Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Эндотелий сосудов в иммунопатогенезе инфекции, вызванной вирусом иммунодефицита человека

РГ6 ОД

. Л. > IV ! •

На правах рукописи

ЩЕГЛОВИТОВА Ольга Николаевна

ЭНДОТЕЛИЙ СОСУДОВ В ИММУНОПАТОГЕНЕЗЕ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ ВИРУСОМ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА

14.00.36 — Аллергология и иммунология 03.00.06 — Вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва — 1996

На правах рукописи

ЩЕГЛОВИТОВА ОЛЬГА НИКОЛАЕВНА

ЭНДОТЕЛИЙ СОСУДОВ В ИММУН0ПАТ0ГЕНЕЗЕ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ ВИРУСОМ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА

14.00.36 - аллергология и иммунология 03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 1996

Работа выполнена в научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН

Научные консультанты: член-корр. РАМН, профессор Ф.И.Ершов

доктор мед. наук, профессор Т.Г.Орлова

Официальные оппоненты: доктор мед. наук, Р.К.Чайлахян

доктор мед. наук, профессор И.Г.Сидорович доктор мед. наук, профессор И.Ф.Баринский

Ведущая организация - ЦНИИ эпидемиологии Госкомсанэпиднадзора России

на заседании Диссертационного сонета Д 001.07.01 в НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН по адресу : 123098, г. Москва, ул. Гамалеи 18

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

Зашита состоится

1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Е.И. Коптелова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Организм человека является саморегулирующейся системой, в которой эндотелий сосудов осуществляет функцию проницаемого барьера между кровью и тканями и, взаимодействуя с клетками крови. способствует их распространению по организму, тем самым поддерживая его гомеостаз (BeilkeM.A., 1989, SpringerT. А., 1992, Springer Т.А., 1994)). В последнее время опубликованы данные об участии эндоте-лиалышх клеток (ЭК) кровеносных сосудов в проявлениях клеточного и гуморального иммунитета (Mantovani A., Dejana Е.. 1989, Pober J.S., и др. 1990). ЭК функционируют как антигенпредставляющие клетки (АПК), влияют на выработку цитокинов иммунокомпетентными клетками, оказывают воздействие на продукцию иммуноглобулинов В-лимфоцитами. Под влиянием цитокинов ЭК активируются, вследствие чего меняется выраженность их участия в межклеточных взаимодействиях. Однако, остается неизвестной роль ЭК в функционировании системы интерферона.

Воспалительные поражения сосудов, васкулиты, часто сопровождают целый ряд инфекционных и неинфекционных заболеваний, в том числе и синдром приобретенного иммунодефицита (СПИЛ) (Levy Y.A., 1993). Антигены вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вызывающего СПИЛ, обнаружены в эндотелии посткапиллярных венул лимфоузлов больных с лимфаденопатичес-ким синдромом (Baroni C.D., и др., 1986) и в эндотелии сосудов подсли-зистой ткани биоптатов шейки матки женщин, зараженных ВИЧ (Pomerantz R.J. и др., 1988); ДНК транскрипты ВИЧ-1 идентифицированы методом гибридизации in situ в эндотелии капилляров мозга людей, умерших с признаками энцефалита (Wiley С.А., и др., 1986). Эти немногочисленные сообщения дают возможность предположить инфицирование эндотелия сосудов ВИЧ при СПИДе.

Для заболевания, вызванного ВИЧ-1 расстройство функционирования иммунной системы является основным проявлением патогенеза (Покровский В.В., Сервецкий К.Л, 1988, Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., 1992, Fauci A.S., 1991, Levy Y.A., 1993,). Нарушения выражаются как в виде супрессии (снижение числа Т-хелперов, вследствие чего снижается активность всех Т-хелперзависимых реакций, гибель других иммунокомпетентных клеток). так и активации (гипергаммаглобулинемия, выработка антиклеточных антител) функций иммунной системы. Кроме того, в крови инфицированных ВИЧ-1 людей и больных СПИДом поддерживается на высоком уровне содержа-

ние цитокинов, в том числе, и интерферонов, которые у здоровых людей обнаруживаются не часто и в небольших количествах (Соловьев В..Д.. Бектемиров Т.Д., 1989, Diarizani F., 1993).

Известно, что интерферону (альфа, бета, гамма и омега), белки, продукция которых популяциями клеток может быть индуцирована разными стимулами, всегда рассматривалась как фактор противовирусной защиты (Соловьев В.Д., Бектемиров Т.Д., 1980, Dianzani F., 1993). Одна из его форм - альфа кислотолабильный интерферон (альфа КЛИ) присутствовала в крови больных аутоиммунными и некоторыми вирусными заболеваниями (Preble О.Т. и др., 1984, Levy Y.A., 1993). Обнаружение альфа КЛИ в крови больных СПИДом, увеличение активности альфа интерферона и его кислотолабильности, являющиеся плохим прогностическим признаком, указывают на развитие порочного круга при этом заболевании.

Вовлечение ЭК в инфицирование ВИЧ при СПИДе может, по-видимому, вызывать как деструктивные поражения самих клеток, так и изменения их функционирования. Цитокины и интерфероны, постоянно присутствующие в крови больных СПИДом, могут изменить выраженность инфекции эндотелия ВИЧ (увеличить, уменьшить) и характер участия ЭК во взаимодействиях с клетками крови и в функционировании иммунной системы.

В связи с этим, представлялось необходимым создание модели инфекции ВИЧ ЭК сосудов человека для изучения роли инфицированных ЭК в функционировании иммунной системы.

Цель работы - оценка роли и механизма участия эндотелия сосудов человека в иммунопатогенезе инфекции, вызванной вирусом иммунодефицита человека.

Задачи исследования: 1. Исследовать возможность участия клеток эндотелия сосудов в продукции интерферона в нормальном и инфицированном организме. Изучить способность культуры клеток эндотелия сосудов синтезировать интерферон in vitro и чувствительность этих клеток к действию интерферона.

2. Выявить закономерности взаимодействия вируса иммунодефицита человека с клетками эндотелия сосудов человека и механизмы передачи инфекции чувствительным культурам.

3. Оценить значение молекул, экспрессированных на поверхности клеток эндотелия сосудов, и антител к ним в инфекции вирусом иммунодефиците человека и передаче инфекции чувствительным культурам.

4. Изучить характер влияния медиаторов клеточного иммунитета и интер-

$еронов на инфекцию вирусом иммунодефицита человека клеток эндотелия сосудов и передачу инфекции чувствительным культурам.

5. Разработать способ получения альфа кислотолабильного интерферона и охарактеризовать его свойства.

6. Сравнить закономерности функционирования сети цитокинов на модели нормальных и инфицированных вирусом иммунодефицита человека клеток эндотелия сосудов.

7. Оценить эффективность отечественных иммуномодуляторов в подавлении инфекции, вызванной вирусом иммунодефицита человека в культурах клеток эндотелия сосудов и Т-лимфоцитов, и исследовать механизмы этих процессов.

Научная новизна.

- Впервые проведено комплексное изучение инфекции ЭК сосудов человека ВИЧ-1 и передачи инфекции Т лимфобластоидной культуре человека, ауто-логичным и гетерологичным лейкоцитам крови.

- Разработана модель инфекции эндотелиальных клеток пупочной вены человека (ЭКПВЧ) ВИЧ-1 и ее трансмиссии Т лимфобластоидной культуре С8166.

- Впервые установлено, что ВИЧ-1 вызывает в ЭКПВЧ развитие абортивной инфекции, проявляющейся в обратной транскрипции вирусспецифической РНК и последующем уменьшении ДНК транскриптов вируса. Инфицирование ЭКПВЧ ВИЧ-1 осуществляется через липидный рецептор галактозил церамид.

- Передача вирусспецифического материала осуществляется при слиянии донорских и реципиентных клеток без предварительного созревания вирио-нов в ЭКПВЧ.

- Впервые охарактеризовано регулирующее влияние моноклональных антител (Мо Ат) к молекулам клеточной адгезии (МКА) и антигенам главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) на инфицирование ЭКПВЧ ВИЧ-1 и передачу инфекции чувствительным культурам.

- Впервые показано, что Мо Ат к 1САМ-1 соединяют в виде моста молекулы IСАМ-1 на ЭКПВЧ и включенные в состав вирионов. Увеличение адсорбции вируса на клетках с помощью этого механизма приводит к увеличению инфицирования ЭКПВЧ ВИЧ-1.

- Показано, что Мо Ат к МКА ингибируют передачу вирусспецифического материала, препятствуя контакту комплементарных молекул, зкспрессиро-ванных на поверхности инфицированнных ВИЧ-1 ЭКПВЧ и клеток С8166.

- Впервые дана оценка функционирования системы интерферона в ЭКПВЧ нормальных и инфицированных ВИЧ-1. Отмечено, что альфа, бета и омега

интерфероны ингибируют инфекцию ЗКПВЧ ВИЧ-1, тогда как гамма интерферон активирует ее.

- Впервые показано, что гамма интерферон активирует передачу вирусс-пецифического материала от инфицированных ВИЧ-1 ЭКПВЧ чувствительным культурам, увеличивая число слияний донорских и реципиентных клеток.

- Разработан метод получения альфа КЛИ. Показано, что кислотолабиль-ность интерферона этого типа связана с содержанием небольшого количества гамма интерферона. Впервые показано активирующее действие альфа КЛИ на инфекцию ВИЧ-1 ЭКПВЧ.

- Выявлено активирующее действие ФНО альфа на инфекцию ВИЧ-1 ЭКПВЧ. Механизм действия этого цитокина аналогичен механизму действия гамма интерферона.

- Впервые выявлен ингибирующий эффект индуктора интерферона ридостина на инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1, ее трансмиссию Т лимфобластоидной культуре С8166 и репродукцию вируса в культуре С8166. Механизм действия препарата связан с модуляцией синтеза цитокинов: активацией выработки альфа интерферона и ингибицией продукции ФНО альфа.

Теоретическое и практическое значение работы. Результаты проведенных исследований позволили получить ряд новых данных, указывающих на значение ЭК сосудов человека в патогенезе инфекции ВИЧ-1.

- ЭК сосудов, как резервуар ВИЧ-1. способны передавать вирусспецифи-ческий материал клеткам крови и. тем самым, распространять инфекцию по организму.

