Энцефалитогенные T-клетки в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита

Носов, Михаил Анатольевич

Диссертации по медицине → Патологическая физиология

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Энцефалитогенные T-клетки в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита

АВТОРЕФЕРАТ

Носов, Михаил Анатольевич Санкт-Петербург 2010 г.

Ученая степень: доктора биологических наук

ВАК РФ: 14.03.03

Автореферат диссертации по медицине на тему Энцефалитогенные T-клетки в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита

На правш-рукописи

Носов Михаил Анатольевич

ЭНЦЕФАЛИТОГЕННЫЕ Т-КЛЕТКИ В РАЗВИТИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО АУТОИММУННОГО ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 7 НИЗ 2011

Санкт-Петербург 2010 г.

4843459

Работа выполнена в Отделе общей патологии и патологической физиологии Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН и Отделе нейроиммунологии Института нейробиологии Макса Планка

Научный консультант:

академик РАМН Елена Андреевна Корнева

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, член-корр. РАМН С.А. Кетлинский доктор медицинских наук, профессор И.Д. Столяров доктор биологических наук, Т.В. Кветная

Ведущая организация:

Российская Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова МО РФ.

Защита диссертации состоится 18 января 2011 года в часов на заседании Диссертационного Совета Д 001.022.02 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

автореферат разослан 20ю г,

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д001.22.02. доктор медицинских наук П.А. Дыбан

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Нервная и иммунная системы постоянно взаимодействуют, что обеспечивается возможностью притока информации от иммунной системы к нервной через гуморальные и нервные пути, а так же восприимчивостью клеток иммунной системы к нейротрансмиттерам и гормонам нейроэндокринной системы, поскольку рецепторы к этим веществам представлены на мембранах иммуноцитов. С другой стороны, сигналы, поступающие от иммунной системы, модулируют функции центральной нервной системы. Дисбаланс во взаимодействии нервной и иммунной систем может приводить к развитию различных форм патологии, проявляющихся соматическими, психическими или психосоматическими расстройствами. Одним из наиболее тяжелых и распространенных заболеваний, связанных с развитием аутоиммунного процесса в центральной нервной системе (ЦНС), является рассеянный склероз (PC), этиология и патогенез которого изучены далеко не исчерпывающе.

Накопленные более чем за столетнюю историю изучения PC данные дают возможность выдвинуть предположение о существенной роли аутоиммунных Т-лимфоцитов в инициации воспаления в ЦНС. Анализ гистологических препаратов, полученных при аутопсии и биопсии у пациентов с диагнозом PC, позволяет постулировать, что практически во всех случаях при PC, в период обострения, очаги поражения инфильтрированы энцефалитогенными Т-клетками (ЭГ Т-клетки), которые локализуются вокруг сосудов головного мозга, что указывает на возможную роль этих клеток в нарушении разделительной функции гемато-энцефалического барьера (Booss, Esiri et al. 1983; Babbe, Roers et al. 2000).

Одними из факторов риска развития PC являются генетические особенности человека или животных, которые затрагивают гены, связанные с основным комплексом гистосовместимости II типа (МНС II), то есть с комплексом, который является ключевым механизмом активации эффекторных Т-клеток (Oksenberg, Barcellos et al. 2004; Lincoln, Montpetit et al. 2005). С другой стороны обнаружено, что лимфоциты больных PC несут специфическую последовательность р цепи Т-клеточного рецептора (TCR) (Oksenberg, Panzara et al. 1993; Madsen, Andersson et al. 1999). Генетические особенности в генах, кодирующих МНС II комплекс, так же играют решающую роль в контроле восприимчивости различных линий крыс к индукции экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) -модели рассеянного склероза (Madsen, Andersson et al. 1999). Обнаруженная зависимость между конкретной последовательностью генов, кодирующих компоненты МНС II, TCR и риском развития PC подтверждает предположение о важной роли Т-клеток в патогенезе PC и ЭАЭ.

Впервые, прямые доказательства роли аутоиммунных процессов в патогенезе заболевания были получены в 80-х годах прошлого столетия благодаря созданию экспериментальной модели PC - адоптивного переносного экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (апЭАЭ) (Ben-Nun, Wekerle et al. 1981). В модели апЭАЭ, патология, схожая с таковой при PC, вызывается введением здоровому животному активированных ЭГ Т-клеток, сенсибилизированных к антигенам ЦНС, в частности к основному белку миелина (МВР). Патогенез апЭАЭ характеризуется развитием воспаления в ЦНС и обратимым нарушением проводящей функции аксонов, хотя и протекает без выраженной демиелинизации в отличии от PC у людей (Linington, Bradl et al. 1988). Обратимое нарушение проводящей функции аксонов, а не полная ее потеря, объясняет монофазный характер течения заболевания, вызванного введением ЭГ Т-клеток, сенсибилизированных к МВР у крыс линии Lewis, которое заканчивается полным восстановлением утраченных функций. Подобная ситуация напоминает симптоматику, характерную для ремитирующей формы PC, при которой периоды обострения заболевания сменяются полным восстановлением в начальный период развития PC. Хотя патогенез апЭАЭ не включает всей совокупности процессов, происходящих при развитии PC, например протекает без выраженной потери миелина, адекватность этой модели для изучения роли Т-клеточной составляющей в инициации и развитии патогенеза PC общепризнанна (Gold, Linington et al. 2006).

Течение апЭАЭ у крыс линии Lewis может быть разделено на 3 фазы: преклиническая фаза, клиническая фаза и восстановление. Преклиническая фаза наиболее важна для понимания механизмов инициации заболевания, опосредованного введением ЭГ Т-лимфоцитов. Несмотря на то, что, апЭАЭ вызывается введением активированных Т-клеток, сенсибилизированных к МВР и экспрессирующих необходимые молекулы для прямой экспансии в ЦНС, большинство Т-клеток достигает ЦНС только через 2-3 суток после введения. Применение методов генной терапии для доставки генов в энцефалитогенные Т-клетки предоставило возможность изучения роли ЭГ Т-клеток в патогенезе апЭАЭ (Flügel, Willem et al. 1999). По предположению А. Flügel, на преклиническом этапе апЭАЭ формируется «миграционный фенотип» энцефалитогенных Т-клеток, который необходим для их проникновения через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и инициации воспаления в ЦНС (Flügel, Berkowicz et al. 2001). Несмотря на большое количество работ, посвященных изучению патогенеза апЭАЭ, остается не до конца ясным, какие клеточные и экстраклеточные компоненты тканей, с которыми взаимодействуют энцефалитогенные клетки в ходе миграции на преклиническом этапе, вовлечены в формирование «миграционного фенотипа» и какие изменения, происходящие с ЭГ клетками, его определяют. По-видимому, Т-лимфоциты, сенсибилизированные к МВР, играют роль провокатора воспаления в ЦНС, хотя непонятно какую роль они играют в

развитии других этапов ЭАЭ. Для того, что бы ответить на эти и другие вопросы, мы использовали систему индуцированного клеточного самоубийства и скрининг функционального состояния ЭГ Т-клеток на различных этапах развития ЭАЭ, а так же попытались вычленить компоненты тканей, вовлеченные в формирование «миграционного фенотипа» у энцефалитогенных клеток.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является определение роли энцефалитогенных Т-клеток в развитии различных стадий экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита и выявление факторов, обеспечивающих энцефалитогенным Т-клеткам «миграционный фенотип», позволяющий им преодолевать гематоэнцефалический барьер и провоцировать развитие аутоиммунного воспаления в центральной нервной системе. Для достижения данной цели поставлены следующие задачи:

1. Используя методы проточной цитометрии, количественной полимеразной цепной реакции и флуоресцентной микроскопии выявить органы, в которые мигрируют энцефалитогенные Т-клетки на преклиническом этапе адоптивного переносного экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита. Провести сравнительный анализ распределения энцефалитогенных Т-клеток, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок, in vivo на разных стадиях развития адоптивного переносного экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, вызванного внутривенным или внутрибрюшинным введением энцефалитогенных Т-клеток. ■

2. На основании данных молекулярного скрининга и количественной полимеразной цепной реакции выделить гены - потенциальные кандидаты, вовлеченные в процесс формирования функциональных изменений энцефалитогенных Т-клеток на преклиническом этапе развитии адоптивного переносного экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита.

3. Исследовать влияние отдельных компонентов экстраклеточного матрикса на миграционную активность энцефалитогенных Т-клеток. Разработать 3-х мерную модель для анализа подвижности энцефалитогенных Т-клеток in vitro, используя метод флуоресцентной микроскопии.

4. Разработать систему, позволяющую селективно удалять энцефалитогенные Т-клетки in vitro и in vivo, а именно создать трасгенную линию первичных Т-клеток специфичных к основному белку миелина, экспрессирующих суицидный (тимидин киназа вируса простого герпеса первого типа - HSV1-TK) и маркерный (зеленый флуоресцентный белок -GFP) гены, а также линии клеток экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок, красный флуоресцентный белок или белок - переносчик норэпинефрина.

5. Изучить роль энцефалитогенных Т-клеток в развитии различных стадий адоптивного переносного экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, неинвазивно удаляя эти клетки методом, основанным на использовании токсических свойств синтетических аналогов тимидина (ганцикловир - вСУ) на клетки экспрессирующие тимидин киназу вируса простого герпеса. Проследить взаимосвязь между количеством энцефалитогенных Т-клеток в организме, интенсивностью провоцируемого ими воспаления в центральной нервной системе и тяжестью клинических проявлений.

6. Используя свойство энцефалитогенных Т-клеток, продуцирующих тимидин киназу вируса простого герпеса, специфически аккумулировать радиоактивные аналоги ганцикловира, попытаться установить локализацию энцефалитогенных Т-клеток в организме на различных стадиях развития экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита с помощью гамма-сканирования.

Особенностью данной работы является использование модели рассеянного склероза, позволяющей изучить функциональные перестройки энцефалитогенных Т-клеток на ранних стадиях развития экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита непосредственно в организме и их роль в инициации патологических процессов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Экспрессия транскрипционного фактора - Круппел-лайк фактора 2 и активирующего миграцию рецептора к гиалуронану активируется в энцефалитогенных Т-клетках в селезенке через 72 часа после введения непосредственно перед резким увеличением числа энцефалитогенных Т-клеток в центральной нервной системе и частично определяет повышение их миграционной активности.

2. Высокомолекулярный гиалуронан - один из компонентов экстраклеточного матрикса, стимулирует двигательную активность и ингибирует пролиферацию энцефалитогенных Т-клеток, не влияя на их способность к активации в ответ на действие специфического антигена. Эти изменения сопряжены с увеличением уровня экспрессии круппел-лайк фактора 2.

3. Энцефалитогенные Т-клетки, сенсибилизированные к основному белку миелина, играют ключевую роль в инициации развития аутоиммунного воспаления в центральной нервной системе, неинвазивное удаление их на клинической стадии развития заболевания не изменяет динамику его течения.

4. Клеточное самоубийство экспрессирующих тимидин киназу вируса простого герпеса энцефалитогенных Т-лимфоцитов, спровоцированное введением ганцикловира, вызывает гибель клеток через активацию р53 зависимого пути апоптоза, но протекает без активации каспазы-3.

5. Удаление чувствительной к ганцикловиру популяции энцефалитогенных клеток на преклинической стадии адоптивного переносного экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита ведет к увеличению инфильтрации центральной нервной системы клетками оставшейся, не чувствительной к ганцикловиру, популяции энцефалитогенных Т-клеток при их совместном введении.

6. Накопление радиоактивно меченых аналогов ганцикловира лимфоцитами экспрессирующими тимидин киназу вируса простого герпеса, используемое для неинвазивного определения их локализации in vivo, ведет к потере пролиферативной и функциональной активности этими клетками.

