химиотерапевтические препараты и кортикостероиды, что приводит к развитию иммунологических нарушений [133]. Хирургическое удаление опухоли проходит на фоне анестезии, которая, наряду с операционной травмой, вызывает супрессию клеточного звена иммунитета продолжительностью до 3 недель [72]. Радиотерапия также вызывает супрессию клеточного звена иммунитета, которая выражается в прогрессивном снижении С04>СБ8 Т-клеток, которое не восстанавливается даже в течение месяца наблюдения [220]. В связи с вышесказанным данной категории больных может быть показана иммунокорригирующая терапия [102, 121, 123, 142].

Многие химиотерапевтические агенты обладают миелосупрессивным действием, ингибируя продукцию форменных элементов крови в костном мозге. Иммунодепрессия проявляется ослаблением иммунного ответа из-за уменьшения количества В- и Т — лимфоцитов, а также снижением содержания отдельных субпопуляций лимфоцитов даже при нормальном абсолютном количестве лимфоидных клеток. На фоне индуцированной химиопрепаратами иммуносупрессии происходит истощение Т-лимфоцитов [83, 84]. Химиотерапия, несмотря на использование стандартных схем, является все же индивидуальным методом лечения. Каждое последующее введение цитостатика осуществляется с учетом реакции пациента на предыдущее введение. Реакция иммунной системы больных на химиотерапию является во многом индивидуальной. В экспериментах на животных было показано, что увеличение продолжительности жизни после химитерапии наблюдается только в том случае, если химиотерапия отменяет опухоль-ассоциированную иммуносупрессию [145].

Химиотерапия - «обоюдоострый меч», вызывающий наряду с цитостатической эффективностью выраженные иммунодепрессивные эффекты [191]. Исследования показали, что химиотерапевтические препараты подавляют пролиферативную активность лимфоцитов, и этот эффект имеет дозозависимый характер. Многие химиотерапевтические агенты обладают миелосупрессивным действием, ингибируя продукцию клеток крови костного мозга и тромбоцитов и приводя к абсолютному снижению числа форменных элементов крови. Эффект миелосупрессии, вызванный химиотерапией, проявляется нейтропенией, которая у онкологических больных является одной из причин развития бактериальной инфекции [133] [47].

После химиотерапии наблюдается выраженное истощение В-лимфоцитов и, как следствие, снижение уровней иммуноглобулинов [133, 134]. Одна из главных особенностей индуцированной химиотерапией иммунодепрессии - длительное угнетение Т-клеточного звена. Было показано, что снижение CD4+ Т клеток отмечалось в течение 5 лет после химиотерапии [37].

При действии цитостатиков CD8+ Т-лифоциты восстанавливаются с помощью тимус-независимого механизма значительно быстрее, чем CD4+ Т клетки, хотя количество СБ8+Т-клеток после химиотерапии существенно снижается [135]. Относительно быстрое увеличение в периферической крови СБ8+Т-клеток после химиотерапии, возможно, не восстанавливает нормальную функцию этого типа клеток [133, 134]. Большая часть восстановленных CDS+T-клеток имеет тенденцию к снижению экспрессии ко-стимулирующих молекул CD28. Экспрессия CD28 на CD8+Т-клетках не восстанавливается в течение года после прекращения химиотерапии. Для объяснения иммунодепрессивного эффекта химиотерапевтических агентов были предложены два механизма. Первый - классический миелотоксический эффект цитостатических препаратов на гемопоэтические клетки-предшественники костного мозга. Также было показано, что тимоциты и активированные лимфоциты подвергаются апоптозу при воздействии цитостатиков [183]. Следовательно, второй механизм иммунодепрессии, вызванной цитостатиками, обусловлен гибелью не только клеток-предшественников, но и разрушением зрелых форм лимфоцитов.

Вследствие химиотерапии отмечается тенденция к снижению количества НК и их цитостатической активности, хотя восстановление

НК происходит быстрее, чем других подтипов лимфоцитов - их цитостатическая активность восстанавливается относительно быстро [43, 153, 159], [132], [211] [28, 159] [39]. НК оказывают противоопухолевое действие, и восстановление их киллерных свойств может оказывать влияние на течение опухолевого процесса [79, 228], [225], [50].

Таким образом, за развитие иммунодефицитных состояний могут быть ответственны не только различные субопуляции Т-клеток и В-клеток, но и биологически активные вещества, оказывающие влияние на клетки иммунной системы; даже клетки соединительной ткани, хемокины и рецепторы к ним также могут обуславливать развитие патологического иммунного ответа.

Коррекция XT-индуцированной иммуносупрессии

Поскольку интенсивные химиотерапевтические режимы могут вызвать глубокую иммунодепрессию, необходимы терапевтические стратегии, направленные на восстановления функции иммунной системы. В настоящее время иммунотерапия опухолей применяется в клинике в сочетании с другими способами лечения, а также широко проводятся экспериментальные исследования в этом направлении. Однако стандартные режимы, направленные на коррекцию опухоль-ассоциированной иммуносупрессии, до настоящего времени не разработаны.

Подходов к иммунотерапии опухоль-ассоциированной иммуносупрессии существует много. Основными являются следующие: применение ИЛ-2, ИЛ-7, JIAK-терапии, трансфекция генов ГКГС, цитокинов, применение гормонов тимуса и других иммуномодуляторов, применение гуманизированных моноклональных антител, плазмофорез, использование активированных дендритных клеток, генно-инженерных методов, методов переключения ответа с ТН2 на ТН1 тип. Одним из наиболее перспективных и наиболее современных способов иммунотерапии опухолей является воздействие на систему врожденного иммунитета с помощью агонистов и антагонистов ТПР.