- Впервые показано антителозависимое усиление инфекции ВИЧ-1, передающееся антителами к молекулам, экспрессированным на поверхности ЭК: МКА и антигенам ГКГ. что указывает на включение аутоиммунитета в патогенез СПИДа.

- Впервые зафиксирована активация медиаторами клеточного иммунитета, гамма интефероном и ФНО альфа, передачи вирусспецифического материала от инфицированных ВИЧ-1 ЭКПВЧ чувствительным культурам (Т лимфоблас-там, лейкоцитам крови). Активации инфекции альфа КЛИ связана с содержанием в нем гамма интерферона, что объясняет прогностически отрицательный показатель нахождения альфа КЛИ в крови больных на поздних стадиях СПИДа.

- Ингибирующее влияние иммуномодулятора ридостина на передачу вирусспецифического материала от инфицированных ВИЧ-1 ЭКПВЧ Т-клеткам свидетельствует о возможности использования этого препарата для лечения инфекции ВИЧ-1.

-Разработанную модель инфекции ВИЧ-1 ЭКПВЧ целесообразно использовать для изучения различных аспектов патогенеза как СПИДа, так и инфекционных заболеваний, сопровождающихся поражением сосудов.

-Предложенная модель является новым подходом к поиску антивирусных, в том числе и анти-ВИЧ, препаратов и изучению механизма их действия.

- Результаты исследования включены в курс лекций на биологическом и медицинском факультетах Римского Университета "La Sapienza".

Апробация работы. Материалы диссертации доложены: на 8 Международном Конгрессе по химиотерапии (Афины, 1975 г.), 1 всесоюзной конференции "Теоретическая и прикладная иммунология" (Москва, 1982 г.), X Региональном симпозиуме социалистических стран по интерферону (Рига, 1988), Ежегодной конференции Международного общества исследователей интерферона (Япония, Киото, 1988; Италия, Флоренция 1989; Канада, Торонто, 1992), Ежегодной конференции Международного общества исследователей интерферона и цитокинов (Япония, Токио, 1993; Венгрия, Будапешт, 1994; США, Балтимор, 1995). Диссертация апробирована на конференции Отдела интерферонов НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН 12 октября 1995 г. (Протокол N б).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 35 работ в отечественных и зарубежных изданиях, получены 2 авторских свидетельства.

Структура и_объем диссертации. Диссертация включает в себя введение, обзор литературы (4 главы), заключение, 6 глав результатов собственных исследований и их обсуждение, обсуждение по работе и выводы. Список литературы состоит из 549 наименований отечественных и зарубежных работ. Диссертация изложена на 251 странице машинописного текста, иллюстрирована 21 рисунком и 54 таблицами.

Основные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором. Исследования по изучению взаимодействия вируса иммунодефицита человека с клетками эндотелия сосудов выполнены в Институте вирусологии Римского университета "La Sapienza" (директор Института, проф. Ф.Дианзани).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Культуры клеток. Первичные культуры эндотелиальных клеток получали и культивировали в соответствии с описанным методом (JaffeE.A., 1980). Клетки идентифицировали как эндотелиальные путем окрашивания антителами к маркерам : фактору YIII von Willebrand (Jaffe Е.А., 1982)

и РЕСАМ-1/ENDOCAM (Shimizu Y., и др., 1992), контаминация макрофагами исключалась после окрашивания антителами к маркеру CD14. Т лимфоблас-тоидная культура человека С8166, хронически инфицирована HTLV-1, но не продуцирует вирус.

2. Вирусные культуры. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1). Штаммы Р-1, PBMQ получены из периферической крови больных СПИДом в Институте вирусологии Римского университета. Штаммы пассировали в культуре С8166 (Титры Ю5"7 ТЦИД 5Q /мл). Лабораторный штамм 11 IB (Popovlc М.. и др. 1984) получали из культуральной жидкости хронически инфицированной культуры клеток Н9 (титр 10^. ТЦИД^/мл). Другие вирусы, использованные в работе: болезни Ньюкастла, штамм Н (ВБН); гриппа, штамм WSN (ВГ); Сендай (ВС); везикулярного стоматита, штамм Индиана (ВВС).

3. Препараты, используемые для скрининга (Ершов Ф.И., 1993): Унитиол (аналог британского антилюизита), аминокапроновая кислота, амбен (синтетическая парааминометилбензойная кислота). N 821 (производное амбе-на), N 822 (производное амбена), ридостин (дс РНК, получаемая из лиза-та киллерных дрожжей S. cerevisiae), кагоцел (синтезирован на основе натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы и низкомолекулярного полифенолг госсипола, выделенного из хлопчатника), камедон - гетероароматическое соединение, относящееся к классу акридионов, саврац - окисленная водорастворимая ацетилцеллюлоза и остаток оксиальдегида - фрагмента структуры низкомолекулярного полифенола госсипола, ларифан - дс РНК фага RFf2. Амплиген - Полинуклеотид, любезно предоставлен доктором Тимковс-ким A.C.

4. Получение радиационных химер (Петров Р.В., Зарецкая Ю.М., 1970). Мышей линии СВА облучали летально (850 R) на установке ЭКУ-50 и вводили внутривенно клетки костного мозга мышей СВА (сингенные химеры) или крыс линии Вистар (ксеногенные химеры).

5. Выделение лейкоцитов из крови доноров и их фракционирование. Лейкоциты человека выделяли из донорской крови путем центрифугирования в градиенте фиколлпака (Соловьев В.Д., Бектемиров Т.А., 1980). Моноцита и лимфоциты разделяли путем адгезии первых на пластиковых чашках Петри. Для разделения лимфоцитов на Т и В субпопуляции фракционировали смесь лимфоцитов на колонках с нейлоновой ватой.

6. Индукция интерферона (Соловьев В.Д., Бектемиров Т.А., 1988). Интерферон индуцировали во взвеси клеток и в монослойных культурах и тестировали по методу (Соловьев В.Д., Бектемиров Т.А., 1988). Ч

7. Определение инфекционной активности вирусов. Титр ВИЧ-1 определяли в культуре С8166 по цитопатическому действию (образование синцития).

8. Очистка ВИЧ-1 в градиенте сахарозы. Вирус, полученный из лизата культуры С8166, сначала очищали низкоскоростным центрифугированием при 4000g в течение 15 минут, затем осаждали ультрацентрифугированием и после следующего центрифугирования в линейном градиенте сахарозы, собирали фракции вируса в плотности 1,16-1,18 г/мл.

9. Определение вирусных и клеточных антигенов. Использовали иммуно-ферментный метод ELISA в соответствии с инструкцией фирмы изготовителя. Клетки и взвесь вируса перед исследованием лизировали детергентом Renex 30. Присутствие мембранных антигенов тестировали методом иммуно-цитофлуорометрии.

10. Приготовление препаратов для электронной микроскопии. Культуры последовательно фиксировали 2,5% глютаральдегидом и 1Z OsO^, заключали в агарозу и разрезали на блоки размером 1 мм^. Срезы толщиной 40-60 нм дополнительно окрашивали на сеточках цитратом свинца, напыляли углеродом и просматривали под электронным микроскопом Philips СМ-10 (Philips, Eindhoven, The Nitherlands).

И. Исследование содержания вирусспецифической ДНК в клетках методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Antonelli G., 1992). Образцы ЭКПВЧ лизировали и использовали праймеры SK 38/39 (для области gag) и зонд SK70.

12. Определение антивирусной активности препаратов и их цитотоксичес-кого действия. Эффект препаратов оценивали по ингибиции репродукции ВИЧ-1 в культуре С8166. Цитотоксическое действие препаратов определяли в МТТ-тесте (Antonelli G., 1992) по светопоглощению при длине волны 570-700 нм в спектрофотометре.

13. Статистическая обработка материалов. Результаты обрабатывали, используя метод Рида и Менча. Достоверность результатов оценивали с помощью критерия Ст'юдента (Корн Г., Корн Т., 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава I. Особенности продукции и действия интерферонов в культурах клеток, получаемых из организма. Сразу же после опубликования пионерских работ Айзекса и Линденмана, а затем и других исследователей, показавших способность вирусов индуцировать, а клеточные культуры продуцировать ИФН ( Соловьев В.Д., Бектемиров Т.А., 1980, Strander Н., Cantell К., 1967, Falcoff R., 1972,, Lindenman J., 1974,), возник вопрос о типах клеток, принимающих участие в продукции интерферона в организме. Использование радиационных

химер типа крыса-мышь (т.е. модели, в которой летально облученным мышам линии СВА инъецируют клетки костного мозга линии Вистар, и к 2: дню все кроветворные органы и кровь содержат клеточные элементы крысиного типа (Петров Р.В., Зарецкая Ю.М., 1979) дает возможность установить более дифференцированно по видоспецифичности интерферона тип клеток. продуцирующий его в организме (De Maeyer-Gulgnard J. и др. 1969).

Оказалось, что клетки крови, костного мозга, селезенки in vitrc под влиянием ВБН, ВГ и полиИ:полиЦ продуцировали ИФН преимущественнс крысиного, т.е. донорского типа, тогда как сывороточный ИФН после использования ВГ и полиИ:полиЦ был преимущественно мышиного, т.е. реци-пиентного типа. Эти результаты указывают на участие в облученном i восстановленном с помощью костного мозга организме в продукции интерферона клеток реципиента, возможно, клеток эндотелия сосудов. Кром< того, при моделировании гриппозной инфекции оказалось, что у мы-шей-ксеногенных химер в легких обнаруживался ИФН мышиного ( реципиент-ного ) типа.

Возможно, эндотелий сосудов принимает участие в продукции интерферона не только в нормальном организме, но при вирусном заражении вовлекается в инфекционный процесс и, вырабатывая интерферон, влияет ш течение инфекционного процесса.

1.1. Продукция интерферона клетками эндотелия сосудов человека и ю чувствительность к действию альфа, бета, гамма и омега интерфе-ронов.

Эндотелий кровеносных сосудов, выстилающий их внутреннюю поверхность, осуществляет функцию гематотканевого барьера, контактирует с клеточными элементами' крови и ее жидкой частью, которая может содержать большие количества цитокинов, в том числе интерферонов, при развитии разного вида патологических состояний (Pober J.S., 1990).

