Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Взаимодействие иммунной системы и монооксигеназной системы печени в фармакологическом эффекте иммуностимуляторов: теоретические и прикладные аспекты

РГБ ОД

2 г,- на правах рукописи

Сибиряк Сергей Владимирович

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ И МОНООКСИГЕНАЗНОЙ СИСТЕМЫ ПЕЧЕНИ В ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОМ ЭФФЕКТЕ ИММУНОСТИМУЛЯТОРОВ : ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ

14.00.25 - фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Уфа - 1996

Работа выполнена в Башкирском государственном медицинском

университете

Научные консультанты: доктор биологических наук, лауреат Государственной премии СССР,

С.А. Сергеева

доктор медицинских наук, профессор P.P. Фархутдинов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор A.C. Закс доктор медицинских наук, профессор В.И. Ратников доктор медицинских наук, профессор Х.М. Насыров

Ведущее учреждение: Российский Государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова

Защита состоится "¡996 года в часов на заседании диссертационного Совета (Д 084.35.01) при Башкирском государственном медицинском университете по адресу: 450000, Уфа, ул. I Лени на., д.З

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке БГМУ

Ученый секретарь диссертационного Совета: доктор медицинских наук,

профессор Э.Г. Давлетов

Автореферерат разослан 1996 года

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Обширный фактический материал свидетельствует об угнетении цитохром P-450-зависимых монооксигеназ печени при введении различных стимуляторов иммунитета, равно как и при развитии бактериальных и вирусных инфекций.

Нет сомнения, что иммунная система и система микросомального окисления тесно взаимосвязаны. Новые данные о роли цитокинов (интерферона, семейства интерлейкин-1 -подобных цитокинов и др.) в депрессии синтеза цитохрома Р-450 и монооксигеназных активностей (Siijita К., et al., 1990; Moochhala Sh., Renton К., 1991; Wright К.,Morgan E., 1991; Kudo Sh., et al., 1991; Clark M., et al., 1994 и др.) подтверждают это.

Большинство исследований носит, однако, феноменологический характер. Концептуальный подход характерен для работ А.С. Закса и соавторов (1976, 1987), D. Nebert и соавторов (1981), И.Е. Ковалева и соавторов (1977 - 1994), касающихся, в основном, проблем рецепции ксенобиотиков и иммунологических аспектов множественности форм цитохрома Р-450. В рамках концепции «иммуно-химического гомеостаза» (И.Е.Ковалев и соавт.,1994) иммунная и монооксигеназная системы рассматриваются как единая система распознавания и элиминации чужеродных высокомолекулярных (иммунная) и низкомолекулярных (монооксигеназная система) соединений с однотипными принципами функционирования и взаиморегуляцией. Некоторые из выдвигаемых авторами положений противоречивы и не находят экспериментального подтверждения.

Имеется дефицит исследований, сопоставляющих «спектр» иммунотропного действия тех или иных препаратов с их влиянием на цитохром P-450-записимые монооксигеназы. Поскольку эффект любого иммуностимулятора определяется дозой, режимом введения и, что особенно важно, той «модельной системой», в которой рассматривается его эффект, проведение параллелей между влиянием на микросомальное

окисление и иммунотропным действием возможно лишь при максимально многогранной оценке последнего. Нередко не принимается к сведению и то, что многие синтетические иммуномодуляторы являются субстратами цитохрома Р-450.

Нет ясности в вопросе влияния индукции или ингибиции микросомальныхферментов печени на иммунореактивность и активность иммуностимуляторов. В рамках концепции «иммунохимического гомеостаза» иммунная и монооксигеназная системы находятся в реципрокных взаимоотношениях: если иммуностимуляция ведет к депрессии микросомального окисления, то индукция монооксигеназнои активности приводит к иммунодепрессии. Детальный анализ литературы не позволяет провести такой параллели.

Актуальна проблема комбинированного применения иммуностимуляторов с другими фармакологическими препаратами и между собой с целью повышения эффективности иммунокоррекции (Д.Н.Лазарева, Е.К.Алехин, 1985; Е.К.Алехин, С.В.Сибиряк, 1987; Е.К.Алехин и соавт.,1993; Алехин Е.К., Лазарева 1994). Часто остается неясной роль фармакокинетической интерференции в конечном эффекте комбинаций. Нередко депрессия микросомального окисления рассматривается исключительно в контексте побочных эффектов иммуностимуляции (J.Descotes et al., 1985-1992). Всегда ли ингибицию микросомального окисления при введении иммуностимуляторов можно рассматривать как проявление побочного действия, и нет ли принципиальной возможности использовать позитивную сторону этого эффекта. С другой стороны, столь же важно исследование возможности применения индукторов микросомального окисления для устранения депримирующего влияния иммуностимуляторов на процессы биотрансформации в печени при сохранении основного эффекта иммуностимулятора.

Ключевые позиции в цепи нейро-эндокринно-иммунных взаимодействий занимают опиатные пептиды, глюкокортикоиды, интерлейкин -1 и интерферон. Выброс интерлейкина-1 и других «ранних» цитокинов, активация ими супраоптико-гипофизарно-адреналовой

системы и увеличение эмиссии глюкокортикоидов - центральное звено «острофазного ответа», как универсального проявления иммунного стресса ( Baumann Н., Gauldie J.,1994; Deuren M.,et al. 1992). Биотрансформация глюкокортикоидов, как впрочем и многих других эндогенных соединений (половых стероидов, арахидонатов, витамина D), осуществляется системой цитохром P-450-зависимых монооксигеназ печени. На сегодняшний день не существует какой бы то ни было концепции о месте ингибиции микросомального окисления в цепи событий ответа «острой фазы».

Анализ взаимосвязи иммунотропного эффекта и влияния на фармакометаболизирующую функцию печени особо интересен для класса азольныхсоединении. Производные азолов, рассматриваемые как преимущественно ингибиторы микросомальных монооксигеназ (Murray М., 1987), наряду с широким спектром фармакологических активностей, в подавляющем большинстве обладают системными иммуномодулирующими свойствами, вполне отвечая принципу «аддерентной иммунокоррекции» ( В.И.Ратников,1988). В НИИ фармакологии РАМН разработаны и внедрены актопротекторбеметил и антигипоксанттомерзол, проявляющие иммунотропную, антирадикальную и антимутагенную активности (В.И.Ратников,1990; С.Б.Середенин, А.Д.Дурнев, 1992). Это, однако, не умаляет актуальности поиска новых активных соединений данного класса. Вероятно, соединения с подобным фармакологическим эффектом нуждаются в отличной от обычных иммуноадыовантов и нммуносупрессоров стратегии скрининга и анализа механизма действия, позволяющей выявить различные стороны фармакодинамики и их взаимосвязь.

Работа выполнялась в рамках НИР «Фармакология обмена веществ и гомеостаза» по планам Научного Совета по фармакологии и фармации при Президиуме АМН СССР (N госрегистрации 01910020189).

Основная часть работы выполнена на кафедре фармакологии Башкирского Государственного медицинского института. Отдельные фрагменты работы выполнены на базе НИИ фармакологии РАМН (г.Москва), лаборатории иммунологии и иммунофармакологии

Всероссийского центра пластической хирургии глаза (г.Уфа), научно-исследовательском технологическом институте гербицидов и регуляторов роста растений (г.Уфа), институте молекулярной патологии и экологической биохимии СО РАМН (г.Новосибирск).

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Целью исследования явилось выявление закономерностей взаимодействия иммунной системы и монооксигеназной системы печени в условиях введения иммуномодуляторов, что необходимо для оптимизации иммунокорригирующей терапии, а также формирование комплексного подхода к созданию новых азольных иммуномодуляторов и анализу механизма их действия.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Выяснение взаимосвязи между иммунотропным эффектом различных по природе иммуномодуляторов и их влиянием на метаболизирующую функцию печени в условиях системной оценки иммунореактивности -антиинфекционной резистентности, противоопухолевого иммунитета, трансплантационного иммунитета, активности макрофагов, гуморального и клеточного иммунных ответов.

2. Изучение иммунотропного действия (активность макрофагов, гуморальный, клеточный иммунный ответ) ингибиторов и индукторов микросомального окисления, а также влияния некоторых фармакологических препаратов-регуляторов активности цитохром Р-450-зависимых монооксигеназ печени на активность иммуностимуляторов.

3. Изучение влияния иммуностимуляторов на специфическую активность фармакологических препаратов (психотропных средств), метаболизирующую функцию печени и иммунореактивность в условиях комбинированного применения.

4. Анализ взаимодействия нейроэндокринной, иммунной и монооксигеназной систем печени в ответе организма на бактериальные иммуностимуляторы.

5. Сравнительный анализ иммунотропных свойств

фармакологических препаратов-производных азолов, разработка подходов к компьютерному дизайну активных иммуномодуляторов этого класса и выявлен не фармакофоров, ответственных за иммунотропную активность.

6. Поискактивныхиммуномодуляторовсредипроизводныхтиетанил-и тиазоло [3,2-а] бгнзимидазола и системный анализ влияния наиболее активного соединения на иммунореактивность, микросомалыюе окисление и свободно-радикальные процессы.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

В работе впервые проведен сравнительный анализ влияния различных по структуре и происхождению иммуностимуляторов (бактериальные ЛПС и протеогликаны, иммуноактивные пептиды, левамизол, нулеинат натрия и др.) в зависимости от дозы, способа и режима введения, природы иммуностимулятора на процессы микросомалыюго окисления в печени и иммунореактивность (активность макрофагов, первичный гуморальный и клеточный иммунные ответы, антиинфекционную и противоопухолевую резистентность,трансплантационный иммунитет), а также сравнительный анализ влияния различных по составу, вновь выделенных, ЛПС грам-негатниных бактерий на активность цитохром P-450-зависимых монооксигеназ печени, активность макрофагов и процессы перекисного окисления липидов в печени.

Выявлено, что депримирующее влияние иммуностимуляторов на микросомалыюе окисление в печени зависит от их способности активировать макрофаги, но не направленности влияния на Гуморальный и клеточный ответ, противоопухолевую резистентность и трансплантационный иммунитет. Депрессия микросомалыюго окисления в печени при введении различных по химическому составу бактериальных Л ПС пропорциональна степени стимуляции макрофагов - поглотительной активности, интенсивности «респираторного взрыва», секреции «ранних» цитокинов (IL-1, TNF), а также интенсивности процесса перекисного окисления липидов в печени.

Установлено, что для синтетических иммуномодуляторов (левамизол, циметидин, новые производные тиетанилбензимидазола),

метаболизирующихся в печени и являющихся субстратами цитохрома Р-450, корреляция между степенью активации макрофагов и депрессией микросомального окисления прослеживается не всегда. Конечный эффект зависит от прямых и опосредованных влияний на цитохром Р-450.