В существующих подходах применяются различные цитокины, чаще всего — колоние-стимулирующие факторы GM-CSF и G-CSF, сокращающие длительность нейтропении, но при этом не влияющие на продолжительность жизни больных [26, 161]. Клинические рекомендации Американского общества клинических онкологов по применению колоние-стимулирующих факторов, основанные на клинических исследованиях, показывают, что эти цитокины стимулируют нейтропоэз [119].

Исследования продемонстрировали положительное действие цитокинов, используемое для коррекции нарушений иммунной системы: сочетание ИЛ-2 с G-CSF не только нормализовывает число нейтрофилов, но и повышает количество и активность эффекторов противоопухолевого иммунитета — НК и Т-лимфоцитов [195].

Продолжаются попытки по применению ИЛ-2 у онкологических больных для коррекции клеточного иммунитета. В настоящее время с этой целью используются рекомбинантный ИЛ-2. В частности, высокодозная терапия этим цитокином дает 20% ремиссий у больных раком почки и меланомой [59]. Терапия ИЛ-2 помогает преодолевать in vivo анергию Т-клеток для их воздействия на опухоль-ассоцированные лимфоциты. Возможно, перспективными окажутся работы с использованием ИЛ-7. Введение этого цитокина активирует Т-лимфопоэз у экспериментальных животных и человека [127] [113] [96], [95], [136] .

Онкологическая иммунология указывает на перспективность использования Т-клеточно-опосредованной цитотоксичности и реакции кожной гиперчувствительности замедленного типа для оценки устойчивости организма хозяина против опухоли [46], [48, 103, 104, 226]. В настоящее время изучают механизмы переключения ТН1-ТН2 типов иммунного ответа, как ключевого звена противоопухолевого иммунитета [56, 154]. Иммунный ответ по ТН1 типу является необходимым для развития гиперчувствительности против опухоли. При этом типе иммунного ответа в качестве промоторов выступают ИЛ-12, ИЛ-2 и ИФН-у, а антагонистами являются ИЛ-4 и ИЛ-10, продуцируемые ТН2 клетками. Активация Т-клеток является необходимой для появления опухоль-чувствительных Т-клеток (С08+ цитолитических Т-клеток), с участием молекул МНС I типа на поверхности антиген презентирующих клеток и других ко-стимулирующих молекул. В этом случае ТН1 клетки являются триггерами для запуска эффекторных реакций.

Усилить цитотоксичность опухоль-ассоциированных лимфоцитов можно с помощью ИЛ-2. ИЛ-2 усиливает пролиферацию опухоль-ассоциированных лимфоцитов, которые получили название ЛАК-клетки (лимфокин активированные клетки). ЛАК клетки обладают гораздо более высокой эффективностью против как ауто-, так и гетерологичных опухолевых клеток. Появление такой противоопухолевой активности после стимуляции опухоль-ассоциированных лимфоцитов ИЛ-2 является одним из ярких примеров использования иммунокоррекции для лечения онкологических заболеваний. Этот пример является важным, так как исходно в эксперименте показано, что лимфоциты, которые получены от животных с опухолью и введены интактным мышам, ускоряют рост опухоли. Поэтому в случае ЛАК можно утверждать, что иммуномодуляторы могут помогать Т-клеткам преодолевать анергию, индуцированную опухолью. По мнению некоторых авторов, именно способность опухоли вызывать у Т-клеток анергию является основной причиной как самого опухоль-индуцированного иммунодефицита, так и причиной роста опухоли [227], [103].

Одним из подходов к повышению эффективности противоопухолевой терапии может служить расширение показаний для ЛАК терапии. В настоящее время ЛАК терапия используется только на фоне распространенного опухолевого процесса. Эффект от цитолитической активности в данных условиях весьма скромный, так как невозможно добиться в этих условиях оптимального соотношения клетка-эффектор: опухолевая клетка как 5:1. Если проводить ЛАК терапию после массивного циторедуктивного лечения, когда зачастую остаточное опухолевое образование вообще не определяется, то такое эффективное соотношение между клетками эффекторами и опухолевыми клетками достижимо. Определенный интерес представляет иммунотерапия, при которой ЛАК клетки применяются в комбинации с

ДК

Дендритные клетки (ДК) представляют собой профессиональные антиген представляющие клетки (АПК), обладающие уникальной способностью индуцировать первичный иммунный ответ [163]. ДК играют важную роль в инициации и регулировке иммунных реакций, направленных против вирусов, бактерий и других патогенов. ДК могут созревать в присутствие бактериальных факторов, в частности ЛПС, и способны активировать НК - ведущие эффекторы врожденного противоопухолевого и противовирусного иммунитета [89] [181]. [164]. Таким образом, разработка и внедрение в клиническую практику противоопухолевых вакцин на основе дендритных клеток можно считать перспективным.

Для изготовления противоопухолевой вакцины инкубируют незрелые ДК с опухолевыми антигенами в присутствии факторов, ведущих к созреванию ДК [76]. Исследование на мышах показало, что лишь иммунизация полностью зрелыми ДК, нагруженными опухолевым антигеном, эффективно защищает при заражении низкоиммуногенной опухолью.

Было показано, что введение мышам незрелых ДК, нагруженных антигеном, не только не вызывает эффективного иммунного ответа, а наоборот способствует подавлению или препятствует развитию иммунного ответа [66]. Предполагается, что данный подход может оказаться перспективным направлением лечения аутоиммунных заболеваний и предотвращения отторжения трансплантированных органов.

