Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Разработка национальной программы качественных доклинических исследований биологически аналогичных лекарственных препаратов рекомбинантного интерферона альфа-2b

а правах рукописи

ВАСИЛЬЕВ АНДРЕЙ НИКИФОРОВИЧ

РАЗРАБОТКА НАЦИОНАЛЬНОЙ ПРОГРАММЫ КАЧЕСТВЕННЫХ ДОКЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ БИОЛОГИЧЕСКИ АНАЛОГИЧНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2Ь

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 7 1"''

I / /імО ¿^ ¡о

14.03.06 — фармакология, клиническая фармакология

Волгоград-2012 г.

005047973

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России и в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН

доктор фармацевтических наук, профессор

Ершов Феликс Иванович Бунятян Наталья Дмитриевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор, академик РАМН, директор НИИ вакцин

и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН Зверев Виталий Васильевич

доктор медицинских наук,

профессор, член-корр. РАМН, заведующий кафедрой фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного

медицинского университета Тюренков Иван Николаевич

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник

ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности

биологически активных веществ» Шилова Елена Владимировна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН

Защита диссертации состоится » 2013 г. в ¿^часов на заседании

Диссертационного совета Д 208.008.02 при Волгоградском государственном медицинском университете Минздрава России по адресу: 400131, Волгоград, пл. Павших борцов, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВолгГМУ Автореферат разослан 12 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Доктор биологических наук, профессор Бугаева Любовь Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Проблема профилактики и лечения вирусных инфекций является одной из основных для современного здравоохранения (Веревщи-ков В.К. и др., 2008). Одним из путей решения указанной проблемы является разработка новых противовирусных лекарственных препаратов (ЛП), в т.ч. ЛП, содержащих в качестве действующего начала интерферон альфа (ИФН альфа) (Ершов Ф.И. и др., 2006).

ИФН альфа относятся к цитокинам (медиаторам иммунитета) и представлены семейством белков, обладающих противовирусной, иммуномодулирующей и противоопухолевой активностью, что позволяет отнести их к полифункциональным биорегуляторам широкого спектра действия и гомеостатическим агентам (Ершов Ф.И. и др., 2005, 2006, Sen GC, 2001). До начала 1980-х гг. производство осуществлялось путем получения нативного ИФН альфа. С открытием гена ИФН альфа, началась эра его биотехнологического синтеза (Nagata S. et al, 1980). Рекомбинантный ИФН альфа является белком, полученным с помощью генно-инженерных технологий. После разрешения медицинского применения первых оригинальных ИФН, в РФ с начала 2000-х гг. проводится активная разработка и государственная регистрация биологически аналогичных ИФН (Государственный реестр лекарственных средств, 2012 г.).

Биологически аналогичный ЛП (биоаналог) — ЛП биологического происхождения, сходный с ЛП сравнения (оригинальным ЛП), но не подпадающий под определение воспроизведенного ЛП, особенно в силу различий по исходному сырью или различий в технологическом процессе производства между биологическим ЛП и биологическим ЛП сравнения. В таких случаях необходимо представить соответствующие результаты доклинических и клинических исследований в отношении указанных различий.

На сегодняшний день вопросы обращения биологических ЛП подняты на государственный уровень (Комплексная программа развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 г., Стратегия развития фармацевтической промышленности Российской Федерации на период до 2020 г.). Однако в Федеральном законе № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств» отсутствуют прямые нормы, регламентирующие обращение биологически аналогичных ЛП. В тоже время в ч. 1 ст. 14 декларируется необходимость со-

блюдения «объективности, всесторонности и полноты исследований, проводимых с использованием современных достижений науки и техники».

При разработке биоаналогичных препаратов концепция, используемая для воспроизведенных ЛП неприменима (СНМР/437/04), поскольку трехмерная структура, количество кислотно-основных вариантов или посттрансляционных модификаций (например, профиль гликозилирования) могут существенно различаться в зависимости от способа и условий производства белка с одной и той же аминокислотной последовательностью и впоследствии влиять на эффективность и безопасность. Для подтверждения биологической аналогичности ЛП, полученного биотехнологическим путем, необходимо доказать, что он по своему качеству, безопасности и эффективности не отличается от оригинального. Для этого проводятся исследования, объем которых значительно превышает требования, предъявляемые к воспроизведенным ЛП, действующим веществом которых являются небольшие, полученные путем химического синтеза молекулы (СНМР/437/04; ЕМЕА/СНМР/В\\Ф/49348/2005;

ЕМЕА/СНМР/ВМ\\Ф/42832/2005).

Для подтверждения биологической аналогичности новых ЛП ИФН альфа препарату сравнения необходимо придерживаться как ранее разработанных рекомендаций (Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств, 2012 г.), так и использовать новые. При этом целесообразно использовать как общие подходы, имеющие отношение ко всем ЛП, полученным биотехнологическим путем, так и частные, затрагивающие непосредственно ЛП ИФН альфа (ЕМЕА/СНМР/ВМ\¥Р/31329/2005).

Гармонизация с европейскими подходами к оценке медицинских технологий позволит решить частные вопросы проведения доклинических исследований биологически аналогичных ЛП ИФН альфа, что хорошо понимается государством (тематический план научно-исследовательских работ Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России (ФГБУ «НЦЭСМП») на 20122014 гг.

В связи с вышеизложенным, разработка национальной программы качественных доклинических исследований ЛП рекомбинантного

ИФН альфа-2Ь представляет собой актуальное направление научных исследований.

Цель и задачи исследования

Основной целью исследования являлась разработка национальной программы проведения комплексных, качественных доклинических исследований препаратов рекомбинантного ИФН альфа-2Ь на основе нормативных документов Российской Федерации и международных нормативных актов.

Для достижения поставленной цели решались следующие конкретные задачи:

1. Провести анализ данных литературы и методических документов, регламентирующих доклинические исследования биоаналогов и обосновать методологические подходы к доклиническим исследованиям биологически аналогичных ЛП рекомбинантного ИФН альфа-2Ь.

2. Определить параметры стандартизации и подтверждения биологической аналогичности, необходимые при планировании и проведении доклинического изучения качества, эффективности и безопасности новых субстанций и ЛП рекомбинантного ИФН альфа-2Ь.

3. Предложить методики, обосновать их необходимость и достаточность, апробировать предложенные методические приемы в эксперименте при доклиническом изучении качества, эффективности и безопасности биоаналогов рекомбинантного ИФН альфа-2Ь.

4. Оценить качество рекомбинантного ИФН альфа-2Ь с использованием методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), электрофореза, реакции вирусной нейтрализации и специфической активности in vitro.

5. Оценить специфическую противовирусную активность различных лекарственных форм (ЛФ) ЛП ИФН альфа-2Ь in vivo для использования в качестве моделей доклинического изучения фарма-кодинамики.

6. Изучить общетоксические свойства различных ЛФ препаратов рекомбинантного ИФН альфа-2Ь с использованием лабораторных животных в условиях острых и хронических экспериментов, в т.ч. местнораздражающего действия при различных путях введения, для использования в качестве моделей доклинического изучения безопасности in vivo.

7. Исследовать специфические виды токсичности — влияние на репродуктивную функцию и эмбриотоксичность, а также иммуно-токсическое и аллергизирующее действие.

8. Провести доклинические фармакокинетические исследования препаратов рекомбинантного ИФН альфа-2Ь in vivo.

9. Оценить фармакодинамические свойства комбинаций рекомбинантного ИФН альфа-2Ь и химиотерапевтических препаратов in vitro в отношении различных возбудителей вирусных инфекций для создания новых комбинированных ЛП.

10. Оценить фармакологические свойства новой фиксированной комбинации ИФН альфа-2Ь с кетоконазолом и нового биоаналога ИФН альфа-2Ь, ковалентно связанного с одной линейной молекулой монометоксиполиэтиленгликоля (ПЭГ ИФН альфа-2Ь). Провести доклиническое изучение фармакодинамики, безопасности и фармако-кинетики указанных препаратов.

11. По результатам доклинического изучения разработать программы клинических исследований I фазы комбинации ИФН альфа-2Ь с кетоконазолом и ПЭГ ИФН альфа-2Ь.

Научная новизна работы

Впервые разработана комплексная программа проведения качественных доклинических исследований ЛП рекомбинантного ИФН альфа-2Ь на основе нормативных документов Российской Федерации и международных нормативных актов.

Впервые, как необходимый элемент комплексного доклинического изучения в соответствии с нормативными документами Российской Федерации и требованиями Европейских руководств по биотехнологическим препаратам, обоснованы и апробированы методики подтверждения параметров качества, эффективности и безопасности биоаналогов ИФН альфа-2Ь.

Впервые проведены комплексные доклинические исследования отечественных биоаналогов ИФН альфа-2Ь: изучена новая оригинальная комбинация ИФН альфа-2Ь и кетоконазола, предназначенная для лечения грибковых инфекций, и новый пэгилированный ИФН — препарат ПЭГ ИФН альфа-2Ь, предназначенный для лечения хронического вирусного гепатита С.

Практическая значимость

На основании разработанного комплекса доклинических исследований проведена оценка качества, безопасности, фармакокинетики

и фармакодинамики новой комбинации — ИФН альфа-2Ь и кетокона-зол, а также нового биоаналога ИФН альфа-2Ь — ПЭГ ИФН альфа-2Ъ.

Разработаны протоколы клинических исследований I фазы, нормативно-техническая документация. Досье поданы в установленном порядке в Минздрав России для проведения процедуры государственной регистрации.

Результаты настоящего исследования использованы:

на Федеральном уровне:

- в Методических указаниях по изучению специфической противовирусной активности фармакологических веществ, вошедших в «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» под общей редакцией член-корр. РАМН, проф. Хабриева Р.У. (утверждены и изданы в 2005 г.);

- в Методическом пособии по исследованию антиоксидантных свойств лекарственных препаратов под редакцией профессора Юрге-ля Н.В., д.б.н. Новикова К.Н. (утверждены Росздравнадзором и изданы в 2009 г.);

- в Методических рекомендациях по подготовке текста инструкции по медицинскому применению лекарственных препаратов (утверждены Росздравнадзором и изданы в 2009 г.);

- в Руководстве по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских исследованиях (рекомендовано Учебно-методическим объединением в качестве учебного пособия, 2010 г.);

- в Методических рекомендациях по составлению, изложению и оформлению инструкции по применению лекарственного препарата (утверждены Минздравсоцразвития РФ в 2012 г.);

- в Методических рекомендациях по общим принципам проведения клинических исследований, МР № 10-02/02/10-2012, Москва 2012;

- в Методических рекомендациях по составлению протокола контролируемого клинического исследования ЛП (выбор контрольной группы), МР № 11-02/02/10-2012, Москва 2012;

- в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств (утверждены Минздравсоцразвития РФ в 2012 г.);

- практические рекомендации диссертационной работы используются при планировании и проведении доклинических исследований НЦ биомедицинских технологий РАМН и ГК «Биопроцесс».

на Муниципальном уровне:

- в методических рекомендациях (№ 23) «Современные аспекты герпесвирусной инфекции. Эпидемиология, клиника, диагностика, лечение и профилактика» (утверждены Департаментом здравоохранения Правительства Москвы и изданы в 2012 г.).

на уровне Учреждения:

- в практике экспертной работы центра экспертизы и контроля готовых лекарственных средств ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России;

- в лекционных курсах 2009-2012 гг. центра образовательных программ и повышения квалификации ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России.

