Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Клеточные и гуморальные механизмы регуляции системы естественной противоопухолевой резистентности (клинико-экспериментальное исследование)

<' : -

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи Ш 615.277.3.015.2+616.155.32

СЛАВИНА Елена Гржгорьевна

КЛЕТОЧНЫЕ И ГУМОРАЛЬНЫЕ МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ СИСТЕМ ЕСТЕСТВЕННОЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ (КЙПШКО-ЭКСПЕКШГГАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.00.14 - Онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой стененк доктора медицинских наук

Москва - 1992

Работа выполнена во Всесоюзном онкологическом научном центре РАМН

Официальные оппоненты:

Академик АЕН, член-корреспондент РАШ, профессор, доктор медицинских наук Ф.И.ЕНДОВ

Акадшяш АЕН, профессор, доктор медицинских наук А.Н.ЧЕРВДЕЕ профессор, доктор медицинских наук В.И.БОРИСОВ

Ведущая организация - Институт общей патологии, онкологии и р диологии им. Р.Е.Кавецкого АН Украины.

Бапщта диссертации состоится "<23 " О^прелл. 199&Г. в я -(О " часов на заседании специализированного совета Д.001.17.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всесоюзном онкологическом научном центре РАШ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВСШ РАШ.

Автореферат разослан " 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат медицинских наук Ю.В.ЕШШКИН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

В последнее десятилетие стало очевиднни, что классическая сноса специфического иммунитета является не единственным, и более го, вогкопно на главннм факторош контроля организма за ростоа в л злокачественно трансформированных клеток. Наиболее древней спо-иой поддержания гомеоотаза.организма является система так назн-еиой естественной резистентности. Одан из наибеiee существенных коипонентов - састеги естественной противоопухолевой резистент-стд, обеспечявавзая в значительной мере контроль за возннкновени-, ростом и кэтастагированиен опухолей (Г.И.Дейчман, 1983). Имевт-иногоянсленные данные о наличии обратной корреляции мезду гатен-вностью функционирования этой системы я ростом опухолей.

У человека п яивотных снигенная активность ЕК-клеток может быть язана с наруиением различных этапов их действия. Это может быть и медленная нх дп^ференцировка из стадии предшественников, и стаиен-* я способность зрелых ЕК-клеток г. установлению тесного контакта с ухолевшзз клетяаш, необходимого для лизиса последних, и нарушение .тзческоЗ активности самих EI-клеток. Практически все ати дефекты ино корригарозать янтерферонами - универсальными регуляторами ак-зеости систе.'.а естественной противоопухолевой резистентности l.Herberman, a.Holden , 1978). Разнообразие типов (<*-, $ -,

' -) интерферонов, а такяе препаратов интерферонов каждого типа, юбенно наиболее часто используемого в клинической практике алъфа-[герферона, приводит к необходимости сравнительной оценки разных «паратов в их способности усиливать противоопухолевые свойства ¡-клеток. С другой стороны, известно, что при распознавании анти-¡Ено-чугеродных клеток, в том числе, и опухолевых, происходит проекция кгрокого спектра иммунологически активных белков - лим$оки-ib иди щпхжнеов, в том числе, и интерферона. Поэтому актуальной дается задача выяснения закономерностей продукции интерферона >н взаимодействии клеток иммунной системы с клетками, имепцимз раз-пшя по "еильнш" и "слабый" антигенам гастосовместимости, а такге опухолевый клетками.

Однш из факторов, участвующих в обратной регуляции фуккниоЕпро-1ния системы естественной резистентности, является угнетахвде дей-гвие на нее различного рода супрессорных воздействий. Это могут

быть простагландинн, супрессорные факторы, продуцируемые опухолевыми клетками, а такта клетки-супрес соры. Описаю роль макрофагов ь супрессга активности ЕК-клеток. Однако шло изучена роль Т-лифад-тов в регуляции их действия. По представления А.И.Агеенко (1984) Т-лимфоциты в ряде случаев внсзупают в роли агентов усиления роста опухоли. Иоано представить, что вто усиление - проявление утнетао-щегосупрессорного влияния Т-дюфоцвтоа на систему естественное резистентности. Имеются лив? единичные сообщения о том, что галенно Т-ли»4>оциты-супрессоры подавляют индуцированную с,раг\гит актпкност ЕК-клеток. Поэтому изучение роли Т-лимфоцитов как супрессоров атой системы является актуальное задачей.

В онкологической практике придается большое значение подвергали определенного уровня функционирования ивдуиологических иеханиаиов контроля опухолевого роста и, в частности, функционирования системы естественной противоопухолевой рззиотентности. С втой целью приггеЕЯ ется различные средства иммунотерапевтичесного воздействия, в топ числе, цитокины и, в частности, интерферош. Получение такого рода средств для иммунотерапии в значительных количествах непросто, они обходятся дорого. Кроме того, будучи высокомолекулярный! соединения ии, они сами по себе могут выступать в роли антигенов; длительное 1 применение в ряде случаев колет приводить к появлению в организме нейтрали эуицих их действие антител, хотя роль последних в свгхении эффективности иммунотерапии цитокинаии не определяется как одиозная ная и разными авторани по-разному обсуцдается. Во всяком случае, её сомненно, что наряду с использованием цитокинов в онкологии необходим поиок синтетических ниэкошлекулярных модификаторов имаувного ответа и системы естественной резистентности. Перспективность поим таких соединений заключается в том, что наряду с существенной активностью они мохут оказаться более доступными в клинической пракш ке как с точки зрения более простого способа получения в достаточвс количестве препаратов во стабильными и легко контролируемыми свойс! вами, так и с экономической точки зрения, йяевгоя также основания предполагать целесообразность комбинированного применения синтетнч« ких имцуномодуляторов с цитокинаии. Одним из таких новых препарата является синтезированное в Институте органического синтеза АН Латв) простое низкомолекухярное соединение - 2-карбамоил-агиридин (леака-дин), показавшее при предварительных исследованиях вырахенвые ш-цп модулирупцие свойства.

Актуальность доследования заключается в отсутствии конкретных дтгнт о неханизках регуляции системы естественной противоопухоле->2 резистентности а взаимоотношения ее с системой специфического •клеточного игвдунитета, что в свою очередь связано с проблемой дбора адекватных средств для комбинированной шмунотерапип онко->гических заболеваний с помощью как природных, так и искусственно 13 да иных препаратов. (

Педь в задачи исследования-

Целью настоящего исследования является изучение роли Т-лимфоци-ш как регуляторных клеток системы естественной резистентности, а иске изучение шадунофармакологических основ действия интерферона нового синтетического икмунонодулятора леакадина на эту састзку.

В работе были поставлены следуйте задачи:

1. Выяснение роли Т-лимфоцитов при росте слабоимцуногенной опуши у штей.

2. Определение соотношения роли системы естественной резистент-юти и Т-лиифоцитов в поддержании индуцированной химиотерапией ре-[ссии опухоли.

3. Изучение закономерностей продукции интерферона при первичном аунологическом распознавании клеточных антигенов.

4. Сравнение шэдунокорригиру£Чих свойств различных препаратов йфа-интерферона.

5. Ииэдгнофармакологнческая оценка нового отечественного низко-яекулярного синтетического имксгномодулятора леакадина.

Научная новизна полученных'результатов

Впервые удалось достоверно показать, что при росте в эксперимен-шьесй системе сяабоиннувогенной опухоли - адэнокарциноыы толстого шечннка - АВДТОЛ - главное противоопухолевое действие у интактаых ¡леченных животных связано с деятельность!) системы естественной яро-гаоопухолевой резистентности и ее зффекторннх клеток - ЕК-клеток; ¡ль хе Т-лиьфэцитов заключается, главный образом, в ограничении ак-шности этой системы. Воздействия, угнетагетще деятельность Т-лшфо-гтов-супрессоров, - тимэкт-чшя, антитимоцитарная сыворотка, пре-зансплантациовяое облучение, циклофосфа'шд, взеденныЗ за 3 дня до плантации опухолевых клеток - способствуют замедлению роста опухо-г.