Использование ДК для лечения онкологических заболеваний стало особо привлекательным после обнаружения ряда опухоль ассоциированных антигенов (ОАА) [166]. К ОАА следует отнести, во-первых, антигены онкогенных вирусов (карцинома печени - вирусы гепатита В и С, рак шейки матки - вирус папилломы, лимфома Беркитта - вирус Эпштейна-Барр), во-вторых, измененные белки, возникшие в результате соматических мутаций, в-третьих, не экспрессируемые в соматических тканях взрослого организма антигены (а-фетопротеин, теломераза), в-четвертых, нормальные антигены, гиперэкспессируемые опухолью (антигены меланомы и рака простаты). В настоящее время считается, что многие опухоли экспрессируют антигены, в той или иной степени распознаваемые иммунной системой [92]. ДК, обработанные опухолевым антигеном в присутствии факторов, повышающих его иммуногенность, например, ФНО-а; ИЛ-1[3; CD40L; ЛПС, способны эффективно презентировать антиген и вызывать развитие Т-клеточного иммунного ответа на него, что было показано in vitro, в экспериментах на животных и в опытах на здоровых добровольцах [158].

Предполагалось, что опухоли в своей основной массе теряют детерминанты I и II класса главного комплекса гистосовместимости МНС [177], [42], [144], [59], [210]. Потеря детерминант I класса автоматически делала невозможным генерирование МНС-зависимых цитолитических Т-клеток и их активацию [209]. Несмотря на потерю или низкий уровень детерминант I класса гистосовместимости, Т-клеточный цитотоксический ответ для аутологичных опухолей был показан для плоскоклеточного рака головы и шеи и аденокарциномы молочной железы. В лимфатических узлах онкологических больных обычно наблюдается интрасинусоидальное накопление крупных гистиоцитов. Такое явление получило название «синусная гиперплазия» или «синусный гистиоцитоз». Было показано, что синусные гистиоциты нагружены опухолевым антигеном. Эффективная иммунотерапия приводит к исчезновению данного явления. Эти клетки при этом не могут функционировать как антиген презентирующие клетки [220]. Были предприняты попытки, используя ДК, пульсированные пептидами мембранного антигена рака простаты, провести иммунотерапию пациентов. Подобная иммунотерапия оказалась эффективной у 15% больных [[208]]. Использование для усиления презентации антигена белков теплового шока принципиально не увеличило эффективность дендритных вакцин [[198]].

К данному моменту времени был проведен ряд клинических испытаний противоопухолевых вакцин на основе ДК. В ряде случаев наблюдался положительный клинический эффект. Это обнадеживает, так как испытания проводились исключительно на больных с распространенной формой заболевания после неудачного использования традиционных методов терапии. Очевидно, гораздо более эффективным данный способ лечения может оказаться для продления безрецидивного периода жизни онкологических больных после максимальной циторедукции хирургическим путем и/или при помощи химиотерапии [111] [213].

Другим подходом к терапии опухолей на основе активации системы врожденного иммунитета служит использование агонистов и антагонистов ТПР. Интересным фактом являются накопленные в последние годы данные, согласно которым активация различных ТПР по разному воздействует на опухолевый рост. Этим объясняется предположение о перспективе применения в онкологии как агонистов, так и антагонистов ТПР.

Лиганды ТПРЗ, а также моноклональные антитела или их фрагменты к ТПР-3 индуцируют продукцию интерферонов I типа [67] [63]. Лиганды этого рецептора эффективны преимущественно при опухолях с повышенной экспрессией ТПРЗ. Активация ТПР5 приводит к генерации антиген-представляющих клеток (дендритных и моноцитов), т.к. на этих клеточных популяциях в основном экспрессируется ТПР5. Причем установлено, что активация ТПР5 его лигандом флагелином индуцирует синтез ИЛ-12 при поддержании продукции ИЛ-10 (супрессорного цитокина) на низком уровне. Важное наблюдение сделано в последние годы, а именно - лиганд ТПР5 не меняет радиорезистентность опухолей у мышей и защищает нормальные клетки против облучения [222].

Главной характерной особенностью активаторов ТПР7 и ТПР8 является их преимущественная локализация на популяции эффекторов врожденного иммунитета - Ту8 клетках, а также усиление эффективности иммунизации микобактериальным антигеном, который применяется для терапии НРУ-ассоциированных болезней, включая онкологические [193].

ТПР9 расположены преимущественно на ДК. Было высказано предположение, что применение Срв олигодеоксинуклеатида (лиганда ТПР9) и антагониста ИЛ-10 окажется перспективным методом терапии рака [61]. На некоторых опухолевых моделях установлено влияние полиморфизма генов ТПР2 и ТПР4 на развитие и прогрессирование опухолей, следовательно, воздействие на ТПР2 и ТПР4 у онкологических больных может иметь неоднозначный эффект [233] [30]. Мутации нуклеиновых кислот и аномальная экспрессия ТПР4 может привести к невосприимчивости лечения такими агонистами ТПР2 и ТПР4 как БЦЖ [212] [176].

При воспалительных процессах, связанных с метаплазией эпителия кишечника, отмечается гиперэкспрессия ТПР 4. Активация ТПР-4 может вызвать увеличение продукции факторов, повышающих риск развития злокачественных новообразований: простагландина Е, активацию эпидермального фактора роста и циклооксигеназы-2 [155].