Впервые проведен сравнительный анализ иммунотропного эффекта ингибиторов (циметидин, левомицетин) и индукторов (фенобарбитал, рифампицин, зиксорин) микросомального окисления в условиях комплексной оценки иммунных функций. Выявлено, отсутствие реципрокных изменений иммунореактивности как при индукции, так и при ингибиции метаболической функции печени. Установлено отсутствие зависимости между иммунотропным эффектом циметидинаи его влиянием на микросомальные ферменты печени в зависимости от режима введения препарата. Показано, что при отсутствии интерференции иммунотропных эффектов иммуностимулятора и индуктора микросомального окисления, последний устраняет депрессию цитохрома Р-450, вызванную иммуностимулятором (ЛПС), сохраняя или усиливая иммуностимулирующий эффект. В свою очередь, иммуностимуляторы -ингибиторы микросомального оксиления, опосредованно через изменение процесса биотрансформации, изменяют специфическй эффект психотропных средств.

Впервые изучена динамика изменений уровня глкжокортикоидов, активности макрофагов и метаболизирующей функции печени при введении иммуностимуляторов бактериальной природы (ЛПС, мурамилдипептид). Полученные результаты позволили сформулировать гипотезу о роли цитокин-опосредованной депрессии цитохрома Р-450 в регуляции ответа «острой фазы».

Впервые проведен сравнительный анализ иммунотропного эффекта различных азольных иммуномодуляторов и предложена классификация иммуноактивных азольных соединений и препаратов, основанная на химической структуре соединений, проведен компьютерный анализ "структура-активность", молекулярный дизайн потенциальных иммуномодуляторов в ряду азолов, обнаружены фармакофоры, ответственные за иммунотропную активность.

Проведен поиск иммуноактивных соединений среди 12 -ти вновь синтезированных производныхтиетанил-итиазоло[3,2-а]бензимидазола. Выявлено наиболее активное соединение - калиевая соль 2-[1-(1,1 диокситиетанил-3)-бензимидазолил-2-тио]уксусной кислоты (лабораторный шифр К-134). Проведен системный анализ иммунотропного эффекта соединения К-134, изучено влияние соединения К-134 активность цитохром Р-450-зависимых монооксигеназ, процессы свободно-радикального окисления. Таким образом, выявлен новый класс синтетических иммуномодуляторов, регулирующих активность цитохром Р-450-зависимых монооксигеназ печени и проявляющих антиоксидантную активность.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ И ВНЕДРЕНИЕ РАБОТЫ

В результате исследований установлены закономерности взаимодействия иммунной системы и монооксигеназеной системы печени в условиях фармакологической стимуляции иммунореактивности и предложена гипотеза о роли депрессии микросомального окисления в развитии «иммунологического стресса». Выявлены рациональные и нерациональные сочетания иммуномодуляторов (Т-активииа, продигиозана) с препаратами, вызывающими индукцию или ингибицшо цитохрома, в том числе и с психотропными средствами (нейролептики, антидепрессанты). Экспериментально обоснована возможность использования индукторов микросомального окисления (знксорин, рифампицин) для коррекции нарушений метаболизирующей функции печени, вызванной введением иммуностимуляторов без изменения основного эффекта последних. Результаты работы открывают перспективные направления для научных исследований: анализ взаимодействия микросомального окисления, оксидантного метаболизма и иммунных функций всамом фагоците и возможность фармакологической коррекции этих процессов, поискрациональныхметодовфармакотерапии и иммуномодуляции в условиях инфекции с учетом влияния препаратов на процессы монооксигенирования и оксидантный метаболизм.

Экспериментально реализован системный подход к созданию и

поиску новых синтетических иммуномодуляторов, включающий компьютерный дизайн структур с потенциальной активностью в пределах изучаемого класса соединений, анализ иммунотропной активности с использованием интегральных моделей и дифференциальной оценки иммунотропного эффекта в условиях моделей, позволяющих оценить активность регуляторных клеток. Сформулирована необходимость обязательной оценки влияния препаратов и соединений на микросомальную активность печени и свободно-радикальные процессы.

Эти исследования позволяют наметить дальнейшие пути изыскания и изучения новых высокоэффективных средств коррекции иммунных функций организма.

В результате работы показано наличие иммунотропной активности у нового класса азольных соединений - производных тиетанилбензимидазола и обнаружено наиболее активное соединение -калиевая соль 2-[1-(1,1 диокситиетанил-3)-бензимидазолил-2-тио]уксусная кислота. Это соединение сочетает свойства иммуномодулятора, регулятора активности микросомальных ферментов и антиоксиданта.

Материалы работы вошли в методические рекомендации МЗ России «Рациональное применение иммуностимуляторов» (1991), использованы в монографии «Иммунотропные свойствалекарственныхсредств»( 1993). Исследования включены в программу ГНТП «Создание новых лекарственных средств методами химического и биологического синтеза», направление 01. В рамках этой программы на кафедрах фармакологии и фармацевтической химии Башкирского государственного медицинского университета проводятся дальнейшее изучение иммунофармакологической активности и токсикологических параметров калиевой соли 2-[1-(1,1 диокситиетанил-3)-бензимидазолил-2-тио] уксусной кислоты, разрабатывается ВФС, ТУ, готовятся материалы для представления в Фармкомитет России. Некоторые из предложенных автором оптимальных комбинаций иммунотропных средств успешно используются в лечебных учреждениях г.Уфы. Теоретические аспекты работы включены в преподавание курсов фармакологии и иммунологии в Башкирском

Государственном медицинском университете.

Под руководством автора защищены две кандидатских диссертации.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

Депрессия микросомального окисления в печени при введении иммуностимуляторов определяется их способностью активировать макрофаги, но не влиянием на гуморальный и клеточный иммунные ответы, трансплантационный и противоопухолевый иммунитет. Прямая взаимосвязь между иммунотрорпным эффектом и влиянием на микросомальные ферменты печени возможно только в том случае, если иммуностимулятор не оказывает прямого влияния на цитохром Р-450-зависимые монооксигеназы. Депрессия микросомальногоокисления при введении макрофагальных стимуляторов является компонентом "острофазного ответа" и направлена на восстановление уровня глюкокортикоидов и оксидантного равновесия и пропорциональна степени активации фагоцитов.

Индукция или ингибиция микросомальных ферментов печени не вызывает реципрокного изменения иммунореактивности (активности фагоцитов, гуморального и клеточного ответов). Индукция микросомальных ферментов печени усиливает иммунотропный эффект бактериальных Л ПС. Принципиально возможно применение иммуностимуляторов для модуляции специфического эффекта фармакологических препаратов при одновременной стимуляции иммунореактивности и использовании индукторов микросомального оксиления для коррекции побочных эффектов иммуностимулирующей терапии без потери основного эффекта иммуностимулятора.

Разработана классификация азольных иммуномодуляторов, выявлены общие закономерности иммунотропного действия и фармакофоры, ответственные за иммунотропный эффект. Это позволяет оптимизировать синтез и скриниг активных иммуномодуляторов.

Выявлен новый класс иммунотропных веществ - производные тиетанилбензимидазола. Среди изученных соединений максимальной активностью характеризуется калиевая соль 2-[1-(1,1 диокситиетанил-

3)-бензимидазолнл-2-тно]уксусная кислоты. Фармакологический эффект тиетанилбензимидазолов характеризуется сочетанием системного иммунорегуляторного действия, модуляции активности цитохром Р-450-зависимых монооксигеназ печени и антиоксидантных свойств.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Диссертационная работа обсуждена на заседании Республиканской проблемной комиссии «Фармакология» и Всесоюзной проблемной комиссии «Фармакология обмена веществ и гомеостаза» Научного совета по фармакологии и фармации при Президиуме АМН СССР (1990), неоднократно обсуждалась на заседаниях общества фармакологов и токсикологов Республики Башкортостан (1988 -1996). Материалы работы неоднократно докладывались на регионарных и Российских научных и научно-практических конференциях, VI-м Всесоюзном съезде фармакологов (1988), 1-м Всероссийском съезде фармакологов (1995), II - 111 Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (1994, 1995), 1-м Всесоюзном съезде иммунологов (1989), 1-м съезде иммунологов России (1992), III Всесоюзном совещании по химическим реактивам (1989), международных конференциях по иммунореабилитации (19921993), IV международной конференции по психонейроиммунологии (1995).

ПУБЛИКАЦИИ.

По материалам диссертации опубликовано 38 печатных работ из них 2 авторских свидетельства, монография.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ.

Диссертация изложена на 268 страницах машинописи имеет традиционную структуру, включает 54 таблицы, 41 рисунок. Библиография представлена 546 отечественными и зарубежными работами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Работа выполнена на неинбредных белых мышах обоего пола, мышах линии СВА, С57В1/6, (CBA*C57BI/6)F1, BALB/C, СЗН. Животные получены из питомника «Рапполово» РАМН , частично - из питомника лабораторных животных НПО «Иммунопрепарат» г.Уфы и питомника «Столбовая» г.Москвы. В экспериментах использованы половозрелые мыши массой от 16 до 20 г. Животные содержались в пластиковых клетках в стандарных условиях, получали стандартное питание. Опытные и контрольные группы содержались в строго идентичных условиях. Эксперименты проводились также на половозрелых неинбредных крысах обоего пола массой 140-160 г (питомник «Рапполово» РАМН).

Водорастворимые препараты и соединения разводили физиологическим раствором хлорида натрия, водонерастворимые препараты и соединения готовили в виде взвеси в 0.5% крахмальном геле. Контрольные группы животных получали физиологический раствор хлорида натрия или крахмальный гель в тех же объемах, способах и режиме введения, что и опытные группы животных. Объем вводимой жидкости не превышал 0.5 мл/10 г массы животного.

Острую токсичность препаратов и соединений определяли методом J. Litchfield и F.Wilcoxon (М.Л. Беленький, 1963) и экспресс-методом (В.Б. Прозоровский и соавт., 1978). 1. Оценка активности монооксигеназной системы печени.

Для оценки активности монооксигеназной системы печени использованы прямые и косвенные методы. Определение продолжительности сна (наркоза), вызванного внутрибрюшинным введение гексенала - 60 мг/кг, как интегральный тест оценки активности смешанных оксигеназ печени, проводили традиционным методом (А.А.Каспаров, И.В. Саноцкий, 1986; Ryan D., Levin W., 1990). Время сна учитывалось как время между потерей и приобретением «рефлекса переворачивания». Во время снаживотные находились втермостатируемой камере (26 ± 1 °С).

Фракцию микросом печени мышей получали методом дифференциального центрифугирования (Ahokas J. et al., 1977).