ЭК, полученные из пупочной вены (ЭКПВЧ), аорты и легочной артерш человека оказались способными in vitro продуцировать ИФН под влияние» ВБН и ВГ, а также полиИ:полиЦ, но не СЭА. ЭК не отличались но активности вырабатываемого интерферона (16-64 ед/мл), который принадлежал i I типу.

ЭК оказались чувствительными к альфа, бета, гамма и омега интерфе-ронам в такой же степени, как и фибробласты человека и культура амнио-тических клеток человека WISH, обычно используемые для тестировали* интерферонов. Результаты были однотипными как в обычном титровании интерферонов, так и в более чувствительном тесте ингибиции одного цикл;

репродукции ВВС.

Следовательно, ЭК человека, продуцирующие под влиянием вирусных и невирусных индукторов ИФН in vitro, и чувствительные к действию разных типов интерферона, можно рассматривать как популяцию клеток, способную принимать участие в функционировании системы интерферона в организме. Предположение об участии ЭК в инфекционном процессе, сделанное по результатам обнаружения реципиентного типа интерферона при гриппозной инфекции ксеногенных химер, является основанием для моделирования на этих клетках инфекционного процесса и изучения влияния на него интер-феронов.

Глава II. Закономерности взаимодействия вируса иммунодефицита человека с культурой эндотелиальных клеток пупочной вены человека.

Немногочисленные сообщения об обнаружении разными методами в эндотелии биоптатов органов антигенов ВИЧ и ДНК транскриптов вируса (Baron! C.D., и др., 1986, Wiley С.А., и др., 1986 Pomerantz R.J., и др., 1988 ) указывают на возможность инфицирования эндотелия сосудов этим вирусом.

Вследствие этого представляло интерес выявить возможность инфицирования ЭК ВИЧ-1 in vitro, исследовать особенности этого взаимодействия, а также возможность трансмиссии инфекции другим типам клеток.

11.1 Инфекция эндотелиальных клеток пупочной вены человека вирусом иммунодефицита человека.

ЭКПВЧ инфицировали штаммами ВИЧ-1 Р-1, PBMG и II IB. В культураль-ной жидкости отмечалось накопление инфекционного вируса и вирусного антигена р24 на следующий после инфицирования день. Однако, репродукции вируса в клетках не происходило, так как при исследовании лизатов инфицированных клеток оказалось, что в культуральной жидкости накапливался непенетрировавшийся в клетки вирус. При трипсинизации ЭКПВЧ сразу после их инфицирования в культуральной жидкости вирус и антиген не обнаруживались.

На основании полученных результатов не было возможности судить о характере инфекции ЭКПВЧ. Однако, известно, что инфицирование ВИЧ может осуществляться и при контакте инфицированных вирусом клеток с не-инфицированными (LI Y. и др., 1992). Вследствие этого для кокультиви-рования с инфицированными ВИЧ-1 ЭКПВЧ использовали CD4+ Т лимфобласто-идную культуру С8166,

Дни

1е ТЦИДяУЮО мкл

Дни

Рис. 1. Передача инфекции ВИЧ-1 от ЭКПВЧ культуре С8166.

А - Результаты ПЦР (ДНК транскрипты) лизатов ЭКПВЧ, полученных в разные сроки после их инфицированния ВИЧ-1. Б -Степень образования синцития культурой С8166 при ее добавлении в разные сроки после инфицирования ЭКПВЧ ВИЧ-1 В - Уровни накопления вируса в культуральной жидкости кокультур после добавления культуры С8166 в разные сроки после инфицирования ЭКПВЧ ВИЧ-1. Г - Уровни накопления вирусного антигена р24 в культуральной жидкости кокультур после добавления культуры С8166 в разные сроки после инфицирования ЭКПВЧ ВИЧ-1. ОП - оптическая плотность.

в которой ВИЧ-1 обычно репродуцируется до высоких титров (01апгап1 Г., и др., 1988) (Рис.1).

Отмечалось образование синцития клетками С8166, что является показателем цитопатического действия вируса в культуре (Б). Кроме того, в культуральной жидкости кокультур накапливались как инфекционный вирус (В), так и антиген р24 (Г), причем величины этих показателей и их максимальные значения зависели от времени начала кокультивирования с инфицированными ЭКПВЧ: показатели были ниже и их максимальные значения были отсрочены во времени при более позднем начале кокультивирования ( от 1 до 7 дня после инфицирования). Эти данные соответствовали результатам определения вирусспецифической ДНК в ЭКПВЧ (А), поскольку ее количество было максимальным на следующий после инфицирования ВИЧ-1 день и затем начинало уменьшаться.

Внесение АЗТ, ингибитора обратной транскрипции

вирусспецифической РНК в ДНК, в культуральную жидкость ЭКПВЧ во время их инфицирования вирусом приводило к уменьшению накопления вируса и антигена в культуральной жидкости кокультур.

На основании полученных результатов можно заключить,- что после заражения ЭКПВЧ ВИЧ-1 происходит обратная транскрипция вирусспецифической РНК, и без созревания вируса вирусспецифический материал передается культуре С8166 в процессе кокультивирования.

При электронно-микроскопическом исследовании в местах контакта инфицированных ЭКПВЧ и клеток С8166 клеточные мембраны отсутствовали, что указывает на передачу вирусспецифического материала путем слияния клеток. Такой способ передачи невирионного вирусспецифического материала описан в литературе для других клеточных моделей (Ь1 У., и др.. 1993). В межклеточных пространствах кокультур обнаруживались вирионы ВИЧ

Трансмиссия вирусспецифического материала происходила и при кокультивировании инфицированных ВИЧ-1 ЭКПВЧ аутологичным и гетерологичным лейкоцитам крови доноров, о чем судили по накоплению вирусного антигена в культуральной жидкости кокультур. Эти данные представляют интерес, так как при экстраполяции на целостный организм указывают на возможность распространения ВИЧ по организму путем передачи вируса лейкоцитам от инфицированных ЭК.

В дальнейшей работе схема экспериментов для характеристики инфекции ЭКПВЧ была следующей: ЭКПВЧ инфицировали ВИЧ-1

(множественность инфицирования. МИ 1-5 ТЦИД50) трипсинизировали и пересевали в свежей культуральной жидкости на новую поверхность той же площади, на следующий день в свежей культуральной жидкости начинали кокультивирование с клетками С8166 и оценивали уровни накопления вируса и антигена р24 в культуральной жидкости.

11.1.a. Характеристика рецепторов для ВИЧ-1 на ЭКПВЧ.

Обычно клетками-мишенями для ВИЧ являются CD4+ лимфоидные и моноцитарные клетки, однако, опубликованы данные об инфицировании нелимфоидных культур клеток как CD4 зависимым, так и CD4 независимым путем (Cao Y., и др., 1990. Clapman P.R., 1991, Doley А., и др., 1992, Fantini J., и др.. 1994, FauciS.F.. 1993). ЭКПВЧ перед инфицированием обрабатывали Мо Ат к CD4 рецептору (100 мкг/мл) (Таблица 1).

Количество вирусного антигена в культуральной жидкости кокультур было одинаковым как при обработке Мо Ат к CD4, так и без нее, что указывает на отсутствие экспрессии CD4 рецептора ЭКПВЧ.

Для CD4- эпителиальных клеток кишечника, нервных клеток и клеток нейробластомы рецептором для ВИЧ-1 является гликосфинголипид галактозил церамид (Гал.Цер.), уровень экспрессии которого на

Таблица. 1. Влияние моноклональных антител на инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1.

N опыта Мо Ат к Вирусный антиген р24

CD4 Гал. Дер пг/мл

1 - 40,0

+ 40.0

2 - 280.0

+ 90,0

наружной мембране клеток связан с пермиссивностью ВИЧ инфекции (ВЬа1 3., и др., 1991, Рапит 3., и др., 1994).

В результате обработки монослоя ЭКПВЧ перед инфицированием Мо Ат к Гал. Цер. (50 мкг/мл) (Таблица 1). количество вирусного антигена в культуральной жидкости кокультур оказалось сниженным. Следовательно,

рецептором (одним из рецепторов) для ВИЧ-1 на культуре ЭКПВЧ, является Гал. Цер.

Из результатов, представленных в данной главе, можно заключить, что ВИЧ-1 инфицирует ЭКПВЧ с использованием липидного рецептора Гал. Цер. Инфекция является абортивной, ограничиваясь первым этапом репродукции вируса: обратной транскрипцией. Инфекция может быть передана при кокультивировании с чувствительной к ВИЧ-1 Т лимфобластоидной культурой С8166. При этом инфицированные ВИЧ ЭКПВЧ сливаются с клетками С8166, после чего происходит завершение репродукции вируса и его созревание с последующим отпочковыванием вирионов и выходом их в межклеточное пространство. Накопление в культуральной жидкости кокультур инфекционного вируса и вирусного анигена указывает на многоцикловую репродукцию ВИЧ. Передача ВИЧ-инфекции происходит и при контакте ЭКПВЧ с аутологичными и гетерологичными лейкоцитами крови. ЭК можно рассматривать как временный резервуар ВИЧ-инфекции, который в организме способствует диссеминации инфекции путем ее передачи лейкоцитам крови.

II.2. Значение антигенов, экспрессированных на поверхности ЭКПВЧ, при инфекции ВИЧ-1.

ЭК сосудов участвуют в иммунных реакциях, так как после активации экспрессируют антигены ГКГ II класса и могут представлять антигены (Pober J.S., 1990), обладают способностью продуцировать цитокины (Mantovani А., 1992), могут инициировать и поддерживать пролиферацию Т клеток (Mantovani А.. 1989). Кроме того, ЭК экспрессируют на наружных мембранах МКА, что дает им возможность регулировать распространение клеток крови по организму для поддержания гомеостаза и при воспалительных реакциях (Springer А., 1990). Вследствие этого представляло интерес исследовать значение молекул, экспрессируемых на наружной мембране ЭКПВЧ, при инфицировании ВИЧ-1 и передаче инфекции чувствительной культуре клеток.

Прежде всего, определили уровень экспрессии МКА и антигенов ГКГ на ЭКПВЧ (Таблица 2).