Было показано, что ЛПС способствует ускорению метастазирования колоректального рака, вызывая повышение адгезионных свойств и способности к инвазии опухолевых клеток за счет изменения экстрацеллюлярного матрикса [120]. Была продемонстрирована возможность гибели злокачественно трансформированных клеток в присутствии интерферона, способного индуцировать апоптоз при действии эндогенных факторов, например,

ТПР 3 на клетках рака простаты человека и ТПР 4 на клетках рака молочной железы [112, 141, 165]. Определение экспрессии генов ТПР для определения того, какой использовать модификатор ЕДК - агонист или антагонист - является перспективным [234].

Одним из перспективных кандидатов для применения в качестве иммунокоррегирующего средства при индуцированных цитостатиками иммунодефицитах может рассматриваться отечественная терапевтическая вакцина ВП-4. ВП-4 оказывает стимулирующее действие на клеточное звено иммунитета и обладает противоинфекционной, противоопухолевой и антиметастатической активностью у мышей [3], [2], [14]. ВП-4 содержит комплекс лигандов толл-подобных рецепторов, посредством которых вакцина оказывает нормализующее влияние на показатели состояния врожденного иммунитета. Такое сочетание свойств представляется оптимальным для иммунотерапии и иммунокоррекции онкологических больных после длительных курсов химиотерапии и комбинированных видов противоопухолевого лечения.

Параллельно с клиническими работами по иммунотерапии опухолей были проведены экспериментальные исследования по увеличению эффективности иммунотерапии опухолей. Такие исследования являются особо ценными, так как они позволяют реально оценить правомерность многих теоретических предположений. Трансфекция генов главного комплекса гистосовместимости, цитокинов и различных костимулирующих молекул с последующим лечением развивающихся опухолей дает интересные результаты [[196], [143], [91]]. Цитокин трансфектированные опухоли в экспериментальных животных подвергаются регрессии, тогда как исходные штаммы - нет. Эти результаты инициировали работы по трансфекции ex vivo опухолей человека, чтобы затем их использовать для иммунотерапии [35, 71]. Отдаленные клинические результаты показали низкую эффективность всех этих подходов.

В клинике были проведены исследования по использованию гормонов тимуса для восстановления клеточного иммунитета. В частности, изучены тимостимулин (Тр-1) и тимозин фракции V или al [101] [44]. Предклинические исследования показали влияние этих препаратов на некоторые функции Т-клеток in vitro и на клеточный иммунный ответ in vivo в экспериментах на животных. Показана также модификация функций лимфоцитов in vitro, полученных от пациентов с плоскоклеточным раком органов дыхания.

Тимомиметики» левамизол и изопринозин могут также использоваться для усиления функциональной активности лимфоцитов и макрофагов in vitro и in vivo [[ЮЗ]]. Так, левомизол отменяет анергию лимфоцитов, выделенных от онкологических больных, к динитрохлорбензолу. Комбинация левомизола с 5-фторурацилом достоверно увеличивает выживаемость у пациентов раком толстого кишки Duke's "С" стадии [[118]]. Изопринозин имеет ограниченное применение в онкологии, которое используется для стабилизации ремиссии [[25]]. Метилинозинмонофосфат, также являющийся «тимомиметиком», in vitro в низких дозах отменяет супрессивное действие Т-лимфоцитов, вызванное простагландинами и пептидами ретровируса Р15Е. В системе in vivo этот препарат увеличивает продолжительность жизни мышей с экспериментальными опухолями [103]. Исследователи считают, что данный препарат будет эффективным в адъювантной терапии.

Отменить супрессивное действие факторов, секретируемых опухолью: CTLA-4, ТФР-Р или Р15Е - можно также с помощью гуманизированных моноклональных антител [[25], [62]]. Плазмофорез отменяет иммуносупрессивное действие комплексов антиген-антитело, удаляя их из сыворотки крови онкологических больных. Повысить эффективность удаления этого комплекса можно также при использовании сорбционных колонок с протеином А стафилококка. У больных после проведения экстракорпоральных методов детоксикации с использованием таких колонок отмечается субъективное и объективное улучшение.

Ранее уже упоминалось об иммуносупрессивном действии простагландинов на иммунную систему онкологических больных. Поэтому использование нестероидных противовоспалительных препаратов (индометацина) должно отменять такое супрессивное действие.

Низкие дозы ЦФ, которые не обладают иммуносупрессивным, миелосупрессивным и тумороцидным действием, также могут быть использованы для усиления клеточного иммунитета [45]. Таким же действием на клеточный иммунитет обладают препараты цинка [104] [98], [185].

Из данных литературы видно, что множество препаратов с различными механизмами действия способны улучшать клеточное звено иммунитета. Поэтому вполне логичным можно считать направление, в котором используют комбинации нескольких препаратов для отмены опухоль-индуцированной иммуносупрессии.

Экспериментальные модели оценки иммуномодулирующих средств

С целью создания эффективных средств коррекции иммунодефицитов, ассоциированных с новообразованиями или с противоопухолевым лечением, а также для терапии иммунологической недостаточности любого другого происхождения разрабатываются экспериментальные модели иммунодепрессивных состояний.

Для изучения свойств иммуномодулирующих средств разрабатываются и применяются иммунодепрессанты и генетически иммунодефицитные животные. Возросшие в последнее время технологические и методологические возможности позволяют конкретизировать поражение не только отдельных звеньев иммунитета, но определять поражение субпопуляций клеток. Так, например, были открыты Т-регуляторные клетки, которые могут создавать состояние специфической иммунологической толерантности не только для «своих», но даже для чужеродных антигенов. Это позволяет разрабатывать средства для этиотропного воздействия и повышения эффективности проводимой терапии. В ряде исследований показано, что иммуномодуляторы различной природы способны восстанавливать количественный и супопуляционный состав лимфоидных клеток после действия цитостатиков [68].