Научная новизна работы

В ходе работы была изучена роль энцефалитогенных Т-клеток в развитии патологических процессов в центральной нервной системе на ранних стадиях развития адоптивного переносного экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, определены клеточные и экстраклеточные компоненты, влияющие на формирование миграционного фенотипа энцефалитогенных Т-клеток и пути реализации развития этих изменений. Использование линий трансгенных энцефалитогенных Т-клеток позволило изучить их роль и функциональные перестройки в процессе развития адоптивного переносного экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита in vivo, что открывает возможность для поиска путей регуляции функций энцефалитогенных клеток. Впервые описаны пути апоптоза экспрессирующих тимидин киназу вируса простого герпеса Т-лимфоцитов, вызванного ганцикловиром и обнаружен токсический эффект аккумуляции радиоактивных аналогов ганцикловира на эти клетки, что необходимо принимать во внимание при проведении клинических и лабораторных исследований.

Практическая значимость работы

Изучение перестроек, происходящих в иммунной системе в преклинический период развития РС, имеет не только теоретический интерес, но перспективно и для клинического применения. Знание механизмов формирования миграционного фенотипа энцефалитогенных клеток, обусловливающих развитие процесса воспаления в ЦНС, предоставляет возможность поиска путей их регуляции или компенсации. Выяснение роли клеточного окружения, влияющего на процесс созревания энцефалитогенных Т-клеток, даст возможность не только влиять на их поведение, но и предотвращать созревание энцефалитогенных Т-клеток in vivo.

Реализация результатов исследования

Результаты работы могут быть использованы в научной практике, связанной с изучением молекулярных механизмов развития патогенеза

рассеянного склероза и его экспериментальных моделей и могут войти в курс преподавания по физиологии, патофизиологии, нейрофизиологии, иммунологии и неврологии. Полученные данные рационально использовать в фармакологии при разработке иммунокорригирующих препаратов.

Апробация работы

Материалы исследования изложены в 38 публикациях и материалах международных конференций, 10 из которых в журналах рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 199 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, из них отечественных - 12 и 234 -зарубежных авторов. Работа проиллюстрирована 36 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Антиген-сенсибилизированные лимфоциты, их генетическая модификация и индукция апЭАЭ

Для получения антиген-сенсибилизированных лимфоцитов и их генетической модификации применяли методы, описанные в работе А. Flügel (Flügel, Willem et al. 1999). Лимфоциты выделяли из брыжеечных (mesenteric nodes - М LNs), парааортальных (para-aortic nodes - PA LNs) и паховых лимфатических узлов (inguinal nodes - Ing LNs) крыс иммунизированных суспензией образованной равными объемными долями МВР или овальбумина (OVA) (150 мкг.) и полного адъюванта Фронда. Лимфоузлы гомогенезировали и клетки отмывали HEPES буфером. 2х107 лимфоцитов высевали на 96 луночный планшет (круглое дно) с предварительно нанесенными 15x105, пакетирующими рекомбинантные ретровирусы, клетками (GP+E) в 10 мл. среды ТСМ (DMEM, L-glutamine, Asparagine, Pn/Str, NAA, ß-меркаптоэтанол и 2% крысиной сыворотки) и в присутствии 100 мкг. МВР или OVA. На второй день к культуре клеток добавляли среду TCGM (DMEM, L-glutamine, Asparagine, Pn/Str, NAA, ß-меркаптоэтанол, 10% инактивированной сыворотки лошади и 5-10% супернатанта, полученного из культуры мышиных спленоцитов активированных СопА). На седьмой день, лимфоциты переносили в 96 луночный планшет с плоским дном и рестимулировали в присутствии облученных тимоцитов (1,2x108 на планшет), 100 мкг соответствующего антигена и 0,4 мг/мл. G-418 (для позитивной селекции транедуцированных клеток). На второй день после первой рестимуляции к культуре клеток добавляли среду TCGM. На третий день производили селекцию клонов по интенсивности флуоресцентного белка (если возможно). Выбранные клоны переносили в 6 см. чашки Петри и инкубировали в течение

2-4 дополнительных рестимуляций (для селекции по антигенной специфичности). Для трансдукции лимфоцитов были использованы векторы на основе ретровируса мышиных стволовых клеток pMSCVneo (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany), экспрессирующие GFP, RFP, GFP-IRES-TK или GFP-IRES-NAT под LTR промотором. апЭАЭ был индуцирован внутривенным или внутрибрюшинным введением активированных лимфоцитов (3 или 5x106 на крысу), после чего животных ежедневно осматривали для своевременного выявления клинических симптомов и взвешивали. Клинические симптомы определяли в соответствии со следующей шкалой: 0,5 - ослабление тонуса хвоста; 1 - паралич хвоста; 2 -нарушение походки; 3 - паралич задних конечностей; 4 - тетрапарез; 5 -смерть. В качестве контроля развития апЭАЭ использовали введение 5x106 Т-клеток сенсибилизированных к овальбумину. Внутрибрюшинное введение физиологического раствора служило контролем к введению ганцикловира. Крысы инбредной линии Lewis были получены из вивария института Биохимии Макса Планка (Мартинсрид, Германия). Животные содержались в стандартных условиях, постоянной температуре окружающей среды (+22°С), 12-часовом световом дне и свободном доступе к воде и пище.

Выявление локализации клеток методом флуоресцентной микроскопии

Для анализа распределения GFP позитивных ЭГ Т-клеток с использованием флуоресцентной микроскопии приготавливали 300 цм переживающие срезы ткани легкого и Omentum предварительно перфузированных животных. Срезы анализировали на Флуоресцентном микроскопе Zeiss (Германия, Oberkochen, Axiovert 200М).

Подсчет клеток проточной цитометрией

Для подсчета клеток методом проточной цитометрии, производили забор органов на различных сроках после внутривенного (хвостовая вена) или внутрибрюшинного введения 5х106 активированных МВР Т-клеток. Органы помещали на лед и взвешивали. Для анализа забирали: кровь, селезенку, околотимические лимфатические узлы (parathymic nodes - РТ LNs), брыжеечные (mesenteric nodes — М LNs), парааортальные (para-aortic nodes -PA LNs) и паховые лимфаузлы (inguinal nodes — Ing LNs), а так же спинной мозг. 4 мл гепаринизированной крови использовали для получения лимфоцитарной фракции на градиенте Optiprep, после чего-клетки отмывали и подсчитывали. Селезенку гомогенизировали через металлический фильтр, после чего обрабатывали АСК буфером для лизирования эритроцитов. Белые кровяные клетки отмывали и ресуспендировали в фосфатном буфере для дальнейшего подсчета. Лимфатические узлы выделяли, гомогенизировали и клетки отмывали фосфатным буфером. Спинной мозг гомогенизировали и клетки помещали на Nycodens градиент для выделения лимфоцитов. Флуоресцентные гранулы добавляли в пробу для проточной цитометрии в

определенном количестве, что позволяло затем определять общее количество ЭГ Т-клеток в образце. Цитомитрию проводили на FACS Calibur (BD).

Определение уровня активации ЭГ Т-клеток и характеристика инфильтратов в ЦНС

Клетки выделяли из органов, как было описано выше, или отмывали фосфатным буфером из культуры in vitro. Для иммуноцитометрического анализа использовали антитела против CD8a, CD45, W3/25 (anti-CD4), 0X33 (CD45RA, В cells), CDllb, CD25 (IL-2R), 0X40 (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany). В качестве контрольных антител использовали неспецифические IgG (Sigma, Munich, Germany). Детекцию первичных антител, осуществляли при помощи вторичных анти мышиных антител, конъюгированных с Allophycocyanin (Invitrogen, Karlsruhe, Germany).

Обработка лимфоцитов ганцикловиром и радиоактивными субстратами in vitro

Использовали ганцикловир (GCV) производства Рош (Roche, Манхейм, Германия), коммерческое название - Цимовен (Cymoven®). Для обработки in vitro использовали GCV в концентрации 1 мкг/мл. Радиоактивно меченные субстраты 5-[123I]iodo-l-(2-deoxy-2-fluoro-ß-D-arabinofuranosyl) uracil [123I]FIAU, 9-[4-fluoro-3-(hydroxymethyl)butyl]guanine - [18F]FHBG и metajodobenzylguanidin - [I23I]MIBG были получены из Института Радиационной Медицины Изар Клиники (Мюнхен, Германия). Клетки инкубировали 1 час при +37°С и 5% С02 в присутствии 0.25, 2.5, 12.5 или 25 nCi субстрата, отмывали и рестимулировапи через 24 часа. Аккумулированную клетками радиоактивность определяли как процент от добавленной в культуру.

Инъекция ганцикловира

Для титрования эффективной концентрации in vivo GCV вводили внутрибрюшинно в дозе 0, 5, 20 и 100 мг/кг веса животных, ежедневно в течение 4-х дней, начиная с момента инъекции энцефалитогенных Т-клеток. В дальнейших экспериментах использовали введение GCV в концентрации 20 мг/кг.

Анализ функциональной активности лимфоцитов

Функциональную активность лимфоцитов определяли по степени активации клеток в ответ на аппликацию антигена. Для этого 3x106 ЭГ Т-клеток инкубировали с 10 мкг/мл МВР и 107/мл облученных тимоцитов в течение двух дней. Степень активации оценивали по уровню экспрессии маркеров активации Т-клеток на FACS-Calibur (Becton Dickinson, Хайдельберг, Германия) и по включению [Н3]-тимидина.

Выявление локализации радиоактивно-меченных ЭГ Т-клеток в органах при помощи гамма камеры

На первый или третий день после введения энцефалитогенных лимфоцитов животным вводили внутривенно по 250 pCi [123I]FIAU или [123I]MIBG. Через 2 или 20 часов животных наркотизировали, используя

внутримышечное введение смеси Фентамил:Домитор:Дормикум (Fentanyl:Domitor:Dorm¡cum - 0.06 мг/кг: 0.2 мг/кг: 2.5 мг/кг веса) и сканировали на гамма камере (Сименс, Германия). После сканирования крысам вводили внутрибрюшинно смесь Антиседан:Аноксат:Нарканти (Antisedan:Anoxat:Narcanti - 0.8 мг/кг: 0.25 мг/кг: 0.15 мг/кг) для купирования действия наркоза. Все животные после введения радиоактивного субстрата содержались в специальном виварии Института Радиационной Медицины (Мюнхен, Германия).

Определение уровня экспрессии генов методом количественной

ПЦР

Для анализа уровня экспрессии про- и противо-воспалительных цитокинов в спинном мозге, лимфатических узлах и селезенке использовали метод количественной ПЦР. Органы забирали, гомогенизировали, клетки отмывали и ресуспендировали в TRIZol (Invitrogen, USA). RNA изолировали и синтезировали кДНК согласно протоколу производителя (RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas). Количественную ПЦР производили TaqMan методом с использованием Maxima™ Probe qPCR Master Mix (Fermentas) и FAM-TAMRA меченных специфичных олигонуклеотидов.

Анализ клеточной подвижности in vitro

Анализ подвижности ЭГ Т-клеток проводили в разработанной нами камере с контролем температуры, влажности и концентрации углекислого газа и кислорода. Клетки помещали в 50% матригель в DMEM среде при 4°С и инкубировали 30 минут при 37°С до образования геля. Отслеживание миграции Tmbp-gfp клеток производили на флуоресцентном микроскопе (ZEISS, Германия, Oberkochen, Axiovert 200М) путем сканирования в течение 30 мин. с интервалом в 30 секунд. Полученные, микрофильмы анализировали при помощи программы ImageJ (National Institute of Mental Health (NIMH)).

Белковый иммуноблот (Вестерн блоттинг)

Клетки собирали, отмывали и ресуспендировали в лизисном буфере (50 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 тМ EGTA, 10% glycerol, l%Triton X-100, 100 mM NaF, 10 mM Na4P207, 1 цМ PMSF, and 1 цМ Na3V04 (Sigma-Aldrich, Munich, Germany). Концентрацию белка определяли с использованием метода Бредфорда (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California,USA). 50 микрограмм белка разгоняли в SDS полиакриламидном геле и переносили на Immobilon-P PVDF мембрану (Millipore,Bedford, Massachusetts, USA). Антитела против р53 (Pab 240, разведение 1:500) и р21 (с-19; разведение 1:200) получены из Santa Cruz (California, USA). Pan-actin-, bax- и puma-специфические антитела были получены из Cell Signaling Technology (Frankfurt, Germany) и использовались при разведении 1:1000. Вторичные анти-мышиные и анти-кроличьи антитела были конъюгированы с пероксидазой хрена (Serotec) и разводились 1:5000. Вторичные антитела детектировали с помощью ECL раствора (Perkin Elmer, Darmstadt, Germany) и рентгеновской пленки X-ray film (Amersham, Little Chalfont, UK). Лизат,

полученный из клеток, обработанных доксирубицином (200нг/мл, Sigma, Munich, Germany) использовали как позитивный контроль активации р53 опосредованного апоптоза.

