Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Влияние иммуномодулятора на механизмы регуляции клеточных реакций в очаге экспериментального воспаления

На правах рукописи

СЕРЕБРЕННИКОВА Светлана Николаевна

ВЛИЯНИЕ ИММУНОМОДУЛЯТОРА

НА МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ КЛЕТОЧНЫХ РЕАКЦИЙ В ОЧАГЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ВОСПАЛЕНИЯ

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 1 ОКТ 2012

Иркутск - 2012

005053027

005053027

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Иркутский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Семинский Игорь Жанович

Официальные оппоненты:

Бодиенкова Галина Михайловна доктор медицинских наук, профессор (Ангарский филиал Федерального государственного бюджетного учреждения «Восточно-Сибирский научный центр экологии человека» СО РАМН -Научно-исследовательский институт медицины труда и экологии человека, заведующая лабораторией иммунологии) Бенеманский Виктор Викторович доктор медицинских наук, профессор (Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ангарская государственная техническая академия», профессор кафедры экологии и безопасности жизнедеятельности человека)

Ведущая организация

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Томск).

Защита диссертации состоится 2012 г. в Ю00 часов на

заседании диссертационного совета Д 001.038.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Автореферат разослан ^_2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Шолохов Леонид Федорович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Воспаление является универсальной защитно-приспособительной реакцией, развивающейся в ответ на повреждение и относящейся к старейшим типам защитных реакций организма (Серов В.В., 1995; Куликова А.Н., 2007). Воспаление относится к адаптивным и индуктивным процессам, зависящим от суммы клеточных и гуморальных факторов, многие из которых продуцируются в ответ на действие воспалительных стимулов. Их образование требует активной работы клеток, которая проявляется в синтезе молекул, направленных на возбуждение, развитие и купирование воспалительной реакции (Маянский А.Н., 2007).

В последние годы особую актуальность приобретает изучение цитокинов -важнейших медиаторов воспалительного ответа, являющихся мощными про- и антивоспалительными агентами (Таджиханова Д.П., 2010; Liles W.C., Van Voorhis W.C., 1995), вовлеченными фактически во все этапы воспалительных и иммунных реакций (Симбирцев A.C., 2004; Калинина Н.М., 2005). Также контроль воспалительного ответа осуществляется эндокринной системой с помощью гормонов, оказывающих ингибирующее и стимулирующее действия (Добротина H.A., 2007). Воспаление сопровождается взаимосвязанным изменением профиля цитокинов и уровня синтеза гормонов. Цитокины, воздействуя на гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую ось, изменяют продукцию гормонов, оказывая влияние на защитные функции организма (Зайнутдинова Г.Х., 2011; Azmi A.S., Mohammad R.M., 2009).

Воспаление является основным звеном патогенеза большинства заболеваний. В неблагоприятных условиях воспалительный процесс может протекать атипично с тенденцией к хронизации (Майборода A.A., 2001; Семинский И.Ж., 2003). Прогностическое значение в протекании воспаления имеет уровень про- и противовоспалительных цитокинов, их соотношение отражает интенсивность, динамику и прогрессирование заболевания (Останин A.A., 2002; Родионова О.Н., 2011). В настоящее время активно исследуются методы воздействия на цитокиновый профиль с лечебной целью. Поэтому возникает необходимость сравнительного изучения разных форм воспаления и механизмов их регуляции с возможностью их патогенетической коррекции лекарственными препаратами.

Цель исследования: оценить интенсивность клеточных реакций и механизмы их регуляции под влиянием иммуномодулятора азоксимера бромида на модели асептического и микробного воспаления.

Задачи исследования:

1. Определить интенсивность клеточных реакций в очаге асептического воспаления с исследованием динамики провоспалительного (ИЛ-lß) и

противовоспалительного (ИЛ-10) интерлейкинов, кортикостерона и тироксина в плазме крови крыс.

2. Выявить особенности протекания клеточных фаз и изменения концентраций регуляторных цитокинов и гормонов в плазме крови животных при микробном воспалении.

3. Оценить нарушение баланса интерлейкина-1р, интерлейкина-10, кортикостерона, тироксина при хронизации воспалительного процесса.

4. Установить закономерности изменения клеточных реакций в очаге микробного воспаления под влиянием иммуномодулятора азоксимера бромида.

5. Исследовать изменение уровней интерлейкина-1 р, интерлейкина-10, кортикостерона, тироксина в плазме крови крыс при микробном воспалении с коррекцией азоксимера бромидом в сравнении с микробным без коррекции и асептическим воспалительными процессами.

Научная новизна работы

Впервые на унифицированной модели асептического и микробного воспаления у крыс при проведении комплексного изучения уровней интерлейкина-1Р, интерлейкина-10, кортикостерона, тироксина с выявлением закономерностей протекания регулируемых ими клеточных фаз воспалительного процесса установлены различия в содержании цитокинов и гормонов при разных формах воспаления. Выявлено, что асептический воспалительный процесс сопровождался разнонаправленными изменениями содержания интерлейкинов: по мере увеличения концентрации интерлейкина-1р, интерлейкин-10 убывал, и наоборот. Синтез кортикостерона находился в прямой зависимости с уровнем провоспалителыгого интерлейкина-1р.

Показано, что при микробном воспалении содержание цитокинов и гормонов резко отличалось от аналогичных показателей при асептическом воспалительном процессе. Выявлено, что увеличение и снижение концентраций интерлейкинов и кортикостерона в плазме крови животных были сочетанными, при этом уровень глюкокортикоида находился ниже показателей, полученных у интактных крыс, на протяжении всего периода исследований. Продолжительность клеточных реакций при этом значительно увеличивалась. Таким образом, впервые установлено, что дисбаланс цитокинов и гормонов, который регистрировался при микробном воспалении, приводил к хронизации процесса. Выявлены механизмы и точки приложения интерлейкинов и гормонов на клетки, реализующие воспалительный процесс.

Впервые применение азоксимера бромида в унифицированной модели микробного воспаления позволило проследить оптимизацию регуляторных механизмов клеточных реакций воспалительного процесса с определением их морфологических характеристик. Приоритетными являются данные о том, что микробное воспаление с коррекцией иммуномодулятором сопровождалось наиболее выраженным увеличением содержания противовоспалительных 4

интерлейкина-10 и кортикостерона в плазме крови крыс, по сравнению с асептическим и стафилококковым воспалением, повышение уровня интерлейкина-1 р было менее интенсивным, чем в серии с микробным воспалительным процессом. При этом максимум концентрации провоспалительного интерлейкина-1 р регистрировался через 1 сутки от начала воспаления, то есть был приближен к срокам его выработки при асептическом процессе. Длительность клеточных фаз микробного воспаления при использовании азоксимера бромида была сокращена по сравнению с микробным воспалением. Таким образом, установлено, что применение азоксимера бромида значительно улучшало течение микробного воспаления, препятствуя его хронизации.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты исследования дополняют знания врачей о патогенезе воспалительной реакции, в частности, конкретизируют представление о роли цитокинов и гормонов на этапах клеточных фаз воспаления. Полученные данные показывают, что дисбаланс цитокинов и гормонов является одним из механизмов хронизации воспаления.

Использование азоксимера бромида для коррекции микробного воспаления открыло новые аспекты клинического применения этого препарата в предупреждении хронизации воспалительного процесса.

Результаты проведенных исследований внедрены в учебный процесс кафедр факультетской терапии и фармакологии ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» Минзравсоцразвития России.

Положения, выносимые на защиту:

1. Асептическое воспаление у крыс сопровождается незначительным повышением провоспалительного интерлейкина- 1Р и кортикостерона с пиком концентраций на срок 12 часов и дальнейшим их снижением на фоне противоположных изменений в содержании противовоспалительного интерлейкина-10, что обеспечивает адекватную интенсивность клеточных реакций.

2. Микробное воспаление, вызванное золотистым стафилококком, характеризуется нарушением баланса про- и противовоспалительного цитокинов и гормонов, что способствует хронизации воспалительного процесса. Повышение и снижение уровней интерлейкинов происходят параллельно с максимумом значений через 2 суток от начала процесса, без преемственности, необходимой для адекватной регуляции воспалительного процесса. Значительное повышение содержания интерлейкина-1 р сопровождается двукратным увеличением уровня интерлейкина-10 на фоне угнетения синтеза кортикостерона.

