Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Индукция гибели опухолевых клеток человека новой невирусной системой на основе дикатионных липидов, гена тимидинкиназы HVS-tk и ганцикловира

На правах рукописи

□03057156

МОСКОВЦЕВ АЛЕКСЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ИНДУКЦИЯ ГИБЕЛИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА НОВОЙ НЕВИРУСНОЙ СИСТЕМОЙ НА ОСНОВЕ КАТИОННЫХ БИСАМФИФИЛОВ, ГЕНА ТИМИДИНКИНАЗЫ Н8У-1к И ГАНЦИКЛОВИРА

14 00 16 - патологическая физиология 03 00 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2007

003057156

Работа выполнена в лаборатории генной терапии Государственного учреждения Научно-исследовательский институт биомедицинской химии РАМН, лаборатории фармакоцитокинетики Научно-исследовательского института экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ РАМН и в отделе общей и молекулярной патофизиологии Государственного учреждения Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской АМН

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Ренад Ибрагимович Жданов доктор медицинских наук Дмитрий Юрьевич Блохин

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАМН Александр Николаевич Терентьев

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН Олег Михайлович Поздняков

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет Автореферат разослан » 02 _2007 года

Защита диссертации состоится «¿3 » C>j 2007 года в 14 ч на заседании Диссертационного совета Д 001 003 01 при Научно-исследовательском институте общей патологии и патофизиологии РАМН по адресу 125315, Москва, Балтийская улица, дом 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат медицинских наук JIH Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Способность к саморегуляции числа клеток - основополагающее свойство многоклеточного организма Эффективным механизмом, обеспечивающим поддержание гомеостаза зрелых тканей и физиологический контроль роста при развитии систем в онтогенезе, является программируемая клеточная гибель, или апоптоз (Fischer, Schulze-Osthoff, 2005) Дизрегуляция апоптоза - существенный элемент развития ряда патологических синдромов Так, с одной стороны, острые коронарная недостаточность, цереброваскулярные заболевания, заболевания печени, почек ассоциированы с некротическими и некробиотическими процессами, массивно протекающими в функционально активных паренхиматозных структурах, в то время как нейродегенеративные синдромы являются следствием медленно прогрессирующей нейрональной гибели С другой стороны, уменьшение способности клеток к апоптозу и последующее их накопление может спровоцировать развитие онкологических и аутоиммунных заболеваний

Возможность модулировать индукцию апоптоза в тканях и управлять механизмом гибели клетки представляется весьма привлекательной целью Особую актуальность это приобретает для терапии онкологических заболеваний, которые по уровню социальной значимости стоят на первом месте в мире Можно сказать, что большинство методик химиотерапии опухолей основано на использовании механизма запрограммированной клеточной гибели (Waxman, Schwartz, 2003) путем активации различных триггеров, запускающих соответствующие природе триггеров и особенностям клетки-мишени каскады трансдукции и амплификации сигнала Воздействие химиотерапевтического агента на клетки является комплексным, и оно может оказаться недостаточно эффективным по отношению к малигнизированным клеткам по ряду причин Среди главных можно перечислить две недостаточность сигнала для индукции на уровне клеток-мишеней и дизрегуляция рецепторных и эффекторных каскадов апоптоза Клональная селекция при опухолевом росте может усилить эти два фактора Недостаточность индукции может быть обусловлена как внешними причинами, например, отсутствием необходимой специфичности действия агента (невысокая избирательность противоопухолевого действия), что приводит к значительной общей токсичности химиотерапии, так и внутренними, на уровне клетки, например, лекарственной устойчивостью Развивающиеся в последние годы методы генной терапии (Andersen, 1992), несмотря на очевидную сложность и проблемы роста этого направления, формируют новые подходы к терапии онкологических заболеваний (Баранов, 1999, Патрушев, 2000) Так, генно-инженерные системы активации нетоксичных соединений, к которым принадлежит исследуемая в работе тимидинкиназа вируса простого герпеса - ганцикловир (HSV-tk/GCV), позволяют воспроизводить триггер индукции клеточной гибели непосредственно в клетке-мишени и поддерживать его активность на высоком уровне с возможностью внешнего им управления Встраивание искусственного индуктора апоптоза происходит на уровне ДНК, реализация - посредством транскрипционного и трансляционного аппаратов клетки Это позволяет увеличить локальную концентрацию токсического индуктора в клетке и усилить сигнал Для успешного применения такого подхода необходимы эффективные системы транспорта генетического материала в клетки-мишени, обеспечивающие нативность доставленных нуклеиновых кислот как необходимое условие корректного включения их в клеточный контекст Существующие методы переноса генно-инженерных конструкций в клетки эукариот, такие, как порация мембран (электропорация, сонопорация, баллистические методы, магнитофекция), или вирусные вектора не всегда эффективны в условиях m vitro и ограничены в своей применимости m vivo либо из-за дополнительных барьеров организма, либо из-за побочных действий, связанных, например, с иммуногенностью вирусных векторов Перспективным альтернативным подходом стали невирусные вектора, лишенные ряда недостатков вышеперечисленных методов (Feigner et al, 1989, Duzgunes, 2003) Для транспорта генетического материала в этом случае используются различные соединения полимеры, липиды Липофекция - перенос генетического материала с помощью липидов -

рассматривается как один из многообещающих способов Однако, механизм липофекции недостаточно изучен, а ее системы не всегда эффективны Разработка новых эффективных v;iro и ш vzvo систем транспорта нуклеиновых кислот на основе неиммуногенных нетоксичных липидных векторных систем, в частности, катионных бисамфифилов, исследование их свойств и биологического действия представляется насущной задачей

Дальнейшее изучение путей индукции, амплификации и экзекуции, приводящих клетку к гибели в результате действия противоопухолевых препаратов, является актуальной проблемой Принято выделять две категории апоптоз-индуцирующих путей - внешние, связанные с активацией ряда так называемых рецепторов смерти, и внутренние, ассоциированные с рецепцией разнообразных повреждений клеточных структур (Achanta et al, 2001) В основе действия системы HSV-tk/GCV лежит экспрессия трансфицированными клетками фермента тимидинкиназы вируса простого герпеса первого типа, способного фосфорилировать ганцикловир до соответствующего монофосфата Последний, фосфорилированный эндогенными киназами до GCV-трифосфата, начинает конкурировать с эндогенным пулом дезоксирибогуаниловой кислоты в процессах синтеза ДНК Встраивание аномального нуклеотида вызывает остановку синтеза ДНК, одноцепочечные разрывы и запускает каскад клеточных реакций, одним из исходов которых может быть гибель клетки (Beltinger et al, 1999) Подробные механизмы индукции апоптоза системой HSV-tk/GCV, как и гомологичные им механизмы активности противоопухолевых препаратов - аналогов нуклеотидов, остаются не до конца изученными Цель исследования

Разработка, оценка эффективности и исследование механизмов действия невирусной генно-инженерной системы активации нетоксичных соединений «ген тимидинкиназы вируса простого герпеса - ганцикловир» на основе новых катионных бисамфифилов Задачи исследования

1 Изучить ключевые для целей транспорта нуклеиновых кислот в клетку физико-химические свойства дисперсных систем новых катионных бисамфифилов ДЭГА стабильность, размеры, агрегатную морфологию липидных частиц Оценить цитотоксичность и мембранотропность в культурах опухолевых клеток

2 Охарактеризовать морфологию и размеры липоплексов - супрамолекулярных ансамблей катионных бисамфифилов ДЭГА и плазмидных ДНК

3 Исследовать эффективность трансфекции липоплексами на основе ДЭГА культур клеток MCF7, 293 и Jurkat разными репортерными системами

4 Оценить эффективность индукции гибели клеток MCF7 и 293 системой ДЭГА-HSVtk-GCV

5 Изучить детали механизма цитотоксического действия системы ДЭГА-HSVtk-GCV, связанные с возможным вовлечением митохондрий и фактора транскрипции NF-kB

Научная новизна исследования Предложены новые катионные бисамфифилы ДЭГА в качестве невирусных медиаторов трансфекции в составе генно-инженерной системы активации нетоксичных соединений ДЭГА-HSV-tk/GCV Использованные в работе катионные бисамфифилы, принадлежащие к новому классу поверхностно активных соединений gemini surfactants, представляют собой оригинальный ряд веществ для изучения соотношения структура-активность Впервые обнаружена пониженная цитотоксичность соединений ДЭГА в группе germm surfactants по сравнению с альтернативной липидной системой DOTMA-DOPE Впервые для данной группы веществ показана зависимость морфологии липоплексов и трансфицирующей активности от длины спейсера в структуре молекулы ДЭГА Показана вовлеченность деполяризации митохондриальной мембраны и активации фактора транскрипции NF-kB в комплексный ответ клетки на действие системы HSV-tk/GCV

Теоретическая и практическая значимость работы Полученные в работе данные представляют теоретический интерес для понимания закономерностей и механизмов невирусного генного переноса и индукции апоптоза генно-инженерными системами

активации нетоксичных соединений Результаты работы имеют практическое значение для обеспечения дальнейшего прогресса в терапии онкологических заболеваний, а также оптимизации применения клинических протоколов генной терапии Основные положения, выносимые на защиту