Получены новые данные о взаимодействии специфического Т-клеточ-

- б -

ного иычунитега е системы естественной резистентности в процессе поддержания индуцированной химиотерапией ремиссии ивдуногенной опухоли на примере лиыфомы ВЬ4 мышей С57В1/6 . Определено, что на раннем этапе рецидивирования этой опухоли после индукции ремиссии цитозаром и дезоксвдитиданоы (араЦ + дЦ), она растет как слабоимму-ногенная, т.е. практически в отсутствие специфического иммунологического контроле. Т-динфоциты в этом периоде Функционирует ливь в роли супресооров, что показано в тесте «та1 а , когда спленоцктн леченных мышей эффективнее инактивирувт клетки лимфоыы после удаления Т-кхеток, а также, если сплеиоциты для теста »1па'а были получены от мышей, которым в самом начале ремиссии был однократно введен цшслофосфен в дозе 100 иг/кг. На бстее позднем этапе рецидврова-ния 5"ой опухоли - 54 и более поздние дни - выявляется отчетливое противоопухолевое действие Т-лимфоцитов. По-видимоцу, на примере этой опухоли подтверждается представление о системе естественно! противоопухолевой резистентности как о наиболее раннем механизме, одерживающем опухолевый рост до развития специфических юащюдогв-ческих реакций, опосредованных Т-димфоцигами, а также, как и в опытах со слабоимчуногенной опухолью АКА.Т01, выявляется супрессорное действие Т-лимфоцитов на деятельность эффекторных клеток системы естественной резистентности. Данные об опосредованной Т-лимфоцитами супрессии этой систем являются принципиально новыми и иаеот определенное теоретическое звачение.

Впервые показана очень ранняя, с первых часов контакта лвафоцн-тов мышей с антигенно-чугеродныии (аллогенныки) клетками, продукция интерферона в смешанной культуре лимфоцитов (СНЛ), а такта достаточно ранняя в свешанной кулыуре лимфоцитов и свпгекннх опухолевых кле ток (СКЛО). Впервые получены данные о возможности чередования продл ции интерферона и его ингибитора в СКД, т.е. о наличии саиорегулиру! щейся системы, определящей и активность системы естественной резистентности: чередование высоких и низких титров интерферона в соседних точках кривой при ежечасном тестировании в оупернатантах СКЯ согласуется о почасовой "пульоациай" активности ЕЕ-клеток в селезенках мышей. Эти данные раскрывает вовне возможности для понимания механизма "надзора" системы естественной резхотентности за постоянством иммунологического гомеостаза организма без предварительной сенсибилизации.

Получены вовне данные о роли антигенных различив между клеткам*

i процессе вторичного шцунного ответа для продукции гамма-интерфе-юна: выяснено, что как различия по "сильным" антигенам главного сошлекса гистосовмзстимости (ГКГ), так и "слабые" различия, не свя-шнныо о ГКГ, индуцируют продукции интерферона предварительно сенси-5глазированными яикфоцитгми мшей во вторичной СКЛ. Продукция интерферона во вторичной СКЛ происходит при различиях реагирующих п сти-дуларущих клеток как по антигенам I класса - продуктам К района ГКГ, гак и по антнгенан П класса, связанны.! с I районе т. Однако различия ю антигенам Д-района ГКГ, также I класса, практически не имеют зча-зення: продукции интерферона з такой вторичной СКЛ не происходит. Значение этих фактов определяется раскрытием механизма участия интерферона в регуляции наряду с системой естественной резистентности at системы специфического нгадунитета, в том числе, вероятно, и противоопухолевого.

Впервые в одновременных ели дагз в одних и тех ае опытах проведено сравнение способности различных препаратов альфа-интерферона стимулировать цитотоксическую активность ЕК-клеток человека. Определено, что такая способность in vitro высокоочиценного яативного препарата (ЧЛИ) и рекомбинактного (реаферон) сходна, а у нативных препаратов промежуточной степени очистки (ннтерлок и лейкинферон) - существенно выше. В опытах по фракционированию препаратов подтверждено,что ЕК-стимуднругщая активность альфа-интерферона действительно связана с самой молекулой интерферона, а не с посторонними белками. У больных сравнимая степень активации ЕК-клеток достигается при ежедневном введении 40x10^ НЕ лейкинферона и 3-6x10® ME высокоочищенных препаратов - ЧЛИ или реаферсна. Это открывает значительные перспективы в иммунотерапии интерфероном - возможность замены одного препарата другим как в случаях ограниченной доступности какого-либо из препаратов, гак и в тех случаях, когда образование нейтрализующих антител к интерферону, что нередко происходит при длительном лечении высокими дозами, главным образом, рекомбинантвнми препаратами, сниаае? эффективность лечения.

Впервые дана комплексная ишунофармакологическая характеристика нового синтетического ижук модулятора леакадина. Выявлены дозы и режимы применения леакадина для повышения генерации специфических цито-токоичееккх лимфоцитов, а также активации ЕК-клеток у мышей. Показано модулирулцее действие леакадина на реакцию "трансплантат против хозяина": в зависимости от интенсивности реакции у интактных мышей леака-

дин может ее усиливать или ослаблять, т.е. ведет себя как истинный иммуномодулятор. Показана его определенная противоопухолевая активность на примере лвьфосаркомы ЛГ мышей. У онкологических больных леакадин заметно нормализует соотношение СД4- и СД8-позетевных лимфоцитов, повышая его у больных с исходно сЕвкеннш н снксая у больных с исходно чрезмерно повышенным этим показателем. Оказалось, что леакадин лишь в слабой степени влияет в среднем по группе леченных больных на активность ЕК-кзеток крови, однако имеется четкая завнси-мосгь и этого его действия от исходного уровня у каждого больного.

Показана целесообразность комбинированного иммунотераневтическо-го применения леакадкна с интерфероном: при этом достигается как повышение активности ЕЕС-клеток, так и нор-тдизация соотношения иммуно-регулягорных Т-лимфоцитов (СД4/СД8).

Научно-практическая значимость результатов исследования и внедрение их в практику

Научно-практическая значимость работы заклзгается в получении новых данных, необходимых для понимания иеханЕзмов функционирования и регуляции системы естественной противоопухолевой резистентности е взаимодействия ее с системой специфического Т-клеточного икмуннтета. Особенно ванным представляется установленный факт ранЕего одергивания системой естественной резистентности роста опухолей, в тол числе и высокоишуногеншгх, в эксперименте. Не менее ваяно выявление ранней про; тщии интерферона в результате взаимодействия аялогенннх лиг фоцитов, разягчавщихся как по "саяьнш", так и по "слабым" антагена: тканевой совместимости, а таете при первичном распознавании лимфоцитами сингеннкх опухолевых клеток, что, по-видз&юку, обусловливает ранний реаг"ию иммунологических механизмов на появление в органиаые чуверодных опухолевых клеток. Для научных исследований дольное збэч> ние имеет разработанная система изучения антисупрессорных воздействий при росте слабогкцуногенннх опухолей, что косе? быть использовано для индикации антисупресссрных свойств новых лекарственных препа ратов. Большую практическую значимость имеет проведение комплексной иммунофармакологической характеристики нового синтетического Еымуно модулятора леакадина и отечественного рекомбинантного препарата альфа-интерферона - реафсрона, в результате которой они рекомендова ны для лечения онкологических больных. Полученные результаты внедре ны в медицинскую практику - получены разрешения Фармакологического

гоиитета Ш СССР на применение этих препаратов в медицине. С участя-эм автора работы разработаны и издана методические рекомендация "Методы определения биологических модификаторов противоопухолевого имму-аитета ин витро а ян впво при клинических испытаниях", утверзденные Ш СССР в 1989 году. Разработанная методика изучения антисупрессор-вых воздействий при росте слаб0и1.я.шюгенн1пс опухолей применяется в табораторяях других научных учрездений, о чем имеются акты внедрения.

Работа выполнялась согласно тегэм основного плана НИР БОНД АШ 2ССР в рамках государстзешшх программ 01.83.0 014992 и 01.83.0 Э14980.

Материалы диссертация опубликованы в 33 печатных работах (список их прилагается).-

Все эксперименты, а также иммунологическое обследование леченных интерфероном и леакаданом больных выполнялось npL личном участии автора. Планирование опытов к оценка результатов, включая их статистическую» обработку, прозодзлось лично автором.