Связь задач исследований с проблемным планом

Диссертационная работа осуществлялась в соответствии с планом научно-исследовательской работы ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России по теме «Научное обоснование методических подходов к доклиническому и клинико-фармакологическому изучению и экспертной оценке эффективности и безопасности лекарственных средств» (№ Гос. регистрации 01201172531).

Апробация диссертации

Материалы диссертации доложены и обсуждены на Научно-практической конференции «Рациональное использование лекарственных средств: достижения и перспективы» (Москва, 2006), XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007), Международной конференции «50-я годовщина открытия интерферона» (Оксфорд, Англия, 2007), VI Международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2007), Научно-практической конференции «Интерферону — 50» (Москва, 2007), Всероссийской конференции по вопросам государственного регулирования в сфере обращения лекарственных средств и медицинских изделий (Москва, 2007), XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008), XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009), II Конгрессе Международного общества клинических фармакологов и фармацевтов стран СНГ (Москва, 2010), XV Международном кон-

грессе «Фитофарм 2011» (Нюрнберг, Германия, 2011), Конференции с международным участием «Актуальные вопросы доклинических и клинических исследований лекарственных средств» (Санкт-Петербург, 2011), Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012), учебном цикле ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России (Москва 2005-2012).

Первичная экспертиза диссертации проведена на заседании расширенной конференции отделов интерферонов и эпидемиологии ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России и на заседании Ученого совета ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России.

Личный вклад автора

Автором осуществлен выбор научного направления, сформулированы цель и задачи исследования, обоснован выбор адекватных путей их решения. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах научно-практического исследования. Автором предложена схема проведения исследований. Автором предложена новая фиксированная комбинация ИФН альфа-2Ь с кетоконазолом. При личном участии автора проведены доклинические исследования ЛП в клеточных культурах и на экспериментальных животных, подтвердившие его безопасность и потенциальную эффективность. Автором предложена схема проведения дальнейшего клинического исследования, разработан дизайн и протокол клинического исследования I фазы. В публикациях, написанных в соавторстве, авторский вклад составляет не менее 80 %.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 53 печатных работы, из них 2 за рубежом, 20 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобр-науки России.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Параметрами стандартизации качества субстанции реком-бинантного ИФН альфа-2Ь, влияющими на эффективность и безопасность готовых лекарственных форм (ЛФ), являются: специфическая активность, токсичность, подлинность, специфические и неспецифические примеси.

2. Исследованные ЛФ ИФН альфа-2Ь характеризуются высокой противовирусной активностью in vitro и in vivo. Они обладают

благоприятным фармакологическим профилем эффективности и безопасности вне зависимости от способа введения, как в остром, так и в хроническом эксперименте.

3. Изученные ИФН альфа-2Ь-содержащие ЛП не обладают эмбриотоксическим действием, не влияют на физическое развитие, скорость развития сенсорно-двигательных рефлексов, эмоционально-двигательное поведение и тонкую координацию движений в постна-тальном периоде in vivo.

4. Изученные ЛФ ИФН альфа-2Ь не оказывают иммунотокси-ческого, аллергизирующего и нейротоксического действия.

5. Фиксированная комбинация ИФН альфа-2Ь и кетоконазола обладает оптимальным соотношением потенциальной пользы к возможному риску медицинского применения, низкой токсичностью, как при остром, так и при хроническом введении. При ректальном введении кетоконазол всасывается в кровь, а ИФН альфа-2Ь не изменяет фармакокинетику кетоконазола.

6. Разработанная программа доклинических исследований биологически аналогичных ЛП рекомбинантного ИФН альфа-2Ь является научно-обоснованной и достаточной для подтверждения их качества, безопасности и эффективности.

Объем н структура диссертации

Диссертация изложена на 285 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение), выводов, списка литературы, а также включает в себя 5 приложений. Работа иллюстрирована 131 таблицей и 21 рисунками. Библиографический указатель включает 264 источников, из них 177 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

В процессе исследования использовали: системный и информационный подход, общенаучные методы исследования, методы логического, документального и статистического анализа. В программе доклинических исследований использованы зарегистрированные и готовые к регистрации в России ЛП рекомбинантного ИФН альфа-2Ь в различных ЛФ под торговыми наименованиями Виферон, ПегАль-тевир, ПегИнтрон (в качестве препарата сравнения) (табл. 1), новая

разработанная нами фиксированная комбинация ИФН альфа-2Ь и ке-токоназола.

Таблица 1. ЛФ и субстанции рекомбинантного ИФН альфа-2Ъ, использованные для отработки программы доклинических исследований ____

ЛФ Дозировка (ИФН альфа-2Ь) Регистрационный статус

ВиАеоон

Суппозитории ректальные 150000 ME; 500000 ME; 1000000 ME; 3000000 ME Разрешены для медицинского применения

Гель для наружного и местного применения 36000 МЕ/г Разрешен для медицинского применения

Капли глазные 4000 МЕ/мл В разработке

Раствор для местного применения 40000 МЕ/мл В разработке

Суппозитории вагинальные 500000 ME Получено разрешение на проведение клинического исследования

Мазь для наружного и местного применения 40000 МЕ/г Разрешена для медицинского применения

Пе.рАпьтевип

Лиофилизат для приготовления раствора для подкожного введения 100 мкг Получено разрешение на проведение клинического исследования

Пе.рИнтпон

Лиофилизат для приготовления раствора для подкожного введения 100 мкг Разрешен для медицинского применения

Субстанции

ИФН альфа-2Ь человеческий рекомбинантный, ООО «Фармапарк», г. Москва

ИФН альфа-2Ь человеческий рекомбинантный, ЗАО «Вектор-медика», г. Новосибирск

Международный стандартный образец активности WHO International Standard Interferon alpha 2b, NIBSC code: 95/566

Международный стандарт ИФН альфа-2Ь человека для хроматографических исследований Interferon alpha-2b CRS EDQM, каталожный номер 10320301

Смесь маркерных белков производства фирмы MBI Fermentas, каталожный номер SM0431

В работе использовано 26 штаммов вирусов: вирус энцефало-миокардита мыши (ЕМС), штамм Кислинга 40614; вирус везикулярного стоматита (VSV), штамм Индиана; 15 штаммов вируса простого герпеса (ВПГ): из них 3 эталонных штамма; 12 клинических изоля-тов; эталонный штамм аденовируса человека Ad5; 6 штаммов вируса гриппа; штамм вируса гриппа птиц A/H5N1 (Цинхай-Сибирский ге-нотип-2); тест-штамм гриба Candida albicans АТСС 885-653 и 102 клинических изолята С. albicans.

В работе использовали 6 линий культур клеток: почки эмбриона свиньи (СПЭВ); почки африканской зеленой мартышки, клон Е6 (Vero Е6); легкого эмбриона человека (MRC-5); почки эмбриона человека, трансформированной ДНК аденовируса 5 типа; почки собаки (MDCK), почки теленка (MDBK).

Для проведения токсикологических, фармакодинамических и фармакокинетических исследований использовали животных различных видов: линейных белых мышей BALB/c, мышей-гибридов Fl (СВАХС57В1/6), крыс породы Вистар, беспородных белых крыс (половозрелых и неполовозрелых), морских свинок (половозрелых и неполовозрелых), кроликов и обезьян.

Методы сравнительного изучения качества

При определении подлинности ИФН альфа-2Ь использовали метод пептидного картирования. Исследование проводили путем оценки профиля хроматограммы испытуемого образца субстанции и стандарта после ферментативного гидролиза трипсином с использованием высокоэффективного хроматографа Sammit, DIONIX, хрома-тографической колонки Vydac С18 218ТР54 5цт, 300Á, 100x4,6 мм. Профиль хроматограммы раствора испытуемого образца субстанции после ферментативного гидролиза трипсином должен принципиально соответствовать профилю хроматограммы раствора стандарта.

Определение подлинности ИФН альфа-2Ь проводили также методом изоэлектрофокусирования с использованием модульной системы Multiphor II и системы гель-документирования G:BOX EF. Положение основных полос в изоэлектрофореграмме испытуемого препарата должно соответствовать положению основных полос в изоэлектрофореграмме стандарта.

Определение специфических и неспецифических примесей в ИФН альфа-2Ь проводили методом ВЭЖХ путем оценки профиля

хроматограммы испытуемого образца субстанции и стандарта с использованием высокоэффективного хроматографа Sammit, DIONIX, С колонки Vydac С18 218ТР54 5цш, 300Ä, 100x4,6 мм. На хромато-грамме, полученной для раствора испытуемого образца, площадь основного пика должна составлять не менее 95 % от общей площади всех пиков, площадь любого дополнительного пика должна составлять не более 3 % от общей площади всех пиков. Сумма площадей дополнительных пиков должна составлять не более 5 % от общей площади всех пиков.

Определение содержания белковых примесей в ИФН альфа-2Ь проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях с использованием прибора для электрофореза Mini-PROTEAN 3 Cell, фирмы «BIO RAD». Электрофорез в восстанавливающих условиях: в дополнение к основной полосе могут присутствовать менее интенсивные полосы с более низкой молекулярной массой, чем основная полоса. Ни одна из дополнительных полос не может быть более интенсивной, чем основная полоса, полученная для 1,0% раствора стандарта, и должно быть не более 3-х дополнительных полос, более интенсивных, чем основная полоса, полученная для 0,2 % раствора стандартного образца. Электрофорез в невосстанавливающих условиях: для раствора испытуемого препарата в дополнение к основной полосе могут присутствовать менее интенсивные полосы с более высокой молекулярной массой, чем основная полоса. Ни одна из дополнительных полос не может быть более интенсивной, чем основная полоса, полученная для 1,0 % раствора стандарта и должно быть не более 3-х дополнительных полос, более интенсивных, чем основная полоса, полученная для 0,2 % раствора стандарта.

Определение аномальной токсичности субстанции ИФН аль-фа-2Ь проводили двумя биологическими методами: с использованием культуры клеток и белых мышей в соответствии с требованиями ОФС 42-0060-07 ГФ XII, с. 124.

Методы сравнительного изучения специфической активности

Определение цитотоксического действия ИФН альфа-2Ь in vitro проводили биологическим методом по оценке влияния присутствия вещества на жизнеспособность клеток и их морфологию.

Определение специфической противовирусной активности и

подлинности ИФН альфа-2Ь проводили на 1-2 суточном монослое культуры клеток — MDBK, Vero или СПЭВ, используя индикаторные штаммы VSV или ЕМС. В качестве стандарта противовирусной активности использовали Международный стандартный образец активности (WHO International Standard Interferon alpha 2b, NIBSC code: 95/566).

Определение специфической активности in vitro. Определение противогерпетической, противоаденовирусной и противогриппозной активности фармацевтических субстанций и готовых ЛП проводили путем оценки концентрации ИФН альфа-2Ь, обеспечивающей защиту клеточного монослоя от развития вирусиндуцированного ци-топатического действия (ЦПД) в 50 % лунок, которая обозначалась, как 50 % ингибирующая доза (ИД50), а также путем оценки снижения инфекционного титра вируса под воздействием различных концентраций ИФН альфа-2Ь.

С целью выявления различий в биологической активности между аналогичным ЛП ИФН альфа-2Ь и ЛП сравнения можно провести ряд сравнительных исследований (например, исследования связывания с рецептором, противовирусных эффектов на культуре клеток, антипролиферативных эффектов на клеточных линиях опухолей человека), результаты большинства из которых могут быть доступны по итогам изучения качества.

Определение противогрибковой активности субстанций и ЛП для комбинирования с ИФН альфа in vitro проводили по методу двукратных серийных разведений путем определения минимальной фун-гицидной концентрации препарата, подавляющей рост испытуемого штамма С.albicans.