3. Иммуномодулятор азоксимера бромид сокращает течение микробного воспаления, препятствуя его хронизации путем воздействия на регуляторные механизмы клеточных фаз, приближая их к показателям асептического процесса. Увеличение содержания провоспалительного интерлейкина- 1р через 1

5

сутки сопровождается двукратным повышением уровня кортикостерона. На фоне снижения интерлейкина-1р и кортикостерона противовоспалительный интерлейкин-10 возрастает в 4 раза через 2 суток процесса. Применение азок-симера бромида активирует противовоспалительные и оптимизирует провос-палительные регуляторные механизмы воспаления.

Апробация материалов диссертации

Основные положения работы доложены и обсуждены на проблемной комиссии «Общая патология, морфология, физиология» Иркутского государственного медицинского университета (2008, 2009, 2010), Центральной проблемной комиссии Иркутского государственного медицинского университета (2011), межкафедральной конференции Иркутского государственного медицинского университета (2012), X Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (2012).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 статей, в том числе 8 - в рецензируемых научных журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ.

Объем и струкггура диссертации

Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 44 рисунками и 11 таблицами. Библиографический справочник содержит 244 источника, из которых 155 на русском и 89 - на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Исследования проведены на 340 беспородных белых крысах-самцах массой 180-220 г в осенне-зимний период, полученных в виварии ФГБОУ ВПО «Ангарская государственная техническая академия». Животные содержались в условиях вивария, эксперимент проводился в соответствии с правилами гуманного обращения с животными, которые регламентированы «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755). Работа проводилась с учетом требований Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в научных целях, и была одобрена этическим комитетом Иркутского государственного медицинского университета. Все оперативные вмешательства проводились в асептических условиях под эфирным наркозом. 6

В соответствии с поставленными задачами животные были разделены на 3 серии: 1-я серия - животные с экспериментальной моделью асептического воспаления (110 крыс); 2-я серия - животные с экспериментальной моделью микробного воспаления (110 крыс); 3-я серия - животные с экспериментальной моделью микробного воспаления с применением иммуномодулятора азокси-мера бромида (110 крыс). Группу сравнения составили 10 здоровых интактных белых крыс-самцов.

Асептическое воспаление у животных (1-я серия), находящихся под легким эфирным наркозом, моделировали путем имплантации под кожу бедра диффузионной камеры собственной конструкции (патент № 5030684 (010989) от 4.03.92), заполненной физиологическим раствором. Диффузионные камеры были изготовлены из милипорового фильтра (SYNPOR, Чехия) размером 1x3 мм, объемом 2,5 мм3 с диаметром пор 0,3-0,5 мкм.

Экспериментальное микробное воспаление у лабораторных крыс (2-я серия) было получено в результате введения под кожу бедра диффузионной камеры, заполненной водной взвесью 24-часовой культуры Staphylococcus aureus № 25943 (F-49) АТСС в дозе 107 микробных тел на 1 мл, полученной по стандарту мутности.

Животным 3-й серии моделировался микробный воспалительный процесс, аналогично 2-й серии, с последующим внутримышечным введением 0,06 мл иммуномодулятора азоксимера бромида 1 раз в сутки в течение 7 дней. Доза рассчитывалась как среднетерапевтическая: каждой крысе массой 180-220 г вводили азоксимера бромид в дозе, равной 0,06 мг, что соответствовало 0,06 мл раствора данного препарата. Первая инъекция была сделана в день операции по моделированию воспалительного процесса.

У крыс всех серий производился забор образцов тканей с камерами для количественной оценки клеточных реакций с помощью морфологических методов, бралась кровь из хвостовой вены для подсчета лейкоцитарной формулы через 12 часов, 1, 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 60 суток воспаления, в течение первых 5 суток воспалительного процесса у животных также осуществлялся забор крови для определения интерлейкина-ip (ИЛ-1р), интерлейкина-10 (ИЛ-10), кортикостерона, тироксина (Т4). Интерлейкин-1(3 является одним из ключевых провоспалительных цитокинов (Куликова А.Н., 2007), обладающим многочисленными биологическими эффектами и регулирующим все стороны воспалительной реакции (Симбирцев А.С., 2002). Интерлейкин-10- один из наиболее важных противовоспалительных цитокинов (Хараева З.Ф., 2007; Kelsall В., 2009), оказывающий выраженное антивоспалительное и антицитокиновое действие (Радьков О.В., Калин-кин М.Н., 2010; Didion S.P., 2009). Данные характеристики интерлейкина-1(3 и интерлейкина-10 определили выбор именно этих медиаторов воспалительного ответа для исследования.

Концентрацию цитокинов и гормонов в плазме крови определяли с помощью иммуноферментного анализа. Лейкоцитарную формулу подсчитывали на мазках, окрашенных по Романовскому - Гимза. Для количественной оценки клеточных реакций материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, подвергали стандартной гистологической обработке, кусочки заливали в парафин, срезы толщиной 7 мкм окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону. На микропрепаратах регистрировали толщину лейкоцитарного вала вокруг стенки камеры, концентрацию клеток в вале, соотношение клеточных популяций, толщину фибробластической капсулы вокруг лейкоцитарного вала, число слоев фибробластов, концентрацию фибробластов в капсуле.

Поглотительную способность фагоцитов у крыс 2-й и 3-й серий оценивали по фагоцитарному числу (ФЧ) и индексу (ФИ), для определения которых использовалось содержимое диффузионных камер.

Для электронномикроскопического исследования кусочки ткани очага воспаления фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере рН - 7,4, контрастировали 2% четырехокисью осмия в течение 12 часов. С готовых блоков получали ультратонкие срезы и просматривали на электронном микроскопе. На электронограммах изучали качественные ультраструктурные характеристики клеток, участвующих в процессе воспаления, и состояние межклеточного вещества соединительной ткани в зоне процесса.

Статистический анализ результатов производили с помощью пакета компьютерных программ BioStat, Microsoft Excel 2003, 2007 для WindowsXP.

Для показателей определялись среднее арифметическое (М), среднее квадратичное отклонение (s). Сравнение средних значений независимых выборок при их нормальном распределении осуществлялипо t-критерию Стьюдента и F-кригерию Фишера. Для проверки соответствия распределения выборочных значений закону нормального распределения применяли критерий Колмогорова - Смирнова. В условиях неподчинения закону нормального распределения применяли U-критерий Манна - Уитни. Различия величин признавали статистически значимыми при критическом уровнер < 0,05. Для исследования силы и направленности взаимосвязей показателей вычислялись коэффициенты корреляции (г).

Результаты исследований и их обсуждение

Асептическое воспаление протекает стандартно как по времени, так и по клеточным событиям, что позволило разработать способы его количественной оценки (Майборода А.А., 2006). По нашим данным, воспалительный процесс, вызванный введением диффузионных камер, заполненных физиологическим раствором, протекал по законам острого асептического воспаления. В течение первых суток вокруг стенок камер формировался лейкоцитарный вал толщиной 150 ± 8 мкм с плотностью клеток 28 ± 4 на 1000 мкм2 с преобладанием нейтро-филов, соотношение «нейтрофил : макрофаг» = 15% \ 25 %. В периферической крови регистрировался незначительный нейтрофилез. На 2-3-и сутки асептиче-8

ского воспаления происходило уменьшение толщины лейкоцитарного вала вокруг стенок камер до 62 ± 6 мкм. В нем начинали преобладать макрофаги, которые активно фагоцитировали нейтрофильный детрит. Ультраструктура макрофагов соответствовала их высокой функциональной активности. Начиная с 3-х суток воспалительного процесса, регистрировалось постепенное замещение макрофагов в лейкоцитарном вале на фибробласты, которые формировали соединительнотканную капсулу вокруг стенок камер. К 10-м суткам толщина фибробластической капсулы была максимальной - 100 ± 15 мкм. В дальнейшие сроки наблюдения происходила организация фибробластической капсулы: уменьшение толщины до 50 ± 7 мкм, превращение фибробластов в фиброциты, снижение их синтетической активности, прорастание внутрь капсулы новых капилляров.

На рисунке 1 показано графическое отображение интенсивности клеточных

фаз экспериментального асептического воспаления.