1 Новые катионные бисамфифилы ДЭГА характеризуются низким значением критической концентрации мицеллообразования, преимущественно ламеллярной морфологией агрегатов в воде для ДЭГАЗ, смешанной для ДЭГА7 и мицеллярной для ДЭГА11, ДЭГА22 Температура фазового перехода ДЭГА близка к физиологической Катионные бисамфифилы ДЭГА образуют устойчивые дисперсные системы в воде

2 Структура и активность супрамолекулярных ансамблей катионных бисамфифилов с плазмидной ДНК зависят от длины алифатического спейсера

3 Среди катионных бисамфифилов ДЭГА при более низкой цитотоксичности максимальной трансфицирующей способностью, сравнимой с коммерческим препаратом Lipofectm, обладает ДЭГАЗ Эффективность трансфекции зависит от типа клеточной культуры, физико-химических особенностей липоплексов, определяемых химической структурой катионного липида

4 Система ДЭГА-HSV-tk/GCV индуцирует клеточную гибель в культурах эффективно трансфицируемых клеток

5 Обнаружена деполяризация митохондриальной мембраны и активация транскрипционного фактора NF-kB в экспрессирующих тимидинкиназу вируса простого герпеса клетках в ответ на ганцикловир

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались на конференциях и международных симпозиумах «Scanning probe Microscopy SPM-2002» (Нижний Новгород, 2002), International Workshop «Scanning Probe Microscopy in Life Sciences» (Берлин, 2003), 12th European Conference on Clinical Oncology, September 21-24, 2003,Copenhagen, Европейском Полимерном Конгрессе ( Москва, МГУ, 2005) Публикации По теме диссертации опубликовано 12 научных трудов, отражающих ее основное содержание

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 119 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, выводов Работа иллюстрирована 32 рисунками Библиографический список содержит 212 источника, из них 17 отечественных и 195 зарубежных

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводились in vitro на культурах клеток

линия ] MCF7 (рис 1 А), происхождение аденокарцинома молочной железы человека (плевральная жидкость) (J Natl Cancer Inst 1973, 51 1409-1416), эпителиоподобной морфологии, монослойный способ культивирования, среда DMEM с бычьим инсулином 10 мкг/мл Коллекция АТСС НТВ22

линия 2 293 (рис 1 Б), происхождение почка эмбриона человека, трансформированные ДНК аденовируса типа 5 (Ad 5) (Virology 1977, 77 319), эпителиоподобной морфологии, монослойный способ культивирования, среда DMEM Коллекция АТСС CRL 1573 линия 3 Jurkat (рис J В), происхождение Т-лимфобластная лейкемия человека (Virology 1977, 77 319), лимфобластоподобной морфологии, суспензионный способ культивирования, среда RPMI Коллекция ИНЦ РАН

Клетки получены из Российской коллекции культур клеток позвоночных (Институт цитологии РАН) Все клетки паспортизованы, прошли контроль видовой специфичности (во всех случаях проведен кариотипический анализ), контроль контаминации (бактерии, грибы и микоплазма не обнаружены)

РИС, I. Мир фол огня клеток, использованных и исследовании: культура клеток MCF-7(a),

культура клеток 293(6), культура клеток Jurkat(H) Световая микроскопия с

контрастированием Хоффмана, Nikon Eclipse ТЕ2000, 20Х

Ii исследовании использовались следующие генетические конструкции:

плазмидные Д1 IK pCMV-SPORT-|JGal (Bio Life Tech, Cat. No. 10586-04) (puc.2 A), pEGFP-NI

(Сtonteeh Laboratories, Inc. U.S.A.) (puc.2 Б), pUT649 (CAYLA, Z1 Montaudran - BP4437,

pEGFP-NI (6), pUT649 (в)

В качестве препарата сравнения в исследованиях фюико-химических свойств комплексов липид-ДНК, цитотоксичности, эффективности трансфскнии использовали Lipofeetm® Reagent: представляющий из себя смесь катпонных ли пи дои DOTMA и DOPE в весовом соотношении 1:1 в концентрации 1 мг/мв (Invitrogen Corporation, U.S.А.). Для индукции гибели траисфицированных HSV-tk позитивных клеток использовали ганцикловир (Хоффмзнн ля Рош).

Для селекции клеток, траисфицированных pUT649, использовали антибиотик флеомицинового ряда Zeocin™ (Cayla, France - InVivoGeii, U.S.A.)

Для визуализации изменения транс мембранного потенциала митохондрий использовали флуоресцентный зонд JC-i; СВГС2(3) (5,5',G,6'-tetrachloro-l ,1 \3,3' tetraethylbenzimidazolvl-carbocyatiine iodide) (Invitrogeû Corporation, U.S.A.). Методы и с слеп рванин.

Плазмидные ДИК наращивались в препаративном количестве в культуре Echerichia coli, были очищены и проанализированы согласно протоколам Маниатиса (Maniatis, 2003). Синтез катионных диче ров ДЭГА. новые катионные липиды синтезированы в лаборатории проф. Ю.Л, Ссбякина (МИТХТ). Соединения представляют собой катионные димериые амфиф ильные производные аминокислот, содержащие в качестве мономера дизфиры L-глутамииовой кислоты и две четвертичные аммониевые группировки, связанные алифатическим спейсером длиной от 3 до 22 (3, 7, 11, 22) метиле новых звеньев. В основу синтеза димеров положена схема, заключающаяся в последовательном получении соответствующего эфира аминокислоты, алкилировании свободной аминогруппы до третичной аминогруппы по реакции восстановительного алкилирования аминов Лсйкарта-

Валлаха, а затем связывании двух молекул эфиров в ходе реакции кватернизации с помощью соответствующих дигалогенидов Структура всех вновь синтезированных соединений подтверждена данными элементного анализа, метода 'Н-ЯМР, ИК-спектроскопии и масс-спектрометрии В качестве контроля при анализе мембранообразующих свойств использовали мономерный аналог L-глутаминовой кислоты Ci6GluN(CH3)3 Липосомы определенного вида готовились из синтезированных катионных димеров ДЭГА с одной длиной спейсера - 3, 7, 11 или 22 Липиды растворяли в хлороформе, липидную пленку получали выпариванием растворителя в роторном испарителе, затем сушили в вакууме Липидную пленку снимали добавлением в колбу испарителя 130 мМ раствора NaCl при встряхивании на вортексе К полученной суспензии больших мультиламеллярных липосом применяли последовательно диспергирование на ультразвуковой бане (Avanti Polar Lipids) 10 мин при 60°С и экструзию через поликарбонатные фильтры (Avanti Polar Lipids) с размером пор 400 нм, 200 нм, 100 нм при 50°С

Критический параметр упаковки р вычисляли по формуле p=v/(la), где v - объем углеводородных цепей амфифила, 1 - длина углеводородных цепей, а - площадь, занимаемая головной группой амфифила Площадь полярной группы а определяли экспериментально из диаграммы я/А (поверхностное натяжение/площадь одной молекулы) Для мономерного липида сравнения на основе L-глутаминовой кислоты этот параметр составляет 59±2 А2 (Ishikawa, et al, 1994) Объем углеводородных цепей вычисляли по формуле v=(27,4+26,9n)Ä3, где п-число углеродных атомов (Bhattacharya, et al, 1998) Длина цепей определяли по формуле 1=(1,5+1,2б5п) А, где n-число углеродных атомов Определение критической концентрации мицеллообразования определяли по графику зависимости A400/lgC (оптическая плотность при длине волны 400 нм/логарифм концентрации соединения) Оптическую плотность растворов определяли на спектрофотометре Jasco-7800 (Япония) в интервале концентраций 103 - 10 6 М/л при длине волны 400 нм и температуре 20°С

Определение температуры фазового перехода Все растворы смеси амфифила с красителем эозином (Россия) были приготовлены при добавлении необходимого количества водного раствора красителя к дисперсии липида, соотношение димер/эозин = 20 1 Образцы в кювете помещали на 10 мин в водяную баню выбранной температуры Измерение оптической плотности проводили при длине волны для мономера 524 нм, димера — 402 нм Устойчивость дисперсий и размеры частиц дисперсной фазы определяли методом корреляционной спектроскопии светорассеяния (динамического лазерного светорассеяния, ДЛС) на устройстве NICOMP 380 (Submicron Particle Sizer Nicomp Model 370, Santa Barbara,CA, USA), включающем He-Ne лазер с длиной волны 632,8 нм Образование липоплексов

Комплексы ДНК липид получали быстрым смешиванием пар растворов ДНК и суспензий липосом ДЭГА - 3, 7, 11, 22 с весовыми соотношениями 1 0,5, 1 1, 1 2,5, 1 5, 1 7,5, 1 10 соответственно Комплексы ДНК LipofectinR готовили согласно инструкции производителя с весовыми соотношениями 1 0,5,1 1, 1 2,5, 1 5, 1 7,5, 1 10 Атомная силовая микроскопия

Для изучения взаимодействия ДЭГА-липосом и LipofectinR с молекулами ДНК, (образование липоплексов) использовали метод атомной силовой микроскопии (ACM) (NanoScope III-a, Digital Instruments, Santa Barbara, USA) Применяли кантилеверы с конусом S13N4 (жесткость 0,32 N/M) для режима контактного съема и Si-кантилеверы с резонансной частотой 200-400 KHz для режима прерывистого съема Частота сканирования для контактного режима была 5 Hz, для прерывистого съема - 5 Hz В качестве подложки использовалась слюда Образец наносился на подложку, выдерживался в течение 5 минут для адсорбции, затем высушивался азотом После чего образец промывался несколькими каплями бидистиллированнной воды (Millipore), высушивался азотом Измерения проводились также и в жидкостной ячейке

