Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Роль оксида азота в регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток
- Ученая степень
- кандидата медицинских наук
- ВАК РФ
- 14.00.14
Оглавление диссертации Какурина, Гелена Валерьевна :: 2004 :: Томск
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. Обзор литературы.
1.1 Особенности регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток.
1.1.1 Структура ДНК опухолевых клеток.
1.1.2. Особенности регуляции клеточного цикла опухолевых клеток.
1.1.3. Характерные особенности апоптоза опухолевых клеток.
1.2. Роль оксида азота в регуляции пролиферации и апоптоза.
1.2.1. Структура, физиологическая роль оксида азота.
1.2.2. Влияние оксида азота на пролиферативные процессы.
1.2.3. Влияние оксида азота на индукцию апоптоза в клетках.
1.3. Влияние оксида азота на эффективность противоопухолевой химиотерапии и фотодинамической терапии.
1.3.1 Свободно-радикальные механизмы противоопухолевого действия химиотерапевтических препаратов и лазерного излучения.
1.3.2. Сочетанное действие оксида азота и свободно-радикальных агентов на пролиферацию и индукцию апоптоза опухолевых клеток.34.
1.3.3. Влияние оксида азота на терапевтическую эффективность доксорубицина.
1.3.4. Перспективы совместного использования фотодинамической терапии и доноров оксида азота в онкологии.
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования.
2.1. Материалы и объекты исследования.
2.2. Методы исследования.
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Исследование влияния оксида азота на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток.
3.1.1.Влияние оксида азота на синтез ДНК в опухолевых клетках.
3.1.2. Индукция апоптоза опухолевых клеток оксидом азота.
3.2. Исследование влияния оксида азота на механизмы регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток.
3.2.1. Влияние оксида азота на метаболизм арахидонат-содержащих фосфолипидов мембран опухолевых клеток.
3.2.2. Влияние оксида азота на функциональное состояние митохондрий опухолевых клеток.
3.2.3. Влияние оксида азота на интенсивность свободно-радикальных процессов в опухолевых клетках.
3.3. Сравнительная оценка влияния оксида азота, пероксидных радикалов и их комбинации на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток.
З.ЗЛ.Влияние активированных кислородных метаболитов на пролиферативную активность опухолевых клеток.
3.3.2. Сочетанное действие оксида азота и свободно-радикальных агентов на пролиферацию опухолевых клеток.
3.3.3. Роль оксида азота в регуляции индукции апоптоза опухолевых клеток, инициированного свободными радикалами.
3.4. Модулирующее действие оксида азота на противоопухолевую активность доксорубицина и фотодинамической терапии.
3.4.1. Сочетанное действие оксида азота и доксорубицина на пролиферацию опухолевых клеток in vitro.
3.4.2. Действие оксида азота на апоптоз, индуцированный доксорубицином in vitro.
3.4.3. Модулирующее действие оксида азота на противоопухолевую активность доксорубицина in vivo.
3.4.4. Модуляция ФДТ оксидом азота.
Введение диссертации по теме "Онкология", Какурина, Гелена Валерьевна, автореферат
б Одним из наиболее важных направлений биомедицинских исследований является выяснение молекулярных механизмов, регулирующих пролиферацию и апоптоз клеток млекопитающих. Регуляция пролиферации и программы апоптоза включает множество различных генетических и патофизиологических факторов, которые пока еще изучены недостаточно.Однако нарушение этих процессов ведет к усилению скорости клеточного роста и снижению дифференцировки, характерному для опухолевых клеток.Злокачественная опухоль представляет собой систему клеток, в которых некоторое их число обладает способностью к перманентной пролиферации и самообновлению. Клоны таких раковых клеток в пределах одной и той же опухоли различаются между собой по степени злокачественности, способности к метастазированию, чувствительности к противоопухолевым препаратам. В основе межклональных различий лежат наследственные изменения, происходящие в опухолевых клетках с очень высокой частотой [3]. Амплификация генов клеточной пролиферации и способность к ауторегуляции обеспечивает преимущество выживания для трансформированных клеток.Известно, что опухолевые клетки обладают повышенной пролиферативной активностью и утрачивают способность к полной дифференцировке и апоптотической гибели [31]. Последнее происходит, вероятно, благодаря генетическим изменениям, происходящим во время онкогенеза. В результате этого нарушаются клеточные механизмы запуска и активации апоптоза, что приводит к снижению способности трансформированных клеток активировать программу клеточной смерти и определяет прогрессирование опухолевого заболевания, а также может являться одной из причин множественной лекарственной резистентности [21, 30].Одной из существенных проблем в терапии рака является развитие резистентности опухолевых клеток к химио- и лучевой- терапии, механизм действия которых имеет в своей основе свободно-радикальные процессы.Известно, что применение антибиотиков антрациклинового ряда и ФДТ сопровождается образованием супероксидного радикала, синглетного кислорода и других высокоактивных молекул. Появление устойчивых к окислительному повреждению опухолевых клеток представляет собой сложный биологический процесс, зависящий от совокупности биохимических и физиологических свойств клеток неоплазмы. Поэтому подбор химиопрепаратов способных усиливать окислительное повреждение и индуцировать апоптоз опухолевых клеток представляет собой важное направление в лечении онкозаболеваний.Некоторыми авторами в качестве одного из возможных способов усиления интенсивности свободно-радикального воздействия было предложено использование его в сочетании с соединениями, генерирующими оксид азота (N0). Оксид азота обладает широким спектром биологического действия как на системном, так и на клеточном уровнях. Исследования последних лет показали, что оксид азота участвует в регуляции пролиферации различных клеток, в том числе и опухолевых [34, 56].Соединения, генерирующие оксид азота или ферменты, участвующие в его синтезе (NO-синтазы), ингибируют пролиферацию клеток и индуцируют апоптоз [57, 63]. Механизм антипролиферативного действия оксида азота мало изучен. Снижение пролиферативного потенциала клеток под влиянием оксида азота, возможно, связано с его способностью инактивировать действие железосодержащих ферментов, участвующих в синтезе АТФ и репликации ДНК [19].Считается, что оксид азота может усиливать цитотоксичность свободных радикалов, причем NO-генерирующие соединения, вступая в реакцию свободно-радикального окисления, могут образовывать еще более цитотоксическое соединение - пероксинитрит. Пероксинитрит, один из самых мощных оксидантов, может повреждать ДНК и вызывать ковалентные модификации белков в клетке, инициируя тем самым апоптоз [8, 86].В то же время существуют противоположные литературные данные об эффекте увеличения клеточной пролиферации оксидом азота. Так, оксид азота усиливает пролиферацию нормальных и стареющих человеческих фибробластов [56]. Увеличение продукции оксида азота может приводить к ингибированию апоптоза [104] и усилению жизнеспособности клеток лимфомы Nb2 [49, 114]. Эти эффекты, вероятно, связаны с антиоксидантными свойствами оксида азота, которые обусловлены его способностью связываться с мембранными и внутриклеточными комплексами железа, ингибировать разложение перекисей, перехватывать свободные радикалы и гасить цепные реакции свободно-радикального окисления [19, 78, 80]. Кроме этого, оксид азота может активировать внутриклеточные процессы, в ходе которых ферменты из малоактивной растворимой формы переходят в более активную мембраносвязанную [9].Таким образом, существование противоречивых литературных данных о механизме действия оксида азота на функциональное состояние опухолевых клеток и отсутствие конкретных результатов применения оксида азота в качестве модулятора опухолетоксического действия свободнорадикальных агентов и терапевтических средств затрудняет его оценку в плане перспективного использования в онкологии.Целью настоящей работы являлось изучение роли оксида азота в регуляции пролиферативной активности и апоптоза опухолевых клеток.Задачи исследования: 1. Исследовать влияние доноров оксида азота в различных концентрациях на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток.2. Изучить влияние доноров оксида азота на интенсивность свободнорадикальных процессов, метаболизм фосфолипидов мембран, функциональное состояние митохондрий опухолевых клеток.3. Изучить сочетанное действие доноров оксида азота и пероксидных радикалов на пролиферативную активность опухолевых клеток 4. Изучить роль доноров оксида азота в регуляции апоптоза опухолевых клеток, индуцированного свободными радикалами.5. Оценить влияние доноров оксида азота на опухолетоксическое действие доксорубицина in vitro.6. Оценить возможность применения доноров оксида азота для усиления терапевтической эффективности антибиотиков антрациклинового ряда и фотодинамической терапии.Научная новизна.Впервые в эксперименте изучено действие широкого спектра концентраций доноров оксида азота на пролиферативную активность опухолевых клеток.Впервые дана оценка интенсивности свободно-радикальных процессов под влиянием оксида азота в опухолевых клетках. Впервые изучена возможность использования доноров оксида азота для усиления опухолетоксического действия свободных радикалов и увеличения противоопухолевой эффективности антибиотиков антрациклинового ряда и фотодинамической терапии.Теоретическая и практическая значимость Теоретическую и практическую значимость проведенной работы определяют новые данные о механизмах регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток соединениями, генерирующими оксид азота, а также новые сведения о механизмах формирования резистентности опухолевых клеток к свободнорадикальному повреждению. Полученные данные позволяют оценить принципиальную возможность использования соединений генерирующих оксид азота в качестве модуляторов свободно-радикального воздействия на опухолевые клетки. Показана целесообразность и обоснованность применения доноров оксида азота для усиления терапевтической эффективности доксорубицина и фотодинамической терапии.Основные положения, выносимые на защиту.1. Доноры оксида азота регулируют пролиферативную активность и апоптоз опухолевых клеток, причем существует концентрационная зависимость влияния на эти процессы.2. Влияние доноров оксида азота на опухолетоксическое действие пероксидных радикалов и доксорубицина неоднозначно и зависит от химической структуры и концентрации используемых соединений.3. При сочетанием применении фотодинамической терапии с использованием лазера на парах золота и доноров NO усиливается апоптоз опухолевых клеток.Публикации Результаты исследований опубликованы в 21 печатной работе.Апробация работы Основные результаты работы представлены: на конференциях молодых ученых НИИ Онкологии ТНЦ СО РАМН (Томск, 1999-2001гг); на молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины», (Новосибирск, 2000г.); на международном конгрессе «Научная молодежь на пороге XXI века» (Томск, 2000г); 7th ESACP Congress «Analitical and cellular pathology» (Paris, 200 lr); 7th International Conferrence "Eicosanoids and other bioactive lipids in cancer, inflammation and related diseases" (Nashville, USA, 200 lr); на VI Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2002г); на VI международном конгрессе «Импульсные лазеры на переходах атомов и молекул» (Томск, 2003); на молодежной научно-технической конференции «Лазеры на парах металлов и их применение» (Томск, 2003 г.).Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 136 страницах и иллюстрирована 23 рисунками и 10 таблицами. Библиография включает 164 литературных источников, из которых 32 отечественных и 132 иностранных.