Изучение активации каспазы 3

Ac-DEVD-AMC (BD Bioscience, Heidelberg, Germany) использовали как флуоресцентный субстрат для каспазы-3. Т-клетки или фибробласты инкубировали в течение 1 часа с Ac-DEVD-AMC (20цМ). Пуромицин (Змкг/мл) или GCV (1цМ) добавляли в инкубационную среду и скорость расщепления Ac-DEVD-AMC измеряли на спектрофотометре (VICTOR 2, Perkin Elmer, Massachusetts USA) при длине волны излученного света 430-460 nm при 37°С в течение 12 часов.

Статистическая обработка результатов

Данные, представленные в разделе "Результаты исследования", являются результатами 4-5 экспериментов, каждое определение проводилось в 3-4 повторах в зависимости от дизайна эксперимента. Результаты экспериментов обрабатывали с помощью стандартных методов вариационной статистики с помощью компьютерных программ STATISTIKA 5.0. и Exel. Достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Энцефалитогенные Т-клетки и апЭАЭ

Для достижения поставленных в работе задач были созданы линии трансгенных CD4+ Т-лимфоцитов, сенсибилизированных к основному белку миелина (МВР) и экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP) (Tmbp-gfp), красный флуоресцентный белок (TMnP.RFp), тимидин киназу вируса простого герпеса 1-го типа в бицестронной кассете вместе с GFP (Tmbp-gfpTK4) или белок - переносчик норэпинефрина - hNET вместе с GFP (ТМВР.0П>ЬКЕ1^). CD4+ Т-лимфоциты, сенсибилизированные к овальбумину (OVA) и экспрессирующие GFP (Tova-gfp) использовали в качестве контрольных. Гены были доставлены в Т-лимфоциты с помощью рекомбинантных ретровирусов, кодирующих интересующие конструкты под LTR промотором и ген устойчивости к неомицину. Функциональную активность доставленных в лимфоциты генов определяли количественной ПЦР, флуоресцентной микроскопией при анализе экспрессии GFP и RFP и в тесте по определению чувствительности к ганцикловиру для TMBp-gfpTK+ клеток. Селекцию клеток по антигенной специфичности осуществляли путем нескольких последовательных стимуляций антигеном в присутствии антиген-презентирующих клеток с цикличностью в 7 дней. После последовательных стимуляций, селекции по гену устойчивости к неомицину и селекции по экспрессии флуоресцентного белка, CD4+CD25+IFNy+ лимфоциты (GFP или RFP) составляли более 96% от всей популяции клеток.

Введение активированных Т-лимфоцитов животным приводило к

развитию классической клинической картины апЭАЭ выраженной в ослаблении двигательной активности конечностей и параличах. апЭАЭ характеризуется воспалением, которое развивается в спинном и головном мозге и протекает со слабо выраженной демиелинизацией и повреждением проводимости аксонов. При апЭАЭ у крыс линии Lewis, вызванным введением специфических к МВР Т-клеток, нарушение проводимости аксонов имеет обратимый характер, что определяет монофазное течение заболевания с последующим полным восстановлением. У животных, которым вводили Т-клетки, сенсибилизированные к овальбумину развитие патологий не наблюдалось.

Использование трансгенных линий ЭГ Т-клеток, несущих маркерный ген, предоставило возможность для отслеживания локализации, поведения и функциональных перестроек непосредственно энцефалитогенных Т-клеток in vivo и ex vivo.

Локализация энцефалитогенных Т-клеток на ранних стадиях развития апЭАЭ

Согласно поддерживаемому нами предположению А. Флюгеля, миграция энцефалитогенных клеток через органы иммунной системы необходима для формирования миграционного фенотипа, который позволяет этим клеткам преодолевать ГЭБ (Flügel, Berkowicz et al. 2001). Поэтому знание путей миграции ЭГ Т-клеток до их проникновения в ЦНС важно для понимания процессов, протекающих в этих клетках, и для обнаружения факторов, которые принимают участие в формировании миграционного фенотипа. Несмотря на обнаружение ЭГ Т-клеток в околотимических лимфоузлах, селезенке и кровотоке на преклиническом этапе развития ЭАЭ, неясно, являются ли эти органы необходимыми для формирования миграционного фенотипа, и будут ли они адресатами миграции ЭГ Т-клеток при другом методе введения. Кроме того следует заметить, что в исследованных органах ЭГ Т-клетки наблюдаются только через 24 часа после введения и их распределение на более ранних сроках остается неизвестным. Для того, чтобы ответить на эти простые, но принципиально важные вопросы, мы провели сравнение путей миграции ЭГ Т-клеток после их внутрибрюшинного и внутривенного введения, используя проточную цитометрию, флуоресцентную микроскопию, гамма-сканирование радиоактивно меченных Т-клеток и количественную ПЦР. Совокупность использованных методов позволила определить, что селезенка и околотимические лимфатические узлы являются органами, вовлеченными в процесс миграции ЭГ Т-клеток на преклиническом этапе ЭАЭ независимо от способа их введения (Рис. 1). Более того, наибольшее количество ЭГ Т-клеток аккумулируется в селезенке непосредственно перед их миграцией в ЦНС и уменьшается обратно пропорционально увеличению их количества в ЦНС, что позволило предположить наличие миграционного фенотипа у ЭГ Т-клеток,

обнаруживающихся в селезенке перед массовой миграцией в ЦНС (Носов М. и др. 2009).

о 180

1 135

# 90

I Я 45 0

Б| 300

= 225

1 150

У 75

1 Я, 0

в§ о X

1000

1 750

с 500

о С й 250 0

г| 180

Дс

S 16 2 12 «Г я

« п

8 600 X

I 450

s- 300

J_I

ill

ж£

! 135

] so I 45

I..

I 600

§ 450 I 300 о 150

й 0

~ eoo

I "50

8*300

I 150 5

а о

LJL

Рисунок 1. Изменение количества энцефалитогенных Т-клеток в органах после их внутривенного и внутрибрюшинного введения.

Распределение количества энцефалитогенных Т-клеток через 24 (А и Д), 48 (Б и Е), 72 (В и Ж) и 96 часов (Г и 3) после внутривенного (А, Б, В, Г) или внутрибрюшинного (Д, Е, Ж, 3) введения в: 1 - Крови; 2 - Спинном мозге; 3 -Селезенке; 4 - Околотимических лимфатических узлах (parathymic nodes - РТ LNs); 5 - Брыжеечных лимфатических узлах (mesenteric nodes - М LNs); 6 -Парааортальных лимфатических узлах (para-aortic nodes - PA LNs); 7 -Паховых лимфатических узлах (inguinal nodes - Ing LNs). *:p<0.001 no отношению к количеству клеток в селезенке через 72 часа после введения. #:р<0.005 по отношению к количеству клеток в спинном мозге через 72 часа после введения.

Для анализа функциональных перестроек ЭГ Т-клеток на преклиническом этапе развития ЭАЭ, ЭГ Т-клетки были сортированы из тканей легкого, околотимических лимфатических узлов, селезенки, спинного мозга и крови через 6, 30, 58, 82 и 106 часов после их введения с помощью флуоресцентно активированной проточной цитометрии, и уровень экспрессии генов IFNy, CD25 (рецептор интерлейкина 2), KLF2 (kruppel like factor 2) и S1P1 (sphingosine-l-phosphate receptor 1) был исследован с помощью количественной ПЦР. В качестве контрольных, использовались клетки инкубируемые in vitro. Активированные in vitro ЭГ Т-клетки экспрессировали маркеры активации (IFNy и CD25) на высоком уровне в день их введения (0ч in vitro) (Рис. 2).

Функциональные перестройки энцефалитогенных Т-клеток на разных стадиях развития апЭАЭ

Тем не менее, экспрессия IFNy и CD25 в культуральных клетках заметно снижалась со временем (82ч и 106ч in vitro). Постепенное снижение уровня CD25 мРНК наблюдалось в Т-клетках, сортированных из легких через 30, 58 и 82 часа после их введения. Снижение уровня экспрессии маркеров активации в ЭГ Т-клетках было зафиксировано в течение всего преклинического этапа ЭАЭ вплоть до их активной миграции в ЦНС, где ЭГ Т-клетки реактивировались в ответ на действие эндогенного миелина мозга (Рис. 2). Противоположная динамика изменения уровня экспрессии была обнаружена при изучении транскрипционного фактора KLF2. Экспрессия KLF2 усиливалась в течение преклинической стадии ЭАЭ и достигала максимума непосредственно перед началом миграции ЭГ Т-клеток в ЦНС (через 82ч в селезенке и околотимических лимфоузлах), где затухала обратно пропорционально степени активации клеток. Схожая динамика изменения экспрессии была обнаружена и для рецептора сфингозин-1-фосфата S1P1, который так же активировался непосредственно перед миграцией ЭГ Т-клеток в ЦНС (Рис. 2). Активация экспрессии KLF2 в процессе миграции на преклиническом этапе ЭАЭ нашла подтверждение и в ходе анализа данных, полученных с помощью ДНК-микрочипов (DNA microarray), которые использовали для определения паттерна экспрессии генов в активированных ЭГ Т-клетках in vitro и в клетках, изолированных из селезенки на преклиническом этапе ЭАЭ через 72 часа после введения.

Кроме KLF2, выраженную активацию экспрессии продемонстрировал ген rhamm, который кодирует рецептор к гиалуронану (RHAMM - receptor for hyaluronan-mediated motility) и, как известно, принимает участие в регуляции подвижности клеток (данные К. Heckelsmiller, не опубликовано).

Исходя из факта, что экспрессия RHAMM активируется в TMBp-gfp клетках непосредственно перед их миграцией в ЦНС, логично предположить, что гиалуронан может играть существенную роль в механизмах развития

модуляцию

функционального состояния

патологии при апЭАЭ через энцефалитогенных Т-клеток.

Для подтверждения данного предположения было исследовано влияние различных компонентов экстраклеточного матрикса на подвижность Tmbp-gfp клеток in vitro, уровень их активации и пролиферативной активности, а также на энцефалитогенный потенциал.

CD25

2x10* 1x102 О

S 4,5x10

х 5

| 3x10J

1 1.5x10''

2 PJ

1 2 3 4 5 8 7! 5 9 10 11

KLF2

. 1 А

я * № 1 : I #

leJJ.I I 1 1 ..я . — .

х 16x102 % .1 I 12x10

1 8x102

& .5

х 4x10 а

и. О ё

£ бхю"

IFN-g

U L: »

3 4 5

6 7

S1P1

* ¡i 8 9 Ю

11 12

1 2 3 А 5 6 7 8 9 10 11 12

4x10" 2x10' 0

4 5 в 7 8 9 10 11 12

Рисунок 2. Динамика изменения экспрессии генов ifny, cd25, klf2 и si pi энцефалитогенными Т-клетками сортированными из: ткани легкого - через 6 - (1), 30 - (2), 58 - (3) и 82 часа (4); из кровотока через 6 (5) и 82 часа (6); из околотимических лимфоузлов через 82 часа (7); из селезенки через 82 часа (8), из спинного мозга через 106 часов (9) после введения и из культуры клеток перед их введением (10) и через 82 - (11) и 106 часов (12) инкубации in vitro.

*:р<0.001 относительно уровня экспрессии соответствующего гена в ЭГ Т-клетках на момент введения. #:р<0.005 относительно уровня экспрессии соответствующего гена в Т- клетках сортированных из селезенки (8).