Культуры клеток, определение цитотоксичности

Адгезионные клетки MCF-7, 293 культивировали на среде DMEM (Gibco™ Invitrogen Corporation) с 10 % FBS (Gibco™ Invitrogen Corporation) ) в атмосфере 5% C02, суспензионные Jurkat - RPM11640 (Gibco™ Invitrogen Corporation) с 10 % FBS (Gibco™ Invitrogen Corporation) в атмосфере 5% CO2 Цитотоксичность ДЭГА-липосом , LipofectinR определяли с помощью МТТ- теста Микроскопия

Статическую, цейтраферную микросъемку производили с помощью видеосистемы на базе цветной интегрирующей 3-х матричной (3CCD) камеры Sony, видеозахват и оцифровку - с помощью фреймграббера Matrox Meteor Флуоресцентную микроскопию производили на микроскопе Zeiss Axioskop 20, конфокальную лазерную сканирующую микроскопию - на инвертированном Nikon Eclipse ТЕ 2000, оснащенном контрастом Хоффмана и конфокальным модулем Cl с лазерами 488 и 543 нм Для цифровой обработки изображений использовалось программное обеспечение KS 100 (Zeiss), Adobe Photoshop, Ulead Media Studio, Image Pro Plus (Media Cybernetics), для трехмерной реконструкции - EZ-Cl v2 30 (Nikon)

Тропность ДЭГА-липосом к клеточной мембране

Определение тропности ДЭГА-липосом к мембране клеток MCF-7 и способности к внутриклеточному накоплению определяли методом флуоресцентной микроскопии с использованием липофильного флуоресцентного зонда кумарина Трансфекция

Липофекцию осуществляли добавлением липоплексов к клеткам в бессывороточной среде без антибиотиков и инкубацией в стандартных условиях культивирования в течение 2 часов После чего клетки отмывали от липоплексов и среду заменяли на полную ростовую Эффективность трансфекции оценивали с помощью световой (pCMV-SPORT-ß-gal) и флуоресцентной (pEGFP-Nl) микроскопии с последующим цифровым анализом изображений с помощью программного обеспечения Image Pro Plus (Media Cybernetics) Альтернативно для подсчета трансфицированных клеток использовали метод проточной цитометрии (pEGFP-Nl) через 24 часа после липофекции по экспрессии репортерных белков Эффективность трансфекции рассчитывали как долю клеток, экспрессирующих ген, к общему числу клеток в процентах Проточная цитометрия

Анализ клеточных суспензий осуществлялся на проточном цитометре Partee Pas, оснащенном лазером с длиной волны 488 нм

Детекция деполяризации митохондриалъной мембраны производилась с помощью зонда JC-1 и конфокальной сканирующей микроскопии

Подтверждение экспрессии мРНК HSV-tk осуществлялось с помощью RT-PCR Детекция активации NF-kB Определение активации транскрипционного фактора NF-kB (р65) в ответ на действие системы HSV-tk производили с помощью NoShift Transcription Factor Assay Kit (EMD Biosciences, Inc, an affiliate of Merck KGaA, Germany) Статистическую обработку результатов производили с помощью программного обеспечения Statistica ver 6 0 (StatSoft Inc, U S A ), а также Microsoft Excel Использовались однофакторный дисперсионный анализ и критерий Крускала-Уоллиса Различия считались достоверными при р<0,05

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для обеспечения дальнейшего прогресса в понимании критических факторов переноса функциональных генов в клетки-мишени с помощью невирусных систем липидной природы, поиска новых типов эффективных нетоксичных веществ для трансфекции, нами было предпринято рассмотрение нового типа молекул - так называемых бисамфифилов (Hatton et al ,1998), или Gemmi surfactants Все возрастающий интерес к активности этих бифункциональных димерных поверхностных агентов обусловлен их необычными физико-

химическими свойствами, существенно отличающимися от мономерных аналогов (Мег^сг е1 а1. 2000). Характерными особенностями химического строения молекул бисамфифилов являются две четвертичные аммониевые группировки, названные димерными, а также алифатический мостик, соединяющий две полярные головки липида (спейсер). Ряд физико-химических свойств бисамфифилов, возможность влиять на а|регатное состояние дисперсной фазы утих соединений в воде и на процесс комплсксообразования ДНК-лип пд путем изменения длины спенсера, были расценены нами как перспективные черты для целей транспорта генов в клетки-мишенн.

Проф. ТО.Л. Ссбякнным (МИТХТ) по оригинальной схеме осуществлен синтез ряда димернйх катионных амфифилов со спсйсерным участком разной длины Полученным соединениям присвоены аббревиатуры ДЭГАЗ, ДЭГЛ7, ДЭГА11, ДЭГА22, где числовой индекс отражает ключевую характеристическую особенность строения молекулы димеров -длину алифатического спсйсера.__

Структурные варианты:

я=3 ДЭГАЗ н=7 ДЭГЛ7 з=П ДЭГА11 в=22 ДЭГА22

Общая структурная формула синтезированных бисамфифилов (п=2).

ЦцС1(СС0СН

> V

ВЧАвООС.Яв

-'((-СНСООСяНи

в ДЭГАЗ г ДЭГАЗ д ДЭГА7 м" е ДЭГА7 л

Ж 3 и к

ДЭГА11 ¿г ДЭГА11 ДЭГА22 ДЭГА22

* Л

\ /Г •<

Чт [ > / N г

л Мономер м Мономер V

Рис, 3. Синтезированные бисамфифилы ДЗГА (М,М'-бис(|,4 - дигексадецил-М,!Ч'-диметил-Ь-глутамил)1,т -алкан дииодиды). Структурные формулы ДЭГА(в,д,ж,и) и мономера (л); конформвции молекул ДЭГА(г,е,з,к) и мономера (М) на основе расчета методом Конолли. По своей структуре N,N'-6110(1,4 - дигексадецил-Н,||*-диметил-Ь-глутамил) 1 (ш -алкан дииодиды являются димерными амфифняами, так как состоят из двух идентичных частей, каждая из которых содержит гидрофобную область (углеводородные хвосты остатки

гексадецилового спирта) и гидрофильную область (полярную головку, представленную четвертичной аммониевой группировкой)

Анализ конфорчаций молекул катионных димеров производился на основе расчета методом Конолли площади поверхности, доступной растворителю, -площади, заметаемой центром пробной сферы, моделирующей растворитель, при ее мысленном прокатывании по поверхности исследуемой молекулы Данные представлены на рис 3

Мембранообразующие свойства, критические концентрации мицеллообразования и температуры фазового перехода катионных димеров*. Для описания возможных агрегатных морфологий липидных архитектур, в значительной степени определяющих формирование комплекса липид-ДНК, использовалась эмпирическая молекулярная модель (Evans, Ninham, 1983) В соответствии с этой моделью липиды организуются в везикулы при значении критического параметра упаковки 0,5<р<1,0 При р<0,5 характерны мицеллярные дисперсии, в то время как при р>1,0 образуются агрегаты инвертировано-гексагональной структуры Полученные данные по мембранообразующим свойствам новых димерных катионных амфифилов свидетельствуют о том, что димерные амфифилы с длиной спейсера s=3, критический параметр упаковки р которых равен 0,71, способны образовывать агрегаты ламеллярной структуры Критические концентрация (ККМ) мицеллообразования и температура фазового перехода для ДЭГАЗ составляют соответственно 5*105моль/л и 42°С Соединение со спейсером s=7 обладает промежуточным параметром упаковки между мицеллярным и ламеллярным типом, имея р=0,49, ККМ=2* 10^ моль/л и Тьп=40°С, в то время как соединение с длиной спейсера s=ll организуется в мицеллы (р=0,38, ККМ=1*10"4 моль/л и Тфп=35°С) Обнаружено, что димерные амфифилы ДЭГАЗ, ДЭГА11 имеют низкое значение ККМ, в 2-4 раза меньшее, чем ККМ для мономерного аналога ДЭГА Ci6GluN(CH3)3 (р=0,71, ККМ=2* 10 4 моль/л и Тф п =45°С)

Для изучения процессов фазовых переходов использовался подход, основанный на связывании липидных дисперсий с красителем (эозином) Краситель имеет в растворе две формы мономерную и димерную Установлено, что с повышением температуры в водном растворе происходит переход формы красителя из димерной в мономерную В присутствии липидных агрегатов зависимость концентраций мономер - димер от температуры будет иной в связи со связыванием красителя с различными частями липида и проникновением его в гидрофобную область амфифила До температуры фазового перехода липида наблюдается простой переход димерной формы в мономерную форму красителя При достижении температуры фазового перехода происходит плавление углеводородных хвостов, краситель высвобождается из гидрофобной области и связывается в виде димера с положительно заряженными четвертичными аммониевыми группами Таким образом, в точке, соответствующей температуре фазового перехода, происходит перегиб линии зависимости интенсивности оптического поглощения димера/мономера от температуры Анализ полученных данных показывает, что синтезированные бисамфифилы имеют температуру фазового перехода, близкую к физиологической, и, следовательно, при температуре клетки эти амфифилы могут находиться в жидкокристаллическом состоянии Катионные бисамфифилы ДЭГА обладают необычными поверхностно-активными свойствами Учитывая наличие постоянного, не зависимого от рН среды, положительного заряда четвертичных аммониевых групп, можно рассматривать катионные бисамфифилы ДЭГА в качестве соединений, способных взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами и способствовать их переносу в клетки