Заключение диссертационного исследования на тему "Роль оксида азота в регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток"
ВЫВОДЫ
1. Установлена концентрационная зависимость действия доноров оксида азота на пролиферацию и апоптоз клеток мастоцитомы Р-815 и асцитной карциномы Эрлиха. Стимуляция пролиферации наблюдалась при воздействии на клетки низких концентраций доноров оксида азота (10"5М и менее). Антипролиферативный эффект и индукция апоптоза достигались высокими дозами (10"3М).
2. Доноры оксида азота в низких концентрациях усиливают функциональную активность митохондрий, стимулируют образование свободных радикалов в физиологических пределах и повышают выход арахидоновой кислоты из мембран, не влияя на ее включение. И, наоборот, в высоких концентрациях они угнетают митоходриальное дыхание, ингибируют включение арахидоновой кислоты и активируют ее выход.
3. Комбинация доноров оксида азота и окислителей (ГПТБ, АБАП) в нетоксичных концентрациях приводила к стимуляции пролиферации опухолевых клеток по сравнению с контролем, а в опухолетоксичных дозах - к снижению их повреждающего действия на синтез ДНК.
4. Влияние оксида азота на индукцию апоптоза свободными радикалами в опухолевых клетках неоднозначно и зависит от концентрации и химической структуры используемых соединений.
5. В экспериментах in vitro сочетанное использование доксорубицина и
4 Г доноров оксида азота в концентрациях 10 -10" М увеличивало пролиферативную активность опухолевых клеток и ингибировало индукцию апоптоза. Высокие дозы нитрита натрия и нитропруссида натрия
3 4
10" М) и нитрозогуанидин (10" М) усиливали опухолетоксическое действие доксорубицина.
6. Донор оксида азота - нитрозогуанидин повышал терапевтическую эффективность доксорубицина, что выражалось в уменьшении объема асцита. Противоопухолевый эффект сочетанного воздействия сопровождался усилением индукции апоптоза опухолевых клеток в 5,4 раза и некроза в 1,6 раза, по сравнению с группой животных, получавших только доксорубицин.
7. Применение ФДТ в комплексе с нитрозогуанидином приводило к усилению индукции апоптоза опухолевых клеток по сравнению с традиционной ФДТ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Согласно современным представлениям, развитие злокачественных опухолей - сложный многостадийный процесс, затрагивающий такие основополагающие физиологические механизмы как пролиферация и апоптоз. Регуляция клеточного роста и гибели представляет собой ключевое звено в поддержании структурно-функционального постоянства тканей, поэтому изучение нарушения этих процессов при неопластическом росте важно не только для понимания патогенетических особенностей развития опухолей, но и позволяет определить новые направления терапии злокачественных новообразований. Оксид азота, являясь многофункциональной регуляторной молекулой, участвует на всех этапах патогенеза злокачественных опухолей [22]. Однако роль N0 в регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток исследована не достаточно. Не исследована возможность использования соединений, генерирующих оксид азота, для усиления эффективности тех видов противоопухолевой терапии, механизм действия которых основан на свободно-радикальном повреждении злокачественной ткани, и включающих химио-, лучевую и фотодинамическую терапию.
В связи с этим, целью настоящей работы явилось исследование роли оксида азота в регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток. При этом решались следующие задачи:
• Исследовалось влияние доноров оксида азота в различных концентрациях на пролиферативную активность опухолевых клеток и индукцию в них апоптоза.
• Изучалось влияние доноров оксида азота на интенсивность свободно-радикальных процессов, метаболизм фосфолипидов мембран, функциональное состояние митохондрий опухолевых клеток.
• Изучалось сочетанное действие доноров оксида азота и пероксидных радикалов на пролиферативную активность опухолевых клеток
• Изучалось роль доноров оксида азота в регуляции апоптоза опухолевых клеток, индуцированного свободными радикалами.
• Оценивалось влияние доноров оксида азота на опухолетоксическое действие доксорубицина in vitro.
• Оценивалось возможность применения доноров оксида азота для усиления терапевтической эффективности антибиотиков антрациклинового ряда и фотодинамической терапии.
Для исследования влияния оксида азота на пролиферативную активность и индукцию апоптоза использовались доноры NO: нитропруссид натрия (SNP), нитрит натрия (NaN02), нитрозогуанидин (MNNG) в концентрациях от 10"3 М до 10"8 М, и субстрат NO-синтазной реакции - L-аргинин (5х10"3М), а также ингибитор NO-синтазной реакции метиловый эфир нитроаргинина (L-NAME, 5х10'3М). Исследование влияния доноров оксида азота на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток проводилось на экспериментальных моделях мастоцитомы Р815 и асцитной карциномы Эрлиха.
В результате проведенных исследований было установлено, что действие доноров оксида азота на пролиферативную активность опухолевых клеток мастоцитомы Р-815 и карциномы Эрлиха зависело от концентрации и химической структуры используемых соединений. Общей тенденцией влияния доноров NO на синтез ДНК в обоих типах клеточных линий являлось то, что в высоких концентрациях (10" М) они оказывали цитотоксической действие. Следует отметить существование критического интервала концентраций доноров оксида азота (10"4-10"5м), начиная с которых ингибирование включения [3Н]-тимидина в ДНК переходило в стимуляцию этого процесса. Исключение составляют SNP, который снижал пролиферативную активность опухолевых клеток мастоцитомы Р-815 практически во всех концентрациях, приближаясь к контрольным значениям
6 8 в диапазоне доз (10" -10" М), и нитрозогуанидин, цитотоксическое действие которого по отношению к карциноме Эрлиха было наиболее выражено.
Слабое стимулирующее действие на пролиферацию оказало добавление Ь-аргинина в суспезии обеих клеточных культур. Ингибирование N0-синтазной реакции метиловым эфиром нитроаргинина практически не изменяло скорость синтеза ДНК опухолевых клеток мастоцитомы Р-815, а в клетках карциномы Эрлиха приводило почти к 50% снижению этого процесса. Эти данные свидетельствуют о различном вкладе N0, образующегося в ЫО-синтазной реакции, в обеспечение рострегуляторных процессов в различных типах опухолевых клеток. Таким образом, оксид азота, синтезируемый как из экзогенных источников, так и эндогенно в N0-синтазной реакции, может изменять пролиферативную активность опухолевых клеток.
Исследование влияния оксида азота на индукцию апоптоза в опухолевых клетках карциномы Эрлиха показало, что применение №N02 и в концентрации 10"3 М приводило к достоверной активации индукции апоптоза по сравнению с контрольным уровнем. Снижение концентрации исследуемых доноров до приводило к ингибированию запуска апоптотической программы. Увеличение числа апоптотически погибших клеток в 1,5 раза выше контрольного наблюдалось под действием Ь-аргинина.
Таким образом, при анализе полученных данных была отмечена концентрационная зависимость действия доноров оксида азота на пролиферативную активность и индукцию апоптоза опухолевых клеток. Высокие концентрации доноров оксида азота угнетали пролиферативную активность и индуцировали апоптоз опухолевых клеток. Снижение концентрации действующих агентов в среде инкубации приводило к увеличению пролиферации опухолевых клеток и снижению процесса запуска программируемой клеточной смерти. В литературе встречаются данные, свидетельствующие как об ингибировании пролиферативной активности оксидом азота [46, 153,139], так и стимуляции этого процесса [56, 139, 141].
Нами впервые показано на широком спектре концентраций возможность разнонаправленного действия доноров N0 в зависимости от дозы.