ИммуЕобиологичеекзе доследования проведены с учгсгзем научных сотрудников ВОЩ А'Ш СССР И.Л.Лейпунсхой, А.И.Чертковой п научного сотрудника Института радиологии я онкологаи Узбекистана А.С.Бабадаа-нова; в хронобиологгческих опытах принимали участие А.П.Суслов (ЕИИЭИ ем. Н.Ф.Гаыалеи АМН СССР), Д.Д.Зархевич л Т.П.Рябых (БОНН ALEE СССР); фракционирование препаратов интерферона проводилось Я.З.Тимофеевым под руководством проф. Т.Г.Орловой и З.П.Кузнецова (ИЭМ т. Н.Ф.Гамалеи); вез клинические исследования проводились в отделении клинической фармакологии ВОНЦ (рук. - проф. А.М.Гарин).

Апробация ^диссертации проведена на кенлабооаторной конференции в ВОНЦ АМН СССР. Основные положения работы были доложены и обсукде-ны на всесоюзные и кеадународных конференциях и симпозиумах.

2. ШШШШ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы кыш енбредных и рекомбинантных линий из питомников "Столбовая" ВОЕЦ АМН СССР и НИЛ экспериментальных моделей А1Ш.

Опухоли: линейно-специфические солидные и асцитнне - саркома Mill (Н-2*5), иастоцитома P-8I5 (H-2d), лшфома SL4 (Н-2Ь), АКАТОЛ (H-2d), лшафосаркогш ЛГ (Н-2*5), лимфома 1.1210 (H-2d), гепатома Н-2-73 (В-2 ).

Антитела: моноклональные антитела к дифференцировояному антигену Thy 1,2 Т-лимфоцитов мышей, любезно предоставленные~нам А.ВДер-вонским, коммерческие препараты моноклональных антител к дифферен-цировояным антигенам Т-лимфоцитов Человека фирмы Orto Diagnostic 0KT3 (СДЗ), 0КТ4 (СД4), 0КТ8 (СД8) И фирмы' Becton Dickinson Leu? (СД16). Антисыворотки к антигенам Т-лимфоцитов мыпи (антитлмоци-тарные антитела) были приготовлены совместно о А.С.Бабадаановым многократной иммунизацией кроликов тимоцитами и тканью головного могга мышей по методу E.s.Oolub (1972) с последухщей адсорбцией тканью печени, эритроцитами, костным мозгом и нормальной сывороткой мышей СВА и BAiB/c . Чнактивированная сыворотка имела цитотокснчелсий титр против тимоцитов мыши 128-256 для разных пулов.

В качестве "вторых" антител при постановке непрямой реакции им-«уно^люоресценции использовали высокоочищенные препараты овечьих антител против иммуноглобулинов мыши фирмы Sigma или их РСаЮдфраг-менты фирмы Hew England Nuclear , конъюг^рованные с PITO .

Для комплементзависимого цитотоксического теста использовали нетоксичный кроличий комплемент фирма Cederline , Канада.

Препараты интерферона

Препараты нативного, частично очищенного и внсокоочищенного лейкоцитарного человеческого интерферона были получены от проф. В.П. Кузнецова из НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Га-лалеи АМН СССР и представляли собой до очистки культуральные жидкости от культивирования лейкоцитарной шссы, подученной из крови здоровых доноров, индуцированной к продукции интерферона вирусом Ныокаслской болезни ( NDV ).

Специфическая активность частично очищенного препарата составляла 8 тыс. МЕ/мг белка, внсокоочищенного - 10 млн. .Л/мг белка. Очист ка препаратов интерферона проводилась по методу, ранее описанному в.] Кузнецовым с соавт.(1980)

Рекомбинантный препарат А-2а-интерферова (реаферон). Создан в ВНИИ генетика Гдавыикробиопроыа при Совете Министров СССР. Бактериальный штамм-продуцент реаферона - Pseudomonas putida VG-84, в генетический аппарат которого с помощью плазмиды PVG-з , ветров! ген человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2. Определение биологических свойств реаферона было проведено во ВНИИ генетика, НПС "Фермент" Минмедбиопрома, а также в институте биоорганической химик АН СССР. По их данным, процентное содержание интерферона в препарате

оставляет более 99$. Удельная активность 1,7x10® МЕ/мг белка. Ле-арственная форма содержит 0,05 М ыагрий-фосфатный буфер, 0,5% че-овеческого сывороточного альбумина, 0,15 М NaGl . Противовирусная ктивность лекарственной форш I млн. МЕ/мл. На его клиническое ис-ытание было получено разрешение ФК Ю СССР, а в настоящее врепя меется разрешение на его медицинское применение для лечения рака очки и некоторых других опухолей.

Препараты бычьего и свиного интерферонов были подучены от про-ессора В.И.Марченко. Они представляют собой нативные препараты ин-ерферонов, индуцированных UDV в клетках свиньи или быка; их анти-ирусная активность проверялась стандартным методом по защите гомо-огичных клеток от питонатического действия вирусов.

Препарат мышиного интерферона готовили индук-яей монослоя мыши-ых клеток L929 вирусом ndy с титром I09, определяемым на ку-иных эмбрионах. Вирус перед индукцией частично инактивировали облу-ением ультрафиолетом. Икфицирова нные культуры инкубировалг при 37°С течение 36 часов, после чего культуральную сред,' отбирали, освобож-али от клеток центрифугированием и для инактивации вируса добавляли ,Н НС1 до достижения рН 2. Закисленные препараты хранили при 4°С

суток и заУем путем добавления 6 к NaOH доводили до рН 7-7,2. ак правило, титр таким образом приготовленных нативных препаратов |ЫЛ 400-500 ед/мл.

Препараты $ - и ¡f -интерферонов были подучены из Государствен-¡ого контроА-Ьного института бактериальных и вакцинных препаратов МЗ 'ССР.

Все препараты интерферонов, применяемых д..л лечения больных -.'ейяикферон, лейкоцитарный интерферон для инъекций, реаферон - прочены на токсичность в культуре ткани и на животных, на безвредность га животных, на мутагенность и пирогенносгь. Стабильность лекаретвен-шх форм сохраняется в течение I года, а в виде растворов в течение te менее 24 часов при температуре от 4 до Ю°С.

Источником этих сведений являются соответствующие эксперпменталь-го-производственныэ регламенты.

Все препараты прошли полный контроль их качества в ГЙСК им.Тара-:евича. На их клиническое применение имеются разрешения Фармакологи-геского Комитета при МЗ СССР.

Противоопухолевые лекарства. а также индометацин и противоопухо-гевый иммуномодулятор леакадан представляют собой препараты фабрич-

ного производства.

Культуры клеток. Для титрования препаратов мышиного интерферона использовали монослойнне культуры гомологичных клеток L929 ; для выявления цитолитической активности ЕК-клеток человека - клетки эритролейкекии К-562 или Т-клегочной лимфомы HOLT 4 , а ЕК-клеток мши - клетки линии УАС-1 , происходящие из долфомы Иолони. Для тит рования интерлейкина-2 использовали лимфобласты, полученные стимуляцией лиьфцитов крови человека 2 мкг/мл конканавалина A in vitro с последупцим культивированием в течение 3-5 дней.

Использованные культуральные среда: среда 199 производства НИИ полиомиэлита и вирусных энцефалитов АМН, Москва, а также ср-да ярит 1640 ( Flow , Англия) с добавлением сыворотки крупного рогатого скота или эмбриональной телячьей сыворотки ( Diíco или HIII£..i им. Н,5.Гамалеи), 2 ыМ L -глутамика, 5 мМ буфера ее?нз , 2 г/л НаНС03 , 40 ыкг/мл гентамицина.

Основные методики

Для определения активности антисывороток использовали реакцию комплементзависимой цитотоксичности против соответствунцих клеток.

Титрование противовирусной активности интерферонов проводили полумикрометодом, в плоскодонных 96-луночных планшетах ( Plow ) по подавлению цитопатического действия вируса везикулярного стоматита в гомологичны клетках.