У крыс с моделью асептического воспаления максимальный уровень ИЛ-1 р в плазме крови регистрировался через 12 часов с последующим его падением в течение 2 суток и исчезновением уже на 3-й сутки от начала воспаления. Со стороны ИЛ-10 определялось снижение его уровня в плазме крови животных на срок 12 часов, по сравнению с фоновыми показателями, с последующим незначительным подъемом этого цитокина до 5 суток от начала воспалительного процесса (табл. 1). Таким образом, с 12 часов асептического воспаления наблюдалась антагонистическая картина в уровнях ключевых цитокинов: ИЛ-ф снижался, ИЛ-10, наоборот, концентрацию увеличивал (г = -0,9; р < 0,05). Можно предположить, что такая взаимосвязь между одними из ведущих про- и противовоспалительных цитокинов при остром асептическом воспалении является оптимальной для своевременного разрешения воспалительного процесса.

Рис. 1. Динамика клеточных реакций в очаге экспериментального асептического воспаления.

Таблица 1

Количественные показатели интерлейкипа-1/!, интерлейкина-10 в плазме крови крыс с экспериментальным асептическим воспалением (п = 60)

Срок воспаления Интерлейкин-1р, пг/мл Интерлейкин-10, пг/мл

фон 0 22,9 ±4,3

12 часов 1,7 ±0,4 3,6 ±0,6'

1 сутки 1,2 ±0,2 10,3 ±1,4'

2 сутки 0,8 ± 0,2 13,1 ±1,7'

3 сутки 0 15,2 ± 1,6

5 сутки 0 15,6 ±3,2

Примечание: * - р < 0,05 - по сравнению с величиной фонового показателя (критерий Манна - Уитни).

Максимум уровня кортикостерона в плазме крови крыс с асептическим воспалением зарегистрирован через 12 часов от начала процесса с последующим снижением до фоновых показателей (табл. 2). На этот же срок имелся самый высокий уровень ИЛ-1 р в плазме крови экспериментальных животных, следовательно, можно предположить, что продукция ИЛ-1 р индуцировала синтез кортикостерона (г = 0,9; р < 0,05). В дальнейшем, по-видимому, проявилось ингибирующее действие ппококортикоида на образование ИЛ-1 р, который через 3 суток от момента имплантации камер в плазме крови крыс уже не обнаруживался. Иная картина наблюдалась со стороны ИЛ-10 и кортикостерона (г = -0,9; р < 0,05). По нашему мнению, усиленное образование ппококортикоида привело к активации синтеза этого противовоспалительного цитокина, концентрация которого в плазме крови крыс стала увеличиваться с момента максимального уровня гормона.

При моделировании асептического воспаления значимых изменений и взаимосвязей у тиреоидных гормонов зарегистрировано не было.

Таблица 2

Количественные показатели кортикостерона, общего и свободного тироксина в плазме крови крыс с экспериментальным асептическим воспалением (п = 60)

Срок воспаления Кортикостерон, нмоль/л Тироксин, нмоль/л Свободный тироксин, пмоль/л

фон 37,2 ± 3,2 73,3 ± 9,4 12,4 ±2,6

12 часов 47,8 ±4,3 89,1 ± 10,9 15,2 ± 1,3

1 сутки 39,2 ± 3,7 93,5 ± 7,3 18,9 ±1,6

2 сутки 40,9 ±4,1 65,3 ± 7,9 12,2 ±2,4

3 сутки 34,2 ± 7,2 86,6 ± 5,3 16,0 ±2,2

5 сутки 28,0 ±5,6 104,0 ± 13,6' 14,9 ±0,6

Примечание: * - р < 0,05 - по сравнению с величиной фонового показателя (критерий Манна - Уитни).

Таким образом, в очаге асептического вбспаления происходила последовательная смена клеточных популяций, которые оптимально выполняли свои функции, и к 20-м суткам процесс воспаления завершался образованием плотной соединительнотканной капсулы, которая обеспечивала полную изоляцию инородного тела от прилегающих тканей. ИЛ-1Р, ИЛ-10, кортикостерон осуществляли эффективную регуляцию формообразовательных процессов в очаге воспаления.

При моделировании микробного воспаления путем введения под кожу животным диффузионных камер, заполненных стафилококком, лейкоцитарная фаза регистрировалась с 1 -х по 7-е сутки воспалительного процесса. Толщина лейкоцитарного вала постепенно нарастала с максимумом 349,4 ± 40,3 мкм на срок 3 суток. В клеточном вале преобладали нейтрофилы, соотношение «нейтрофил : макрофаг» = 3 : 1. ФЧ составляло 4-6 микробных тел на клетку, ФИ - 60-70 %. Начиная с 7-х суток от начала воспаления, в лейкоцитарном вале начинали преобладать макрофаги, толщина вала снижалась до 208,7 ± 28,4 мкм. Ультраструктура макрофагов соответствовала стадии воспалительного процесса, В клетках имелось большое количество фаголизосом, содержащих фрагменты стафилококка и нейтрофильного детрита. Формирующаяся по периферии лейкоцитарного вала фибробластическая капсула имела толщину 245,0 ± 37,8 мкм. Лишь к 20-м суткам воспалительного процесса произошло уменьшение толщины лейкоцитарного вала до 167,5 ± 46,2 мкм. При стафилококковом воспалении до 60-х суток фибробластическая капсула оставалась незрелой: толщина - 250-350 мкм, недостаточное количество коллагена, маленькая плотность фибробластов, наличие макрофагов.

На рисунке 2 приведены показатели клеточных реакций экспериментального микробного воспаления.

У животных с микробным воспалением было зарегистрировано интенсивное увеличение концентрации ИЛ-1р в плазме крови с максимумом через 2 суток и последующим резким снижением уровня данного цитокина, но фоновое нулевое значение на 5-е сутки достигнуто не было. Со стороны противовоспалительного ИЛ-10 наблюдалось падение его концентрации в плазме крови крыс на срок 12 часов, далее уровень ИЛ-10 увеличивался с максимальным значением через 2 суток от начала воспаления. В последующие сроки воспалительного процесса, вплоть до 5-х суток, концентрация этого цитокина падала (табл. 3). С 12 часов от начала микробного воспаления оба исследуемых цитокина, ИЛ-1 р и ИЛ-10, имели схожую динамику: максимум концентраций в плазме крови через 2 суток с дальнейшим снижением их показателей. Можно предположить, что одновременный пик концентраций ИЛ-1р и ИЛ-10 (г = 0,8; р < 0,05) связан с повреждением нейтрофилов и макрофагов бактериальными токсинами, в результате чего происходит одновременный выброс ими провос-палительного ИЛ-1Р и противовоспалительного ИЛ-10.

Таблица 3

Количественные показатели интерлейкина-1р, интерлейкина-10 в плазме крови крыс с экспериментальным воспалением, вызванным золотистым стафилококкам (п - 60)

Срок воспаления ИнтерлейкинИр, пг/мл Интерлейкин-10, пг/мл

фон 0 22,9 ±4,3

12 часов 5,6 ± 0,9" 4,4 ± 1,0

1 сутки 11,9 ± 1,9" 23,0 ± 6,9'

2 сутки 28,9 ± 1,7" 50,6 ± 5,9'

3 сутки 7,8 ± 1,6 27,8 ± 7,4'

5 сутки 1,1 ±0,3 23,7 ± 6,3'

Примечание: * - р < 0,05 - по сравнению с величиной соответствующего показателя у крыс с асептическим воспалением (критерий Манна - Уитни).

В модели микробного воспаления было отмечено снижение концентрации кортикостерона в плазме крови животных, по отношению к контрольным показателям, на протяжении всех 5 суток его определения (р < 0,05). Только на срок 2 суток от начала воспалительного процесса наблюдался незначительный подъем данного глюкокортикоида практически до контрольного значения (табл. 4) на фоне максимального уровня ИЛ-1 р, который, по-видимому, оказал небольшой стимулирующий эффект на выработку кортикостерона (г = 0,7; р < 0,05). В дальнейшие сроки воспаления наблюдалось одновременное снижение в плазме крови концентраций кортикостерона, ИЛ-1Р и ИЛ-10.

До 5-х суток наблюдения у крыс с микробным воспалением регистрировались разнонаправленные изменения в содержании тироксина и интерлейкинов с выявлением между ними отрицательных взаимосвязей: чем выше были ИЛ-1Р и ИЛ-10 в плазме крови, тем ниже становился уровень общего (г = -0,9; р < 0,05 и г = -0,8; р < 0,05 соответственно) и свободного (г = -0,6; р < 0,05 и г = -0,8; р < 0,05 соответственно) тироксина.