Определение противовирусной активности in vivo провели на экспериментальной модели герпетического кератита кроликов (был использован штамм вируса простого герпеса I типа «Коптев») и на модели генитального герпеса у самцов морских свинок (штамм вирус ВПГ-2 ЕС с инфекционным титром 107 тканевой цитопатической инфекционной дозы (ТЦИД)50/мл). При динамическом наблюдении за развитием герпетической инфекции учитывали: поверхность поражения в %, интенсивность выраженности признаков поражения, наличие кровоточащих язв, орхит, сроки полной эпителизации слизистой оболочки. Для количественной оценки использовали систему баллов

от 0 до 4, выражавшую суммарно интенсивность патологических признаков. Эффективность оценивали по разнице суммы баллов в основной и контрольной группе. Наблюдение проводили в течение 20 дней.

Для ЛП рекомбинантного ИФН альфа-2Ь, при применении доз выше 9 млн. ME, возможно изучение специфической активности на животных с определением основных фармакодинамических маркеров _2' ,5 '-олигоаденилатсинтетазы, ß2-микpoглoбyлинa, неоптерина.

Определение противовирусной активности комбинации препаратов in vitro проводили по методу Anhal at al, 1980 и Neyts J., De Clercg E, 1997. Для оценки эффективности комбинации использовали понятие фракционного ингибирующего коэффициента (ФИК), значение которого вычисляли по формуле:

ИД50 комбинации

ФИК =-—---~

сумма ИД50 отдельных соединении

При значении ФИК 0,5 имеет место умеренный синергизм соединений, при значении ФИК равном 1-1,5 имеет место аддитивный эффект комбинации, при значении ФИК более 2 имеет место антагонизм соединений.

Методы сравнительного изучения фармакокинетикн

Изучение фармакокинетических свойств препарата ПЭГ ИФН альфа-2Ь проводили на крысах-самцах Sprague-Dawley и яванских макаках. В качестве препарата сравнения использовали Пегинтрон. Крысам ЛП вводили подкожно (п/к) и внутривенно (в/в) в дозах 140 мкг/кг, обезьянам — п/к в дозе 115 мкг/кг. Определение концентрации ИФН альфа-2Ь проводили с помощью стандартного иммунофер-ментного анализа с использованием тест системы Human IFN a BMS 216 (Bender MedSystems, Austria); для определения концентраций образцов строили калибровочную кривую по стандартным образцам в диапазоне концентраций от 1 нг/мл до 5000 нг/мл.

Изучение биодоступности ИФН альфа-2Ь при его ректальном введении в виде суппозиториев и через катетер проведено на кроликах породы Шиншилла (в т.ч. неполовозрелых) после однократного введения ЛП в дозе 150 тыс. ME. Исследования проведены в соответствии с действующими в РФ рекомендациями по изучению фармакокинетикн лекарственных средств. Определяли основные фармакоки-нетические параметры: площадь по фармакокинетической кривой «концентрация-время» (AUC), период полувыведения (Ту,), макси-

мальная концентрация (С1Пах), время достижения максимальной концентрации (tmax) И Др.

Изучение фармакокинетики комбинации ИФН альфа-2Ь и кетокоиазола. С учетом литературных данных была разработана процедура количественного определения кетоконазола в плазме крови кроликов методом ВЭЖХ. Разработанный метод предусматривает осаждение белков в плазме крови метиловым спиртом с последующим центрифугированием. При изучении фармакокинетики кетоконазола вводили ректально суппозитории, содержащие 50, 100 или 200 мг кетоконазола и 500 тыс. ИФН альфа-2Ь, и внутрь (для сравнения) — кетоконазол, таблетки, 200 мг.

Изучение общетоксического действия и специфических видов токсичности проводили в соответствии с действующими методическими указаниями и рекомендациями (2000, 2005 гг.) по экспериментальному изучению новых фармакологических веществ. Использовали животных различных видов: мышей, крыс, кроликов, морских свинок, как половозрелых, так и неполовозрелых. Путь введения соответствовал изучаемой ЛФ. Высшая изученная доза в экспериментах многократно превышала терапевтическую дозу или определялась технической возможностью введения соответствующей ЛФ.

При изучении острой и субхронической токсичности состояние гомеостаза экспериментальных животных оценивали с помощью функциональных, гематологических, биохимических и патоморфоло-гических методов.

Проводили общий клинический анализ крови и мочи, определяли основные биохимические показатели сыворотки крови. После эвтаназии перед проведением вскрытия оценивали: состояние кожи, шерстного покрова, видимых слизистых оболочек, а также внутренних органов грудной, брюшной полостей и органов таза. Отбирали образцы органов и тканей, в т.ч. место введения препарата, для последующего гистологического анализа.

Поведенческие реакции крыс оценивали тестированием свободного поведения (с использованием компьютеризированной системы Auto Track System) и обучения (в Shuttle-Box). Определение водной мотивации и анксиолитического действия проводили в модификации конфликтного теста Вогеля (Зозуля A.A. и соавт., 1999).

Исследования аллергизирующего и иммунотоксического действия проводили с помощью стандартных методов in vivo (на мышах,

крысах и морских свинках) и in vitro. Для сенсибилизации лабораторных животных использовали разные схемы многократного введения исследуемых препаратов. При изучении аллергизирующего действия выявляли состояние гиперчувствительности немедленного и замедленного типов: в тесте отека лапки мыши, реакциях активной и пассивной кожной анафилаксии, в реакции дегрануляции тучных клеток in vitro. Иммунотоксические свойства препарата оценивали на мышах по гуморальному и клеточному иммунному ответу на чужеродный антиген, в качестве которого использовали эритроциты барана, а также на крысах по показателям фагоцитарной активности перитонеаль-ных макрофагов и содержанию комплемента в сыворотке крови.

Изучение репродуктивной токсичности проводили на крысах породы Вистар. Первым днем беременности считали день обнаружения сперматозоидов в вагинальных мазках самок, подсаженных накануне к самцам в соотношении 3:2. Наблюдение за животными вели в течение всего срока беременности. Тестируемый препарат (ЛП или плацебо) вводили животным ректально. На 20-й день беременности часть животных умерщвляли и определяли количество желтых тел беременности в яичниках, мест имплантации в матке. При оценке тератогенного действия подсчитывали количество плодов с аномалиями, заметными при внешнем осмотре, далее плоды осматривали на предмет состояния внутренних органов и скелета, взвешивали и определяли их краниокаудальный размер. Часть плодов фиксировали в растворе Буэна и исследовали методом серийных срезов по Вилсону с целью выявления дефектов развития внутренних органов. Другую часть плодов фиксировали в 96 % растворе этилового спирта и окрашивали по методу Доусона для идентификации аномалий развития скелета. Проводили наблюдение за физическим развитием крысят, изучали скорость созревания сенсорно-двигательных рефлексов в период вскармливания, обучаемость и память.

Методы статистической обработки

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с использованием метода описательной статистики: вычисляли среднее значение, рассчитывали стандартное отклонение. Для получения достоверных результатов каждый опыт с использованием культур клеток повторяли не менее 3-х раз.

Статистическая обработка данных экспериментальных исследований на животных выполнялась с использованием пакета приклад-

ных программ «Statistica 9.1» (StatSoft Inc., США). Количественные признаки, имевшие нормальное распределение, описывались средними и среднеквадратическими отклонениями (M±s); не имевшие нормального распределения, описывались медианами и квартилями (Me [LQ; UQ]). Качественные признаки описывались абсолютными и относительными частотами их значений. Для количественных признаков сравнение несвязанных групп проводилось с использованием непараметрического теста Манна-Уитни (U-test), сравнение связанных групп проводилось с использованием непараметрического теста Вил-коксона (W-test). Для сравнения частот значений признаков в группах применялся двусторонний точный критерий Фишера. Различия считались статистически значимыми при достигнутом уровне значимости р <0,05.

Результаты исследований и их обсуждение Результаты сравнительного изучения качества Анализ данных литературы и изучение законодательных актов, регламентирующих процедуру доклинического и клинического исследования биоаналогов ЕС и США, позволил установить параметры стандартизации и методики анализа фармацевтической субстанции рекомбинантного ИФН альфа-2Ь — это подлинность, специфическая активность, чистота (микробиологическая, специфические и неспецифические примеси), аномальная токсичность. Другие показатели, например, концентрация белка - специфичны для каждого препарата и не являются характеристиками его качества и безопасности. Определение подлинности в нормативных документах ЕС, США и РФ проводится аналогичными методиками: методом электрофокусирования, методом электрофореза в ПААГ, методом пептидного картирования. В России кроме перечисленных методов, используемых для установления подлинности субстанции рекомбинантного ИФН альфа-2Ь, указан еще метод нейтрализации противовирусной активности специфическими антителами. В нормативных документах Европы и США, в свою очередь, указан метод определения специфической активности в сравнении с международным стандартным образцом активности. Таким образом, для выбора показателей и определения основных параметров, определяющих качество субстанции ИФН альфа-2Ь и ЛФ, произведенных на ее основе, были выбраны методы, указанные в табл. 5. Проанализировав образцы субстанции ИФН альфа-2Ь различных производителей методами, указанными в табл. 5, были

получены данные, свидетельствующие о том, что выбранные методы позволяют установить различия в качестве субстанций. Результаты анализа субстанции ИФН альфа-2Ь методом электрофореза в ПААГ в восстанавливающих и невосстанавливающих условия приведены на рис. 1, методом пептидного картирования — на рис.2, а методом ВЭЖХ — на рис. 3. Для оценки подлинности препаратов ИФН альфа-2Ь методы, указанные в табл. 5 не всегда применимы, в связи с малой концентрацией белка в некоторых ЛФ. В таких случаях для установления подлинности субстанции ИФН альфа-2Ь можно использовать метод нейтрализации противовирусной активности, а так же биологический метод оценки противовирусной активности.

Таблица 5. Параметры стандартизации субстанции ИФН альфа-2Ь.

Показатель Требования РФ Требования ЕС

Подлинность 1. Реакция нейтрализации противовирусной активности: противовирусная активность ЛП должна нейтрализоваться анти-альфа-интерфероновым иммуноглобулином 1. Специфическая активность: образец должен обладать противовирусной активностью в сравнении с активностью международного стандарта активности ИФН альфа-2Ь

2. Метод изоэлектрического фокусирования: на изоэлек-трофореграмме испытуемого ЛП основные полосы должны соответствовать основным полосам на изоэлектрофо-реграмме раствора стандарта

3. Метод электрофореза в ПААГ в восстанавливающих условиях: положение основной полосы на электрофоре-грамме испытуемого ЛП должно соответствовать положению основной полосы на электрофореграмме раствора стандарта

4. Метод пептидного картирования с использованием метода ВЭЖХ: профиль хроматограммы раствора исследуемого ЛП (ВЭЖХ после ферментативного гидролиза трипсином) должен соответствовать профилю хроматограммы раствора стандарта

Аномальная токсичность ЛП должен быть нетоксичным. Контроль Л?/ с использованием культуры клеток. Контроль №2 на животных (белые мыши)

Специфические и неспецифические примеси 1. Метод электрофореза: а) в восстанавливающих условиях: в дополнение к основной полосе могут присутствовать менее интенсивные полосы с более низкой молекулярной массой, чем основная полоса. Ни одна из дополнительных полос не может быть более интенсивной, чем ос-

новная полоса, полученная для 1,0 % раствора стандарта и должно быть не более трех дополнительных полос, более интенсивных, чем основная полоса, полученная для 0,2 % раствора стандарта; б) в невосстанавливающих условиях: помимо основной полосы могут присутствовать менее интенсивные полосы с более высокой молекулярной массой, чем основная полоса. Ни одна из дополнительных полос не может быть более интенсивной, чем основная полоса, полученная для 1,0 % раствора стандарта, и должно быть не более трех дополнительных полос, более интенсивных, чем основная полоса, полученная для 0,2 % раствора

стандарта._

2. Метод ВЭЖХ: на хроматограмме, полученной для раствора испытуемого препарата, площадь основного пика должна составлять не менее 95 % от общей площади всех пиков. Площадь любого дополнительного пика должна составлять не более 3 % от общей площади всех пиков. Сумма площадей дополнительных пиков должна составлять не более 5 % от общей площади всех пиков._

М

,_б)_

0,625 0,125 0,025 0,005 0,001 (м г/мл)

Рисунок 1. Результаты анализа подлинности субстанции ИФН альфа-2Ь методом электрофореза в ПААГ в восстанавливающих (а) и невосстанавливающих (б) условиях. 1 - образец субстанции ИФН альфа-2Ь

производства ООО «Фармапарк», 2 - образец субстанции производства ЗАО «Вектор-медика» и растворы стандарта различной концентрации.