Существуют различные подходы к созданию иммуносупрессорных состояний у мышей. Наиболее распространенные иммунодепрессанты - это кортикостероиды и алкилирующие агенты, в некоторых случаях применяют ионизирующие излучения. Известно, что большие дозы глюкокортикоидов могут вызывать в организме экспериментальных животных развитие иммунологической депрессии, проявляющейся рядом эффектов: угнетением моноцитарно-макрофагальной системы, снижением массы и клеточности тимуса, селезенки, лимфатических узлов и костного мозга [17, 18, 81, 82]. Применение лекарственных препаратов, вызывающих иммуносупрессию, связано с воздействием на целый ряд тканей, которые не являются мишенью для действия иммуносупрессантов. Такое воздействие нарушает хрупкое равновесие организма с возбудителями заболеваний и оказывает влияние на механизмы их взаимодействия. Таким образом, необходимо представлять изменения, происходящие в организме в ответ на введение этих препаратов для адекватной оценки их воздействия на иммунную систему и ее возможности к адаптации [114].

Цитостатики могут оказывать разнонаправленное влияние на иммунную систему и продукцию иммунокомпетентными клетками цитокинов [51], [131], [190], [199]. Некоторые химиотерапевтические агенты, в частности, ЦФ в малых дозах, способны вызывать иммуностимулирующее действие [51], [140], [151], [160]. Этот эффект объясняется способностью цитостатиков избирательно ингибировать супрессорную популяцию Т-регуляторных клеток, что, в свою очередь, приводит к активации Thl лимфоцитов и усилению продукции противовоспалительных цитокинов, например, ИФН-у [51], [151]. Другие исследователи обращают внимание на угнетение синтеза и секреции цитокинов под действием цитостатиков в терапевтических режимах [199].

ЦФ - химиотерапевтический алкилирующий агент, применяемый при лечении онкологических и аутоиммунных заболеваний [34, 52]. ЦФ наиболее часто используется для получения иммуносупрессии у мышей [16]. В работах на животных были показаны изменения, происходящие в клеточном звене иммунного ответа в ответ на введение ЦФ. ЦФ угнетает иммунологическую реактивность за счет влияния на клетки-предшественники [7]. У животных отмечается дозозависимое снижение клеточной пролиферации лимфоцитов in vitro и снижение ответа на туберкулин по сравнению с животными, не получавшими лечение ЦФ.

Выраженность повреждающего действия ЦФ на лимфоидную и миелоидную ткани зависит от режима и дозы введения препарата. Изменения происходят как в лимфатических узлах и селезенке, так и в циркулирующей популяции лимфоцитов. Среди эффектов ЦФ - резкое снижение костно-мозговых Т-клеток вплоть до 10 суток [9], снижение количества незрелых миелоидных и эритроидных элементов [10]. В процессе репарации костно-мозгового кроветворения происходит ускорение созревания гемопоэтических предшественников [8], [6]. Пролиферация в ответ на введение фитогемагглютинина и конкавалина подавляется незначительно. При введении ЦФ в дозе порядка 200 мг/кг в течение более 2 дней отмечается развитие нейтропении [34, 38].

Миело- и лимфосупрессивный эффект ЦФ был описан еще в середине 60-х годов [77, 78] [152]. Супрессивное действие ЦФ проявляется в терапевтических дозах, которые для мышей составляют более 10 мг/кг веса тела животных, а для человека более 5 мг/кг. ЦФ уже в дозе 20 мг/кг вызывает уменьшение числа спленоцитов у мышей. При этом количество Т-клеток уменьшается на 50% процентов. Высокодозная химиотерапия в максимально переносимых дозах вызывает резкое снижение количества Т-лимфоцитов до 90% [151]. В малых дозах алкилирующие химиотерапевтические агенты способны оказывать иммуномостимулирующее действие за счёт угнетения Т-супрессорной субпопуляции [151]. ЦФ при ежедневном введении в течение 7 дней по 20 мг/кг вызывает снижение пролиферативной активности спленоцитов [172].

В исследованиях на мышах для создания иммунодефицитных состояний применяется, в том числе ЦФ в дозе 50 мг/кг массы тела [204]. Исследовалась эффективность введения полисахаридов в качестве иммуностимуляторов у мышей с иммунодефицитом, вызванным ЦФ. В качестве маркеров оценивалась фагоцитарная активность, стимулированная пролиферация Т-клеток, усиление гемолиза и реакция гиперчувствительности замедленного типа в ответ на динитрофторбензол [65].

Также исследовали эффективность введения лактоферрина в качестве стимулятора иммунитета у мышей, леченых ЦФ. Было выявлено, что лактоферин не оказывает действия на количество клеток или их состав, но ускоряет процесс восстановления лимфопоэза и миелопоэза [34]. Для стимуляции лимфопоэза и миелопоэза применяют гормоны тимуса, цитокины, вещества с низкой молекулярной массой [33].