В настоящее время биохимические и молекулярные механизмы регуляции пролиферации и апоптоза активно исследуются. Установлено существование универсальных сигнальных путей, которые принимают участие в регуляции обоих процессов [26, 30, 62, 87]. Кроме того, показано, что пролиферация и апоптоз обусловлены и сопровождаются серией определенных метаболических изменений [30, 62 , 87, 100].
Следующей задачей нашего исследования явилось комплексное изучение механизмов регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток оксидом азота.
Влияние оксида азота на метаболизм фосфолипидов мембран исследовали по выходу и включению меченой [1-С14] арахидоновой кислоты в мембраны опухолевых клеток. Проведенные исследования показали, что инкубация опухолевых клеток мастоцитомы Р-815 в среде содержащей ЫаТМС>2 в различных концентрациях приводила к увеличению выхода [1-С14] арахидоновой кислоты из мембран фосфолипидов на 36 % по сравнению с контрольным уровнем. В то же время Ь-аргинин не оказывал активирующего воздействия на выход арахидоновой кислоты из фосфолипидов мембран опухолевых клеток.
Исследование включения арахидоновой кислоты в фосфолипиды мембран опухолевых клеток показало, что добавление в среду инкубации опухолевых клеток мастоцитомы Р-815 ЫаТМОг в высоких концентрациях приводило к ингибированию этого процесса, что вероятно связанно с мембранотоксическим действием оксида азота на опухолевые клетки [24, 17, 86, 90].
Таким образом, под действием оксида азота наблюдается увеличение выхода жирной кислоты, что приводит к накоплению внутриклеточного содержания арахидоновой кислоты, которая в дальнейшем может использоваться как субстрат для синтеза биологически активных эйкозаноидов [51]. Метаболиты арахидоновой кислоты участвуют в передаче пролиферативного сигнала [123] и увеличение ее содержания, под действием оксида азота, может являться одной из причин приводящей к усиленной пролиферации опухолевых клеток. Клеточная восприимчивость, по мнению некоторых авторов, к различным регуляторным сигналам может эффективно модулироваться низкими концентрациями оксида азота [59, 131]. Таким образом, влияние оксида азота на клеточную пролиферацию возможно связано с его способностью к регуляции внутриклеточного содержания и биологической активности других клеточных посредников, участвующих в пролиферативных ответах, таких как
Са , цАМФ, арахидоновая кислота и т.д. [8, 24, 42, 46, 68, 146].
Повышение концентрации N0 до 10"3М в среде инкубации приводило наряду с активацией выхода арахидоновой кислоты к ингибированию ее включения в мембранные фосфолипиды. Это может свидетельствовать о нарушении процессов репарации мембран опухолевых клеток, что приводит к накоплению лизофосфолипидов, которые являются детергентами, разрушающими стабильность липидного бислоя [10]. Одним из следствий таких нарушений может быть образование пор в мембранах митохондрий, ведущее к выходу цитохрома С в цитоплазму и запуск апоптотических процессов [88, 112, 144].
Проведенные исследования по изучению влияния оксида азота на митохондриальную функцию опухолевых клеток показали, что КаЫ02 и ЭЫР (10"-10* М) снижали показатель митохондриального дыхания на 11-22% соответсвенно, а Ь-аргинин оказывал слабое ингибирующее действие. Таким образом, практически все используемые нами >Ю-доноры угнетали митохондриальное дыхание опухолевых клеток, что вероятно связано со способностью оксида азота обратимо ингибировать митохондриальное дыхание путем конкурирования с Ог в цитохромоксидазе [24]. Также известно, что оксид азота в высоких концентрациях снижает поглощение О2 и разобщает окислительное фосфолирирование в митохондриях [24], что ведет к развитию энергодефицитных состояний в клетке. Следствием уменьшения уровня АТФ в свою очередь может являться снижение пролиферативных процессов в клетках [19, 87].
Была исследована интенсивность свободно-радикальных процессов в опухолевых клетках карциномы Эрлиха под действием NO-генерирующих соединений SNP и L-аргинина. Результаты экспериментов показали увеличение уровня АКМ в опухолевых клетках карциномы Эрлиха под действием оксида азота, что выражалось в усилении флюоресценции. Увеличение интенсивности образования АКМ L-аргинином носило волнообразный характер, что вероятно связано с особенностью регуляции синтеза оксида азота в NO-синтазной реакции по принципу обратной связи [24]. SNP существенно усиливал окислительные процессы, индуцированные пероксидами, в опухолевых клетках. Известно, что оксид азота способен вступать в реакцию с органическими пероксильными радикалами (RO2), образующимися в результате индукции АКМ цепных реакций свободно-радикального окисления и последующим формированием органических пероксинитритов (ROONO-), которые обладают более выраженными окислительными свойствами [121].
Таким образом, оксид азота оказывал существенное влияние на механизмы, регулирующие пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток. Низкие концентрации доноров оксида азота вызывали усиление функциональной активности митохондрий, активацию свободно-радикального окисления в физиологических пределах; увеличение выхода арахидоновой кислоты из мембранных фосфолипидов, ведущее к накоплению биологически активных липидных интермедиатов, участвующих в регуляции пролиферативных процессов. Таким образом, все перечисленные процессы в совокупности ведут к усилению пролиферации и ингибированию апоптоза ' опухолевых клеток, которое было зарегистрировано нами при изучении скорости синтеза ДНК и уровня расщепления ДНК в опухолевых клетках под действием доноров оксида азота.
В противоположность этому, высокие концентрации оксида азота приводили к угнетению митохондриальной функции опухолевых клеток, что ведет к ингибированию митохондриального дыхания и снижению содержания АТФ [38]; к ингибированию включения арахидоновой кислоты, что говорит о токсическом действии оксида азота на мембраны [9, 17, 86, 147]. Таким образом, процессы, происходящие в опухолевой клетке под действием высоких доз оксида азота, ведут к снижению пролиферативной активности и последующей индукции апоптоза опухолевых клеток, что было зарегистрировано нами при изучении этих процессов. Действительно, апоптоз, индуцируемый оксидом азота, может опосредоваться повреждением ДНК, активацией проницаемости митохондриальных пор, повреждением фосфолипидов митохондриальной мембраны и выходом цитохрома С из митохондрий, снижением уровня АТФ [88, 112, 133, 144, 147, 148, 153].
Полученные данные свидетельствуют о том, что оксид азота может активно влиять на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток, что дает основание использовать его для усиления эффективности противоопухолевых воздействий. Известно, что многие классические методы лечения онкологическиз заболеваний, применяемые в клинической практике, (химио-, лучевая и фотодинамическая терапия) имеют в своей основе свободно-радикальный механизм. Поэтому следующая серия экспериментов была посвящена исследованию сочетанного воздействия свободных радикалов и N0 на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток на модельной системе in vitro.
Предварительные исследования показали концентрационную зависимость влияния пероксидов на пролиферативиую активность клеток карциномы Эрлиха и мастоцитомы Р-815, что выражалось в ингибировании синтеза ДНК высокими концентрациями и стимуляцией этого процесса выше контрольных значений низкими дозами используемых соединений.
При исследовании сочетанного действия оксида азота и свободно-радикальных агентов на пролиферацию опухолевых клеток было показано, что инкубация опухолевых клеток мастоцитомы Р-815 и карциномы Эрлиха с донорами оксида азота в нетоксичной концентрации в комбинации с субтоксичными концентрациями пероксидов приводила к увеличению включения [3Н]-тимидина в ДНК по сравнению с контрольной популяцией опухолевых клеток, инкубированных только с источниками пероксидных радикалов, либо не влияла на неё. Комбинация ЫО-доноров в тех же концентрациях с цитотоксичными дозами ГПТБ и АБАП, угнетающих синтез ДНК более чем на 80%, приводила к снижению антипролиферативного действия свободных радикалов.
Здесь следует отметить, что БИР в концентрациях 10"4- 10"5 М, №N02 в концентрации 10"5 М и Ь-аргинин полностью ингибировали антипролифератиный эффект АБАП (20мМ). И только №N(>2 в концентрации 10 нМ потенцировал цитотоксическое действие ГПТБ.
Таким образом, инкубация опухолевых клеток только с донорами оксида азота в нетоксичных концентрациях не приводила к выраженному изменению пролиферативной активности, но комбинация его со свободно-радикальными агентами стимулировала синтез ДНК, выше уровня контроля.
Анализируя полученные в этой работе данные можно предположить, что взаимодействие оксида азота с пероксидными радикалами не всегда приводит к образованию цитотоксических продуктов. Учитывая данные о возможности органических пероксинитритов распадаться с образованием органических нитратов, N0 может выступать как антиоксидант. Кроме того, известно, что N0 связывает мембранные и внутриклеточные комплексы железа, что препятствует распаду пероксидов с образованием радикалов и развитию цепных реакций свободно-радикального окисления [19, 78, 80]. Возможно, что антиоксидантные свойства и обуславливают цитопротекторное действие N0.