ЭК экспрессировали специфический маркер РЕСАМ-1 (89,8%) и МКА ICAM-1 (15-18%), но не экспрессировали МКА LFA-1; уровень экспрессии антигена ГКГ DR был невысоким (не более 1,6% ЭК) и Ь2 экспрессировали не более 45,2% ЭК. Количество клеток.

Таблица 2. Процент ЭКПВЧ, содержащих специфические антигены на наружной мембране.

Мо Ат

N опыта

1

3

РЕСАМ-1

ЮАМ-1

ЬРЛ-1

Б1?

Ь2

89,8

О 1,6 45,2

18,0 О

47,1 15,0

Обозначения: - не определяли

экспрессирующих эти молекулы, зависело от донора, что, возможно, также объясняет разницу в уровнях и динамике накопления вируса и антигена в культуральной жидкости кокультур.

Для исследования значения молекул, экспрессированных на поверхности ЭКПВЧ, использовали Мо Ат к этим молекулам. Оказалось, что обработка антителами (10мкг/мл) к 1САМ-1, 01?. но не к РЕСАМ-1, ЬРА-1 и Ь2 перед инфицированием ЭКПВЧ ВИЧ-1 приводила к увеличению накопления вируса и антигена р24 в культураньной жидкости кокультур. Наиболее выраженное активирующее инфекцию действие отмечено при использовании Мо Ат к IСАМ-1.

11.2.а. Исследование механизма активирующего действия моноклональных антител к 1САМ-1 на инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1.

При выполнении этого этапа исследования кроме Мо Ат к 1САМ-1 использовали также Мо Ат к ЬРА-1 (МКА, не экспрессируемая ЭКПВЧ) и к РЕСАМ-1 (МКА, экспрессируемая ЭКПВЧ и являющаяся маркером ЭКПВЧ). ЭКПВЧ были обработаны Мо Ат к перечисленным ММ, инфицироьа-ны ВИЧ-1, и количество вируса и антигена тестировали в культуральной жидкости кокультур (Таблица 3).

Количество инфекционного вируса и вирусного антигена в культуральной жидкости кокультур ЭКПВЧ, обработанных Мо Ат к ЮАМ-1, статистически достоверно превышало эти же показатели при обработке ЭКПВЧ Мо АТ к и^А-! (р-0,001) и РЕСАМ-1 (р=0,007).

Таблица 3. Влияние моноклональных антител к МКА на инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1

Мо Ат Антиген представлен на Индекс репродукции х

к ЭКПВЧ вирионах ВИЧ-1кх антиген р 24х*х п

1САМ-1 + + 13,Oil,6 5.Oil,4 rt /

LFA-1 - + 1.6±1,4 1,5+0,5 4

РЕСАМ-1 + - 1,0*0.2 1,2+0,3 2

х - соотношения инфекционного вируса„ (ТЦИД^ /мл) и вирусного антигена (пг/мл) в культуральной жидкости необработанных и обработанных Мо Ат ЭКПВЧ. р=0.001 IСАМ-1 к ЬРА-1, р=0,007 1САМ-1 к РЕСАМ-1.

Использование Fab фрагментов Мо Ат к ICAM-1. обработанных папаи-ном. не оказало активирующего влияния на накопление вируса и антигена в культуральной жидкости кокультур. Эти данные указывают на значение двух активных центров в одной молекуле антитела для проявление эффекта активации инфекции.

Известно, что вирионы после завершения репродукции в клетках при отпочковывании от них могут включать в свой состав клеточные антигены, экспрессированные на наружной мембране (Levy Y.A., 199.3). Для получения пула ВИЧ-1 обычно использовалась культура С8166. Оказалось, что до 95Z клеток этой культуры экспрессировали МКА ЮАМ-1 и LFA-1. но не экспрессировали маркер ЭКПВЧ РЕСАМ-1. В дополнение к этим данным было показано, что вирионы ВИЧ-1 содержали МКА ICAM-1 и LFA-1, но не РЕСАМ-1.

Для изучения механизма активирующего действия Мо Ат к ICAM-1 исследовали их влияние на адсорбцию вируса. Для контроля использовали Мо Ат к LFA-1 и к РЕСАМ-1. ЭКПВЧ были обработаны Мо Ат к этим МКА (10 мкг/мл) в течение 1 часа при 3?", затем клетки были промыты трехкратно, инфицированы ВИЧ-1 обычным путем, разрушены криолизисом и в надосадочной жидкости определяли количество вирусного антигена (Таблица 4).

Только в случае использования Мо Ат к ICAM-1, но не к LFA-1 и к РЕСАМ-1, отмечено увеличение адсорбции вируса на ЭКПВЧ: 54.8 пг/мл в контроле и 89.0 пг/мл при обработке антителами, причем разница была статистически достоверна ( р=0.031).

Таблица 4. Влияние моноклонапьных антител к МКА на адсорбцию ВИЧ-1 на ЭКПВЧ.

Мо Ат Вирусный антиген р24, пг/мл п р

- 54.8±8.5 4 -

ЮАМ-1 89.0±9.0 6 0.031

ЬГА-1 56.6+10.5 5 0.900

РЕСАМ-1 61.0+9.5 а 0.650

Можно заключить, что вирионы ВИЧ-1 после репродукции в культуре С8166 при отпочковывании захватывают МКА ЮАМ-1, экспрессированную на поверхности этих клеток. Мо Ат к 1САМ-1 увеличивают адсорбцию вируса на поверхности ЭКПВЧ, путем образования моста между этими молекулами, экспрессированными на поверхности ЭКПВЧ и включенными в состав вирионов; увеличенная адсорбция вируса приводит к увеличению инфицирования клеток и последующему увеличению передачи инфекции чувствительной культуре С8166.

Мо Ат к. иА-1 не оказывают активирующего инфекцию действия, так как. хотя этот антиген и включается в состав вирионов в ходе отпочковывании от культуры С8166, однако, ЭКПВЧ не экспрессируют его. Мо Ат к РЕСАМ-1 также не оказывают активирующего действия на инфекцию, так как, хотя ЭКПВЧ и экспрессируют этот антиген, однако, вирионы его не содержат, так как культура С8166, используемая для получения пула вируса, не экспрессирует этот маркер ЭК.

Мо Ат к МКА 1САМ-1 оказывали влияние и на передачу инфекции от ЭКПВЧ культуре С8166. Обработка инфицированных ВИЧ-1 ЭКПВЧ Мо Ат к 1САМ-1 (10 мкг/мл) непосредственно перед началом кокультиви-рования с культурой С8166 приводила к уменьшению накопления вируса и антигена в культуральной жидкости. Объяснение этому феномену может заключаться в том. что Мо Ат соединяются с соответствующими молекулами, экспрессированными на поверхности ЭКПВЧ. и препятствуют их контакту с комплементарными молекулами, экспрессированными на поверхности клеток С8166 СIСАМ-1 на ЭКПВЧ и ЬРА-1 на С8166 ). вследствие этого ухудшаются условия межклеточного контакта и, как следствие, происходит уменьшение передачи инфекции.

Из результатов, представленных в данном разделе главы, можно заключить, что Мо Ат к молекулам, экспрессированным на наружной мембране ЭК, оказывают регулирующее влияние как на заражение ВИЧ-1 ЭКГОЧ ( антителозависимое усиление инфекции), так и на передачу инфекции Т лимфобластоидной культуре С8166 (уменьшение передачи). При экстраполяции этих результатов на целостный организм можно заключить, что присутствие в крови антител к МКА и антигенам ГКГ (Mantovani А., 1989, Levy J.A., 1993) модулирует инфицирование клеток вирусом и распространение его по организму.

Глава Ш. Действие альфа, бета, гамма и омега интерферонов на инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1.

Известно, что в крови людей, инфицированных ВИЧ-1, и больных СПИДом присутствуют альфа, альфа КЛИ, бета и гамма интерфероны (Preble О.Т., 1984. Laurence J.. 1990, Levy Y.А., 1993). Значение интерферонов в патогенезе заболевания не изучено. В системах in vit.ro отмечен кнгибирующий эффект альфа интерферона и дихотомическое действие гамма интерферона на ВИЧ-1 инфекцию (Kovanagi Y., и др., 1988. Baca-Regen L. и др., 1994. Pitha Р. , 1994, Poli Q. и др., 1994). Вследствие этого, представляло интерес исследовать влияние интерферонов на инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1.

III. 1. Исследование влияния интерферонов на инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1.

ЭКПВЧ обрабатывали одним из типов интерферона в концентрации 104 ед/м.п в течение 24 часов, затем монослой отмывали, инфицировали ВИЧ-1 обычным путем и кокультивировали с клетками С8166 (Таблица 5).

Отмечено снижение титров инфекционного вируса и вирусного антигена в культуральной жидкости кокультур после обработки ЭКПВЧ интерферонами альфа, бета и омега. Влияние гамма интерферона на инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1 было противоположным : титры вируса и количество вирусного антигена оказались увеличенными. Сходные результаты были получены при обработке ЭКПВЧ этими же интерферонами и использовании множественности инфицирования(МИ) от 0.1 до 10.0.

Обработка ЭКПВЧ интерферонами альфа, бета, гамма и омега не оказала влияния на адсорбцию ВИЧ-1, хотя в других клеточных системах отмечено увеличение адсорбции ВИЧ-1 под влиянием интерферонов и цитокинов, являющееся результатом активации экспрессии рецепторов для ВИЧ-1 (Dolev А. и др., 1994). Ингибирующее инфекцию действие

- 18 -

Таблица 5. Влияние интерферонов на инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1.

Обработка Инфекционный вирус Log ТЦИД50 /мл Вирусный антиген р24 нг/мл

- 2.1 2,00

ИФН альфа 1.1 0,01

- 3.2 60,00

ИФН бета 2.6 7,00

- 3.8 2,00

ИФН омега 0.5 0,01

- 1,8 0,03

ИФН гамма 2,1 0.25

альфа, бета и омега интерферонов, очевидно, связано с их влиянием на внутриклеточные механизмы ВИЧ-1 инфекции ЭКПВЧ, уже частично изученные и изучаемые на других моделях и во многом известные (РоП 6., 1994, РПЬа Р., 1994). Активирующее инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1 действие гамма интерферона представляло интерес для дальнейшего исследования.

111.2. Изучение механизма активирующего действия гамма интерферона на инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1.

