Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Разработка методологии и оптимизация приготовления аутологичных противоопухолевых вакцин для лечения больных диссеминированной меланомой кожи и раком почки

Направахрукописи

ДАНИЛОВ Алексей Олегович

РАЗРАБОТКА МЕТОДОЛОГИИ И ОПТИМИЗАЦИЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ АУТОЛОГИЧНЫХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ ДИССЕМИНИРОВАННОЙ МЕЛАНОМОЙ КОЖИ И РАКОМ ПОЧКИ

Специальность: 14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена в Государственном Учреждении Науки Научно-исследовательском Институте онкологии им.проф.Н.Н.Петрова

Минздрава РФ

Научный руководитель:

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук В.М.Моисеенко

доктор биологических наук профессор С.Л.Киселев

доктор биологических наук, профессор В.Б.Климович

засл.деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор М.Л.Гершанович

Ведущее учреждение:

Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет им.И.П.Павлова

Защита состоится « Э » 2004 г. в_часов на заседании

Специализированного Ученого совета по защите диссертаций Д.208.052.01 ГУН Научно-исследовательского института онкологии им.проф.Н.Н.Петрова МЗ РФ (189646, Санкт-Петербург, Песочный-2, Ленинградская ул., д.68).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

Худолей В.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы'. В последние годы благодаря значительным достижениям в области генетики, молекулярной и клеточной биологии обозначились новые перспективные подходы к биотерапии злокачественных новообразований. Такие известные факты, как спонтанный регресс злокачественной опухоли, нередко весьма значительная продолжительность безрецидивного периода после ее хирургического удаления, многократно доказанная на различных моделях сенсибилизация лимфоцитов больного к опухолевым клеткам и способность лизировать их. по крайней мере in vitro, убедительно свидетельствуют в пользу того, что иммунная система играет важную роль на некоторых этапах патогенеза опухоли (Хансон К. П. и соавт., 1996; Nestle F.O., Dummer R., 1998; Houghton AN. et al., 2001; Jager E. et al., 2003). Это положение является отправной точкой для различных новейших молекулярно-биологических приемов воздействия на клеточный и гуморальный иммунитет онкологических больных. Поэтому особенно активно разрабатываются методы, направленные на активацию естественного противоопухолевого иммунитета (методы активной специфической иммунотерапии), в том числе вакцинотерапия. В отличие от профилактических вакцин против инфекционных агентов, для которых индукция нейтрализующего гуморального иммунитета является наиболее значимым звеном, основное направление противоопухолевой вакцинации сфокусировано на развитии антиген-зависимого Т-лимфоцитарного ответа (Pardoll D.M., 1998). По литературным данным, одним из эффективных способов генерации специфического противоопухолевого иммунитета является создание вакцин на основе аутологичных модифицированных опухолевых клеток (Моисеенко В.М., 2000; Барышников А.Ю., 2002, Xu M. et al., 2000). Модификация опухолевых клеток используется для усиления их иммуно-генности, что позволяет индуцировать клоногенную пролиферацию эффекторных клеток и/или усиливать уже существующий противоопухолевый иммунный ответ. В качестве одного из наиболее перспективных молекулярно-биологических подходов к созданию противоопухолевых вакцин рассматривается введение в опухолевую клетку генов некоторых цитокинов (ИЛ-2, 7, 12; ГМ-КСФ и др.). После блокады пролифе-ративных способностей облучением такие модифицированные клетки могут в течение месяца существовать в организме, продуцируя цитокины, стимулирующие противоопухолевый иммунитет (Киселев С.Л. и соавт., 2000). Одним из подобных агентов для вакцинотерапии опухолей считается недавно выделенный и клонированный

. ; uU. uitLötwtt/WlbHAK

I БИБЛИОТЕКА

! оУ^У:

белок Tag 7 (Kiselev S.L et aL, 1998; Lann S. et al, 2001). Еще одним достаточно перспективным направлением повышения иммуногенности считается введение в процессе вакцинации аутологичными опухолевыми клетками лимфокинов и их индукторов для привлечения и активации иммунокомпетентных клеток, таких как ИЛ-1,2 и др. (Salgaller M L, 2000) В ряде клинических исследований установлено, что методы вакцинотерапии наиболее эффективны при лечении больных диссеминированной меланомой кожи и метастатическим раком почки При этом результаты сопоставимы с современной химио-иммунотерапией (Моисеенко В М, 2001; Vile R et al, 1996; Kawai К, 2002). Однако до настоящего времени такие подходы всё еще не имеют широкого применения в клинической практике из-за трудоемкости процессов приготовления вакцин и их высокой стоимости.

В связи с вышеизложенным разработка и оптимизация методов усиления противоопухолевого иммунитета с помощью аутологичных противоопухолевых вакцин с адъювантом и генетически модифицированных опухолевых клеток представляется актуальной научно-практической задачей.

Цель и задачи исследования. Цель работы - улучшение результатов лечения больных диссеминированной меланомой кожи и метастатическим раком почки на основе усовершенствования методов получения аутологичных модифицированных и немодифицированных вакцин. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Апробировать различные методы получения культур опухолевых клеток из операционного материала больных диссеминированной меланомой кожи и метастатическим раком почки.

2. Выявить оптимальные условия культивирования опухолевых клеточных линий путем подбора необходимого набора питательных сред и их компонентов.

3 Оптимизировать процесс модификации опухолевых клеток для повышения их иммуногенности, используя невирусные методы трансфекции.

4 Оптимизировать различные методы консервации опухолевых клеточных линий, предназначенных для приготовления соответствующих вакцин, без потери антигенности в процессе длительного курса лечения больных.

5. Оценить эффективность и токсичность аутологичных вакцин с адъювантом ИЛ-ip и вакцин на основе аутологичных опухолевых клеток, модифи-

цированных геном tag 7, в лечении больных диссеминированной меланомой

кожи и раком почки

Научная новизна. Впервые проведен сравнительный анализ различных методов получения кпеточных культур из опухолевых клеток больных диссеминированной меланомой и метастатическим раком почки, их хранения и усиления иммуно-генности после различных методов модификации.