Анализ размеров везикул дисперсных систем ДЭГАЗ, ДЭГА7, ДЭГА11, ДЭГА22, DOTMA-DOPE Размеры агрегатов (везикул) липидной фазы зависят от метода

♦Совместно с проф Ю JI Себякиным (МИТХТ)

приготовления липоеом В результате исследований дисперсных систем катионных димеров ДЭГА, полученных методом диспергирования на ультразвуковой бане без экструзии, обнаружено, что липосомальные препараты как ДЭГА, так и ООТМА-ООРЕ устойчивы во времени в условиях полярного растворителя (вода), постоянства рН=7,4, поддерживаемом фосфатно-солевым буфером при 1=37°С

> Размеры везикул ДЭГАЗ -К-Размеры везикул ДЭГА11 -•—Размеры везикул DOTMA DOPE

■Размеры везикул ДЭГА7 Размеры везикул ДЭГА22

Рис 4 Анализ размеров частиц дисперсных фаз катионных бисамфифилов

Упаковка молекул частиц дисперсной фазы, состояние дисперсной фазы определяются конформацией молекул, электростатическими и гидрофобными взаимодействиями полярных частей и гидрофобных остатков молекул, соответственно Катионные димеры с коротким спейсером имеют неравномерно распределенную плотность заряда поверхности везикулы, поэтому электростатическое отталкивание между частицами дисперсной фазы у димеров с коротким спейсером в целом ниже, чем у димеров с длинным спейсером Увеличение размеров везикул ДЭГАЗ по сравнению с другими катионными димерами может быть вызвано этой причиной

Анализ размеров* и морфологии липоплексов

В результате предварительно проведенных экспериментов по оценке эффективности трансфекции оптимальное весовое соотношение липид-ДНК ЬЛ) для липоплексов ДЭГА-рЕОРР-Ш оказалось равным 5, для БОТМА-БОРЕ- рЕОРР-Ш - 2 В связи с этим, определение агрегативной устойчивости липоплексов проводили для указанных соотношений

♦Совместно с н с НИИ ЭДИТО Е Ю Филиновой

—♦—Размеры комплексов ДЭГАЗ —А^Размеры комплексов ДЭГА7 фракция1

- -Размеры комплексов ДЭГА7 фракция2 —Ж—Размеры комплексов ДЭГА11 —♦—Размеры комплексов ДЗГА22 —®— Размеры комплексов DOTMA DOPE

Рис 5 Агрегативная устойчивость липоплексов ДЭГА- рЕОРР-Ш, БОТМА-БОРЕ- рЕОРР-N1

Липоплексы ДЭГА 11,22- рЕОРР-Ш агрегировали с неравновесной кинетикой, приведшей к значительной ошибке определения размеров Катионный димер ДЭГА-7 образовывал с плазмидной ДНК рЕОИР-К 1 две фракции липоплексов с исходными размерами 210 и 360 нм, последняя агрегировала интенсивнее (рис 5) Полидисперсность размеров липоплексов превышала таковую липосомных препаратов

Основным фактором, определяющим распределение липоплексов по размерам при разном соотношении липид-ДНК, является конечный заряд комплексов На диаграмме распределения размеров липоплексов в зависимости от соотношения липид-ДНК выраженные максимумы соответствуют заряду липоплексов, близкому к нейтральному (рис 6)

Рис 6 Распределение липоплексов ДЭГАЗ,7- pEGFP-Nl, DOTMA-DOPE- pEGFP-Nl по размерам при разном соотношении липид-ДНК (L/D)

Для изучения пространственной структуры комплексов, образующихся при смешении катионных липосом на основе димерных амфифилов с ДНК, была применена атомно-силовая микроскопия Дисперсионные системы DOTMA-DOPE, ДЭГАЗ, ДЭГА7

продемонстрировали в основном глобулярный вид везикул (рие7), Визуализировались агрегаты везикул катионных димеров - ДЭГАЗ и ДЭГА7 (показаны стрелками на рис.'' в,г)

а ЦОТМА-ООРЕ - ' —4.7 ,/ на ^аЭРЧИж^НР 0 б ВОТМА-РОРЕ 1 Ж ЧРШ -Хгяз о

в ДЭГЛЗ Г ДЭГЛ7 г^^Щ^НЯ* изо у? .у не Ш 1

Рис. 7. Атомная силовая микроскопия липоеом ГЮТМЛ-ООРЕ (а, б), ДЭГЛЗ(в) и ДЭГА7(г).

В ходе экспериментов было обнаружено, что липосомы на основе димеров с различными спейсерными участками при взаимодействии с ДНК образуют два разных комплекса, отличающихся по геометрической форме и по размеру. Так, для комплексов, образованных катионнымн липосомами на основе липида со спейссром э=3 основной геометрической формой являлся торопд, тогда как для липоеом, состоящих из липидов со спейссром 5=7 наиболее вероятной являлась цилиндрическая структура, хотя и наблюдалось присутствие небольшого количества глобулярных частиц. Различия отмечались и в отношении размеров образовавшихся комплексов (рис.8). Применение метода атомной силовой микроскопии для визуализации как липоеомальных препаратов, так и липоплексов дало в целом результаты, сопоставимые сланными корелляционной спектроскопии рассеяния.

Катионные димеры содержат две четвертичные аммониевые группы. Димеры с длинными спейсерами при образовании липоплексов более эффективно локализуют и нейтрализуют заряд ДНК, имеют при этом достаточно обьемные гидрофобные части, что может способствовать образованию комплексов гексагональной фазы димера и ДНК, причем матрицей для липоплексов выступает ДНК. Липоплексы, образуемые катионными димерами е длинными спейсерами в таком случае должны иметь преимуществен!гую форму цилиндров и агрегировать, что, возможно, является причиной неустойчивости липоплексов ДЭГА11,22-рЕСРР-Ж. При комплексообразованпи ДНК с димерами с короткими спейсерами последние, возможно, сохраняют бислойную структуру в связи с меньшим объемом гидрофобных частей. Термодинамика взаимодействия катионных липидов, и в особенности катионных димеров с Д51К сложна, и на настоящее время не существует точной формальной модели этого процесса.

Й ДЭГАЗ- рЕОРР-И 1 1 ь-а-ак. б ДЭГАЗ- рС М V - Э РО КТ-Р-ца 1 1 Вы ' кс т—^ / /3£с зн 0

В ДЭГА7- pEGFP-.Nl Г ДЭГА7- рЕСРР-Ш

д ДЭГА7- оСМУ-5РОЯТ-В-аа! е ДЭЕА22- рЕйЕР-Ы!

ж ООТМА-ООРЕ- рЕОРР-Ы1 3 ООТМА-ООРЕ- рСМУ^РОКТ-р^а!

Рис. 8. Атомная силовая микроскопия липопясксов ДЭГАЗ- рЕОРР-Ы 1 (а), ДЭГАЗ- рСМУ-5РОКТ-р-ца1(б), ДЭГА7- рЕОРР-И! (в,г), ДЭГА7- рСМУ-ЗКЖТ-^аЦд), ДЭГА22- рЕОРР-Ш(е) ООТМА-ООРЕ- рЕОРР-Ы 1(ж), ООТМА-ООРЕ- рСМУ-5РОГГ-р-^ (з)

Цитотокснчность катонных димеров ДЭГЛ. В ходе предварительных экспериментов было установлено, что токсичность липоплексов определяется, в основном, липидным компонентом. При выборе метода оценки цитотоксичности дисперсий катионных липидов исходили из предположения, что их действие на клетку может быть обусловлено не только прямым мембранотропиым эффектом, но и являться результатом цепи внутриклеточных событий после попадания в клетку липосомальных частиц и иметь, таким образом, отсроченный эффект. Для определения общей цитотоксичности был использован МТТ-тест, основанный на способности м итохо ндриал ьн ых дегидрогеназ конвертировать водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиуь( бромид (МТТ) в окрашенный формазан, который кристаллизуется в ну фи клетки. Растворение формазана с помощью димстилсульф оксида (ДМСО) или изопропанола, позволяет осуществить фотометрию и фиксировать изменение оптической плотности раствора, пропорциональной числу жизнеспособных клеток.

Характер зависимости оптической плотное™ от количества клеток в 1 мл суспензии для культур клеток MCF7, 293 и Jurkat близок к линейному в рабочем диапазоне концентраций клеточных суспензий. Поскольку активность митох он дриал ьных дегидрогеназ неодинакова в клетках разных линий, калибровочные кривые МТТ-теста не совпадают (рис,9)

ia

8 " г: ,-"• 1 I

£ о а в в X 04 § е* вг у-: . Я ' I 1

■а зо » 40 » « из во » 1« 110

Кол-во леток/ 10ОО/мл

[-»-MCF7 —2Ю Aiitot

Рис. 9, Калибровочная кривая оптическая плотность-количество клеток для культур 293, MCF7, Jurkat

МТТ-тест проводили с клетками 293, MCF7, Jurkat в двух временных интервалах - ¡2 часов и 24 часа инкубации для диапазона концентраций липидных соединений, верхний предел которого более, чем в 10 раз превышает рабочую концентрацию липидов (рис.10).