На фоне применения ЦФ у мышей со спонтанным развитием сахарного диабета 1 типа отмечается поражение Т регуляторных клеток СБ4+СВ25+РохрЗ+, у них снижается супрессивная активность и увеличивается экспрессия маркеров апоптоза [52]. Показано, что нафталан увеличивает количество и функциональную активность макрофагов у белых мышей с индуцированным ЦФ иммунодефицитом [15]. Тимозин а также изучали на мышах с иммунодефицитом, индуцированным введением ЦФ. Введение тимозина а статистически значимо увеличивает уровень С08+, при оценке уровеня ФНО-а, интерферона у, интерлейкина 2, интрелейкина 6 и интерлейкина 10 статистически значимых различий не выявлено [64].

Миелосупрессорное состояние у мышей для изучения действия иммуномодуляторов можно вызвать введением ЦФ и гидрокортизона в дозах 160 мг/кг и 40 мг/кг массы тела животных. Гидрокортизон до 21 суток от начала наблюдения вызывает снижение общего количества ядросодержащих клеток костного мозга. Однократное подкожное введение полиоксидония в дозе 40 мг/кг массы тела животных через 10 суток после введения гормона достоверно ускоряет восстановление количества ядросодержащих клеток костного мозга мышей. Внутрибрюшинное введение ЦФ приводит к развитию гипоплазии костного мозга. Однократное введение полиоксидония на 3 сутки после введения цитостатика значительно ускоряет регенерацию лимфоцитарного, эритроцитарного и гранулоцитарного ростков костномозгового кроветворения [21].

Изучение морфофункциональных особенностей тучных клеток на фоне иммуносупрессии, вызванной ЦФ, показало, что у мышей отмечается более выраженная и более длительная супрессия морфофункционального статуса тучных клеток и естественных факторов защиты при инфицировании стафилококком [13].

Иммуномодуляторы различной природы оказывают стимулирующее влияние на продукцию цитокинов иммунокомпетентными клетками как в монорежиме, так и в сочетании с введением цитостатиков [3], [14], [68], [190]. По мнению некоторых авторов, именно цитокины являются связующим звеном между врождённым и адаптивным противоопухолевым иммунитетом [43], [84].

ЦФ индуцированный иммунодефицит является простой и воспроизводимой моделью, которая позволяет изучить воздействие на различные звенья иммунного ответа, оценить активность иммуномодуляторов. Учитывая противоречия, неоднозначность трактовки накопленных данных, а также новые взгляды на роль отдельных субпопуляций лимфоцитов и цитокинов, эта классическая модель иммуносупресии требует детального описания с целью выявления наиболее значимых критериев нарушения функции иммунитета. Представление полной картины изменений, происходящих у лабораторных животных на фоне введения ЦФ, позволит охарактеризовать эффективность иммуномодуляторов и их перспективность для коррекции изменений иммунного ответа у больных с индуцированными специфическим лечением нарушениями.

В настоящее время широко исследуется влияние различных веществ на функцию иммунной системы; на основании полученных данных разрабатываются методики иммуносупрессивной или иммуностимулирующей терапии [73] [123] [102, 169] [31, 121, 142, 150, 187, 231, 236, 238] [202, 216] [85, 105].

Одновременный метаболизм веществ в организме

Говоря о применении одного вещества для отмены нежелательных побочных эффектов другого препарата, не следует забывать о возможности появления новых терапевтических эффектов комбинации этих препаратов. Такие терапевтические эффекты могут проявляться вследствие взаимного влияния веществ на метаболизм друг друга.

Любое вещество, которое попадает в организм, подвергается метаболическим превращениям. Общую стратегию метаболизма ксенобиотиков можно определить следующим образом - превратить соединение в более гидрофильное, которое бы было просто вывести из организма с биологическими жидкостями. Такая стратегия эффективна, но имеет серьезные изъяны. Первый изъян заключается в том, что может возникать ситуация, когда метаболическим превращениям должны подвергаться сразу несколько ксенобиотиков. В этом случае один ксенобиотик может резко нарушать выведение другого. Результатом нарушения такого выведения может явиться увеличение биологической активности вещества. Чтобы продемонстрировать, как сильно может меняться биологическая активность вещества, приведем пример сочетанного применения препарата клофелина и алкоголя. От обычной терапевтической дозы человек может потерять сознание и даже погибнуть. Второй изъян такой стратегии метаболизма - при окислении (для увеличения гидрофильности) ксенобиотиков последние могут приобретать новую биологическую активность, в частности, цитотоксическую и канцерогенную. Более детальный анализ взаимного влияния ксенобиотиков на их фармакологическую активность проведен в диссертационной работе Т.А.Богуш [4].

ЦФ - это алкилирующий противоопухолевый препарат, который очень эффективен для лечения онкологических, аутоиммунных заболеваний. Вот уже более 50 лет он является одним из наиболее часто используемых препаратов. Главной особенностью ЦФ является то, что исходный препарат не обладает фармакологической активностью. Фармакологической активностью обладают только реактивные метаболиты, которые образуются при его метаболической активации в печени под действием монооксигеназ. Поэтому при нарушении метаболической активации (заболевания печени и т.д.) ЦФ теряет свою фармакологическую активность. Эти же реактивные метаболиты ЦФ опосредуют и его токсическое действие. Поэтому токсическое и противоопухолевое действие ЦФ тесно связано между собой.

