Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Иммунотропные эффекты рекомбинантного интерлейкина-2(ронколейкина) и его влияние на цитохром Р450-зависимые монооксигеназы печени

На правах рукописи

Кидрасова Елена Николаевна

ИММУНОТРОПНЫЕ ЭФФЕКТЫ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА -2 (РОНКОЛЕЙКИНА) И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА ЦИТОХРОМ Р450-ЗАВИСИМЫЕ МОНООКСИГЕНАЗЫ ПЕЧЕНИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ).

14 00 25 — фармакология, клиническая фармакология 14 00 36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск-2007

003060823

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН и в лаборатории иммунофармакологии и иммунотоксикологии Института иммунологии и физиологии

Уральского отделения РАН

Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор Сибиряк Сергей Владимирович

доктор биологических наук, профессор Вахитов Венер Абсатарович

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Зарудий Ф А

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Теплова С Н

Ведущая организация: Российский Государственный медицинский Университет

Защита состоится в "__"_ 2007 года на заседании

диссертационного совета при Д 208 117 03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия" Росздрав РФ по адресу, 450092, г Челябинск, ул Воровского д 64

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия" Росздрав РФ

Автореферат разослан "__2007 год

Ученый секретарь диссертационного совета, Доктор медицинских наук, профессор

Телешева Л Ф

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

В настоящее время значительно возрос интерес исследователей и врачей клинической практики к препаратам рекомбинантных цитокинов Это обусловлено углублением понимания регуляторной роли цитокинов не только в рамках функционирования иммунной системы, но и всего организма, а также прогрессом в области получения рекомбинантных цитокинов и высокой эффективностью цитокинотерапии при лечении злокачественных опухолей, вирусных инфекций, иммунодефицитных состояний [Симбирцев, 2002, Rouveix et а!, 2000, Jonasch et al., 2001]

Участие цитокинов в сложной цепи нейро-иммуно-эндокринной регуляции гомеостаза, плейотропность биологической активности обусловливает то, что их введение, помимо основного иммунотропного фармакологического эффекта, сопровождается побочным действием, - изменением функциональной активности других систем организма (нервной, эндокринной, сердечно-сосудистой и пр) [Симбирцев, 2002, Черешнев и соавт, 2002] Одним из свойств цитокинов является способность изменять (как правило, угнетать) экспрессию и активности цитохром Р450-зависимых монооксигеназ печени и других тканей, - ключевой ферментной системы, участвующей в биотрансформации и детоксикации низкомолекулярных чужеродных соединений (ксенобиотиков), а также в биотрансформации липофильных эндогенных соединений [Сибиряк и соавт, 2003, 2006, Morgan, 1999] В экспериментальных и клинических исследованиях показано, что введение рекомбинантных ИЛ-1, ФНО, интерферонов I типа, приводит к угнетению окислительной биотрансформации, изменению фармакокинетики совместно вводимых лекарственных средств и, как следствие, изменению их фармакодинамики и токсичности [Сибиряк и соавт, 1990, 1995, Okuno et al, 1990, Craig et al, 1993, Rouveix et al, 2000, Sibiryak et al, 2004] В отношении цитокинов Т-хепперных клонов (ИЛ-2, ИЛ-4, уИФН, ИЛ-10) в литературе представлены довольно противоречивые результаты В частности, это касается ИЛ-2 ряд авторов отмечают способность рекомбинантного ИЛ-2 угнетать монооксигеназы при введении экспериментальным животным, или в процессе цитокинотерапии [Abdel-Razzak et al, 1993, Thai et al, 1994, Elkahwaji et al, 1999], другие исследователи отрицают влияние ИЛ-2 на монооксигеназы [Sunman et al, 2004] В отличие от провоспалительных цитокинов, для которых существует четкий параллелизм между иммунотропным эффектом и воздействием на систему цитохром Р450-зависимых монооксигеназ [Sibiryak et al, 2004], сведений о взаимосвязи иммунотропного эффекта ИЛ-2 и его влиянием на монооксигеназы нет.

Отечественный препарат дрожжевого рекомбинантного человеческого ИЛ-2, ронколейкин, активно внедряется в клиническую практику, как эффективный иммуномодулятор [Елькин и соавт, 2002, Козлов, 2002, 2006, Попович, 2004 и др ] В то же время, побочные эффекты терапии ронколейкином, в частности его влияние на систему цитохром Р450-зависимых монооксигеназ, взаимосвязь с иммунотропным действием не охарактеризованы Этот аспект действия ронколейкина представляется существенным, поскольку препарат, как, впрочем, и препараты других рекомбинантных цитокинов, нередко используется в рамках комплексной фармакотерапии, особенно в онкологии [Сепиашвили, 2001, Кислелевский и соавт,

2001, Киселева и соавт, 2001, Молчанов и соавт, 2002, Рукавицын, 2002, Попович, 2004]

В настоящее время характер окислительного метаболизма, спектр, участвующих в биотраснформации изоформ цитохрома Р450 для многих лекарственных препаратов четко установлен Имеющиеся, а также вновь установленные сведения о характере воздействия цитокинов на те или иные изоформы, позволяет предположить направленность изменений биотрансформации совместно вводимых лекарств Это определяет целесообразность создания компьютерной программы, позволяющей прогнозировать особенности фармакокинетической интерференции

Все изложенное выше и определило актуальность настоящего исследования

Цель исследования:

Оценить влияние человеческого рекомбинантного ИЛ-2 (ронколейкина) на цитохром Р450-зависимую монооксигеназную систему печени во взаимосвязи с иммунотропным эффектом в экспериментальных условиях и разработать компьютерную программу, позволяющую прогнозировать характер влияния цитокинов на биотрансформацию лекарственных средств

Задачи исследования:

1 Изучить иммунотропные эффекты ронколейкина (влияние на структуру гемограммы, пролиферативную активность и апоптоз в лимфоидных органах, субпопуляционную структуру лимфоцитов периферической крови) у интактных крыс при его введении в различных дозах

2 Изучить влияние ронколейкина на гистологическую структуру печени при его введении в различных дозах

3 Изучить влияние ронколейкина на конститутивные цитохром Р450-зависимые монооксигеназы печени

4 Изучить иммунотропные эффекты ронколейкина и его влияние на цитохром Р450-зависимые монооксигеназы печени в условиях индукции повреждения печени гепатотропными ядами

5 Разработать компьютерную программу, позволяющую прогнозировать характер изменения метаболизма лекарственных препаратов при проведении комплексной цитокинотерапии

Научная новизна:

Оценено влияние отечественного препарата дрожжевого рекомбинантного человеческого ИЛ-2 - ронколейкина на показатели пролиферативной активности, апоптоза в лимфоидных органах крыс, субпопуляционную структуру лимфоцитов периферической крови крыс при введении препарата в различных дозах Установлено, что иммуностимулирующий эффект препарата проявляется в наибольшей степени при однократном введении низких доз цитокина и выражается в стимуляции гемопоэза, активации митогенеза тимоцитов, увеличении содержания в периферической крови Т-лимфоцитов, экспрессируюгцих а-цепь рецептора к ИЛ-2

Впервые установлено, что ронколейкин, при однократном введении крысам, в зависимости от дозы, вызывает умеренные изменения гистологической структуры печени "воспалительно-дистрофического" характера, причем эффект более выражен при введении низких доз цитокина. Ронколейкин изменяет конститутивную активность цитохром Р450-зависимых монооксигеназ печени Характер влияния ронколейкина на монооксигенирование реализуется изоформами цитохрома Р450 различных подсемейств (СУР1А, СУР2В, СУР2С, СУР2Е, СУРЗА) неоднозначен В зависимости от дозы ронколейкин увеличивает, или не влияет на СУР1А-зависимую этоксирезоруфин-7-деэтилазную (ЭРОД)активность, угнетает СУР2С-зависимую дибензилфлюоресцеин-дебензилазную (ДБФД) активность, угнетает СУР2Е-зависимую р-нитрофенол-гидроксилазную (ПНФГ) активность и мало влияет на СУРЗА-зависимую эритромицин-Ы-деметилазную (ЭРНД) активность в печени Трёхкратное ежедневное введение ронколейкина в дозе 1 х 105 ед/кг не сопровождается изменениями монооксигеназных активностей