Впервые представлены клинические данные по оценке эффективности и токсичности вакцин, полученных на основе аутологичных опухолевых клеток, трансфе-цированных геном tag 7 и вакцин, полученных на основе аутологичных опухолевых клеток в сочетании с адъювантом ИЛ-1р.

Практическая значимость работы. Приготовление вакцин является, по существу, производством лекарственного препарата, что требует выработки четких технологических условий по оптимизации и стандартизации процессов их приготовления в соответствующем клиническим требованиям санитарном режиме В результате данного комплексного экспериментально-клинического исследования сформулированы рекомендации по стандартизации получения аутологиччых противоопухолевых вакцин на основе модифицированных и немодифицированных опухолевых клеток

Апробация работы Результаты исследования обсуждались на нзучных конференциях НИИ онкологии им проф Н Н Петрова, материалы диссертации были доложены на обществе онкологов Санкт-Петербурга и Ленинградской области; на I Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия рака» (Москва, 2002), на Международной конференции «Проблемы онкоиммунологии научные и прикладные аспекты» (Киев, 2003), на Международном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003). По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Объем и структура работы Диссертация изложена на страницах машинописного текста, включает /У таблиц и 2>S рисунков. Работа состоит из введения, четырехглав, выводов и списка литературы. Списоксодержит 35~ отечественных и зарубежных публикации.

На защиту выносятся следующие положения:

1. На основе совершенствования условий выделения и культивирования клеток меланомы кожи и рака почки определены адекватные способы дезагрегации тка-

невых фрагментов и подобраны компоненты питательных сред, оптимальные для данных типов опухолей.

2. Липофекция достаточно эффективна для создания вакцин на основе ауто-логичных клеток меланомы кожи и рака почки, модифицированных геном tag 7.

3. Вакцинотерапия на основе аутологичных опухолевых клеток, модифицированных геном tag 7, нетоксична для человека и имеет иммунологический и клинический эффект при лечении больных меланомой кожи и раком почки.

4. ИЛ-1Р можно применять в качестве адъюванта для вакцинотерапии на основе аутологичных немодифицированных опухолевых клеток.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для приготовления культур опухолевых клеток с целью дальнейшей противоопухолевой вакцинации использовали операционный материал 155 больных, проходивших лечение в НИИ онкологии им.проф.Н.Н.Петрова в 2001-03 г.г. (106 больных диссеминированной меланомой кожи и 49 больных метастатическим раком почки). Из исследованных образцов меланомы кожи 20 были получены из первичной опухоли, 86 представляли собой метастатические образования (60 - в лимфатических узлах, 1 - в легком, 25 - в мягких тканях). Все образцы рака почки были получены из первичных опухолей.

Технология приготовления аутологичных клеточных вакцин предполагает осуществление следующих этапов: дезагрегацию образцов опухоли, культивирование, замораживание, различные приемы модификации опухолевых клеток и их анализ, облучение клеток с целью блокады их пролиферативной активности.

Для дезагрегации фрагментов опухолей с помощью трипсина использовали метод R. Cole и J. Paul (1966) с небольшими модификациями, с помощью коллагена-зы - руководствовались методом R.I. Freshney (1972). Для приготовления суспензии опухолевых клеток механическим способом использовали стерильный стеклянный ручной гомогенизатор (АО Стекольный з-д «Дружная горка», Россия) и автоматический измельчитель ткани "Медимашина" (DAKO, Дания).

О жизнеспособности опухолевых клеток судили по окрашиванию акридиновым оранжевым и бромистым этидием (Sigma, США) (Клаус Дж., 1990), а также по окрашиванию 0,04% трипановым синим (Sigma, США).

Получение культур клеток из опухолевой ткани производили по принципам работы in vitro по Адамсу и Freshney (Ацамc P., 1983; Freshney R.I., 2000). Выделенные опухолевые клетки культивировали при 37°С, 5% СО2 и 100% влажности в пластиковых флаконах (Sarstedt, ФРГ). Для изучения оптимального соотношения компонентов питательных сред использовали DMEM (Invrtrogen, США), DMEM/F12 (Биолот, РФ), RPMI-1640 (Serva, ФРГ), разное количество СЭКРС (5,10,20%) (Биолот, РФ), кондиционированные среды культур фибробластов легких эмбриона человека, препарат трансферрин-инсулин-селен (Invitrogen, США) (конечная концентрация в среде: 5 мкг/мл, 5 мкг/мл, 5нг/мл, соответственно), 50 мкг/мл гентамицина, 2,5 мкг/мл фунгизона (Invitrogen, США). Эффективность добавок к ростовой среде определяли по скорости прироста клеток.

Ростовые и антигенные характеристики опухолевых клеток определяли с помощью их клонирования в мягком агаре (Courteney V.D., Mills J. 1978), подсчета времени удвоения клеточной популяции, иммунохимического окрашивания с помощью моноклональных антител S 100 и НВМ-45 (меланома кожи), NCL-RCC(paK почки) (Novocastra, Великобритания)

Для замораживания культур опухолевых клеток использовали криосреду, содержащую 50% питательной среды, 40% СЭКРС, 10% диметилсульфоксида (Sigma, США) Применяли общепринятый рутинный метод замораживания клеток и программный замораживатель Computer Freezer Ice Cube 1810 SY-LAB (Италия).

С целью блокады пролиферации культуру опухолевых клеток облучали в суммарной дозе 2000 сГр на терапевтическом аппарате "Рокус-У Со60 1,25 mev (мощность дозы 0,99 сГр/с; Россия) (Berd D. et al., 1990; Sorffer R. et al., 1998).

Оптимизацию модификации геном tag7 опухолевых клеток in vitro производили, используя невирусные методы трансфекции с помощью двух типов липосом и электропорации. Липофекцию осуществляли в соответствии с рекомендациями разработчика (SurovoyA. et al., 1998). Для анализа экспрессии введенных генов применяли генетические конструкции, кодирующие ген ß-галактозидазы и EGFP-ген. Эффективность трансфекции оценивали по соотношению окрашенных (трансфециро-ванных) клеток, к общему количеству клеток в процентах. Электропорацию осуществляли на приборе Gene Pulser II electroporator (Bio-Rad, США), при этом использовали параметры, рекомендуемые фирмой-производителем для эукариотических клеток: вольтаж ниже 1000 V и емкость выше 500 nF.