В клинической практике наиболее изучен микросомальный метаболизм ЦФ: выделены и идентифицированы его реактивные метаболиты и продукты детоксикации. Для ЦФ, а также продуктов его метаболизма изучена фармакокинетика, в том числе у онкологических больных. Общую схему метаболизма ЦФ в организме можно представить следующим образом (рис.1). Цитотоксическая и алкилирующая активность ЦФ появляются под действием монооксигеназ в печени [29] [94]. На первом этапе происходит окисление гетероциклического кольца с образованием 4-оксиЦФ и альдофосфамида, который может спонтанно разлагаться с образованием высокореактивного акролеина и фосфамидиприта. При ферментативном окислении оксициклофосфана и альдофосфамида под действием альдегиддегидрогеназы, альдегидоксидазы и алкогольдегидрогеназы образуются кетоциклофосфан и карбоксифосфамид, не обладающие противоопухолевой активностью и являющиеся продуктами детоксикации.

При неферментативном разложении неактивного карбоксифосфамида образуется нороазоиприт, обладающий высокой алкилирующей активностью и высокой токсичностью, но не обладающий противоопухолевым эффектом.

В литературе описано, что микросомальные ферменты печени и НАДФН увеличивают токсический противоопухолевый эффект ЦФ. Важно помнить о многообразии ферментативных систем организма, в связи с чем совместный метаболизм препаратов может значительно изменять их первоначальный эффект, вызывая изменение активности (увеличение токсичности, снижение клинического эффекта, усиление клинической эффективности, появление новых форм токсичности). аснгснг о/*^

А сн? н о-снг о] сснгс. н

СМхоюШЫф» Н аснгснг о м- сн2 сюнгснг о снг

СусйфЫмрЬапшй

КЯ н он сенгснг о^-сн м СН2 сюнгснг о- сн2

Н ООН сюнгснг о,м СЮН2СН2 о-сн2 Р сюнгснг о," с

N Р снг сюнгснг о снг

Д-КйосусЯорЬсирЬшпмЬ аснгснг о,мн

НР аснгснг аг а^-ас: сюнгснг 0 N н р сюнгснг н о-- р сюнгснг о-снгснгс'^ 0""*0»"*" сюнгснг о сн^н^

АМорЫлр^игчде

СагЬохурЬоврНатк!«

ОН

Рисунок 1. Активация ЦФ под действием ферментов печени

Поэтому ЦФ можно рассматривать как своеобразный индикатор взаимных метаболических превращений ксенобиотиков. Приведем один из примеров того, как метаболические превращения ЦФ могут сопровождаться увеличением его фармакологической активности. В 80-х годах прошлого столетия была очень популярна гипотеза, что опухоль -это ловушка глюкозы [23]. В экспериментальной и клинической онкологии возникло направление, утверждающее, что при искусственной гипергликемии опухолевый узел будет закисляться. Закисление клетки будет нарушать в ней репарационные процессы. Отсюда исследователи делали вывод о необходимости проведения химиотерапии на фоне искусственной гипергликемии. Данная гипотеза полностью игнорировала метаболизм препаратов в организме. Действительно, комбинация искусственной гипергликемии и ЦФ сопровождалась выраженным увеличением противоопухолевой активности цитостатика. По новому направлению в клинической онкологии в НИИ онкологии и медицинской радиологии было проведено широкомасштабное клиническое испытание на 488 больных -была изучена фармакокинетика ЦФ на фоне искусственной гипергликемии. Гипергликемия блокирует разрушение реактивных метаболитов ЦФ, и все эффекты по увеличению противоопухолевой активности ЦФ объясняются не закислением опухолевых клеток в результате гипергликемии, а изменением фармакокинетики ЦФ [1] [12, 22]. Меньшая доза ЦФ на фоне изменения фармакокинетики вызывала токсическое и, следовательно, лечебное действие цитостатика. А поскольку в терапевтических схемах химиотерапии доза цитостатиков жестко регламентирована, то использование данной комбинации в клинической практике было смертельно опасно для пациентов.

Таким образом, изменение фармакологического действия ЦФ при его совместном применении с другими препаратами указывает на нарушение метаболизма ЦФ. Нарушение метаболизма ЦФ сопровождается изменением его лечебного и токсического действия, что делает невозможным использованием этой комбинации без углубленного исследования фармакокинетики цитостатика в клинической практике.

Степень и характер влияния противоопухолевых цитостатических препаратов на гемопоэз во многом определяют возможности применения этих веществ в клинической практике. При изучении действия ЦФ был установлен его выраженный миело- и лимфосупрессивный эффект [5] [11] [137]. В то же время клетки-предшественники гранулоцитов менее подвержены действию ЦФ, чем эритроидные ядросодержащие клетки и клетки-предшественники лимфоцитов [186]. Установлено, что влияние ЦФ на иммунную систему зависит от концентрации препарата, а также от времени его введения относительно антигенной стимуляции. Наиболее чувствительны к ЦФ клетки на стадии пролиферации [55]. В последние годы было показано, что алкилирующие химиотерапевтические агенты в малых дозах способны оказывать иммуностимулирующее действие за счёт угнетения Т-супрессорной субпопуляции [151]. Напротив, в терапевтических концентрациях они способны угнетать иммунный ответ. В частности, ЦФ в дозе 20 мг/кг вызывает уменьшение числа спленоцитов у мышей [137]. При этом число Т-клеток снижается на 50%. Высокодозная химиотерапия (200 мг/кг) вызывает резкое уменьшение количества Т-лимфоцитов (на 90%) [151]. По данным литературы, ЦФ при ежедневном введении в течение 7-ми дней в дозировке 20 мг/кг вызывает снижение пролиферативной активности лимфоцитов селезёнки на такие митогены, как липополисахарид, конкавалин А и Pseudomonas aeruginosa [110] [172]. Показано также, что однократное введение ЦФ приводит к снижению числа лимфоцитов — особенно В-клеток, экспрессирующих В220. Кроме того, ЦФ вызывает снижение продукции иммуноглобулинов клетками Пейеровых бляшек [110]. Эти результаты, по мнению авторов, свидетельствуют о необходимости комбинации химиотерапии и иммунотерапии при лечении злокачественных новообразований. В ряде исследований показано, что иммуномодуляторы различной природы способны восстанавливать количественный и супопуляционный состав лимфоидных клеток после действия цитостатиков [151] [21, 68] [70].