Подвижность энцефалитогенных клеток и влияние на нее экстраклеточного матрикса

Гиалуронан (Ьуа1игопап) это гликозаминогликан, который входит в состав соединительной, эпителиальной и нервной тканей. В ЦНС гиалуронан является одним из основных компонентов экстраклеточного матрикса и участвует в регуляции активации и миграции клеток через взаимодействие со своими рецепторами СЭ44 и 1ШАММ. Поскольку на преклиническом этапе развития ЭАЭ происходит активация рецептора к гиалуронану в ЭГ Т-клетках в процессе их миграции, логично предположить, что гиалуронан может играть роль в формировании «миграционного» фенотипа. Для изучения роли эктраклеточного матрикса (ЭКМ), гиалуронана в частности, в формировании

«миграционного» фенотипа ЭГ Т-клеток, мы разработали метод для оценки подвижности клеток in vitro (см. методы). Используя флуоресцентный микроскоп, отслеживали миграцию ЭГ Т-клеток, которые были предварительно рестимулированы в присутствии различных компонентов ЭКМ в Матригеле в течение 30 мин при 37°С и при контроле уровня С02 и 02 (Matrigel, BD). Полученные таким образом микрофильмы анализировали с помощью программы ImageJ (National Institute of Health, USA). Результаты представлены в виде совмещенных траекторий отдельных клеток, распределения клеток по скоростям и отношения количества быстро мигрирующих (средняя скорость >3.5 мкм\мин) и медленно мигрирующих клеток (средняя скорость <3.5 мкм\мин).

При сравнении миграционной активности ЭГ Т-клеток активированных in vitro (48 часов после стимуляции) и тех же клеток, но выделенных с помощью проточной цитометрии из ЦНС животных (на 4ый день после введения), с апЭАЭ (ex vivo), было обнаружено, что ex vivo ЭГ Т-клетки способны мигрировать через ЭКМ значительно интенсивнее, чем клетки, которые инкубировали in vitro (Рис. 3). Средняя скорость миграции культуральных клеток составляла 3,4 мкм/мин., а максимальная 24 мкм/мин. против 5,74 мкм/мин. и 39 мкм/мин. для ex vivo изолированных клеток соответственно. Таким образом, разработанный нами метод позволяет визуализировать функциональные изменения ЭГ Т-клеток, выражающиеся в способности клеток мигрировать через ЭКМ. Используя описанный метод, было изучено влияние компонентов ЭКМ на миграционную активность ЭГ Т-клеток. В этих целях клетки рестимулировали в присутствии смеси компонентов ЭКМ и в присутствии высокомолекулярного или низкомолекулярного гиалуронана, а затем определяли миграционную активность этих клеток, степень их активации, пролиферации, а так же уровень экспрессии KLF2.

Оказалось, что присутствие в инкубационной среде Матригеля ведет к повышению миграционной активности ЭГ Т-клеток по сравнению с таковой у клеток, которые были рестимулированны без добавлений (средняя скорость 3,8 мкм/мин. и 6,3 мкм/мин.; максимальная 26 мкм/мин. и 39 мкм/мин. для ЭГ Т-клеток, стимулированных без добавок и в присутствии Матригеля, соответственно) (Рис. 4). Большинство клеток, которые были рестимулированы в присутствии Матригеля, двигались со средней скоростью более 5 мкм/мин., то есть относились к «Быстрым». Присутствие высокомолекулярного гиалуронана в инкубационной среде так же стимулировало активацию миграции ЭГ Т-клеток через ЭКМ, в то время как аппликация низкомолекулярного гиалуронана не влияла на способность ЭГ Т-клеток к миграции (Рис. 5) (средняя скорость 3,3 мкм/мин. и 4,9 мкм/мин.; максимальная 23 мкм/мин. и 34 мкм/мин., для ЭГ Т-клеток, стимулированных в присутствии низкомолекулярного гиалуронана и высокомолекулярного гиалуронана, соответственно).

In vitro

Ex vivo

5 10 15 20

Скорость миграции (мкм/мин.)

Медленные

Быстрые

5 10 15 20

Скорость миграции (мкм/мин.)

Медленные

Быстрые

Рисунок 3. Миграция культуральных энцефалитогенных Т-клеток и клеток выделенных из ЦНС в экстраклеточном матриксе.

А - Траектории миграции отдельных клеток, совмещенные в стартовой точке. Б - Распределение клеток по скоростям миграции. В - Процент клеток, мигрирующих медленно (со скоростью менее 3.5 мкм/мин.); и быстро (быстрее чем 3.5 мкм/мин.). *: р<0.05 по отношению к количеству «быстрых» клеток in vitro.

Контроль

Матригель

до

5 10 15 20

Скорость миграции (мкм/мин.)

Медленные

Быстрые

100 80 60 40 20 0

5 10 15 20

Скорость миграции (мкм/мин.)

Медленные

быстрые

Рисунок 4. Влияние ЭКМ на миграционную активность энцефалитогенных Т-клеток после их стимуляции в присутствии Матригеля и без него.

(А) Траектории миграции отдельных клеток, совмещенные в стартовой точке. (Б) Распределение клеток по скоростям миграции. (В) Процент клеток, мигрирующих медленно (со скоростью менее 3.5 мкм/мин.); и быстро (быстрее чем 3.5 мкм/мин.). *: р<0.05 по отношению к количеству «быстрых» клеток в контроле.

Высокомолекулярный гиалуронан

Низкомолекулярный гиалуронан

с; 20

5 10 15 20

Скорость миграции (мкм/мин.)

с;

ь:

0 ш

30 ■

20 ■

5 10 15 20

Скорость миграции (мкм/мин.)

0) 40

.о

Медленные

Быстрые

: 20

Медленные

Быстрые

Рисунок 5. Влияние ЭКМ на миграционную активность энцефалитогенных Т-клеток после их стимуляции в присутствии высокомолекулярного или низкомолекулярного гиалуронана.

А - Траектории миграции отдельных клеток, совмещенные в стартовой точке. Б - Распределение клеток по скоростям миграции. В - Процент клеток мигрирующих медленно (со скоростью менее 3.5 мкм/мин.); и быстро (быстрее чем 3.5 мкм/мин.). *: р<0.05 по отношению к количеству «быстрых» клеток после рестимуляции с высокомолекулярным гиалуронаном.

Для того, что бы нивелировать неспецифическое влияние трехмерной структуры ЭКМ на функции Т-клеток, была произведена оценка воздействия биологически неактивного матрикса - Algi Gel и показано, что эффект действия экстраклеточного матрикса на миграционную активность ЭГ Т-клеток осуществляется через активное взаимодействие компонентов ЭКМ с клетками, а не за счет его геометрии. Рестимуляция ЭГ Т-клеток в присутствии ЭКМ ведет к снижению пролиферативной активности клеток. Присутствие в инкубационной среде гиалуронана снижает интенсивность пролиферации активированных Т-клеток по сравнению с контрольными, но наиболее выраженный ингибирующий эффект на пролиферацию клеток обнаружен при рестимуляции ЭГ Т-клеток в присутствии Матригеля. В этом случае пролиферация, определенная по уровню встраивания ЗН-тимидина, снижалась на 50% (Рис. 6). Несмотря на снижение пролиферативной активности энцефалитогенных Т-клеток при их стимуляции в присутствии ЭКМ, уровень их активации соответствовал таковому у клеток в контроле. Уровень маркеров активации 0X40 и CD25 сохранялся примерно на одном уровне после стимуляции клеток в присутствии Матригеля, гиалуронана или без добавок. Более того, клетки, которые были рестимулированы в присутствии ЭКМ, экспрессировали klf2 на более высоком уровне по сравнению с клетками, которые были стимулированы без добавок (Рис. 6 Б).

А Б

12000 10000

£ а

4000 2000 0

ш =6*10 I М

111 ■ н! IИ

Контроль НАШИ НАНМИ МО * Контроль НА мв

Рисунок 6. Интенсивность пролиферации - (А) и экспрессии КЬР2 -(Б) в ЭГ Т-клетках, рестимулпрованных в присутствии экстраклеточного матрикса.

А - Связывание 3Н-тимидина (сргп) при рестимуляции клеток в присутствии высокомолекулярного (НА НМ\У) и низкомолекулярного (НА ЬМ\\0 гиалуронана и матригеля (МС). В Уровень экспрессии КЬР2 в ЭГ Т-клетках, растимулированных с высокомолекулярным гиалуронаном (НА) или матригелем (МО). *: р<0.05 по отношению к контролю.

В завершении был исследован энцефалитогенный потенциал ЭГ Т-клеток после рестимуляции в присутствии Матригеля или гиалуронана. Введение ЭГ Т-клеток, которые были рестимулированны с ЭКМ, вызывало развитие ЭАЭ, начиная с 4-х суток после их введения у животных всех

исследованных групп. Тем не менее, животные, которым вводили ЭГ Т-клетки, рестимулированные с Матригелем, продемонстрировали развитие более тяжелых клинических симптомов (Рис. 7). Введение клеток, рестимулированных в присутствии гиалуронана, вызывало развитие заболевания, которое протекало тяжелее, чем у животных контрольной группы, но менее тяжело, чем у животных, которым вводили клетки, активированные в присутствии Матригеля.

Таким образом, компоненты экстраклеточного матрикса играют существенную роль в формировании фенотипа ЭГ Т-клеток, в частности в активации миграционной активности клеток, подавлении пролиферации без влияния на их способность к активации и усилении энцефалитогенных свойств лимфоцитов, сенсибилизированных к антигену ЦНС.

2 5 о

а> £ ?

Ч 1

1 2 3

5 6 7 8 11

Время после введения (дни)

£ 30

g 20 8 10 S о

Ф -10 |-20 S-30

012345678 11 Время после введения (дни)

Контроль о И HMW НА

■ MG

Рисунок 7. Клинические симптомы, проявляющиеся при введении энцефалитогенных Т-клеток, рестимулированных в присутствии экстраклеточного матрикса (Высокомолекулярного гиалуронана — НМ\У НА и матригеля - Мв). *: р<0.05 по отношению к контролю.

Энцефалитогенные Т-клетки в развитии апЭАЭ

В настоящее время, не вызывает сомнения, что ведущая роль в инициации воспаления в ЦНС при развитии PC и ЭАЭ принадлежит энцефалитогенным CD4 лимфоцитам. Тем не менее, их роль и функция на клиническом и восстановительном этапе до сих пор остаются невыясненными. Более того, согласно устоявшемуся предположению развитие аутоиммунного воспаления в ЦНС в модели ЭАЭ опосредовано наличием двух волн миграции ЭГ Т-клеток в ЦНС (Wekerle, Linington et al. 1986; Hickey, Hsu et al. 1991). Bo время первой волны Т-клетки мигрируют в ЦНС непосредственно после введения, причем количество этих клеток крайне незначительно (десятки, сотни). Вторая, массивная, волна инфильтрации ЦНС ЭГ Т-клетками происходит на 3-4 день после их введения и сопровождается проявлением клинических симптомов. Незначительное количество клеток - «пионеров»

("Pioneers cells"), которые проникают в ЦНС с первой волной, имеют фенотип активированных Thl клеток и синтезируют провоспалительные цитокины, независимо от присутствия эндогенных антигенов. Согласно предположению, именно клетки - «пионеры» создают необходимые условия для развития второй волны проникновения в ЦНС антиген специфических энцефалитогенных Т-клеток и неспециализированных клеток иммунной системы (Flügel, Odoardi et al. 2007). Тем не менее, данный сценарий развития апЭАЭ не имеет строгого подтверждения до сих пор, из-за крайне небольшого числа клеток - «пионеров», мигрирующих в ЦНС.

Использование системы индуцибелыюго самоубийства позволило исследовать роль энцефалитогенных клеток на разных стадиях развития апЭАЭ. Для этой цели была выбрана система индуцибельного клеточного самоубийства на основе тимидин киназы вируса простого герпеса первого типа (Herpes simplex virus 1 thymidine kinase - HSV-TK) и нетоксичного агента Ганцикловира (GCV).

Следует отметить, что механизм клеточной гибели в системе HSV-TK/GCV не до конца ясен, хотя существуют предположения, что апоптоз, наряду с неапоптотическими механизмами клеточной гибели, может быть вовлечен в этот процесс. Индукция гибели клеток, экспрессирующих HSV-TK после обработки GCV происходит, главным образом, вследствии блокирования репликации в процессе деления клеток, и, следовательно, должна иметь место в культуре активно делящихся, пролиферирующих клеток. Оказалось, что система индуцибельного клеточного самоубийства (СИКС) на основе HSV-TK/GCV эффективна для удаления как активно пролиферирующих, так и слабо пролиферирующих TMBp-gfp ТК+ клеток (Рис. 12).