Таблица 4

Количественные показатели кортикостерона, тироксина, свободного тироксина в плазме крови крыс с экспериментальным воспалением, вызванным золотистым стафилококкам (п = 60)

Срок воспаления Кортикостерон, н моль/л Тироксин, нмоль/л Свободный тироксин, пмоль/л

фон 37,2 ±3,2 73,7 ± 9,4 12,4 ± 2,6

12 часов 29,4 ± 3,8" 90,9 ± 16,5 15,0 ± 1,2

1 сутки 35,1 ±4,8 78,3 ± 12,9 15,9 ± 1,5

2 сутки 36,6 ± 4,6 51,4 ± 11,3 11,5 ± 1,7

3 сутки 19,9 ±5,9' 70,7 ± 12,6 12,8 ±2,1

5 сутки 26,6 ± 2,9 81,9 ±7,0" 13,9 ± 1,4

Примечание: * - р < 0,05 - по сравнению с величиной соответствующего показателя у крыс с асептическим воспалением (критерий Манна - Уитни).

Таким образом, воспалительный процесс, вызванный стафилококком, замедлен во времени, характеризуется длительным течением клеточных фаз, наложением их друг на друга, медленным фиброзированием очага воспаления с образованием «неполноценной» капсулы, не способной обеспечить надежную изоляцию воспалительного агента. Клетки, реализующие воспаление, недостаточно полно осуществляют свои основные функции: снижены все реакции нейтрофилов, макрофагов, фибробластов, что связано с патогенным действием токсинов и структурных компонентов стафилококка. Уровни и динамика содержания ИЛ-1 р, ИЛ-10, кортикостерона у данной группы животных отличаются от аналогичных показателей при асептическом воспалении. Так как клетки очага воспаления регулируются гормонами и цитокинами, можно предположить, что происходит нарушение их синтеза вследствие негативного влияния токсинов стафилококка на регуляторные системы. Следовательно, продемонстрировано, что микробное воспаление имеет тенденцию к хронизации процесса, в отличие от асептического.

У животных с микробным воспалением, вызванным имплантацией камер со стафилококком на фоне введения азоксимера бромида, лейкоцитарная фаза воспаления протекала в течение 5 суток. Максимальная толщина лейкоцитарного вала регистрировалась на срок 1 сутки - 340,0 ± 42,4 мкм. Среди клеточных форм преобладали нейтрофилы, которые интенсивно фагоцитировали фрагменты разрушенных тканей, клетки стафилококка. Их фагоцитарная активность

была выше, чем в серии с микробным воспалением (ФЧ = 8—10 микробных тел на клетку; ФИ = 70-75 %) (р < 0,05) (рис. За, б). Начиная с 5-х суток, в очаге воспаления преобладали макрофаги, которые сменяли нейтрофилы и являлись основными фагоцитирующими клетками. Ультраструктура макрофагов характеризовалась гипертрофией вакуолярно-лизосомального аппарата, в фаголизосомах содержались остаточные тельца. К 15-м суткам макрофаги полностью очистили зону повреждения от стафилококка, нейтрофильного детрита, девитализированных тканей, что позволило фибробластам эффективно формировать фиброзную капсулу. Фибробластическая фаза воспаления началась с 3-х суток, когда вокруг камер по периферии клеточного вала появилась тонкая фибробластическая капсула. Капсула закономерно развивалась, достигнув максимальной толщины на 10-е сутки - 318,3 ± 46,2 мкм. Далее происходило ее уплотнение, уменьшение толщины до 208 ± 24 мкм, снижение синтеза коллагена, трансформация фибробластов в фиброциты, образование новых капилляров.

На рисунке 3 представлены изменения клеточных реакций при микробном воспалении с коррекцией иммуномодулятором азоксимера бромидом.

лейкоцитарная фаза макрофагическая фаза фибробластическая фаза

15с

60с

Время

Рис. 3. Динамика клеточных реакций в очаге экспериментального воспаления, вызванного золотистым стафилококком с коррекцией азоксимера бромидом. Примечание: * - р < 0,05 - между микробным и микробным с коррекцией азоксимера бромидом воспалении (критерии Стьюдента и Фишера).

При воспроизведении у крыс микробного воспаления с введением азоксимера бромида пик концентрации провоспалительного ИЛ-1Р был зарегистрирован через 1 сутки от начала процесса (табл. 5), при этом значение его было ниже (р < 0,05), чем в серии с микробным воспалением, с дальнейшим снижением его уровня.

Можно предположить, что более низкое содержание провоспалительного цитокина явилось результатом мембраностабилизирующего действия азоксиме-

ра бромида на синтезирующие его клетки в отношении токсинов стафилококка, вызывающих гиперактивацию и цитолиз этих клеток с выбросом достаточно больших концентраций ИЛ-1р. По нашему мнению, в серии микробного воспаления с применением иммуномодулятора имелось приближение динамики продукции ИЛ-1Р к срокам его выработки при асептическом воспалении, где максимум этого цитокина регистрировался через 12 часов от начала процесса, в отличие от чисто стафилококкового воспалительного процесса, имевшего наивысший уровень ИЛ-1Р только через 2 суток после введения камер (рис. 4).

Таблица 5

Количественные показатели интерлейкина-1р, интерлейкина-10 в плазме крови крыс с экспериментальным воспалением, вызванным золотистым стафилококком на фоне коррекции азоксимера бромидам (п = 60)

Срок воспаления Интерлейкин-1р, пг/мл Интерлейкин-10, пг/мл

фон 0 22,9 ±4,3

12 часов 9,4 ± 3,0" 41,1 ± 8,4'

1 сутки 21,2 ±2,8' 31,3 ±6,7

2 сутки 16,3 ± 1,6' 84,4 ± 5,8'

3 сутки 11,0 ± 1,5" 64,8 ± 6,3'

5 сутки 5,7 ±0,9' 56,1 ±4,7"

Примечание: ' - р < 0,05 - по сравнению с величиной соответствующего показателя у крыс с микробным воспалением (критерий Манна -Уитни).

асептическое воспаление микробное воспаление

Рис. 4. Сравнительная динамика уровня интерлейкина-1р при асептическом, микробном и микробном с коррекцией азоксимера бромидом экспериментальном воспалении. Примечание: * - р < 0,05 - между микробным и микробным с коррекцией азоксимера бромидом воспалении; # -р < 0,05 - между микробным и асептическим воспалением (критерий Манна-Уитни).

Со стороны противовоспалительного ИЛ-10 была зарегистрирована отличающаяся от предыдущих серий воспаления картина: через 12 часов после имплантации диффузионных камер крысам наблюдался подъем уровня ИЛ-10 в плазме крови (табл. 5), в отличие от асептического и стафилококкового процессов, где на этот срок регистрировалось его снижение в крови (рис. 5). Через 1 сутки у крыс этой серии концентрация ИЛ-10 в плазме крови снижалась, что соответствовало максимальному значению провоспалительного ИЛ-1(3. Далее следовало резкое повышение уровня ИЛ-10 с пиком концентрации на 2-е сутки и последующим медленным уменьшением его значения, но, вплоть до 5 суток воспаления, ИЛ-10 сохранял высокие цифры концентрации. По нашему мнению, азоксимсра бромид активировал продукцию и оптимизировал сроки выработки противовоспалительного ИЛ-10, чем способствовал более быстрому протеканию воспалительного процесса.

Рис. 5. Сравнительная динамика уровня интерлейкина-10 при асептическом, микробном и микробном с коррекцией азоксимера бромидом экспериментальном воспалении. Примечание: * -р< 0,05 - между микробным и микробным с коррекцией азоксимера бромидом воспалении; # -р < 0,05 - между микробным и асептическим воспалением (критерий Манна - Уитни).

Максимум кортикостерона в этой экспериментальной серии регистрировался через 1 сутки (табл. 6) одновременно с пиком ИЛ-1 р (г = 0,6;/7 < 0,05) и падением уровня ИЛ-10, при этом увеличение уровня глюкокортикоида было достаточно значительным на протяжении всех 5 суток исследования, по сравнению с фоновыми показателями и уровнями, полученными в других сериях воспаления (рис. 6). Далее выявлялась взаимосвязь между содержанием кортикостерона и ИЛ-10: при повышении уровня ИЛ-10 концентрация гормона снижалась и, наоборот (г = -0,8; р < 0,05). Можно предположить, что синтез этих противовоспалитель-16

ных биологически активных веществ находится в противоположной зависимости. Похожие данные были получены в модели асептического воспаления, при стафилококковом же процессе динамика уровней цитокинов и кортикостерона была однонаправленной. Вероятно, стимулирующее действие иммуномодулятора на фагоциты опосредованно привело к усилению продукции ппококортикоида, которая была угнетена в модели микробного воспаления без применения препарата. Уровни тироксина и свободного тироксина в плазме крови животных этой серии практически не отличались от фоновых показателей (табл. 6).