Рисунок 2. Результаты анализа субстанции ИФН альфа-2Ь методом ВЭЖХ: а) образец субстанции ИФН альфа-2Ь производства ООО «Фармапарк», б) образец субстанции производства ЗАО «Вектор-медика».

В результате проведенного анализа подлинности фармацевтической субстанции и ЛП ИФН альфа-2Ь по двум методикам, указанным в табл. 5, были получены данные, подтверждающие подлинность. Методом электрофореза в ПААГ в восстанавливающих и невосста-навливающих условиях для двух образцов субстанции разных производителей (рис. 1) показано, что на электрофореграмме для обоих испытуемых образцов основная полоса располагается аналогично основной полосе международного стандартного образца Interferon alpha-2b CRS EDQM, при этом отсутствуют полосы с более высоким молекулярным весом, чем основная полоса. В образцах присутствуют две полосы с более низким молекулярным весом, чем основная полоса, при этом интенсивность этих полос меньше, чем интенсивность основной полосы, полученной для раствора стандарта с разведением до концентрации 1,0 %. При анализе подлинности субстанции методом пептидного картирования профиль хроматограммы растворов исследуемых образцов субстанции (ВЭЖХ после ферментативного гидролиза трипсином) соответствовал профилю хроматограммы раствора стандарта. При оценке специфических и неспецифических примесей в образцах субстанции методом ВЭЖХ (рис. 2) на хроматограмме испытуемого образца №1 площадь основного пика составила 98,69 %, при этом площадь остальных пиков составила 1,31 %. На хромато-грамме образца №2 площадь основного пика составила около

Г

б)

98,46 %, при этом площадь дополнительных пиков составила 1,53 %. Площадь дополнительных пиков была не более 2 %.

Таким образом, установленный комплекс методов для оценки качества субстанции ИФН альфа-2Ь является достаточным для подтверждения биоаналогичности.

Результаты сравнительного изучения специфической активности

Оценка фармакологической активности in vitro и in vivo является одним из наиболее доступных методов предварительной оценки эффективности ЛП. Перед проведением оценки противовирусной активности проводили исследование цитотоксических свойств ЛП по стандартной методике. Результаты сравнительного изучения ИФН альфа-2Ь-содержащих ЛП представлены в табл. 6.

Таблица 6. Результаты сравнительного изучения ИФН альфа-2Ь

Противогерпесвирус-ная активность ИФН альфа-2Ь-содержащих ЛП ИД50 при инфекционной множественности заражения (ИМЗ) 0,1 БОЕ/Кл составила 250 МЕ/мл, ИД50 при ИМЗ 0,01 БОЕ/Кл составила 156,25 МЕ/мл. ЭДюо при ИМЗ ОД БОЕ/Кл составила 5000 МЕ/мл, ЭДшо при ИМЗ 0,01 БОЕ/Кл составила 1250 МЕ/мл. Для сравнения противогерпесвирусная активность субстанции рекомбинантного ИФН альфа-2Ь: ИД50 при ИМЗ 0,1 БОЕ/Кл составила 962,5 МЕ/мл, ЭД100 при ИМЗ 0,1 БОЕ/Кл составила 962,5 МЕ/мл Под воздействием ЛП в концентрации 625 МЕ/мл происходит снижение инфекционного титра ацикло-вир-резистентных изолятов на 2,5 lg БОЕ/мл по сравнению с контролем

Противоаденовирусная активность ИФН аль-фа-2Ь-содержащих ЛП Концентрация 2000 МЕ/мл (ИД50) подавляет репродукцию аденовируса человека 5-го серотипа в культуре клеток 293 при низкой ИМЗ (в пределах 0,1 БОЕ/Кл). Предварительная обработка клеток ЛП в концентрации 1000 МЕ/мл за 24 ч до инфицирования повышает проявляемую им на культуре клеток про-тивоаденовирусную активность

Противогриппозная активность ИФН аль-фа-2Ь-содержащих ЛП При концентрации 5000 МЕ/мл наблюдали снижение инфекционного титра вируса гриппа А H3N2/Aichi/68 на 1,01 lg ТЦИД50/мл, вируса гриппа A H3N2/Aichi/68, выделенного из легочной ткани белых мышей, на 1,0 lg ТЦИД5о/мл, вируса гриппа А HiN,/USSR/77 на 2,32 lg ТЦИД5(/мл

Определение противовирусной активности По всем критериям (динамика среднего индекса ро-говичной патологии, сроки полной эпителизации ро-

ЛП in vivo на модели экспериментального герпетического кератита кроликов говицы и степени помутнения роговицы) отмечается преимущество глазных капель ИФН альфа-2Ь при сравнении с контрольной группой без лечения

Определение противовирусной активности in vivo на модели экспериментального ге-нитального герпеса морских свинок Местное нанесение ЛП на зону поражения через 3-4 ч после инфицирования животных предотвращало развитие выраженной местной симптоматики или ограничивало развитие инфекционного процесса.

Определение противовирусной активности комбинаций in vitro. На модели герпетической, гриппозной и аденовирусной инфекции были исследованы комбинации ИФН альфа-2Ь и других этио-тропных противовирусных препаратов: ацикловира (АЦВ), фосфита ацикловира (Ф-АЦВ); ганцикловира (ГНР); 9-p-D-арабинофуранозиладенина (АраА); 5-йод-2'-дезоксиуридина (ИДН); (Е)-5-(бромовинил)-2'-дезоксиуридина (БВИДН); рибавирина (РБН); тринатриевой соли фосфорномуравьиной кислоты (ФСТ), видарабина (ВДН) и кетоконазола (KKJ1) (рис. 3 и 4).

АЦВ + ИФН a-2b 0.2

ГНР + ИФНа-2Ь 0.28

ИДН * ИФН а-2Ь ЯНВ1 0,28 Ф-АЦВ + ИФН а-2Ь БВИДН . ИФН а-2Ь ФСТ + ИФН а-2Ь РБН + ИФН а-2Ь ВДН * ИФН а-2Ь ККЛ i ИФН а-2Ь

О 0,5 1 1,5 2 2,5 3

| Синергизм | Аддитизм | Антагонизм

Рисунок 3. Значение ФИК для комбинаций различных противовирусных ЛП и рекомбинантного ИФН альфа-2Ь

АЦВ + ИФН a-2b ГНР + ИФН ct-2b ИДН + ИФН а-2Ь Ф-АЦВ + ИФН а-2Ь Б8ИДН + ИФН а-2Ь ФСТ + ИФН а-2Ь РБН + ИФН а-2Ь ВДН + ИФН а-2Ь ККЛ + ИФН а-2Ь

О 5 10 15 20

При комбинированном использовании препаратов достижение противовирусного эффекта происходит при снижении ИД50 соединений в несколько раз.

Рисунок 4. Снижение ИД50 отдельных компонентов в комбинации

Представленные на рис. 3 и 4 данные однозначно указывают на то, что при комбинированном использовании препаратов достижение противовирусного эффекта происходит при снижении концентрации соединений, что имеет явное преимущество перед использованием ЛП по отдельности.

Определение противогрибковой активности in vitro. При изучении противогрибковой активности фиксированной комбинации ИФН альфа-2Ь и кетоконазола в отношении эталонного штамма С. albicans показано, что минимальная подавляющая концентрация (МПК) для кетоконазола равна 0,04 мкг/мл, МПК фиксированной комбинации ИФН альфа-2Ь и кетоконазола составила 0,04 мкг/мл. При оценке противогрибковой активности кетоконазола в отношении клинических изолятов С. albicans, выделенных от больных с дисбио-зом кишечника, около 22,5 % клинических изолятов были высоко чувствительны к кетоконазолу, МПК составила 0,02 мкг/мл. Около 8,8 % клинических изолятов имели чувствительность к кетоконазолу при концентрации 0,09 мкг/мл, около 10,8% — при 0,19 мкг/мл и 16,7% — при 0,78 мкг/мл. Полученные данные свидетельствуют о высокой активности комбинации ИФН альфа-2Ь и кетоконазола в отношении грибов рода С. albicans, при этом активность ЛП сопоставима с активностью субстанции кетоконазола.

Результаты сравнительных фармакокинетических исследований

Результаты сравнительного изучения биодоступности ИФН альфа-2Ь при его ректальном введении кроликам в виде суппозиториев и через катетер представлены в таблице 7.

Таблица 7. Фармакокинетические параметры ИФН альфа-2Ь при введении кроликам через ректальный катетер и в виде суппозиториев

Возраст животных Введение через ректальный катетер Введение в виде суппозиториев

xl0J AUC ЕДхмин/м л х105 AUC ЕДхми н/мл MRT мин X10J AUC ЕДхмин/ мл х 106 AUC ЕДхмин/ мл MRT мин

Половозрелые 5,97±0,69 0,997± 0,15 163,8± 6,97 7,4±0,45 1,3±0,09 175,04±4,8 9

Неполовозрелые 4,96±0,24 0,865± 0,044 175,9± 10,0 7,58±0,34 1,58±0,12 208,6±10,0

Показано, что AUC и среднее время удержания вещества (MRT) для взрослых и новорожденных кроликов при введении препарата в виде суппозиториев имеют большее значение по сравнению с этими же параметрами при введении субстанции катетером. Т1/2 ИФН аль-фа-2Ь из организма кроликов во всех случаях были приблизительно одинаковым. Стх ИФН альфа-2Ь в крови во всех случаях была также приблизительно одинаковой и составляла 26-32 мкг/мл. Таким образом, сравнительный анализ основных фармакокинетических параметров ЛП ИФН альфа-2Ь показал, что его применение в виде суппозиториев имеет явное преимущество перед применением с помощью ректального катетера.

Изучена фармакокинетика при ректальном введении кроликам комбинации ИФН альфа-2Ь с кетоконазолом. Установлено, что кето-коназол после ректального введения достаточно быстро поступает в системный кровоток (уже через 2 ч после введения достигается Стах). С увеличением дозы средние значения СтаХ и AUC пропорционально увеличиваются. Усредненные значения концентрации кетоконазола после его ректального введения в суппозиториях, содержащих 50, 100, 200 мг кетоконазола и 500 тыс. МЕ ИФН альфа-2Ь, и соответствующие фармакокинетические профили, рассчитанные по параметрам, показаны на рис. 5.

Время, ч

Рисунок 5. Усредненные фармакокинетические профили кетоконазо-ла после ректального введения в суппозиториях с разной концентрацией кетоконазола (50, 100 и 200 мг) и 500 тыс. МЕ ИФН альфа-2Ь.