Впервые изучены иммуно-гепатотропные эффекты ронколейкина на фоне токсического гепатита, вызванного введением четыреххлористого углерода. Обнаружено, что ронколейкин при введении в дозе 1 х 105 ед /кг препятствует вызванной четыреххлористым углеродом индукции СУР2Е1, но не защищает печень от повреждения и потенцирует угнетение других монооксигеназ, а также усиливает иммунодепрессивное воздействие четырёххлористого углерода на тимоциты

Разработана компьютерная программа, позволяющая прогнозировать характер изменения метаболизма лекарственных препаратов при их совместном введении с препаратами рекомбинантных цитокинов

Научно-практическая значимость работы:

Полученные результаты способствуют расширению знаний о цитокиновой регуляции цитохром Р450-зависимых монооксигеназ и биотрансформации ксенобиотиков и метаболизирующихся цитохромом Р450 эндобиотиков, а также углубляют понимание механизмов регуляции гомеостаза при инфекции и "иммунном" стрессе Результаты работы свидетельствуют, что рекомбинантный ИЛ-2 (ронколейкин) характеризуется гепатотропным эффектом, в эффективных дозах изменяет морфо-функциональное состояние печени и ее фармако-метаболизирующую функцию Это имеет практическую значимость при проведении комплексной фармакотерапии, поскольку назначение различных лекарственных препаратов на фоне приема ронколейкина может изменить их фармакокинетику и, как следствие, фармакодинамику и токсичность

Установлено, что токсические поражения печени гепатотропными ядами являются противопоказанием для применения ронколейкина.

Создана компьютерная программа, которая на основании полученных сведений о влиянии ронколейкина на те или иные изоформы цитохрома Р450, а также данных о характере влияния других препаратов цитокинов, позволяет прогнозировать характер изменения биотрансформации лекарственных средств и оптимизировать комплексную фармакотерапии с использование цитокинов

Внедрение результатов исследования:

Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую работу в лаборатории иммунофармакологии и иммунсггоксикологии Института иммунологии и физиологии Уро РАН (г Екатеринбург), лабораторию молекулярной биологии и биотехнологии Института биохимии и генетики УНЦ РАН (г Уфа), используются

при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедре иммунологии и биохимии Челябинской государственной медицинской академии (г Челябинск), на кафедре фтизиопульмонологии Башкирского государственного медицинского университета (г Уфа)

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Дрожжевой рекомбинантный человеческий ИЛ-2 (ронколейкин) у крыс, при однократном введении, в зависимости от дозы, проявляет иммунотропный эффект, обеспечивая стимуляцию гранулоцитопоэза, и воздействует преимущественно на Т звено иммунитета, усиливая митогненез тимоцитов, экспрессию а-цепи рецептора к ИЛ-2 на зрелых Т-лимфоцитах периферической крови

2 Ронколейкин, при однократном введении в низких дозах, вызывает умеренные изменения гистологической структуры печени в виде незначительных "воспалительно-дистрофических изменений" паренхимы органа. В зависимости от дозы ронколейкин изменяет конститутивную активность цитохром Р450-зависимых монооксигеназ печени, причем характер его влияния на монооксигеназную активность изоформ различных подсемейств неодинаков - ронколейкин преимущественно активирует Ah-рецептор-зависимые изоформы (CYP1A1/2) и преимущественно угнетает изоформы подсемемейств CYP2C, CYP2E, CYP3A

3. Ронколейкин в условиях токсического поражения печени гепатотропным ядом (четыреххлористый углерод) препятствует индукции изоформы CYP2E1, но не защищает печень от повреждения, усиливает ее функциональную недостаточность и не обеспечивает коррекции нарушений иммунитета, вызванных токсикантом

4 Прогнозирование характера взаимодействия препаратов рекомбинантных цигокинов с другими лекарственными препаратами возможно в рамках компьютерной программы на платформе Microsoft NET 2 0 с применением технологии ADO NET 2 0 в среде Microsoft Visual Studio 2005

Апробация работы:

Результаты диссертационной работы доложены на научно-практической конференции "Рациональное использование лекарств" (г Пермь, 2004), 2-ой Российской школе по иммунотерапии (г. Новороссийск, 2005), Всероссийском научном симпозиуме "Цитокины Стволовая клетка" (г Новосибирск, 2005), XIII Российском национальном Конгрессе "Человек и лекарство" (г Москва, 2005), IV конференции иммунологов Урала (г Уфа, 2005), V конференции иммунологов Урала (г Оренбург, 2006), Российской конференции молодых ученых, посвященной памяти H H Кеворкова (г Пермь, 2006)

Публикации-

По материалам диссертационной работы опубликовано 9 работ Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 129 страницах, иллюстрирована 9 таблицами и 25 рисунками Она состоит из введения, обзора литературы, раздела, отражающего результаты собственных исследований и их обсуждения, заключения и выводов Список литературы включает 301 источников (88 отечественных и 213 зарубежных)

6

Благодарности'

Автор выражает глубокую благодарность программисту Курчатову П В за помощь в разработке программы для анализа характера фармакокинетической интерференции

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Материалы и методы исследования.

Работа выполнена на 200 половозрелых крысах-самцах линии WAG/Rij массой 140-160 г Животные содержались в пластиковых клетках в стандартных условиях вивария с 12-часовым световым циклом "день-ночь", получали стандартное питание и свободный доступ к воде За 12 часов до умерщвления животных кормление прекращали При работе с животными соблюдались Международные рекомендации по проведению медико-биологических исследований с использованием лабораторных животных (1989) Все болезненные манипуляции и умерщвление животных осуществляли под эфирным наркозом, по достижению животными "бокового положения"

Коммерческий препарат дрожжевого рекомбинантного человеческого интерлейкина-2 (рИЛ-2, ронколейкин) (ООО "БИОТЕХ", С -Пб ) разводили стерильным изотоническим раствором хлорида натрия и вводили внутрибрюшинно однократно в диапазоне доз от 5 х 106 ед/кг до 6 х 104 ед/кг Объем вводимой жидкости составлял I мл на 100 г массы животного Контрольные группы получали эквивалентное по объему и, в зависимости от концентрации ронколейкина, содержанию, разведенных физиологическим раствором хлорида натрия компонентов стабилизаторов ронколейкина (натрия додецилсульфат, D-маннит, дитиотреитол), предоставленной фирмой-производителем Тестирование животных осуществляли спустя 24 часа после введения рекомбинантного цитокина.

Токсический гепатит вызывали путём введения четыреххлористого углерода (CCI) в виде 50%-го масляного раствора в объеме 0,4 мл /100 г массы крысы подкожно, в течение четырех дней [Скакун и соавт, 1975, Олейник, 1983, Скакун и соавт , 1984, Виноградов и соавт , 1993] Контрольная группа получала эквивалентное количество кукурузного масла

Для анализа гемограммы кровь (200 мкл) получали у наркотизированных животных из ретроорбитапьного синуса, помещали в пробирки с сорбированным антикоагулянтом (BD) Эритроциты лизировапи добавлением 2 мл раствора CellLyse (BD), дважды омывали раствором CellWash (2 мл) (BD), ресуспендировали в растворе СеНПх (1 мл) (BD) и затем анализировали параметры прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния на проточном цитофлюориметре FASC Calibur (BD) В некоторых опытах морфологичесий состав крови анализировали традиционным методом мазки крови фиксировали метанолом и далее окрашивали по Романовскому-Гимзе, микроскопировали на световом микроскопе Jenamed-2 при увеличении х 1000

Для получения суспензий тимоцитов или спленоцитов кусочки тимуса или селезенки помещали в 0,15 M фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБР, pH 7,2) Ткань органа измельчали в стеклянном гомогенизаторе, избегая вращательных движении Клеточную взвесь фильтровали через капроновый фильтр, эритроциты лизировали раствором CellLyse (BD), клетки отмывали, ресуспендировали в ФСБР в концентрации - 1 х 10е клеток/мл и далее использовали для анализа