Концентрацию белка в микросомальной фракции определяли методом Лоури в модификации Hartree Е. et al. (1972). Содержание цитохромов Р-450 и Ь5 определяли оригинальным методом Oniura Т. и Sato R. (1964). N-деметилазную активность микросом печени оценивали по скорости деметилирования аминопирина с образованием формальдегида; о р-гидроксилазной активности микросом судили по скорости гидроксилирования анилина и образования р-аминофенола (И.И. Карузина, А.И. Арчаков, 1977). Реакционная система включала 40 гаМ tris-H Cl буфера, 16 mM MgC12, 3 шМ НАДФ*Н и 0.5 -1.5 мг белка микросом. Концентрации конечных продуктов расчитывали по калибровочным кривым, построенным по стандартным растворам формальдегида и р-аминофенола соответственно. 2. Иммупофармакологические и иммунологические методы исследования.

Экспериментальнуюлетальную инфекцию у мышей воспроизводили, согласно общепринятым методам (З.В. Ермольева и соавт.,1976) путем внутрибрюшинного введения 1.25 - 2.0 DL50 суточной культуры Ps. Руосуапеа. Оценивалась выживаемость животных и средняя продолжительностьт жизни.

О состоянии противоопухолевого иммунитета судили по динамике роста привитыхеолидных опухолей саркомы S-180 (неинбредные мыши) и меланомы В-16 (мыши линии C57BL/6). Штаммы опухолей получены из банка ВОНЦ РАМН. Имплантацию материала осуществляли стандарнтным методом (З.П. Софьина и соавт.,1979).

Аллотрансплантацию кожного лоскута у мышей.осуществляли по методу Billinngham R. и Medawar Р. в модификации Р.В. Лиознера и соавторов (1971) в различных гистонесовместимых системах: доноры -мышилинийС57ВЬ/6(гаплотипН-2Ь),Ва1Ь/С(гаплотипН-2а), реципиенты - мыши линии СВА (гаплотип Н-2к).

Адъювантный артрит воспроизводили на крысах традиционным методом (C.B. Сибиряк и соавт.,1985). Аутоиммунную гемолитическую анемию воспроизводили на мышах-самках линии СЗН, путем еженедельной инокуляции ксеногенных эритроцитов (A.B. Максимов, 1983).

Для оценки поглотительной функции макрофагов в системе in vivo

(п основном купферовских клеток печени и селезеночных макрофагов) использован тест клиренса коллоидного угля в варианте, описанном в руководстве Hudson L. и Hay F. (1989). Мышам внутривенно вводили желатинизированный коллоидный уголь (160 мг/кг). В течение 12 минут с интервалом 2 минуты -производили забор крови (25 мкл) из контрлатерального синуса. Пробы вносили в 2 мл 0.15% раствора карбоната натрия и спектрофотометрировали (675 им). Результат выражали в виде абсолютного значения клиренса и корригированного значения фагоцитоза, в котором учитывалась масса органов РЭС - печени и селезенки (А.Д. Адо, 1961; Benacerraf В. et al., 1954).

Поглотительную активность макрофагов в системе in vitro оценивали стандартным способом по фагоцитозу микросфер латекса с последующим подсчетом числа фагоцитирующих клеток и количества поглощенных частиц.

Оценку интенсивности кислородзависимого метаболизма (мембраносвязанных НАДФ*Н-оксидазных систем) фагоцитов производили в монослое или суспензионной системе, используя традиционный НСТ-тест (Д.Н. Маянский, 1985). Учитывали процент диформазан-позитивных клеток и средний цитохимический коэффициент (ЦХК). В работе использован водорастворимый НСТ-хлорид (Merk) в конечной концентрации 0.2% (0.15М фосфатно-буферный солевой раствор, pH 7.2 - 7.4).

Генерацию активных форм кислорода (АФК) фагоцитами оценивали также по интенсивности люминол-зависимой хемилюминисценции суспензии фагоцитов (см. ниже)

Секреторную активность фагоцитов оценивали в системе in vitro, используя культуру мононуклеаров периферической крови здоровых доноров. Взвесь мононуклеаров получали на градиенте фиколл-изопака (Flow Ьав). Мононуклеары инкубировали с исследуемыми препаратами и соединениями 4-24 часа. Уровень цитокинов - интерлейкина-1 (IL-lß), опухоль-некротнзирующего фактора (TNFa) и a-интерферона (I FNa) в супернатантах культур определяли твердофазным ИФА, применяя коммерческие тест-системы ProConILIß, ProConTNFa, ProConIF-2plus

(НИИ ОЧП, С,- Пб.).

О состоянии гуморального иммунного ответа судили по числу антитело-образующих клеток (АОК) в селезенке мышей, иммунизированных эритроцитами барана. Число АОКопределяли слайд-методом Cunnengham A. et al. (1966) на 5 сутки после иммунизации. Животных иммунизировали внутрибрюшинно оптимальной (2*108 Эр/ мышь) и толерогенными дозами - гипериммунной (2*109 Эр/мышь) и субоптимальной (2*107 Эр/мышь), что позволяет оценить состояние регуляторных популяций (Ts, Tlh, T2h) иммунокомпетентных клеток (Nagai К. et al.,1986).

Для оценки состояния клеточного звена иммунореактивности использовали модель контактной гиперчувствительности замедленного типа, вызванную аппликацией 2,4-динитрофторбензола (Serva) в модификации, описанной Phanupak Р. и соавторами (1974). Причем использовали как сенсибилизирующие (25 мкл 0.5% раствора ДНФБ), так и толерирующие, гипериммунные (150 мкл 0.5% раствора) дозы (Claman Н., Miller, 1976; Sy М. et al.,1977).

Уровень кортизола в сыворотке определяли с помощью стандартных наборов СТЕРОН-1251 радиоиммунологически или твердофазным ИФА (Nova Path Cortisol, Bio Rad).

3. Методы оценки свободно-радикальных процессов.

Генерацию АФК в суспензии фагоцитов или цельной крови оценивали по интенсивности люминол-зависимой хемшиоминисценции. Инкубационная среда включалаО. 15М растворхлорида натрия, содержащий 10"бМ люминола. Свечение измеряли нахемшноминомере ХЛ-003 МСКБ «Союз», проверку стабильности работы прибора и пересчет результатов измерений проводили относительно эталона свечения (СФХМ-1, ГОСТ 9411-81), имеющего интенсивность излучения 500000 квант/с, принятой за 1 относительную единицу светосуммы.

Суммарный «оксидантный потенциал» ткани, характеризующий как состояние антиоксидантных систем, так и процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали регистрируя Ре++-индуцированную хемилюминисценцию гомогената ткани (Р.Р.Фархутдинов, В.А.

Лиховских, 1995).

Инкубационная система включала гомогенат печени в калий-фосфатном буфере (20 шМ КН2Р04, 105 шМ KCl, pH 7.45, белок гомогената 1 мг/мл). Перекисное окислении инициировал и добавлением в среду 50 шМ раствора FeS04*7H2O до конечной концентрации 2.5 шМ при термостатировании и постоянном перемешивании реакционной смеси (800 об/мин). Учитывали латентный период медленной вспышки, светосумму медленной вспышки, интенсивность спонтанного свечения.

Уровень малонового диальдегида (МДА), как одного из конечных продуктов ПОЛ, оценивали в гомогенате печени по количеству продуктов, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили, 1977).

Активность супероксиддисмутазы (СОД) в гомогенате печени оценивали по ингибированию генерации супероксид-аниона в системе феназинметасульфат-НАД*Н (Fried R., 1975).

4. Психофармакологические методы исследования.

Для оценки специфического эффекта использованных в работе психотропных средств (нейролептики и антидепрессанты) использованы следующие методические подходы: - тест «открытого поля» в классическом варианте постановки (Weicher M.-Z.,1967); оценка каталептогенного эффекта нейролептиков по « шкале каталепсии» (К.С. Раевский, 1978); тест «подвешивания за хвост» (Stem L. et al., 1985). В последнем случае регистрировалась суммарная продолжительность периодов иммобилизаций (неподвижности, «отчаяния») животного за 6 минут наблюдения при помещении животного в «неизбегаемую» ситуацию подвешивания специальным зажимом за хвост в условиях, исключающих воздействие посторонних раздражителей.

5. Методы статистической обработки результатов.

Для оценки существенности различий применялся разностный метод с использованием t-критерия Стьюдента для количественных признаков и непараметрический критерий х2 (В.Ю. Урбах, 1964). Среднеквадратичные отклонения от %-выражения величин определяли по методу Л.С. Каминского (1959). Определение среднесмертельных доз

осуществляли методами Литчфилда и Уилкоксоиа, Кербера, экспресс-методом (М.Л. Беленький, 1963; И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев, 1962; В.Б. Прозоровский и соавт., 1978). Расчет коэффициентов комбинированного действия препаратов выполнялся как описано И.В. Сватковым, В.И. Мудрым (1988). Метод многомерного шкалирования признаков (М.Дейвисон,1988) и факторный анализ выполнялись в рамках стандартной программы StatSoft Windows, версия 4.3.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.Влияние различных иммуностимуляторов на основные системы иммунитета и активность микросомальных ферментов печени.

Фармакологический эффект любого препарата складывается из единства основного и побочного действий. Сходный фармакологический эффект предполагает и общность эффектов побочного действия (В.Ф. Давыдов, 1990). Депрессия монооксигеназной активности печени рассматривается как один из основных побочных эффектов иммуностимуляции. Однако, иммуностимуляторы представлены обширной группой препаратов, характеризующихся разнообразным «спектром» иммунотропного эффекта, что определяется влиянием на те или иные популяции эффекторных и регуляторных клеток. Выделение «доминантной» составляющей иммунотропного эффекта, ответственной за угнетение цитохром P-450-зависимых монооксигеназ, возможно лишь при комплексной оценке иммунотропного эффекта и использовании однотипных иммунологических моделей.

Использовались различные по структуре и происхождению иммуностимуляторы (продигиозан, мурамилдипептид-МДП, Т-активин, мнелопид, нуклеинат натрия, левамизол, диэтилдитиокарбамат натрия -ДТК, хлорид лития). Дозы и схемы введения препаратов оставались неизменными и независили от модельной иммунологической системы.

При оценке поглотительной активности макрофагов и продолжительности гексеналовогосна продигиозан (0,5 мг/кг) и левамизол (4 мг/кг) вводили в мышцу на -7,-4 и -1-е сутки до тестирования; мурамилдипептид (2 мг/кг) и В-активин (100 мкг/мышь) - однократно,

внутрибрюшинно, на -1-й день; Т-активин (0,25 мг/кг) и ДТК (25 мг/ кг) - под кожу, с -7-го по -1-й день; нуклеинат натрия (20 мг/кг) и хлорид лития (10 мг/кг)-внутрибрюшинно, с -4-го по -1-й день. При изучении гуморального и клеточного ответа продигиозан и левамизол вводили на 0-й и +3-й дни после иммунизации эритроцитами барана или сенсибилизации ДНФБ,Т-активин и ДТК - сО-го по +4-й день, нуклеинат натрия и хлорид лития - с +1 по + 4-й день, мурамилдипептид и В-активин - на +1-й день. Пути введения и дозы те же.