Сравнение фармакокинетических параметров кетоконазола при введении ректально и в виде таблеток показало, что средние значения Стах и AUC в случае таблеток примерно в 2 раза выше, чем для суппозиториев (22,6 против 10,5 мкг/л и 146 против 70,9 мкгхч/мл соответственно). Величина отношения среднего значения AUC244 ДОЯ суппозиториев, содержащих 200 мг кетоконазола, к таковой для таблеток (относительная биодоступность) составляет около 50 %. Усредненные фармакокинетические профили кетоконазола после ректального введения в форме суппозиториев и в форме таблеток в дозировке 200 мг приведены на рис. 6.

-Д- Свечи

-1-1-1-1—

0 6 12 18 24

Время, Ч

Рисунок 6. Усредненные фармакокинетические профили кетоконазо-ла после ректального (суппозитории) и перорального (таблетки) введения в дозе 200 мг.

Таким образом, при ректальном введении кетоконазол быстро поступает в системный кровоток и его фармакокинетика при этом линейна. На фармакокинетический профиль кетоконазола при ректальном введении не оказывают влияние другие компоненты ЛП. При ежедневном ректальном введении кетоконазола в дозе 100 мг в крови животного не происходит кумуляции. Биодоступность кетоконазола при ректальном введении составляет около 50 % относительно таблеток.

Результаты изучения фармакокинетики при п/к и в/в введении ЛП ПЭГ ИФН альфа-2Ь на крысах представлены на рис. 7 и 8 и в табл. 8.

Рисунок 7. Фармакокинетиче- Рисунок 8. Фармакокинетиче-ский профиль ЛП ПегИнтрон® и ский профиль ЛП ПегИнтрон® и ПЭГ ИФН альфа-2Ь при п/к вве- ПЭГ ИФН альфа-2Ь при в/в введении крысам дении крысам

Стах ИФН альфа-2Ь наблюдали при в/в введении ПегИнтрона и ПЭГ ИФН альфа-2Ь через 15 минут (1027,1±155,0 нг/мл и 999,1±241,8 нг/мл соответственно).

Таблица 8. Концентрация ИФН в сыворотке крови крыс, нг/мл при п/к и в/в введении ЛП пэгилированных ИФН альфа-2Ь _

Время забора крови, ч ПегИнтрон, п/к ПЭГ ИФН альфа-2Ь, п/к ПегИнтрон, в/в ПЭГ ИФН альфа-2Ь, в/в

0,4 1,9±0,9 1,0±0,2 1027,1±155,0 999,1±241,8

1 10,5±3,4 15,6±6,4 452,3±62,6 253,1±29,4

6 47,2±5,6 40,5±4,7 81,6±15,5 29,0±3,5

12 63,1±11,3 36,2±7,0 36,4±4,1 15,8±2,0

24 23,9±2,3 13,2±3,0 10,6±2,9 7,8±1,4

48 8,0±0,2 4,6±1,9 5,8±0,7 2,9±0,6

72 3,7±0,3 1,2±0,3 5,2±4,0 0,8±0,2

96 0,7±0,1 0,5±0,1 0,5±0,1 0,3±0,1

168 0,2±0,1 0,2±0,1 0,1±0,03 0,1±0,03

Установлено, что при внутривенном введении препаратов, начиная с первого часа, концентрация ИФН альфа-2Ь снижалась (452,3±62,6 нг/мл в группе ПегИнтрон и 253,1±29,4 нг/мл в группе ПЭГ ИФН альфа-2Ь) и продолжала снижаться дальше. В последней временной точке (168 ч) его концентрация составила в обеих группах одинаковое значение: 0,1 ±0,03 нг/мл.

При п/к введении ПегИнтрона Стах ИФН наблюдали в точке 12 ч (63,1±11,3 нг/мл), а ПЭГ ИФН альфа-2Ь — в точке 6 ч (40,5±4,7 нг/мл), однако статистически достоверных межгрупповых различий в этих временных точках не обнаружено (6 и 12 ч). Достигнув Спта>: при п/к введении, концентрация ИФН альфа-2Ь также снижалась, и в точке 168 ч составил 0,2±0,1 нг/мл в обеих группах.

Таким образом, можно сделать заключение, что фармакокинети-ческий профиль тестируемого препарата ПЭГ ИФН альфа-2Ь сопоставим с ЛП сравнения ПегИнтрон.

Результаты исследования фармакокинетики ЛП ПегИнтрона и ПЭГ ИФН альфа-2Ь при п/к введении обезьянам представлены в табл. 9.

Таблица 9. Концентрация ИФН в сыворотке крови обезьян после п/к введения препаратов пэгилированного ИФН, нг/мл

ПЭГ ИФН альфа-2Ь ПегИнтрон

Время забо- Животное Животное Животное Животное

ра крови, ч № 37273 № 37009 № 37654 № 36846

0 14,8 0,0 0,0 0,0

1 56,5 247,2 141,0 9,5

3 192,4 769,4 492,8 279,3

6 277,7 821,4 388,4 364,0

12 119,6 490,6 237,2 286,7

24 91,8 144,5 247,4 252,2

48 55,8 96,0 88,1 81,4

72 63,4 34,3 36,0 34,6

96 29,4 12,8 38,0 21,7

120 13,5 4,8 0,7 3,4

168 24,6 0,0 10,2 0,0

. 1000

О 1 3 б 12 24 48 72 96 120 168

Время забора кроаи дян исследоаанин фармакочинетики

-«-ПЭГ ИФН альфо 2Ь. Животное № 37273 ♦ПЭГ ИФН ольфз-2Ь. Животное № 37009 -*-ПегИнтрон. Животное № 37654 -»«-ПегИнтрон, Животное № 36846

Рисунок 9. Фармакокинетический профиль препаратов ПегИнтрон" и ПЭГ ИФН альфа-2Ь при п/к введении ЛП обезьянам

Показано, что Стах достигается через 6 ч после введения. Фармакокинетический профиль тестируемого ЛП ПЭГ ИФН альфа-2Ь сопоставим с профилем ЛП сравнения ПегИнтрон.

При доклинической оценке безопасности ЛП в ЕС обязательным является проведение токсикокинетических исследований. Основной целью является описание системной экспозиции препарата у животных с учетом уровня токсических и нетоксических доз и продолжительности эксперимента. Данный вид исследований проводится параллельно с проведением токсикологических экспериментов.

Исследование фармакокинетики in vivo является распространенным методом оценки ЛП. Однако в случае биоаналогов не всегда данные, полученные на животных, могут быть эквивалентны данным, полученным на людях. В случае препаратов рекомбинантного ИФН альфа-2Ь исследование фармакокинетики на животных с определением основных фармакодинамических маркеров — 2',5'-олигоаденилатсинтетазы, р2-микроглобулина, неоптерина возможно только при применении доз выше 9 млн. МЕ, как описано выше.

Результаты сравнительных токсикологических исследований

Результаты токсикологического изучения ИФН альфа-2Ь в ЛФ суппозитории ректальные представлены в табл. 10.

Таблица 10. Изучение общетоксического действия, репродуктивной токсичности, аллергизирующего действия и влияния на иммунологический статус ЛП ИФН альфа-2Ь, суппозитории ректальные

Острая токсичность. Крысы (в т.ч. неполовозрелые), однократно в максимально возможной дозе для ректального введения 72800000 МЕ/кг). Резор-бтивно-токсического и ме-стнораздражающего действия не отмечено. Субхроническая токсичность. Кролики (ректально, 30 дней в дозе 2000000 МЕ/кг). Отмечено снижение количества эритроцитов и тромбоцитов. ЛП не оказывал общетоксического и местнораздражающего действия. Аллергенность. В опытах на неполовозрелых морских свинках аллергизирующего действия не выявлено (реакция общей анафилаксии, реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) при внутрикожном и конъ-юнктивальном введении).

Иммунотоксичность. В рамках изучения субхронической токсичности при ректальном введении кроликам не отмечено влияния на реакцию бласт-трансформации культивируемых in vitro лимфоцитов на Т- и В-клеточные митогены (фитогемагглю-тннин, конканавалин А, декстрансульфат), систему комплемента. Репродуктивная токсичность. Эмбриотоксиче-ское действие. Крысы (ректально, в дозах по ИФН 4286 МЕ; 14286 МЕ и 285720 МЕ). ЛП не влиял на течение беременности, не вызывал нарушений развития плода. Влияние на постнатальное развитие. Крысы (ректально по ИФН 285720 МЕ). ЛП не влиял на физическое развитие, сенсорно-двигательные рефлексы, эмоциональное поведение, координацию движений, обучаемость, память.

Установлено, что при однократном и многократном введении половозрелым и неполовозрелым животным ЛП ИФН альфа-2Ь, суппозитории ректальные, не оказывает резорбтивно-токсического и ме-стнораздражающего действия, не обладает репротоксическими, ал-лергизирующими и иммунотоксическими свойствами.

Исследования поведенческих реакций крыс под влиянием ИФН альфа-2Ь, суппозитории ректальные. Тестируемый ЛП или плацебо вводили животным ректально в дозе 285 720 МЕ/кг массы тела однократно и в течение 30 дней. На протяжении всего периода введения ЛП у животных не отмечено озноба, изменения температуры тела. ЛП также не влиял на поведение животных в тесте «открытое поле», не оказывал влияния на обучаемость животных, как в случае однократного, так и в случае длительного введения, не обладал ни анксиолитическим, ни анксиогенным действием. Таким образом, ЛП не изменял поведенческие реакции крыс, что косвенно может свидетельствовать об отсутствии у него влияния на настроение.

Результаты токсикологического изучения ИФН альфа-2Ь, гель для наружного и местного применения, представлены в табл. 11.

Таблица 11. Изучение общетоксического, аллергизирующего действия и влияния на иммунологический статус ЛП ИФН альфа-2Ь, гель для наружного и местного применения_

Острая токсичность. Неполовозрелые мыши (внутри-брюшинно, 7,2 млн. МЕ/кг), гибели не отмечено, отмечена кратковременная лейко- и тромбоцитопения, анемия Субхроническая токсичность. Крысы в т.ч. неполовозрелые (накожно, соответственно, до 500 мг/кг и 250 мг/кг 3 раза в сутки в течение 30 дней). Резорбтивно-токсического и мест-нораздражающего действия не отмечено. Раздражающее действие также не отмечено при однократном накожном нанесении крысам (в т.ч. неполовозрелым в дозе 2500 мг/кг и 1250 мг/кг соответственно), морским свинкам (в дозе 2500 мг/кг); при однократном введении геля в конъюнктивальный мешок кроликам (в дозе 70 мг) не выявлено гиперемии, отечности сосудов конъюнктивы, склеры и роговицы.

Аллергенность. Неполовозрелые морские свинки (кожные и конъюнктивальные пробы, анафилактогенная активность). Аллергизирующего действия не отмечено. Влияние на иммунокомпетентные органы. При изучении субхронической токсичности на неполовозрелых животных ЛП не влиял на массу тимуса и селезенки.

Установлено, что ИФН альфа-2Ь, гель для наружного и местного применения, при однократном и многократном нанесении половозрелым и неполовозрелым животным не обладает резорбтивно-токсическим, местнораздражающим и аллергизирующим действием.

Результаты токсикологического изучения ИФН альфа-2Ь, капли глазные, представлены в табл. 12.