Для определения экспрессии гена tag 7 в опухолевых клетках разделение белков клеточных лизатов проводили по Лэммли (Laemmli U.K., 1970) в камере для вертикального электрофореза (Hoefer Scientific). Иммуноблот-анализ осуществляли по . стандартной методике (Михайлов А.Т., Симирский В.Н., 1991). Мембраны, содержащие исследуемые образцы, окрашивали поликлональными кроличьими антителами к рекомбинантному белку Tag 7 и/или моноклональными антителами к синтетическому эпитопу EFRH, содержащемуся на С-конце белка Tag7 (Novartis, Швейцария).

Для приготовления вакцин индивидуально для каждого больного выращивали культуру опухолевых клеток и хранили в замороженном состоянии в криокомплексе. В зависимости от вида вакцинации опухолевые клетки после размораживания либо сразу подвергали облучению с целью блокады их пролиферативной активности, либо модифицировали геном tag 7, тестировали клеточные лизаты на присутствие белка Тад7 и подвергали облучению. Опухолевые клетки в количестве 1 х 107 (Mahvi D.M. eta!., 1997; Dillman R.O. etal., 1998) вводили больному строго внутрикожно па-равертебрально в 3 точки (в случае немодифицированной вакцины в смеси с ИЛ-Iß в количестве 60 нг и последующем введении ИЛ-Iß в дозе 470 нг на физиологическом растворе). В 4 точку вводили облученные неизмененные опухолевые клетки. Схема вакцинации была выбрана на основании анализа опубликованных протоколов клинических исследований по аналогичным видам вакцин.

Клиническую и иммунологическую оценку эффективности вакцинотерапии на основе генетически модифицированных опухолевых клеток провели у 21 пациента с гистологически верифицированным диагнозом диссеминированной меланомы кожи (17 больных) и рака почки (4 больных). Средний возраст больных составил 43,6±12,3 года (от 21 до 71 года). Перед проведением вакцинотерапии всем пациентам были выполнены циторедуктивные операции с целью получения материала для приготовления аутологичной вакцины: 3 (из 21) больным была произведена полная циторе-дукция и 18 (из 21) - частичная. Все пациенты прошли комплексное обследование, включающее стандартные клинические, лабораторные, рентгенологические и ультразвуковые методы исследования. На момент вакцинации 18 (85,7%) больных имели отдалённые метастазы преимущественно в мягких тканях и лимфатических узлах (66,7%), и лёгких (47,6%). Поражение других органов наблюдалось реже (28,6%).

В исследование по применению вакцинотерапии на основе опухолевых клеток с адъювантом ИЛ-Iß было включено 54 пациента с гистологически верифицированным диагнозом диссеминированной меланомы кожи (35 больных) и рака почки (19

больных). Клиническую и иммунологическую оценку эффективности данного вида вакцинотерапии провели у 50 пациентов (32 больных меланомой кожи и 18 больных раком почки). Средний возраст больных, включенных в исследование, составил 55,1±11,7 лет (от 22 до 78 лет). Среди них присутствовали 20 пациентов, получавших вакцинотерапию с паллиативной целью, и 34 пациента, получавших адьювант-ную терапию. Перед проведением вакцинотерапии 44 пациентам (81,5%) выполнены циторедуктивные операции, в результате которых был получен материал для приготовления аутологичной вакцины: 24 больным (54,5%) произведена полная циторе-дукция и 20 (45,5%) -частичная в объеме лимфаденэктомии или иссечения транспортных метастазов (11 больных), паллиативной нефрэктомии (7 больных), резекции легкого (1 пациент) и резекции ребра (1 пациент). У 10 больных была удалена первичная опухоль.

Диссеминированная форма заболевания выявлена у 20 пациентов (45,5%), из них у 11 (55%) диагностированы висцеральные метастазы и у 9 (45%) метастатическое поражение мягких тканей и лимфатических узлов.

При оценке лечебного действия использованы единые критерии объективного эффекта (ВОЗ, 1998). Статус больного оценивался по системе ECOG. Степень токсичности вакцины определялась по шкале СТС NCIC (расширенная шкала ВОЗ).

В процессе вакцинотерапии осуществляли мониторинг состояния клеточного и гуморального иммунитета, неспецифической резистентности организма Оценивали относительное и абсолютное содержания основных субпопуляций Т-лимфоцитов ^3, CD4, CD8), В-лимфоцитов ^20), НК-клеток ^16), активированных Т- и В-лимфоцитов (CD25, CD30, CD38, CD71, CD95), функциональную активность Т-лимфоцитов по их ответу на митогены конковалин А и фитогемагтлютинин, уровень иммуноглобулинов классов М, G, А в сыворотке крови больных, циркулирующие иммунные комплексы, фагоцитарную и метаболическую активность нейтрофилов и моноцитов (Меньшиков В В. и соавт., 1987; Кадагидзе З.Г и соавт., 1989; Тотолян А А., 1999). Тесты проводили на базе городской больницы № 31, Санкт-Петербург.

Полученные данные обработаны методами вариационной статистики. Для определения достоверности различий средних двух совокупностей применялся критерий Стьюдента-Фишера. Показатели выживаемости больных оценивали методом Каплан-Мейера. Значимость различия функций выживания в двух группах оценивали с помощью критерия Гехана-Вилкоксена.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка оптимальныхусловий получений,хранения, модификации куль тур опухолевыхклеток Несмотря на непрерывное совершенствование технологии выделения и культивирования опухолевых клеток, до сих пор существуют значительные трудности в создании условий, благоприятных для создания и ведения индивидуальных первичных культур, которые дают им селективные преимущества в росте по сравнению с нормальными клетками, такими как, например, фибробласты (Giard D.P. et al., 1973; Hoal-Van Helden E G. et al., 1986; van Muijen G N P. et al., 1991; De Waard-Siebinga I. et al., 1995; Dillman R.O. et al., 2000; Sugaya M et al, 2002). Первым этапом оптимизации способов приготовления вакцинных препаратов из опухолевых клеток больных стал сравнительный анализ различных технологий получения и пассирования культур клеток меланомы кожи и рака почки больных, которым была назначена вакцинотерапия с помощью аутологичных опухолевых клеток, генетически модифицированных или в сочетании адъювантом.