Рис. !0. Цитотоксичность кат ионных днмеров ДЭГЛ и ГЮТМЛ-ООРЕ для культур клеток МСИ7 (а, б), 293 (в, г), 1игка1 (д, е) для интервалов ¡2ч, 24ч

В связи с тем, что МТТ-тест основан на оценке ферментативной активности митОХОндриальных дегидрогеназ, под понятием общая цитотоксичность мы понимаем лишь зафиксированное снижение конверсии МТТ в формазан, которое может быть вызвано как минимум двумя факторами - изменением количества жизнеспособных клеток в результате их гибели, индуцированной цитотоксическим агентом, и влиянием веществ на мегаболизм. Сопоставление МТТ-теста и прямого подсчета жизнеспособных клеток, основанного на применении пары флуоресцентных красителей: акридинового оранжевого и этидин бромида (рис. 11), позволило структурировать цитотоксичность по крайней мерс для одной концентрации веществ и в одной временной точке основной вклад в нее вносит гибель клеток, индуцированная кат но иным и ля пилами. Влияние веществ на метаболизм в данном сравнении статистически недостоверно, однако из-за больших ошибок прямых подсчетов клеток полностью исключить его нельзя, и требуются дальнейшие исследования.

Цитотоксичносгь. клетки MCF7« 24 ч 100 мкг/мл

100 о

900 ■ 8(>0 § 70.0

Е- ео.о § soo

* 40.0 о 30.0

* 20 0 10.0

0.0

Ь-- j

ДЭГА1 ' Д^ГДП ДЭГИ2 ООТ

ыи динтий 00

■ ЧОРД ДИТ1ИЯД. Й - ^нтХКПОМ&ч-^ W4TM

ЦИТОТСКСИЧНОСТЬ, КЛСТИИ .Ii- - J' 24 ' ООЧКГ.'МГ!

Рис. 11. Сопоставление МТТ-теста и подсчета количества жизнеспособных клеток с применением пары флуоресцентных красителей: акридиновый оранжевый, этидий бромид: MCF7, 24 ч 100 м кг/мл липндов(а); 293, 24 ч i 00м кг/мл .пипидов(б); Jurkat, 24 ч 100 м к г/мл ЛНПИДОв(в),

Таким образом, величины ингибнрующих концентраций следующие:

lCso-i2 для соединений ДЭГД7, ДЭГА11, ДЭГА22 в культуре клеток MCF7 находится в

диапазоне 50,0-100,0 мкг/мл, DOTMA-DOPE около 25,0 мкг/мл.

1С ко-12 ч для соединений ДЭГАЗ, ДЭГА7, ДЭГАМ в культуре клеток 293 находится в диапазоне 50,0-100,0 мкг/мл, ДЭГА22 - около 25,0 мкг/мл, DOTMA-DOPE - в диапазоне 12,5-25,0 мкг/мл.

ICso-12 ч для соединений ДЭГАЗ, ДЭГА7, DOTMA-DOPE в культуре клеток Jurkat находится к диапазоне 3,1-6,3 мкг/мл, ДОГА 1 I - в диапазоне 6,3-12,5 мкг/мл, ДЭГА22 - в диапазоне 12,5-25,0 мкг/мл.

На основе полученных данных мы можем заключить, что общая иитотоксичнссть катионных димеров ДЭГА достоверно ниже, чем DOTMA-DOPE; токсичность в культуре клеток Jurkat лимфобластного происхождения выше у всех соединений по сравнению с адгезионными культурами MCF7 и 293. 13 диапазоне концентраций и при временах экспозиции, соответствующих условиям траксфекции, токсичность всех соединений незначительна, что делает возможным их применение в качестве медиаторе® травсфекции. По результатам исследования гропности ДЭГАЗ-липосом к плазматической мембране клеток MCF7 показано, что уже через 3-5 минут после инкубации флуоресцентно меченых липосом с клетками наблюдается флуоресценция клеток по периметру, что может свидетельствовать о связывании липосом с мембраной клеток. Через 10-15 мин. наблюдалось накопление флуоресцентной .метки в цитоплазме в виде дискретных образований (рис. 12).

Время инкубации 5 мин.Стрелкой помечена линия гистограммы. Поле!

Время инкубации 15

мин.Стрелкой помечена линия

гастограммц. 11оиге2

Гистограмма адоль линии Х=520 но зеленому каналу (НП'С). Время ннкубанин 5 мин. Поде!

Гистограмма вдоль линии \'=Ш0 но зеленому каналу (К1ТС). Время н||кубацнн I5 мин. Поле2

4 А

В Время инкубации 5 мнн.

Поле!

■

. : а]

Время инкубации 15 мни. Полс2

Время инкубации ] 5 мнн. Стрелкой помечена линия гистограммы. ПолеЗ

Гистограмма вдоль пинии У 240 по зеленому каналу (К1ТС). Время инкубации ]5 иин. ПодеЗ

Время инкубации ] 5 мин. ПолеЗ

Ж

■ а^Д

Время инкубации 15 мин. Полс4

Время инкубации 15 мнн. Поле4

Время инкубации 15 мнн. Поле 5

Рис, 12. Инкубация во влажной камере флуоресцентномеченых липосом ДЭГЛЗ с клетками МСР-7, время инкубации 5 и 15 мин, флуоресцентная (а, б, г, д, ж, з, к, м) , флуоресцентная и светлопольная микроскопищ'в, е, и, л).

Эффективность трансфекции клеток лнпоплексами ДЭГА. Преимуществом не вирусных систем трансфекции но сравнению с вирусными является отсутствие жестких ограничений на размер генетических конструкций, что делает возможным применение сравнительно больших и сложных плазмидных ДНК. Для определения влияния на эффективность трансфекции размера генетических конструкций и оценки возможности применения катионных димеров с разными плазмидными ДНК использовали два вида репортерных систем:

Л) основанная на экспрессии в трансфицированных клетках фермента [i-галактозидазы, идентифицируемой по хромогенной реакции с субстратом X-Gal, Ген р-галактозидазы входит в состав 7,2 Jib плазмидной ДПК рСМV-SP0RT-P-gaI пол контролем immédiate early promoter of CMV ( Pcmv it);

Б) основанная на экспрессии в транфицированных клетках мутантной формы зеленого флуоресцентного белка с оптимизированными спектральными свойствами. Ген EGFP входит в состав 4,7 kh плазм ид ной Д] IK pEGFP-Nt под контролем immediate early promoter of CMV ( Pcmv ie).

Использование идентичных промотеров в репортерных системах позволило исключить эффект «силы промотора» на экспрессию трансгена. Плачмидные ДНК перед образованием липоплексов находились преимущественно в супсрскручснной форме, что подтверждалось элеирофоретической подвижностью.

В оценке эффективности трансфекции методами светлопольной и флуоресцентной микроскопии с прямым подсчетом клеток, экс премирующих репортерный ген, статистически достоверных отличий между репортерными системами обнаружено не было. Таким образом, для данных генетических конструкций влияния их размеров на эффективность трансфекции не выявлено. Сравнимая экспрессия (-35% для ДЭГАЗ) для двух репортерных систем подтверждает возможность использования катионных димеров ДЭГА с различными плазмидными ДНК. Методы прямого подсчета клеток в светлопольной и флуоресцентной микроскопии, несмотря на ошибку, могут служить для оценки эффективности трансфекции (рис. 13, 14).

Рис. 13, Клетки 293, трансфицированные липоплексами ДЭГА-репортсрные плазмиды: а, б -ДЭГАЗ с рЕ01'Р-Ы1, флуоресцентная мпкроскопия(а), флуоресцентная и светлопольная микроскопия; в, г - ДЭГЛ7 с рСМУ-ЭРОЯТ-р-да1, светлопольная микроскопия. Стрелками показаны трасфнцированные клетки.

В ДЭГАЗ, световая 0 ДЭГА7, световая □ ДЭГ А11. световая 0 ДЭ ГА 2 2, свето вая ЭООТМА-ООРЕ, световая

ЕДЭГАЗ. флуоресцентная

@ ДЭ ГА7 ,ф л уо р есце н тн зя О ДЭГА11 .флуоресцентная ЕЭ ДЭ Г А22, фпуоресце нт на я □ ООТМА-ООРЕ флуоресцентная

Рис. 14. Оценка эффективности трансфекшш клеток МСР7, 293, ]чгка1 \УТ липоплсксами с помощью подсчета при светлопольной (рС М V - К ГО [ГГ-р-уа!) и флуоресцентной микроскопии (рЕОРР-М 1)

Метод проточной цитомстрии по флуоресценции НОРР с применением ре портерной системы рЕОРР-№1 был использован для определения различий в эффективное™ тршефекции среди катион ных липидов (ДЭГАЗ, ДЭГА7, ДЭГА11, ДЭГА22 и ООТМА-ВОРЕ) и между клеточными культурами (МСТ7, 293, Наибольшая трансфицирующйя способность

была отмечена у ДЭГАЗ и ООТМА-ПОРЕ в адгезионных культурах МСР7 (-39% для ДЭГАЗ), 293 (-40% для ДЭГАЗ). Для суспензионной культуры Лигка! ни одна из предложенных невирусных систем не оказалась эффективной (рис. 15).