Таблица 12. Изучение общетоксического действия препарата ИФН альфа-2Ь , капли глазные_

Субхроническая токсичность. ЛП вводили половозрелым и неполовозрелым кроликам в течение 30 дней, путем закапывания в один глаз при помощи микропипетки с объемом подачи 10 мкл (1 капля). Половозрелые животные получали ЛП в суточной дозе 30 мкл/кг и 150 мкл/кг, неполовозрелые —60 мкл/кг и 300 мкл/кг. Не отмечено влияния на физиологические, биохимические, гематологические и па-томорфологические показатели. Отличий в переносимости ЛП половозрелыми и неполовозрелыми кроликами не установлено._

Местнораздражающее действие. При глазной инсталляции ЛП в течение 30 дней половозрелым и неполовозрелым кроликам в суточных дозах до 150 мкл/кг и 300 мкл/кг соответственно, не отмечено слезотечения, отека, гиперемии сосудов конъюнктивы и склеры.

Установлено, что препарат ИФН альфа-2Ь, капли глазные, при многократной глазной инсталляции половозрелым и неполовозрелым кроликам не обладает резорбтивно-токсическим и местнораздражающим действием.

Результаты токсикологического изучения ИФН альфа-2Ь, раствор для местного применения, представлены в табл. 13.

Таблица 13. Изучение общетоксического, аллергизирующего действия и влияния на иммунологический статус ЛП ИФН альфа-2Ь, раствор для местного применения_

Острая токсичность. Интраназапьно: мыши -до 5000 мкл/кг, крысы (в т.ч. неполовозрелые) - до 2500 мкл/кг. Интраваги-нально: крысы - до 2500 мкл/кг. Гибели животных, токсических эффектов не отмечено. Субхроническая токсичность. Интраназапьно: крысы (в т.ч. неполовозрелые) - до 240 мкл/кг (превышает терапевтическую дозу более чем в 5 раз*) в течение 14 дней. Интравагинально: половозрелые крысы - до 1400 мкл/кг (10-кратная терапевтическая доза) в течение 14 дней. Физиологические, биохимические и патоморфологические показатели не отличались от контроля. Отличий в токсическом действии ЛП на неполовозрелых животных от половозрелых не отмечено. Местнораз-дражающего действия не зафиксировано.

Аллергенность. Мыши Иммунотоксичность. При оценке влияния на фа-

(реакция ГЗТ, активной гоцитарное, клеточное и гуморальное звенья ими пассивной кожной мунитета и систему комплемента токсических эф-анафилакции), крысы фектов не отмечено, (реакция дегрануляции тучных клеток): токсических эффектов не отмечено

Установлено, что ЛП ИФН альфа-2Ь, раствор для местного применения, при интраназальном и интравагинальном введении не оказывает резорбтивно-токсического и местнораздражающего действия, не обладает аллергизирующими свойствами, не влияет на фагоцитарное, клеточное и гуморальное звенья иммунитета, систему комплемента.

Результаты токсикологического изучения ИФН альфа-2Ь, раствор для местного применения, при интрауретральном введении животным представлены в табл. 14.

Таблица 14. Изучение общетоксического действия ИФН альфа-2Ь, раствор для местного применения, при интрауретральном введении

Острая токсичность. При однократном интрауретральном введении (кролики-самцы, 0,3 мл/животное или 12000 МЕ/животное) резорбтивно-токсического и местнораздражающего действия не отмечено

Субхроническая токсичность. При интрауретральном введении (кролики-самцы, 0,3 мл/животное/сутки в течение 30 дней) не отмечено влияния на общее состояние животных, состав периферической крови, мочи, состав сыворотки крови, состояние внутренних органов, а также местноразд-ражающего действия_

Примечание: доза 0,3 мл/животное обеспечивала избыточное заполнение уретры.

Установлено, что при однократном и многократном интрауретральном введении кроликам ИФН альфа-2Ь, раствор для местного применения, не обладал резорбтивно-токсическим и местнораздра-жающим действием.

Результаты токсикологического изучения ИФН альфа-2Ь, суппо- -зитории вагинальные, при интравагинальном введении животным представлены в табл. 15.

Таблица 15. Изучение общетоксического действия ИФН альфа-2Ь,

суппозитории вагинальные _

Острая токсичность. Субхроническая токсичность. При

При интравагинальном введе- интравагинальном введении крысам (50, нии мышам (4500 мг/кг) и кры- 250 и 500 мг/кг) в течение 60 дней ЛП не сам (3000 мг/кг) резорбтивно- обладал токсическим воздействием на ор-

токсического и местнораздра-жающего действия не отмечено ганизм животных, не оказывал местноразд-ражающего действия

Установлено, что ЛП V ФН альфа-2Ь, суппозитории вагиналь-

ные, при однократном и многократном интравагинальном введении животным не оказывал резорбтивно-токсического и местнораздра-жающего действия.

Результаты токсикологического изучения ИФН альфа-2Ь, мазь, представлены в табл. 16.

Таблица 16. Изучение общетоксического, аллергизирующего действия и влияния на иммунологический статус ИФН альфа-2Ь, мазь_

Субхроническая токсичность. Кролики (накожно до 300 мг/кг 3 раза в день в течение 30 дней). Резорбтивно-токсического и местнораздражающего действия не отмечено. Раздражающее действие (дополнительные исследования; кролики, морские свинки: накожно 10 г/кг, однократно). Не отмечено образования эритемы, утолщения кожной складки и других признаков воспаления. При нанесении кроликам 50 мг мази на слизистую оболочку глаза ЛП не вызывал гиперемии, отечности конъюнктивы, склеры и роговицы Аллергенность. Использованы методы: ГЗТ (мыши, сенсибилизация 15000 и 150000 МЕ/кг, терапевтическая и в 10 раз превышающая терапевтическую), реакция активной кожной анафилаксии (мыши, сенсибилизация 15000 и 150000 МЕ/кг, терапевтическая и в 10 раз превышающая терапевтическую), эпику-танная сенсибилизация (крысы, сенсибилизация ИФН в дозах 15000 и 150000 МЕ/кг: реакции специфического лизиса лейкоцитов и де-грануляции тучных клеток). Аллергизирующего действия не отмечено

Иммунотоксичность. По окончании изучения субхронической токсичности при накожном нанесении мази определяли уровень неспецифической резистентности животных (по фагоцитарной активности нейтрофилов) и уровень комплемента в сыворотке крови. Токсические эффекты не выявлены

Установлено, что ИФН альфа-2Ь, мазь, не обладает резорбтивно-токсическим, местнораздражающим, аллергизирующим и иммуно-токсическим действием.

Результаты проведенных токсикологических исследований подтверждают безопасность ИФН альфа-2Ь: по данным всех проведенных токсикологических исследований ИФН альфа-2Ь характеризуется низкой степенью токсичности вне зависимости от ЛФ.

Экспериментальное изучение общетоксического и местно-раздражающего действия комбинации ИФН альфа-2Ь и кетоко-назола, суппозитории ректальные и вагинальные, на половозрелых животных при ректальном введении. Исследуемый ЛП или плацебо вводили животным ректально в виде подогретой до 35 С

суппозиторной массы 2 раза в день в течение 30 дней в разовых дозах 25 мг/кг (12 500 ME/кг ИФН альфа-2Ь и 5 мкг/кг кетоконазола) и 250 мг/кг (125 ООО ME/кг ИФН альфа-2Ь и 50 мкг/кг кетоконазола) массы тела. В результате проведенного исследования установлено, что при однократном введении ЛП кроликам в дозе 1000 мг/кг (500 000 МЕ/кг ИФН альфа-2Ь и 200 мкг/кг кетоконазола) ректально не обнаружено общетоксического и местнораздражающего действия. При повторном многократном введении доз 25 мг/кг (12500 ME/кг ИФН альфа-2Ь и 5 мкг/кг кетоконазола) и 250 мг/кг (125 000 ME/кг ИФН альфа-2Ь и 50 мкг/кг кетоконазола) в течение 30 дней не отмечено изменений в поведении животных, в состоянии кожного покрова и видимых слизистых оболочек, не выявлено изменений в показателях крови и мочи. По полученным данным было сделано заключение о том, что комбинация ИФН альфа-2Ь с кетоконазолом, суппозитории, при многократном введении не оказывала местнораздражающего и общетоксического действия.

Экспериментальное изучение общетоксического и местнораздражающего действия комбинации ИФН альфа-2Ь и кетоконазола, суппозитории ректальные и вагинальные, на половозрелых животных при интравагиналыюм введении. Исследуемый ЛП или плацебо вводили животным интравагинально в виде подогретой до 35 С суппозиторной массы 2 раза в день в течение 30 дней в разовой дозе 3000 мг/кг (470 000 ME/кг ИФН альфа-2Ь и 200 мкг/кг кетоконазола). По полученным данным было сделано заключение о том, что комбинация ИФН альфа-2Ь с кетоконазолом, суппозитории, при многократном введении крысам интравагинально не оказывал местнораздражающего и общетоксического действия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проделанной работы была разработана комплексная программа проведения качественных доклинических исследований биоаналогов рекомбинантного ИФН альфа-2Ь, которая включает:

1. Качество:

1.1. Подлинность: (оценка специфической активности биологическим методом (реакция нейтрализации противовирусной активности), электрофорез в ПААГ, изоэлектрическое фокусирование, пептидное картирование).

1.2. Сравнительный профиль примесей (электрофорез в ПААГ, ВЭЖХ).

2. Фармакодинамические исследования:

2.1. Исследования in vitro'.

С целью выявления различий в биологической активности между аналогичным ЛП и ЛИ сравнения необходимо представить результаты ряда сравнительных исследований (например, исследования связывания с рецептором, противовирусных эффектов на культуре клеток, антипролиферативных эффектов на клеточных линиях опухолей человека), результаты большинства из которых могут быть доступны по итогам изучения качества. Сравнительные исследования должны проводиться на основе адекватных, современных валидированных методов.

2.2. Исследования in vivo:

Для подтверждения сопоставимости по исследуемым показаниям фармакодинамическую активность биологически аналогичного ЛП и ЛП сравнения можно количественно сравнить на:

• подходящих фармакодинамических моделях на животных, например, путем оценки фармакодинамических маркеров, как то активность сывороточной 2',5'-олигоаденилатсинтетазы.

или

• подходящих опухолевых моделях на животных (например, бестимусных мышах, являющихся носителями ксенотранспланта-тов опухоли человека).

или

• подходящих вирусных моделях на животных.

3. Сравнительные фармакокинетические исследования ИФН альфа-2Ь на животных не проводятся, так как они обладают низкой прогностической ценностью. Полноценные фармакокинетические исследования рекомендуется проводить в ходе I фазы клинических исследований.

4. Токсикологические исследования:

Необходимо представить результаты, как минимум, одного исследования субхронической токсичности при многократном введении на животных.

При проведении исследований токсичности при многократном введении необходимо предусмотреть проведение надлежащих токси-кокинетических исследований и изучение иммуногенности.

Необходимо представить результаты исследования местной переносимости на не менее чем одном виде животных. Исследование

местной переносимости может составлять часть исследований токсичности при многократном введении, описанных выше.

При доклиническом изучении биологически аналогичных ЛП, содержащих ИФН альфа, результаты исследований фармакологической безопасности, репродуктивной токсичности, мутагенности и канцерогенное™, как правило, представлять не требуется.

Схема подтверждения биологической аналогичности ЛП ИФН альфа-2Ь на этапе изучения качества и доклинических исследований представлена на рис. 10.

Программа апробирована при проведении доклинических исследований ЛП ИФН альфа-2Ь, комбинации ИФН альфа-2Ь и кетоко-назола и ПЭГ-ИФН альфа-2Ь. Разработаны протоколы клинических исследований I фазы для комбинации ИФН альфа-2Ь с кетоконазолом и ПЭГ-ИФН альфа-2Ь. Предполагается, что результаты клинических исследований будут получены в 2013-2014 гг.