Таблица 6

Количественные показатели кортикостерона, тироксина, свободного тироксина в плазме крови крыс с экспериментальным воспалением, вызванным золотистым стафилококком на фоне коррекции азоксимера бромидам (п — 60)

Срок воспаления Кортикостерон, н моль/л Тироксин, нмоль/л Свободный тироксин, пмоль/л

фон 37,2 ± 3,2 73,7 ± 9,4 12,4 ± 2,6

12 часов 55,9 ± 6,4 68,8 ± 9,5 12,8 ±3,3

1 сутки 64,6 ± 4,7" 68,6 ± 7,3 12,7 ±3,1

2 сутки 42,0 ± 5,6 75,2 ± 10,7' 11,1 ±1,5

3 сутки 46,8 ±7,5 71,0 ±8,8 12,0 ±1,1

5 сутки 36,3 ±4,6" 39,9 ±5,8 14,5 ±4,0

Примечание:' -р < 0,05 - по сравнению с величиной соответствующего показателя у крыс с микробным воспалением (критерий Манна - Уитни).

Рис. 6. Сравнительная динамика уровня кортикостерона при асептическом, микробном и микробном с коррекцией азоксимера бромидом экспериментальном воспалении. Примечание: * - р < 0,05 - между микробным и микробным с коррекцией азоксимера бромидом воспалении; # -р < 0,05 - между микробным и асептическим воспалением (критерий Манна - Уитни).

Следовательно, можно предположить, что при асептическом воспалении сформировалась оптимальная функциональная система с определенными количеством, силой и направлением функциональных связей между параметрами регуляторных систем и клеток, реализующих воспаление. При микробном воспалении токсины стафилококка привели к хронизации процесса, разрушив системы функциональных связей с формированием патологической функциональной системы хронического воспаления. Корректирующее действие азоксимера бромида на функции клеток и регуля-торные системы в очаге воспаления восстановило часть функциональных связей, приблизив их к «норме», что предупредило механизмы хронизации воспаления и оптимизировало его течение и исход. Несмотря на то, что токсины стафилококка, действуя на гормоны, интерлейкины и клетки очага воспаления, приводили к затягиванию всех фаз воспаления, по сравнению с асептическим воспалением, азоксимера бромид увеличил фагоцитарную активность лейкоцитов, скорость их миграции в очаг воспаления, синтез коллагена фибробластами, взаимодействие клеток в очаге воспаления, снизил выработку ИЛ-1Р, активировал синтез ИЛ-10, кортикостерона и, таким образом, уменьшил время течения фаз процесса и воспаления в целом, препятствуя хронизации воспаления.

На основании анализа литературных данных и собственных исследований можно предложить схему, отражающую роль ИЛ-1Р, ИЛ-10 и кортикостерона в механизмах формирования клеточных реакций в очаге асептического, микробного и микробного с коррекцией азоксимера бромидом воспаления (рис. 7). При асептическом воспалении имелись оптимальное увеличение и динамика интерлейкинов и кортикостерона, что сопровождалось адекватной продолжительностью и своевременной сменой клеточных реакций в очаге воспаления (физиологическое воспаление). При микробном воспалительном процессе имелось чрезмерное увеличение уровня ИЛ-1р, повышение ИЛ-10 на фоне угнетения выработки кортикостерона, что привело к затягиванию во времени всех фаз воспаления с наложением их друг на друга (тенденция к хронизации воспаления). Микробное воспаление с коррекцией азоксимера бромидом сопровождалось умеренным повышением ИЛ-1 р на фоне выраженного подъема ИЛ-10 и кортикостерона, что сократило длительность клеточных фаз, приблизив ее к продолжительности реакций при асептическом воспалительном процессе (оптимизация воспаления).

Рис.7. Роль ИЛ-1р, ИЛ-10, кортикостеронав механизмах формирования клеточных реакций в очагах экспериментального воспаления (Т - увеличение концентрации; ¿-уменьшение концентрации; 14-увеличение длительности клеточной реакции; - сокращение длительности клеточной реакции).

Таким образом, полученные данные конкретизируют представление о роли цитокинов и гормонов на этапах клеточных фаз воспаления и дополняют знания врачей о патогенезе воспалительной реакции, обосновывают использование азоксимера бромида для предупреждения хронизации воспалительного процесса.

выводы

1. Одним из регуляторных механизмов асептического воспаления является повышение провоспалительного интерлейкина-1р и кортикостерона через 12 часов от начала процесса на фоне снижения противовоспалительного интерлейкина-10. С 12 часов воспаления увеличивается концентрация противовоспалительного интерлейкина-10, что обеспечивает адекватную продолжительность и своевременную смену клеточных реакций в очаге воспаления (лейкоцитарной фазы — 1-е сутки, макрофагической - 2—3-й сутки, фибробластической — 3-20-е сутки).

2. Микробное воспаление характеризуется увеличением продолжительности лейкоцитарной фазы до 7 суток, макрофагической — до 20 суток и незавершенной фибробластической фазой, что свидетельствует о тенденции к хронизации воспалительного процесса.

3. Микробный воспалительный процесс сопровождается одновременным подъемом провоспалительного и противовоспалительного цитокинов с пиком концентраций через 2 суток и дальнейшим параллельным снижением их уровней, что значительно отличается от показателей, выявленных при асептическом воспалении.

4. Высокое содержание интерлейкина-1р при микробном воспалении приводит к угнетению выработки кортикостерона, концентрация которого снижается в 2 раза с момента максимального уровня провоспалительного интерлейкина-1р, по сравнению с показателями, полученными у здоровых крыс.

5. При микробном воспалительном процессе выявленный дисбаланс про- и противовоспалительного интерлейкинов и кортикостерона обусловливает недостаточность основных функций клеток, реализующих воспаление: снижены все реакции нейтрофилов, макрофагов, фибробластов, особенно фагоцитарная и синтетическая (в 1,7 и 1,6 раза соответственно).

6. Применение иммуномодулятора азоксимера бромида сокращает длительность клеточных реакций воспаления (лейкоцитарную фазу — на 2 суток, макрофагическую — на 5 суток, завершение фибробластической — на 60 сутки), улучшает функции фагоцитов и фибробластов, ответственных за воспалительный процесс, препятствует затягиванию микробного воспаления.

7. Азоксимера бромид в 4 раза усиливает выработку противовоспалительного интерлейкина-10 и в 2 раза кортикостерона на фоне умеренного повышения провоспалительного интерлейкина-1р. Применение азоксимера бромида активирует противовоспалительные и оптимизирует провоспалитель-ные механизмы регуляции воспалительного процесса. Динамика изменений содержания цитокинов и кортикостерона под влиянием иммуномодулятора приближается к показателям асептического воспаления.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Список статей в рецензируемых научных журналах:

1. Серебренникова С.Н., Семинский И.Ж. Роль цитокинов в воспалительном процессе (сообщение 1) // Сибирский медицинский журнал. - 2008. -№6.-С. 5-8.

2. Серебренникова С.Н., Семинский И.Ж. Роль цитокинов в воспалительном процессе (сообщение 2) // Сибирский медицинский журнал. - 2008. -№ 8. - С. 5-8.

3. Серебренникова С.Н., Семинский И.Ж., Клименков И.В., Семенов Н.В. Механизмы регуляции клеточных реакций в очаге асептического воспаления // Сибирский медицинский журнал. - 2012. - № 1. - С. 71-73.

4. Серебренникова С.Н., Семинский И.Ж., Клименков И.В., Семенов Н.В. Влияние полиоксидония на механизмы регуляции клеточных реакций в очаге микробного воспаления // Сибирский медицинский журнал. - 2012. - № 2. -С. 42-45.

5. Серебренникова С.Н., Семинский И.Ж., Клименков И.В., Семенов Н.В. Клеточные реакции и механизмы их регуляции в очаге экспериментального асептического воспаления // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2012. - № 3 (85), 4.2.-С. 309-312.