Для получения одноклеточной суспензии традиционно используют механический и ферментативный способы диссоциации опухолевой массы. Однако по данным литературы ни один из этих методов не является идеальным для выполнения главной задачи - получения наибольшего числа метаболически активных клеток, способных к пролиферации (Tvert K.M. et al, 1981; Dairkee S.H. et al., 1997; Freshney R.I., 2000). В нашем исследовании сравнение способов дезагрегации образцов опухолей провели на материале, полученном от 54 больных меланомой кожи и 19 больных раком почки. При этом количество жизнеспособных клеток, выделенных при ферментативной обработке трипсином составило 30,4 ± 8,8%, коллагеназой - 68,1 ± 10,2%*, при механической диссоциации с помощью гомогенизатора и медимашины - 84,3 ± 12,1%* для меланомы кожи (* р>0,01). Для фрагментов опухолей почки эти показатели составили 29,8 ± 6,3%; 72,9 ± 8.6%*; 63,4 ± 3,9%*, соответственно (*р>0,01). Таким образом, диссоциация коллагеназой была достаточно эффективна, особенно при пониженной плотности образцов опухолевой ткани, однако, мы пришли к выводу о целесообразности предпочтительного использования автоматического механического способа дезагрегации для данных типов опухолей, так как выход жизнеспособных клеточных элементов был достаточным для их дальнейшего успешного культи-

вирования и одновременно появлялась возможность стандартизации процессов измельчения опухолевых образцов для получения моноклеточной суспензии.

В результате процессов дезагрегации в культуру были переведены клетки из опухолевых образцов от 106 больных меланомой кожи и 49 больных раком почки. При адаптации опухолевых клеток к росту in vitro мы не ставили задачу получения клеточных линий, так как известно, что на основе короткоживущих культур опухолевых клеток можно успешно создавать противоопухолевые вакцины (Dillman R.O. et al., 2000,2001). После процессов диссоциации адаптировались к росту in vitro первичные культуры 79 больных меланомой кожи (74,5%) и 34 больных раком почки (69,4%). Неудачи в культивировании, связанные с малым выходом жизнеспособных опухолевых клеток и низкой скоростью их роста, наблюдали в 27 случаях меланомы (25,5%) и 15 - рака почки (30,6%) (табл. 1).

Таблица 1

Результаты культивирования клеток меланомы кожи и рака почки

Результаты Меланома кожи (кол-во образцов) Рак почки (кол-во образцов)

Дезагрегация 106 49

Первичные культуры 79 34

1-2 пассажа 25 22

3-5 пассажей 42 8

>5 пассажей 12 4

Клонирование в мягком агаре 63 34

Охарактеризован рост 14 9

Антигенная специфичность 18 34

Неудача в культивировании 27 15

В табл. 2 представлены характеристики полученных клеточных культур меланомы кожи, пассированных не менее 5 раз. В процессе культивирования клетки меланомы кожи демонстрировали разную скорость пролиферации, время удвоения для культур меланомы составило от 48 ч. до 144 ч. (в среднем 94,3±6,8; n=14). В ходе цитологической верификации обнаружились морфологические различия клеток меланомы разных пациентов, касающиеся размера и формы клеток, степени пигментации, типа роста и других признаков, что совпадает с данными других авторов (Irvine A.R. etal., 1975; Houghton A.N. et al., 1987; AubertC. et a!., 1993). При культивировании клеток меланомы из 79 образцов получили 12 суспензионных субкультур (15,1%), 32 субкультуры с адгезионным типом роста (40,5%) и 10 субкультур с полусуспензионным типом роста (12,6%), у которых можно было изменить адгезивные

Таблииа 2

Характеристика полученных клеточных культур меланомы кожи

Клеточная культура (Na протокола) Количество пассажей Рост Время удвоения (ч.) ЭК в мягком агаре (%) Морфология Пигментация Экспрессия антигенов

S100 НМВ-45

Пассаж Пассаж Пассаж Пассаж Пассаж

1 5 8 1 5 8 1 5 8 1 5 8 1 5 8

82 6 + ++ 96 0,001 SD S + + + +

88 8 + + ++ 96 0,000 SD SD S + + + + •

105 5 + + 120 0,002 PDS SD + + _ + +

213 10 + + ++ 120 0,008 D D D + ++ ++ ++ _

120 10 +++ +++ +++ 48 0,021 SD S S i + + +

156 8 + ++ ++ 72 0,004 PD PD P ++ ++ ++ + +

181 14 ++ ++ ++ 96 0,003 D D D ++ ++ ++ i* + _ +

207 12 ++ ++ ++ 72 0,009 P P P + + + • + ++ _ +

213 10 + + ++ 120 0,008 D D D + ++ ++ ++

226 17 +++ +++ +++ 72 0,022 SD SD S + + ++ + + + +

230 6 + + 144 0,002 S S _ _ + + + +

234 5 ++ ++ 96 0,011 PD P + + „ +

236 8 + ++ ++ 96 0,002 SD S s + ++ + + + + +

240 '6 +++ +++ 72 0,006 SD SD + + + ++ + +

О - дендритоподобная; Р - полигональная; Э - веретенообразная форма клеток, ±, +, ++, +++ - степень выявления при-.

знака

свойства, используя подложку из коллагена. Остальные культуры удалось пассировать не более двух раз. При клонировании первичных культур меланомы в мягком агаре эффективность колониеобразования составила от 0,001% до 0,022% (в среднем 0,0087±0,0016%; п=42), и такой существенный разброс (более чем в 20 раз) в определенной степени зависел от пролиферативной активности клеточных культур. Стабильно пролиферирующие культуры меланомы тестировали на присутствие опу-холеспецифических антигенов: S 100 (выявлен на клетках 14 культур) и НМВ-45 (выявлен на клетках 11 культур).