Сравнительное изучение качества

Изучение подлинности

Биологическая активность Электрофорез в ПЛАГ Изоэлектрическое фокусирование Пептидное картирование

Изучение профиля примесей

Электрофорез » 1ІААГ ВЭЖХ

1. Качества подтверждено - 2. Аналогичность по качестку доказана

Сравнительные доклинические исследования

Токсикологические исследования

Фармакодинамические исследования

Исследования токсичности при многократном введении

Токсикокинетика Иммуногенность Местная переносимость

прочие виды исследований, как правило, не требуются

In vitro

Связывание с рецептором

Противовирусные эффекты на культуре клеток

Анталрол ифератмные эффекты на клеточных линиях опухолей

In vtvo

Оценка

фармако динамических маркеров

Противовирусные эффекты

Противоопухолевые эффекты

Клинические исследования

В зависимости от результатов определяется объем клинических исследований

Рисунок 10. Схема подтверждения биологической аналогичности ЛП ИФН альфа-2Ь на этапе изучения качества и доклинических исследований

ВЫВОДЫ

1. Впервые разработана комплексная программа качественных доклинических исследований биологически аналогичных ЛП рекомбинантного ИФН альфа-2Ь. Включенные в нее методики по подтверждению качества, эффективности и безопасности являются базовыми для подтверждения биологической аналогичности и достаточными при планировании и проведении надлежащего изучения новых субстанций и ЛП рекомбинантного ИФН альфа-2Ь.

2. При доклинических исследованиях качества (подлинность, специфические и неспецифические примеси) биологически аналогичных ЛП рекомбинантного ИФН альфа-2Ь обосновано применение ВЭЖХ, электрофореза в ПААГ, методов пептидного картирования и изоэлектрофокусирования, позволяющих определить подлинность субстанции ИФН альфа-2Ь и ЛП, полученных на ее основе. При оценке специфических и неспецифических примесей в образцах площадь основного пика составила 98,46-98,69 %. Площадь дополнительных пиков не превышала 2 %, что соответствует международным требованиям.

3. При установлении подлинности активной субстанции ЛП ИФН альфа-2Ь, предназначенных для наружного и местного применения, следует использовать биологический метод оценки противовирусной активности и метод нейтрализации противовирусной активности в связи с малой концентрацией активного компонента. Установлен диапазон доз ингибирующего эффекта на ЦПД различных вирусов в культуре клеток в зависимости от ИМЗ (от 0,01 до 0,1 БОЕ/Кл). Одновременно с определением специфической активности необходимо проведение реакции нейтрализации противовирусной активности анти-альфа-интерфероновым иммуноглобулином.

4. Подтверждена in vivo противовирусная активность изученных ЛФ ИФН альфа-2Ь на экспериментальной модели генитально-го герпеса (морские свинки) и герпетического кератита (кролики) на основе оценки различий в площади поверхности поражения (%, t-тест, р <0,05), интенсивности признаков воспаления (баллы, тест Манна-Уитни, р <0,05), сроков полной эпителизации слизистой оболочки (дни, t-тест, р <0,05), индексе роговичной патологии (баллы, тест Манна-Уитни, р <0,05), степени помутнения роговицы

(баллы, тест Манна-Уитни, р <0,05), сроках полной эпителизации роговицы (дни, t-тест, р <0,05).

5. Установлена безопасность исследованных фармацевтических субстанций и готовых ЛФ рекомбинантного ИФН альфа-2Ь на различных видах лабораторных животных при сравнительных доклинических исследованиях общетоксических свойств в условиях острых и хронических экспериментов, в т.ч. местнораздражающего действия при различных путях введения. Показана нецелесообразность изучения острой токсичности и экспериментов на неполовозрелых животных (в дозах до 70 млн. МЕ/кг), что позволяет сократить количество лабораторных животных и затраты на исследования до 20 %.

6. При сравнительных доклинических исследованиях специфических видов токсичности ЛП рекомбинантного ИФН альфа-2Ь установлена их идентичная иммуногенность (базовый показатель биоаналогичности) и показана нецелесообразность изучения влияния на репродуктивную функцию и эмбриотоксичность, что позволяет сократить количество лабораторных животных и затраты на исследования до 30 %.

7. Определены в эксперименте основные фармакокинетиче-ские параметры: С™« (при и/к введении крысам: 6ч- 40,5±4,7 нг/мл; обезьянам: 6ч- 277,7 и 821,4 нг/мл), AUC (у крыс в дозе от 4914 до 29400 мкг/м2 AUCo^ - от 1,06х10б до 6,38х106 ЕДхч/мл; у обезьян - в дозе от 1413 до 14126 мкг/м2 - от 0,39хЮ6 до 6,18х10б), средний Т1/2 из плазмы (у крыс - 20±2,2 ч, обезьян - 30±3,1 ч). Показана нецелесообразность изучения фармакокинетики биоаналогов ИФН альфа-2Ь на животных ввиду высокой вариабельности и линейности фармакокинетических параметров.

8. Впервые методом определения ФИК и оценки ИД50 отдельных компонентов определены фармакодинамические параметры новых комбинаций рекомбинантного ИФН альфа-2Ь с др. хи-миотерапевтическими ЛП in vitro на моделях герпетической, гриппозной, аденовирусной и грибковой инфекции (ИФН альфа-2Ь + ацикловир - ФИК = 0,2, снижение ИД50 в -10 и -9,8 раза для каждого компонента комбинации соответственно; ИФН альфа-2Ь + ганцикловир - ФИК = 0,8, снижение ИД50 в - 20 и ~ 4,4 раза для каждого компонента комбинации соответственно). Для комбина-

ции с кетоконазолом синергизма, аддитизма и антагонизма не выявлено (ФИК = 1,0).

9. Впервые изучены фармакологические свойства новой фиксированной комбинации ИФН альфа-2Ь с кетоконазолом и нового биоаналога ИФН альфа-2Ь, ковалентно связанного с одной линейной молекулой монометоксиполиэтиленгликоля (ПЭГ ИФН альфа-2Ь). По разработанной программе проведено доклиническое изучение фармакодинамики, безопасности и фармакокинетики указанных биоаналогов, необходимое для обоснования сокращенной программы доклинических и клинических исследований.

10. По результатам сравнительного изучения качества и доклинических исследований разработаны программы дальнейшего изучения ЛП пэгилированного ИФН альфа-2Ь и комбинации ИФН альфа-2Ь с кетоконазолом, начинающиеся с I фазы клинических исследований.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Сформулированы общие принципы стандартизации и проведения фармацевтических, фармакодинамических, фармакокинети-ческих, токсикологических доклинических исследований моно- и поликомпонентных биоаналогов (в нашем случае противовирусных ИФН альфа-2Ь-содержащих ЛП), которые предлагается использовать при планировании исследований.

2. По итогам исследования разработана программа качественных доклинических исследований биологически аналогичных ЛП рекомбинантного ИФН альфа-2Ь. Разработаны методические рекомендации по планированию и проведению указанных исследований в РФ.

3. Полученные данные об эффективности комбинаций рекомбинантного ИФН альфа-2Ь и ЛП др. фармакотерапевтических групп позволяют предложить новые комбинированные схемы терапии вирусных и вирусно-бактериальных инфекций.

4. Для повышения конкурентных преимуществ отечественных ЛП рекомендуется проводить их доклинические исследования на основе требований надлежащей лабораторной практики, с учетом не только отечественных, но и международно-признанных нормативных документов. Необходим контроль методик организации исследований, личного состава исследователей, помещений, в которых проводятся доклинические исследования и содержатся животные, качества

животных, условий их содержания, лабораторного или экспериментального оборудования и его калибровки, испытуемого и контрольного вещества, их чистоты, способов введения, составления и проведения подробной стандартной методики экспериментальных работ и порядка проведения исследований, регистрации данных и оформления отчета, а также их хранения, требований к службе контроля качества исследований, включая гуманное обращение с животными.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Калетра (лопинавир/ритонавир) — новый ингибитор ВИЧ-протеаз / Ершов Ф.И., Касьянова Н.В., Васильев А.Н. // Антибиотики и химиотерапия — 2002 г. — том 47, № 11 — С.27-29.

2. Новый анти-ВИЧ препарат — Агенераза (ампренавир) / Ершов Ф.И., Касьянова Н.В., Васильев А.Н. // Антибиотики и химиотерапия — 2002 г. — том 47, № 8 — С.29-31.

3. Методические указания по определению индивидуальной чувствительности организма к интерферонам, другим цитокинам и индукторам интерферона / Ершов Ф.И., Мезенцева М.В., Васильев А.Н., и др. // Ведомости Научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств. — 2002. — №1. — С. 22-26.

4. Методические указания по проведению доклинических исследований цитокин-индуцирующей активности антивирусных препаратов / Ершов Ф.И., Мезенцева М.В., Васильев А.Н. и др. // Ведомости Научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств. — 2002. — №1. — С. 26-29.

5. Тризивир (абакавир, ламивудин, зидовудин) — новый препарат для лечения ВИЧ-инфекции / Ершов Ф.И., Касьянова Н.В., Васильев А.Н. // Новые лекарства — 2003. — №4. — С. 15-18.

6. Методические указания по изучению специфической противовирусной активности фармакологических веществ / Ершов Ф.И., На-ровлянский А.Н., Васильев А.Н. и др. // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под общей редакцией член-корр. РАМН, проф. Р.У Хабриева. — 2 изд., перераб. и доп. —М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. — С.532-557.

7. Вопросы рационального использования противовирусных лекарственных средств / Васильев А.Н. // Тез. докл. XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство». — Москва, 16-20 апреля 2007 г. — ООФ «Здоровье человека». — 2007. — С.535.

8. Глоссарий терминов, наиболее часто используемых в процессе экспертной оценки и регистрации лекарственных средств. Буданов C.B., Кукес В.Г., Васильев А.Н., и др. //Проект. — М. — Издательский дом «Русский врач». — 2007. — 68 с.

9. Доклинические и клинические исследования лекарств — современные требования, подходы к экспертизе / Васильев А.Н. // Материалы Всероссийской конф. по вопросам государственного регулирования в сфере обращения лекарственных средств и медицинских изделий.

— М. — Минздрава. Росздравнадзор. — 2007. С. 37-44.

10. Местная терапия простого герпеса: PRO и CONTRA / Халдин A.A., Самгин М.А., Баскакова Д.В., Васильев А.Н. // Российский журнал кожных и венерических болезней. Приложение «Герпес». — 2007. — №2. С.4-10.

11. Мониторинг безопасности проведения клинических исследований лекарственных средств / Сюбаев Р.Д., Енгалычева Г.Н., Васильев А.Н., и др. // Шестая международная конференция «Клинические исследования лекарственных средств» 12 октября 2007 г. — Матер, конф.

— Москва, Россия. — РАМН, Минздрава, РАН. — С. 109-110.

12. Новый подход в профилактике и лечении ассоциированных грибковых инфекций различной локализации / Васильев А.Н., Малиновская В.В., Бойков С.С., Парфенов В.В, Мороз А.Ф. // Ведомости научного центра экспертизы средств медицинского применения. — 2007.

— №3. С.44-48.

13. Новый подход в профилактике и лечении ассоциированных грибковых инфекций различной локализации / Васильев А.Н., Малиновская В.В., Парфенов В.В, Мороз А.Ф., Налетова Е.Г. // Тез. Докл. Международная конференция 50-я годовщина открытия интерферона

— Оксфорд, Англия, 16 — 19 сентября 2007.