6. Серебренникова С.Н., Семинский И.Ж., Клименков И.В., Семенов Н.В. Роль азоксимера бромида в механизмах регуляции клеточных реакций в очаге микробного воспаления // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2012. - № 3 (85), 4.2.-С. 312-316.

7. Серебренникова С.Н., Семинский И.Ж., Семенов Н.В., Гузовская Е.В. Интерлейкин-1, интерлейкин-10 в регуляции воспалительного процесса // Сибирский медицинский журнал. — 2012. - № 8. — С. 10-12.

8. Серебренникова С.Н., Семинский И.Ж,, Семенов Н.В., Гузовская Е.В. Исследование корректирующего влияния иммуномодулятора азоксимера бромида на очаг экспериментального микробного воспаления у лабораторных животных // Известия ИГУ. Серия «Биология. Экология». - 2012. - № 3 -С. 17-20.

Публикации в иных изданиях:

1. Серебренникова С.Н., Семинский И.Ж., Семенов Н.В. Влияние цитокинов на клетки очага воспаления // Сб. проблемы и перспективы современной науки. - 2009. - Т. 2, № 1. - С. 20-22.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИЛ-10 - интерлейки н-10

ИЛ-1Р - интерлейкин-10

Мкм - микрометр

Т4 - тироксин

ФИ - фагоцитарный индекс

ФЧ - фагоцитарное число

Подписано в печать 19.09.2012. Бумага офсетная. Формат 60х841/,6-Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № 080-12._

РИО НЦРВХ СО РАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1. Тел 29-03-37. E-mail: arleon58@gmail.com)

актуальность проблемы

В организме человека и животных существует система защитных реакций, направленных на сохранение его генетической индивидуальности [128]. Воспаление является универсальной защитно-приспособительной реакцией, развивающейся в ответ на повреждение [27, 60, 107] и относящейся к старейшим типам защитных реакций организма [67]. Она состоит из поэтапных изменений микроциркуляторного русла, системы крови и соединительной ткани, которые направлены на устранение воспалительного агента и восстановление поврежденной ткани [107]. В разные фазы воспаления и регенерации меняются типы клеточных взаимодействий и роль «дирижера» клеточных ансамблей переходит от одних популяций клеток к другим [152]. Воспаление является адаптивным и индуктивным процессом, зависящим от суммы клеточных и гуморальных факторов, многие из которых продуцируются заново, в ответ на действие воспалительных стимулов. Их образование требует активной работы клеток, которая проявляется в синтезе молекул, направленных на возбуждение, развитие и купирование воспалительной реакции. К таким регуляторным факторам относятся цитокины; клеточные адгезины; простаноиды; факторы, контролирующие апоптоз, дифференцировку и пролиферацию клеток; антигенпредставляющие молекулы [70]. Таким образом, адекватность воспаления на всех этапах регулируется с помощью межклеточных взаимодействий путем синтеза различных биологически активных веществ [152].

Цитокины являются важнейшими медиаторами воспалительного ответа [29, 121, 207], мощными про- и антивоспалительными агентами, стимуляторами образования и высвобождения других биологически активных веществ [45, 131]. Цитокины вовлечены фактически во все этапы воспалительных и иммунных реакций [41, 42, 116, 124, 141]. Провоспалительные цитокины обеспечивают рекрутирование в очаг воспаления эффекторных клеток, стимулируют их фагоцитарную, бактерицидную активность [141], оказывают влияние практически на все органы и системы организма, участвующие в регуляции гомеостаза [60, 117]. Главным из провоспалительных цитокинов, регулирующих воспалительный процесс, является интерлейкин-1[3 (ИЛ-1[3) [78, 82, 97]. Для избежания избыточных проявлений провоспалительных цитокинов в организме включаются механизмы негативного контроля, опосредованные продукцией противовоспалительных цитокинов и растворимых ингибиторов провоспалительных цитокинов [141, 168]. Ключевым противовоспалительным цитокином в регуляции воспаления является интерлейкин-10 (ИЛ-10), ингибирующий синтез практически всех провоспалительных цитокинов [34].

Контроль воспалительного ответа осуществляется также эндокринной системой с помощью гормонов, которые могут оказывать ингибирующее (глюкокортикоиды, адренокортикотропный гормон (АКТГ)) и стимулирующее (тироксин) действия [98]. Воспаление сопровождается взаимосвязанным изменением профиля цитокинов и уровня синтеза гормонов. Цитокины, воздействуя на гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую ось, изменяют продукцию гормонов, оказывая влияние на защитные функции организма [139, 162]. Интерлейкин-1 (ИЛ-1) стимулирует выработку глюкокортикоидов в организме [6], которые, в свою очередь, угнетают синтез ИЛ-1 [103, 139].

Воспаление является основным звеном патогенеза большинства заболеваний. В неблагоприятных условиях воспалительный процесс может протекать атипично с тенденцией к хронизации [107, 110]. Прогностическое значение в протекании воспаления имеет уровень про- и противовоспалительных цитокинов, их соотношение отражает интенсивность альтеративно-деструктивных и регенераторно-восстановительных процессов, динамику и прогрессирование заболевания. Снижение уровней цитокинов может свидетельствовать об угнетении неспецифической защиты, что может способствовать хронизации процесса [100, 141]. Резкое повышение синтеза цитокинов может приводить к катастрофическим последствиям. Гиперцитокинемия сопровождается развитием в периферической крови системных повреждений и дисфункцией эндотелия, что в короткие сроки приводит к системному поражению внутренних органов и смертельному исходу [77].

В качестве эффективного иммуномодулятора в настоящее время используется азоксимера бромид. Препарат не только восстанавливает иммунный статус, но и связывает и выводит токсины, а также обладает антиоксидантным и мебраностабилизирующим действиями [46]. Однако, конкретный механизм действия препарата на регуляторпые процессы в очаге воспаления до конца не изучен. Таким образом, актуальным является изучение механизмов регуляции клеточных реакций в очаге экспериментального воспаления с коррекцией азоксимера бромидом.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Оценить интенсивность клеточных реакций и механизмы их регуляции под влиянием иммуномодулятора азоксимера бромида на модели асептического и микробного воспаления.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Определить интенсивность клеточных реакций в очаге асептического воспаления с исследованием динамики провоспалительного (ИЛ-10) и противовоспалительного (ИЛ-10) интерлейкинов, кортикостерона и тироксина в плазме крови крыс.

2. Выявить особенности протекания клеточных фаз и изменения концентраций регуляторных цитокинов и гормонов в плазме крови животных при микробном воспалении.

3. Оценить нарушение баланса интерлейкина-1р, интерлейкина-10, кортикостерона, тироксина при хронизации воспалительного процесса.

4. Установить закономерности изменения клеточных реакций в очаге микробного воспаления под влиянием иммуномодулятора азоксимера бромида.

5. Исследовать изменение уровней иптерлейкина-1[3, интерлейкина-10, кортикостерона, тироксина в плазме крови крыс при микробном воспалении с коррекцией азоксимера бромидом в сравнении с микробным без коррекции и асептическим воспалительными процессами.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА:

Впервые на унифицированной модели асептического и микробного воспаления у крыс при проведении комплексного изучения уровней интерлейкина-ф, интерлейкина-10, коргикостерона, тироксина с выявлением закономерностей протекания регулируемых ими клеточных фаз воспалительного процесса установлены различия в содержании цитокинов и гормонов при разных формах воспаления: выявлено, что асептический воспалительный процесс сопровождался разнонаправленными изменениями содержания интерлейкинов - по мере увеличения концентрации интерлейкина-ф, уровень интерлейкина-10 убывал, и наоборот. Установлено, что содержание кортикостерона находилось в прямой зависимости с уровнем провоспалительного интерлейкина-1 (3.

Показано, что при микробном воспалении содержание цитокинов и гормонов отличалось от аналогичных показателей при асептическом воспалительном процессе. Впервые выявлено, что увеличение и снижение концентраций интерлейкинов и кортикостерона в плазме крови животных были сочетанными, при этом уровень глюкокортикоида находился ниже показателей, полученных у интактных крыс, на протяжении всего периода исследований. Доказано, что продолжительность клеточных реакций при этом значительно увеличивалась. Впервые установлено, что дисбаланс цитокинов и гормонов, который регистрировался при микробном воспалении, приводил к хронизации процесса. Выявлены механизмы и точки приложения интерлейкинов и гормонов на клетки, реализующие воспалительный процесс.