Активность ЕК-клеток оценивали в цитотоксическом тесте (K.Brun-aer et al. , I9S8) против меченых Сг клеток-мишеней: К-562 или uolt 4 для ЕК-клеток человека и yac-1 - для ЕК-клеток мыши. Зффекторные клетки получали из периферической крови человека или селезенок мши. Интенсивность цитолиза определяли по выходу изотопа из убитых клеток-мипзеней и количественно выражали через цитотокси-ческий индекс (Ц"П' £}. и число литических единиц (ЛЕ), в I млн моно цуклеарнцх клеток.

Количество Т-лимфоцитов и соотношение ишунорегуляторгшх субпопуляций у больных определяли методом непрямой иадунофлуоресцекции ( LuDaroff, Яакзтаа , I9S8) в модификации А.ВДервонского

и соавг. (1983) на предметных стеклах, покрытых поли-1 ^лизином.

Способность лимфоцитов крови больных к продукции интерлейкича-2 определяли, инкубируя моноцуклеарные клетки крови в присутствии 0,8 мкг/мл митогена ОГА-Р ( Diíoo ) в течение 3&-48 часов, с последупцим титрованием супернатанта по стимуляции включения 3Н-тими-

дина в клетки 5-7-дневной культуры Кон-А-лимфобластов. Для идентификации интерлейкина-2, а такде количественного выражения уровня его продукции использовали в качестве контролей референс-препарат с известной активностью I ед/мл), а такяе антитела против ИЛ-2. Оба контрольных препарата получены от Н.Н.Войтенка (ВГЩ).

Для определения продукции интерферона в процессе первичного и вторичного иммунологического' распознавания использовали метод культивирования лимфоцитов (спленоцитов) мышей различных линий в первичной смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ) или лимфоцитов и опухолевых клеток (СКЛО), а также во вторичной СКЛ, где отвечавшие клетки представляли собой спленоциты аллоимадунных мышей, полученные в различные сроки после иммунизации in vivo . Иммунизацию проводили однократным введением штам-реципиентам 90 млн.спленоцит -в, облученных la vitro в дозе 15 Гр, от мышей им,ty визирующих линий <Караулов с соавт., 1980).

Оба вида СКЛ, а также СКЛО культивировали в лунках 24--уночных пластиковых пластин ( Linbro , США) в объеме 2 мл среды RPlíI 1640 с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки, I» -глютамина, гента-мицина и 2-ыеркаптоэтанола. Соотношения отвечающих и стимулирующих клеток: 1:1 (5 млн + 5 млн) для первпчяой СКЛ, 5 млн спленоцитов + 0,1 млн опухолевых клеток в лунке для СКЛО и 10:1 (5 млн отвечающих клеток + 0,5 млн спленоцитов иммунизирующей линии) для вторичной С1СЛ.

Идентификацию свойств продуцируемого в СКЛ и СКЛО интерферона проводили: а) обработкой трипсином (I мг/мл 30 мин при 37°С) с последующим прекращением реакцли соевым ингибитором трипсина (0,5 мг/мл 30 мин при 37°С); б) определением чувствительности к низкоьу рН (закисление in раствором hci до рН 2 с последующим восстановлением нейтральной реакции добавлением через 2-3 суток 1И раствора NaOH до достижения рН 7,0-7,2); в) определением термочувстви-тельностз прогреванием при 56° в течение I часа; г) определением типа интерферона обработкой овечьими антискворотками против мышиных oí. — и Р -интерферонов. Для изучения роли антисупрессорных воздействий при росте слабоиммуногенной опухоли использовали "В-мшае2", для получения которых взрослых мышей balb/o подвергали тпмзктомки ( Налов et al. , 1971; Huía et el. , 1982) с последующим (через 20 дней) облучением в дозе 8,5 Гр на установке ГУНУ С Со®® (скорость дозы 6,3 Гр/мин) и заищтой в/в введением через 2 saca после облучения 15 млн клеток сингенной эмбриональной печени. В других

опытах использовали тимгктоыию без облучения или только облучение до введения клеток опухоли (5 Гр), ила введение циклофосфамида (100 мг/кг) за 3 дня до имплантации опухолевых клеток.

Для исследования ивдунологическпх закономерностей и поисков методов продления ремиссии при экспериментальных лейкозах попользовали разработанные В.М.Бухланом с соавт. (1980, 1989) методы химиоте-рапевтической индукции ремиссий (подробно в тексте), а также метод Winn'а

Фракционирование препаратов интерферонов при определении идентичности молекул, ответственных за противовирусную и ЕК-стнмулирупцие активности, было проведено И.В.Тимофеевым (ИЭМ е.". Я.Ф.Гамалеи) под руководством Т.Г.Орловой и В.П.Кузнецова по методу H.Dahl (1978).

Статистическая обработка результатов проведена с использованием критерия t Стьядента-1>Ешера, критерия , критерия Вшгкоксона для непараметрических величин, а такяе пробит-анализа. Различия считали достоверными при рч 0,05 и высокодостоверными при р < 0,01. Разброс данных, представленных на графиках и диаграммах охарактеризован с помощью стандартной оиибки средних величин.

Вся статистическая отработка проведена на компьютере Hewlett-Packard по программам, разработанным ведущим научным сотрудником Института химической физики юл. Н.Н.Семенова РАН кандидатом физико-математических каук И.О.Лейцунским.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИСС.ВД0ВАНИЙ И ИХ ОБСУЗДШИЕ

3.1. Механизмы клеточной регуляции системы естественной противоопухолевой резистентности

3.1.I. Изучение ;оли Т-лимфоцитов в контроле роста слабошамуногенной опухоли

В литературе имеются лишь единичные сообщения о взаимодействии системы естественной противоопухолевой резистентности в ее гффектор-ных клеток о Т-лимфоцитами. На модели слабоиммуноганной опуголи AKATOI, не индуцирующей в процессе своего роста специфического иммунного ответа (Г.И.Авдеев и соавт. 1978), исследовали характер рота этой опухоли и активность ЕК-клеток на фоне частичной элиминации и угнетения функций Т-димфоцитов у мышей в сингенной системе. Для »тоге животные были подвергнуты следующим воздействиям:

а) тимэктомия взрослых 8-недельных мышей ваьз/о в день 0; через 21 день оки получили летальную дозу гамма-облучения 8,5 Гр под защитой кроветзорения внутшпзенным введением сразу после обду-

С "

чения 15x10 клеток сингекной эмбриональной печени ("В-мыегй" ), на 28 день га были имплантированы клетки опухоли АКАТОЛ;

б) тимэктомия взрослых милей без облучения; через 3 мес. после нее - имплантация клеток опухоли;

в) введение антитимоцитарной сыворотки с цитотоксическим титром против тимоцитов мкшей 128-256; сыворотку ввод"ли внутризенно по 200 мкл каждые 2 дня с 3 по 15 день после прививки опухолевых ¡слеток;

г) облучение в дозе 5 Гр за 2 часа до введения опухолевых клеток;

д) введение 100 мг/кг циклофосфамида sa 3 суток до чнокуляши опухолевых клеток; при этом прямой противоопухолевый эффект цякло-фосфамида исключался, т.к. фармакокннетическяе исследованп * показали полное отсутствие препарата в организме к концу первых суток после его введения ( Brook , 1963).

Как видно на диаграмме (рис. I), все воздействия вызывали статистически достоверное угнетение роста опухоли: у "В" мкшей он был подавлен на 67,5^, у тимэктомированных кызей - на 61,5^ у облученных или леченных антитимоцитарной сывороткой - на 63,0$ и 63,8% соответственно; предварительное введение цгаслофоогаусда угнетало рост опухоли несколько слабее, на 38,9/5, но н это угнетение было статистически значимым - средняя масса опухолей у интактнш: животных в этйх опытах составляла I42I+II7 и I3S0+75 мг (в 2 опытах), а у получивших ЦЗ - 925+83 и 794+74 мг соответственно.

Дополнительное введение "B-мышам" идп облученным или лечекнкм ЦЗ мышам сингенных клеток селезенки от интактных мышей почти полностью восстанавливало рост опухолей; если se такие клетки до адоптивного переноса были обработаны in vitro аниггкмоцитарнкми антителами в присутствии комплемента - восстановления не происходило. Неэффективным было лечение мшей контрольной группы вместо антитимоцитарной сыворотки нормальной сыворотки кролика, а такле лояная операция вместо

тимэктомии.