Анализ клеточного цикла и апоптоза спленоцитов и тимоцитов осуществляли традиционным методом окрашивания йодистым пропидием с последующей цитофлюометрией на проточном цитометре FASC Calibur (BD) Использовали стандартную процедуру окрашивания клеточную взвесь фиксировали в ледяном 70% этаноле из расчета 1 часть взвеси клеток и 9 частей этанола. Фиксированную взвесь центрифугировали в течение 5 мин (150g), супернатат удаляли и клетки ресуспендировали в гипотоническом растворе йодистого пропидия (Applechem) (0,1% цитрат натрия, 0,1% Triton Х-100, йодистый пропидий 50 мкг/мл) Далее клетки инкубировали при комнатной температуре 30 мин и анализировали на проточном цитофлюориметре Данные анализировали в рамках программного обеспечения CellQuest Оценивали величину гиподиплоидного пика (Ml), что соответствовало апоптотирующим клеткам, величину Gl /GO - пика (М2), что соответствовало покоящимся клеткам и клеткам находящимся в пресинтетической фазе, и величину SG2M — пика (МЗ), что соответствовало клетками, находящимся в фазе синтеза ДНК и митотическом цикле [Darzynkiewicz et al, 1994]

В процессе иммунофенотипирования лимфоцитов периферической крови оценивали содержание CD3+CD4+ Т-лимфоцитов-хелперов, CD3+CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов/супрессоров, а также экспрессию a-цепи рецептора к ИЛ-2 (CD25+) на CD3+ Т-лимфоцитах крови Исследование проводилось методом прямого двухпараметрического иммунофлюоресцентного окрашивания цельной крови Использовались мышиные моноклонапьные антитела против поверхностных антигенов лимфоцитов крысы и соответствующие изотипические контроли (все реактивы фирмы Caltag Labs ) - анти CD3-FITC IgM, антиС04-РЕ IgG,, антиС08-РЕ IgG|, aHraCD25-PE IgG|, IgM-FITC/IgGj-PE Результаты цитофлюорометрии обрабатывали в рамках программы программы CellQuest

Для оценки гистологической структуры печени использовали обзорные препараты Кусочки органа фиксировали в 10%фосфатно-буферном формалине и заливали в парафин С помощью микротома (Leica) готовили срезы толщиной 5 мкм, которые окрашивали по общепринятой методике гематоксилин-эозином Морфологические исследования проведены на базе лаборатории морфологии ГУЗ "Всероссийский центр глазной и пластической хирургии" Росздрава

Для оценки монооксигеназных активностей использовалась субмитохондриальная фракция печени (12000g - гомогенаты, 512-фракция), которые адекватно заменяют очищенные микросомы при определении монооксигеназных активностей [Pelkonen et al, 1974, Myers et al, 2001] Все процедуры получения S12-фракции производили на холоде (4°С) Для получения 812-фракции навеску органа помещали в 50шМ TRIS-HC1 буфер (pH 7,4), содержащий 1,15% KCl Соотношение "масса навески буфер" составляло 1 10 (вес объём) Навеску органа гомогенизировали в тефлоновом гомогенизаторе (ЗОООоб/мин, 3 мин) Далее гомогенат центрифугировали на центрифуге JUAN К23 с угловым ротором в режиме 12000g, 20 мин, 4°С Супернатант (812-фракцию) переносили в пластиковые пробирки (Costar) и хранили при -70°С Содержание белка в 812-фракции оценивали, используя метод Бредфорда и стандартный набор для определения белка ProteinAssay Kit (BioRad) Калибровку осуществляли по раствору бычьего сывороточного альбумина

Дибензилфлюоресцеин-дебензилазную (ДБФД) активность определяли флюорометрическим методом [Stresser et al, 2000, 2002] Определение 7-этоксирезоруфин-О-деэтилазной (ЭРОД) активности осуществляли по методу R Pohl и J Fouts [1980] Оценку р-нитрофенол-гидроксилазной (ПНФГ) и эритромицин-N-

деметилазной (ЭРНД) активностей осуществляли колориметрически, используя при анализе ПНФГ-активности метод, описанный [Forkert et al, 2001], а при анализе ЭРНД-активности метод [Werrigloer, 1978] При анализе монооксигеназных активностей использовались реактивы фирмы Sigma (St Louis, Mo), GENTEST (BD) Флюорометрические исследования проведены на флюориметре VersaFluor 13 (BioRad), колориметрические - на планшетном фотометре MultiskanPlus (Labsystems) Содержание общего билирубина в сыворотке (мкМ/л) определяли по методу Иендрашика-Грофа, используя стандартный набор реагентов "БИЛИРУБИН-НОВО" (Вектор-Бесг, г Новосибирск)

Активность аланинаминотрансферазы (АЛТ) в сыворотке оценивали кинетическим методом при 25°С на анализаторе Reflotron (Roche), используя стандартные тест - полоски REFLOTRON GPT ("сухая" химия)

Содержание малонового диальдегида (МДА) исследовали биохимическим методом, предложенным И Д Стальной и Т Г Гаришвили [1977]

Статистическую обработку результатов исследования проводили стандартными методами вариационной статистики в рамках программного обеспечения Statistica для Windows, версия 6 0 Для отрицания "нулевой" гипотезы использовались, в зависимости от характера распределения, групповой t-критерий Стьюдента для независимых признаков или параметрические критерии различии Различия между группами считались статистически значимыми при Р<0,05 При Р<0,10 различия расценивались как тенденция к увеличению или снижению значений [ Трахтенберг и соавт, 1991]

Результаты исследования и их обсуждение.

В первой серии экспериментов было изучено влияние ронколейкина при его введении крысам в различных дозах и режимах на показатели гемограммы периферической крови, пролиферативную активность и апогггоз в лимфоидных органах, фенотипические особенности Т-лимфоцитов периферической крови, а также гистологическую структуру печени и конститутивные монооксигеназные активности

При введении в максимальной дозе (5 х 106ед /кг) ронколейкин вызвал статистически значимый лейкоцитоз (содержание лейкоцитов увеличивалось на 52,2 %, Р=0,03), однако существенного изменения структуры лейкограммы не наблюдалось Введение рекомбинантного цитокина в дозе 2,5 х 10 ед/кг не приводило к нарастанию числа лейкоцитов в целом, но значимо изменялась структура гемограммы нарастало процентное содержание лимфоцитов, а доля моноцитов и палочкоядерных гранулоцитов достоверно снижалась При однократном введении в дозе 1x10 ед /кг статистически значимых изменений числа лейкоцитов и структуры гемограммы по сравнению с контрольной группой животных ронколейкин не вызывал При дальнейшем снижении дозы (5 х 105 ед/кг) вновь наблюдался лейкоцитоз (число лейкоцитов возрастало на 34 %, Р=0,04), причем при последующем снижении дозы цитокина эта тенденция сохранялась, но статистически значимых различий с контролем не было При введении в дозе 5 х 105 ед /кг изменений структуры гемограммы не было, но введение в 2,5 х 105 ед/кг ронколейкина вызывало стимуляцию гранулоцитопоэза (возрастало процентное содержание молодых и зрелых форм гранулоцитов и уменьшалась "доля" лимфоцитов) Введение ронколейкина в дозе 1 х 105 ед/кг не вызвало статистически значимых изменений гемограммы, а введение в минимальной дозе приводило к снижению содержания лимфоцитов Трехкратное ежедневное введение препарата в дозе 1 х I05 ед/кг не изменяло структуры гемограммы

Аналогичные данные были получены при анализе относительного содержания клеток в регионах мононуклеаров и гранулоцитов, полученных при анализе параметров светорассеяния клеток на проточном цитофлюориметре В этом случае статистически значимое возрастание относительного содержания клеток в регионе гранулоцитов наблюдалось в группе животных, получавших ронколейкин в дозе 2,5 х 10 ед /кг, в остальных случаях значимых различий не было