ЭКПВЧ обработали гамма интерфероном (10-1000 ед/мл) в течение 24 часов до инфицирования вирусом (А, В) или после него (Б) и кокультивировали с клетками С8166 (А,Б) или активированными ФГА лейкоцитами донора (В) (Таблица 6).

Гамма ИФН оказывал активирующее действие на инфекцию УКПЬЧ ЬИЧ-1 при его использовании до инфицирования клеток и после него. Эффект проявлялся при кокультивировании как с Т лимфобластоидной культурой С8166, так и с активированными лейкоцитами донорской крови.

Поскольку обработка гамма интерфероном ЭКПВЧ не оказала влияния на адсорбцию вируса, представляло интерес исследовать его влияние на внутриклеточное состояние вируса.

Определяли количество вирусного антигена р24 и

Таблица 6. Влияние гамма интерферона на инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1.

Интерферон Инфекционный вирус Вирусный антиген р24

. ед/мл Ьо^ ТДИДзд /мл пг/мл

А. О <0,5 15

10 1,25 135

100 1,87 300

1000 2,12 375

Б. О 1.72 225

10 2,35 950

100 2,25 1300

В. О 0,75 500

100 1,25 800

300 1,25 1900

Обозначения: А - обработка гамма интерфероном до инфицирования ЭКПВЧ, кокультиьирование с культурой С8166; В-обработка гамма интерфероном после инфицирования ЭКПВЧ, кокультивирование с культурой С8166; В - обработка гамма интерфероном до инфицирования ЭКПВЧ, кокультивирование с активированными лейкоцитами донорской крови, вирусспецифической ДНК в лизате ЭКПВЧ через 24 часа после обработки гамма интерфероном (100 ед/мл) и инфицирования ВИЧ-1 (время начала кокультивирования). Не отмечено разницы в количестве антигена и ДНК в клетках обработанных и не обработанных гамма интерфероном.

Следовательно, гамма интерферон не оказывает влияние как на инфицирование клеток вирусом, так и обратную . транскрипцию вирусспецифической ДНК в ЭКПВЧ.

II1.2. а. Исследование значения МКА при активации гамма интерфероном инфекции ЭКПВЧ ВИЧ-1. В предыдущей главе было отмечено значение 1САМ-1 в передаче ВИЧ-1 инфекции от ЭКПВЧ чувствительной культуре С8166. Исходя из этих данных, были поставлены эксперименты, цель которых заключалась в исследовании влияния гамма интерферона на экспрессию молекул

1СЛМ-1 в инфицированных ВИЧ-1 ЭКПВЧ и оценке значения получаемых результатов в феномене активации инфекции.

Эксперименты были поставлены в трех аранжировках: А. ЭКПВЧ были обработаны гамма интерфероном (100 ед/мл) в течение 24 часов, и в лизате клеток определяли содержание 1САМ-1; Б. ЭКПВЧ были обработаны гамма интерфероном (100 ед/мл) в течение 24 часов и инфицированы ВОТ обычным путем; через 24 часа в лизате клеток определяли содержание IСАМ-1; В. ЭКПВЧ были инфицированы ВИЧ-1 обычным путем и при пересеве клеток в культуральную жидкость внесен гамма ИФН (100 ед/мл), после 24 часов культивирования в лизате клеток определяли содержание 1САМ-1. (Таблица?).

Таблица 7. Влияние гамма интерферона на экспрессию 1САМ-1 нормальными и инфицированными ВИЧ-1 ЭКПВЧ.

Опыт Интерферон Инфекция ВИЧ-1 1САМ-1, нг/10б клеток

А - - 12.5

+ - 20.0 '

Б - + 11.0

+ + 24.0

В - + 31.0

+ + 47.5

Обозначения: А - обработка клеток интерфероном. Б - обработка клеток интерфероном и последующее инфицирование ВИЧ-1. В -инфицирование клеток ВИЧ-1 и последующая обработка интерфероном.

Обработка гамма интерфероном приводила к увеличению экспрессии МКА 1САМ-1 неинфицированными ЭКПВЧ, что известно из литературы (РоЬег .1.5., 1990). Активирующее действие гамма интерферона на экспрессию этой молекулы отмечено при использовании его как до инфицирования ЭКПВЧ ВИЧ-1, так и после инфицирования.

Очевидно, гамма ИФН, активируя экспрессию на ЭКПВЧ МКА 1САМ-1, улучшал контакт этих клеток с клетками С8166 и, тем самым.

увеличивая передачу вирусспецифического материала, увеличивал уровень репродукции вируса и его накопления в культуральной жидкости.

■ Обработка ЭКГОЧ, после экспозиции с гамма интерфероном (100 ед/мл) в течение 24 часов и инфицирования ВИЧ-1, Мо Ат к ЮАМ-1 перед началом кокультивирования с культурой С8166 уменьшали накопление вируса и антигена р24 в культуральной жидкости кокультур (Табл. 8 А ); отмечено дозозависимое действие антител. Кроме того, обработка клеток С8166 Мо Ат к МКА ЬГА-1, которая экспрессируется С8166 и является лигандом для 1САМ-1, перед началом кокультивирования с обработанными гамма интерфероном (100 ед/мл) и инфицированными ВИЧ-1 ЭКПВЧ, также привела к уменьшению накопления

Таблица 8. Влияние моноклональных антител к 1САМ-1 и к ЬГА-1 на передачу ВИЧ-1 инфекции от ЭКПВЧ, обработанных гамма интерфероном, культуре клеток С8166

Мо Ат, мкг/мл, к Вирусный антиген Инфекционный вирус ICAM-1 LFA-1 р24, пг/мл Log ТЦИДцп /мл

А. 0 - 1175 2,62

10 - 375 (68%) 1,5 (>99%)

30 - 300 (79%) 0,6 (>99,9%)

Б. - 0 640

10 260 (60%) 30 60 (91%)

Обозначения: А - ЭКПВЧ обработаны Мо Ат к ЮАМ-1, Б - С8166 обработаны Мо Ат к LFA-l, в скобках указан процент ингибиции.

вируса и антигена р24 в культуральной жидкости кокультур (Таблица 8 Б); отмечено дозозависимое действие антител.

Эти результаты можно объяснить тем, что нейтрализация каждой МКА специфическими Мо Ат на клетках одного типа препятствует соединению с комплементарной молекулой на поверхности клеток другого типа при кокультивировании, контакт между клетками ухудшается, что уменьшает передачу инфекции.

Электронно-микроскопическое исследование кокультур (Таблица 9)

показано, что обработка гамма интерфероном (100 ед/мл), привела к увеличению числа слияний инфицированных ЭКПВЧ с клетками С8166 (р<0.001).

Таблица 9. Действие гамма интерферона на слияние ЭКПВЧ, инфицированных ВИЧ-1, с клетками С8166.

Гамма ИФН Инфекция Индекс слияния Число слияний

- - <0,01 <0,001

- + 0,31 0,4840,10

+ + . 0,84 1.05+0,14

Обозначения: Индекс слияния - количество слияний при адгезии ЭКПВЧ-С8166 (р.-0,001 в X2 ), Число слияний - среднее число слияний на каждую ЭКПВЧ, вовлеченную в адгезии с С8166 (р<0,001 в тесте Student).

Таким образом, в отличии от альфа, бета и омега интерферонов, которые ингибировали инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1. гамма ИФН активировал инфекцию. Активирующее действие гамма интерферона было выражено при его использовании как до, так и после контакта ЭКПВЧ с ВИЧ-1. Гамма ИФН не оказывал влияния на адсорбцию вируса на ЭКПВЧ и на его внутриклеточный процессинг. Механизм действия гамма интерферона заключался в активации на инфицированных ВИЧ-1 ЭКПВЧ экспрессии МКА ICAM-1, что улучшало контакт этих молекул с комплементарными молекулами на клетках С8166, приводило к увеличению числа их слияний .(данные подтвержденные электронно-микроскопическими исследованиями), и увеличивало передачу вирусспецифического материала. Гамма ИФН увеличивал также трансмиссию ВИЧ-1 инфекции и лейкоцитам донорской крови, что, при экстраполяции на целостный организм, может указывать на активацию передачи инфекции из ее резервуара ЭК лейкоцитам крови и увеличению диссеминации инфекции по организму. Кроме того, полученные результаты указывают на невозможность использования гамма интерферона для лечения ВИЧ-1 инфицированных людей.

Глава IY. Разработка метода получения и характеристика альфа кислотолабильного интерферона.

Присутствие альфа КЛИ в крови характерно для больных

аутоиммунными заболеваниями (Mosmann T.R., 1994). Обнаружение высоких уровней альфа интерферона в крови и увеличение степени его кислотолабильности является прогностически отрицательным показателем у больных СПИДом (Fauci A.S., 1991). Вследствие этого, представляло интерес разработать метод получения альфа КЛИ и изучить некоторые его свойства.

IY.1. Разработка условий получения альфа КЛИ.

Обычно при получении альфа интерферона трудно выделить кислотолабильный подтип, так как обычный способ инактивации вируса-индуктора, присутствующего в нативном материале, обработкой кислотой при pH 2.0 вызывает инактивацию этого подтипа интерферона. Ранее при получении вакцин вирус инактивировали бетапропиолактоном (ВПЛ) (Соловьев В.Д., Бектемиров Т.Д., 1980). Кроме того, при обработке материалов, полученных от инфицированных вирусом лесов Семлики мышей. БПЛ, происходила инактивация вируса, но не интерферона (Barrett А.С.Н., 1984).

При скрининге индукторов оказалось, что только ВГ, но не ВБН или ВС инактивировался БПЛ (конечное разведение 1:4000, не инактивирующее активность альфа кислотостабильного и гамма кислотолабильного интерферонов человека) и не вызывал интерференцию в культурах, используемых для тестирования интерферона. Для индукции интерферона во взвесь лейкоцитов доноров (1x106 мл) вносили ВГ (100 ШДзд на клетку) и после 24 часов культивирования половину надосадочной жидкости обрабатывали БПЛ, другую половину обрабатывали HCl при pH 2,0 (Рис. 2).