Анализ показал (рисунок 1), что угнетение метаболизирующей функции печени наблюдается только в том случае, если препарат вызывает активацию макрофагов. При этом характер влияния на гуморальный и клеточный иммунные ответы может быть самый разнообразный. Не было выявлено корреляции между влиянияем препаратов на метаболизирующую функцию печени и трансплантационный иммунитет (аллотрансплантация кожного лоскута в системе СВА - С57В1/6) и рост привитой саркомы Б-180 (препараты вводились в эквивалентных дозых и режимах введения со дня трансплантации кожного лоскута или имплантации опухолевого материала). Существенно, что ни один из иммуностимуляторов не изменял продолжительности сна, вызванного неметаболизирующимся в печени барбиталом-натрия.

В использованном режиме введения продигиозан, МДП, левамизол, нуклеинат натрия и хлорид лития обеспечивали не только повышение поглотительной активности макрофагов, но и увеличивали интенсивность спонтанного кислородзависимого метаболизма в этих клетках (по НСТ-тесту), причем продигиозан, МДП и нуклеинат натрия увеличивали как число диформазан-позитивных клеток, так и ЦХК; левамизол - только число диформазан-позитивных макрофагов, хлорид лития - ЦХК. Т-активин, миелопид и ДТК были неэффективны. В витральной системе (мононуклеары периферической крови) продигиозан (5 мкг/мл), МДП (5 мкг/мл) и левамизол (0.5 гпМ) вызывали существенное усиление секреторной функции фагоцитов, - уровень интерлейкина 10 (1Ь-1|3) в супернатантах опытных культур превышал таковой в контроле на 300%, 60% и 63% соответственно. Т-активин (5 мкг/мл) и миелопид (5 мкг/мл)

а 200

100 б 140 120100 В 200 "1

100

Ш

Г 200 "

100

и

Б

1 2

6 7 8

Рис. 1. Влияние различных иммуностимуляторов на метаболизирующую активность печени и основные системы иммунитета. По осям абсцисс: 1 - продигиозан; 2 - левамизол; 3 - Т-активин; 4 -диэтилдитиокарбамат натрия; 5 - нуклеинат натрия; 6 - хлорид лития; 7 - мурамилдипептид; 8 - миелопид.

По осям ординат показатели (в % к контролю, горизонтальная линия ± доверительный интервал): а - продолжительность гексеналового сна; б -корригированное значение фагоцитоза; в-число АОК на 106спленоцитов; г-интенсивность ГЗТ(приросттолщины уха).

не усиливали эмиссии интерлейкина 1.

Последующие эксперименты внесли весьма существенную поправку. Прямая зависимость между дозой, обеспечивающей стимуляцию фагоцитов и угнетением микросомальной активности печени обнаруживаетсмя лишь при введении неметаболизирующихся в печени иммуностимуляторов - продигиозана,J1 ПС Е. coli, МДП, вакцины БЦЖ,зимозана(коэффициент детерминации признаков- 88%). В случае применения синтетического иммуномодуляторалевамизола, метаболизирующегося цитохром Р-450-зависимыми монооксигеназами (Engelmann G., Richardson А., 1986) наблюдается иная картина. У мышей, получавших препарат в широком диапазоне доз (2.5 -11 мг/кг), режимов и способов введения, корреляция между скоростью биотрансформации гексенала, а также уровнем цитохрома Р-450, Ь5 и монооксигеназными активностями и состоянием фагоцитов прослеживалась не всегда (коэффициент детерминации -25%). Так, к примеру, в дозе 4 мг/кг (в мышцу), при ежедневном и интермиттпрующсм трехкратном введении, левамизол повышал поглотительную активность макрофагов, снижал уровень цитохрома Р-450 и статистически значимо угнетал аминопирин N-деметилазную активность. При однократном введении левамизола активность макрофагов не изменялась, уровень цитохрома Р-450 был повышен, ферментативная активность достоверно не отличалась от контроля. В группах животных, получавших левамизол перорально (интермиттирующая или ежедневная схема введения) в дозе 11 мг/кг, наблюдалось увеличение уровня цитохрома Р-450, Ь5 и аминопирин -N-деметилазной активности, активность фагоцитов не изменялась. Пероральное введение внутрь в дозе 2.5 мг/кг вызывало снижение уровня цитохрома и ферментативной активности, активность фагоцитов не изменялась; при внутрибрюшинном ежедневном введении этой же дозы наблюдалась индукция микросомальных ферментов, но повышение поглотительной функции макрофагов. При однократном внутрибрюшинном введении (2.5 мг/кг) уровень цитохрома идеметилазная активность снижались, активность фагоцитов оставалась неизменной. Активность гид роксил азы анилинане претерпевала статистически значимых изменений ни в одной из групп.

I I - Уровень

цитохрома Р450

| |-Уропень цитохрома Ь5

- Активность М-деметилазы аминопирина

- Активность р-гидроксилазы анилина

□ - Эмиссия 1Ь-1р Г|- Эмиссия ТЫ Ра

- Поглотительная активность макрофагов

- Генерация АФК макрофагами

140

120

100

Г"|- Ре-индуциро-_ ванная хеми-люмиписценция гомогената печени

Б

Рис. 2. Влияние различных по составу ЛПС на монооксигеназную систему (А), активность макрофагов (Б), и Ре-индуцированную хемилюминисценцию гомогената печени у мышей. По осям абсцисс: 1 - продигиозан; 2 - ЛПС Е.соП МЯе-600(664); 3 - ЛПС Е.соП МЯе-600(665); 4 - ЛПС БИ.Боппе! (654); 5 - ЛПС БИлоппе! (671).

По осям ординат: показатели в % к контролю (горизонтальная линия) ± доверительный интервал.

Аналогичная закономерность наблюдалась и при оценке влияния продигиозана, Т-активина и левамизола на интегральный показатель состояния механизмов неспецифической защиты (в первую очередь фагоцитарного звена) - антиинфекционную резистентность мышей при введении летальной дозы культуры синегнойной палочки: продигиозан угнетал метаболизирующую функцию печени только в эффективных дозах; Т-активин, независимо от дозы, был неэффективен в обоих тестах; для левамизола характер эффектов был идентичен описанному выше. Это и неудивительно, поскольку влияние любого метаболизирующегося цитохром P-450-зависимыми монооксигеназами ксенобиотика на активность самого цитохрома Р-450 определяется кинетикой его метаболического превращения, что в свою очередь зависит от дозы, кратности введения и т. д.

Наиболее тесная взаимосвязь между активацией фагоцитов и состоянием монооксигеназной системы печени была продемонстрирована для различных по составу ЛПС грам-негативных бактерий (рисунок 2). Наряду с продигиозаном использовались вновь полученные (лаборатория бактериальных субклеточных структур НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского) ЛПС мутантного штамма Е. coli MRe-600 (N664-Westfal, N665-Buaven) и ЛПС Sh.sonnei 90-90 (N654-Westfal, N671 -Buaven). Различия в способе получения определяли разницу в соотношении основных компонентов молекулы ЛПС, а следовательно и «мощность» иммуностимулирующего действия (З.В. Ермольева, 1968; С.В.Сибиряк, Е.К.Алехин, 1988; Szentivanyi А., 1985).

Все ЛПС, введенные в эквивалентной дозе ( 5 мкг/мышь, внутрибрюшинно),втойилииной степени активировали поглотительную функцию и «респираторный взрыв» (люминолзависимая хемилюминпсценция) в макрофагах, а также индуцировали секрецию цитокинов (IL-1 b, TN Fa, al FN) при добавлении в культуру мононуклеаров (5 мкг/мл). Максимальной активностью характеризовались продигиозан и «полные эндотоксины» - 665,671. Генерация активных форм кислорода (АФК) при стимуляции фагоцитов полисахаридами закономерно сопровождаласьсмещениемоксидантного равновесия в ткани и увеличением

интенсивности процесса ПОЛ. Это выражалось в увеличении уровня липоперпоксидов, взаимодействующих с ионами Fe++ и увеличении светосуммы медленной вспышки индуцированной железом хемилюминисценции гомогената печени. Однако статистически значимые отличия от контроля были лишь в группах животных, получивших наиболее активные Л ПС.

Влияние ЛПС на уровень цитохрома Р-450, Ь5, аминопирин-N-деметилазную и, в меньшей степени, анилин-р-пщроксилазную активность микросом было, по сути, «зеркальным отражением» их влияния на активность макрофагов: степень угнетения микросомального окисления была пропорциональна активирующему влиянию на макрофаги и прооксидантному эффекту ЛПС.

2. Влияние индукторов и ингибиторов печеночных монооксигеназ на основные системы иммунитета и активность иммуномодуляторов.

Для оценки влияния модуляторов активности цитохром Р-450-зависимых монооксигеназ на иммунореактивность были взяты гем-активный ингибитор циметидин, апофермент-активный ингибитор левомицетин (Murray M., 1987) и «эталонные» индукторы микросомального окисления, различающиеся по «спектру» индуцируемых изос}юрм цитохрома P-450-фенобарбитал (P-450IIB, P-450IIC, P-4501IIA), зиксорин (Р-450IA, P-450IIB), рифампицин - P450HIA ( А.А.Бакибаев и соавт.,1995; В.М.Щербаков, А.В.Тихонов, 1995; NebertD.etal., 1989;Gonzalez F., 1989).

Индукторы микросомального окисления - фенобарбитал (70 мг/кг), зиксорин (40 мг/кг) и рифампицин (20 мг/кг) вводили внутрь 3-кратно с -3 по -1-й день до оценки поглотительной активности макрофагов и продолжительности гексеналового сна. При оценке гуморального и клеточного ответов препараты использовали по аналогичной схеме до иммунизации (сенсибилизации) или с 0-го по +2-й день после нее. Ингибиторы печеночных монооксигеназ -циметидин (100 мг/кг) и левомицетинасукцинат (100 мг/кг) вводили однократно, внутрибрюшинно за 12 часов до оценки поглотительной активности макрофагов или продолжительности сна. Этот период соответствует максимальному угнетению метаболизирующей функции печени, что было определено в

предварительных экспериментах. В опытах по изучению гуморального и клеточного ответов препараты вводили за 12 часов до или через 12 часов после иммунизации (сенсибилизации). Две схемы введения препаратов были использованы с учетом возможного прямого иммунотропного действия, которое, как известно определяется режимом введения препарата относительно антигенного стимула.

Результаты иллюстрирует рисунок 3. В использованных дозах и режиме введения циметидин (при введении до антигенной нагрузки) стимулировал антителогенез и контактную гиперчувствительность. Фенобарбитал угнетал поглотительную активность макрофагов и ГЗТ (при введении после сенсибилизации ДНФБ), причем угнетение поглотительной активности было связано со значительным увеличением массы печени и, соответственно, уменьшением корригированного значения фагоцитоза, но не снижением абслолютного значения клиренса. Левомицетин,атакже остальные индукторы микросомальногоокисления не вызывали изменений поглотительной активности макрофагом, гуморального ответа, контактной гиперчувствительностн. Эти эксперименты свидетельствуют об отсутствии, по крайней мере, прямой связи между состоянием микросомальныхоксигеназ печени и состоянием пммунореактивности.