Изучение сочетанного действия оксида азота и свободных радикалов на индукцию апоптоза опухолевых клеток карциномы Эрлиха показало активацию этого процесса при комбинированном применении №N02 (Ю"5
М) и АБАП (0,1 шМ), L-аргишша (5х10'3М) и АБАП (0,1 шМ), L-аргинина и ГПТБ(0,1 мМ). В других случаях наблюдалось снижение апоптотической гибели клеток. Основываясь на полученных результатах можно предположить, что сочетанное применение доноров оксида азота и свободно-радикальных агентов в низких концентрациях может приводить к усиленной пролиферации с одновременной индукцией апоптоза.
Одним из частных случаев свободно-радикального воздействия на опухолевые клетки является химиотерапия лекарственными препаратами, в частности антрациклиновыми антибиотиками.
При действии доксорубицина на клетки карциномы Эрлиха нами была зарегистрирована концентрационная зависимость влияния препарата на процесс синтеза ДНК аналогичная действию свободно-радикальных агентов используемых нами ранее. Высокие концентрации доксорубицина (10*6 М и выше) ингибировали включение [3Н]-тимидина в ДНК. Снижение его концентрации до 10"7 М приводило к усилению синтеза ДНК, что можно объяснить стимуляцией пролиферативных процессов через АКМ-опосредованный путь [157]. Действие доксорубицина на индукцию апоптоза опухолевых клеток, носило волнообразный характер, хотя с уменьшением дозы антибиотика апоптотическая гибель однозначно увеличивалась. Возможно, это связано с особенностью репаративных процессов в опухолевых клетках. Стоит отметить, что и пролиферативная активность опухолевых клеток в тех же концентрациях увеличивалась.
Анализируя полученные данные можно заключить, что реализация опухолетоксического эффекта доксорубицина осуществляется как через ингибирование пролиферативных процессов, так и через индукцию апоптоза. Образующиеся в результате метаболизма антибиотика АКМ могут вызывать повреждения нуклеиновых кислот, инактивацию ферментов и запуск цепных реакций перекисного окисления липидов, что ведет к нарушению различных клеточных функций, ингибированию пролиферации клеток и индукции апоптоза [4, 28, 40, 41, 57, 62, 66]. Согласно литературным данным стимуляция свободными радикалами и клеточного деления и апоптотической гибели может проходить по одним и тем же сигнальным путям [26, 30, 87, 100]. Естественно предположить, нто в этом случае рост пролиферативной активности будет сопровождаться ростом гибели клеток по апоптотическому сценарию.
Использование комбинации доксорубицина с донорами оксида азота приводило к достоверному увеличению процессов синтеза ДНК в опухолевых клетках карциномы Эрлиха, за исключением усиления опухолетоксического действия доксорубицина (Ю М), которое наблюдалось при добавлении доноров оксида азота NaN02 и SNP в концентрациях
10"3М.
Эндогенный источник оксида азота L-аргинин в сочетании с доксорубицином оказывал выраженное цитопротекторное действие. В то же время было обнаружено соединение, которое значительно усиливало цитотоксическое действие доксорубицина. Так нитрозогуанидин в концентрации Ю^М в 3 раза усиливал ингибирующее действие доксорубицина на синтез ДНК.
Полученные результаты показывают, что применение доксорубицина в сочетании с донорами оксида азота in vitro выявило наличие сложной закономерности в воздействии различных комбинаций доз антибиотика и доноров оксида азота на пролиферативную активность опухолевых клеток. Доноры оксида азота имеют неоднозначное действие на антипролиферативный эффект доксорубицина, что зависит от химического строения и концентрации используемых соединений. На основании полученных результатов можно предположить, что оксид азота может являться одним из факторов, способствующим появлению клонов опухолевых клеток, устойчивых к доксорубицину и обладающих повышенной пролиферативной активностью.
Исследование действия оксида • азота на индукцию апоптоза опухолевых клеток доксорубицином показало, что добавление в инкубационную среду NO-доноров значительно снижало апоптотическую гибель клеток карциномы Эрлиха. Достоверное увеличение апоптотически погибших клеток наблюдалось только при сочетании SNP и доксорубицина в концентациях 10 "5 М.
Таким образом, доноры NO заметно снижали антипролиферативный эффект доксорубицина и индукцию апоптоза в опухолевых клетках in vitro. Важно отметить, что действие NO-генерирующих соединений не зависело от способа образования оксида азота в клетках. Вещества, химически генерирующие NO — SNP и NaNÜ2, обладали сходным эффектом с L-аргишшом - субстратом NO-синтазной реакции.
Пполученные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что N0 может являться фактором, защищающим ДНК опухолевых клеток от повреждающего действия доксорубицина, и может вносить свой вклад в развитие резистентности опухолей к антрациклиновым антибиотикам. Однако стоит отметить, что в некоторых ситуациях наблюдалось потенцирование повреждающего действия доксорубицина. В итоге конечный результат комбинированного действия оксида азота и свободных радикалов зависит от многих факторов: от концентрации действующих агентов, от типа клеток, от условий постановки экспериментов. Учитывая способность некоторых противоопухолевых препаратов усиливать генерацию NO [16, 98], необходимо, на наш взгляд, дополнительно исследовать противоопухолевую активность комбинации препаратов, используемых в химиотерапии.
Для более полной оценки роли доноров оксида азота в модуляции противоопухолевого действия доксорубицина было проведено исследование in vivo. Показано, что MNNG может усиливать противоопухолевое действие доксорубицина. Сочетанное использование доксорубицина и MNNG приводило к значительному уменьшению размера опухоли, а также усилению 'индукции апоптоза и некроза клеток карциномы Эрлиха по сравнению с действием одного химиопрепарата. Ранее показано, что противоопухолевая эффективность циклофосфана повышалась при его комбинации с донором NO по отношению к клеткам лейкемии Р-388 [11, 12]. Сопоставляя эти факты можно сделать заключение о целесообразности
Ill применения доноров оксида азота для повышения эффективности используемых в клинике химиотерапевтических агентов. Существенным вкладом в повышение противоопухолевой эффективности доксорубицина оксидом азота является усиление иммунного ответа по отношению к злокачественным новообразованиям [24, 107, 119, 124].
Другим направлением, позволяющим расширить круг применения доноров оксида азота, может быть их использование для повышения противоопухолевой активности фотодинамической терапии. Принцип ФДТ основан на способности фотосенсибилизатора накапливаться в опухолевых тканях и при лазерном облучении генерировать образование АКМ [27], которые обладают цитотоксическим эффектом и индуцируют апоптоз опухолевых клеток.
В результате проведенных экспериментов было показано, что использование ФДТ увеличивало некротическую гибель опухолевых клеток в 6,6 раза, апоптотическую в 1,7 раза по сравнению с контролем, объем опухоли при этом уменьшался на 30%. Комбинация ФДТ и MNNG не влияла на объем опухоли, хотя некроз клеток увеличивался в 5,7 раза, а апоптоз в 2,4 раза по отношению к контрольному уровню. Попытка использования донора оксида азота в качестве фотосенсибилизатора показала, что апоптотическая гибель клеток увеличивалась в 1,2 раза, а некротическая в 5,6 раза, объем опухоли уменьшался в 14,5 раза по сравнению с контролем. Механизм усиления противоопухолевого действия лазерного излучения оксидом азота до сих пор не известен. Вероятно, усиление эффективности ФДТ донорами оксида азота связано со способностью оксида азота вступать в реакцию с органическими пероксильными радикалами (RO '), образующимися в результате лазерного облучения с последующим формированием органических пероксинитритов (ROONO"), которые обладают большей цитотоксичностыо [31, 88]. Учитывая данные о том, что опухолевые клетки чаще всего находятся в опухолевом узле в состоянии гипоксии и ФДТ может приводить к усилению гипоксии облучаемых тканей
44], а оксид азота способен выступать в качестве акцептора электронов в дыхательной цепи митохондрий, снижая тем самым уровень тканевой гипоксии, можно предположить, что, поглощая оксид азота, опухолевые клетки будут более восприимчивы к облучению по сравнению с нормальными клетками. Таким образом, можно заключить, что влияние оксида азота на свободно-радикальное воздействие, реализуемое при ФДТ, зависит от условий постановки эксперимента и от концентрации действующих агентов. Отмечено усиление противоопухолевой активности ФДТ под влиянием оксида азота.
Таким образом, в данной работе впервые было исследовано влияние широкого спектра концентраций доноров оксида азота, свободных радикалов и их комбинации на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток. Обобщая предствленные результаты можно сделать вывод о концентрационной зависимости влияния оксида азота, а также свободных радикалов на клеточные физиологические эффекты и метаболические процессы. По нашим данным N0 в высоких концентрациях оказывает повреждающее действие на опухолевые клетки, что выражается в усилении образования свободных радикалов, ингибировании процессов репарации мембран, что ведет к их повреждению, нарушению функции митохондрий. Итогом такого воздействия являются угнетение пролиферации опухолевых клеток и индукция в них апоптоза (Рис. 22).
В противоположность этому, N0 в низких концентрациях активирует митохондриальное дыхание, усиливает передачу ростстимулирующих сигналов за счет освобождения арахидоновой кислоты, что ведет к активации пролиферативных процессов (Рис. 23).