В условиях индукции клеточной супрессии вакциной БЦЖ элиминаций Т-лимфоцитов также способствовала задержке роста опухоли АКАТОЛ.

100 -

90 .

80

70

о f 60

о К 50

ь

о 40

30

20

10

I la 2 2a 3 3a 4 4a- 46 5 5a 56

Рис. I. Poet опухоли АКАТОЛ у мышей balb/o в результате антисуп-рессорных воздействий:

1. "В"-¡ляпе

1а. "В"-мши + клетки~но№алъной*"сингенной селезенки

2. Тилэктошя

2а. Ложная' тишэктомия

3. Антитимоцитарная сыворотка За. Нормальная кроличья сыворотка

4. jf -облучение (5 Гр)

4а.¿'-¿облучение (5 Гр) + клетки нормальной сингенной селезенки

46.f-облучение (5 Гр) + клетки нормальной сингенной селезенки, обработанные анти-Т-сыворотки с С».

5. Циклофосфаыид (ЦФ, 100 мг/кг).

5а. Щ + клетки нормальной сингенной. селезенки 56. ЦФ + клетки нормальной сингенной селезенки, обработан нне анти-Т-сывороткой с С'.

j¡3, как известно, может отполировать противоопухолевые дадунологи-.ескке механизмы, в том числе и активность ЕК-клеток ( 0.Hatho , 978; C.Heimey and S.Gillia , 1982), В НаСТОЯХЗИХ опытах (рВС. 2) вакцина БЦЕ, введенная в I и 10 дни после инокуляции опухолевых клеток, подавляла рост опухоли AKAT0I иа 42,4$, в то время как антитнмо-цатарная сяворотиа (АТС) при, введении ее с I по 15 день роста опухоли - на 67,4$. Наибольший противоопухолевый эффект оказывало совместное применение вакцины БЦК и АТС - подавление роста опухоли на 74,7$. При сравнении по массе опухолей эффект совместного применения статистически значимо выше, чем каждого воздействия в отдельности (р< 0,001 в двух из трех опытов). Адоптивный перенос клеток селезенки от юшей с опухолью AKAT0I, леченных ЕВД + АТС( приводил к 27,45? угнетению роста -этой опухоли у реципиентов, и этот эффект усиливался до 31,2$ в результате предварительной элиминации из перенесенных спленв-цитов Т-клеток обработкой la vitro антитимоцитарной сывороткой в присутствии комплемента, в то время как элиминация макрсфагов на эффективность адоптивного переноса но влияла (рис. 2).

3.1.2. Активность ЕК-клеток при росте опухоли АВДТОЛ под влиянием претрансплантационного облучения

Суммарные результаты 3-х опытов показаны на рис. 3. Известно,что мыши линии balb/o относятся к генетически "слабым" по активности ЕК-клеток ( o.stutman et al. , IS8I), поэтому даже при соотношении эффзкторных клеток и клеток-мишеней, равном 200:1, цитотокси-ческий индекс (ЦП!) у контрольных мышей не превышал 15$. На 2-й день после прививки опухолевых клеток ЦТИ возрастал до 25%, но к 5 дню снижался до очень низкого уровня ( < 5%) и оставался ниже контрольного уровня по крайней мере до 9 дня. У мышей, подвергшихся пре-трансплантациоЕному облучению, ЦТИ на 2 день после прививки опухолевых клеток незначительно превышал наблюдаемый у необлученных животных в этот срок (30$), однако снижения его к 5 дню практически не происходило, а к 9 дню он возрастал в среднем до 45$.

Таким образом, можно заключить, что взаимодействие системы естественной противоопухолевой резистентности с системой Т-лиыфоцитов заключается в супрессорной роли последних, осуществляющих клеточную обратную регуляцию механизмов естественной резистентности in vivo I in vitro

Ж

п

Рис. 2. Влияние на рост опухоли AKAT0I вакцины ЩК, антиткыоцктарной сыворотки, их совместного пртлекенЕя, а также адоптивного переноса спленоцитов от мыпей с растущей опухолью, леченных этими воздействиями.

I. I. (дни I и 10); 2Ï АТС (с I по 15 день i^oej по 200 мкл в/в) ; 3. ЩК + АТС; 4. БЦЕ + нормальная сыворотка кролика. П. Адоптивный перенос спленоцитов от мышей с опухолью АКАТОЛ,леченных:

5..-ЩЕ; 6. АТС; 7. ЕЩ и'АТС; 8." ЕЩ и АТЛ + ..обработка

vitro АТС + С' (элиминация Т-лимфоцитав); 9. Ш и АТС + обработка la vitro ка^боныгьннм железом и магнитом (элиминация макрофагов).

Рис. 3. Влияние претрансплантационного облучения у мышей со слаЗо-иммуногенной опухолью на цитотоксическую активность ЕК-кле-ток.

I. Интактные мыши. 2 '. Мыли с опухолью АКАТОЛ".

3". Мыши с опухолы» АКАТОЛ," подвергшиеся цретрансплантацион-

ному облучению в дозе 5 Гр.

ЦТИ на графиках дан для соотношения эффекторных клеток и клеток-мишеней равного 200:1.

По оси абтцисо - сроки от момента прививки опухолевых клеток (дни), по оси ординат - ЦТИ {%).

3.2. Клеточные основы поддержания индуцированной химиотерапией ремиссии лейкозов и роль циклофосфамида как антисупрессорного'агента

Описанное выше антисупрессорное действие циклофосфамида,проявленное на примере слабоиммуногенной солидной опухоли АКАТОЛ, было проверено в .другой экспериментальной модели - при рецидивировании Т-кле-точной лимфомы ъъ\ у мышей С57В1/63 . Ранее В.М.Вухианом и

соавт. (1980, 1989) была разработана схема лечения животных, иноку-лированных клетками лимфош £Ь4 , вклшчаццая индукцию ремиссии цитозином-арабинозидом (цитазаром, ара-Ц) в летальных дозах под защитой дезоксицитидином (дЦ). Было также показано, что в селезенке и лимфатических узлах мышей с этой лимфомой, ремиссия которой была индуцирована таким способом, не содержится клеток, проявляпцих специфическую) цитотоксичесную активность против клеток-мишеней EL4 (М.Ф.Бархоткина и соавт., 1985). Однако у этих мкшей на всех этапах наблюдения, т.е. до начала лечения,во время лечения и после его окончания выявлялись Т-клетки иммунологической памяти, способные при вторичной иммунизации ln vitro превращаться в ЦТ1, специфически лизируицие клетки ей .

В терапевтических опытах оказалось возможным продление ремиссии, индуцированной совместным применением ара-Ц и дЦ, с помощью дополнительного использования циклофосфамида лутем однократного его введения в самом начале ремиссии.

В наших опытах мы исследовали клеточные основы продления индуцированной химиотерапией ремиссии лейкоза EI4 циклофосфамидом.

Для индукции ремиссии лечение начинали на 10-11 день после инокуляции клеток лккфомы, когда средний размер опухолевых узлов достигал 10-12 мм в диаметре. Мышам С57В1/6;) прививали подкожно по 10® асцитных опухолевых клеток в 0 день. Препараты вводили внутри-брллинно 3 раза в день тремя курсами: с II по 14, с 18 по 21 и с 25 по 28 сутки." Разовые дозы для араЦ - 10 мг/кг, для дЦ - 20- мг/кг.

Средняя продолжительность жизни нелечзнннх мышей составляла 21,8 суток (от 13 до 42 у отдельных животных). Гибель - 100%, У леченных такими курсами мышей средняя продолжительность жизни достигала 54,7 суток (р с 0,001); удлинение продолжидельности жизня составляло 151%, Прм этом до 17% животных в разных опытах оказывалось излеченным.

Первым днем ремиссии считался день полного рассасывания подкожно растущей лимфомы. Циклофосфамид вводили однократно внутрибршшшо на

3 день после окончания индукционной терапии, т.е. на 31 день после трансплантации опухолевых клеток.

Результаты противорецидивного действия ЦФ представлены на рис.