Впервые применение азоксимера бромида в унифицированной модели микробного воспаления позволило проследить оптимизацию регуляторных механизмов клеточных реакций воспалительного процесса с определением их морфологических характеристик. Приоритетными являются данные о том, что микробное воспаление с коррекцией иммуномодулягором сопровождалось увеличением содержания противовоспалительных интерлейкина-10 и кортикостерона в плазме крови крыс, по сравнению с асептическим и стафилококковым воспалением, повышение уровня интерлейкина-1р было менее интенсивным, чем в серии с микробным воспалительным процессом. Установлено, что максимум концентрации провоспалительного интерлейкина-1 [3 регистрировался через 1 сутки от начала воспаления, то есть был приближен к срокам выработки при асептическом процессе. Новыми являются данные, что длительность клеточных фаз микробного воспаления при использовании азоксимера бромида была сокращена по сравнению с микробным воспалением. Установлено, что применение азоксимера бромида значительно улучшало течение микробного воспаления, препятствуя его хронизации.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ:

Результаты исследования дополняют знания врачей о патогенезе воспалительной реакции, конкретизируют представление о роли цитокинов и гормонов на этапах клеточных фаз воспаления. Полученные данные показывают, что дисбаланс цитокинов и гормонов является одним из механизмов хронизации воспаления.

Использование азоксимера бромида для коррекции микробного воспаления открыло новые аспекты клинического применения этого препарата в предупреждении хронизации воспалительного процесса.

Результаты проведенных исследований внедрены в учебный процесс кафедр факультетской терапии, фармакологии, патологии с курсом клинической иммунологии и аллергологии ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» Минзравсоцразвития России.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Асептическое воспаление у крыс сопровождается незначительным повышением провоспалительного интерлейкина-1(3 и кортикостерона с пиком концентраций на срок 12 часов и дальнейшим их снижением на фоне противоположных изменений в содержании противовоспалительного интерлейкина-10, что обеспечивает адекватную интенсивность клеточных реакций.

2. Микробное воспаление, вызванное золотистым стафилококком, характеризуется нарушением баланса про- и противовоспалительного цитокинов и гормонов, что способствует хронизации воспалительного процесса. Повышение и снижение уровней интерлейкинов происходят параллельно с максимумом значений через 2 суток от начала процесса, без преемственности, необходимой для адекватной регуляции воспалительного процесса. Значительное повышение содержания интерлейкина-1р сопровождается двукратным увеличением уровня интерлейкина-10 на фоне угнетения синтеза кортикостерона.

3. Иммуномодулятор азоксимера бромид сокращает течение микробного воспаления, препятствуя его хронизации путем воздействия на регуляторные механизмы клеточных фаз, приближая их к показателям асептического процесса. Увеличение содержания провоспалительного интерлейкина-1(3 через 1 сутки сопровождается двукратным повышением уровня кортикостерона. На фоне снижения интерлейкина-1р и кортикостерона противовоспалительный интерлейкин-10 возрастает в 4 раза через 2 суток процесса. Применение азоксимера бромида активирует противовоспалительные и оптимизирует провоспалительные регуляторные механизмы воспаления.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА

Диссертация является самостоятельным научным трудом, выполненным на базе кафедры патологии с курсом клинической иммунологии и аллергологии

ГБОУ ВПО ИГМУ (зав. д.м.н., проф. Семинский И. Ж.), отдела «Ультраструктуры клетки» ЛИН СО РАМ (рук. д.б.н. Лихошвай Е. В.), отдела лабораторной диагностики ГУЗ ИДЦ (зав. к.б.н. Огарков О. Б.). Автором осуществлялось моделирование очагов асептического и микробного воспаления у экспериментальных животных, коррекция микробного воспалительного процесса иммуномодулятором, оценка гистологических микропрепаратов тканей и электронограмм, создание базы данных, статистическая обработка и анализ полученных результатов, написание научных статей.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ:

Основные положения работы доложены и обсуждены на проблемной комиссии «Общая патология, морфология, физиология» Иркутского государственного медицинского университета (2008, 2009, 2010), Центральной проблемной комиссии Иркутского государственного медицинского университета (2011), межкафедральной конференции Иркутского государственного медицинского университета (2012), X Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (2012).

По теме диссертации опубликовано 9 статей, в том числе 8 - в рецензируемых научных журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ:

Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 44 рисунками и 11 таблицами. Библиографический справочник содержит 244 источника, из которых - 155 отечественных и 89 зарубежных авторов.

выводы

1. Одним из регуляторных механизмов асептического воспаления является повышение провоспалительного интерлейкина-1(3 и кортикостерона через 12 часов от начала процесса на фоне снижения противовоспалительного интерлейкина-10. С 12 часов воспаления увеличивается концентрация противовоспалительного интерлейкина-10, что обеспечивает адекватную продолжительность и своевременную смену клеточных реакций в очаге воспаления (лейкоцитарной фазы - 1 сутки, макрофагической - 2 - 3 сутки, фибробластической - 3 - 20 сутки).

2. Микробное воспаление характеризуется увеличением продолжительности лейкоцитарной фазы до 7 суток, макрофагической - до 20 суток и незавершенной фибробластической фазой, что свидетельствует о тенденции к хронизации воспалительного процесса.

3. Микробный воспалительный процесс сопровождается одновременным подъемом провоспалительного и противовоспалительного цитокинов с пиком концентраций через 2 суток и дальнейшим параллельным снижением их уровней, что значительно отличается от показателей, выявленных при асептическом воспалении.

4. Высокое содержание интерлейкина-1(3 при микробном воспалении приводит к угнетению выработки кортикостерона, концентрация которого снижается в 2 раза с момента максимального уровня провоспалительного интерлейкина-1(3, по сравнению с показателями, полученными у здоровых крыс.

5. При микробном воспалительном процессе выявленный дисбаланс про- и противовоспалительного интерлейкинов и кортикостерона обусловливает недостаточность основных функций клеток, реализующих воспаление: снижены все реакции нейтрофилов, макрофагов, фибробластов, особенно фагоцитарная и синтетическая (в 1,7 и 1,6 раза соответственно).

6. Применение иммуномодулятора азоксимера бромида сокращает длительность клеточных реакций воспаления (лейкоцитарную фазу - на 2 суток, макрофагическую - на 5 суток, завершение фибробластической -на 60 сутки), улучшает функции фагоцитов и фибробластов, ответственных за воспалительный процесс, препятствует затягиванию микробного воспаления.

7. Азоксимера бромид в 4 раза усиливает выработку противовоспалительного интерлейкина-10 и в 2 раза кортикостерона на фоне умеренного повышения провоспалительного интерлейкина-ip. Применение азоксимера бромида активирует противовоспалительные и оптимизирует провоспалительные механизмы регуляции воспалительного процесса. Динамика изменений содержания цитокинов и кортикостерона под влиянием иммуномодулятора приближается к показателям асептического воспаления.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По нашим данным, воспалительный процесс, вызванный введением диффузионных камер, заполненных физиологическим раствором, протекал по законам острого асептического воспаления. В течение первых суток вокруг стенок камер формировался лейкоцитарный вал толщиной 150 ± 8 мкм с плотностью клеток 28 ± 4 на 1000 мкм" с преобладанием нейтрофилов, соотношение нейтрофил : макрофаг - 75 % : 25 %. Нейтрофилы интенсивно захватывали продукты разрушенных тканей. В этот же срок происходил массовый аутолиз нейтрофилов вследствие незавершенного фагоцитоза. В отдаленной от очага воспаления зоне имелись незначительная сосудистая реакция, признаки стаза и гиперемии, дилатация капилляров и венул, краевое стояние лейкоцитов, периваскулярная инфильтрация. На 2 - 3 сутки воспалительного процесса, вызванного имплантацией камер с физиологическим раствором, происходило уменьшение толщины лейкоцитарного вала вокруг стенок камер до 62 ± 6 мкм. В нем начинали преобладать макрофаги, которые активно фагоцитировали нейтрофильный детрит, очищая зону повреждения и подготавливая ее к дальнейшему фиброзированию. Сосудистая реакция снижалась. Ультраструктура макрофагов соответствовала их высокой функциональной активности. В периферической зоне происходило накопление малодифференцированных фибробластов. Начиная с 3 суток воспалительного процесса регистрировалось постепенное замещение макрофагов в лейкоцитарном вале на фибробласты, которые формировали соединительнотканную капсулу вокруг стенок камер. К 10 суткам толщина фибробластической капсулы была максимальной 100 ± 15 мкм. Она состояла из 8-10 слоев фибробластов, синтезирующих коллаген и гликозаминогликаны. В дальнейшие сроки наблюдения происходила организация фибробластической капсулы: уменьшалась ее толщина до 50 ± 7 мкм, фибробласты превращались в фиброциты, снижалась их синтетическая активность, внутрь капсулы прорастали новые капилляры.