Антивирусная активность материала, обработанного БПЛ, била не менее, чем в 4 раза выше, чем активность материала, обработанного при pH- 2,0, при тестировании на гомологичной культуре ДФЧ. Следовательно, материал, обработанный БПЛ, содержал КЛИ. Активность обоих материалов, тестируемая в гетерологичной культуре MDBK была одинаковой. Ш'1>, оОработанный БПЛ, при типировании оказался альфа интерфероном. Альфа КЛИ продуцировала неприлипающая к пластику фракция лимфоцитов, которая включает в себя Т- и В-лимфоциты, которые, как известно (Dlanzani F.. 1993), являются продуцентами гамма и альфа интерферона соответственно.

Лейкоциты крови доноров, культивируемые в течение 24 часов, иногда спонтанно вырабатывали кислотолабильный ИФН. титр которого в некоторых случаях достигал 16 ед/мл. При типировании этот ИФН

256 -

128. 6 и.

32.

О

га г > X X рз га - -г ; й ; г < Г

- ■_ 1 •: > > ✓ ? * " X £ §

1

24

—О—2

| ■ 13 I-\л

А 8 72

1.3 - ИФН после обработки БПЛ часы

2.4 - ИФН после обработки при рН-2,0

1,2 - титры ИФН, определяемые в культуре ДФЧ 3,4 - титры ИФН, опрелеляемые в культуре МОВК

Рис. 2. Продукция интерферона лейкоцитами человека после индукции вирусом гриппа.

нейтрализовался антисывороткой к гамма интерферону. По сравнению с индуцированным гамма интерфероном он оказался высокотермолабильным, так как полностью инактивировался при экспозиции при 37' в течение 5 дней.

Следовательно, в интерфероне, полученном после индукции лейкоцитов ВГ и инактивации вируса БПЛ, содержался гамма ИФН, продуцируемый спонтанно, но из-за выраженной термолабильности не обнаруживаемый при биологическом типировании.

Известно, что альфа и гамма интерфероны в смеси при определении антивирусной активности проявляют аддитивное действие (Пе^сйшап №.1?., Р1е1БсЬтап С.М., 1984). Очевидно, ИФН, получаемый после индукции ВГ, содержал альфа и гамма интерферон, аддитивное действие которых проявлялось только при инактивации вируса БПЛ, обработка

которым сохраняла кислотолабильный ИФН. После обработки кислотой при рН 2,0 гамма ИФН полностью инактивировался, антивирусную активность в смеси проявлял только кислотоустойчивый альфа ИФН. вследствие чего титр интерферона резко снижался. Одинаковый титр интерферона, после обработки как БШ1. так и кислотой, определямый в гетерологичной культуре М1)ВК (чувствительной только к альфа интерферону человека), указывает на присутствие в материале одного и того же количества альфа интерферона.

Одновременно с исследованиями по разработке метода получения альфа КМ, представленными в данной главе, в Институте вирусологии Римского университета изучалась способность лейкоцитов донорской крови продуцировать ИФН под влиянием лейкоцитов, инфицированных ВИЧ-1, и после одного цикла репродукции фиксированных глютаральдегидом (СароМапсМ М.И. и др., 1992). В этом случае культуральная жидкость индуцированных лейкоцитов содержала альфа КЛИ, который, как показали исследователи, состоял из альфа интерферона и очень небольшого количества гамма интерферона (~1Х). В следующих экспериментах использовали именно этот ИФН. ЭКПВЧ были обработаны разными дозами альфа КЛИ в течение 24 часов, затем инфицированы ВИЧ-1 обычным путем, с последующим кокультивированием с культурой СгЗ 166 (Таблица 10).

Таблица 10. Влияние альфа КЛИ на инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1.

Альфа КЛИ, Инфекционный вирус Вирусный антиген р24 ед/мл Log ТЦИД50 /мл пг/мл

Содержание вируса и вирусного антигена оказалось увеличении в культуральной жидкости кокультур в случае обработки ЭКПВЧ альфа ЮМ. Следовательно, альфа КЛИ активировал инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1, и эффект мог быть связан с тем, что в состав альфа КЛИ входит гамма ИФН, который, как показано в данном исследовании, активировал инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1.

100

300

2,75

3,5

4,0

1900 5300 4700

Экстраполируя результаты, изложенные в данной главе исследования, можно предположить, что в организме действие альфа КЛИ складывается из ингибирующего инфекцию действия альфа интерферона и активирующего инфекцию действия гамма интерферона. Увеличение кислотолабильности этого типа интерферона, по-видимому, указывает на увеличение активности в нем гамма интерферона, что может приводить к увеличению распространения инфекции из его резервуара - ЭК.

Глава Y. Влияния ФНО альфа на инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1.

Известно, что ФНО альфа является цитокином. активирующим инфекцию ВИЧ-1 в культурах клеток и, кроме того, увеличенные количества этого цитокина обнаруживались в крови инфицированных ВИЧ-1 людей (Fauci A.C., 1991, Levy Y.A., 1993).

ФНО альфа вносили в разных концентрациях в культуральную жидкость ЭКПВЧ на 24 часа, затем клетки были промыты средой и инфицированы ВИЧ-1 обычным путем. В части экспериментов ФНО альфа (Шмкг/мл) был внесен в культуральную жидкость за 24 часа до инфекции и присутствовал в этой же концентрации в культуральной жидкости как до инфицирования, так и в следующие 24 часа после инфицирования , или же ФНО альфа вносили только после заражения клеток на 24 часа (Таблица 11).

Таблица 11. Влияние ФНО альфа на инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1.

ФНО альфа Инфекционный вирус Вирусный антиген

до инфекции после инфекции Log ТЦИД50 /мл р24, пг/мл

- - 2,12 21

+ - 2,72 40

+ + 2,82 60

- + •2,75 24

Внесение ФНО альфа в культуральную жидкость до инфицирования ЭКПВЧ ВИЧ-1 в концентрациях от 1 нг/мл до 1000 нг/мл не привело к значительным отличиям в титрах инфекционного вируса и концентрациях вирусного антигена в культуральной жидкости кокультур по сравнению.с необработнанными ФНО альфа ЭКПВЧ. Только использование 10 мкг/мл ФНО

Пг»

- ¿У -

альфа оказало влияние на урожай вируса в культуральной жидкости кокультур. Наибольший эффект ФНО альфа был отмечен при постоянном присутствии этого цитокина как до заражения ВИЧ-1, так и после него.

Для исследования механизма активирующего эффекта ФНО альфа ЭКПВЧ обработали этим цитокином в течение 24 часов или

до инфицирования ВИЧ-1 или после него. В криолизате клеток, взятых в срок перед началом кокультивирования. не отмечено различий в количестве антигена в культурах, обработанных и не обработанных ФНО альфа. Следовательно, ФНО альфа не влияет на процессинг вируса в клетках.

Из данных литературы известно, что ФНО альфа, подобно гамма интерферону, активирует экспрессию ЮАМ-1 в культуре ЭК (РоЬег .ЬЗ., 1990). ФНО альфа вносили в культуральную жидкость ЭКПВЧ на 24 часа или до инфицирования или после него (Таблица 32).

. Таблица 12. Влияние ФНО альфа на экспрессию ЭКПВЧ 1САМ-1.

ФНО альфа ЮАМ-1, нг/мл

до заражения после заражения культуральная лизат

жидкость клеток

1 0,379 6,093

+ 1,188 12,21

о 1,054 10,54

+ 1,629 16.29

Обработка ФНО альфа привела к активации экспрессии IСАМ-1 нормальными ЭКПВЧ. При предобработке ЭКПВЧ ФНО альфа и последующем их заражения отмечалось увеличение экспрессии 1САМ-.1 в клетках и его растворимой фор/и ь культуральной жидкости. Аналогичные результаты получены в ЭКПВЧ, инфицированных ВИЧ-1 и затем культивировавшихся в присутствии ФНО альфа: отмечено увеличение экспрессии ЮАМ-1 клетками (10.54 нг/мл - контроль и 16.29 нг/мл - опыт соответствнно) и увеличение содержания ЮАМ-1 в культуральной жидкости (1.054 нг/мл - контроль и 1.629 нг/мл ).

Следовательно, влияние экзогенно внесенного ФНО альфа на инфицирование ЭКПВЧ ВИЧ-1 заключалось в активации экспрессии МКА

ICAM-1. что, как и при использовании гамма интерферона, приводило к улучшению контакта ЭКГОЧ и клеток культуры С8166 и более выраженной передаче вирусного материала.

Из результатов экспериментов, представленных в данной главе, можно заключить, что ФИО альфа, подобно гамма интерферону, увеличивает передачу вирусспецифического материала чувствительным культурам от инфицированных ЭК, что при экстраполяции на организм указывает на значение этого цитокина в распространении вируса.

Глава YI. Характеристика антивирусного действия химиопрепаратов и индукторов интерферона в культурах, инфицированных ВИЧ-1.

Данные о том, что4 ВИЧ является этиологическим агентом СПИДа, явились основанием для поиска препаратов, обладающих анти ВИЧ-1 . активностью.

Y1.1. Исследование анти-ВИЧ-1 активности препаратов.

Влияния ряда препаратов на репродукцию ВИЧ-1 исследовали вТлим-фобластоидной культуре С8166, в этой же культуре определили токсическое действие препаратов в МТТ тесте (Таблица 13).

50% ингибирующие концентрации (ИК) препаратов зависели от использованной МИ вируса. После определния 50% токсической концентрации (ТК) был подсчитан терапевтический индекс (ТИ) каждого препарата, ТИ отражает разницу между 50% ИК препарата и 50% ТК.

Результаты, суммированные в таблице, показали, что из 6 препаратов, являющихся химиопрепаратами, 4 обладали анти ВИЧ-1 активностью. ТИ для унитиола составлял 190, для аминокапроновой кислоты - 100, для препарата N 822 -100, для препарата N 399 - 400. Из 7 индукторов интерферона 6 проявили анти ВИЧ-1 активность, ТИ был равен: >100 для ридостина, для амплигена -> 4-8, для кагоцеля - 200, для камедона - 700, для савраца - 2000.

Препараты, у которых ТИ составляет 100 и более, представляют интерес для дальнейшего исследования и последующего использования в клинике. Ридостин соответствует этим критериям и, кроме того, разрешен Фармакологическим Государственным Комитетом Института доклинической и клинической экспертизы лекарств МЗ и Медпрома РФ для использования при ряде заболеваний, вызываемых вирусами.

Таблица 13.