Для того, чтобы исследовать роль энцефалитогенных клеток на разных стадиях развития апЭАЭ, использовали введение GCV в различные сроки. Инъекции GCV начинались со дня введения, через 48 или 84 часа после введения TMBp-ofpTK+ или TMbp-gfp лимфоцитов, что соответствовало преклинической и началу клинической стадии развития апЭАЭ. Каждый курс введения GCV имел продолжительность 4 суток. Длительность и тяжесть течения заболевания были значительно меньше у животных, получавших GCV, на преклинической стадии (начиная с момента и через 48 часов после введении ЭГ Т- клеток) по сравнению с контрольными крысами, которым вводили физиологический раствор (продолжительность заболевания: 2±1,4 и 3,25±0,35 по сравнению с 6±0,7 днями; суммарные клинические симптомы: 1,5±1,4 и 3,75±2,4 по сравнению с 14,1±1,28 для животных, получавших GCV начиная с момента введения и через 48 часов после введения по сравнению с контрольной группой соответственно) (Рис. 8; Таблица 1). Применение GCV с момента первого проявления клинических симптомов, через 84 часа после введения энцефалитогенных Т-клеток, не сказывалось на развитии заболевания (продолжительность заболевания: 4,7±0,7 и 6±0,7 дней;

суммарные клинические симптомы: 12,74±0,36 и 14,1 ±1.28 для животных, получавших ОСУ или физиологический раствор соответственно) (Рис. 8; Таблица 1).

Таблица 1. Проявления клинических симптомов при введении ганцикловира.

Тип клеток и Кл-во Продолжи- Максимальные Суммарный Максимальное

курс введения крыс тельность Кл. Симптомы клиническим изменение веса

ОСУ Дни индекс в фаммах

Физ.р-р. 8 6+0.7 3.7±0.06 14.1+1.28 -40.5+1,4

вСУ с 0 часов 8 2+1.41* 1+0.7* 1.5+1.4* -28+4.24*

ССУ с 48 часов 8 3.25+0.35* 2.58+0.1 \*# 3.75±2.4* -35.5+1.7

ОСУ с 84 часов 8 4.710.7 3,65+0.2 12.74+0.36 -42.3+6.08

о 4 с

X о

о 3

0 2

ф £-■у

1 1 с;

Физ.р-р. вСУ 84 ч вСУ 48 ч вСУОч

О 1

(Г

¡1

7 8

Время после введения ЭГ Т-клеток (дни)

Рисунок 8. Ганцикловир опосредованное удаление ТМвр-сррТК+ клеток на преклиническом этапе развития ЭАЭ эффективно снижает тяжесть течения заболевания.

Клинические симптомы апЭАЭ, вызванного введением 5x106 ТМВр-орр'ГК: клеток. ОСУ вводили ежедневно, начиная с момента инъекции Т клеток (0 ч), через 48 (48 ч) и через 84 часа (84 ч). *: р<0.05; проявление симптомов при введении ОСУ по сравнению с их проявлением при введении физ-го р-ра.

вСУ (20мг/кг) вводили внутрибрюшиино в течение 4-х дней начиная с момента введения (0 ч) и через 48 (48 ч) или через 84 часа (84 ч) после введения ЭГ Т-клеток. Контрольным животным вводили физиологический раствор, начиная с момента введения клеток.

*: р<0.05; проявление симптомов при введении ССУ по сравнению с их проявлением при введении физ-го р-ра.. #:р<0,05 проявление симптомов при введении ССУ с момента введения Т клеток по сравнению с их проявлением у животных, получавших ОСУ после 48 часов.

Следует отметить, что животные, получавшие ОСУ, начиная с преклинической стадии (со дня введения клеток и через 48 часов), демонстрировали схожую динамику снижения тяжести течения заболевания по сравнению с контрольными, тем не менее, тяжесть симптомов заболевания, различалась. Исследовано соотношение особенностей проявления клинических симптомов у животных, которым вводили вСУ в различных вариантах с количеством энцефалитогенных клеток в спинном мозге, селезенке и в лимфатических узлах. ТМВр-сгрТК+ клетки подсчитывали в различных органах посредством флуоресцентной цитометрии на 4-й день у животных, получавших вСУ в преклинической стадии (0 ч и 48 ч) и на 5-й день у животных, получавших вСУ с 84 часов. Значительное уменьшение количества энцефалитогенных Т- клеток было обнаружено во всех органах и при всех курсах введения вСУ (Рис. 9). У животных, получивших ОСУ с момента введения Т-клеток, ТМвр-сррТК+ клетки практически не обнаруживались во всех исследованных органах. При начале курса инъекций вСУ через 48 часов после введения клеток примерно 80-90 % процентов инъецированных клеток были специфически удалены. Введение ССУ с момента проявления клинических симптомов, то есть через 84 часа после введения клеток, вызывало 50 процентное уменьшение количества энцефалитогенных клеток в ЦНС и на 40% и 80% сокращалось количество клеток в селезенке и лимфоузлах, соответственно. Интересно отметить, что изменение количества энцефалитогенных клеток в исследованных органах было прямо пропорционально уровню экспрессии ПТЧу, 1Ь-17 и 1Ь-2Я, определенному с помощью количественной ПЦР (Рис. 9 Б). Удаление ЭГ Т-клеток на преклиническом этапе развития ЭАЭ приводит к существенному ослаблению инфильтрации ЦНС макрофагами, неспецифическими Т и В-клетками. Количество ЭГ Т-клеток в ЦНС уменьшается более чем на 96%, в то время как инфильтрация макрофагами, СБ4 лимфоцитами и В-клетками снижается только на 45, 50 и 30% соответственно. Следовательно, даже незначительное число Т-клеток, преодолевающих ГЭБ, привлекает достаточное количество клеток иммунной системы, образующих инфильтраты и способствующих развитию патологических процессов. Хотя клинические симптомы при этом значительно снижены, тем не менее, они проявляются (Рис. 10).

I о

II II

1.2, . 1 I 0.8 0.6: 0.4 0.21 0

н О

О Физ.р-р.

ЦНС

вСУ 84ч

1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2

I-............ о

ОСУ 48ч

Селезенка

вСУ Оч

1.2 1 0.8 0.6 0.4, 0.2 ........ О

ЛУ

Б)

^ 5.00е-02,

2 4.00е-02

| 3.00е-02

£ 2.00е-02 га

ьг 1.00е-02

^ о.оое+оо! 2

Физ.р-р. ■ ЭСУ 84ч

йСУ 48ч

вСУ Оч

5.006-02 4.00е-02 3.00е-02 2.00е-02 1.00е-02 о.оое+оо.......

И-17

\L-2R

Рисунок 9. Изменение количества Тмнр-(;крТК+ клеток и уровня экспрессии цитокинов в органах крыс с апЭАЭ, вызванным введением ТМвр-сгрТК+клеток при различных курсах введения ОСУ.

Ежедневные инъекции ОСУ начинали с 0, 48 или 84 часов после введения Тмвр-он>ГК клеток. А - отношение количества ТМВР.0РРТКт клеток у животных после инъекции вСУ к количеству ТМвр-оррТК+ клеток у животных, которым вводили физиологический раствор. В - Уровень экспрессии П-Ыу, 1Ь-17 и рецептора 1Ь-2 (1Ь-2Я) мРНК, определенных методом количественной ПЦР в спинном мозге крыс на 4 ый день после введения ТМВр_оррТК клеток. *:р<0.05 по отношению к соответствующим показателям у контрольных животных (введение физиологического раствора).

Данное наблюдение полностью подтверждает предположение о роли ЭГ Т-клеток как провокаторов и дирижеров аутоиммунного воспаления в ЦНС. Таким образом, полученные нами данные дают возможность заключить, что ЭГ Т-клетки играют ключевую роль в инициации аутоиммунного воспаления в ЦНС, но не имеет существенного значения в развитии патологических процессов на клинической и восстановительной стадиях апЭАЭ.

А)

£>

з:

" 3 ф

о 1 ф

¡о-

Ф-Р-Р- Тмвретр ШОСУТ„вмп>

Б)

I Ф.р-р. Т„вр^„тк* I 6СУТ„вР<!РРТК-

О Ф.р-р- Тмар-етр А ф.р-р. Т„ВМРРТК-

1А ...

Время после введения (дни)

'о.....1........2

АН

3 4

"5 6

8 Ю ® „

ш О

| -10

1 "20 I -30 § -40 -50

♦ ОС\/ ТМВР<1П, ...с-.-Л

А6СТТ„

\ >,/

В)

Г)

2 350; т*мвр-срр Е 350

1300 |зоо-:

я 250 | Г1 Физ.р-р. я 250

1200 ■ вСУ •$ 200-

| 150: | 150

о 100 8 юо

* о £1....... II 1 Г1 П I 50 | * 0

О.......1......2.......3 4 5......6......7......8 9......10

Время после введения (дни)

.ТК*

Физ.р-р. вСУ

.1..............■

вРР С045 С011 С04 С08а 0X33

вЯР СР45 С011 С04 С08а 0X33

Рисунок 10. Ослабление клинических симптомов и уменьшение воспаления в центральной нервной системе при инъекции Ганцнкловира.

Клинические симптомы (А) и изменение веса (Б) у животных, получивших инъекцию Т\шр-оррТК.' или ТМвр-орр лимфоцитов. ОСУ вводили ежедневно в течение 4 дней с момента введения клеток. Количество клеток в ОБР, СБ45, СОНЬ, С04, С08а и 0X33 позитивных популяциях в спинном мозге через 96 часов после введения ТМвр-орр (В) или ТМвр-оррТК+ (Г) лимфоцитов при каждодневной в/б инъекции ОСУ (черные столбики) или физиологического раствора (белые столбики). *:р<0.05.

Влияние удаления Г\шрчлр! клеток на активность Г\1 нс-ки1 клеток при апЭАЭ

Система индуцированного клеточного самоубийства (СИКС) на основе Н8У1-ТКЛЗСУ нашла широкое применение, как в лабораторной, так и в клинической практике. Например, СИКС применяется при клеточной терапии с целью обезопасить пациента от возникновения нежелательных эффектов, сопряженных с введением клеток. Низкая токсичность субстрата Н8У1-ТК для организма и высокая избирательность легли в основу создания стратегии генной фермент-продраг опосредованной терапии рака, включающей методы генной терапии для доставки активности НБУЫк в опухолевые клетки и провокацию самоубийства последних системным введением ОСУ (БНЫ, Сагпо ег а1. 2003). Высокая эффективность терапии раковых опухолей с

применением системы HSV-TK/GCV обусловлена наличием «эффекта свидетеля» (bystander effect - анг.), в результате которого гибнут не только клетки, экспрессирующие HSVl-tk, но и клетки, находящиеся в непосредственной близости от них.

Для того чтобы исключить возможность сопутствующего негативного влияния гибнущих TMBP.GFPTK+ клеток на другие клетки, вовлеченные в развитие ЭАЭ, мы изучили влияние удаления TMBP_QFPTK+ клеток на активность TMBp.RFp эндефалитогенных клеток в эксперименте с их комбинированным введением. Под комбинированным введением Т-клеток подразумевается совместное введение чувствительных и толерантных к GCV энцефалитогенных Т-клеток, экспрессирующих различные флуоресцирующие белки, необходимые для их дальнейшего распознавания. Введение TMBp-gfpTK+ и Tmbp-rfp клеток проводили на фоне ежедневного введения GCV с последующим подсчетом количества флуоресцирующих «красных» (RFP) и «зеленых» (GFP) клеток в ЦНС. Удаление «зеленых» TMbp-gfpTK+ клеток не сказывалось на энцефалитогенном потенциале оставшейся популяции «красных» Tmbp-rfp клеток, и не влияло на другие клетки иммунной и нервной систем, участвующие в развитии патологии, что подтверждено динамикой проявления клинических симптомов (Таблица 2). Удаление «зеленых» Тмвр-gfpTK+ клеток не только не оказывало ингибирующего влияния на способность «красных» TMbp-rfp клеток мигрировать в ЦНС, но, неожиданно для нас, приводило к увеличению числа мигрировавших в ЦНС «красных» клеток (Рис. 11 А и Б).