Таким образом, влияние рекомбинантного ИЛ-2 (ронколейкина) на показатели лейкограммы интактных крыс при его однократном внутрибрюшинном введении в диапазоне доз от 6 х 104 ед/кг до 5 х 106 ед/кг не характеризуется ни прямой, ни обратной доза - зависимостью Интерпретация полученных данных достаточно сложна, поскольку ИЛ-2, будучи продуктом активированных Т-лимфоцитов, контролирующим их экспансию и пролиферацию, обеспечивает не только "цитокиновую поддержку" Т-клеточного иммунного ответа, но и индуцирует продукцию других цитокинов (особенно в высоких дозах), в частности, гематопоэтических колониестимулирующих факторов и цитокинов-регуляторов гемопоэза (ГМ-КСФ, ИЛ-3, ИЛ-5), провоспалительных цитокинов ФИО, ИЛ-1, ИЛ-12 [Возианов и соавт, 1998, Ветра и соавт, 2000, Ярилин, 2000, Le Gros et al, 1987, Kupper et al, 1987, Cuturi et al, 1989, Warren et al, 1996, Mehrotraet al, 1998] Полученные нами результаты согласуются с данными других авторов, - в зависимости от дозы, состояния иммунной системы, режима введения ИЛ-2 может вызвать разноплановые изменения гематологических показателей [Егорова и соав, 1999, Козлов, 2002, Hladik et al, 1994, Elias et al, 2004, Morgan et al, 2005] He исключено, к примеру, что наблюдаемый при введении высокой дозы ронколейкина лейкоцитоз является следствием индукции выброса провоспалительных цитокинов

Для более детальной характеристики иммунотропного эффекта далее была изучена пролиферативная активность и апоптоз клеток лимфоидных органов (тимус и селезенка) после однократного введения рекомбинантного цитокина

При однократном внутрибрюшинном введении в диапазоне доз от 2,5 х 106 ед/кг до 5 х 105 ед/кг ронколейкин статистически значимо не влиял на пролиферативную активность и апоптоз спленоцитов При введении в дозе 1 х 10б ед /кг ронколейкин вызывал статистически значимое снижение величины диплоидного пика на цитофлюорограммах (Р=0,01), те количества клеток, находящихся в фазе покоя и пресинтетической фазе клеточного цикла (G1/G0-клеток) При этом наблюдалась тенденция к возрастанию величина SG2M - пика, что в совокупности свидетельствует о возрастании митотического потенциала клеток, а индекс пролиферации статистически значимо возрастал (рисунок 2) Дальнейшее снижение дозы цитокина в диапазоне от 5 х 105 ед/кг до 1 х 105 ед/кг существенно не изменяло митотической активности спленоцитов и их апоптоза. В минимальной дозе (6 х 104 ед/кг) вновь проявлялось активирующее влияние ронколейкина на митогенез спленоцитов

В диапазоне доз от 2,5 х 106 ед /кг до 5 х 105 ед /кг ронколейкин статистически значимо не влиял на пролиферативную активность и апоптоз тимоцитов Однако, при снижении дозы (2,5 х Ю5 ед/кг и 1 х 105 ед/кг) проявлялось отчетливое тимус-стимулирующее действие препарата - ронколейкин статистически значимо увеличивал величину SG2M - пика и, следовательно, количество митотически активных клеток

011 1. (ЛО. J 1

¥ V РН г, I *

1 О л: П.Г . '

V и К11-ЧШ1

: г м 5 ^ ии..., ,

. Г.1 ' 1 I , - ; . ■

I Г С N [Оу 1 1 ТЫ

;

|1 V

ГО ' ТО

Рисунок 1. Цитофлюорограммы, иллюстрирующие ДНК-структуры клеточного цикла и апоптоза тимоиитов и спленоцитов, окрашенных йодистым про пи днем (ТАСЗСаиЬиг)

М1 - гиподиплоидные (апоптотирующие) клетки; М2 - диплоидный пик (СЮ01) Ш - 8С.2М - пик

160 п

140 120 100

зо -60 4020 о

1

т

4Ж

и-

О Иналчс пролиферации т имоцитаи □ Индекс прслиф»ра4ии СППОНОЦИТФЯ

Рисунок 2. Влияние ронколейкина на индекс пролиферагивиой активности гимопитов и спленоцитов.

I [о оси ординат: показатели в % от та коп их в контрольной группе (100%) Но оси абсцисс: 1 - контроль, 2 - ронколейкин 2,5 ч !06 ед./кг, 3 - ронколейкин I х Ю6 ед./кг, 4 - ронколейкин 5 х 105 ед./кг, 5 - ронколейкин 2,5 х 10( ед./кг, 6 - ронколейкин 1 х 10^ сд./кг, 7 - ронколейкин Ь х 101 ед./кг

При этом содержание клеток, находящихся в фазе покоя, имело тенденцию к снижению, а индекс пролиферации значимо возрастал В минимальной дозе (6 х 104 ед/кг) наблюдаемая закономерность сохранялась, однако различия не были статистически значимы Уже в ранних работах было показано, что ИЛ-2 является ключевым цитокином, контролирующим развитие тимоцитов, обеспечивающим их пролиферацию и защищающим от апоптоза, функцию ЭКТ [Ярилин, 1999, Kintzel et al, 1991]

Ранние тимоциты экспрессируют рецептор к ИЛ-2 и мРНК ИЛ-2, а добавление экзогенного ИЛ-2 в культуры фетальных тимоцитов или его введение индуцирует пролиферацию тимоцитов [Tonbio et al, 1989, Mashnski et al, 1992, Varas et al, 1997] Судя по полученным данным, оптимальный тимус-стимулирующий эффект при экзогенном введении рекомбинантного цитокина проявляется при использовании невысоких доз препарата, что согласуется с данными других исследователей [Varas et al, 1997] Закономерен активирующий эффект рИЛ-2 на клетки периферических лимфоидных органов Очевидно, что "отвечающими" клетками в этом случае являются как зрелые примированные Т-лимфоциты, для которых ИЛ-2 является фактором экспансии [Ярилин, 1999], так и, опосредованно, В-лимфоциты Не удивительно, что дозовая зависимость влияния ронколейкина на спленоциты иная, нежели для клеток тимуса.

Одним из ведущих, клинически значимых эффектов ИЛ-2 при его введении пациентам с иммунологической недостаточностью является восстановление субпопуляционной структуры Т-лимфоцитов [De Paoli, 2001] В этой связи, представлялось особо интересным оценить характер влияния ронколейкина на субпопуляционную структуру Т-лимфоцитов периферической крови, а также экспрессию a-цепи рецептора к ИЛ-2 на СОЗ+Т-лимфоцитах, как показателя активации Т-кпеток В этих экспериментах ронколейкин вводили в дозах, обеспечивающих тимус-стимулирующий эффект, 2,5 х 105 ед/кг и 1,0 х 105 ед/кг Результаты иммунофенотипирования представлены на рис 3

При введении в дозе 2,5 х 105 ед/кг содержание CD4+ Т-лимфоцитов практически не изменялось, а при введении меньшей дозы (1,0 х 105 ед/кг) ронколейкин вызывал тенденцию к увеличению содержания CD4+ Т-хелперов, однако достоверных различий с контрольной группой животных не было Содержание CD3+CD8+ лимфоцитов в группах животных, получавших ронколейкин, по сравнению с контрольной группой также не изменялось В то же время, при введении рекомбинантного ИЛ-2 в дозе 2,5 х 105 ед/кг прослеживалась отчетливая тенденция (Р=0,07) к увеличению содержания Т-лимфоцитов, экспрессирующих а-цепь рецептора к ИЛ-2 (CD3+CD25+ лимфоцитов) в периферической крови, а при введении препарата в дозе 1,0 х 105 ед/кг содержание СШ5-экспрессирующих Т-лимфоцитов возрастало почти в 2 раза, и различия с контрольной группой были статистически значимы Полученные результаты подтверждают иммунотропный эффект рекомбинантного ИЛ-2 (ронколейкина), при его введении в невысоких дозах направленный на индукцию Т-клеточных механизмов

Кгжгроль

V -002

sï ~

■■ 1 d 10 10 10 Îtr CMfnC

N tC* C.T tr

РоиколсИкПН, l

I SRit-j «t

Контроль Ронколейкин 2,5 Ронкелейкин 1,0 ï 105 ед./кг x 105 ед7кг

□ CD3+C04+ nCD3+CDâ+ EU CD3+CD2S+

Рисунок 3. Влияние ронкотейкииа ira содержание основных субпшуляимй Т-лимфоцитов (CD3+CD4+ и CD3+CD8+) и Т-лимфоцитов, э кспрессирующих а-цспь рецептора к ИЛ-2 (CD3+CD25+) в периферической крови контрольных крыс и крыс, получавших различные дозы препарата.