В зависимости от режима введения и дозы циметидин может вызывать индукцию микросомальных ферментов, связанную с прямой транскриптационной активацией гена (1оапшс1е5 С. е1 а1., 1989; Кар^апоук Т., 1990; Кагеп1атр'1 8., Тоггопеп И., 1990). Иммуностимулирующий эффект цпметидина связываютс блокадой Н2-гистамнновых рецепторов иммуноцитов (Е.К.Алехин исоавт., 1993; МауН§к'.1.,1987). В проведенных экспериментах циметидин, при введении в дозе 100 мг/кг внутрь в течение 7-ми дней обеспечивал индукцию микросомальных ферментов печени, что выражалось в укорочении продолжительности гексеналового сна и более чем двукратном снижении выживаемости мышей при введеннитоксическойдозы4-ацетаминофена(700 мг/кг). Направленность иммунотропного эффекта циметндина не изменялась - циметидин при ежедневном энтеральном введении вуказанной дозе со дня иммунизации

100

120

100

а I

I

200

100

200

100

В

Ь г!

11

Т1

ь-

1 2 3 4 5

Рис. 3. Влияние ингибиторов (I) и индукторов (II) цитохром Р-450-зависимых монооксигеназ печени на продолжительность гексеналового сна и основные системы иммунитета. ,

По осям абсцисс: 1 - циметидин; 2 - левомицетин; 3 - фенобарбитал; 4 - зиксорин; 5 - рифампицин.

В и Г - препараты вводились до (белые столбики) и после (серые столбики) иммунизации эритроцитами или сенсибилизации ДНФБ. По осям ординат - обозначения те же, что на рис. 1.

(сенсибилизации) также обеспечивал стимуляцию антителогенеза и контактной гиперчувствительности и, кроме того, статистически достоверное увеличивал поглотительную активность РЭС.

В условиях комбинированного введения Т-активин (0.125 мг/кг) и циметидин (100 мг/кг, внутрибрюшинно) характеризовались индифферентным типом взаимодействия в отношении макрофагальной активности и метаболизирующей функции печени, синергидным влиянием на гуморальный ответ и антагонизмом в отношении контактной гиперчувствительности, противоопухолевого и трансплантационного иммунитета.

Продигиозан (0.5 мг/кг) и циметидин при совместном введении характеризовались антагонистичным типом взаимодействия при оценке их влияния на микросомальную активность печени: при однократном введении циметидина (100 мг/кг, внутрибрюшинно) и продигиозана степень угнетения метаболизирующей функции печени была ниже ожидаемой; при курсовом введении циметидина (100 мг/кг, внутрь) продигиозан устранял индукцию микросомальных ферментов. Антагонизм прослеживался и при оценке совместного влияния препаратов на поглотительную активность макрофагов, первичный гуморальный отпет и контактную гиперчувствительность. Полученные результаты закономерны и объясняются как в^заимонивелирующим влиянием на процесс активации синтеза цитохрома, так и конкурентным воздействием на активность макрофагов - блокаторы Н2-гнстаминовых рецепторов ингибируют ЛПС-индуцированную секрецию и эффекты монокинов (Ыакапо К. е1 а1., 1991; N¡¡1™ М., ег а!., 1994; Реглет I*. е1 а1., 1994; ОеЬ^е У. е1 а!., 1994). Это подтвердилось и в настоящих исследованиях. Так, уровень 1Ь-1р в супернатантах культур мононуклеаров при добавлении 0.01 тМ циметидина составил 175.5+14.1 пкг/мл, продигиозана (5 мкг/ мл) - 255.0+21.4 пкг/мл (Р<0.05), комбинации препаратов - 204.0 + 44.0 пкг/мл, против контрольного уровня - 148.4 + 16.0 пкг/мл.

Вероятно наибольшую аналитическую ценность представляют те ситуации, когда индуктор микросомального окисления не обладает собственным иммунотропным эффектом.

При анализе комбинированного действия продигиозана (0.5 мг/кг, однократно, день введения - «О») и зиксорина (40 мг/кг, внутрь, дни введения - 0, +1, +3) был обнаружен антагонистический тип взаимодействия в отношении метаболизирующей функции печени -зиксорин устранял депрессию микросомальной активности, вызванную введением полисахарида. Продолжительность гексеналового наркоза в "зиксориновой" группе составила 9.3±3.2 мин., в "продигиозановой" -64.0±8.0 мин., в группе животных, получивших комбинацию препаратов

- 32.0±5.4 мин., в контроле - 40.0±5.6 мин. Характер совместного влияния препаратов на гуморальный иммунный ответ и контактную гиперчувствительность расценивался как индифферентный, в то же время зиксорин усиливал стимулирующее влияние продигиозана на поглотительную активность фагоцитов. Так, корригированное значение фагоцитоза в этой группе мышей составило 9.8±0.41, в "продигиозановой"

- 8.4±0.4 (РС0.05), в "зиксориновой" - 7.0±0.56, в контроле - 7.0±0.3.

Этаже закономерность подтвердилась и в случае комбинированного введения Л ПС Е. соН МЯе-бОО (0.5 мкг/мышь) и рифампицина (20 мг/ кг), что иллюстрирует рисунок 4. Рифампицин, введенный нафонеЛПС увеличивал уровень цитохрома Р-450 (даже в сравнении с контрольной группой), препятствовал снижению аминопирин-М-деметилазной и анилин-р-гидроксилазной активностей. В группе животных, получавших Л ПС совместно с индуктором в сравнении с группой животных, которым вводили один ЛПС прослеживалась незначительная тенденция к увеличению поглотительной активности РЭС, наблюдалось усиление поглотительной активности перитонеальных макрофагов, а интенсивность «респираторного взрыва» (по НСТ-тесту) была значительно выше. Эти результаты согласуются с исследованиями К.Н. Новикова и соавторов (1995), обнаруживших сходные изменения физико-химических характеристик мембран нейтрофилов при воздействии форболмиристоацетата и индукторов мцкросомального окисления и синергидном влиянии этих агентов на генерацию нейтрофилами АФК.

Существенно, что усиление генерации АФК кислорода в группе животных, получавшихЛ ПС и рифампицин не приводило к формированию

I I - Уровень цитохрома Р-450

- Уровень цитохрома Ь5

I 1 - Активность И-деметилазы

Активность р-гидроксилазы

I I - Поглотительная активность РЭС

Перитонеальные макрофаги:

Г"] - Латекс-фагоцитоз

- Активность НАДФ*Н-оксидазы

□ - Ре^-инд. ХЛ Г~] - Уровень МДЛ Активность СОД

Рис. 4. Влияние рифампицина, ЛПС Е.соН МИе-бОО и их комбинации на состояние монооксигеназной системы печени (А); макрофагальную активность (Б) и показатели оксидантного метаболизма в печени (В) у мышей.

По осям абсцисс: 1 - контроль; 2 - рифампицин; 3 - Л ПС М11е-600(665). Г1о осям ординат: показатели в % к контролю±доверительный интервал.

«оксидативного стресса» в ткани печени. Это связано с отчетливым увеличением активности супероксиддисмутазы (СОД),- одного из ключевых ферментов, обеспечивающих антиоксидантную защиту в цитозоле и экстрацеллюлярном пространстве втом числе и при индукции цитохрома Р-450(Л.Ф. Панченкоисоавт., 1981; Л.А. Тиунов, 1995; Раг£е1 Я., 1991; ВеИошо в., 1992).

3. Иммунофармакологические и фармакокинетические аспекты взаимодействия иммуностимуляторов с психотропными препаратами.

Обнаруженные закономерности подтвердились при изучении комбинированного действия продигиозана с психотропными средствами - нейролептиками (аминазин, галоперидол) и антидепрессантами (имипрамин, амитриптилин). Выбор препаратов был обусловлен характером их биотрансформации, - использованные нейролептики и трициклические антидепрессанты на 95% метаболизируются монооксигеназами печени путем гидроксилирования или образования дезметилпроизводных(К.М. Лакин, Ю.Ф. Крылов, 1981; ЕгезйеГвку Ь. е1 а1., 1988), причем спектр «психотропной активности» некоторых метаболитов (нортриптилин) отличен от неизменного препарата. Продигиозан, угнетая биотрансформацию в печени, а следовательно и соотношение метаболитов и неизменных препаратов в организме животных изменял специфическую активность психотропных средств (по тесту «открытого поля», «подвешивания за хвост», оценке каталептогепного эффекта). Характер изменения специфического эффекта психотропных препаратов при однократном введении, спустя сутки после введения продигиозана (0.5 мг/кг), представлен в таблице 1.

При курсовом введении (таблица 2) аминазин и галоперидол вводили внутрь в течение 7 суток в дозах 2 мг/кг и 0.5 мг/кг соответственно. Имипрамин и амитриптилин вводили внутрь в течение 14сутоквдозах 10 мг/кг и 2 мг/кг соответственно. Продигиозан вводили в мышцу, одновременно с препаратами 1 раз в 3 дня в случае применения нейролептиков и 1 раз в 5 дней в случае использования антидеирессантов. Наряду с изменением специфической активности продигиозан препятствовал вызываемой психотропными средствами индукции

Таблица 1

Характер изменения токсичности и активности некоторых психотропных средств (однократное внутрибрюшинное введение) на

фоне продигиозана

Препарат Токсичность Специфическая активность

Аминазин (2 мг/кг) снижение замедление наступления и пролонгирование эффекта

Галоперидол (0.25 мг/кг) не изменяется то же

Имипрамин (16 мг/кг) ■ не изменяется усиление и пролонгирование эффекта

Амитриптилин (16 мг/кг) незначительное снижение замедление наступления, снижение эффекта

Таблица 2

Взаимодействие продигиозана с психотропными средствами _при их курсовом введении_

Комбинация Характер влияния на микросомаль-ныеферменты Изменение специфического эффекта психотропных средств Изменение иммуностимулирующего эффекта продигиозана (етивность макрофагов)

Продигиозан + аминазин антагонизм замедление наступления не изменяется или незначительно усиливается

Продигиозан + галоперидол антагонизм замедление наступления незначительно усиливается

Продигиозан + имипрамин антагонизм пролонгирование и усиление снижается

Продигиозан + амитриптилин антагонизм пролонгирование и усиление не изменяется

микросомальных ферментов. Уместно отметить, что увеличение скорости метаболической дезактивации в процессе длительного приема препарата является одной из ведущих причин терапевтической резистентности к психотропным средствам (Mendonca L., Carlos А., 1988). При этом, если психотропный препарат в использованном режиме введения не обладал иммунотропной активностью (аминазин, галоперидол, амитриптилин), то эффект продигиозана (повышение антиинфекционной резистентности, поглотительной активности макрофагов) или не менялся или незначительно усиливался. Имипрцмин повышал поглотительную активность макрофагов; комбинация его с продигиозаном характеризовалась антагонистичным типом взаимодействия. Таким образом фактор фармакокинетической интерференции явился определяющим в изменении психотропного эффекта нейролептиков и антидепрессантов, но не иммунотропного эффекта продигиозана.