4 А и Б. Видно, что добавлен!-j к известной схеме, применяемой для ин дукции ремиссии, ЦФ в дозе 100 мг/кг на 31 день после введения оцухо левых клеток увеличивало как продолжительность ремиссии, так и выжи-

ваемость шлей с лимфоыой В14

0ЙЗ, дарения ара Ц + дЦ ара Ц + дЦ + : Г

Лачение: ? араЦ + дЦ.

%т

Рис. 4. А. Влияние циклофосфаишда на продолжительность ремиссии _ лейкоза BL4

Б. Влияние циклофосфамида Еа выживаемость, мышей с лейкозом EL4

1. Лечение араЦ + дД.

2. АраД + дЦ + щшгофосфамид. Бе- лечения.

По' оси абсцисс - дни опыта'.

По оси ординат - А - % мышей без опухоли.

Б - % живых мышей*

Анализ клеточных популяций, ответственных за этот эффект, проведенный "с помощью теста Winn'а (меотнонейтрализугщий тест), а также In vitro по оценке щтолитапеской..активности Ж-клеток показал, что в начале роста у нелеченных животных лимфома BL4 проявляет свойства слабоимцуногенной опухоли, растущей в отсутствие специфи-

ческих эффекторных клеток Т-клеточной природа. Спленоциты мшей, пс дученные на 36-43 дни после прививки опухолевых клеток (8-15 дней после окончания курсов араЦ + дЦ)', введенные штактннм мышам в смес с клетками лимфомы,увеличивали, хотя статистически и недостоверно, среднюю продолжительность жизни реципиентов. Обработанные se перед переносом in vitro анти-Г-сывороткой и комплементом, они оказались существенно более активными, что свидетельствует, во-первых, с отсутствии какой-либо роли Т-лдафоцитов в противоопухолевом эффекте и, во-вторых, о том, что как и при росте опухоли АМТОЯ, Т-лимфощп в этот период функционируют в роли супрессоров. Добавление в схему лечения доноров спленоцитов циклофосфана приводило к дальнейшему на расганию средней продолжительности низни реципиентов, особенно если клетки таких доноров были обработаны in vitro АТС и комплементом, что существенно повышало их эффективность.

Параллельное определение in vitro цитотоксической активное га ЕК-клеток в селезенках мышей с лгафэмой EL4 показало значительное ее снижение ухе на 7 день роста лимфомы in vivo : ЩИ составлял лишь 61% от его уровня у интактных мышей, а количество ли тических единиц (IE) на 10' спленоцитов - 81$ от норны. На 34-36 дни роста опухоли, т.е. на 6-8 день после окончания консолидирующей терапии араЦ +■ дЦ эти показатели составили соответственно 54,6? и 37,2? от контроля и бшга еще низе у мышей, получивших также циклено фан за 3-5 дней до тестирования - 37,2 я 20,%. В более поздний сро; - 43 день роста опухоли оба показателя нарастали, причем у мышей, п лучивших циклсфосфан за 12 дней до тестирования, восстанавливались д уровня близкого к нормальному, что полностью согласуется с результа тами, полученными в тесте winn'a и подтверждает зависимость рост лимфомы EL4 в эти сроки от активности механиков естественной резистентности.

Иные закономерности имеют место на более позднем этапе роста лимфомы EL4 . К 54 дню опыта (26 день после окончания хурсоь араЦ + дЦ) цитотоксическая активность ЕК-клеток в селезенке мышей с опухолью резко сшшаетпя, в то же время в тесте Тола'а спленоциты таких мышей сохраняют высокую активность. Однако в этот период спленоциты животных, леченных только араЦ + дЦ, более эффективны в отношении противоопухолевого действия, чем от мышей получивши*, такж цшелофосфан. Более того, обработка клеток селезенки, подученных га 54 день, in vitro АТС и комплементом практически полностью отмен)

ла юс эффект, в то время как такая ге обработка клеток селезенки, полученных в период 36-43 дни роста лиьфош, усиливала их тормозящее рост действие. Иными словами, к 54 дни противоопухолевый эффект спленоцитов мышей с лимфомой ЕЬ4 становится зависимым преимущественно от Т-лимфоцитов, по-видимому, ЦТЛ.

Таким образом, кинетику '.иммунологического клеточного контроля роста лимфомы ЕЬ4 можно представить как двухфазную. В первой фазе этот контроль обеспечивается системой естественней резистентности и ее эффекторными клетками - лимфоцитами-естественными киллерами, а Т-лим$оциты участвуют лишь в роли супрессоров этой системы, которые эффективно угнетаются циклофосфаном и элиминируются обработкой АТС в присутствии комплемента. Однако этот контроль дос.аточно слаб, т.к. известно,.что клетки ЕЬ4 в значительной мере резистентны к цитолитическому действию ЕК-клеток, и действительно, 100$ мышей с этой опухолью без лечения погибает. Химиотерапия араЦ + дЦ пог^оля-ет достичь полной ремиссии, но она у большинства животных непродолжительна и лишь 15-17$ их излечивается.' Ремиссию удается продлить однократным введенчем 100 мг/кг циклофоофана (нетерапевтическая доза) и клетки селезенки мышей, получивших щшюфосфан, высокоэффективны в адоптивном переносе противорецидивного действия нелеченнш животным, особенЕо.если они взяты в сроки, когда угнетающее действие циклофосфана на эффекторные клетки уже не проявляется и сохраняется лшь в отношении Т-супрессоров.

После применения циклофосфана значительно возрастает частота случаев полного излечения: к 60 дню более 40£ леченных таким образом мышей все еще находится в ремиссии. Но дальнейшее поддержание ее зависит узе, по-видамому, от цитолитическях Т-лимфоцитов.

Суммируя результаты этой группы опытов, можно' сказать, что как и в случае со сл-боиммуногенной опухолью АКАТОЛ, антисупрессорное действие цяклофосфамвда примененного не в лечебном режиме, распространяется и па другие модели, в частности, на лимфому ЕЬ4 .

3.3. Продукция интерферона в процессе иммунологического распознавания

Кроме клеточной, по-видимому, супрессорной, регуляции системы естественной резистентности имеется другая, гуморальная, зависящая в значительной мере от цитокинов. Описано усиливающее цитотоксический

потенциал ЕК-клеток действие интерлейкинов, особенно интерлейкана-2, фактора некроза опухолей и др. Главным же гуморальным фактором, определяющим активность этой састеш являются кнтерфероны всех известных типов - л , Э и <{ . При этом, если интерферояы альфа и бета-вирусиндуцированные и продуцируются практически всеми клетками организма, интерферон гамма типа вырабатывается при стимуляции клеток имцунокошетентных органов - Т-лвмфоцитов и ЕК-клеток - антигенами, т.е. собственно в процессе иммунологического распознавания, а затем он сам наряду с другими типами интерфероков функционирует в ка честве стимулятора или регулятора активности ЕК-клеток. В настоящей работе было предпринято изучение продукции интерферона в сметанной культура лимфоцитов как модели первичного иммунологического распозна вания, начиная с первых часов культивирования. И действительно, уже с первых часов интерферон выявлялся в надосадках смешанной культура адлогенных лимфоцитов мыаей линии В6(Н-к.') и 1)2 (Н-2а) и кривая его активности (рис. 5) демонстрирует пульсирующий характер его продукции. Она выявляется в виде острых пиков, возникающих каждые 3-4 часа и падений до очень низкого уровня. Так как отбор проб кагдый час прс изводился из разных лунок, т.е. без смены среды в культуре после каз дой предыдущей пробы, такие падения титров интерферона, как и в случае с ФИМ и фактором, усиливающим миграцию макрофагов, можно объяснить чередованием в различные сроки продукции интерферона и какого-5 его ингибитора, идентифицировать который нам не удалось.

Выявленный фактор действительно является интерфероном, что было определено в специальных опытах. Он обладает противовирусной активностью, видоспецифичен - защищает от цитопатического действия вирусг везикулярного стоматита гомологичные 1,шитые клетки 19 2Э к не защищает гетерологичные клетки человека и. • его действие сохраняется после прекращения контакта с обработанными клетка"и и даже после их тщательного отмывания, инактивируется трипсином, он устойчив к 30-минутноаду прогреванию при 56°С. По чувствительности к низкой рН может быть отнесен к интерферону гамма типа, что подтверждается очень слабым снижением акгивности при обработке антителами к интер феронам других типов - альфа и бега, в то время как контрольный пре парат вирусиндуцированного фибробластного интерферона полностью инактивируется антителами к £ -интерферону.