Вверху: Цитофлюорограммы, иллюстрирующие ai i ал из Субпопуляций CD3+CD4+ лимфоцитов и CD3+CD25+ лимфоцитов в периферической крови контрольной крысы, н крысы, получавшей Ронколейкин

Внизу: Показатели u%«i таковых » контрольной группе - 100 %

В целом, данные, полученные в результате анализа иммунотрогшых свойств рекомбинантного ИЛ-2 (ронколейкина) при его Однократном внутрибрюш и н ном введении ингакгным крысам, демонстрируют, что эффект рекомбинантного цитокина я значительной мере зависит от дозы. Причем иммуностимулирующее действие проявляется при введении относительно невысоких доз препарата, в диапазоне от 6 х !0а до 2,5 х 105 ед,/кг, что проявляется усилением пролифератнвного потенциала спленоцитов или тимоцитов, тенденцией к нарастанию С04+ Т-лимфоцигов в циркуляции, возрастанию числа Т-лимфоцитов, экспрсссируюпшх «-цепь ИЛ-2Р.

На следующем этане исследовании были оценены гистоморфологические изменения в печени при введении ронколейкина. Через 24 часа после введения ронколейкина в дозе 5 х I О6 ед,/кг, на обзорных препаратах печени в отличие от крыс контрольной группы часто встречались гипертрофированные ядра гепатоцитов с одним или двумя ядрышками, Л при введении ронколейкина в дозах 2,5 х И)6 ед. /кг в венозных сосудах определялись умеренные признаки ста!а крови При введении ронколейкина в диапазоне доз от 1 х 106 ед. /кг до 5 х I (У ел. /кг изменения гистологической структуры печени были несколько более выражены, чем при его введении в высоких дозах. На некоторых срезах отмечались признаки мелковакуольной жировой дистрофии цитоплазмы гепатоцитов в области отдельных портальных трактов и явления застоя плазмы крови и отдельных центральных венах, В таких участках синусоиды вокруг центральных вен несколько расширялись.

При введении ронколейкина в диапазоне доз от 2,5 к 105 да IX 10 ед./кг описанные изменения сохранялись: в печени нередко обнаруживались участки клеток с вакуолизированной цитоплазмой, хсття при этом структура ядер в клетках не изменялась (рис, 4). В пери портальных областях иногда обнаруживались небольшие по площади лимфопитарные инфильтраты. В портальных кровеносных сосудах таких участков выявлялись признаки стаза элементов крови, синусоиды были расширены. Желчные протоки и крупные кровеносные сосуды не изменялись.

Рисунок 4. Гистологическая структура печени крыс при введении ронколейкина н

дозе 2,5 х 105 ед./кг

В минимальной дозе б х 10 ед. /кг ронколейкин вызвал неоднородные морфологические изменения в печени. Большей частью паренхима печени состояла из мелких равномерно окрашивающихся гепатоцитов, выстроенных в характерные балочные структуры. Ядра печеночных клеток с крупными глыбами хроматина были четко очерчены. Дистрофические изменения Р цитоплазме гепатоцитов не обнаруживались. В синусоидах хорошо просматривались веретеновидные

14

синусоидальные клетки Обращали на себя внимание признаки стаза крови в отдельных портальных венах и артериях В таких зонах паренхимы печени, где эти явления наблюдались, синусоидные капилляры были расширены и содержали элементы крови В некоторых участках печени, независимо от локализации в дольке, выявлялась мелкоочаговая пролиферация купферовских клеток

Таким образом, введение рекомбинантного ИЛ-2 - ронколейкина вызвало умеренные изменения гистологической структуры печени, максимально выраженные именно при введение низких доз цитокина, т е имелся определенный параллелизм между иммунотропным эффектом Существенно, что описываемые морфологические изменения не сопровождались негативной динамикой биохимических показателей -активность сывороточной аланинаминотрансферазы (AJTT), уровень общего билирубина, а также содержание малонового диальдегида в гомогенатах печени крыс, получавших ронколейкин по сравнению с контрольной группой животных, оставались неизменными, независимо от дозы введенного цитокина. Отсутствие повреждений гепатоцитов выгодно отличает ронколейкин от рекомбинантных интерферонов и рекомбинантных провоспалительных цитокинов Введение рекомбинантных интерферонов, как в экспериментальных условиях, так и в клинических ситуациях, вызывает развитие синдрома цитолиз гепатоцитов, а введение высокой дозы рекомбинатного ИЛ-1 (6 х 106 ед/кг) вызывает выраженную дистрофию гепатоцитов и резкое нарушение внутрипеченочной гемоциркуляции [ Ахматов А Т, Сибиряк С В , 2004, Shibayama, 1992, Wang et al, 1995, Shirasugi et al, 1997, Bradham et al, 1998]

Для анализа влияния ронколейкина на функциональную активность монооксигеназной системы печени были использованы субстраты, позволяющие судить о монооксигеназной активности изоформ цитохрома Р450, различающихся по механизмам транскрипционной регуляции экспрессии генов и регуляции монооксигенирования

Метаболизм этоксирезоруфина - О-деэтилирование осуществляется, в основном, изоформами цитохрома CYP1AI и CYP1A2, которые отвечают преимущественно за трансформацию полициклических планарных соединений [Щербаков и соавт, 1994, Guengerich et al, 1982, Ryan et al, 1990] Особенностью этих изоформ является то, что регуляция транскрипции генов этих изоформ осуществляется через арилуглеводородный рецептор (Ah-рецептор) [Nebert et al, 2004] При введении ронколейкина в высоких дозах 5 х 106 ед/кг и 2,5 х 106 ед/кг статистически значимых изменений CYP1 AI-зависимой ЭРОД-активности по сравнению с контрольными группами не было (рисунок 5) При введении ронколейкина в дозе I х 106ед/кг, скорость монооксигенирования этоксирезоруфина несколько снижалась, при дальнейшем снижении дозы до 5 х 105 наблюдалось нарастание ЭРОД-активности (статистически достоверных отличий от контроля не было, из-за значительной вариабельности результатов) Однократное введение препарата в дозы 2,5 х 105 ед/кг вызвало достоверную индукцию ЭРОД-активности (рис 5) При дальнейшем снижении дозы ЭРОД активность оставалась повышенной, по сравнению с контрольной группой, но достоверных отличий не было Таким образом, влияние ронколейкина на активность Ah-рецептор-зависимых изоформ цитохрома Р450 зависело от дозы, угнетающего эффекта выявлено не было, более того, рИЛ-2 вызывал индукцию цитохрома Р450

Использование дибензилфлюоресцеина в качестве селективного субстрата для оценки монооксигенирования, осуществляемого подсемействами изоформ цитохрома Р450 CYP2C и CYP3A предложено сравнительно недавно [Stresser et al, 2000, 2002]

Рисунок 5 Влияние ронколейкива на монооксигенаэные активности в 8-12 фракции гомогенатов печени крыс. Показатели представлены в % к контрольным значениям. По оси абсцисс; 1 - контроль, 2 - ронколейкин. 5 х 10'' ед./кг, 3-ронколейкин 2,5 \ 106 ед./кг, 4 - ронколейкин 1 х Ю6 ед./кг, 5 - ронколейкин 5 х 105 ед./кг. 6 - ронколейкин 2,5 \ 105 ед/кг, 7 -ронколейкин 1 х 105 ед./кг, 8 - ронколейкин 6 х 104 ед./кг

При этом, как уже отмечалось, что в отличие от человека, у которого в гепатоцитах преобладает экспрессия изоформ CYP3A (CYP3A4), у крыс преобладает экспрессия изоформ CYP2C (CYP2C6/7) Транскрипционная регуляция генов CYP2C и CYP3A сопряжена с ядерными "orphan" рецепторами (PXR, CAR, RXR) [Quttrochi, Gusehan, 2003] В диапазоне доз от 5 до 2,5 х 106 ед /кг ронколейкин не изменял ДБФД-активности При введении препарата в дозе 1 х 106 ед/кг скорость монооксигенирования дебензилфлюоресцеина несколько возрастала, однако статистически значимых различий с контрольной группой не было При снижении дозы до 5 х 105 ед/кг наблюдалось незначительное снижение ДБФД-активности, а при введении в дозах 2,5 х 105 ед/кг и 1 х 105 ед/кг отмечалась статистически значимое снижение СУР2С-зависимой ДБФД-активности Однократное введение ронколейкина в дозе 6 х 104 ед/кг не вызвало статистически значимых изменений Полученные результаты свидетельствуют, что введение ронколейкина в невысоких дозах угнетает у крыс СУР2С-зависимое монооксигеирование