В табл. 3 представлены характеристики культур рака почки, которые также пассировали не менее 5 раз. Культуры рака почки также различались морфологически, но имели сходный тип роста. Из 34 первичных культур более 2 пассажей прошли 12 субкультур (35,3%). Скорость пролиферации полученных культур рака почки была ниже, чем у культур меланомы кожи, время удвоения составило от 96 ч. до 168 ч. (в среднем 128,0±8,0; п=9). Кроме того, в процессе культивирования клеток рака почки удалось выявить в ряде случаев зависимость пролиферативной активности клеток от наличия в культуральном сосуде ростовой поверхности, состоящей из смеси коллагена и СЭКРС. При культивировании в мягком агаре первичныэ культуры клеток рака почки 24 пациентов не образовывали колонии. Эффективность колониеобразования удалось определить у 10 культур, она составила от 0,001% до 0,015% (в среднем 0,0049+0,0012%). Культуры, не давшие колоний в мягком агаре, тестировали на присутствие тканеспецифических антигенов для того, чтобы отдифференцировать клетки рака почки от клеток стромы, в частности, фибробластов, которые также могут быть выделены из ткани опухоли.

Так как скорость пролиферации клеток была разной и в определенной степени зависела от условий культивирования, мы попытались активировать рост медленно растущих опухолей с помощью изменений состава питательных сред. На основании результатов экспериментов с опухолевыми клетками, полученными от 32 больных меланомой кожи и 9 больных раком почки, установлена принципиальная возможность такого подхода, но при строго индивидуальном подборе условий для каждого случая (рис.1 А, Б). Об эффективности действия добавок к ростовой среде судили по скорости прироста клеток на 3 сутки.

Таблица 3

Характеристика полученных клеточных культур рака почки

Клеточная культура (№ протокола) Количество пассажей Рост Ёремя удвоения (ч.) ЭК в мягком агаре (%) * Морфология Экспрессия антигенов (ЫСЫЗСС)

Пассаж Пассаж Пассаж

1 S 8 1 5 8 1 5 8

89 5 + + 168 0,001 Р Р +

177 5 + + * 144 0,002 PS PS +

135 8 + ++ ++ 96 0,015 S PS P ++

139 6 + + 120 0,005 S S +

142 8 + + ++ 96 0,001 Е E E +

147 5 + + 120 0,004 PS S +

158 5 + + 144 0,006 Е E +

187 6 + + 144 0,001 Р P +

228 6 + + 120 0,002 S S ++

Р - полигональная, Б - веретенообразная, Е - эпителиоидная форма клеток, +, ++, - степень выявления признака

Питательная среда DMEM/F12 оказалась предпочтительнее по сравнению со средой DMEM и RPMI-1640. Увеличение содержания сыворотки в среде от 5% до 20% также приводило к более активному росту опухолевых клеток, как и добавление 20% объема стерильной кондиционированной среды культуры фибробластов легких эмбрио-

на человека, так как фибробласты способны продуцировать факторы, усиливающие опухолевый рост (Cornil I. et al., 1991). Для клеток опухолей почки состав самой питательной среды существенно не влиял на скорость их пролиферации, однако культуры отвечали ускорением роста на присутствие в среде инсулина, трансферрина и селена в стандартной дозе. В дальнейшем при культивировании клеток меланомы кожи и рака почки мы руководствовались полученными данными, поскольку активная пролиферация опухолевых клеток in vitro сокращает сроки приготовления противоопухолевых вакцин, что немаловажно для успешного лечения больных.

При исследовании эффективности способов замораживания культур опухолевых клеток использовали распространенный рутинный метод постепенного снижения температуры в холодильнике глубокого холода и программный замораживатель, который позволяет фиксировать планомерное снижение температуры до заданных параметров. Сравнение этих двух методов замораживания осуществили на 23 культурах меланомы кожи и получили достоверные различия в количестве жизнеспособных клеток: 65,2±3,31% и 79,9±4,05%, соответственно, р<0,05. (рис.2).

Как известно, при замораживании происходят осмотические изменения, повреждающие липопротеины и вызывающие появление разрывов в клеточных мембранах (Lovelock J.E., Bishop M.W.H., 1959). Замораживание не должно быть слишком медленным, так как в этом случае облегчается рост кристаллов льда, в то же

время при быстром замораживании не обеспечивается выход воды из клеток. Поэтому ломимо добавления криопротекторов (глицерина, диметилсульфоксида и др.) необходимо придерживаться скорости замораживания 1°С в мин., что оптимально достигается использованием соответствующих компьютерных программ.

Второй этап исследований по оптимизации процесса приготовления вакцинных препаратов из опухолевых клеток больных включал в себя усовершенствование способов их модификации. После подбора условий выделения и культивирования опухолевых клеток 27 культур меланомы кожи и 5 культур рака почки были трансфе-цированы геном tag7 с помощью электропорации и двух типов липосом.

Мы отказались от использования электропорации для переноса генов в клетки меланомы кожи и рака почки, так как эффективность трансфекции была незначительной и не превышала 2%. Однако, ряд авторов показали достаточную по их мнению эффективность электропорации (max - 6%) на моделях опухолей мышей и крыс, таких как меланома В16, карциносаркома Р22, саркома SaF in vitro и in vivo, особенно, когда применяли способ трансфекции с помощью длительных во временном отношении низкочастотных электрических импульсов в комбинации с липосомами (Cemazar M. et al., 2002)

Для трансфекции опухолевых клеток были задействованы две липосомальные системы: Unrfectin-21 и Unifectin-56. После подбора оптимальных условий трансфекции её эффективность для культур клеток меланомы кожи разных пациентов составила 4% (min) -10% (max) (в среднем 6,06±0,48%; n=16) при использовании системы липосом Unifectin-21; 12 % (min) - 30 % (max) (в среднем 15,91±1,62%; n=11) -Unifectin-56. Для культур рака почки эффективность трансфекции с системой Unifectin-21 составила 4% (min) - 6% (max) (в среднем 4,60±0,40%; n=5) и с системой Unifectin-56 10 % (min) - 22 % (max) (в среднем 12,80±2,49%; n=5). Кроме того, эффективность трансфекции зависела от типа роста культуры: клетки с адгезионным типом роста подвергались трансфекции лучше, чем с суспензионным. Поэтому в контексте подбора условий оптимальной трансфекции адаптация суспензионных культур к росту на субстрате способствовала увеличению ее эффективности. Таким образом, в качестве основного метода был выбран липосомный метод трансфекции, и система липосом Unifectin-56 оказалась наиболее эффективной для генетической модификации клеток меланомы кожи и рака почки. Невирусные методы переноса генов являются наиболее безопасными в генной терапии человека, и, в отличие от ви-

русных, не обладают мутагенностью, нетоксичны и не имеют ограниченной емкости (Богданенко Е.В. и соавт., 2000). В тоже время недостатком всех невирусных методов переноса генов является непродолжительное время экспрессии, ограниченное эндосомно-лизосомальной деградацией, а также отсутствие специфичности. Кроме того, очень трудно достичь высокой эффективности трансфекции, работая с индивидуальными аутологичными культурами опухолевых клеток пациентов в отличие от стабильных клеточных линий (Gainer A.L. et al., 2000; Pardoll D.M., Jaffee E.M., 2000). Поэтому в настоящее время продолжаются работы по совершенствованию невирусных способов переноса генетической информации в клетки.