Феномены стимуляции и ингибирования пролиферации опухолевых клеток под действием соответственно низких и высоких концентраций пероксидных радикалов и ИО-генерирующих соединений являются небезынтересными с теоретической и практической точек зрения. С теоретической точки зрения, полученные результаты хорошо согласуются с концепцией Селье и существующими представлениями, основанными на многочисленных данных литературы о том, что малые дозы токсических веществ (слабый химический стресс) оказывают стимулирующее действие, а высокие их дозы оказывают соответственно повреждающее действие, вплоть до гибели клеток [24]. Кроме того, полученные данные свидетельствуют о том, что нарушение в сиситеме регуляции синтеза оксида азота и активных форм кислорода могут быть далеко небезразличны для пролиферативной активности опухолевых клеток. С практической точки зрения, полученные результаты представляют интерес в связи с тем, что реальные популяции опухолевых клеток в организме онкологических больных гетерогенны и изменчивы по многим фенотипическим признакам. В связи с этим нельзя исключить возможность существования клонов клеток в одном опухолевом узле с различным порогом чувствительности к радио- и химиотерапевтическим воздействиям. Вследствие этого, специфическая противоопухолевая терапия может, например, привести к гибели значительной массы опухолевых клеток, но в то же время оказать стимулирующее воздействие на пролиферацию отдельных высокорезистентных клеток, что в конечном итоге может вести к генерализации опухолевого процесса. Таким образом, результаты этих исследований показывают, что действие оксида азота и веществ, генерирующих пероксиды, на опухолевые клетки может быть более сложным и не столь однозначным, как это считали ранее. В связи с этим, лечащие врачи должны внимательно относиться к назначению терапевтических средств, которые могут активировать образование оксида азота и пероксидов в организме пациентов с онкологическими заболеваниями.
Повреждение мембран
Усиление образования свободных радикалов, процессов ПОЛ
Нарушение ионного гомеостаза клетки, Увеличение внутриклеточного Са"
2 +
Повреждение митохондрий
Ингибирование ферментов репарации ДНК
Активация
Са2+-зависимых протеаз
Выход цитохрома С
Нарушение энергообеспечения клетки
Гг ^
Угнетение пролиферации клеток
Активация каспаз
Активация фосфолипазы А2, ингибирование репарации мембран
Повреждение ядерной мембраны
Повреждение ДНК
Активация проапоптотических генов
Сенсибилизация к цитокинам Г
АПОПТОЗ л
Рис 22. Повреждающее действие оксида азота в высоких концентрациях: угнетение пролиферативной активности и индукция апоптоза опухолевых клеток
Стабилизация мембран
Регуляция образования свободных радикалов, процессов ПОЛ
Увеличение содержания внутриклеточных посредников Са2+, сАМФ, арахидоновой кислоты
Активирование ферментов репарации ДНК (ДНК-протеинкиназы)
Активация нитритредуктазной активности митохондрий
Усиление ЫАОРН-оксидазной реакции митохондрий
-<
Активация пролиферативных процессов
Стабилизация функции митохондрий
Задержка выхода цитохрома С
Инактивация каспаз
Активация цГМФ-зависимой протеинкиназы, циклооксигеназы
Модуляция Ьс12/Ьах семейства Индукция Н8Р-70
Ограничение активности р53, сверхэкспрессия Ьс12
БЛОКИРОВАНИЕ АПОПТОЗА
Рис. 23. Протекторное действие оксида азота в низких концентрациях: усиление пролифератиной активности и блокирование апоптоза опухолевых клеток.
В данной работе получены результаты, показывающие принципиальную возможность развития направления по использованию доноров оксид азота для усиления терапевтической эффективности доксорубицина и ФДТ. В то же время следует отметить, что доноры N0 могут оказывать неоднозначное действие на процессы пролиферации и апоптоза опухолевых клеток. Поэтому требуются дополнительные исследования для окончательных выводов о клиническом применении доноров оксида азота. По нашему мнению, это откроет перспективу их использования в сочетании с классическими методами противоопухолевой терапии, и будет способствовать развитию новых подходов к лечению злокачественных заболеваний.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2004 года, Какурина, Гелена Валерьевна
1. Блохин H.H. Химиотерапия опухолевых заболеваний/ Блохин H.H., Переводчикова Н.И.//М.: Медицина, 1984. 304 с.
2. Бахтин Ю.Б. Клонально-селекционная концепция опухолевого роста / Бахтин Ю.Б., Пинчук В.Г., Швембергер И.Н., Бутенко З.А. — Киев.: Наукова думка, 1987. 216 с.
3. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты. // Вестник Российской академии медицинских наук. 1998.- N7. - С. 43-51.
4. Гаузе Г.Ф. Противоопухолевые антибиотики. / Гаузе Г.Ф., Дуднин Ю.В.// М.: Медицина, 1987. 176 с.
5. Герштейн Е.С. Основа создания новых противоопухолевых препаратов — исследование механизмов передачи митогенных сигналов факторов роста. /Герштейн Е.С., Кушлинский Н.Е., Трапезников Н.Н // Сиб. Мед. Журн.,1999,№3-4,т.14, стр.55-63
6. Дункан Э.А. Генетические изменения, связанные с иммортилизацией. Дункан Э.А., Реддел P.P. // Биохимия. 1997. - Т.62. - вып. 11. - С. 14771490 .
7. Зайчик А.Ш. «Основы общей патологии», Зайчик А.Ш. Чурилов Л.П., С- Петербург, 1999г
8. Зенков Н. К. NO-синтазы в норме и при патологии различного генеза. / Зенков Н. К., Меныцикова Е.Б., Реутов В.П. // Вестник российской академии медицинских наук. 2000. - N4. - С. 30 — 34.
9. Кондакова И.В. Активация фосфолипазного гидролиза в процессе окислительного повреждения клетки. Кондакова И.В., Борунов Е.В.,f 120
10. Антипова Е.В.//Бюллютень экспериментальной биологии и медицины.-Москва.-1991-T.-CXII .-№9.-с. 285-287.
11. Коновалова Н.П. Донор оксида азота повышает эффективность цитостатической терапии и задерживает развитие лекарственной резистентности.//Вопр. онкологии.-2003.-T.49.-N« 1 .-С.71 -75
12. Коновалова Н.П. Влияние донора оксида азота на терапевтическую эффективность цитостатиков и синтез ДНК.// Коновалова Н.П., Волкова Л.М., Якушенко Л.Ю. и др.//Российский биотерапевтический журнал.-2003.-№2.-52-55
13. Комбинированное и комплексное лечение больных со злокачественными опухолями. / под ред. Чиссова В.Е. М.: Медицина, -1989.-560 с.
14. Кудрявцев Ю.И./Динамика апоптотических событий, индуцированных фактором некроза опухолей в лейкозных клетках U-937.// Кудрявцев Ю.И., Фильченков A.A., Абраменко И.В., Полищук Л.З., Слуквин И.И., Белоус Н.И.// Эксп. онкология, 1996, 18, 353-356
15. Куцый М.П. Участие протеаз в апоптозе. Куцый М.П., Кузнецова Е.А, Газиев А.И. // Биохимия, 1999.т.64.вып.2,с.149-163.
16. Левина В.И., Азизов О.В., Арзамасцев А.П. и др.// Вопр. биол., мед. и фарм. химии. 2001.№ 1. С. 47-49.
17. Лобышева И.И. Взаимодействие динитрозильных тиолсодержащих комплексов железа с пероксинитритом и перекисью водорода in vitro. Лобышева И.И., Сереженков В.А., Ванин А.Ф.// Биохимия,-1999г.-т.64,-вып.2,-с. 194-2000
18. Луценко C.B. Молекулярные механизмы противоопухолевой активности антибиотиков антрациклинового ряда./ Луценко C.B., Фельдман Н.Б., Туманов С.Г., Северин С.Е.//Вопр. биол.мед. и фарм. химии.2001.-№2.-С.-3-9
19. Меньшикова Е.Б. Биохимия окислительного стресса. Оксиданты и антиоксиданты / Меньшикова Е.Б., Зенков Е.К., Шергин С.М. -Новосибирск : изд-во, 1994. 203 с.
20. Окулов В.Б. Адаптивные реакции клеток как основа прогрессии опухолей./ Окулов В.Б., Зубова С.Г. // Вопр. онкологии 2000. - Т.46. -N5. - С. 505-512
21. Программированная клеточная гибель./Под ред. Новикова В.С.-С.-Петербург:Наука,-1996.-276с.
22. Проскуряков С.Я. Оксид азота в неопластическом процессе. Проскуряков С.Я., Коноплянников А.Г., Иванников А.И. и др. // Вопросы онкологии.-2001.-Т.47. N3.- С. 257-269.
23. Проскуряков С.Я. Оксид азота и терапия злокачественных новообразований. / Проскуряков С.Я., Коноплянников А.Г., Иванников А.И. и др. // Российский онкологический журнал. 2000. - N3.- С. 41-48.
24. Реутов В.П. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих./Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Охотин В.Е., Косицын Н.С.// // Москва. «Наука». 1998г
25. Рябов Г.А. Роль оксида азота как регулятора клеточных процессов при формировании полиорганной недостаточности/ Рябов Г.А., Азизов Ю.М.//Анестезиология и реаниматология// Москва 2001, стр 8-12 , т. 1
26. Саприн A.C. Окислительный стресс и его роль в механизмах апоптоза и развития патологических процессов / А.С Саприн., Е.В. Калинина // Успехи биологической химии. 1999. — Т. 39. - С. 289—326.