Клетки, продуцирующие интерферон в СКЛ, относительно радиорезис тентны - их активность снижается при облучении в дозах 35-70, но не

-Ire. 5. Кинетика продукции интерферона в первые сутки в смепанной культуре лимфоцитов.

По оси абсцисс - часы культивирования от момента смешизапзя в культуре аллогенных клеток; то оси ординат - титры интерферона'' (ME/мл).

!5 Гр, в отличие от клеток, продуцирузщнх ФШ в этих же условиях: ю даняш А.П.Суслова! их активность существенно повреждается гамка-эблучением в доз" 15 Гр и даже ниже.

Продукция интерферона в смешанных культурах лимфоцитов и синген-зых опухолевых клеток также определялась уже в первые сутки совмест-юго культивирования, хотя и в слабой степени, с существенным нарастанием в последущле 2,3 и 4 сутки в различных лиц§оцит-оцухоль зингеннкх комбинациях (рис. 6): лимфоциты мышей ДВА/2 с клетками зингенной игетоцитомы Р815^ лик^оцятн мышей Б6 и BIO с клетками соответственно лимфемы ЕМ и саркош HX-II. Инактивированные облучением в дозе 60 Гр лимфоциты мышей ДВА/2 не продуцировали интерферон в ЗКЛО с клетками сянгенной опухоли P8I5.

Ркс. 6. Продукция интерферона в СКЛО*

По оси абсцисс - дни культивирования; по оси ординат .титры интерферона (МЕ/мл)

Выявление ранней продукции интерферона в наших опытах, как и фактора ингибиции миграции макрофагов и дрзтих имыуномедиаторов -интерлеЙкшш-2 ( Bruserud et al. , 1936), фактора, ивдацируодего экспрессии рецептора для интерлейкина-2, фактора дкщ&еренцирозки Т-киллеров ( C.Hardt et al. , 1986) и т.д. при inwitro взаимодействии с трансплантационными антигенами и антигенотюдобнымк структурами сйнгенных опухолевых клеток свидетельствует о способности неивдунизированных клеток-продуцентов лшфокинов Т-клеточной, и не Т-клеточной природы исключительно быстро, в течение нескольких часов, активироваться и начать выработку важных для последующего иммунного ответа рехуляторных факторов.

Отдельного обсуждения заслуживает факт "пульсации" ранней продукции интерферона на протяжение, главным образом, первых суток ОКЕ. По-видимому, выделение интерферона включает по принципу негативной обратной связи увеличение активности соответствующего ингибитора.

Можно предположить, что периодические колебания активности интерферона, выявленные в первичной СКЛ, являются развернутый во времени отражением гомеостатических обратных.связей, существующих между его продуцентами и клетками, продуцирующими соответствующий для этого лимфокина ингибитор или фактор с альтернативной активностью. Эти связи усиливаются по интенсивности и меняются во времени в условиях антигенного раздражения. Наличие таких связей подтверждается давно известнши фактами о существовании у клеток, продпирущих интерферон в ответ на вирусную инфекцию, фазы рефрактерности к действию того же ила другого индуктора, в продолжение которой клетка, начавшая вырабатывать интерферон,не монет быть повторно индуцирована.

В связи с этим возникает предположение о том, ч-. э наряду с колебаниями продукции интерферона и его ингибитора могут иметь место и колебания активности клеток, функции которых контролируются интерфероном и, в первуг очередь, Ж-клеток. Оно полностью подтверждается результатами изучения активности EfC-клеток мышей при почасовом тестировании в течение почти полных суток.

3 дальнейшем возникает вопрос о продукции интерферона при вторичном ответе на i легочные антигены, особенно "слабые", какими являются антигены сингенннх опухолей. Этот вопрос бнл изучен во вторичной смешанной культуре лгафжитов, где отвечающие клетки получали от мышей, предварительно иммунизированных la vivo обдученнши 20 Гр клетками мышей линий, отличающихся от доноров отвечапяих клеток по "сильным" или "слабым" антигенам гистосовместимосги.

Оказалось (рис. 7), что после иммунизации мышей линии BI0 клетками D2 f отличающимися от иммунизированных мышей iio всему гаплотипу, включая главный комплекс гистосовместимости, за исключением локуса Mis , клетки, способные продуцировать интерферон во вторичной CICI с лшфоцитачи иы^низируицей линии, выявляются лишь на 6 день после иммунизации. Их лнтерферонпродацирущая активность существенно нарастает к 14 дню, однако в первые сутки после иммунизации продукции интерферона нет, так же, как в сингенной СМ. На 6 и 14 дни различна в титрах интерферона в супернатантах, полученных из аллогенной и сингенной смеси, статистически значимы.

При исследовании значения основных районов главного комплекса гистосовместимости для формирования клеток, способных при вторичном контакте с антигеном продуцировать интерферон, оказалось, что существенное значение имеют различия по К и I районам (пары линий

<Q-.P5 BIO енти Д2 различия no всему Н-2

60 40 20

различия по К р-ну Н-2

Д.ЛХ анти А.ТЬбО 40 20 60

A. AL анти А.ТН различия по 40 I р-ну Н-2 20

О иконные

BIO анти Р 107 различия пси- • Д р-ну Н-2 V

ГЬ* ГЪ

<0.05.о ос 'BAIB/c ачти Д2г " разлитая повне

Н-2

0.001<0>001 ВЛ1В/с анти ДВЛ/2 • разлгчхм по всеиу галлотпцу, кроме

iL IL

■ESI.

Н-2

CS нешыунннав

Рис. 7. Продукция интерферона во вторичной скд в различные сроки после иммунизации.

По оси абсцисс - сроки от иммунизации in vivo до начала СКД. По оси ординат - татры интерферона в супернатантнх. СКЯ.

а.ах зг=*= a.tl и a.al íía.th соответственно)," но не по д району (пара НЮ7 в. 10 ). щ® этом, как к при различиях по всему

комплексу Н-2, в первые сутки после иммунизации клетки-продуценты не выявляются; они появляются еще позднее, после 6 дня после Еквдтсзаци:; титры интерферона в супервагантах культур, поставленннх на 14 день после иммунизации, достаточно высоки. При различиях по д району ни в один из тестируемых сроков продукции интерферона во вторичной CKI по сравнению с сингенной смесью практически не было.

Во вторичных смешанных культурах лимфоцитов мышей, различающихся по "слабым" антигенам гистосовместимости локуса ms (ваьв/с = ива/2) продукция интерферона была отмечена в значительных титрах уже на I, а также на 6 сутки после иммунизации и к 14 дню практически прекращалась. Такая же динамика выявлялась при различиях взаимодействующих клеток вне главного комплекса гистосовместимости в паре линий ваьв/о -анги-с?;

Правда, в другой паре с такими различиями - В.10-анти-В6 в первые сутки после иммунизации клетки-продуценты интерферона не определялись: их активность обнаруживали лишь па 6 и 14 дни.

Сходные ищуногенетические взаимодействия ранее были описаны А.П. Су словил (1987) при определении продукции фактора ингибицш миграции макрофагов во вторичной СКЛ. Клетки, продуцирушдае во вторичной CKI ЗИМ в первые сутки после in vivo иммунизации, названы им "ранними" продуцентами ОШ. Так же, как и продуценты интерферона, они обнаруживались только при использовании спленоцитов от мышей линий, различающихся по минорным антигенам гистосовместимости. Истинно иглмунные, "поздние" клетки-продуценты хорошо индуцирозались при различиях донора и реципиента по' всему комплекс. Н-2 и его К- и I-районам, Kj не по слабым Я-антнгенам. Так же, как и продуценты интерферона ни "ранние", ни "поздние" ФИМ-продуценты не могли быть индуцированы антигенными различиями, обусловленными D -районом.