Так как белок Tag 7 детектируется в трансфецированных клетках только им-мунозлетрофоретически, вводили в опухолевые клетки ген tag 7после подбора условий максимально эффективной трансфекции на модельной системе с помощью репортерных генов, описанной выше, и осуществляли иммуноблот-анализ клеточных лизатов с помощью иммунного окрашивания двумя типами антител до и после трансфекции, что позволило подтвердить ее эффективность: опухолевые клетки 32 больных подвергали модификации и только 23 образца дали положительный результат в иммуноблотинге (рис.3).

Известно, что эффективность использования модифицированных цитокином опухолевых клеток для индукции противоопухолевого иммунитета зависит от количества продуцируемого цитокина (Colombo M.P., Fomi G., 1994; Pardoll D.M, Jaffee E.M., 2000). Поэтому использование иммуноблот-анализа для подтверждения синтеза белка, кодируемого введенным в клетки геном, помогает в создании геноинже-нерных противоопухолевых вакцин.

Оценка токсичности и клинической эффективности вакцин на основе аутологичных опухолевых клеток, модифицированных

геном tag 7

Наряду с разработкой методологии получения аутологичных противоопухолевых вакцин мы ставили задачу провести клиническую апробацию методов их приготовления Для этого нами была проведена предварительная клиническая и иммунологическая оценка эффективности вакцин на основе аутологичных опухолевых клеток, модифицированных геном tag 7, и в сочетании с адъювантом ИЛ-1р.

В зависимости от клинического состояния больных, переносимости вакцинации, количества материала для вакцинации больные распределились следующим образом: шесть генетически модифицированных вакцин получили 8 больных (38,1%), 4 введения вакцины - 3 пациента (14,3%), 3 введения - 4 пациента (19%), 2 введения - 3 пациента (14,3%) и 1 введение - 3 пациента (14,3%). Преждевременное завершение лечения было обусловлено прогрессированием заболевания у 12 больных (57,1%). Ни у одного из пациентов не отмечено ухудшение самочувствия и побочных явлений (лихорадки, регионарной лимфаденопатии, изъязвлений в месте иньекций, аллергических и аутоиммунных реакций, желудочно-кишечных расстройств), связанных с введением вакцины. В местах инъекции аутологичных опухолевых клеток, модифицированных геном tag7, через 48-72 часа у 10 (47,6%) из 17 больных, (3 больных раком почки и 7 меланомой кожи) регистрировалась местная реакция в виде участков гиперемии, которая расценивалась как реакция ГЗТ (рис.4). У 4 пациентов (19%) ГЗТ не определяли.

Полный и частичный регресс (уменьшение метастатических очагов более чем на 50%) (критерии ВОЗ, 1998) зарегистрирован не был. Стабилизация процесса наблюдалась у семи больных меланомой кожи. У одной больной раком почки зарегистрировали минимальный регресс метастазов в легких менее чем на 50% (рис.5).

При анализе времени до прогрессирования у всех пациентов, получавших лечение, максимальное значение составило 14 месяцев от начала терапии. Среднее значение - 3 месяца. Тринадцать пациентов, которые получили от 1 до 3 введений вакцины, имели ослабленное общее состояние - 2 балла (в соответствии с критериями ВОЗ) и множественные висцеральные метастазы. Наблюдаемое в этом случае

прогрессирование расценивалось нами как отсутствие эффекта, хотя ожидаемая его реализация к этому моменту ещё не наступила. При исключении из оценки этой группы среднее значение времени до прогрессирования составило 6,7 ±3,2 месяца (р=1,1) (от 4-х до 14 мес.). Медиана выживаемости на фоне вакцинотерапии составила 4,5 месяца от начала лечения, средняя продолжительность жизни 7,4 мес. (95% С1 4,99,8 мес.)

При анализе результатов иммунологического обследования было установлено, что вакцинотерапия вызывает иммунный ответ на введение опухолевых клеток у 95,0% (19 из 20) первично иммунизированных пациентов. У больных меланомой кожи со стабилизацией процесса (п=7) и прогрессированием заболевания (п=12) выявили иммунологически различный ответ на проводимую вакцинотерапию. До вакцинации у этих групп больных абсолютное содержание основных популяций и субпопуляций лимфоцитов в периферической крови находилось практически на одном уровне. В процессе вакцинотерапии абсолютное содержание в периферической крови больных со стабилизацией процесса Т-лимфоцитов (СОЗ'1') достоверно увеличивалось, преимущественно за счет увеличения количества С04+ и С08+-клеток (рис 6).

Также зарегистрирован увеличенный пролиферативный ответ лимфоцитов на Кон А и ФГА по сравнению с показателями функциональной активности лимфоцитов у больных с прогрессированием процесса. Абсолютное содержание активированных Т- И В-КЛет0К (СО25*,СО30\СО38*,СО71*) имело тенденцию к увеличению в процессе вакцинотерапии у больных со стабилизацией процесса, в то же время у больных с

прогрессированием заболевания оставалось на одном уровне или снижалось. Пациенты, получившие полный курс лечения, демонстрировали возвращение к исходному уровню исследуемых иммунологических параметров через 1 месяц после окончания вакцинотерапии, что указывает на необходимость проведения повторных курсов вакцинации.