70 -60 50 40 ■ 30 20 10 о ■

А -и

щ § --

МСГ7

293

■ЬгЧа! УУТ

□ ДЭГАЗ □ ДЭГА7 аДЭГА11 ШДЭГА22 еСЮТМА-ООРЕ]

Рис. 15. Определение эффективности трансфскции клеток МСР-7,293, Jurkat с помощью проточной цитометрии

Цнтотоксическое действие эффекторною комплекса ДЭГАЗ-рUT649/GCV. В связи с наибольшей эффективностью трансфекции применение эффектор НОЙ плазмиды pUT649 осуществлялось в комплексе с ДЭГАЗ. Ци тота к с ическое действие спустя 72 часа после добавления в срсду культивации ганцикдовира, идентифицированное с помощью МТТ-теста, заключалось в существенном уменьшении количества жизнеспособных клеток культур и MCF7, и 293 (рис. 16).

120 1 100

1 во

2 к

1 40

iHtjJOni

1 ж

MCF7

293

¡□О, 1 rnkg/rn DI mkg/ml ■ 5mkg/ml □ контроль

Рис. 16. Выживаемос ть клеток культур MCF7 и 293 после трансфекции липоплексами ДЭГАЗ-рЦТ649 и гш и мене и ид гаиникловира. 72 часа. МТТ-тест

Высокий процент клеточной гибели (до 75 % для MCF7 и до 61% для 293) на фойе сравнительно невысокой эффективности трансфекции, не превышающей 50 %, возможно, обусловлен так называемым эффектом летального соседства (bystander effect), характерным часто наблюдаемым свойством суицидной системы HSV-tk/GCV. Считается, что это действие опосредовано межклеточными контактами, степень развития которых кореллируст с выраженностью эффекта.

Проведение селекции чралефицировинных рИТ649 клеток с целью обогащения популяции HSV-tk положительными клетками возможно благодаря тому, что продукт экспрессии представляет собой рскомбпнантный белок тимидинкиназу, конъюгированную с продуктом экспрессии Sb Ые гена (375 пар нуклеотидов) - небольшим белком - Sh ble protein (MW: 13.665 kDa), обладающим высокой афинностью к антибиотикам флеомици нового ряда (в частности, Zcocin) и тем самым сообщающим устойчивость трансфицированным клеткам. Экспрессия мРНК тимидинкиназы вируса простого герпеса первого типа была подтверждена с помощью RT-PCR с применением пары праймеров (sense: 5' -G С TGCTTG С A AT ACG GTGC G - 3'; amisciisc:5'-CGCAGATCGTCGGTATGGAGCC-3') Наличие полосы последовательности размером 368 оснований свидетельствует об ее экспрессии (рис. 17, помечена стрелкой).

Рис. ) 7. Электрофореграмма результата RT-PCR Исследование деполяризация митокондриальной мембраны при действии системы HSV-tk/GCV, Деполяризация митокондриальной мембраны свидетельствует о вовлечении митохондрии в индуцированный повреждением каскад клеточных реакций. Для проверки, имеет ли это место в случае системы HSV-tk, использовали конфокальную лазерную сканирующую микроскопию клеток MCF7, прошедших селекцию как HSV-tk позитивных и обработанных Гандиюювиром, против контрольных, нетрансфицированных. Для детекции трансмембранного потенциала мнтохондриальной мембраны использовали флуоресцентный зонд JC-l (5,5\6,6'-tetrachloro-1,1 ',3,3 '-tetraethylbenzimidazolyl carbo cyan ine iodide), обладающий высоким Сродством к митохондриям и способностью к спектральному сдвигу эмиссии с 527 нм в мономерной форме (зеленая флуоресценция) при снижении потенциала и деполяризации до 590 нм (оранжево-красная) при образовании J-агрегатов.

Рис. 18, Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия П5У-1к позитивных (опыт) и Н5У-1к негативных клеток МС?7 через 24 и 48 часов после добавления в среду ганцикловира. Окраска потенциалозависимым, тропным к митохондриям красителем .10-1, Гистограммы яркости соотношения красный/зеленый канал.

Полученные данные (рис, 18) позволяют утверждать, что в ответ на действие системы HSV-tk в клетках MCF7 развивается деполяризация митохондриапьной мембраны спустя 24 часа после начала инкубации с ганцикловиром, что может свидетельствовать о вовлечении митохондриадьного каскада в цепь событий, являющихся реакцией клетки на действие системы l!SV-tk.

Определение активации транскрипционного фактора NГ-kB (рб5) в ответ на действие системы HSV-tk производили с помощью NoShift Transcription Factor Assay Kit (EMD Biosciences, Inc, an affiliate of Merck KGaA, Germany), нового метода анализа транскрипционных факторов, альтернативного методу элсктрофоретической подвижности EMSA. Набор обеспечивает быструю и чувствительную детекцию транскрипционных факторов или других белков, связывающихся с ДНК и основан на колориметрии в планшете. Сущность метода заключается в образовании ДНК-белковых комплексов, в которых ДПК-связывающий белок, выделенный из клеток в составе либо общего лизата, либо экстракта белков ядра, распознает специфическую последовательность, представляющую из себя сайт связывания этого белка. Эта специфическая последовательность представлена в наборе биотинилированными двух цепочечными олигонуклеотидами, которые смешивают е белковым экстрактом. Смесь затем переносится в иммунологический планшет с иммобилизованным етрептавидином. Таким образом, олигонуклеотиды, как связавшиеся, так и не связавшиеся со «своим» узнающим белком, образовывают конъюгат со етрептавидином и фиксируются тем самым на поверхности планшета. Связавшийся белок (транскрипционный фактор) детектируется затем системой, состоящей из специфичных антител к ДНК-связывающему белку, вторичных антител, конъюгнрованных с псроксидазой хрена и хромогенной реакции с ТМВ субстратом. Активированные ДНК-связываюшис белки локализуются в ядре клеток, поэтому для анализа экстрагировали белки ядра клеток с помощью NucBustcr Protein Extraction Ки (EMD Biosciences, Inc. an affiliate of Merck KGaA, Germany)

Оншчсская I f.to I носи.. 00

02 04 0 6 О-в t 1-3 Ы 1.6 1.8 2

нет воздействии НЗОЗ, 30 90 мин

,-^-

К202, 30 м*М, М тт>, ННКП мвхмалярно Н202, 30 м-М. 90 мим СККП, HSV.fk/GCV. 24 часа

^-

_■ fO.eS- ■ ¡0 37_

KSV-IWGCV, СН<П, эквимолярмо lOHSV-A"-' ■HSV-tk-*i

Рис. 19. Активация NF-kB при действии системы HSV-tk/GCV по сравнению с контрольным воздействием перекисью водорода в культуре клеток MCF7 (где ННКП - неспецифическая нуклеотидиая конкурентная последовательность, С11КП - специфическая нуклеотилная конкурснтнаяпоследовательность)

В клетках MCF7 при действии системы HSV-tk/GCV спустя 24 часа после добавления ганцикловира в среду культивации была обнаружена активация фактора транскрипции NF-кВ, что определялось по увеличению оптической плотности (рис 19)

Обнаруженные клеточные ответы в виде деполяризации митохондриальной мембраны (рис 18) и активации NF-kB (рис 19) позволяют предположить комплексное действие системы HSV-tk/GCV, индуцирующее каскад реакций, ведущий к клеточной гибели Таким образом, индукция апоптоза представляет собой сложное событие, вовлекающее множество рецепторных зон и амплификационных петель Помимо классического р53-опосредованного пути в ответ на повреждение ДНК, имеющего место при действии HSV-tk, можно предположить подключение дополнительных стимулов, например, связанных с возможной пертурбацией репарации ядерной ДНК, синтеза митохондриальной ДНК (ядерно-митохондриальное взаимодействие) Каждый из этих сигналов может быть подпороговым и недостаточным для принятия клеткой решения о самоубийстве, но интегральной суммы сигналов может хватить для исполнения апоптоза Возможно, что клетка нуждается в своеобразном дополнительном «опросе» о степени повреждения своих систем для принятия решения об экзекуции эффекторной стадии апоптоза С этой точки зрения повреждение ядерной ДНК может являться основной, но отнюдь не единственной причиной апоптоза Интересным фактом в данном случае является изменение роли NF-kB, более известного как антиапоптотический фактор, в проапоптотический Это явление скорее говорит о неспецифическом модулировании этим транскрипционным фактором апоптотической машинерии, так как значительное количество промотеров содержит сайты связывания для NF-kB Специфичность интеграции сигнала может быть обусловлена не только типом повреждения, но и особенностями самой клетки-мишени, и это не противоречит наблюдаемой двойственной природе NF-kB

ВЫВОДЫ

1 В работе предложена новая невирусная система на основе катионных бисамфифилов ДЭГА, гена тимидинкиназы вируса простого герпеса в составе плазмидной ДНК pUT649 и ганцикловира, которая эффективно вызывает гибель опухолевых клеток по механизму апоптоза, индуцированного продуктом «летального синтеза» - активированным ганцикловиром

2 Дисперсные системы катионных бисамфифилов по данным физико-химических методов характеризуются агрегативной устойчивостью, субмикронными размерами и способностью к слиянию с мембранами клеток MCF-7