Таблица 2. Энцефалитогенный потенциал 1мврда клеток при специфическом удалении ТМВР_СП> ТК+ клеток введением ганцикловира.

Тип клеток и Введение GCV Кл-во крыс Продолжительность. Дни Максимальные Кл. Симптомы. Суммарный клинический индекс Максимальное изменение веса в граммах

ТК" 8 3.5+0.7 2.24±0.7 5.11 ±0.19 18.35+1.9

ТК+ 8 4±0 2.41±0.82 5.37+1.24 24.5±0.7

ТК"ЯК+ 8 4+0 2.9Ш.12 7.35+1.1 25.7512.4

TK7TKVGCV 8 3.5±0.7 2.7+0.05 6.82+1.6 24.6+3.7

АпЭАЭ индуцировали введением ЗхЮ6 Тмшмир клеток (ТК~), ЗхЮ6 ТМВр.0ррТК+ клеток (ТК+), или ЗхЮ6 Тмвр.крр клеток совместно с ЗхЮ6 ТМВр-оррТК+ клеток (ТК7ТК '). Начиная со дня введения клеток, животные получали ежедневные инъекции физ.р-ра или йСУ (20мг/кг).

То есть наблюдался эффект замещения «красными» ТМВР.К!1> клетками удаленных «зеленых» ТМвр-оррТК+ клеток. Объяснение этого феномена кроется в предположении о наличии двух волн миграции ЭГ Т-клеток в ЦНС в процессе развития апЭАЭ.

А).

1 2x10°'

1 1.5x10е

к 1x10 1

5 5

+ 5x10

Б)

"Гивр-нрр"'" Тцвр-егр-тк

§ 1.вх1 о6

1 8x105

4x10

2x10

о,

® "Гмар,0рр.тк+Тмвр_крр

" "Гузр^рр^+Тувр.дрр+бСХ/

Рисунок 11. Количество энцефалитогенных Т-клеток в ЦНС при неинвазивном удалении части популяции введением ганцикловира (20 мг/кг веса).

А - Количество ЛГР+ и Б - ОРР клеток в ЦНС на 4-е сутки после введения ЭГ Т-клеток: без или в комбинации с ежедневным введением вСУ. * (р<0.05) Мее!.

Согласно этому предположению, незначительное число введенных активированных ЭГ Т-клеток (клетки «пионеры») мигрируют в ЦНС в течение первых часов после введения и посредствам секреции провоспалительных цитокинов создают возможность для массовой миграции клеток иммунной системы со второй волной их поступления в мозг. Ранее нами было показано, что для эффективного удаления ТМВР_Г,П>ТК клеток введением ОСУ требуется не менее 24-48 часов, что вполне достаточно для активации резидентных клеток ЦНС клетками «пионерами». Таким образом, к началу второй волны экспансии ЭГ Т-клеток в ЦНС создается ситуация, при которой уровень перестроек в ЦНС, сформированный клетками «пионерами», соответствует введенному количеству ЭГ Т-клеток (6x106 ЭГ Т клеток = 3x10б ТМвр-оррТК+ + 3x106 Тмвр.р^р клеток), в то время как количество ЭГ Т-клеток на периферии, к этому времени, сокращается вдвое, вследствии гибели «зеленой» популяции Тмшмнр'ГК.! клеток. Образовавшийся дисбаланс между изменениями, сформированными клетками «пионерами» в ЦНС, и количеством клеток во второй волне миграции позволяет «красным» Тибр-ют клеткам занимать места удаленных «зеленых» ТМВр_0ррТК' клеток. Таким образом, нам удалось описать феномен, подтверждающий важную роль клеток «пионеров» обеспечивающих базис для второй волны экспансии ЭГ Т-клеток в миграционным фенотипом в ЦНС в патогенезе ЭАЭ (Носов М.А. и др. 2010).

Способы гибели лимфоцитов в системе ШУ-ТК/вСУ.

Индукция гибели клеток, экспрессирующих НБУ-ТК после обработки ОСУ происходит, главным образом, вследствии блокирования репликации в процессе деления клеток, и, следовательно, должна иметь место в культуре активно делящихся, рролиферирующих клеток. Восприимчивость медленно пролиферирующих Тмвр-огр ТК+ клеток к обработке ОСУ определило необходимость изучения путей гибели лимфоцитов (Рис. 12).

g | 1,6

1 MBP-GFP

• MBP-GFP

лк

24 48 72 96 Время инкубации в часах

24 48 72 96

Время инкубации в часах

Рисунок 12. Специфическое удаление TMbp-gfpTK+ клеток после обработки ганцикловиром in vitro.

Специфическое удаление бластных TMBP.GFPTK+ (А) и покоящихся ТМвр-СТРТК+ (Б) клеток после инкубации с GCV (1 мкМ/мл). *:р<0.001 относительно к количеству TMbp-gfp клеток.

Несмотря на то, что СИКС на основе НБУ-ТК/ОСУ получило широкое распространение как в экспериментальной так и в клинической практике, механизм цитотоксичности ОСУ, опосредованный ШУ-ТК, изучен далеко не исчерпывающе. Типичные морфологические изменения и фрагментация ДНК, индуцированные вСУ в ТМВР.0рр ТК+ клетках свидетельствуют об

апоптотическом пути клеточной гибели. В данном случае важно упомянуть, что токсический эффект ОСУ высоко специфичен. Количество Тмвр.Срр клеток в культуре при обработке ОСУ не сокращалось, и эти клетки не проявляли никаких признаков апоптоза, хотя оставались восприимчивы в стауроспорину, как и Тмвр-орр ТК+ клетки.

Лимфоциты Бласты Покоящиеся

ТК+ М

+ -

- - +

Ртк+

actin

р53

р21

PUMA

Вах

клеток,

- GCV 6h

GCV 20h + Dox

вызванный

Рисунок 13. Апоптоз Тм: ганцикловиром.

(А) Фрагментация хромосомальной ДНК в TMbp-gfpTK+ (ТК+) (5-8) и Tmbp-gpp (ТК-)(1-4) клетках. Фрагментация геномной ДНК из необработанных клеточных линий (1 и 5), после 6 часов инкубации со стауроспорином (2 и 6), после 6- ти часов (3 и 7) или 24-х часов (4 и 8) инкубации в присутствии GCV. М: маркеры молекулярного веса. Представлены результаты одного из трех независимых экспериментов.

(Б) Результаты Вестерн Блот анализа белков р53, р21, Puma и ВАХ в Tmbp-gfpTK+ бласт-лимфоцитах и TMBp.gfpTK+ покоящихся лимфоцитах после 6 -ти и 20-ти часов инкубации с GCV. В качестве позитивного контроля индукции апоптоза использовали инкубацию с доксирубицином (Doxorubicin - Dox) в концентрации 0,2 мкг/мл в течение 24 часов. Бета- актин использовали как контроль загрузки геля.

Ранее было показано, что р53 и Вс12 пути апоптоза могут быть вовлечены в обеспечение клеточной гибели, индуцированной HSV-TK/GCV (Huang, Xia et al. ; van Dillen, Mulder et al. 2005). Следует заметить, что пути апоптоза могут значительно варьировать в зависимости от типа клеток, а возможно и от вида и линии животных. Полученные нами результаты подтверждают вовлечение р53 в механизмы гибели TMbp-gfp ТК+ клеток, индуцированной GCV, так же как и вовлечение Вах и PUMA в этот процесс (Рис. 13). Активация белка Puma характерна для покоящихся Т-клеток, а р21 -для бластных, активно пролиферирующих клеток. CD95 вовлечен в механизмы гибели клеток нейробластомы человека, спровоцированной

системой HSV-TK/GCV, через р53 опосредованную аккумуляцию CD95 и образование сигнального комплекса с последующей активацией каскада каспаз (Glaser, Castro et al. 2001). Сигнальный каскад, запускаемый Fas-рецептром (CD95), как известно, играет важную роль в контроле выживания Т-клеток, и возможно, вовлечен в апоптоз Tmbp-gfp ТК+ клеток, индуцированный GCV, хотя отсутствие активации каспазы 3 у TMbp-gfp ТК+ клеток после обработки GCV не укладывается в данную схему (Рис. 14). Цитотоксический эффект GCV на покоящиеся ЭГ Т-клетки может быть объяснен продолжающимся процессом репарации, который требует синтеза ДНК de novo в ЭГ Т-клетках и при котором GCV-трифосфат может встраиваться в ДНК и запускать программированную клеточную гибель. На возможность данного сценария указывает накопление р53 в покоящихся ТМВр. GFpTK+ клетках.

А Б

§8000

О 7000

.5 5000

«3000

0) W

га о.

1000

2 4 6 8 12 время (ч) ❖ Контроль« puro Д GCV

о 8000

о 7000 "га

¿5000

„3000. я 1000

rfMo»0'

.ичр*^

! 4 6 8 12 время (ч) ❖ Контроль« puro д GCV

Рисунок 14. Активность каспазы 3 в ТМвр-с,крТК+ лимфоцитах (А) и в экспрессирующих тимидин киназу вируса простого герпеса фибробластах (Б).

В эксперименте был использован флуоресцентный субстрат каспазы 3 -Ас-БЕУО-АМС после инкубации клеток с физ. р-ром (ромбики), пуромицином (квадратики) или с йСУ (треугольники). Длительность наблюдения -12 часов.

Суммируя результаты по изучению пути развития апоптоза, индуцированного GCV, можно выделить 2 основных сценария, характерных для бластных и покоящихся лимфоцитов. Активация р53 пути в бласт -лимфоцитах ведет к блокированию клеточной пролиферации через активацию ингибитора циклин-зависимых киназ с последующей активацией белка Вах, в то время как апоптоз у покоящихся лимфоцитов преимущественно затрагивает активацию Puma. Эти процессы лежат в основе механизмов гибели лимфоцитов, индуцированной с помощью СИКС.

Неинвазивное сканирование.

Способность клеток, экспрессирующих HSVl-tk, специфически аккумулировать радиоактивно меченные аналоги ГЦВ позволяет отслеживать их локализацию и миграцию in vivo с помощью гамма-камеры или позитрон -эмиссионной томографии (ПЭТ) (Tjuvajev, Stockhammer et al. 1995; Tjuvajev, Finn et al. 1996; Larson, Tjuvajev et al. 1997; Tjuvajev, Avril et al. 1998). В данной работе сравнили две системы визуализации Т-клеток in vivo при помощи гамма-камеры, основанные на экспрессии HSVl-tk или гена, кодирующего белок - переносчик норепинефрина/норадреналина (hNET) (Doubrovin, Doubrovina et al. 2007).

A) Б)

MBP-GFP

В)

Рисунок 15. Результаты гамма сканирования животных спустя 2 часа после введения (123I|FIAU (250 Ц.О), осуществленного через один (А) или три (Б) дня после адоптивного переноса Тмвр.сгр или TMBP.GFP ТК клеток и 2 часа после введения [123I]MIBG (250 цСЛ) осуществленного на третий день после адоптивного переноса TMbp-gfp hNET или TMbp-gfp ТК клеток (В). Стрелками показана область локализации селезенки, линиями -мочевого пузыря и щитовидной железы.

Сканирование в гамма камере не выявило специфической локализации Т-клеток через 2 часа после введения радиоактивного трейсера, а через 20 часов, позволило обнаружить аккумулированную клетками радиоактивность в селезенке, как в случае введения Tmbp-gfp ТК, так и при введении TMBp-gfp hNET клеток (Рис. 15).

Цитотоксический эффект радиоактивно меченных аналогов GCV на ЭГ Т-клетки

В процессе определения локализации ЭГ Т-клеток при развитии ЭАЭ с помощью гамма-сканирования, нами обнаружен токсический эффект аккумуляции радиоактивно меченных аналогов GCV на ЭГ T-клетки, что представляется особенно важно всвязи с использованием данного метода не только в экспериментальной, но и в клинической практике. Известно, [123I]FIAU имеет большее сродство к HSVl-tk, чем [18F]FHBG, который, в свою очередь, является субстратом для мутированной тимидин киназы HS VI-sr39tk (Alauddin and Conti 1998; Gambhir, Bauer et al. 2000). В соответствии с этим, используемые нами лимфоциты накапливали преимущественно [123I]FIAU, поскольку экспрессировали HSVl-tk дикого типа, и именно [l23I]FIAU имел выраженное супрессивное влияние на интенсивность процесса пролиферации лимфоцитов в ответ на присутствие антигена (Рис. 16).