4. Взаимодействие иммунной системы, нейроэндокринной системы и монооксигеназной системы печени в эффекте иммуностимуляторов.

Активацию макрофагов в ответ на введение иммуностимулятора вполне правомерно рассматривать как модель реальной ситуации, возникающей в условиях «возмущения» иммунного гомеостазаинфектом в широком понимании этого слова. Макрофаг, как «сторожевая» клетка, запускает цепь событий, направленных на мобилизацию механизмов неспецифической и специфической защиты, т.н. «ответ острой фазы» (acute pliase response, APR). Ключевым моментом острофазного ответа является выброс IL-1, IL-6, TNF, IFN и ряда других цитокинов, системный эффект которых, в первую очередь, проявляется в: 1) индукции выброса глюкокортикоидов необходимых как для инциации, так и для завершения APR 2) перестройке биохимического паттерна гепатоцитов (Baumann Н., Glaudie J., 1994; Steel D., Whitehead A., 1994). He менее важный компонент APR - сдвиг оксидантного равновесия вследствии генерации фагоцитами АФК, окисленных галогенидов, оксида азота. В конечном счете острофазный ответ возможно рассматривать как стрессорную реакцию, учитывая однотипность реагирования центральных и периферических нейрогуморальных механизмов при

психоэмоциональном воздействии, иммунизации, развитии инфекционного процесса (М.Г. Кишов, 1989; Е.А. Корнева, 1989; Клуша В.Е. и соавт.,1989; Totli L. et al., 1989 и др.).

Анализ динамики изменения активности фагоцитов, метаболизирующей функции печени и уровня сывороточного кортизола после однократного введения бактериальных иммуноадъювантов (продигиозан-0.5 мг/кг, МДП- 2 мг/кг, ЛПС E.coli ВО-111 - 1.5 мг/кг), проведенный более чем на 6000 мышах показал однотипное реагирование изучаемых показателей независимо от природы иммуностимулятора и половых различий. Прослеживалось три основных фазы реакции (рисунок 5) взаимосвязанного реагирования изучаемых признаков, что подтвердилось также при суммарном анализе всех экспериментов методами факторного анализа и многомерного шкалирования:

1) Резкое увеличение уровня кортизола в сыворотке; активность макрофагов кратковременно возрастает, затем снижается; метаболическая функция печени не изменена. Продолжительность -12 часов.

2) Концентрация кортизола в сыворотке ниже контрольной; активность макрофагов нарастает и достигает максимума; метаболическая функция печени угнетена. Продолжительность этой фазы до 3 суток.

3) Уровень кортизола нарастает и возвращается к исходному; активность макрофагов снижается; метаболическая функция печени восстанавливается.

Знаменательно, что в группе мышей, получавших Л ПС (ЛПС Е. coli MRe-600) совместно с индуктором микросомального окисления -рифампицином (схема введения см. выше) уровень кортизола на+4 сутки наблюдения был, как и следовало ожидать, ниже такового в группе мышей, получавших один ЛПС, и составил, соответственно, 16.0±1.6 nmol/1 и 20.0+1.5 nmol/l (Р<0.05).

Базируясь на твердо аргументированных фактах депримирующего влияния цитокинов на активнось цитохром P-450-зависимых монооксигеназ (Shedlovsky St. et al.,1987; Mocchala Sh., Renton K.,1990; Wright K, Morgan E., 1991; Cribb A., et al.,1994; Clark M. et al.,1996 др.), возможности интенсивной внепеченочной бпотрансформации стероидов

Рис. 5. Влияние Л ПС Е.соП В:0-111 на поглотительную активность макрофагов (А), продолжительность гексеналового сна (Б) и уровень кортизола в сыворотке крови (В) у мышей.

По осям ординат: А - корригированное значение фагоцитоза; Б -продолжительность гексеналового сна; В - уровень кортизола в сыворотке. Б, В - значения представлены в % от контроля.

По осям абсцисс: время (в часах), прошедшее с момента введения иммуностимулятора.

Горизонтальная линия- контрольное значение±доверительный интервал

Рис. 6. Взаимодействие нейро-эндокринной системы, иммунной системы и системы монооксигеназ печени в "острофазном ответе".

в активированных макрофагах (Sawyer N. et al.,1963; Mekata H., 1971), обратной зависимости между активностью микросомальных монооксигеназ и интенсивностью процесса ПОЛ (Ю.П. Голиков, 1993; Э.Н. Баркова, О.В. Гуров, 1995; Parke D. et al.,1991), возможности генерации АФК самим цитохромом Р-450 в избытке НАДФ*Н при отсутствии субстрата монооксигенирования (Bondy St., Naderi S., 1994), обратной зависимости активности макрофагов от уровня эндогенных глюкокортикоидов (В.А. Труфакин и соавт., 1991; Gemsa D. et al., 1973), интенсификации гексозомонофосфатного шунта, как основного источника НАДФ*Н, в активированных фагоцитах и гепатоцитах (И. Ф. Усынин и соавт., 1992), а также полученных выше результатах (разделы 1-4), депрессию микросомального окисления в условиях иммуностимуляции правомерно рассматривать как проявление общебиологической реакции. Эта реакция, в числе других, направлена на восстановление гомеостаза при острофазном

ответе (иммунном стрессе) и обеспечиваетопосредованное через дистантный эффект цитокинов торможение биотрансформации глюкокортикоидов (рисунок 6). «Локальный» компонент реакции обусловлен сдвигом оксидативного равновесия, изменением физико-химических свойств биомембран и непосредственным угнетением цитохром Р-450-зависимых монооксигеназ, как потенциально возможного источника АФК. Несомненно, изложенная концепция далеко не полна, но не содержит внутренних противоречий и допускает экспериментальную проверку. Можно полагать, что фармакологическая модуляция активности микросомальных ферментов в интактном организме вряд-ли вызывает непосредственное изменение иммунных функций. "Фактор индукции" микросомальных ферментов приобретает значимость именно в условиях измененной иммунореактивности (активация фагоцитов), в частности при комбинированном применении индукторов цитохром Р-450-зависимых монооксигеназ с макрофагальными стимуляторами и, вероятно, инфекционном процессе.

5. Сравнительная иммунотропная активность азольных иммуномодуляторов, компьютерный дизайн активных иммуномодуляторов в ряду азолов и поиск активных соединений в ряду тиазоло [3,2-а] бензимидазолов и 1-(тистанил-3)2-замсщс1шых бензимидазола..

Комплексный подход к изучению фармакологического эффекта и уже известных, и новых иммуномодуляторов, включаюший оценку их влияния на иммунореактивность, микросомальное окисление и оксидантные процессы является наиболее целесообразным. Это касается, в первую очередь, азольных иммуномодуляторов, характеризующихся весьма разноплановой иммунотропной активностью и являющихся регуляторами микросомалыюго окисления. Такой подход был реализован при анализе фармакодинамического эффекта вновь синтезированного, активного иммуномодулятора - калиевой соли 2-[ 1 -(1,1 -диокситиетанил-3)бензимидазолил-2-тио] уксусной кислоты (лабораторный шифр К-134).

Поиск активных иммуномодуляторов включал несколько этапов.

На первом этапе исследования был проведен сравнительный анализ

иммунотропной активности фармакологических препаратов и соединений азольной структуры. Были использовании простые азолы, содержащие различные функциональные группы (имидазол, метронидазол, бензимидазол, дибазол, клотримазол), моноциклические азолы, содержащие фрагмент уреидов (мебендазол, мерказолил) конденсированные гетероциклические азолы (левамизол, диметиламинотиазоло [3,2-а] бензимидазол). Препараты и соединения вводили в эквитоксических дозах - 1/20 от DL50, внутрибрюшинно, четырехкратно.

Все изученные соединения, отличаясь по степени выраженности эффекта, характеризовались однотипной направленностью иммунотропного Действия: повышали клиринговую функцию макрофагов, при введении со дня иммунизации эритроцитами барана не влияли (имидазол, бензимидазол, дибазол, мебендазол) или угнетали (остальные препараты) формирование АОК в селезенке, угнетали развитие контактной гиперчувствительности к ДНФБ. В условиях индукции гипердозовой (эритроциты барана, ДНФБ) и низкодозовой (эритроциты барана) толерантности практически все препараты и соединения восстанавливали реактивность. Изученные препараты и соединения обеспечивали супрессию трансплантационного иммунитета, увеличивая продолжительность жизни кожного аллотрансплантата.

Анализ более чем 300 литературных источников и полученные результаты были использованы для выявления закономерностей, связывающих строение различных азоловс их иммунотропной активностью с последующей компьютерной генерацией структур с предполагаемыми иммунотропными свойствами. Исследования проведены с помощью системы прогноза и дизайна структур с заданными свойствами - «SARD» (Л.А. Тюрина и соавт., 1989; Ч.Ш. Кадыров и соавт., 1989) в лаборатории математического моделирования научно-исследовательского технологического института гербицидов и регуляторов роста растении (зав. - докт. хим. наук, Л.А. Тюрина), при участии С. С. Волковой-Положительное влияния для проявления избранного «решающего набора» иммунотропной активности (стимуляция фагоцитов, супрессия гуморального иммунитета и аутоиммунитета) оказывают группы S, С1,

N+, фрагменты циклических систем C-N=C, N=C-S, N-C=0, CH-N. Наиболее предпочтительны оказались структуры с трициклическои системой, куда входит шестичленный карбоцикл и два пятичленных цикла i имидазольный и серасодержащий циклы с одной ненасыщенной С=С связью) и бициклические структуры, в частности бензимидазолы, атом азота которых соединен с диокситиетановым или тиетановым циклом. Влияние азольных соединений на микросомалыюе окисление определяется иными факторами молекулярной организации, восновном, стереохимическими особеностями положения заместителей азольного гетероцикла и их липофильностыо (Murray М.,1987). Генерация потенциальных иммуномодуляторов, фрагмент которой представлен на рисунке 7, проведена среди структур, имеющих максимальное соответствие с гипотетической идеальной структурой.

На следующем этапе исследований был осуществлен поиск иммуноактивных соединений среди 12-ти вновь синтезированных производныхтиетанилитиазолобензимидазола (кафедра фармацевтической химии БГМУ, зав.-доцент Ф.А. Халиуллин) близких или тождественных структурам, сгенерированным на основе базовых структур 1 ранга 4А и 23А (рисунок 7).