N-деметилирование эритромицина селективно осуществляется изорформами подсемейства CYP3A [Guengerich et al, 1982, Ryan et al, 1990, Hiñes et al, 2001, Quattrochi et al, 2001] Характер изменения эритромицин-Ы-деметилазной активности (ЭРНД) при введении Ронколейкина в различных дозах иллюстрирует рисунок 5 Видно, что статистически значимых изменений скорости деметилирования эритромицина в субмитохондриальной фракции гомогенатов печени не было, независимо от дозы введённого цитокина

Гидроксилирование /^-нитрофенола осуществляется, изоформой CYP2E1, которая отвечает преимущественно за трансформацию низкомолекулярных ксенобиотиков - спиртов, кетонов, а также четырёххлористого углерода, бензола, толуола, анилина [Сибиряк и соав, 2003, Guengerich et al, 1982, Ryan et al, 1990, Morel et al, 2000] Изоформа CYP2E1 является, в некоторой мере, уникальной, поскольку железо гема цитохрома находится в ней исходно в высокоспиновом состоянии Для индукции этой изоформы нет необходимости в синтезе белка de novo, а в процессе индукции, CYP2E1 генерирует свободные радикалы и является одной из наиболее "прооксидантных" изоформ [Щербаков и соавт, 1994, Гуляева и соавт, 1994, 1997, Morel et al, 2000] Роль CYP2E1 в организме очень важна, учитывая участие в биосинтезе регулирующих сосудистый тонус производных арахидоновой кислоты [Сибиряк и соавт, 2006] При введении в максимальной дозе (5 х 106 ед /кг) ронколейкин статистически значимо, резко, снизил CYP2E1-зависимую ПНФГ-активность При введении в дозе 2,5 х 106 ед /кг ронколейкин не изменял интенсивности метаболизма р-нитрофенола. При дальнейшем снижении дозы постепенно нарастало угнетающее воздействие в дозах 1 х 106 ед /кг и 5 х 105 ед /кг ронколейкин вызывал тенденцию к снижению ПНФГ-активности, а при ведении в дозах 2,5 х 105 ед/кг и 1 х 105 ед/кг статистически значимо снижал ПНФГ-активность При введении в минимальной дозе рекомбинантный цитокин не изменял биотрансформации р-нитрофенола. Таким образом, введение рИЛ-2 оказывало однонаправленный ингибиторный эффект на монооксигеназную активность, реализуемую изоформой CYP2E1

Суммируя результаты проведенных исследований можно заключить, что введение дрожжевого рекомбинантного IL-2 (ронколейкина) изменяет состояние цитохром Р450-зависимой монооксигеназной системы печени, причем характер влияния цитокина на конституитивную активность тех или иных изоформ неоднозначен и определяется дозой введения цитокина На основании полученных данных можно говорить о параллелизме между иммунотропными и гепатотропными

эффектами рИЛ-2 - наиболее отчетливо влияние рИЛ-2 проявлялось именно при введении невысоких доз препарата, которые обеспечивают иммунотропный эффект и его влияние на Т звено иммунитета Этот факт хорошо согласуется с современным представлением о тесной связи между иммунной и монооксигеназной системами, которые можно рассматривать как систему "иммунохимического гомеостаза" [Ковалев и соавт, 1994, Сибиряк и соавт, 2003,2006]

Наши результаты свидетельствуют об индуцирующем воздействии рИЛ-2 на изоформы подсемейства 1А, отсутствии влияния на изоформы подсемейства CYP3A и преимущественно ингибиторном воздействии на изоформы подсемейства CYP2C и CYP2E Эти данные частично противоречат результатам, полученным другими исследователями Обнаружено, что бактериальный рИЛ-2 при введении крысам (125*106 ед/кг) или мышам (50 000- 250 000 ед/мышь) приводит к удлинению гексобарбиталового сна, угнетению метаболизма бензпирена, этилморфина, этоксирезоруфина, амидопирина, бензфетамина, пентоксирезоруфина, эритромицина, активности эпоксидгидролазы Это сопровождается падением суммарного уровня цитохрома Р450 в микросомах печени и белков изоформ, относящихся к различным подсемействам (CYP1A, 2В, 2С, 2D, ЗА) [Ansher et al, 1992, Abdel-Razzak et al, 1993, Thai et al, 1994]

По данным Tinel и соавторов [1995], рИЛ-2 снижает уровень иммунореактивных белков CYP1A2, 2В1/2, 2С11, ЗА2, 2D1 Этот эффект устраняется введением в среду антител против ИЛ-2Р или ингибитором тирозинкиназы -генистеином В то же время, некоторые исследования подтверждают полученные нами данные и свидетельствуют о способности рИЛ-2 индуцировать дебризохин и буфуралол-гидроксилазы (CYP2D), 7-этоксикумарин-О-деэтилазу (CYP1A1/2) и бензферамин-Ы-деметилазу [Morgan, 2001] Нельзя не обратить внимание и на различные технологии получения рекомбинантных бактериальных и дрожжевых цитокинов В чем причина разнопланового влияния ронколейкина на цитохром Р450"7 Влияние цитокинов на монооксигеназы, в конечном счете, связано с изменением транскрипции генов различных изоформ В свою очередь, механизмы транскрипционной регуляции генов различных изоформ неодинаковы Это механизмы, связанные с ретиноид-Х-рецептором активируемыми индукторами пролиферации пероксисом [Ge et al, 1998, Denison et al, 1995, Savas et al, 1999, Aranda et al, 2001, Hines et al, 2001, Quattrochi et al, 2001, Kliewer et al, 2001] В свою очередь, различные цитокины имеют индивидуальные сайты связывания в регуляторных участках генов изоформ, или контролируют активность транскрипционных факторов [Сибиряк и соавт, 2006] Способность к связыванию зависит от дозы цитокина [Hakkola et al, 2001]

Одной из точек приложения влияния рИЛ-2 на активность AhR-зависимых монооксигеназ может быть сигналлинг, связанный с ретинобластомным белком (Rb) Наличие в домене арилуглеводородного рецептора субъединицы LXCXE, ответственной за взаимодействие с основным белком, контролирующим переход клетки из G1 в S фазу - белком ретинобластомы Rb, обеспечивает возможность контроля клеточного цикла при активации AhR [Hines et al, 2001, Ge et al, 1999] В покоящихся клетках, ретинобластомный белок находится в гипофосфорилированном (активном) состоянии, для перехода клеток в фазу синтеза, необходима инактивация этого белка путем гиперфосфорилирования циклин-зависимыми киназами Активация арилуглеводородного рецептора приводит к освобождению ингибитора циклин-зависимых киназ и нарушению процесса гиперфосфорилирования

ретинобластомного белка, в результате чего не происходит освобождения

18

субъединицы ( 2 Г, контролирующей транскрипцию генов фазщ синтеза и остановка клеточного цикла ¡liines et al , 2001; Kolluri et at, 1999). Не менее решающим для судьбы клеток является взаимодействие ари л углеводородного рецептора и транскрипционного фактора NFkB (Tjan et al, 19991. В свою очередь, механизмы регуляции клеточного цикла Ш1-2 в имму некомпетентных клетках, тесно сопряжены с системой Rb-эависимого контроля клеточного цикла [Kolenko et al., 1997; Flores et al., 1999; Ertesvag et al., 2002; Colombetti et al., 2006],

Каковыми бы не были механизмы влияния, с прикладной точки зрения ешжно, что и рамках комбинированной фармакотерапии с использованием цитокипов и, в частности, ронколейкина, возможно нарушение фармакокинетических параметров лекарств, мегаболизируемых различными изоформами цитохром Р450, Следовательно, и изменение их фармакодинамики и токсичности.