При введении ЦФ наблюдается тимическая атрофия с уменьшением размеров органа и заметным обеднением долек, кроме того в тимусной паренхиме выявляются миелометапластические изменения, особенно в субкапсулярной и кортико-медуллярной зонах [146] [171]. В капсулярной зоне и в перегородках наблюдается истончение соединительнотканных элементов [146]. Среди клеток долек тимуса увеличивается число апоптозированных тимоцитов с фрагментированной ДНК. Такие тимоциты имеют высокий уровень экспрессии каспазо-активируемой ДНКазы [171]. Показано, что ЦФ вызывает практически полное истощение лимфоидных клеток в фолликулах бурсы Фабрициуса и значительное уменьшение её массы [194].

В первую очередь под действием ЦФ в фолликулах бурсы снижается число пиронинофильных клеток. Через 26 дней после введения ЦФ клеточный состав фолликулов бурсы полностью восстанавливается, но репопуляция кортикальной зоны в фолликулах бурсы имеет место только после мозговой зоны [194]. В настоящее время почти нет сведений о морфогистохимических характеристиках лимфоидных органов при проведении иммунокоррекции на фоне супрессивного действия цитостатиков. Использование результатов морфогистохимических исследований позволит расширить характеристику иммуномодулирующих эффектов, проявляющихся как на уровне центральных и периферических органов иммунной системы, так и субпопуляционного состава составляющих их и периферическую кровь лейкоцитов. Подобные исследования, наряду с изучением макроскопических изменений и клинико-патологическими данными, способствуют установлению иммуномодулирующего эффекта того или иного препарата непосредственно на иммунную систему.

2. Материалы и методы

5. Выводы

1. Разработана модель стойкой (7-10 дней) иммуносупрессии при трехкратном внутрибрюшинном введении ЦФ мышам в дозе 100 мг/кг с интервалом 72 часа с учетом фармакокинетики активных метаболитов ЦФ, морфологии органов иммуногенеза, состава форменных элементов периферической крови, продукции цитокинов, содержания основных субпопуляций лимфоцитов селезенки мышей и цитотоксической активности N К-клеток.

2. Фармакокинетика ЦФ при трехкратном введении по сравнению с однократным характеризуется снижением концентрации активных метаболитов ЦФ, увеличением времени достижения их максимальной концентрации с 10 до 15 мин, периода полуэлиминации с 11,3 до 15,1 мин и периода полного выведения из организма с 5 до 6 часов.

3. Показано, что при морфогистологическом исследовании органов иммуногенеза (красный костный мозг, тимус, селезенка) трехкратное введение ЦФ угнетает миело- и лимфопоэз, уменьшает количество молодых, зрелых и дифференцирующихся форм клеток, нарушает строму и сосудистую сеть органов с последующим неполным восстановлением в течение 120 часов преимущественно элементов стромы, а в периферической крови наблюдается выраженная лейкопения с 3 по 12 сутки при минимальном количестве лейкоцитов на 8-9 сутки (3,7-1,7)х103 в мм3, повышение содержания сегментоядерных лейкоцитов и отсутствие моноцитов.

4. Установлено, что при трехкратном введении ЦФ в сыворотке крови мышей существенно снижается уровень ИЛ-1|3, кратковременно уменьшается уровень ИЛ-12 и транзиторно повышается ИЛ-6 и ИНФ-у, уменьшается содержание Т- (СЭЗ+ ,СБ4+) и В клеток (С019+), Т регуляторных лимфоцитов (СБ4+/0)25+), ЫК

БХ5+) и снижается цитотоксическая активность натуральных киллеров.

5. ВП-4 восстанавливает нарушения, вызванные ЦФ в органах миело- и лимфопоэза, что проявляется в появлении молодых клеток, находящихся на различных стадиях дифференцировки, нормализации сосудистой сети кроветворных и лимфоидных органов, а в периферической крови повышением уровня лимфоцитов, моноцитов и появлением до 18% бластных форм клеток.

6. Установлено, что при введении ВП-4 на фоне индуцированной ЦФ иммуносупрессии, в сыворотке крови кратковременно снижается ИЛ-1повышается продукция ИЛ-6, ФНО-а, ИЛ-12, ИНФ-у, ИЛ-4, ИЛ-10 при снижении уровня супрессорного цитокина ТФР-Р, в селезёнке мышей повышается число СБ4+ Т-лимфоцитов с 17 до 28,4% и В-клеток с маркером СЭ19+ с 7 до 19%.

7. Комбинированное применение ВП-4 (200 мкг/мышь) и ЦФ (50-100 мг/кг) способствует усилению противоопухолевого действия цитостатика у мышей с плазмоцитомой МОРС-21, что проявляется в увеличении СПЖ животных с 25,4±0,7 до 40,0±0,9 суток и с 37,3±0,9 до 45,8±1,9 суток соответственно при 50 и 100мкг/кг ЦФ.

8. Введение ВП-4 на фоне индуцированной ЦФ иммуносупрессии позволяет корригировать иммунологические нарушения, обусловленные супрессивным действием цитостатика.