В целом, можно утверждать, что у всех обследованных пациентов меланомой кожи развивался иммунологический ответ на проводимую вакцинотерапию, однако именно у тех больных, у которых после курса вакцинотерапии наблюдали стабилизацию процесса, имела место более выраженная активация Т- и В-клеточного звена иммунной системы. В том случае, когда проводимая вакцинотерапия не оказала существенного влияния на опухолевый процесс, кратковременный подъем рассматриваемых параметров перед 2-й вакцинацией сменился их падением.

Таким образом, применение вакцины на основе аутологичных опухолевых клеток, модифицированных геном tag 7, нетоксично и сопровождается усилением активности клеточного звена иммунной системы.

В настоящее время известны результаты клинических и иммунологических исследований Ml фазы вакцин, приготовленных на основе опухолевых клеток, модифицированных генами цитокинов, таких как ГМ-КСФ, ИЛ-2, 7,12, применявшихся для лечения больных меланомой кожи и раком почки (Mahvi D.M. et al., 1997; Sun Y., 199B; Palmer K., 1999; Schreiber S. etal., 1999; Chang A.E. et al., 2000; Kusumoto M. et al., 2001; Witting B. et al., 2001; Kaufman H.L et al., 2002; Volk J. et al., 2002; Parmiani G. et al., 2003). Все виды вакцин формировали у ряда больных реакцию ГЗТ и вызывали активацию противоопухолевого клеточного и гуморального иммунитета, однако их клиническая эффективность не была значительной. Поэтому в настоящее время в области создания геноинженерных вакцин, когда индукция иммунного ответа зависит от интенсивности локальной экспрессии в опухолевых клетках введенного гена, повышенное внимание исследователей направлено на разработку стабильных продуцентов искомого цитокина или группы цитокинов.

Оценка токсичности и клинической эффективности вакцин на основе аутологичных опухолевых клеток с использованием ИП-lß в качестве адъюванта

В настоящее время попытки добиться выраженного иммунологического и, как следствие, клинического эффекта от проводимой противоопухолевой вакцинотера-

пии привели к активному использованию цитокинов в роли адъювантов, в том числе в сочетании с генетически модифицированными опухолевыми клетками (Antonia S. J. et a!., 2002). Одним из ключевых иммуномедиаторов, который незаслуженно мало используется как адъювант в вакцинотерапии опухолей, является ИЛ-1. В нашем исследовании мы оценивали иммунологическую и клиническую эффективность вакци-' ны на основе цельных опухолевых клеток с добавлением в качестве адъюванта препарата «Беталейкин», являющегося лекарственной формой рекомбинантного ИЛ-Iß, который у человека является основной секретируемой формой ИЛ-1, осуществляющей свое действие как местно, так и на системном уровне. Что очень важно в контексте иммунотерапии, ИЛ-1 стимулирует специфическое звено иммунитета, воздействуя на функциональную активность Т- и В-лимфоцитов (Симбирцев С. А, 1990).

Шесть вакцинаций получили 17 больных (31,5%), 5 введений вакцины -12 пациентов (22,2%), 4 введения -1 2 пациентов (22,2%), 3 введения - 3 пациента (5,6%), 2 введения - 8 пациентов (14,8%) и 1 введение аутологичной вакцины -1 пациент (1,9%). Преждевременное завершение лечения было обусловлено прогрессирова-нием заболевания. Основным осложнением, наблюдавшимся в ходе лечения, была лихорадка I-II степени, которая наблюдалась в дни введения у 19 больных

(35,2%) из 54. Других побочных явлений (регионарной лимфаденопатии, изъязвлений в месте иньекций, аллергических и аутоиммунных реакций) не было.

Полный и частичный регресс (уменьшение метастатических очагов более чем на 50%) (критерии ВОЗ, 1998) зарегистрированы не были. Стабилизация процесса наблюдалась у 10 из 20 больных (50%), получавших паллиативную вакцинотерапию. Средняя продолжительность эффекта составила 6 месяцев (от 3 до 14 месяцев). У 6 пациентов эффект продолжается в течение 3-10 мес+.

В группе пациентов, получавших адьювантную вакцинотерапию, у 21 больного (61,8%) из 34 определялось время до прогрессирования заболевания, среднее значение которого составило 16,4 месяца (от 4,5 до 43 месяцев).

При характеристике показателей выживаемости в этих двух группах больных выявлено, что медиана выживаемости пациентов, получавших вакцинотерапию с лечебной целью, составила 5 месяцев от начала лечения, средняя продолжительность жизни 8 мес (95% CI 4,8-11,2 мес), в то время как медиана выживаемости больных, получавших вакцинотерапию с адьювантной целью, составила 13 месяцев от начала лечения, а средняя продолжительность жизни 14,7 мес.

мес) При этом отмечено значимое различие функции выживания (р=0,00569) по критерию Гехана-Вилкоксена

В процессе анализа иммунологических параметров периферической крови больных, получавших данный вид вакцинотерапии, удалось обнаружить иммунный ответ на введение опухолевых клеток у 90,0% (45 из 50) первично иммунизированных пациентов. Мы выявили различия в динамике абсолютного содержания основных популяций и субпопуляций лимфоцитов в периферической крови больных мела* номой кожи и раком почки, получавших вакцинотерапию с адъювантной и лечебной целью, которые в большинстве случаев коррелировали с результатами лечения. До вакцинации у всех обследованных групп больных показатели клеточного иммунитета находились практически на одном уровне. В процессе адъювантной вакцинотерапии больные меланомой кожи без прогрессирования опухоли имели достоверное увеличение абсолютного содержания в периферической крови CD3+, CD4+ и CD8+-лимфоцитов по сравнению с содержанием этих клеток у больных с прогрессирова-нием заболевания (рис 7)

Тот жэ процесс, но менее выраженный, наблюдали при анализе иммунологических показателей у больных меланомой кожи, получавших паллиативное лечение. Функциональная активность лимфоцитов, определяемая по их ответу на митогены Кон А и ФГА имела волнообразный характер и тенденцию к увеличению к концу курса вакцинации именно у больных без прогрессирования процесса и со стабилизацией состояния.