Генатотропимс и иммунотрфПные эффекты ронколейкина и условиях индукции токсического поражения печенн;

В настоящее время ронколейкип активно используется в терапии вирусных гепатитов [Лобзин и со авт., 2000]. В то же время, результаты проведенных экспериментов, в частности, выявленная способность ронколейкина внгибировать CYP2E1-зависимое монооксигеннровамис при введении в дозах, одновременно обеспечивающих иммунотропный аффект, закономерно поставили вопрос о возможности использования рИЛ-2 при таком токсическом поражении печени, при котором существенное п атотоксикологи ч ее кое значение имеет индукция CYP2EI, к примеру, CCLj-инду пиропам ном гепатит Известно также, что формирование ССЦ-инду цированногО гепатита сопровождается выраженной иммуносупресеией [Нот el al., 2000}.

Четырехкратное введение СС14 вызывало формирование токсического поражения печени, что было документировано как морфологически, гак и при оценке биохимических показателей. Hâ обзорных срезах печени отчетливо прослеживались резкая вакуолизация гепатоцитов, появлялись очаги некроза, нарушалась архитектоника печеночной паренхимы, наблюдалась резкая яеривазальная инфильтрация и геморрагическое пропитывание паренхимы печени.

Введение ронколейкина на фоне индукции токсического гепатита существенно не изменяло патогистологической картины (рис 6).

Рисунок6. Гистологическая структура печени крысы, получавшей ССI., и ронкояе&шн

В группе крыс, получавших С С Ц более чем 6-ти кратно возрастала активность сывороточной АЛТ (298,2 ± 56,0 МЕ/л, протйв 42.2 ± 4,1 МЕ/л в контрольной группе, ¡' < 0.05). что свидетельствовало о цитолизе гепатоцитов. В гомогенатах печени возрастало содержание конечного продукта липопероксидацнн, - МДА (0, 104 ± 0,015 нМ/мг против 0, 053 ± 0,006 нМ/мг в контрольной группе, Р < 0.05). Ронколейкин, при введении на фоне четыречхлористого углерода снижал содержание МДА (0, 053 + 0,006 нМ/мг, Р < 0.05 в сравнении с группой, получавшей только СС14)однако активность АЛТ была практически идентична таковой в группе крыс, получавших только СС14 (266,9 ± 60.8 МЕ/л).

Ведение СС|4 приводило к глубокой депрессии ЭР ОД-активности, ДЬФД-акзивности, ЭРНД-акгИВНость имела тенденцию к снижению, а ПНФГ-активность значимо возрастала (рис. 7). Причем имелась высокая ранговая корреляция между уровнем ГШФ1 -активности и уровнем МДА в контрольной группе (1^=0.70, Р=0.01), чзо подтверждает роль СУР2Е1 как источника свободных радикалов. Депрессия остальных видов активности связана, скорее вест, с повреждением гепатоцитов и свидетельствует о глубоком нарушении функциональной активности печени

Рисунок 7. Изменение монооксигеназных активностей в субмитохоядриапьной фракция печени крыс при токсическом поражении, вызванном четыреххяориешм углеродом, и при введении ронколейкина иптактным крысам и на фоне ССЦ.

Введение ронколейкина на фоне четыреххлори сто го углерода приводило к усилению депрессии СТР1А1/2-зависимой ЭРОД активности, СУР2С-завнснмой ДЬФД-активности, интенсивность СУРЗД-зависимою демезилирования эритромицина существенно не изменялась. Что касается СУ02Е1 -зависимой ПНФГ-акгивности, то сам ронколейкин, как и в предшествующем эксперименте, Икгибкровал ее и устранял индукщио, вызванную ССЗд.

Развитие токсического гепатита сопровождалось и мму носу премией, - СС14 вызывал значимое усиление апоптоза спленоцитов и супрессию митогекеза тимоцитов Ронколейкин устранял апонзотенныЙ эффект четыреххлористого углерода на Спленониты, по усиливал антимитотическое воздействие зоксиканта на тимопиты (табл. 1).

Таким образом, вопреки ожиданиям, ронколейкин при введении на фоне токсического СС14- индуцированного гепатита несмотря на снижение индукции изоформы цитохрома Р450 СУР2Е1 и, как следствие, уменьшение липопероксидации в печени, не препятствовал повреждению печени, потенцировал угнетающее воздействие четыреххлористого углерода на другие изоформы цитохрома, усугублял функциональную недостаточность гепатоцитов В последние годы установлено, что механизмы формирования СС14- индуцированного гепатита связаны не только, и не столько, с генерацией свободных радикалов, но с "цитокиновым" повреждением гепатоцитов Гепатотропные яды (ССЦ и диметилнитрозамин) индуцируют в печени продукцию ФНО, экспрессию апоптогенных ФНО-рецепторов 1 типа [Нот е1 а1, 2000], индуцируют гибель гепатоцитов по механизму, связанному с экспрессией апоптогенного белка р21 [ЯегГаэ е1 а!, 2006]

Как бы то ни было, полученные результаты свидетельствуют о том, что использование ронколейкина при токсических поражениях печени вряд ли целесообразно, а явления токсического гепатита могут рассматриваться, как противопоказания к применению этого цитокина

Таблица 1

Влияние четыреххлористого углерода, ронколейкина и их комбинированного введения на показатели апоптоза и митогенеза спленоцитов и тимоцитов крыс_

Группа животных (п) Спленоциты, относительное содержание клеток, % Тимоциты, относительное содержание клеток, %

Апоптоз (М1 -пик) 00/01 (М2-пик) БЮМ (МЗ-пик) Апоптоз (М1 -пик) 00/01 (М2-пик) Б02М (МЗ-пик)

1 Контроль (п = 12) 2 ССЦ, четырехкратно, п/к, (п= 18) 3 Ронколейкин, однократно, 1 х 10 ед/кг (п = 10) 4 ССЦ + Ронколейкин (п = 12) 0,9±0,2 1,5±0,2* 1,0±0,2 1,3±0,3 89,7±1,1 89,1 ±0,7 89,3±1,4 89,4±0,8 6,5±1,0 6,8±0,4 6,3±0,5 7,2±0,5 1,3±0,1 1,3±0,2 0,8±0,1 1,6±0,3 81,9±2,0 72,7±4,4 80,0±2,4 67,9±6,9* 6,2±0,5 4,7±0,4* 7,6±0,4* 3,9±0,6*

Примечание М1 - гиподиплоидный пик - апоптотирующие клетки, М2 диплоидный пик (0001) - покоящиеся клетки, МЗ - пик (802М) - клетки, находящиеся в фазе синтеза ДНК и митотическом цикле

Компьютерная программ» ирогноча изменений бнотрапсформацни фармакологических препаратов в условии* комплексной цитокино- и фа рма котерапн н

Программа разработана для платформы Microsoft .NET 2.0 с применением технологии ADO.NET 2 0 в среде Microsoft Visual Studio 20(15 (рис. 8). Для долговременного хранения данных используется технология XML- Для работы программы необходимо наличие Microsoft .NET Framework 2.0. Работа программы СОСТОИТ из циклов запросов Пользователя к данным и ответов программы. В качестве долговременного хранилища используемых данных выступают файлы в формате XML. I ipn запуске данные загружаются в память, после чего пользователь посредством Щонного интерфейса может формировать параметризованные запросы, анализировать результаты работы программы, а также изменять данные. В качестве базы данных о характере биотрапсформации лекарств сведение представленные на сайте http://www.dmi.ecoreetown.edu. Первый этап работы программы предполагает работу исследователя, который в режиме диалогового окна "Данные " вводит интересующие его изоформЫ, интересующий препарат цитокинов, а также, на основании собственных исследований или данных литературы характер воздействия препарата пито Кино В на ту, или иную изоформу цитохрома Р450 (рис. 9).