14. Применение Виферона при тяжелых формах вульгарных угрей у мужчин / Корнева JT.B., Малиновская В.В., Молочков A.B., Васильев А.Н. // Тез. докл. XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». — Москва, 16-20 апреля 2007 г. — ООФ «Здоровье человека». — 2007. — С.120.

15. Рекомендуемый объем исследований эффективности современных антивирусных ЛП / Васильев А.Н., Буданов C.B. // Тез. докл. XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство». — Москва, 16-20 апреля 2007 г. — ООФ «Здоровье человека». — 2007. — С.535-536.

16. Роль системы изопреноидов в противовирусном иммунитете / Наровлянский А.Н., Васильев А.Н., Савойская С.Л. и др. // В книге:

Интерферону — 50 лет. — Матер, научно-практ. конф. — 19-20 ноября 2007 г. — Москва. — 2007. — С.106-125.

17. Система изопреноидов: роль в противовирусном иммунитете / Наровлянский А.Н., Васильев А.Н. и др. // Ведомости научного центра экспертизы средств медицинского применения. — 2007. — №3. С.66-77.

18. Фармакологические особенности комплексного препарата Виферон / Васильев А.Н., Малиновская В.В., Парфенов В.В. // Вестник педиатрической фармакологии и нутрициологии. — 2007. — Том 4. №1. -С.42-45.

19. Терапия рецидивирующей генитальной формы герпесвирус-ной инфекции у женщин / Васильев А.Н., Каграманова Ж.А., Малиновская В.В., Парфенов В.В., Выжлова E.H., Серова Е.В. // Лечащий врач.

— 2012,—№5. С.68-70.

20. Применение препарата Виферон, мазь, для профилактики ОРВИ у детей / Макарова З.С., Васильев А.Н., Доскин В.А., Малиновская В.В., Парфенов В.В., Мешкова E.H. // Антибиотики и химиотерапия — 2008 г. — том 53, № 3-4 — С.9-12.

21. Применение препарата Виферон, суппозитории, при гриппе у взрослых больных / Гатич Р.З., Колобухина Л.В., Васильев А.Н., и др.// Антибиотики и химиотерапия — 2008 г. — том 53, № 34 — С.13-17.

22. Применение сверхмалых доз антител к гамма-интерферону в лечении и профилактике вирусных инфекций / Васильев А.Н., Сергеева С.А., Качанова М.В. и др. // Антибиотики и химиотерапия — 2008 г. — том 53, № 3-4 — С. 32-35.

23. Противовирусная и иммуномодулирующая активность полипренилфосфатов при вирусных инфекциях / Васильев А.Н., Ожерелков C.B., Козлов В.В. и др. / Антибиотики и химиотерапия

— 2008 г. — том 53, № 3-4 — С.3-8.

24. Разработка гармонизированных требований к экспресс-отчетам о клинических исследованиях / Васильев А.Н., Сюбаев Р.Д., Верстакова О.Л. и др. // Тез. докл. XV Российского национального конгресса «Человек и лекарство». — Москва, 14-18 апреля 2008 г. — С.530.

25. Разработка гармонизированных требований к периодическим отчетам о клинических исследованиях / Енгалычева Г.Н., Сюбаев Р.Д., Васильев А.Н. и др. // Тез. докл. XV Российского национального конгресса «Человек и лекарство». — Москва, 14-18 апреля 2008 г. — С.538.

26. Фортепрен — новый перспективный антигерпесный и иммуномодулирующий препарат на основе полипренилфосфатов / Наровлянский А.Н., Парфенова Т.М., Васильев А.Н. и др. II России-

ский иммунологический журнал РАН. — 2008. — Том 2(11), Номер 2-3 -С.256.

27. Виферонотерапия и ее эффективность у беременных со смешанной урогенитальной инфекцией / Новикова C.B., Шугинин И.О., Васильев А.Н. и др. // Тез. докл. XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». — Москва, 6-10 апреля 2009 г. — С.399-400.

28. Иммуномодулирующая активность полипренилфосфат — содержащих препаратов при герпетической инфекции / Васильев А.Н., Наровлянский А.Н., Ожерелков C.B. и др. / Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней. Сборник научных трудов (выпуск 9) —2009 г. —С.237.

29. Интерфероны первого типа — индукция и механизмы противовирусного действия / Васильев А.Н., Малиновская В.В., Парфенов В.В., Дмитриева Е.В. // Антибиотики и химиотерапия — 2009 г. — том 54. — № 7-8. — С. 50-55.

30. Критерии оценки безопасности внесения изменений в состав вспомогательных веществ зарегистрированного лекарственного средства / Верстакова O.JL, Сюбаев Р.Д., Васильев А.Н., Енгалычева Г.Н. // Тез. докл. XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». — Москва, 6-10 апреля 2009 г. — С.630.

31. Местное применение препарата интерферона в лечении сте-нозирующего ларинготрахеобронхита у детей / Васильев А.Н., Малиновская В.В., Кладова О.В., и др. // Тез. докл. XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». — Москва, 6-10 апреля 2009 г. —С.424-425.

32. Методическое пособие по исследованию антиоксидантных свойств ЛП // Бердников Н.Г., Буданов C.B., Васильев А.Н. и др. / Под редакцией профессора Юргеля Н.В., доктора биологических наук Новикова К.Н.. — М. — Издательский дом «Русский врач». — 2009. — 36 с.

33. Методические рекомендации по подготовке текста инструкции по медицинскому применению ЛП. / Юргель Н.В., Давыдова К.С., Васильев А.Н. и др. // Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения и социального развития. — М. — 2009. — 47с.

34. Опыт применения Виферона-геля для профилактики и лечения ларинготрахеитов у детей дошкольного возраста / Каюмова Д.А., Кулагина М.Г., Боровикова Е.В., Васильев А.Н. // Тез. докл. XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». — Москва, 6-10 апреля 2009 г. — С.439.

35. Препарат Виферон, суппозитории, в терапии рецидивирующей герпесвирусной инфекции у женщин / Васильев А.Н., Ка-граманова Ж.А., Малиновская В.В., Парфенов В.В. // Антибиотики и химиотерапия — 2009 г. — том 54, № 5-6 — С.54-58.

36. Разработка новых методических документов по доклинической оценке эффективности и безопасности новых лекарственных средств / Васильев А.Н., Верстакова O.JL, Сюбаев Р.Д., Крутикова Н.М. // Тез. докл. XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». — Москва, 6-10 апреля 2009 г. — С.53.

37. Разработка унифицированных требований к отчетам о безопасности клинических исследований / Енгалычева Г.Н., Сюбаев Р.Д., Васильев А.Н., Буданов C.B. // Тез. докл. XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». — Москва, 6-10 апреля 2009 г. — С.656.

38. Совершенствование экспериментальной и экспертной оценки новых лекарственных средств, полученных с помощью новых технологий / Сюбаев Р.Д., Верстакова O.JI., Васильев А.Н. // Тез. докл. XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». — Москва, 6-10 апреля 2009 г. — С.744.

39. Эффективность анаферона в комплексной терапии гени-тального герпеса / Зуйкова И.Н, Васильев А.Н., Шульженко А.Е. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины — 2009 г. — приложение к №8 — С.45-49.

40. Эффективность терапии рецидивирующей генитальной формы герпесвирусной инфекции препаратом Виферон, гель для местного применения, у женщин / Васильев А.Н., Каграманова Ж.А., Малиновская В.В. и др. // Клиническая дерматология и венерология — 2009 г. — № 4 — С.88-91.

41. Оценка влияния антиоксидантов на специфическую противовирусную активность интерферона альфа-2Ь человеческого рекомбинантного в отношении вируса простого герпеса в культуре клеток / Васильев А.Н. // Антибиотики и химиотерапия — 2010 г. — том 55, № 7-8 — С.20-25.

42. Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских исследованиях / Асташкин Е.И., Ачкасов Е.Е., Васильев А.Н. и др. // Рекомендовано Учебно-методнческнм объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для системы медицинского и фармацевтического послевузовского образования. — М. — Профиль-2С. — 2010. — 358с.

43. Информационное обеспечение безопасности комбинированной фармакотерапии / Сюбаев Р.Д., Васильев А.Н. , Яворский А.Н., Енгалычева Г.Н. // Ремедиум — 2011 г., №4 — С.81-82.

44. Противовирусная активность антиоксидантов и их комбинаций с интерфероном альфа-2Ь человеческим рекомбннантным в отношении вируса гриппа птиц A/H5N1 / Васильев А.Н., Дерябни П.Г., Галегов Г.А. // Цитокины и воспаление — 2011 г. — том 10, №2 — С.32-37.

45. Антивирусная активность рекомбннантного интерферона альфа-2Ь в комбинации с некоторыми антиоксидантами / Васильев А.Н., Дерябин П.Г., Галегов Г.А. // Антибиотики и химиотерапия — 2012 г. — том 56. — № 9-10. — С. 27-32.

46. Современные аспекты герпесвирусной-инфекции. Эпидемиология, клиника, диагностика, лечение и профилактика. Методические рекомендации №23 Правительство Москвы, Департамент здравоохранения / Каржас Н.В., Малышев H.A., Рыбалкина Т.Н., Васильев А.Н. и др. // М.: Спецкнига — 2012 г. — 128 с.

47. Качественные доклинические исследования — необходимый этап разработки и внедрения в клиническую практику новых ЛП / Васильев А.Н. // Антибиотики и химиотерапия — 2012 г. — том 57. — № 1-2 — С.41-50.

48. Изучение токсичности и защитных свойств интерферона альфа-2Ь с антиоксидантами и специфических противовирусных химиопрепаратов при герпесвирусных инфекциях in vitro и in vivo / Васильев А.Н., Климова P.P., Тюленев Ю.А. // Эпидемиология и инфекционные болезни. — 2012 г. — № 2. — С. 29-35.

49. Совершенствование диагностики герпесвирусных инфекций / Васильев А.Н., Федорова Н.Е., Климова P.P., Адиева A.A., // Клиническая лабораторная диагностика. — 2012 г. — № 6. — С. 52-55.

50. Методические рекомендации по составлению, изложению и оформлению инструкции по применению ЛП (утверждены Минздрав-соцразвития в 2012 г.).

51. Методические рекомендации по общим принципам проведения клинических исследований, MP № 10-02/02/10-2012, Москва 2012.

52. Методические рекомендации по составлению протокола контролируемого клинического исследования ЛП (выбор контрольной группы), MP № 11-02/02/10-2012, Москва 2012.

53. Рациональный выбор наименований лекарственных средств: Методические рекомендации. — М.: ФГБУ «НЦЭСМП» Минздравсоц-развития России, 2012. — 35 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AUC Площадь под фармакокинетической кривой «концен-

трация-время»

СНМР Committee for Medicinal Products for Human Use

Стах Максимальная концентрация

EDQM European Directorate for the Quality of Medicines

ЕМА European Medicines Agency

MRT Среднее время удержания вещества

БОЕ Бляшкообразующая единица

ВЭЖХ Высокоэффективная жидкостная хроматография

ГЗТ Гиперчувствительность замедленного типа

ГФ Государственная фармакопея

ИД Ингибирующее действие

ИМЗ Инфекционная множественность заражения

ИФН Интерферон

ЛП Лекарственный препарат

ЛФ Лекарственная форма

мпк Минимальная подавляющая концентрация

ПААГ Полиакриламидный гель

ПЭГ Полиэтиленгликоль

ПЭГ-ИФН Пэгилированный интерферон

ТЦИД Тканевая цитопатическая инфекционная доза

ФИК Фракционный ингибирующий коэффициент

ЦПД Цитопатическое действие

ЭД Эффективная доза

Подписано в печать:

13.12.2012

Заказ №> 7979 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 wwvv.autoreferat.ru