Влияние С8166.

- £9 -

препаратов на репродукцию ВИЧ-1 в культуре

Группа Наименование 50% 50% Терапевтический

препаратов ингибирующая токсическая индекс

концентрация концентрация

Химиопре-парапы

Унитиол Аминокапро-новая к-та N 822 N 821 N 399 Амбен

9-130 х

80-680 5-80 нет 40-300 нет

1900 х

>10000 625

1670

-190

>100 >100

-400

Индукторы Ридостин 40 >4000 >100

интерферона Кагоцел 50 10000 200

(иммуномоду- Камедон 10 7000 700

ляторы) Саврац 5 10000 2000

Ларифан нет

Амплиген А 50-400 >400 >4

Амплиген Б 25 >400 >8

Обозначения: х - мкг/мл, нет - нет эффекта

YI.2. Влияние ридостина на репродукцию ВИЧ-1 в Т. лимфобластоидной культуре человека С8166.

Ридостин - дс РНК,полученная из киллерных дрожжей S.Cerevisiae, относится к группе иммуномодуляторов. Иммуномодуляторы - препараты нормализующие нарушенные вследствие разных причин взаимодействия иммунокомпетентних клеток. Нарушения функционирования иммунной системы являются одним из основных проявлений инфекции ВИЧ (Levy, 1992)..Поэтому представляло интерес исследовать влияние ридостина на репродукцию ВИЧ-1 в Т лимфобластоидной культуре С8166, которая, как было показано в данном исследовании, вырабатывала спонтанно альфа и гамма интерфероны и ФНО альфа.

При обработке культуры C8J66 ридостином 50% ИК при МИ 0.01 составляла 4.5 мкг/мл, при МИ 0.001 составлял 68 мкг/мл и при МИ

0.0001 была равна 11 мкг/мл. 50% ТК препарата составляла >4000 мкг/мл. Следовательно ТИ был от >60 до >1000 и зависел от МИ ВИЧ-1, использованной в работе.

Ридостин ингибировал репродукцию ВИЧ-1 и в культуре активированных ФГА (Ю мкг/мл) лейкоцитов донорской крови, г.пх ик составляла 30 мкг/мл, что близко к результатам,

полученным с культурой С8166.

При изучении механизма действия ридостина клетки С8166 (1x10 б мл) инкубировали с этим препаратом (400 мкг/мл) и в динамике отбирали пробы для тестирования цитокинов методом ELISA (Таблица 14).

Таблица 14. Влияние ридостина на продукцию цитокинов культурой С8166.

День Ридостин Альфа ИФН Гамма ИФН ФНО альфа

ед/мл ед/мл пг/мл

1 - 2,1*0,6 2,15+1,2 73+8

+ 18,3+4,2 0,2+0,1 39+5

о /С - 4,3+1,2 8,49+2,3 548+40

+ 31,7+6,2 0,74+0,2 85+10

Отмечено увеличение продукции альфа интерферона в культурах, обработанных ридостином, до 31.7+6,2 ед/мл (контроль - 4.3 ед/мл) на 2 день после начала экспозиции. Продукция гамма интерфероне, которая была невысокой в необработанных культурах, резко снизилась, и на 2 день титры гамма интерферона составляли 8,49*2,3 ед/мл в контроле и 0.74+0,2 ед/мл в культурах, обработанных ридостином. Продукция ФНО альфа также была уменьшена с 73*8 ед/мл в контроле до 39*5 ед/мл,в культурах, обработанных ридостином в течение 1 дня, и с 548*40 ед/мл в контроле до 85+10 ед/мл в культурах, обработанных ридостином в течение 2 дней. ■

Из этих данных можно заключить, что анти-ВИЧ-1 действие ридостина связано, возможно, с активацией выработки альфа интерферона, который мог угнетать репродукцию вируса в клетках

С8166, а также ингибицией синтеза ФНО альфа, который, активирует репродукцию ВИЧ в клеточных культурах.

При культивировании клеток С8166 с разными концентрациями альфа интерферона (10-1000 ед/мл) отмечалось снижение продукции ФНО альфа, однако, уровень снижения был незначительным. Кроме того, ранее было отмечено также, что культура С8166 не чувствительна к действию интерферонов.

Следующие эксперименты были выполнены для исследования значения ФНО альфа в репродукции ВИЧ-1 в культуре С8166. Инфицированные клетки С8166 (1x106 мл, МИ 0,001 ТЦИД ) культивировали с Мо Ат к ФНО альфа. После образования синцития в контрольных необработанных антителами клетках все культуры криолизировали и в надосадке определяли титр вируса (Таблица 15).

Таблица 15. Влияние моноклональных антител к ФНО альфа на репродукцию ВИЧ-1 в культуре С8166.

Мо Ат Инфекционный вирус

мкг/мл Log ТЦИД50 /мл

0 3,25

1 1,12

5 1,75

10 <0,5

Мо Ат к ФНО альфа ингибировали репродукцию ВИЧ-1 в культуре, что видно по уменьшению титра вируса с 3,25 ТЦИД50 /мл в контроле до 1,12 ТЦИД эд/мл при использовании минимального количества антител (1мкг/м.л).

Следовательно, анти ВИЧ-1 активность ридостина.в культуре С8166 является с.педстмк-м уменьшенной выработки ФНО альфа, который обычно активирует репродукцию ВИЧ, а культурой С8166 продуцируется спонтанно, что, по-видимому, поддерживает репродукцию в ней ВИЧ-1.

УI.3. Влияние ридостина на инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1 и ее передачу . культуре С8166.

Ридостин (400 мкг/мл) вносили на разных этапах инфекции ЭКПВЧ и ее передачи культуре С8166 (Таблица 16). При обработке ридостином

ЭКПВЧ ингибирующее инфекцию действие отмечалось при добавлении препарата после инфицирования клеток или же при постоянном его присутствии в культуральной жидкости ЭКПВЧ (А). Максимальное ингибирующее действие (вирус и антиген в культуральной жидкости не обнаруживался) проявлялось при внесении ридостина сразу после инфицирования ЭКПВЧ и последующем добавлении его в культуральную жидкость при кокультивировании с клетками С8166 (Б).

Следовательно, ридостин оказывал ингибирующее действие на . ВИЧ-1 инфекцию на этапе культивирования ЭКПВЧ, передачи инфекции культуре

Таблица 16. Влияние ридостина на инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1 и ее передачу культуре С8166.

А. Ридостин добавили Инфекционный вирус Вирусный антиген К ЭКПВЧ Log ТЦИД50 !/мл р24, пг/мл

Перед инфицированием 24 часа

После инфицирования 24 часа

Перед и после инфицирования, 48 часов Контроль

4,5 3400

3,75 2100

3,75 2300

5,0 >4000

Б. Ридостин добавили к Инфекционный вирус Вирусный антиген . ЭКПВЧ С8166 Log ТЦИДэд /мл р24, пг/мл

3,1 2,15 <1.5 3,35

670 230 <20 6200

+

С8166 и кокультивирования. При использовании МИ ЭКПВЧ - 0.1, 1.0 и 10.0 ТЦИДс;о ВИЧ на клетку получены аналогичные результаты.

Ридостин (400мкг/мл), внесенный в культуральную жидкость ЭКПВЧ. индуцировал выработку альфа интерферона (10 ед/мл) этими клетками. Поскольку, как было показано в данном исследовании, альфа

- ЗУ -

ИФН ингибировал инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1, нельзя исключить, что именно с помощью этого механизма ридостин уменьшал ВИЧ-1 инфекцию на этапе его контакта с ЭКПВЧ. При внесении ридостина в культуральную жидкость кокультур его действие можно объяснить влиянием на функционирование сети цитокинов в культуре С8166.

Из результатов экспериментов, представленных в данной главе, можно заключить, что хш.'.иопрзпараты и иммуномодуляторы обладают анти-ВИЧ активностью в культуре клеток С'8166. Иммуномодулятор ридостин ингибирует инфекцию ВИЧ-1 в культуре С8166 влияя на продукцию цитокинов: уменьшает выработку активирующего инфекцию ФНО альфа. В ЭКПВЧ ридостин индуцирует выработку альфа интерферона, который, по-видимому. проявляет ингибирующее действие. При постоянном присутствии ридостина ингибирующий эффект является суммой ингибирующих механизмов, проявляющихся на каждом этапе инфекции. Полученные данные обосновывают дальнейшее использование ридостина для лечении инфицированных ВИЧ-1 людей.

ВЫВОДЫ

1. Впервые создана модель инфекции ЭК ВИЧ-1 и ее передачи СЭ4+Т лимфобластоидной культуре С8166.

2. ВИЧ-1 вызывает в ЭКПВЧ развитие абортивной инфекции, характеризующейся обратной транскрипцией вирусной РНК и последующим уменьшением количества ДНК транскриптов в клетках. В ЭКПВЧ не происходит созревания вирионов и передача вирусспецифического материала культуре С8166 осуществляется путем слияния донорских и реципиентных клеток с последующей репродукцией вируса. Отмечена прямая зависимость между уровнем вирусспецифической ДНК в ЭКПВЧ и уровнями накопления инфекционного вируса и вирусного антигена в культуральной жидкости кокультур.

3. ЭКПВЧ не экспрессируют С04 рецептор и ВИЧ-1 инфицирует клетки через галактозил и-рамид - липид, экспрессированный на клеточной мембране.

4. Впервые показано, что инфекция ЭКПВЧ ВИЧ-1 может быть передана аутологичным и гетерологичным лейкоцитам крови.

5. Антитела к МКА и антигенам ГКГ являются регуляторами как инфицирования ЭКПВЧ ВИЧ-1, так и передачи инфекции культуре С8166. Впервые показано, что моноклональные антитела к IСАМ-1 увеличивают инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1 путем образования моста между молекулами

1СЛМ-1, экспрессированными на поверхности ЭКПВЧ, и этими же молекулами, включенными в состав вирионов при их отпочковывании от клеток, экслрессирующих эти МКА. Моноклональные антитела к ICAM-1 ингибируют передачу инфекции, препятствуя соединению МКА ICAM-1 на ЭКПВЧ с ее лигандом на культуре С8166 МКА LFA-1.