Установлено, что при моделировании микробного воспаления путем введения под кожу животным диффузионных камер, заполненных стафилококком, лейкоцитарная реакция регистрировалась с 1 по 7 сутки воспалительного процесса. Толщина лейкоцитарного вала постепенно нарастала, достигая максимальной толщины на срок 3 суток - 349,4 ± 40,0 мкм, плотность клеток в вале была 20 - 25 клеток на 1000 мкм". В клеточном вале преобладали нейтрофилы, соотношение нейтрофил : макрофаг = 3:1. Для нейтрофилов в очаге воспаления у этой группы животных были характерны незавершенный фагоцитоз и значительный аутолиз. Лейкоцитарный вал представлял нейтрофильный детрит, в котором имелись клетки стафилококка. В периферической крови наблюдался нейтрофильный сдвиг лейкоцитарной формулы влево. ФЧ - 4 - 6 микробных тел на клетку, ФИ - 60 - 70 %. В отдаленной зоне была выражена сосудистая реакция: отек соединительной ткани, отложение нитей фибрина, краевое стояние лейкоцитов, диапедез и перивазальная инфильтрация. Миграция и дифференцировка клеток фибробластического ряда была замедлена по отношению к контролю. Начиная с 7 суток от начала воспаления в лейкоцитарном вале начинали преобладать макрофаги, количество которых в 2 раза превышало количество нейтрофилов. Клеточный вал становился менее плотным -. 18,9 ± 0,7 на 1000 мкм". Толщина вала снижалась до 208,7 ± 28,4 мкм. Ультраструктура макрофагов соответствовала стадии воспалительного процесса. В клетках имелось большое количество фаголизосом, содержащих фрагменты стафилококка и нейтрофильного детрита. Часть макрофагов подвергалась деградации и аутолизу. В периферической зоне очага воспаления регистрировалось снижение сосудистой реакции, периваскулярные инфильтраты в основном были представлены моноцитами. Формирующаяся по периферии лейкоцитарного вала фибробластическая капсула имела толщину 245,0 ± 37,8 мкм, 4-5 слоев фибробластов образовывали параллельные ряды. В капсуле преобладали малодифференцированные формы фибробластов, синтез коллагена осуществлялся слабо. Аналогичная картина наблюдалась до 20 суток от начала воспаления. Лишь к 20 суткам воспалительного процесса произошло уменьшение толщины лейкоцитарного вала до 167,5 ± 46,2 мкм. Клеточный вал состоял в основном из макрофагов, скоплений стафилококка не обнаруживалось. Сосудистая реакция затухала. Фибробластическая капсула медленно уплотнялась, большинство клеток по ультраструктуре соответствовало коллагенобластам. Между рядами фибробластов располагались нити коллагена, хотя в фибробластической капсуле присутствовало незначительное количество макрофагов. При стафилококковом воспалении до 60 суток фибробластическая капсула оставалась незрелой: толщина - 250 - 350 мкм, недостаточное количество коллагена, маленькая плотность фибробластов, наличие макрофагов.

Установлено, что у животных с микробным воспалением, вызванным имплантацией камер со стафилококком на фоне введения азоксимера бромида, лейкоцитарная фаза воспаления протекала в течение 5 суток. Максимальная толщина лейкоцитарного вала регистрировалась на срок 1 сутки 340,0 ± 42,4 мкм. На этот же срок наблюдалась максимальная плотность клеток в вале 26,6 ± 1,7 на 1000 мкм". Среди клеточных форм преобладали нейтрофилы, которые интенсивно фагоцитировали фрагменты разрушенных тканей, клетки стафилококка. Их фагоцитарная активность была выше, чем в серии с микробным воспалением (ФЧ = 8-10 микробных тел на клетку; ФИ = 70-75 %). В периферической зоне очага воспаления наблюдалась значительная сосудистая реакция подкожной соединительной ткани: вазодилатация, полнокровие сосудов, диапедез и периваскулярная инфильтрация лейкоцитов, среди которых вначале преобладали нейтрофилы, а затем - моноциты. В этой же зоне регистрировалось незначительное количество малодифференцированных фибробластов. Затем до 5 суток от начала воспаления в лейкоцитарном вале происходил незавершенный фагоцитоз нейтрофилов, их массовая гибель и, начиная с 5 суток, в очаге воспаления преобладали макрофаги, которые сменяли нейтрофилы и являлись основными фагоцитирующими клетками. Макрофаги эффективно переваривали нейтрофильный детрит и клетки стафилококка. Ультраструктура макрофагов характеризовалась гипертрофией вакуолярно-лизосомального аппарата, в фаголизосомах содержались остаточные тельца. В периферической зоне очага воспаления сосудистая реакция снижалась, среди клеточных форм преобладали моноциты и малодифференцированные фибробласты. Обращало на себя внимание усиление микровезикулярного транспорта через эндотелиоциты микрососудов, по сравнению с картиной, наблюдавшейся при микробном воспалении. К 15 суткам от момента введения камер макрофаги полностью очистили зону повреждения от стафилококка, нейтрофильного детрита, девитализированных тканей, что позволило фибробластам эффективно формировать соединительнотканную капсулу. Фибробластическая фаза воспаления началась с 3 суток, когда вокруг камер по периферии клеточного вала появилась тонкая фибробластическая капсула, состоящая из 3 - 4 слоев параллельно ориентированных клеток, начинающих синтезировать гликозаминогликаны и коллаген. Капсула закономерно развивалась, достигнув максимальной толщины на 10 сутки (318,3 ± 46,2 мкм) с числом слоев 7-8. Большинство фибробластов интенсивно синтезировало компоненты соединительной ткани, признаков острого воспаления не наблюдалось. Начиная с 10 суток, происходило уплотнение фибробластической капсулы, уменьшение ее толщины до 208 ± 24 мкм, снижение синтеза коллагена, трансформация фибробластов в фиброциты, образование новых капилляров.

На основании анализа литературных данных и собственных исследований можно предложить схему, отражающую роль ИЛ-10, ИЛ-10 и кортикостерона в механизмах формирования клеточных реакций в очаге асептического, микробного и микробного с коррекцией азоксимера бромидом воспаления (рис. 44). При асептическом воспалении имелись оптимальное увеличение и динамика интерлейкинов и кортикостерона, что сопровождалось адекватной продолжительностью и своевременной сменой клеточных реакций в очаге воспаления (физиологическое воспаление). При микробном воспалительном процессе имелось чрезмерное увеличение уровня HJI-ip, повышение ИЛ-10 на фоне угнетения выработки кортикостерона, что привело к затягиванию во времени всех фаз воспаления с наложением их друг на друга (тенденция к хронизации воспаления). Микробное воспаление с коррекцией азоксимера бромидом сопровождалось умеренным повышением ИЛ-1(3 на фоне выраженного подъема ИЛ-10 и кортикостерона, что сократило длительность клеточных фаз, приблизив ее к продолжительности реакций при асептическом воспалительном процессе (оптимизация воспаления) (рис. 43 а, б, в).

•••»••• макрофагическая фаза --»--лейкоцитарная фаза —»-—фибробластическая фаза а б в

Рис. 43. Длительность клеточных реакций в зависимости от формы экспериментального воспаления (а - асептическое воспаление; б - микробное воспаление; в - микробное воспаление с коррекцией азоксимера бромидом; Л -лейкоцитарная фаза; М - макрофагическая фаза; Ф - фибробластическая фаза).

Рис. 44. Роль ИЛ-1(3, ИЛ-10, кортикостерона в механизмах формирования клеточных реакций в очагах экспериментального воспаления - увеличение концентрации; I - уменьшение концентрации; - увеличение длительности клеточной реакции; - сокращение длительности клеточной реакции).