На основании сравнительного анализа влияния вновь синтезированных соединений, а также левамизола и дибазола, при использовании эквитоксических доз (1/10 - 1/20 DL50) и однотипных режимов введения, на развитие летальной синегной инфекции (профилактическое введение соединений) и рост привитой саркомы S-180 (лечебное введение) были выявлены наиболее активные соединения - пиперидинивая соль2-[1-(тиетанил-3)бензимидазолил-2-тио] уксусная кислота (К-219) и калиевая соль 2-[1-(1,1-диоксотиетанил-3)-бензимидазолил-2-тио]уксусная кислота (К-134).Так, по способности ингибировать рост привитой саркомы S-180 соединение К-134 превосходило левамизол в 2.2 раза, соединение К-219 в 2.3 раза; по способности ингибировать рост меланомы В-16 - в 2.3 и 2 раза, соответственно; по протективному эффекту при летальной инфекции -в 3.8 и 3.5 раза, соответственно. При этом соединение К-134

Базовые структуры

( I ); 4А; ранг 1

10- 11 »■ 4. гЫ, гу-N.

( П ); 23А; ранг 1

4.

эо,

( III ); 8А; ранг 2

1._ з. 7.СН,

» У-М Н-М о-ы

5. 8.\=|!) 6.-0 И.

Гедерированные структуры (IV) (V) (VI)

1.-0.361 ^ум^Э Ь=0.117 ^^И^з' 1.-0.421

_I_I_I_

замена N11

(VII)

СК-Б-СН,-«

I_I

Ь—0.202

( VIII )

^^ сн, - соо—к

замена С1

♦ I-и

I Ь—0.117

Ь=0Л41

(IX) /ч

(X)

т

замена С1 и БОл

' У4

Сс-¿У™»

I—11------

1.-0.361 Ь«0.000

Ъ*0ЛП 0.141

формально ( XI )

пустая .. .. .. ^

замена

н-м-м

СН-цикла

'*" N-1

н-м | о=м;

и> чо

Рис. 7. Фрагмент компьютерной генерации потенциальных иммуномодуляторов на основе базовых структур, сформированных по решающему набору признаков иммуногропной активности

Калиевая соль 2-[1-(1,1-диокситиетанил-3) бензимидазол-2-тио] уксусной кислоты

характеризовалось наименьшей токсичностью и наиболее стабильным эффектом. Острая токсичность при внутривенном введении мышам составила 1990 (1862-2186) мг/кг, при внутрибрюшинном введении -1988 (1694-2346) мг/кг, при энтеральном введении - 6400 (5300-8760) мг/ кг.

В диапазоне доз от 1/20 до 1/100 ОЬ50, вне зависимости от кратности введения и сроков введения соединение К-134 обеспечивало супрессию гуморального ответа, но восстановливало реактивность на фоне введения гипериммунной или субоптимальной дозы эритроцитов барана. Влияние соединения К-134 на формирование контактной гиперчвствительности определялось сроком введения и сенсибилизирующей дозой ДНФБ. Будучи введенным после сенсибилизации, К-134 (в дозах 8 - 100 мг/кг внутрибрюшинно, 320 мг/ кг внутрь) угнетало экспрессию контактной гииерчувствительности, но повышало реактивность при введении до сенсибилизации (8 - 40 мг/кг внутрибрюшинно )и на фоне гипериммунной дозы ДНФБ (100 мг/кг, внутрибрюшинно). Влияние соединения К-134 на трансплантационный иммунитетопределялосьсхемой введения: интер.митттирующее введение соединения (100 мг/кг внутрибрюшинно, 1 раз в 3 дня) с +1 дня после пересадки кожного лоскута не изменяло продолжительности жизни аллотрансплантата гистонесовместимой системе мыши линии С57В1/6 (донор) - мыши линии СВА (реципиент). При ежедневном введении в этой же дозе наблюдалосьзамедление отторжение аллотрансплантата, что

Таблица 3. Влияние калиевой соли 2-[1-(тиетанил-3)бензимидазолил-2-тио] уксусной кислоты на активность макрофагов, состояние монооксигеназной системы печени и свободно-радикальные процессы

Доза, схема путь введения (in vivo) или концентрация в системе in vitro Поглотительная активность РЭС Поглотительная активность ПМ Спонтанный кис-лородзависимий метаболизм ПМ "Респираторный взрыв" в ответ на индуктор Секреция 1L-1, TNF, IFN Уровень Цх Р-450 Уровень Цх В, Активность аминопирин N-деметилазы Активность анилин р-гидролазы Fe-индуциров. хемилюм. гомо-гената пенчени ЛЗХЛ крови Генерация АФК в модельной системе реак.Фентона I ЮЛ в модельной системе липосом

1/20 DLj, внутрибрюшно однократно t — — — 4 4 4 1 — —

1/20 DLjq внутрибрюшно 1 раз в 3 дня t — — — 4 4 4 4 — —

1/20 DL„ внутрибрюшно ежедневно t t t Í 4 4 4 1 0 1

1/20 DLM внутрь ежедневно 0 Of ot t 0 0 t 0 0 4

1/100 DLM внутрь ежедневно 0 0 0 t t 0 t t 0 0

1 тМ J 1 — 4 0 1 i 0

0,1 шМ 1 4 t 0 0 i 1 0

0,01 тМ 0 0 Ot 0 0 1 0 0

0,001 тМ — — t — — — — —

О - отсутствие эффекта | - стимуляция | - угнетение __ - не изучалось

ПМ - перитонеальные макрофаги, ЛЗХЛ - люминол-зависимая хемшпоминисценция, АФК - активные формы кислорода, ПОЛ - перекисное окисление липкяов

было связано с индукцией у реципиентов супрессорных клеток: лимфоузловые клетки и спленоциты реципиентов, получавших соединение K-I34. при введении интактным сингенным мышам в дозе 1*10s адоптивно переносили состояние «неотвечаемости» при последующей пересадке этим мышам кожного лоскута от мышей СВА. При введении в дозе 150 мг/кг энтерально в период индукции адъювантного артрита (с +1 по +14 сутки после инокуляции ПАФ) соединение К-134 угнетало развитие суставного синдрома, а при введении мышам линии СЗН, иммунизированным ксеногенными эритроцитами, подавляло развитие аутоиммунной гемолитической анемии. В витральной системе вдиапазоне концентраций otO.OOI доО. 1 шМ соединение К-134 проявляло отчетливый митогенный эффект, увеличивало экспрессию С02-рецепторов, рецепторов к интерлейкину-2 и HLA-DR антигенов. В то же время, соединение К-134 угнетало пролиферацию лимфоцитов, вызванную оптимальными и сукоптимальными дозами митогенов (ФГА КонА).

Полученные данные свидетельствуют о регуляторном влиянии на механизмы формирования иммунного ответа, реализующимся, вероятно, через прямое воздействие на соответсвующие популяции иммуноцитов. Иными словами, соединение К-134 правомерно расценивать как "системный иммуномодулятор" (Б. С. Утешев и соавт., 1995)

Суммарные данные по влиянию соединения К-134 на активность макрофагов, процессы микросомального окисления и оксидантные процессы представлены втаблице 3 и свидетельствуют о взаимосвязи этих сторон фармакологического эффекта. В дозе 100 мг/кг при внугрибрюшинном введении (1/20 DL50) К-134 повышало поглотительную активность макрофагов, спонтанную и индуцированную стафилококком активность кислородзависимого метаболизма в этих клетках. В этих же дозах, независимо от кратности введения, соединение К-134 обеспечивало выраженную депрессию уровня цитохрома Р-450 в печени и монооксигеназных активностей. Так, при ежедневном введении соединения К-134 уровень цитохрома Р-450 в опытной группе животных составил 80% от контроля (Р<0.05), активность деметилазы аминопирина - 70% (Р<0.01), активность гидроксилазы анилина - 80% (Р<0.001). В дозе 320

мг/кг соединение К-134 мало влияло на поглотительную активность макрофагов, но сохраняло стимулирующий эффект в отношении спонтанного и индуцированного кислородзависимого метаболизма фагоцитов; в этой дозе К-134 не изменяло уровня цитохрома Р-450, гидроксилазной активности, но почти на 20% (Р<0.05) повышало деметилазную активность микросом. При введении внутрь в дозе 6.4 мг/ кг (1/100 ОЬбО) соединение К-134 обеспечивало мощную индукцию микросомальных ферментов, -уровень цитохрома возрастал на 40% (Р<0.05), деметилазная активность - на 30% (Р<0.01), анилин-р-гидроксилазная - на 40% (Р<0.001). В этой же дозе соединение К-134 не влияло на поглотительную активность и спонтанный кислородзависимый метаболизм фагоцитов, но почти в 2 раза усиливало реактивность НАДФ* Н оксидазных систем фагоцита в ответ на индуктор «респираторного взрыва», что подтверждает изложенные ранее данные. Так показатели спонтанного НСТ-теста перитонеальных макрофагов в группе мышей, получавших К-134, составили: % диформазан-позитивных клеток -5.6+0.8, ЦХК - 0.07±0.008, в контроле - 6.1+0.6 и 0.07+0.01; показатели индуцированного стафилококком НСТ-теста составили в опытной группе 19.0+1.9 и 0.25±0.02, в контроле 9.3±0.6 и 0.12±0.01

Можно полагать, что влияние соединения К-134 обусловлено и прямым и опосредованным через макрофаги воздействием на цитохром Р-450-зависимые монооксигеназы. Изучаемое соединение обеспечивало выраженную индукцию секреции монокинов - ключевых факторов депрессии печеночных монооксигеназ, превосходя по этой способности левамизол, взятый вэквимолярной концентрации:уровень 1Ь-фиа1РЫ при добавлении К-134 (0.1 тМ) в культуру мононуколеаров составил 212.0 + 38.0 пкг/мл и 18.0 + 5.2 пкг/мл соответственно, против таковых в контрольных культурах - 112.0 + 11.0 пкг/мл и 3.1 + 1.2 пкг/мл. С другой стороны, К-134 (0.01 - 1 тМ) непосредственно связывалось с гемопротеидом и образовывало с конститутивными и фенобарбитал-индуцированными изоформами цитохрома Р-450 печени крыс фермент-субстратный комплекс со спектрами связывания 1 типа (Ьтт = 415 нм, Ь тах = 385 нм), а также ингибировало аминопирин-Ы-деметилазную

активность микросом in vitro.