6. ЭКПВЧ чувствительны к антивирусному действию альфа, бета, гамма и омега интерферонов в такой же степени, как и перевиваемая культура человека WISH и диплоидная культура фибробластов человека PEU. Интерфероны альфа, бета и омега ингибируют инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1, тогда как гамма интерферон активирует ее.

7. Впервые показано, что гамма ИФН активирует передачу ВИЧ-1 инфекции от ЭКПВЧ культуре С8166. Один из механизмов этого процесса заключается в активации гамма интерфероном экспрессии МКА IСАМ-1 на ЭКПВЧ, вследствие чего увеличивается количество слившихся донорских ■ и реципиентных клеток и увеличивается уровень репродукции вируса.

8. Альфа КЛИ человека, состояний из смеси альфа и гамма интерферонов, активирует инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1.

9. Гамма интерферон оказывает регулирующее влияние на синтез и продукцию цитокинов ( ИЛ-1, ИЛ-6) нормальными и инфицированными ВИЧ-1 ЭКПВЧ.

10. ФИО альфа, подобно гамма интерферону, активирует передачу инфекции от ЭКПВЧ культуре С8166, увеличивая экспрессию IСАМ-1 на инфицированных ЭКПВЧ.

11. Впервые показано ингибирующее действие индукторов интерферона ридостина, кагоцеля, камедона. савраца на инфекцию культуры С8166 ВИЧ-1.

12. Ридостин ингибирует инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1, передачу инфекции культуре С8166 и репродукцию вируса в культуре С8166, изменяя уровень ■ синтеза и секреции цитокинов, продуцируемых этими культурами.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Течение вирусных инфекций и образование интерферона у радиационных химер//кн. "Вопросы радиационной иммунологии" М. 1972, 50-54 (Орлова Т.Г., Менткевич Л.М., Соловьев В.Д.)

2. Образование интерферона и инфекционный процесс, вызванный вирусом везикулярного стоматита (ВВС) у радиационных химер/ZActa Virologica, 1973, 17, 2, 159-162 (соавт. Менткевич Л.М., Орлова

Т.Г., Соловьев В.Д.)

3. Образование интерферона и инфекционный процесс, вызванный вирусом гриппа у радиацинных химер//АсЬа Virologica, 1973, 17, 5, 435-438.

4. Видоспецифичность интерферона - признак ксеногенного химеризма кроветворной ткани//Радиобиология, 1973, 14, "6 293-294 (соавт. Менткевич Л.М., Амченкова A.M.).

5. Production of interferon induced by viruses and PolilrPoliC in radiation Chomeras// Acta Virologica, 1974, 18, 261-263 (соавт. Менткевич Л.М., Орлова Т.Г.).

6. Влияние облучения и последующей трансплантации костного мозга на образование сывороточного и клеточного интерферона у мышей//Радиобиология, 1974, 14, 5, 776-778 (соавт. Менткевич Л.М.).

7. Способ получения человеческого интерферона//Авторское свидетельство N 460870, выдано в 1974 г. (соавт. Орлова Т.Г., Соловьев В.Д., Менткевич Л.М., Кузнецов В.П.).

8. Видоспецифичность интерферона, индуцированного вирусом гриппа и лолиИ:полиЦ у ксеногенных химер//Радиобиология, 1975, 15, 4, 630-633 (соавт. Менткевич Л.М.).

9. Костномозговой интерферон//Бюлл. эксп. биол. и мед.. 1975, 7, 62-64 (соавт. Соловьев В.Д., Менткевич Л.М., Орлова Т.Г., Осидзе Н.Г., Гуленков В.В.).

10. Клеточные и молекулярно-биологические основы образования интерферона//кн. "Успехи иммунологии", изд. Медицина, 1977, 191-201 (соавт. Орлова Т.Г., Менткевич Л.М., Когновицкая А.И., Георгадзе И.И., Соловьев В.Д.).

11. Comparative study on the anticellular and antiviral effects of interferon and the haemopoietic stem cell inhibition factor//Acta virologica, 1979, 23, 177-182 (соавт. Орлова Т.Г.. Голованова Т. А., Мысякин Е.Б., Бохонько А.И., Каулен Д.Р.).

12.Интерферониндуцирующая активность клеток костного мозга, обработанных мРНК д./i;! штфферона при трансплантации их облученным мышам//Вопросы вирусологии. 1979. 5, 541-544 (соавт. Орлова Т.Г., Жданова Л.В., Менткевич Л.М., Соловьев В.Д.).

13. Возможность использования клеток селезенки людей для продукции интерферона//Вопросы вирусологии. 1981, 1, 64-67 (соавт. Орлова Т.Г., Верулава И.И., Менткевич Л.М., Кулагин И.Н.. Пафомов Г.А., Соловьев В.Д.).

14. Способ получения иммунного интерферона//Авторское спиде-

тельство N 1498226, выдано в 1986 г. (соавт. Орлова Т.Г., Езепчук Ю.В., Носкова В.П., Соловьева М.Н., Аспетов Р.Д., Носков А.Н.).

15. Использование энтеротоксинов, адсорбированных на фильтрах, для получения иммунного интерферона//Вопросы вирусологии, 1987, 3, 327-329 (соавт. Носков А.Н.. Соловьева M.Н., Менткевич Л.М., Езепчук Ю.В.. Покидышева Л.Н.. Орлова Т.Г.).

16. Кислотолабильный и кислотостабильный интерфероны, индуцированные вирусом инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота//Вопросы вирусологии, 1988, 4, 437-440 (соавт. Орлова Т.Г., Шуляк А.Ф., Крюков Н.Н).

17. Продукция интерферона и активость естественных киллеров, индуцированных стафилококковым энтеротоксином в клетках селезенки мышей//Вопросы вирусологии, 1988, 3, 305-308 (соавт. Сухих Г.Т.. ВанькоЛ.В., Сулейманова Н.С., Фукс Б.Б., Тотибадзе Н.В., Езепчук Ю.В., Орлова Т.Г.).

18. Продукция интерферона первичной культурой эндотелиальных клеток человека//Бюлл. эксп. биол. и мед., 1989,11, 580-583 (соавт. Антонов А.С., КабаеваН.В., Орлова Т.Г.).

19. Интерфероны, вырабатываемые лейкоцитами человека после индукции вирусом гриппа//Вопросы вирусологии, 1989, 4, 463-466 (соавт. Орлова Т.Г., Кулиева А.М.).

20. Кислотолабильные интерфероны у больных аутоиммунными заболеваниями//кн. "Современные аспекты применения интерферонов и других иммуномодуляторов", Москва, 1990, (соавт. Кулиева А.М., Балабанова Р.М., Сейланов Л.С., Когновицкая А.И., Мамонтова Т.В., Орлова Т.Г.).

21. Продукция интерферона чувствительными и резистентными к фактору некроза опухолей линиями клеток//Вопросы вирусологии, 1990, 35, 1, 70-71 (соавт. Мамонтова Т.В., Орлова Т.Г.).

22. Клетки-продуценты альфа и гамма интерферонов человека//Вопросы вирусологии, 1990, 35,3, 213-215 (соавт. Орлова Т.Г., Соловьева М.Н., Славина Е.Г.. Когновицкая А.И., Мамонтова Т.В., Кулиева А.М.).

23.Интерфероны, продуцируемые лейкоцитами крупного рогатого скота//Ветеринарная иммунология и биотехнология, Труды ВИЭВ, 1988, т. 66, 28-32 (соавт. Шуляк А.Ф., Крюков Н.Н., Орлова Т.Г.).

24. Кислотолабильный интерферон человека//Интерферон-89, Сборник научных трудов, М. 1989, 77-82 (соавт. Кулиева А.М., Ляхов В.В., Орлова Т.Г.).

25. Production of a-interferon by human leukocytes//Acta

virologica, 1990, 34, 529-536 (соавт. Кулиева A.M., Орлова Т.Г.).

26. Изучение возможных механизмов образования альфа кислотолабильного интерферона//Интерферон-92, Труды НИИЭМ им. Гамалеи, М. 1992, 79-84 (соавт. Антонов А.С.. Кабаева Н.В.).

27. CD-4-positive lymphoid cells rescue HIV-1 replication from abortively infected human primary endothelial cells//Arch. Virol.,

1993, 132, 267-280 (соавт. Capobianchi M.R., Antonelli Q., Quanmu D., Dianzani F.).

28. Interferon system in patients with rheumatoid arthritis and sclerodermia systematica//Acta Virologica, 1993, 37, 54-60 (соавт. Балабанова P.M., Кулиева A.M., Сейланов Л.С., Аникина H.В., Орлова Т.Г.).

29. Immunomodulator ridostin inhibits both replication of HIV-1 in sensitive cells and rescue from abortively infected HUVEC//J. Interf. Res., 1993, 13, suppl. 1, W-12-7. (соавт. Capobianchi M.R., Ameglio F., Dianzani F., Ershov F.).

30. Effects of IFNs on the infection of human endothelial cells by HIV-1//J. Interf. Res., 1993, 13, suppl. 1, W-12-8 (соавт. Capobianchi M.R., Mercuri F., Ameglio F., Dianzani F., Ershov F.).

31. Альфа кислотолабилышй интерферон, обзор//Вопросы вирусологии,

1994, 39, 3, 102-110 (соавт. Орлова Т.Г.).

32. IFN gamma stimulates HIV-1 infection. Role of enhanced ICAM-1 expression in the cell-mediated virus transmission from endothelium to T eel Is//J. Interf. Res., 1995. 15, suppl. 1, F-47 (соавт. Capobianchi M.R., Gentile M., Scanio V., Barresi C., Ameglio F., Dianzani F.).

33. Ridostin inhibits HIV-1 replication in the T lymphoblastoid cell line C8166. Possible role of altered cytokine productiori//Acta Virologica, 1995, 39, 185-188 (соавт. Ameglio F., Trento E., Ershov F.).

34. Ridostin inhibits transfer of HIV-1 from abortively infected human umbilical vein endothelial cells to T lymphoblastoid eel Is//Acta Virologica, 1995, 39, 189-192 (соавт. Ershov F.).

35. Antibody to ICAM-1 mediates enhancement of HIV-1 infection of human endothelial cells//Arch. Virol., 1995, 140, 951-958 (соавт. Scanio V., Fais S., PapadiaS., Abbate I.. Castilletti C., Dianzani F., Capobianchi M.R.).