27. Соколов В.В. ФДТ злокачественных опухолей основных локализаций с препаратами фотогем и фотосенс (результаты 3-л. наблюдений).// Соколов В.В., Странадко Е.Ф., Жаркова Н.Н.//Вопр.онкологии.-1995г.-Т.41.-№2.-С. 134-137
28. Суханова Г.А., Серебров В.Ю. Биохимия клетки. Томск: Чародей, 2000 - 184 с.
29. Успенская Ю.А. Фундаментальные науки медицине (реалии, приоритеты, перспективы)/ Успенская Ю.А., Круглик О.В., Нефедов В.П.,//Красноярск.-1998.-С.38-50
30. Фильченков А.А. Апоптоз и рак./ Фильченков А.А., Стойка Р.С.// -К. Морион, 1999г.
31. Фильченков А. А. Апоптоз: краткая история, молекулярные механизмы, методы выявления и возможное значение в онкологии / Фильченков А.А., Стойка Р.С.// Эксп. онкология,18,435-448,1996
32. Шапот B.C. Биохимические аспекты опухолевого роста / B.C. Шапот. Москва: Наука, 1975. -304 с
33. Alan R. Brash. Arachidonic acid as a bioactive molecule.//Alan R. Brash.// J Clin Invest.-2001.- V. 107.-N. 11.-P. 1339-1345
34. Ambs S. Interactive effects of nitric oxide and the p53 tumor suppressor gene in carcinogenesis and tumor progression// S Ambs, SP Hussain and CC Harris// The FASEB Journal, 1997.- Vol 11.- 443-448
35. Ambrosone C.B. Antioxidant Redox Signal. 2000. - Vol. 2, № 4. P. 903-917.
36. Andreka Peter. Cytoprotection by Jun Kinase During Nitric Oxide-Induced Cardiac Myocyte Apoptosis //Peter Andreka, Jie Zang, Christopher Dougherty, et all// Circulation Research. 2001V.88.-P.305
37. Babich M.A. Synergistic killing of virus-transformed human cells with interferon and N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine//M.A. Babich and R.S. Day// Carcinogenesis, 1989, Vol 10, P. 265-268,
38. Balakirev M.Y. Modulation of the mitochondrial permeability transition by nitric oxide// MYu Balakirev, VV Khramtsov and G Zimmer //European Journal of Biochemistry, 1997r. Vol 246, 710-718,
39. Bachur N.R. NADFH cytochrome P450 reductase activation of quinone anticancer agents to free radicals. / Bachur N.R., Gordon S.L., Gee M.V. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - Vol. 76. - N2. - P. 954-957
40. Becquet F. Superoxide inhibits proliferation and phagocytic internalization of photoreceptor outer segments by bovine retinal pigment epithelium in vitro. / Becquet F, Goureau O, Soubrane G, et al. // Exp.Cell.Res. 1994. -Vol.212. - P. -374-382.
41. Brox L. The effect of anoxia on anthracycline induced DNA damage in the RPMI 6410 human lymphoblastoid cell line/ Brox L., Gowans b., To R.et al.//Can.J.Biochem.-1982.-Vol.60,N.9.-P.873-876.;
42. Briine B. Apoptotic Cell Death and Nitric Oxide: Activating and Antagonistic Transducing PathwaysWB. Briine, K. Sandau, and A. von Knethen.// Biochem. Biophys. Res. Commun.-1997.-V.229. P. 396-401.
43. BoutonC., Hirling H., Drapier J., C.,//J.Biol.Chem.,272,19969-19975
44. Cohen J.J. Programed cell death in the immune system/ Cohen J.J. //Adv. Immunol/ 1991. 50 .55-85
45. Cha M.S. Endogenous production of nitric oxide by vascular endothelial growth factor down-regulates proliferation of choriocarcinoma cells./ Cha M.S., Lee M.J., Je G.H., et all //Oncogene.- 2001.-V.20(12).-P.1486-96
46. Chen G.G. Negative correlation between the ratio of Bax to Bcl-2 and the size of tumor treated by culture supernatants from Kupffer cells. //Chen GG, Lai PB, Hu X, et all // Clin Exp Metastasis.- 2002.-V.19(5).-p.457-64
47. Dao T. Tumor necrosis factor-a induces apoptosis in human leukemia T cell line MOLT-16: its relation to bcl-2 and c-myc expression. /Dao T., Ariyasu T., MicallefM., Minowada J.,//Int J Oncol.- 1994.-V.4.-P.1371-5
48. Dodd F. L-arginine inhibits apoptosis via a NO-dependent mechanism in Nb2 lymphoma cells.// F Dodd, M Limoges, RT Boudreau, et all/ J Cell Biochem- 2000.-V. 77(4).-P.624-34.
49. Doi K. Excessive production of nitric oxide in rat solid tumor and its implication in rapid tumor growth//Doi K., Akaike T., Horie H., et all/ Cancer (Phila.).- 1996.-V.77.-P. 1598-1604
50. Eling E. Thomas. Cellular proliferation and lipid metabolism: importance of lipoxygenase in modulating epidermal growth factor-dependent mitogenesis./ Eling E. Thomas, Glasgow C. Wayne.//Cancer and metastasis Reviews.-1994.-Vol. 13.- P.397-410.
51. Ervens J. Molsidomine inhibits the chemoattractant-induced respiratory burst in human neutrophils via a NO-independent mechanism\Ervens J.; Seifert R. WBiochem Pharmacol.- 1992.-V.44(4).- p.637-44
52. Filep J.G. Nitric oxide co-operates with hydrogen peroxide in inducing DNA fragmentation and cell lysis in murine lymphoma cells / Filep JG, Lapierre C, Lachance S, et al.// Biochem.J 1997. - Vol. 321. - P. 897-901.
53. Frédéric Feger. Role of Iron in Tumor Cell Protection from the Pro-Apoptotic Effect of Nitric Oxide WFredéric Feger, Hélène Ferry-Dumazet, Maria Mamani Matsuda et all//Cancer Research 61, 5289-5294, July 1, 2001
54. Fritzer-Szekeres M. Enhanced effects of adriamycin by combination with a new ribonucleotide reductase inhibitor, trimidox, in murine leukemia. / Fritzer-Szekeres M, Novotny L, Romanova D, et al.// Life Sei. 1998. -Vol.63 - P. 545-552.
55. Gansauge S. Exogenous, but not endogenous, nitric oxide increases proliferation rates in senescent human fibroblasts / Gansauge S, Gansauge F, Nussler AK, et al. // FEBS Letters. 1997. - Vol. 404. - P. - 160-164.
56. Gansauge S. The induction of apoptosis in proliferating human fibroblasts by oxygen radicals is associated with a p53- and p21WAFlCIPl induction. / Gansauge S, Gansauge F, Gause H, et al. // FEBS Letters. 1997. - Vol. 404. -P. 6-10.
57. Genaro, A. M., Hortelano, S., Alvarez, et ail // J. Clin. Invest.-1995.-V.95.-P. 1884-1890.
58. Gastman Brian R. Tumor-induced Apoptosis of T Cells: Amplification by a Mitochondrial Cascade//Brian R. Gastman, Xiao-Ming Yin, Daniel E. Johnson, et all// Cancer research.-2000. vol. 60. p. 6811-6817.
59. Gewirtz D.A. DNA damage,gene expression, growth arrest and cell death./ Gewirtz D.A. //Oncol Res.- 1993.-V.5.-P.397-408
60. Glockzin S. Activation of the cell death program by nitric oxide involves inhibition of the proteasome. / Glockzin S, von Knethen A, Scheffner M, et al. //J.Biol. Chem. 1999.-Vol. 274.-P. 19581-19586.
61. Gomer C.J. Photodynamic therapy-mediated oxidative stress can induce expression of heat shock proteins// CJ Gomer, SW Ryter, A Ferrario, N Rucker, S Wong and AM Fisher //Cancer Research.- 1996.- V. 56.-Is. 10.-P. 2355-2360,
62. Gomes E.R. Nitric oxide modulates tumor cell death induced by photodynamic therapy through a cGMP-dependent mechanism./ ER Gomes, RD Almeida, AP Carvalho,and CB Duarte W.Photochem Photobiol.-2002.-V. 76(4).-P. 423-30
63. Gorman A. Role of peroxide and superoxide anion during tumour cell apoptosis. / Gorman A, McGowan A, Cotter TG. // FEBS Letters. 1997. -Vol. 404.-P.-27-33.
64. Girotti A. W. Photodynamic lipid peroxidation in biological systems. //Photochem. Photobiol. -1990.-V. 51.-P.497-509
65. Gupta S. Involvement of nitric oxide during phthalocyanine (Pc4) photodynamic therapy-mediated apoptosis // Gupta S., Ahmad, N., and Mukhtar //H. Cancer Res. -1998.-V. 58.-P. 1785-1788
66. Haddad R. In vitro and in vivo effects of photodynamic therapy on murine malignant melanoma/R. Haddad, A. Blumenfeld, A. Siegal, et all// Annals of Surgical Oncology.- 1998.-Vol 5.-Is. 3.-P. 241-247,
67. Hajri A. In vitro and in vivo efficacy of photofrin and pheophorbide a, a bacteriochlorin, in photodynamic therapy of colonic cancer cells./ A Hajri, S Wack, C Meyer, et allWPhotochem Photobiol.-2002.-V. 75(2).-P. 140-8.