а) б)

1.4

I g «S ШШ Ь 12.! !-! Г", ^ I""*»

j]J 1 I | i I [1 ......,

ЩI...............— I I1LIs I ..LI

Контроль i-FiAU "F-FHBG 0 Ята шс^

Рисунок 16. Действие накопленного клетками радиоактивного субстрата на их функциональную активность in vitro.

(А) Блокирование пролиферации TMbp_gfp ТК клеток специфическим субстратом тимидин киназы in vitro. По оси абсцисс - отношение количества Tmbp-gfp к Tmbp-gfp ТК клеток, инкубированных один час в присутствии [123I]FIAU или [18F]FHBG, рестимулированных и подсчитанных на второй день после стимуляции специфическим антигеном.

(Б) Дозозависимое изменение количества 1 mbp-gfp или 1 mbp-gfp ТК клеток, инкубированных в отсутствии или с 0,25; 2,5 или 25 nCi [ I]F1AU. *р<0.05 по отношению к количеству клеток в контроле.

Справедливо заключить, что специфическое накопление радиоактивного субстрата в клетке, а не присутствие радиоактивности в культуральной среде, ведет к повреждающему эффекту. Следует заметить, что проявляющаяся токсичность [,23I]FIAU по отношению к TMbp-gfpTK+ может быть объяснена непосредственным повреждающем действием присутствующего в ядре изотопа, а не блокированием транскрипции вследствие встраивания трифосфата FIAU во вновь синтезирующуюся цепь ДНК, как это происходит в случае обработки GCV, поскольку концентрация химической составляющей FIAU в десятки раз ниже требуемой для проявления токсического эффекта.

В работах Zanzonico и Koehne экспрессия HSVl-tk в лимфоцитах, сенсибилизированных к антигенам Эпштейн-Бар-ассоциированной лимфомы, применялась для выявления их локализации при клеточной терапии с использованием введения радиоактивно меченых аналогов тимидина - 2'-fluoro-2'-deoxy-l-p-D-arabinofuransyl-5-iodo-uracil (FIAU)-[13II]FIAU и [124I]FIAU с последующей детекцией гамма камерой или ПЭТ (Koehne, Doubrovin et al. 2003; Zanzonico, Koehne et al. 2006).

12 3 4

Время после даедени* T клеток (дня)

12 3 4

Время после введения Т кяегок (дни)

в>

Контроль ГЦВ

12 3 4

Время после введения Т клеток (дни)

Рисунок 17. Функциональная активность энцефалитогенных Т -клеток in vivo при накоплении ими радиоактивного субстрата.

Клинические симптомы развития ЭАЭ (показаны столбцами) и динамики изменения веса животных (показаны линиями), при: А - адоптивном переносе TMBp.GFp введении физиологического раствора или [123I]FIAU (250 ¿iCi). Б - адоптивном переносе Tmbp-gfp ТК, введении физиологического раствора или [123I]FIAU (250 |J.Ci). В - при ежедневном введении GCV (20мг/кг) или физиологического раствора. *р<0.01 по сравнению с соответствующими показателями у контрольных животных.

Специфическое накопление радиоактивных субстратов лимфоцитами, продуцирующими HSVl-tk, не вело к снижению цитотоксичности иммуноцитов по отношению к клеткам лимфомы, вызванной вирусом Эпштейн-Бара, то есть не влияло на функциональную активность Т-клеток.

С другой стороны, полученные нами результаты подтверждают существование токсического действия радиоактивно меченых аналогов GCV на HSVl-tk продуцирующие Т-лимфоциты. Кроме того, удалось обнаружить дозозависимое токсическое действие радиоактивно меченого аналога ГЦВ -[123I]FIAU на лимфоциты, экспрессирующие HSVl-tk in vitro и значительную потерю функциональной активности Т-клеток in vivo. По-видимому дело в том, что в экспериментах Koehne изучали изменение цитотоксической активности Т-клеток, сенсибилизированных к антигенам Эпштейн-Бар-ассоциированной лимфомы, после коинкубации их с радиоактивным субстратом (Koehne, Doubrovin et al. 2003). В настоящей работе показано ингибирование пролиферативной активности TMbp-gfp ТК клеток в ответ на действие антигена. Введение радиоактивного субстрата так же приводило к значительному ослаблению клинических проявлений. У животных, получивших инъекцию TMbp-gfp ТК и [123I]FIAU, наблюдалось лишь незначительное ослабление тонуса хвоста. У крыс контрольных групп, которые получили инъекции только TMBp-gfpTK+ или TMbp-gfp в комбинации с [123I]FIAU, развивается тетрапорез, что соответствует 4му уровню клинических проявлений (Рис. 17). Значительное ослабление тяжести заболевания при введении Tmbp-gfpTK+ и [123I]FIAU может быть объяснено ингибирующим эффектом радиоактивного субстрата на пролиферацию ТМвр-gfpTK+клеток, что соответствует результатам, полученным in vitro.

Поскольку радиоактивно меченные субстраты к HSV1-TK широко используются в экспериментах и клинике для неинвазивного контроля за вводимыми лимфоцитами при клеточной терапии, представленные данные необходимо учитывать, т.к. такие приемы анализа могут приводить как к ослаблению, так и к изменению функциональной активности этих клеток и соответственно к снижению эффективности терапии или риску развития побочных эффектов.

Заключение

Современные представления о патогенезе рассеянного склероза базируются на обширном материале, накопленном в ходе клинических и лабораторных исследований, и позволяют определить его как аутоиммунное нейродегенеративное заболевание, провоцируемое энцефалитогенными CD4+ лимфоцитами, несущими Т-клеточный рецептор, специфичный к антигенам ЦНС. В связи с важной ролью ЭГ Т-клеток в развитии PC, их изучению уделяется пристальное внимание, что становиться возможным при использовании модели PC - адоптивного переносного экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита.

В работе изучено поведение и роль ЭГ Т-клеток на различных этапах развития апЭАЭ и обсуждаются механизмы, обеспечивающие ЭГ Т-клеткам возможность их проникновения в ЦНС инициации развития патологического процесса. Полученные данные подтверждают высокую вероятность двухэтапной миграции ЭГ Т-клеток в ЦНС и описывают механизмы формирования «миграционного фенотипа», что предоставляет потенциальную возможность для поиска путей коррекции этого процесса. Впервые подробно описаны пути апоптотической гибели лимфоцитов в системе индуцированного клеточного самоубийства (HSV-TK/GCV) и обнаружен токсический эффект радиоактивных аналогов GCV, угнетающих функциональную активность Т-лимфоцитов, что существенно и следует учитывать при применении данного метода в клинике.

Исследование проводилось в рамках отдельных научных проектов поддерживалось грантами Немецкого научного фонда (SFB455) и Фонда Hertie (1.01.1/04/010 и 1.01.1/07/005).

Автор выражает благодарность профессору Alexander Flügel (University Medical Center Gottingen and The Hertie Foundation, Gottingen) профессору Татьяне Борисовне Казаковой, профессору Hartmut Wekerle (Max-Planck Institute for Neurobiology, Munich), к.м.н. Ю.В. Гаврилову, докторам Thomas Ritter, Dmitry Lodygin, Francesca Odoardi и Naoto Kawakami за помощь в сборе материала для исследований.

ВЫВОДЫ

1. На преклинической стадии развития адоптивного переносного экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, инициированного в/в или в/б введением 5 миллионов Т-клеток (Thl), сенсибилизированных к основному белку миелина, аккумуляция энцефалитогенных Т-клеток (ЭГ Т-клеток) наблюдается в селезенке через 72 часа после их введения, после чего количество их в селезенке резко снижается и увеличивается в ЦНС.

2. ЭГ Т-клетки, сортированные из селезенки через 72 часа после введения, активно мигрируют через экстраклеточный матрикс в экспериментах in vitro в отличие от этих же клеток, сортированных из культуры in vitro непосредственно перед введением животному.

3. ЭГ Т-клетки, полученные из селезенки через 72 часа после их введения, характеризуются функциональными изменениями - снижением экспрессии маркеров активации Т-клеток (IFNy и CD25), активацией экспрессии транскрипционного фактора - Круппел-лайк фактор 2 (KLF2) и Активирующего миграцию рецептора к гиалуронану (RHAMM), участвующих в регуляции подвижности клеток.

4. Добавление в культуральную среду высокомолекулярного гиалуронана - лиганда к RHAMM, и Матригеля активирует подвижность ЭГ Т-клеток in vitro, ингибирует их пролиферацию и активирует экспрессию гена klf2, что характерно для формирования «миграционного фенотипа» ЭГ Т-клеток.

5. Созданы трасгенные линии первичных МВР (основной белок миелина) специфичных Т-клеток, экспрессирующих суицидный (тимидин киназа вируса простого герпеса - HSV1-TK) и маркерный (зеленый флуоресцентный белок — GFP) гены, а также линии клеток, экспрессирующих GFP, RFP или белок - переносчик норэпинефрина (hNAT).

6. Провокация апоптоза энцефалитогенных Т-клеток, продуцирующих HSVl-tk, ганцикловиром (GCV) позволяет специфически удалять ТМвр-oFpTK клетки in vitro (до 90% за 24 часа) и in vivo (>95% после 2х кратной инъекции GCV и > 99% после 4х кратной инъекции GCV).

7. Активация процесса апоптоза, спровоцированная системой HSV1-TK/GCV, вызывает гибель бластных и покоящихся энцефалитогенных лимфоцитов через активацию р53 зависимого пути апоптоза, но протекает без активации каспаз.

8. Удаление энцефалитогенных Т-клеток in vivo на преклиническом этапе апЭАЭ с использованием системы клеточного самоубийства (HSV-TK/GCV) снижает уровень экспрессии IFNy, IL-17 и IL-2R, количество инфильтратов в ЦНС, а также тяжесть клинических симптомов апЭАЭ.

9. Удаление чувствительной к GCV популяции энцефалитогенных клеток (Tmbp-gfpTK) на преклинической стадии апЭАЭ ведет к увеличению инфильтрации ЦНС клетками оставшейся, не чувствительной к GCV, популяции энцефалитогенных Т-клеток (Tmbp-rfp) при их совместном введении.

1 ((.Удаление энцефалитогенных Т-клеток in vivo на клиническом этапе развития апЭАЭ с использованием системы HSV-TK/GCV не влияет на тяжесть протекания апЭАЭ.

11. Специфическое накопление радиоактивно мечешШх аналогов GCV -[123I]FIAU Т-клетками, экспрессирующими HSV-TK, ведет к потере ими пролиферативной и функциональной активности.

12.На преклиническом этапе развития апЭАЭ, вызванного введением ЭГ Т-клеток, сенсибилизированных к основному белку миелина, происходит комплекс функциональных изменений ЭГ Т-клеток, обусловливающих возможность последующего массивного проникновения ЭГ Т-клеток в ЦНС через гематоэнцефалический барьер, развития аутоиммунного воспаления в ЦНС и проявления клинических симптомов заболевания.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, включенных в Перечень ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации:

1. Носов М.А., Флюгель А. В поисках виновного: Анализ миграции энцефалитогенных Т клеток на преклиническом этапе развития адоптивного ЭАЭ при их внутривенном или внутрибрюшинном введении // Российский Физиологический Журнал им. Сеченова. - 2009. -№95.-С. 1416-1426.

2. Носов М.А., Антон М., Вебер В., Барабанова С.В., Векерле X., Корнева Е.А., Флюгель А. Влияние радиоактивно-меченных субстратов к HSV1-ТК, применяемых при неинвазивном сканировании, на функциональную активность антиген сенсибилизированных лимфоцитов // Медицинский академический журнал. - 2010. - Т. 10. - № 1. - С. 24-30.

3. Носов М.А., Флюгель А., Корнева Е.А. Регуляторные феномены, вызванные энцефалитогенными Т-клетками на периферии и в ЦНС в процессе развития адоптивного переносного экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита // Вестник СПбГУ. Сер. 11. - 2010. - № 3. - С. 193-200.