3 Изученные в работе бисамфифилы ДЭГА сравнительно нетоксичны в экспериментах m vitro на монослойных культурах клеток 293, MCF-7 и суспезионной культуре Jurkat и могут быть использованы в качестве медиаторов для переноса генетических конструкций в опухолевые клетки человека

4 Исследованы физико-химические свойства супрамолекулярных ансамблей катионных бисамфифилов и плазмидных ДНК (липоплексов) Показано, что эффективность трансфекции линий клеток 293, MCF-7 и Jurkat зависит от длины алифатического спейсера катионных бисамфифилов, определяющей морфологию липоплексов

5 Методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии показано, что в механизм гибели опухолевых клеток под действием системы ДЭГЛ-НЗУчк/гапцикловпр вовлечены ранняя деполяризация митохондриальной мембраны, а также активация фактора транскрипции NF-kB (модификация метода иммуно-ферментного анализа «по shift») В гибель клеток 293 и MCF-7 вносит вклад эффект «летального соседства» (bystander effect)

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Elkady А , Sebyakin Y , Gallyamov М , Moskovtsev А , Alexeev А , Bishoff G , Skripmkova M A , Zhdanov R, and Khokhlov A DNA-Lipid supramolecular complexes structural and functional peculiarities as studied by scanning atomic force microscopy// Proceedings of Int Conference on Scanning probe Microscopy SPM-2002 -Nizhnyi Novgorod, 2002 - P 181-183

2 Zhdanov R I, Bogdanenko E V , Moskovtsev A A , Podobed О V , and Duzgunes N Liposome-mediated gene delivery dependence on lipid structure, glycolipid mediated targeting, and immunological properties // Methods in Enzymol Liposomes, Part С Gene Transfer and Therapy (Elsevier) -2003 -Vol 373 - P 433-465

3 Elkady A , Sebyakin Y , Gallyamov M , Moskovtsev A , Bishoff G , Zhdanov RI, and Khokhlov AR DNA-Lipid supramolecular complexes structural and functional peculiarities as studied by scanning atomic force microscopy //Micro- and Nanostructures of Biological Systems (Shaker Verlag, Aachen) - 2004 -P 32-47

4 Zhdanov R I, Elkady A S , Moskovtsev A , Sebyakin Yu L , Khokhlov A R On structural-activity relationship for lipoplexes prepared from a newly synthesized dicationic lipid and plasmid DNA //Technology and Health Care-Int J of Health Care and Engineering (IOS Press) -2004 -Vol 12-№2-P 209-210

5 Zhdanov RI, Elkady A , Moskovtsev A A , Sebyakin Yu L, Larin A S , Muranov A V , Khokhlov A R Dependence of efficacy of gene transfer using lipoplexes based on new dicationic lipids from their structure // Doklady Biochem Biophys Int Ed -2004 -Vol 398 - P 261-264

6 Alice A Sokolovskaya, Andrey D Mikhailov, Aleksey A Moskovtsev, John E Eriksson and Dmitry Yu Blokhin Induction of CD95-resistance leads to multiresistant phenotype // Proceedings of the Miami Nature Biotechnology Winter Symposium 50 YEARS ON FROM THE DOUBLE HELIX TO MOLECULAR MEDICINE - 2003 - Vol 14 -P 41,112

7 A A Moskovtsev, E Filinova, Yu L Sebyakm, DYu Blokhin Detection of Potentially Effective Lipid Transfection Reagents //2nd International Workshop "Scanning Probe Microscopy in Life Sciences", Berlin, 2003 - P 14

8 A A Sokolovskaya, D Yu Blokhin, A D Mikhailov, T N Zabotina, A A Moskovtsev, J E Eriksson, A Yu Baryshnikov CD95-deficient cell line resistance to death receptors activation and other apoptotic signals// Abstrl8th UICC International Cancer Congress, 30 June- 5July, Oslo,Norway Int J Cancer - 2002 -Suppl 13, P 939

9 A A Sokolovskaya, A D Mikhailov, A A Moskovtsev, D Yu Blokhin, J E Eriksson, Induction of CD95-resistance cell lme leads to multiresistance phenotype//Abstr 10th Euroconference on Apoptosis"Charming to Death" - Institut Pasteur, Pans, 2002 -P131

ЮБогданенко ЕВ, Свиридов ЮВ, Московцев А А„ Жданов РИ Невирусный перенос генов in vivo в генной терапии//Вопросы Медицинской Химии -2000 -Т 46 - С 229-242

11 Соколовская А А , Заботина Т Н , Московцев А А , Лукашина М И , Жданов Р И , Блохин Д Ю Характеристика методов детекции апоптоза и их использование в экспериментальной и клинической онкологии //Российский Биотерапевтический Журнал - 2003 -Т 2 - №3 -С 53-60

12 Блохин Д Ю , Соколовская А А , Московцев А А Fas-дефицитная линия клеток Jurkat/A4, резистентная к индукторам и лигандам программированной клеточной гибели// Российский Биотерапевтический Журнал -2003 - №1- С 14

Заказ № 161/02/07 Подписано в печать 26 02 2007 Тираж 140 экз Уел пл 1,5

^ ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 \ '/ \vw\v с/г ги , е-тай т/о@с/г ги

Актуальность исследования

Способность к саморегуляции числа клеток - основополагающее свойство многоклеточного организма. Эффективным механизмом, обеспечивающим поддержание гомеостаза зрелых тканей и физиологический контроль роста при развитии систем в онтогенезе» является программируемая клеточная гибель» или алоптоз (Fischer. Schulze-OsthofF, 2005). Дизрегулнция аполтоза существенный элемент развития ряда патологических синдромов. Так, с одной стороны. острые коронарная недостаточность, цереброваекулярные заболевания, заболевания печени, почек ассоциированы с некротическими и нскробнотическнми процессами, массивно протекающими в функционально активных паренхиматозных структурах, в то время как нейродегенеративные синдромы являются следствием медленно прогрессирующей нейрональиой гибели, С другой стороны, уменьшение способности клеток к апоптшу и последующее их накопление может спровоцировать развитие онкологических и аутоиммунных заболеваний.

Для современной патофизиологии апоптоз, характеризуемый как запрограммированная последовательность молекулярных событий, ведущих клетку к гибели, представляет собой еще и концептуальное понятие, определяющее один из вариантов ответа клеткн на повреждающее воздействие. Апоптоз-залрограммнрованный акт активного самоуничтожения клеткн (Луценко В.К., 2004) - является элементом типовых патологических процессов, отличается детерминированным характером. «Повреждение играет роль причины и триггерного механизма развития патологического процесса, который осуществляется собственными, вторично возникающими, присущими самим измененным структурам, эндогенными механизмами» (Крыжаиовский Г.Н., 1996). Исследование этих эндогенных механизмов является для молекулярной патофизиологии актуальной задачей, а возможность модулировать индукцию алоптоза в тканях и управлять механизмом гибели клетки предстаапяется весьма привлекательной целью. Это особенно важно для терапнн онкологических заболеваний, которые по уровню социальной значимости стоит на одном m первых мест а мире- Можно скачать, что большинство методик химиотерапии опухолей основано на использовании механизма запрограммированной клеточной гибели (Waxman, Scbwaitz, 2003} путем активации различных триггеров, запускающих соответствующие природе триггеров и особенностям клетки-мишени каскады трансакции и амплификации сигнала Воздействие хнмнотерапевтнческого агента на клетки являете и комплексным, и оно может оказаться недостаточно эффективным по отношению к малигнизнрованным клеткам по ряду причин. Среди главных можно перечислить две: недостаточность сигнала для индукции на уровне клеток-мншеней и днзрегуляция рсцепторных и эффиаорных каскадов апоптоза, Клональная селекция при опухолевом росте может усилить эти два фактора. Недостаточность индукции может быть обусловлена как внешними причинами, например, отсутствием необходимой специфичности действия агента {невысокая избирательность противоопухолевого действия), что приводит к значительной общей токсичности химиотерапии, так и внутренними, на уровне клетки, например, лекарственной устойчивостью. Развивающиеся в последние годы методы генной терапии (Andersen. 1992), несмотря на очевидную сложность и проблемы роста этого направления, формируют новые подходы к терапии онкологических заболеваний (Баранов, 1999; Патрушев, 2000), Так, генно-инженерные системы активации нетоксичных соединений, к которым принадлежит исследуемая в работе гнмидннкиназа вируса простого герпеса ■ ганцикловир (HSV-tk/GCV), позволяют воспроизводить триггер индукции клеточной гибели непосредственно в клетке-мншени и поддерживать его активность на высоком уровне с возможностью внешнего им управления. Встраивание искусственного индуктора апоптоза происходит на уровне ДНК, реализация - посредством транскригщнонного и трансляционного аппаратов клетки. Это позволяет увеличить локальную концентрацию токсического индуктора в клетке и усилить сигнал. Для успешного применения такого подхода необходимы эффективные системы транспорта генетического материала в клетки-мишени, обеспечивающие нати вноси» доставленных нуклеиновых кислот как необходимое условие корректного включения нх в клеточный контекст. Существующие методы переноса генно-инженерных конструкций в клетки зукарнот, такие, как порацня мембран {злектропорацня, соногюрация, баллистические методы, магннтофекцня), или вирусные вектора не всегда эффективны в условиях in vitro и ограничены а свосн применимости in vivo либо из-за дополнительных барьеров организма, либо из-за побочных действий, связанных, например, с иммуногенностью вирусных векторов. Перспективным альтернативным подходом стати невнрусные вектора, лишенные ряда недостатков вышеперечисленных методов (Feigner et al-, 1989; Duzgunes, 2003). Для транспорта генетического материала в этом случае используются различные соедн нения: полимеры, лип иды. Лнпофекция -перенос генетического материала с помощью липидов - рассматривается как один из многообещающих способов. Однако, механизм лнпофекции недостаточно изучен, а ее системы не всегда эффективны, Разработка новых эффективных in vitro и in vivo систем транспорта нуклеиновых кислот на основе ненммуног енных нетоксичных лнпидных векторных систем, в частности, кат ионных бисамфифилов, исследование нх свойств и биологического действия представляется насущной задачей.