68. Harris S.R. Oxidative stress contributes to the anti-proliferative effects of flavone acetic acid on endothelial cells.// Harris S.R., Panaro N.J., Thorgeirsson U.P.// Anticancer Res.- 2000.- V.20.-N.4.-P.2249-54
69. Hobbs A. J. Nitric oxide-cyclic GMP signal transduction system. /Hobbs A. J., Ignarro L. J. //Methods Enzymol., 269: 134-148, 1996, 5
70. Huie R.E. The reaction of NO with superoxide./ Huie RE, Padmaja S. // FreeRadicRes Commun 1993.-Vol.18-P. 195-199.
71. Ioannidis I. Cytotoxicity of nitric oxide in Fu5 rat hepatoma cells: evidence for co-operative action with hydrogen peroxide/Ioannidis I., de Groot H. //Biochem J.- 1993 .-V.296 ( Pt 2).- p341-5
72. Johnson Mark L. Roles of Nitric Oxide in Surgical Infection and SepsisWMark L. Johnson, M.D., Timothy R. Billiar, M.D.W World J. Surg. 1998.-V.22.-P. 187-196,
73. Juckett M.B. Nitric oxide donors modulate ferritin and protect endothelium from oxidative injury. / Juckett MB, Weber M, Balla J, et al. // Free Rad. Biol. Med. 1996. - Vol. 20. - P.63-73.
74. Kroncke K.D. Pancreatic islet cells are highly susceptible towards the cytotoxic effects of chemically generated nitric oxide.// Kroncke K.D., Brenner H.H., Rodriguez M.L.//Biochim Biophys Acta.- 1993.-V.1182 N.2.-P.221-9
75. Kanner J. Nitric oxide as an Antioxidant. /Kanner J., Harel S., Granit R. // Archives of biochemistry and by ophysics. 1991.-Vol. 289.-P. 130-136.
76. Kanner J., Harel S., Granit R. // Lipids. 1992. - Vol. 27. - P. 46-49.
77. Keennedy K.A. Effect of antracyclines on oxigenated and hipoxic cell/ KeennedyK.A.,Siegfried J.M., Sarttorelli A.C. et al.// Ibid.-1983.-Vol.43.-N1.-P.54-59
78. Kerr J.F.R. Apoptosis. Its significance in cancer and cancer therapy/Kerr JFR et al.// Cancer.- 1994.-V.73.-P.2013-26
79. Khurana G. Nitric oxide and arachidonic acid modulation of calcium currents in postganglionic neurones of avian cultured ciliary ganglia// G Khurana and MR Bennett//British Journal of Pharmacology.-1999,- Vol 109.-P. 480-485
80. King K.L. Cell cycle and apoptosis: common pathways to life and death /King K.L., Cidlowski J.A // J Cell Biol.-1995.-V.58.-P.175-180
81. Kolb J.P. Mechanisms involved in the pro- and anti-apoptotic role of NO inhuman leukemia./Kolb J.P.//Leukemia.-2000.-N. 14(9).-P. 1685-94.
82. Koshimura K. Self-protection of PC 12 cells by 6R-tetrahydrobiopterin from nitric oxide toxicity./ Koshimura K; Murakami Y; Tanaka J; Kato Y.J. //Neurosci Res.- 1998 .-V.54(5).-p664-72
83. Von Knethen A. Attenuation of macrophage apoptosis by the cAMP-signaling system/ von Knethen A , Brune B //Mol Cell Biochem.- 2000 .-V.212( 1 -2).-P.3 5-43
84. Korbelik M. The role of host lymphoid populations in the response of mouse EMT6 tumor to photodynamic therapy//M Korbelik, G Krosl, J Krosl and GJ Dougherty // Cancer Research.-1996.-Vol 56.- Is. 24.-P. 5647-5652,
85. Kondakova I.V. Phospholipase A stimulation in tumor cells by subtoxic concentration of tret-butyl hydroperoxide./Kondakova I.V., Peiretti F., Nalbone G., Lafont H.// Bioch. and Bioph. Acta . -1995.- Vol. 1258.- P. 297302.
86. Kwak J.Y. Cytokines secreted by lymphokine-activated killer cells induce endogenous nitric oxide synthesis and apoptosis in DLD-1 colon cancer cells.// Kwak J.Y., Han M.K., Choi KS et all./ Cell Immunol.- 2000.-N 1.-V.203(2).-P.84-94
87. Lee Y.B. Role of tumor necrosis factor-alpha in neuronal and glial apoptosis after spinal cord injury/ Lee Y.B., Yune T.Y., Baik S.Y., et all// Exp Neurol.- 2000 .-V. 166(1 ).-P. 190-5
88. Lemaire G. Differential cytostatic effects of NO donors and NO producing cells./ Lemaire G; Alvarez-Pachon FJ; Beuneu C; et all// Free Radic Biol Med.- 1999 .-V.26(9-10).-p 1274-83
89. Leto G. Antimetastatic activity of adriamycin in combination with proteinase inhibitor in mice/ Leto G., Tumminelo F.M., Gebbia N. Et al.// Anticancer Res.-I990.-Vol.l0.-P.265-270.
90. Lind D.S. Nitric oxide contributes to adriamycin's antitumor effect. / Lind D.S., Kontaridis M.I., Edwards P.D. et al. // J. Surg. Res. 1997. - Vol.2. - P. 283-287.
91. Lissi E., Pascual C., Castillo M. // Free Rad. Res. Comms. 1992. - Vol. 17.-P. 299-311.
92. Lundberg A.S. Control of the Cell Cycle and Apoptosis/A.S. Lundberg and R.A. Weinberg //European Journal of Cancer, Vol. 35, No. 4, pp. 531±539, 1999
93. Luo D. Inhibition of nitric oxide synthase by antineoplastic anthracyclines. /Luo D., Vincent S.R. // Biochem Pharmacol. 1994. Vol.11. — P. 2111 — 2112.
94. Mannick J. B. S-Nitrosylation of mitochondrial caspases / Joan B. Mannick, Christopher Schonhoff, Natalia Papeta, et all // The Journal of Cell Biology.- 2001.-Vol. 154.- N.6.- P.l 111-1116
95. Mannick J. B. Nitric oxide produced by human B lymphocytes inhibits apoptosis and Epstein-Barr virus reactivation.// Mannick J. B., Asano K., Izumi K., Kieff E., Stamler J. S. // Cell, 1994.-V.79.-P.1137-1146
96. Martin S.J., Green D.R.//Cell.l995. vol. 82. P. 349-352.
97. Marklund S. L., Westman N.G.// Radiat. Res.-1984.-Vol.l00.-P.155-123
98. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and cytotoxicity assays.//Mosmann T./J. Immunol. Methods , 1983, V.65, PP. 55-63.
99. Mates J.M. Role of reactive type of oxygen in apoptosis: values for therapy of a cancer/ Mates JM, Sanchez-Jimenez FM// Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 2000 V.46(l).-P.199-214
100. Meeta Jaiswal. Nitric oxide in gastrointestinal epithelial cell carcinogenesis: linking inflammation to oncogenesis /Meeta Jaiswal, Nicholas F. LaRusso, and Gregory J.// Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 281.2001.- G626-G634,
101. Menconi M J. Nitric oxide donor-induced hyperpermeability of cultured intestinal epithelial monolayers: role of superoxide radical, hydroxyl radical, and peroxynitrite./ Menconi M J. Y Tsuji, N Unno,M Smith et all//Shock.1996.-V.6(1).-P. 19-24.j
102. Mills J.C. Apoptotic membrane blebbing is regulated by myosin light chan phosphorylation/ Mills J.C., Stone N.I., Erhardt J., Pittman R.N.//J.Cell Biol.-1998.-V.140.-P.627-636.
103. Mimnaugh E.G. Differential oxygen radical susceptibility of adriamycin-sensitive and -resistant MCF-7 human breast tumor cells. / Mimnaugh EG, Dusre L, Atwell J, et al. // Cancer Res. 1989. - Vol.49 - P. 8-15.
104. Miura Y. In vivo electron paramagnetic resonance studies on oxidative stress caused by X-irradiation in whole mice. / Miura Y, Anzai K, Urano S, et al. // Free Rad. Biol. Med. 1997. - Vol. 23. - P. 533-540.
105. Miura T., Muraoka S., Ogiso T. // Res. Commun. Molec. Pathol. Pharmacol. 1995. - Vol. 87. - P. 133-143.
106. Nakaya N, Lowe S.W., Taya Y. Et al.// Oncogene. 2000. Vol. 19. P. 63696375
107. Nussler K. Andreas. Inflammation, immunoregulation, and inducible nitric oxide synthase./ Nussler K. Andreas, Timothy R. Billiar// J. Leukoc. Biol.-1993. Vol.54 P.171-178
108. Orlov S.N., Dam T.V., Tremblay J.et al.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. Vol. 221. P.708-715.
109. Padmaja S. The reaction of nitric oxide with organic peroxyl radicals. /Padmaja S, Huie RE. // Biochem.Biophys. Res.Commun. 1993. - Vol. 195. - P. 539-544.