ДИНЧт-" ¿fctSfW* ¡¿iWl CnpAft*-»

♦ MnrApflfWlOe Iii4ft»n«! *

* i^ffiM^?^

iv.f

it-Tfi' rs-i T'n-Hi-:-»

С101С y*

Ç&Ki

r. i f»

Рисунок 8 Работа и диалоговом окне "Данные" компьютерной программы для изучения взаимодействия рекомбинантных ниток и пои и других фармакологических препаратов на уровне окислительного метаболизма

В режиме "Данные - изоформы цитохрома" исследователь первоначально осуществляет ввод названия интересующих его изоформ цитохрома Р450. Затем, в режиме диалогового окна "Данные - воздействующие препараты" осуществляется ввод названия воз действу ющего препарата и ввод характера влияния этого препарата на те, или иные изоформа цитохрома Р450. Использование соответствующих "управляющих клавиш" предполагает возможность добавления названий препаратов. Далее, в рамках работы диалогового окна "Данные - Препараты" осуществляется запрос об особенностях окислительной биотрансформации того или иного препарата из списка, имеющегося в базе данных. При этом возможно дополнение списка е

указанием характера их биотрасфор Mai ш и с помощью соответствующих "управляющих клавиш".

Рисунок 9. Работа в диалоговом окне "Анализ" компьютерной программы для изучения взаимодействия рекомбинангных цитокинов и других фармакологических препаратов на уровне окислительного метаболизма

Следующий этап работы программы предназначен как для самого исследователя, гак и для аользоватедей. В рамках диалогового окиа "Ананиз" осуществляется ввод препарата шпокина и совместно вводимого препарата и выясняется характер фар макоки нети ческой интерференции.

выводы

1. Дрожжевой человеческий рекомбинантный ИЛ-2 (ронколейкин) при однократном введении крысам проявляет иммунотропное действие и изменяет клеточный состав крови. В зависимости от дозы ронколейкип индуцирует лейкоцитоз {5 х 1|Сг ед./кг и 5 х tOs ед. /кг), активирует лимфопеш (2,5 х 10й ед./кг) или гранулоЦИтопоЭз (2,5 х 10! ед./кг), стимулирует митотичеекий потенциал спленоцитов {1 х 106 ед./кг и 6 х Ю4 ед/кг) и тимоцитов (2,5 х 105 ед/кг и 1 х Ш5 ед./кг), при введения а низких дозах ронколейкип вызывает тенденцию к увеличению содержания CD3+CD4+ Т-лимфоцитов (1 х 10s ел./кг) в периферической крови и индуцирует экспрессию а,-цепи рецептора к ИЛ-2 на Т-лимфоцитах (2,5 х ÍJP сд/кг и 1 х 105 ед./кг).

2. Ронколейкип, яри однократном введении, вызывает зависимые от дозы изменения ги его логической структуры печени в виде умеренных дистрофических изменений гепигоцитов и инфильтрации паренхимы клеточными элементами upo пи. Преимущественно монояуклеарного ряда. Эти изменения более выражены при введении низких доз рон колей кип а (2.5 х 10' ед/кг я 1 х 1ед./кг) и ис сопровождаются повреждением гепатоцитов, холестатом и интенсификацией липопероксидации в печени.

3. Ронколейкин изменяет конститутивную активность шттохром Р450-завиеимых МО) то кеи ген аз в печени. Влияние ронколейкин на изоформы цвтохрома F450

различных подсемейств неодинаково и зависит от дозы: при введении в дозе 2,5 х 105

ед./кг ронколейкин иидуцирует CYP1A1/2-зависимое деал кэширование эгоксирезоруфина {ЭРОД-активность): в диапазоне доз от 1 до 2,5 х 105 сд./кг

ронколейкин угнетает СУР2С-зависимое дебензилирование дибензилфлюоресцеина (ДБФД-активность), ронколейкин не изменяет интенсивности СУРЗ А-зависимого № деметилирования эритромицина (ЭРНД-активность), при введении в дозе 5х106 ед /кг, а также в диапазоне доз от 1 до 2,5 х 105 ед/кг ронколейкин угнетает СУР2Е1-зависимое гидроксилирование р-нитрофенола (ПНФГ-активность)

4 На фоне введения гепатотропного яда (четыреххлористого углерода) ронколейкин (1 х 105 ед/кг) устраняет индукцию СУР2Е1 и снижает интенсивность липопероксидации в печени, но не препятствует повреждению паренхимы органа и потенцирует вызванное токсикантом угнетение монооксигеназ изоформ СУР1А1/2 и СУР2С

5 Ронколейкин при введении на фоне гепатотропного яда не обеспечивает полноценной коррекции неблагоприятного воздействия четыреххлористого углерода на иммунную систему ронколейкин уменьшает анопто генное действие четырёххлористого углерода на спленоциты, но не устраняет антимитотические воздействия токсиканта на тимоциты

6 Разработана пользовательская программа, позволяющая прогнозировать изменение метаболизма и активности некоторых препаратов при их использовании в комплексной фармакотерапии с рекомбинантными цитокинами

Практические рекомендации:

При назначении рекомбинантного ИЛ-2 (ронколейкина) в рамках комплексной фармакотерапии желательно учитывать особенности биотрансформации совместно вводимых препаратов, и в зависимости от изменении их биотрансформации осуществлять коррекцию их терапевтической дозы Применение рекомбинантного ИЛ-2 (ронколейкина) не целесообразно при токсических поражениях печени и токсические гепатозы являются противопоказанием для применения этого цитокина.

Список публикаций по теме диссертационной работы

1 Шамова (Кидрасова) Е.Н Влияние Ронколейкина на пролиферативную активность и апоптоз в лимфоидных органах у крыс / Шамова (Кидрасова) Е Н, Сибиряк С В // Рациональное использование лекарств Мат научн практ Конференции- Пермь -2004.-Ч 2 - С 48-49

2 Шамова (Кидрасова) Е Н Влияние человеческого рекомбинантного 1Ь 2 (Ронколейкина) на конституитивные монооксигеназные активности печени у крыс МУАО/Яу / Шамова (Кидрасова) Е Н, Сибиряк С В , Нигматуллина Э А //Тез XIII Росс Национ Конгр "Человек и лекарство"- Москва. - 2006 -С 126

3 Кидрасова КН Иммуногрогшые эффекты человеческого рекомбинантного ИЛ-

2 (Ронколейкина) у крыс и его влияние на цитохром Р450-зависимые монооксигеназы

печени / Сибиряк С В, Кидрасова ЕН// Вестник Уральскон Медицинской академической науки -2006 •№ 1 ■ С 98-104

4 Шамова (Кидрасова) Е Н Гепатотропные эффекты человеческого рекомбинантного ИЛ-2 (Ронколейкина) у крыс / Шамова (Кидрасова) Е Н, Сибиряк С В , Нигматуллшга Э А Н Цитокины и воспаление -2005 -№ 3 -С 149

5 Кидрасова Е H Влияние человеческого рекомбинантного IL 2 (Ронколейкина) на цитохром Р450-зависимые монооксигеназные активности и фармакометаболизирующую функцию печени / Кидрасова Е H, Сибиряк С В, Нигматуллина Э А // Иммунология Урала - 2005 - № 1 (4) - С 158 - 159

6 Шамова (Кидрасова) Е H Иммунотропные эффекты человеческого рекомбинантного IL 2 (Ронколейкина) у крыс / Шамова (Кидрасова) Е H, Сибиряк С В, Вахитов В А // Тез Межд Конгр "Иммунитет и болезни от теории к терапии" - Москва - 2005 - С 56

7 Кидрасова Е H Отсутствие защитного эффекта Ронколейкина при поражении печени, вызванного гепатотропным ядом / Кидрасова Е H, Сибиряк С В // Вестник Уральской Медицинской академической науки - 2006 - № 3 (1) - С 85 - 87

8 Кидрасова Е H Характеристика функционального состояния печени и некоторые иммунологические показатели при введении Ронколейкина у крыс WAO/Rij в условиях токсического гепатита, вызванного четыреххлористым углеродом / Кидрасова Е H, Сибиряк С В , Вахитов В А // Иммунология Урала. -2006 -№ 1 (5) - С 15-16

9 Шамова (Кидрасова) Е Н Изменение структуры гемограммы и субпопуляционной структуры лейкоцитов при введении Ронколейкина у крыс WAG/Rij / Сибиряк С В , Шамова (Кидрасова) Е Н , Юсупова Р Ш //Тез Межд Конгр "Иммунитет и болезни от теории к терапии" - Москва - 2005 - С 56

г

¿¡—-jv Отпечатано с готовых диапозитивов в ООО «Принт+»,

заказ № 105, тираж 100 шт, 450054, пр Октября, 71