Таким образом, при применении адъювантной и лечебной вакцины на основе немодифицированных опухолевых клеток в сочетании с ИЛ-1р у большинства больных меланомой кожи развивался иммунный ответ на проводимое лечение, который выражался в усилении активности клеточного звена иммунной системы. Вакцинотерапия аутологичными опухолевыми клетками в сочетании с ИЛ-10 безопасна и не сопровождается клинически значимыми побочными эффектами. Представленные в литературе экспериментальные и клинические исследования противоопухолевых вакцин с ИЛ-1а или в качестве адъюванта также указывают на активацию иммунной системы в процессе вакцинации (МсСипе в.в. е! а1, 1990; \WooClock и. е! а1, 1999).

Отсутствие объективных клинических эффектов от проводимой терапии (полный и частичный регресс) может быть связано с рядом причин: распространённостью опухолевого процесса, наличием метастатического поражения жизненно важных органов, ослабленным общим статусом больных (на момент начала лечения большинство пациентов имели статус 2 в соответствии с критериями ВОЗ, 1998), предшествующим лечением (химио- или лучевой терапией) Очевидно, что иммунотерапия аутологичной вакциной будет более эффективна у больных с небольшой опухолевой массой, применяемая с адъювантной целью у пациентов с высоким риском развития рецидива после хирургического лечения.

ВЫВОДЫ

1. В результате сравнения ферментативного и механического способов дезагрегации тканевых фрагментов меланомы кожи и рака почки было установлено, что количество жизнеспособных клеток при диссоциации трипсином составило 30,4±8,8% и 29,8±6,3%, коллагеназой -68,1 ±10,2% и 72,9±8,6%, механическим способом - 84,3±12,1% и 63,4±3,9% соответственно, то есть для успешного выделения

одиночных клеток меланомы кожи и рака почки из тканевых образцов можно применять автоматическую механическую дезагрегацию.

2. Оптимальными условиями для культивирования большинства культур меланомы кожи и рака почки являются: среда РМЕМ/Р12, содержащая 20% СЭКРС, 20% кондиционированной среды фибробластов легких эмбриона человека. Целесообразно при медленном росте культуры клеток рака почки добавлять к питательной среде трансферрин, инсулин, селен.

3. В результате использования механического способа дезагрегации и эффективных условий культивирования из опухолевых образцов 106 больных мелано-мой кожи и 49 больных раком почки были получены первичные культуры в количестве 79 (74,5%) и 34 (69,4%), соответственно.

4. Максимальная эффективность трансфекции с помощью электропорации составила 2%, при использовании липосом - 30%. Таким образом, липофекция достаточно эффективна для клеток меланомы кожи и рака почки. Условия трансфекции необходимо подбирать индивидуально для каждого пациента.

5. Иммунотерапия больных диссеминированными солидными опухолями вакциной на основе опухолеьых клеток, модифицированных геном tag7, нетоксична, сопровождается развитием реакции гиперчувствительности замедленного типа у 47,6% больных, иммунологическим ответом у 95%, стабилизацией процесса у 41, 1 % (7 из 17) больных меланомой кожи и объективным регрессом метастазов в легких (минимальный регресс менее 50%) у 25% (1 из 4) пациентов с раком почки.

6. Перспективным представляется проведение иммунотерапии генетически модифицированной вакциной у больных после радикального лечения или циторе-дуктивных операций с минимальным объемом опухолевой массы.

- 7. Вакцинотерапия на основе опухолевых клеток в сочетании с неток-

сична, сопровождается иммунологическим ответом у 90% больных, стабилизацией опухолевого процесса у 10 пациентов (6 - меланома кожи и 4- рак почки) из 20 (50%), получавших вакцину с лечебной целью (средняя продолжительность эффекта - 6 мес.) и отсутствием прогрессирования опухоли у 20 пациентов (10 - меланома кожи и 10 - рак почки) из 34 (61,8%), получавших вакцину с адъювантной целью (среднее значение времени до прогрессирования -1 6,4 мес).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Данилов А.О.. Данилова А.Б., Балдуева ИА, Моисеенко В.М. Современные технологии получения противоопухолевых вакцин // Материалы I Всероссийской научно-практической конференции "Биотерапия рака", - Москва, 2002. - С.26-27.

2. Данилов АО.. Ларин С.С., Данилова А.Б., Моисеенко В.М. и др. Оптимизация метода приготовления вакцин на основе аутологичных генетически модифицированных опухолевых клеток для лечения больных диссеминированной меланомой кожи // РосБиотер.журнал - 2003. - Т.2. - №3. - С.47-53.

3. Моисеенко В.М., Данилов АО.. Ларин С.С., Данилова А.Б. и др. Активная специфическая иммунотерапия с помощью вакцин на основе аутологичных модифицированных опухолевых клеток у больных диссеминированой меланомой кожи и метастатическим раком почки // Онкология. - 2003. - Т.5. - №2. - С. 176.

4. Щекина ЛА, Балдуева И А, Моисеенко В.М., Данилов АО. и др. Динамика иммунологических показателей в процессе активной специфической иммунотерапии больных с солидными опухолями // Онкология: - 2003. - Т. 5. - №2. - С. 182.

5. Моисеенко В.М., Данилов А.О.. Ларин С.С:, Данилова А. Б. и др. Применение вакцин на основе аутологичных генетически модифицированных опухолевых клеток для лечения больных диссеминированной меланомой кожи и метастатическим раком почки // Мед.иммунол. - Т.5. - №3-4. - С.360-361.

6. Данилов А.О.. Ларин С.С., Данилова А.Б., Моисеенко В.М. и др. Усовершенствование метода приготовления аутологичных модифицированных противоопухолевых вакцин для активной специфической иммунотерапии больных диссемини-рованными солидными опухолями // Вопр.онкол. - 2004. - Т.50. - №2. - в печати.

7. Моисеенко В.М., Данилов А.О., Балдуева И. А, Данилова А.Б. и др. I-II фаза клинической оценки эффективности генотерапии на основе аутологичных опухолевых клеток, модифицированных геном tag 7у больных диссеминированными солидными опухолями // Вопр.онкол. - 2004. - Т.50. - №3. - в печати.

Подписано к печати 12.01.04. Тираж 60 экз.

Отпечатано в АМА НЗ РФ, С.-Петербург, п. Шушары, Пушкинская, 12.

«•-2615