110. Pagnini U. Modulation of anthracycline activity in canine mammary tumour cells in vitro by medroxyprogesterone acetate.//Pagnini U, Florio S, Lombardi P, et all// Res Vet Sci.- 2000.-V.69.-N.3.-P. 255-62.
111. Park K.G.M. L-arginine stimulates human lymphocyte natural cytotoxicity// Park K.G.M., Hayes P.H., Garlick P.J., Erenin 0.//Proc Nutr.Soc.-l 991 -V.-50.-№2-P.-772A.
112. PommierY. Effect of dimethylsulfoxide thiorea upon intercalator-induced DNA single-strend breaks in mouse leukemia (1210) cells/ PommierY., Zwelling L.A., Matter M.r., et al.//Cancer Res.-1983.-Vol.-43,N12.*P.5718-5724
113. Postan M. Myocardial cell response to Trypanosoma cruzi infection /Postan M, Arnaiz MR, Fichera LE. // Medicina (B Aires).- 1999.-V.59 .-N.2.-P.57-62
114. Qian Shi. Influence of Nitric Oxide Synthase II Gene Disruption on Tumor Growth and Metastasis /Qian Shi, Qinghua Xiong, Bailiang Wang, et all//Cancer Research.- 2000.-V.60.-P.2579-2583
115. Quigley G.J. Molecular structure of an anticancer drug DNA complex: daunomycin plus d(CpGpTpApCpG) / Quigley G.J., Wang A. H-J., Ughetto G. et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. - 1980. - Vol 77. - N12. - P. 72047208. ■
116. Radi R., Beckman J.S., Bush K.M. et al.// J.Biol. Chem. 1991. - Vol. 266. p. -4244-4250.
117. Rogers K.E. Cell surface-mediated cytotoxicity of polymer-bond andriamycin against drug-resistant hepatocytes/ Rogers K.E., Carr B.I., Tokes Z. A.//Cancer Res.-1983.-Vol.43,N6.-P.2741-2748.
118. Romagnani P. IP-10 and Mig production by glomerular cells in human proliferative glomerulonephritis and regulation by nitric oxide.// Romagnani P, Lazzeri E, Lasagni L, Mavilia C, et all.//J. Am. Soc. Nephrol.- 2002.-V.13.-N.1.-P.53-64
119. Sacai T. Inhibition of NO synthase induction by an anticancer drug 4'-epi-doxorubicin in rats./ Sacai T., Muramatsu I., Hayashi N et al.// Gen. Pharmacol. 1996. Vol.8. - P. 1367 - 1372.
120. Sandler S. Novel experimental strategies to prevent the development oftype 1 diabetes mellitus/ Sandler S, Andersson AK, Barbu A, et all // Ups Jj
121. Med Sei.- 2000.-V. 105.-N.2.-P. 17-34
122. Shi L. Premature p34cdc2 activation reguired for apoptosis./ Shi L., Nishioka W.K., Th,ng J., et all//Science.- 1994-V.263.-P.1143-5
123. Siegert A. Nitric oxide of human colorectal adenocarcinoma cell lines promotes tumour cell invasion /Siegert A., Rosenberg C., Schmitt W.D., et all //Br J Cancer.- 2002 .-V.86.-N.8.-P.1310-5
124. Soini Y. Expression of inducible nitric oxide synthase in healthy pleura and in malignant mesothelioma./Soini Y, Kahlos K, Puhakka A, et all //Br. J. Cancer.- 2000 .-V.83.-N.7.-P.880-6
125. Shi Q. Influence of nitric oxide synthase II gene disruption on tumor growth and metastasis.// Shi Q, Xiong Q, Wang B, et all.// Cancer Res-2000.-N 60(10).-PP:2579-83
126. Terwel D. S-nitroso-N-acetylpenicillamine and nitroprusside induce apoptosis in a neuronal cell line by the production of different reactive molecules./ Terwel D, Nieland LJ, Schutte B, et all//Eur J Pharmacol.-2000 V. 14.-N.400( 1 ).-P. 19-33
127. Thomas W.J. The role of oxygen-derived free radicals and nitric oxide in cytokine-induced antiproliferation of pancreatic cancer cells.//Thomas W.J.,
128. Thomas D.L., Knezetic J.A., et all.// Neuropharmacology.-2002.- V.-42.-N.2.-P.262-9
129. Tokes Z.A. Adriamycin induced elevation of proteolitic activity measured at the cell surface PAA/ Tokes Z.A., Csipke C.P., Siegfried J.M., et all.//Cancer Res.-1981 .-Vol.41 .-P.22-28
130. Torok Natalie J. Nitric Oxide Inhibits Apoptosis Downstream of Cytochrome c Release by Nitrosylating Caspase 9 / Natalie J. Torok, Hajime Higuchi, Steven Bronk et all.// Cancer Research.- 2002.-V.62.-P. 1648-1653
131. Tritton T.R. The anticancer agent adriamycin can be actively cytotoxic without entering cells./Tritton T.R.,Yee G.//Science.-1982.-Vol.217.-P.248-250
132. Tsuji Y. Nitric oxide donors increase cytosolic ionized calcium in cultured human intestinal epithelial cells.// Tsuji Y, N Unno, MJ Menconi, et all/ Shock, -1996.V.6.-N.1.-P. 19-24.
133. Unno N; Smith M; Aguirre DE; et all.//Biochim Biophys Acta.- 1998. V.-1425>-N.l.-p. 189-203
134. Wang Hong. Quantifying cellular oxidative stress by dichlorofluorescein assay using microplate reader// Wang Hong, James A. Joseph//Free Radical Biology& Medicine.- 1999.- Vol.27-Nos.5/6-P.612-616
135. Wang H.H. B16 melanoma cell arrest in the mouse liver induces nitric oxide release and sinusoidal cytotoxicity: a natural hepatic defense against metastasis// Wang HH, Mcintosh AR, Hasinoff BB, et all. //: Cancer Res.-2000.-V.60.-N.20.-P.5862-9
136. Weinberg R. A. Oncogenes and the molecular origins of cancer / R. A. Weinberg, N.Y. Harbor // Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989. -Vol. 45. -P.235-256.
137. Xu W. Nitric oxide upregulates expression of DNA-PKcs to protect cells from DNA-damaging anti-tumour agents./Xu W, Liu L, Smith GC, Charles 1G.// Nat Cell Biol.- 2000 .-V.2.-N.6.-P.339-45
138. Yabuki M. Oxygen-dependent fragmentation of cellular DNA by nitric oxide /Yabuki M; Inai Y; Yoshioka T; et all//Free Radic Res.- 1997.-V.26.-N.3.- p245-55
139. Yalowich J.C. Mechanism of nitric oxide protection against tret-butyl hydroperoxide-induced cytotoxicity in I-NOS-transduced human erythroleukemia cells/ Yalowich J.C., Gorbunov N.V., Kozlov A.V.,et all.// Biochemistry.-1999.-Vol 33.-P. 10691 -8
140. Yamamoto S. Tumor promotion and arachidonic acid cascade//Nippon Yakurigaku Zasshi.- 1993.-V. 101.-N.6.-P. 349-61
141. Yang F., Knethen A. And Brune B. // J of Leukoc. Biol. -2000. -Vol.69. -P.916-922.
142. Yang M. Adriamycin stimulates proliferation of human lymphoblastic leukaemic cells via a mechanism of hydrogen peroxide (H202) production. /Yang M, Nazhat NB, Jiang X, et al.//Br J Haematol 1996.- Vol.95. - P. - 339-344.
143. Yang F. Modulation of nitric oxide-evoked apoptosis by the p53-downstream target p21(WAFl/CIPl)./Yang F, von Knethen A , Brune B// J. Leukoc Biol.- 2000 .-V.68.-N.6.-P.916-22
144. Yang J.Q. v-Ha-ras mitogenic signaling through superoxide and derived reactive oxygen species./Yang J.Q., Buettner G.R., Domann F.E., et all.// Anticancer Res.- 2001 .-V.21.-N.6A.-P.3949-56
145. Zagozdzon R. The potentiated antileukemic effects of doxorubicin and interleukin-12 combination are not dependent on nitric oxide production./Zagozdzon R, Giermasz A, Golab J, et all.//Cancer. Lett.- 1999.-V.-147.-N. 1 -2.-P. 67-75
146. Zhang X.M. Metastatic melanoma cells escape from immunosurveillance through the novel mechanism of releasing nitric oxide to induce dysfunctionof immunocytes. //Zhang X.M^Ca Q./ Eur. J. Surg.- 2001.- V.167.-N7.-P.484-9
147. Zweier J.L.,Wang P., Samoilov A., Kuppusamy P.//Nature Med.-1995.-Vol.l.-P.804-809.
148. Zhang Z., Naudhton D., Winyard P.G., et all.// Biochem.Biophys.Res.Commun.-1998.-Vol.249.-P.767-772.