4. Носов М.А., Корнева Е.А. Анализ миграционной активности энцефалитогенных Т-клеток in vitro // Медицинская иммунология. -2010. - Т.12. - № 6. - С. 565-568.

5. Носов М.А., Корнева Е.А. Определение локализации эцефалитогенных Т клеток в курсе пассивного ЭАЭ требует сочетанного использования проточной цитометрии и количественной ПЦР // Цитокины и воспаление. - 2011. - Т. 10. - № 1. - С. 26-31.

6. Odoardi F., Kawakami N., Li Z., Cordiglieri C., Streyl K., Nosov M., Klinkert W. E„ Ellwart J. W„ Bauer J., Lassmann H., Wekerle H., Flugel A. Instant effect of soluble antigen on effector T cells in peripheral immune organs during immunotherapy of autoimmune encephalomyelitis // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 2007. - Vol.104. - P. 920-925.

7. Lyakhovich A., Canals F., Nosov M., Surralles J. A DIGE-based approach to study interacting proteins // J. Biochem. Biophys. Methods. - 2007. - Vol. 70. - P. 693-695.

8. Grundtner R., Dornmair K., Dahm R., Fliigel A., Kawakami N., Zeitelhofer M., КпбЯег M., Nosov M., Selzer E., Willheim M., Kiebler M., Wekerle H., Lassmann H., Bradl M. CNS inflammation in the myelin degenerative central nervous system is triggered by the presence of polyclonal T lymphocyte infiltrates and the local activation of T cells // Neurobiology of Disease. -2007.-Vol. 28.-P. 261-275.

9. Fliigel A, Odoardi F, Nosov M, Kawakami N. Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy // J. Neuroimmunol. - 2007. - Vol. 191. - P. 86-97.

10.Ritter Т., Nosov M., Griffin M. Gene Therapy in Transplantation: Towards Clinical Trials. Opinion in Molecular Therapeutics // Curr. Opin. Mol. Ther. -2009.-Vol. 11.-P. 504-512.

Список статей опубликованных в прочих изданиях

П.Носов М.А., Лодыгин Д.Н., Корнева Е.А. Значение экспериментальных моделей аутоиммунного энцефаломиелита в изучение патогенеза рассеянного склероза // Нейроиммунология. - 2010. - Т. 8. - № 3-4. - С. 413.

12.Nosov М. A., Barabanova S. V., Glushikhina М. S., Kazakova Т. В., Korneva Е. A. Antigen-induced activation of hypothalamic cells (assessed by expression of the c-fos gene) // Neurosci. Behav. Physiol. - 2002. - Vol. 32. -P. 523-528.

13-Носов M.A., Барабанова C.B., Казакова Т.Б., Корнева Е.А. Активация клеток гипоталамуса после антигенного воздействия (по экспрессии гена c-fos) // Российский Физиологический журнал им. Сеченова. - 2001. - № З.-С. 331-340.

14.Корнева Е.А., Казакова Т.Б., Носов М.А. Экспрессия c-fos мРНК и с-Fos-подобных белков в клетках гипоталамических структур при введении антигена // Аллергология и Иммунология. - 2001. - № 1. - С. 37-44.

15.Korneva Е. A., Barabanova S.V., Nosov М. A., Rogers V., Novikova N. S., Kazakova Т. B.Induction of c-fos and interleukin-2 gene expression in the central nervous system following stress stimuli // Pathophysiology. - 2000. -Vol. 7.-P. 53-61.

16.Korneva, E. A., Barabanova S. V., Golovko О. I., Nosov M. A., Novikova N. S., and Kazakova Т. B. C-fos and IL-2 gene expression in rat brain cells and splenic lymphocytes after nonantigenic and antigenic stimuli // Neuroimmunomodulation. - 2000. - Vol. 917. - P. 197-209.

17.Барабанова C.B., Новикова H.C., Носов M.A., Корнева Е.А., Казакова Т.Б. Влияние стресса на экспрессию генов c-fos и ИЛ-2 в клетках нервной и иммунной систем // Нейрохимия. - 1998. - Т. 15. - № 4. - С. 380-387.

18.Гришина Т.В., Мюльберг А.А., Головко О.И., Новикова Н.С., Носов М.А., Овчинникова Т.В., Потапенко Н.А., Корнева Е.А., Казакова Т.Б. Физико-химическая характеристика ядерных белков из клеток ткани головного мозга и селезенки крыс,регулирующих экспрессию гена интерлейкина-2 // Нейрохимия. - 1996. - Т. 13. - С. 90-97.

19.Головко О.И., Гришина Т.В., Новикова Н.С, Носов М.А., Мюльберг А.А., Корнева Е.А., Казакова Т.Б. Регуляция экспрессии гена ИЛ-2 ядерными белками из мозга крыс в Т лимфоцитах в норме и после иммуносупрессии // Нейрохимия. - 1996. - Т. 13. - № 3. - С. 195-205.

20.Kazakova Т.В., Golovko O.I., Barabanova S.V., Nosov M.A., Novikova N.S., Korneva E.A. The interleukin-2 and c-fos genes expression in the rat nervous cells after mustard oil injection. // Immunol. Letters. - 1997. - Vol. 56. - № 45. - P. 322-333.

Список тезисов

21.Носов M.A., Глушихина М.С. Экспрессия c-fos мРНК в структурах гипоталамуса крыс после антигенного воздействия: Тезисы конференции к 110-летию НИИЭМ РАМН / - Л. - 2000. - С. 125.

22.Kazakova Т., Barabanova S., Nosov М., Golovko О., Novikova N. The IL-2 and c-fos gene expression in the rat nervous cells after mustard oil injection: European Immunology Meeting / Immunology letters. - Amsterdam, - 1997. -Vol.56. - №4.-P. 242.

23.Kazakova Т., Golovko O., Barabanova S., Nosov M„ Novikova N. Stress induced changes in interleukin-2 gene expression in mice T-cells: European Immunology Meeting / Immunology letters. - Amsterdam, - 1997. - Vol. 56. - № 4. - P. 472.

24.Nosov M., Golovko O., Novikova N. c-fos gene expression in the rats brain after different stressful stimuli: III international congress of Pathophysiology / J. Pathophysiology. - Lahti, Finland. - 1998. - Vol. 5. Suppl. 1. - P. 147.

25.Golovko O., Barabanova S., Nosov M., Novikova N. Interleukin-2 and c-fos gene expression in murine T-lymphocytes in normal and stressful conditions: III international congress of Pathophysiology / J. Pathophysiology. - Lahti, Finland. - 1998. - Vol. 5. Suppl. 1. - P. 151.

26.Nosov M., Barabanova S., Golovko O., Novikova N. Expression of Interleukin-2 gene expression in rat brain in normal and stress condition: III international congress of Pathophysiology / J. Pathophysiology. - Lahti, Finland. - 1998. - Vol. 5. Suppl. 1. - P. 147.

27.Kazakova T., Nosov M., Grishina T., Novikova N. The effects of IL-2 trans-factors from spleen and brain on IL-2 mRNA expression in T-cells under stressful conditions: Abstracts of the 21-th European Conference on psychosomatic Research / - Bordeaux, France. - 1996. - P. 76.

28.Nosov M. A., Barabanova S.V., Golovko O. I. IL-ip- Induced Production of IL-2 Protein in Murine Brain: The 4th International Congress of the International Society for Neuroimmunomodulation / Neuroimmunomodulation. - 1999. - Vol. 6. - P. 435.

29.Nosov M., Gluschihina M., Korneva E. C-fos and IL-2 gene expression in hypothalamic structures after antigene injection: NOS-M seminar. Integrative Biology / Soria Moria Conference Center. - Oslo. - 2001. - P. 35.

30.Kazakova T.B., Barabanova S.V., Glushikhina M.S., Nosov M.A., Parkhomenko E.P., Korneva E.A. The brain cells activation in early period after anigenic stimuli application: Int.Congress "Allergy, Immunology and Global Network:insight into new millenium"/ - NY, USA. - 2001. - P. 142.

31 .Kazakova T.B., Golovko O.I., Nosov M.A., Parkhomenko E.P., Glushikhina M.C. Interleukin-2 gene expression in murine lymphocytes after strucanalogs of thymic and hypothalamic peptides application: 2nd European Congress on Biogerontology / - Gerontology. - St. Petersburg, Russia. - 2000. - № 5. - P. 158.

32.0doardi F., Kawakami N., Nosov M., Wekerle H., Flugel A.. Real time immaging of effector cell activation within autoimmune CNS lessions after soluble antigen treatment: International Symposium "Interaction of the

nervous and immune system in health and disease"/ - St. Petersburg, Russia. -2007. - P. 272.

33.Nosov M., Streyl K., Ulaganathan V.K., Wekerle H., Flugel A. Peripheral milieus license autoaggressive effector T cells to invade their target organ: 38th Annual Meeting of the German society of Immunology (DGfi) / -Heildelberg, Germany. - 2008. - P. 172.

34.Ritter T., Wilk M., Gong N.. Pleyer U., Nosov M. Immune response to gene therapy vectors in the context of cornea transplantation: European association of Vision and Eye Research (EVER) / - Slovenia. - 2009. - P. 23.

35.Nosov M, Wekerle H., Flugel A. Targeted killing of autoreactive CD4+ effector T cells reveals their importance for the induction and maintenance of acute autoimmune CNS disease: Meeting of the Irish society of Immunology (ISI) / - Dublin, Ireland. - 2008. - P. 64.

36.Ritter T., Treacy O., Heinzl T., Nosov M. Analysis of the TLR and chemokine/receptor mRNA expression profile of mesenchymal stem cells after genetic modification with recombinant adenovirus: Meeting of the Irish society of Immunology (ISI) / - Dublin, Ireland. - 2009. - P. 26.

37.Nosov M, Flugel A., Wekerle H. The seed of death: Introduction of suicide genes into autoimmune effector T cells: Meeting of Irish Society for Gene & Cell Therapy and International Society for Cell & Gene Therapy of Cancer (ISGCT and ISCGTC) / - Cork, Ireland. - 2008. - P. 72.

38.Nosov M. O'flynn L., Anegon I., Ritter T. Regulation of T cells associated immune response in cornea transplantation and autoimmunity by adenovirus-mediated gene therapy: Ilnd International Symposium "Interaction of the nervous and immune system in health and disease / - St. Petersburg, Russia. -2009.-P. 149.

Список сокращений

АСТН адренокортикотропный гормон

CFA полный адъювант Фройнда

CREB cyclic-AMP-response element (CRE)-binding protein

CRH кортикотропин рилизинг гормон

DA Dark Agouti

GC глкжокортикоиды

GCV ганцикловир

GFP зеленый флуоресцентный белок

HA гиалуронан

HSV-TK тимидин киназа вируса простого герпеса I типа - HSV-

Ig иммуноглобулин

IL интерлейкин

IRF5 интерферон-регулирующий фактор 5

KLF2 круппел-лайк фактор 2

MBP основной белок миелина

мне главный комплекс гистосовместимости

MOG гликопротеин миелина олигодендроцитов

PLP протеолипидный протеин

RFP красный флуоресцентный белок

RHAMM - активирующий миграцию рецептор к гиалуронану

TCR рецептор Т-лимфоцитов

TNF фактор некроза опухолей

AchR ацетилхолин

апЭАЭ адоптивный переносной экспериментальный

аутоиммунный энцефаломиелит

ГТАС гипоталамо-гипофизарно-адреналовая система

ГЭБ гематоэнцефалический барьер

ИС иммунная система

НС нервная система

ПЦР полимеразная цепная реакция

PC рассеянный склероз

ЦНС центральная нервная система

ЭАЭ экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит

ЭГ Т- - энцефалитогенные Т-клетки

клетки

Отпечатано в ООО "АРКУШ", Санкт-Петербург, ул. Рубинштейна, д.2/45 ИНН 78254429721 КПП 78501001 Подписано в печать 15.12.2010 г. усл. печ. л. 2.0 заказ № 1512/1 от 15.12.2010 г., тир. 100 экз.

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Энцефалитогенные T-клетки в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита

Автореферат диссертации по медицине на тему Энцефалитогенные T-клетки в развитии экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита

Похожие научные работы

Каталог диссертаций