Дальнейшее изучение путей индукции. амплификации и экзекуции, приводящих клетку к гибели в результате действия противоопухолевых препаратов, является актуальной проблемой, Принято выделять две категории алоптоз-нндуцнрующих. путей - внешние, связанные с активацией ряда так называемых рецепторов смерти, и внутренние, ассоциированные с рецепцией разнообразных повреждений клеточных структур (Achanta et al,, 2001). В основе действия системы HSV-ik/GCV лежит экспрессия трансфеин рока иными клетками фермента тимидникиназы вируса простого герпеса первого типа, способного фосфорилнровать ганцнкловнр до соответствующего монофосфата. Последний, фосфор или рованлый эндогенными кип азами до GCV-трифосфата., начинает конкурировать с эндогенным гулом дезо кс нр н богу а н ило во й кислоты в процессах синтеза ДНК. Встраивание аномального нуклеотида вызывает остановку синтеза ДНК, одноточечные разрывы и запускает каскад клеточных реакций, одним нэ исходов которых может быть гибель клетки (Bellinger ct al., 1999), Подробные механизмы индукции апоптоза системой I ISV-tk/GCV, как н гомологичные нм механизмы активности противоопухолевых препаратов - аналогов нуклеотидов, остаются не до конца изученными.

Цель исследований.

Разработка, опенка эффективности и исследование механизмов действия невирусной генно-ннженерной системы активации нетоксичных соединений «ген тимндинкнназы вируса простого герпеса - ганцнкловнр» на основе новых катион ных бисамфнфилов. Задачи исследования.

1. Изучить ключевые для целен транспорта нуклеиновых кислот в клетку физико-химические свойства дисперсных систем новых катнонных бисамфнфилов ДЭГА: стабильность, размеры, агрегатную морфологию лншшных частиц. Оценить цктотокснчность и мембранотропность в культурах опухолевых клеток,

2. Охарактеризовать морфологию и размеры лшюплексон супрамолекулярных ансамблей катионных бисамфнфилов ДЭГА и плазмидных ДНК.

3. Исследовать эффективность трансфекцни лнпоплексами на основе ДЭГА культур клеток MCF7, 293 и Jurkat разными репортериыми системами.

4. Оценить эффективность индукции гибели клеток MCF7 и 293 системой ДЭГА-HSVtk-GCV,

5. Изучить детали механизма цитотокенчеекого действия системы ДЭГА-HSVtk-GCV, связанные с возможным вовлечением митохондрий и фактора транскрипции NF-kB,

Научный новизна исследовании.

Предложены новые катнонные бнеамфнфнлы ДЭГА в качестве невирусных медиаторов транефекцнн в составе генно-инженерном системы активации нетоксичных соединений ДЭГА-HSV-tk/GCV. Использованные в работе катнонные бисамфифилы, принадлежащие к новому классу поверхностно активных соединении gemini surfactants. представляют собой оригинальный ряд веществ для научения соотношения структура-активность. Впервые обнаружена пониженная интотокснчиость соединений ДЭГА в группе gemini surfaclants по сравнению с альтернативной липидной системой DOTMA-DOPE. Впервые для данной группы веществ покачана зависимость морфологии лнпоплексоь и тражфецнрующей активности от длины спейссра в структуре молекулы ДЭГА. Показана вовлеченность деполяризации митохондриальной мембраны н активации фактора трэнскрипцин NF-kB в комплексный ответ клетки на действие системы HS V-tk/GC V. Теоретический и практическая шчнмаегь работы.

Полученные в работе данные представляют теоретический интерес для понимания закономерностей н механизмов нсвирусного генного переноса и индукции ariomoua генно-инженерными системами активации нетоксичных соединений. Результаты работы имеют практическое значение для обеспечения дальнейшего прогресса в терапии онкологических заболеваний, а также ошнмнзацни применения клинических протоколов генной терапии. Основные положении, выносимые на защиту t. Новые катнонные бисамфифилы ДЭГА характеризуются низким значением критической концентрации мниеллообразования, преимущественно ламеллярной морфологией агрегатов в воде для ДЭГАЗ, смешанной для ДЭГА7 н мнцеллярной для ДЭГА11, ДЭГА22, Температура фазового перехода ДЭГА близка к физиологической, Катионные бнсамфнфилы ДЭГА образуют устойчивые дисперсные системы в воде,

2. Структура и активность супрамолекулярных ансамблей катионы ьгх бнеамфнфилов с плазмндной ДНК зависят от длины алифатического спсйсера.

3. Среди катнонных бнеамфлфилон ДЭГА при более низкой цнтотоксичностн максимальной трансфецирующей способностью, сравнимой с коммерческим препаратом 1лроГес1ш, обладает ДЭГАЗ. Эффективность трансфекцнн зависит от типа клеточной культуры, фкзнхо-хнмнческнх особен ностей липоплексоа, определяемых химической структурой катионного липида.

4. Система ДЭГА-НЗУ-1к/ОСУ индуцирует клеточную гибель в культурах эффективно трансфеиирусмых клеток,

5. Обнаружена деполяризация мктохондриальной мембраны и активация транскрипционного фактора NF-k.Il в экспрессирующих ткмидинкнназу вируса простого герпеса клетках в ответ на ганникловир

выводы

1. В работе предложена новая невнрусна* система на основе катонных бисамфнфнлов ДЭГА, гена тимидинкиназы вируса простого герпеса в составе плазм нл ной ДНК рЦТ649 н ган ни клавира, которая эффективно вызывает гибель опухолевых клеток по механизму апоптоза, индуцированного продуктом «летального синтезам - активированным ганцнкловнром.

2. Дисперсные системы катион них бнеамфифнлов по данным физико-химических методов характеризуются агрегата вной устойчивостью, субмнкронными размерами и способностью к слиянию с мембранами клеток МСР-7.

3. Изученные в работе бисамфифилы ДЭГА сравнительно нетоксичны в экспериментах Iп \'Чго на монослойных культурах клеток 293, МСТ-7 и суснезнонной культуре .Гигка! и могут быть использованы в качестве медиаторов для переноса генетических конструкций в опухолевые клетки человека.

4. Исследованы физико-химические свойства супрамолекулярных ансамблей катионных бисамфифилов и плазмидных ДНК (липоплексов). Покатано, что эффективность трансфскцин линий клеток 293, \1CF-7 и ^игкчИ зависит от длины алифатического спенсера катионных бнсамфнфнлов. определяющей морфологию липоплексов.

5. Методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии показано, что в механизм гибели опухолевых клеток под действием системы ДЭГА-Н$У-(к/ганинкловир вовлечены ранняя деполяризация мнтохоидрнальной мембраны, а также активация фактора транскрипции КГ-кВ (модификация метода иммуно-ферментного анализа «по зЫЯ»). В гибель клеток 293 и МСР-7 вносит вклад эффект «(летального соседства» (ЬуОДгёег еГГсс!)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обнаруженные клеточные ответы в виде деполяризации митохондриальной мембраны н активации NF-kB позволяют предположить комплексное действие системы HSV-tk/GCV, индуцирующее каскад реакций, ведущий к клеточной гибели. Таким образом, индукция апонтоза представляет собой сложное событие, вовлекающее множество рсцелторных зон и амплнфнкацнонных петель. Помимо классического р53-олосредованного пути в ответ на повреждение ДНК, имеющего место при действии HSV-tk, можно предположить подключение дополнительных стимулов, например, связанных с возможной пертурбацией репарации ядерной ДНК, синтеза мнтохондриальной ДНК (ядерно-митохондриальное взаимодействие). Каждый из этих сигналов может быть подпороговым и недостаточным для принятия клеткой решения о самоубийстве, но интегральной суммы сигналов может хватить для исполнения апоптоэя, Возможно, что клетка нуждается в своеобразном дополнительном «опросе» о степени повреждения своих систем для принятия решения об экзекуции эффекторной стадии апоптоза. С этой точки зрения повреждение ядерной ДНК может являться основной, но отнюдь не единственной причиной апонтоза. Интересным фактом в данном случае является изменение роли NF-kB, более известного как антнапоптотический фактор, в проалоптотнческнй. Это явление скорее говорит о неспецифическом модулировании этим транскрипционным фактором аноптотнчсской машннерин, так как значительное количество промотеров содержит сайты связывания для NF-kB. Специфичность интеграции сигнала может быть обусловлена не только типом повреждения, но и особенностями самой клеткн-мишеин, и это не противоречит наблюдаемой двойственной природе NF-kB.