Ни в дозах, обеспечивающих активацию фагоцитов, ни в дозах, обеспечивающих индукцию микросомальных ферментов, соединение К-134 не изменяло оксидантного равновесия в печени и параметров Fe-индуцированной хемилю^минисценции. Более того, вдозах 100 и 320 мг/ кг соединение угнетало интенсивность люминол-зависимой хемилюминисценции цельной крови, а в системе in vitro в концентрациях 0.1-1 тМ при 60-минутной инкубации с макрофагами угнетало кислородзависимый метаболизм фагоцитов. Объснение этим фактам лежит в прямой антиоксидантной активности соединения: в диапазоне концентраций от 0.01 до 1 шМ К-134 снижало спонтанное свечение, увеличивало латентный период медленной вспышки и снижало светосумму медленной вспышки Fe-индуцированнойхемилюминисценции гомогената печени, в концентрация 0.1 - 1 тМугнеталогенерациюАФКвмодельной системе фосфат-цитрат-ионы железа (реакция Фентона), но не угнетало индуцированную ионами железа ПОЛ в модельной системе фосфолипидов. Подобный антиоксидантный эффект типичен для прямых акцепторов АФК.

Таким образом, фармакологический эффект калиевой соли 2-[1-(1,1 -диоксотиетанил-3)бензимидазолил-2-тио) уксусной кислоты, сочетающий иммуномодулирующую активность, прямое и опосредованное воздействие на фармакометаболизирующую функцию печени и антирадикальные свойства представляется весьма ценным и определяет перспективу дальнейшего изучения и внедрения данного соединения в клиническую практику.

ВЫВОДЫ

1. Выявлены закономерности взаимодействия иммунной системы и монооксигеназной системы печени в фармакологическом эффекте иммуностимуляторов: определена доминантная составляющая иммунотропного эффекта, обуславливающая депрессию цитохром Р-450-зависимых монооксигеназ; изучена роль метаболического превращения самого иммуностимулятора, изменения оксидативных

процессов в печени; изучено влияние фармакологических препаратов -ингибиторов и индукторов ' микросомального окисления на иммунореактивность и активность иммуностимуляторов; выяснен характер реагирования гипофизарно-адреналовой системы, микросомальной системы печени и системы мононуклеарных фагоцитов при введении иммуноадыовантов. Все это позволило сформулировать концепцию о роли депрессии микросомального окисления в регуляции иммунного гомеостаза и разработать методологические подходы к анализу некоторых сторон механизма действия вновь синтезированных азольных иммуномодуляторов.

2. Депрессия цитохром Р-450-зависимых монооксигеназ при введении иммуностимуляторов зависит от их способности активировать макрофаги (включая оксидантный метаболизм, секрецию монокинов), но не определяется направленностью влияния на гуморальный иммунный ответ, контактную гиперчувствительность, трансплантационный и противоопухолевый иммунитет.

3. Прямая корреляция между активацией макрофагов и депрессией микросомальных монооксигеназ прослеживается лишь при введении неметаболизирующихся в печени природных иммуностимуляторов; при введении метаболизирующихся в печени синтетических соединений (левамизол, циметидин, производныетиетанилбензимидазола) конечный эффект определяется интерференцией прямых и опосредованных влияний на цитохром Р-450.

4. Снижение уровня цитохрома Р-450 и монооксигеназных активностей в печени при введении различных по составу ЛПС грам-негативных бактерий пропорционально способности последних стимулировать макрофаги и процессы липопероксидации в печени.

5. Индукция или ингибиция микросомальных монооксигеназ различными фармакологическими препаратами не вызывает реципрокных изменений иммунореактивности; изменение характера влияния циметидина на микросомальные ферменты печени не сопровождается инверсией иммунотропного эффекта препарата. Характер изменений микросомальной активности печени при комбинированном применении

циметидина с иммуностимуляторами (Т-активпн, продигиозан) не определяет конечный иммунотропный эффект комбинаций препаратов, в то же время индукторы микросомальных ферментов (зиксорин, рифампицин) в дозах, не оказывающих иммунотропного эффекта, усиливают стимулирующее влияние бактериальных Л ПС на макрофаги.

6. Продигиозан, угнетая микросомальные ферменты, изменяет биотрансформацию и, как следствие, динамику развития специфического эффекта психотропных средств (аминазин, галоперидол, имипрамин, амитриптилин) как при их однократном введении на фоне иммуностимулятора, так и при курсовом введении; в последнем случае устраняется индукция микросомальных ферментов, вызываемая психотропными препаратами. Разнонаправленное влияние продигиозана и психотропных средств на микросомальные ферменты не определяло конечный иммунотропный эффект комбинаций.

7. Депрессия цитохром Р-450-зависимыхмоноксигеназ печени при введении бактериальных иммуностимуляторов является компонентом «острофазного ответа», направлена на восстановление нарушенного иммунного гомеостаза и обеспечивает регуляцию уровня глюкокортикоидов и оксидантных процессов.

8. Азольные иммуномодуляторы характеризуются однотипным паттерном иммунотропной активности. Установлена четкая зависимость биологического действия от химического строения изучаемых соединений с выделением фармакофоров, обеспечивающих искомый эффект.

9. Выявлен новый класс иммуномодуляторов - производные тиетанилбензимидазола. Наибольшую активность проявляла калиевая соль 2-[1-(1,1-диоксотиетанил-3)бензимидазолил-2-тио]-уксусной кислоты наиболее близкая по структуре к полученному в результате компьтерного дизайна «эталонному» азольному иммуномодулятору.

10. Фармакологическая активность калиевой соли 2-[1-(1,1-диоксотиетанил-3)бензимидазолил-2-тио]-уксусной кислоты включает в себя системное иммунорегуляторное действие (стимуляция антиинфекционной резистентности, активности фагоцитов, противоопухолевой реактивности, супрессия аутоиммунитета и

трансплантационного иммунитета, модуляция гуморального и клеточного ответов, интерфероногенные свойства), регуляцию ферментативной активности цитохром P-450-зависимыхмонооксигеназиантиоксидантные свойства.

>

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние некоторых иммуностимуляторов на антиинфекционную резистентность и активность монооксигеназной системы печени // Фармакология и токсикология. - 1990.- N2,- С.55-57 (Алехин Е.К., Хайбуллина С.Ф., Рябчинская Л.А.)

2. Фармакокинетические и иммунофармакологические аспекты взаимодействия продигиозана с психотропными средствами // Фармакология и токсикология. - 1990,- N6,- С.36-19. (Алехин Е.К.)

3. Иммунотропная активность 1-(тиетанил-3)-2-замещенных бензимидазола// В сб.: Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояних. Тез. докл. X научн. конф. - Челябинск, 1990,- С.212. (Садыков Р.Ф.)

4. Иммунотропная активность производных азолов и их конденсированных гетероциклических систем //Хим.- фармацевт, журн. - 1990. - N11.- С. 19 - 24 ( Строкин Ю.В., Садыков Р.Ф., Дианов В.М.).

5. Динамика изменений метаболической активности печени при введении иммуностимуляторов бактериального происхождения // В сб.: Вопросы теоретической и практической медицины. - Уфа, 1991.- С.37-38.

6. Infliio de cimetidino, T-aktivino kaj ties kombinajo: eksperimenta analiso // Med. Intern. Rev. - 1991.- vol.14a.-N3,- P.130-136 (Sigaev N., Aljohin E.).

7. Синтез и иммунотропная активность производных тиазоло [3,2-aj бензимидазола // Хим.- фармацевт, журн. - 1991.- N.1.-C.40-42. (Дианов В.М., Садыков Р.Ф., Строкин Р.Ф., Хайбуллина С.Ф.)

8. Interago de imunostimulilay kaj neuroleptikoj // Med. Intern. Rev. -1991.- vol.14a.- N4,- P.218 - 221. (Sigaev N.. Krasilova I.).

9. К вопросу о взаимодействии иммунной системы и монооксигеназной системы печени // Тез. докл. 1-го съезда иммунологов России -Новосибирск, 1992 - С.431 - 432.

10. Сравнительная иммунотропная активность фармакологических препаратов азолов // Там же - С.413 - 414 (Садыков Р.Ф.)

11. Взаимодействие иммунной системы и монооксигеназной системы печени//Фармакол. итоксикол. - 1992. - N4. - С.46 -48 (Красилова И.Л., Рябчинская Л.А., Волкова С.С. и др.).

13. Immunomodulating activity of derivatives of thiethanyl -and thiazolobenzimidazole // Rehabilitation of immune system. Abstr. 1st Int. Conf. of immunorehabilitation. - Dagomys, 1992. - P.lll (Sadykov R., Khaibullina S., Kataev V.)

14. Иммунотропные свойства лекарственных средств - Уфа, 1993 -208 С. ( Е.К. Алехин, Д.Н. Лазарева).

15. Иммунотропная активность производныхтиазолобензимидазола // Иммунология. - 1994.- N.6.- С.24-25. (Алехин Е.К., Хапиуллин Ф.А., Волкова С.С., Катаев В.А.)

16. Модуляция продигиозаном специфической активности антидепрессантов // Эксперим. клин, фармакология. - 1995. -N.5.- С.9-12 (Красилова И.Л.)

17. Взаимодействие нейро-эндокринной, иммунной системы и системы микросомального окисления печени в ответе организма на бактериальные иммуностимуляторы // Нейроиммунология. Нейроинфекция. Нейроимидж. Материалы IV Международной конф. по нейроиммунологии - С.Пб., 1995 - С. 106-108 (Сергеева С.А., Красилова И.Л.)

18.Теоретические и прикладные аспекты взаимодействия иммунной системы и монооксигеназной системы печени // Фундаментальные исследования как основа создания лекарственных средств. Тез. докл. 1-го съезда Российского научного общества-фармакологов, Волгоград, 913 октября 1995 года,-М., 1995.-С.395-396.(СергееваС.А., Крыжановский С.А., Хайбуллина С.Ф. и др.)

20.Динамика изменений макрофагальной активности,

метаболической активности печени и уровня кортизола в сыворотке мышей на фоне введения бактериальных иммуностимуляторов// Бюлл. эксперим. биол. мед. - 1996. - N2. - С. 177 - 180. (Сергеева С.А., Красилова И.Л.).

21.Влияние циметидина на метаболическую активность печени и иммунореактивность // Тез. докл. III Рос. национ. конгресса «Человек и лекарство»- М., 1996. - С.203

22. Влияние производного тиетанилбензимидазола на свободно-радикальные процессы и микросомальное окисление в печени //Там же - С.49 (Катаев В.А., Сергеева С.А., Фархутдинов P.P., Хлопушина Т.Г. и др.)

Авторские свидетельства:

1. 3-(циклогексиламинометил)тиазоло [3,2-а] бензимидазола дигидрохлорид, проявляющий иммунотропную, антиаггрегационную, противогрибковую активность - АС N 1564997 от 15 января 1990 года.( Дианов В.М., Строкин Ю.В., Хайбуллина С.Ф.)

2. Пиперидиниевая соль 2-[1-(тиетанил-3) бензимидазолил-2 тио] уксусной кислоты - АС N 1620611 от 12 октября 1992 года ( Катаев В.А., Халиуллин Ф.А., Садыков Р.Ф.)