Причины и физиологический смысл различий кинетики формирования клеток-продуцентов иммунсмедиаторов в зависимости от типа антигенных различий взапмодейстдуясих клеток неясны. Известно, что при иммунизации кхей большим количеством облученных аллогенных клеток наиболее рано появляются специфические и особенно неспецкйические Т-лимфоци-ты-супрессоры (Б.Д.Брондз, 1987); они обнаруживаются уже в первые сутки после иммунизации и достигают максимальной активности к 4 дню. При различиях донора и реципиента по слабым трансплантационным антигенам формирование супрессоров замедлено, но к 16 дню их активность проявляется с максимальной эффективностью. Возможно, эти различия могут лежать в основе относительно позднего появления продуцентов интерферона (и ФИМ) в селезенках мышей, иммунизированных облученными клетками при различиях донора и реципиента по "сильным" антигенам гистосовместшлос.д I и П класса. Более позднее появление клеток-суп-рессоров при иммунизации "слабили" антигенами не препятствует на раннем этапе развития иммунного ответа появлению клеток, продуцирующих иммуномедиаторы и, напротиз, угнетает их активность в более поздний срок (14 день после идадунизации). Не исключено, что "ранние" и "поздние" продуценты интерферона вообще различные клеточные популяции. По данным А.П.Суслова "ранние" продуценты 'ЖМ-клетки с фенотипом Lyt 1+2+ , в то время как"поздние" - Lyt 1+2~ . Соответственно, кроме различий в кинетике образования Т-супрессороз при иммунизации "сильными" или "слабыми" трансплантационными антигенами

MoiyT шеть таете значение различия между самими клетками-продуцентами и их чувствительностью к супрессии.

В элиминации клеток с сильны.®' антигенными отличиями от фенотипа клеток реципиента, в том числе, и высокоиммуногенных опухолей, главную роль играют Т-лимфоциты-киллеры, активность которых в умеренной степени может усиливаться интерфероном, а индукция на ранних этапах их формирования практически не подвержена его влиянию. В то же время дая ЕК-клеток, главного эффекторного механизма для элиминации неантигенных и слабоантигенных клеток, в частности, слабоищуноген-ных опухолей, интерферон является основным регулятором. Кроме того, ЕК-клетки могут сдерживать развитие даже имгдуногенных опухолей до сформирования специфического иммунного ответа. В связи с этим возможно, что физиологический смысл продукции интерферона при вторичном иммунном ответе и, главным образом, смысл различий в кинетике появления продуцирующих его клеток при имыунизациа клетками с сильными или слабыми антигенными различиями может заключаться в необходимости мобилизации различного.рода эффекторных клеток для реакции на иммунизирующие клетки.

. 3.4. Модуляции интерфероном активности ЕК-клеток в экспериментах in vitro и у онкологических больных

3.4.1. Изучение роли степени и способа очистки альфа интерферона для активации ЕК-клеток in vitro

функция интерферона (интерферонов) как регулятора активности ЕК-клеток, а также других зффекторных клеток системы естественной противоопухолевой резистентности легла в основу применения его в клинической практике, в частности, в онкологии. При лечении злокачественных опухолей и лейкозов учитываются различные активности интерферонов: имцуномодулирующая, антивирусная, антипролиферативная. И если две последние могут иметь значение преимущественно в терапии лейкозов, причем использование интерферонов в качестве цитостатиков пробле матично как по степени эффективности в сравнении с другими цитостати-ками, так и по причинам чисто экономическим, то применение их для иммунотерапии имеет определенное значение при лечении ряда солидных опухолей и в онкологической гематологии. В обзоре литературы суммированы основные данные по лечению интерфероном опухолей почки, мочевого пузыря, остеосарком и др.

Все типы интерферонов - альфа, бега, гамма - проявляют значительную активность в стимуляции противоопухолевого действия эффек-торных клеток системы естественной противоопухолевой резистентности. В СССР до настоящего времени большая часть клинических исследований выполнена с использованием препаратов ал^а-интерферона, т.к. интерферона р - и J" - имеются пока лишь в ограниченном количестве, и их предклиническое изучение еще не закончено. Используемые препараты альфа-интерферона различаются по технике приготоЕ. эния - натпвные и рекомбинантные; нативные препараты в спою очередь выпускаются высоко-очищенными и промежуточной степени очистки. В последних наряду с самим интерфероном могут в виде примесей находиться другие цитокины или иного типа биологически активные компоненты. Задачами исследования были: попытка выяснения вопроса о том,сама ли молекула тнтерферо-на ответственна за иымуномодулирущий эффект в препаратах, особенно в препаратах промежуточной степени очистки, а также сравнение г1фек-тивности различных препаратов интерферона в стимуляции цитотоксичес-кой активности ЕК-клеток. Предварительные опыты показали, что неочищенный (исходный) препарат нативного альфа-интерферона значительно превышает по этой способности препарат высокоочищенного инъекционного интерферона: эквивалентная степень активации ЕК-клеток человека при обработке in vitro может быть получена при применении в 12,5 раз меньшей дозы неочищенного препарата, чем инъекционного. То есть в процессе очистки и концентрации человеческого лейкоцитарного интерферона нарастание его антивирусной активности существенно опережает увеличение ЕК-стимулируадей способности. Это может быть связано либо с утерей части факторов, ответственных за активацию ЕК-клеток, либо с частичной инактивацией активных центров самой молекулы интерферона, определяющей этот тип эффекта. Ранее уже были получены сходные данные в отношении антипролиферативного действия интерферона (И.З.Тимофеев и соавт., 1981).

3 наших опытах обработка препаратов додецилсульфатом натрия (ДСН) с последующим фракционированием методом гельфильтрации на колонке с сефадексом Q25 показала, что как антивирусная, так и ЕК-стимулирующая активность определяются в одной и той же фракции, соответствующей белку, и не разделяются даже после предварительного кипячения с ДСН. При этих ужесточенных условиях обработки возможна лишь частичная диссоциация молекулы интерферона с отделением низко-

молекулярного фрагмента, проявляющего некоторую ЕК-стимулирувдую активность и не имеющего антивирусной.

При исследовании панели гетерологичных препаратов альфа интерферона способность к стимуляции цитотоксической активности ЕК-клеток человека совпадала со способностью к защите клеток человека против цитопатогенного действия вируса везикулярного стоматита в препаратах свиного и бычьего лейкоцитарных вирусиндуцированных интерферонов. Напротив, мышиный интерферон, не обладающий антивирусной активностью в отношении клеток человека, не влиял и на цитотоксические свойства человеческих ЕК-клеток.

Все это свидетельствует о том, что ЕК-стимулирующая активность интерферона тесно связана с антивирусной и принадлежит самому интерферону. В неполностью очищенных препаратах, однако, стимулировать цитотоксичность ЕК-клэток могут дополнительно и другие белки. По крайней мере, в исходном, неочищенном препарате, а также в препарате промежуточной степени очистки интерлок найдена некоторая ИЛ-2-подоб-ная активность. С другой стороны, она обнаружена также в препарате jf -интерферона, однако jf-интерферон по способности активировать цитотоксичность ЕК-клеток уступает Л -интерферону как рекомбинантнс му, так и в еще большей степени нативному.

3.4.2. Сравнительная ЕК-стабулирующие активность препаратов альфа-интерферона у онкологических больных

Три препарата альфа-интерферона - препарат промежуточной степей очистки с невысокой удельной активностью (8.000 LIE на мг белка) "лейкинферон", высокоочищенный препарат "человеческий лейкоцитарный^ интерферон для инъекций" (ЧЛИ) с высокой удельной активностью (1x10' ME на мг белка) и рекомбинантннй препарат "реаферон" - проходили I и П фазы клинических испытаний в отделении клиническо:" фармакологии ВОНЦ ШВ. СССР. В настоящей работе проведено сравнение влияния этих препаратов на активность ЕК-клеток больных и на соотношение количеств иммунорехуляторных Т-лимфоцктов - клеток, экспрессирупцих маркеры СД4 и СД8. Все три препарата увеличивали цитотоксическую активность ЕК-клеток периферической крови леченных больных в сходной степени - в 1,3-1,6 раза при оценке по цитотоксическому индексу г в 1,24^3,81 раза по числу литических единиц на I млн. лимфоцитов. При этом активность нативных препаратов превышала активность рекомбинан'

ного. Степень стимуляции ЕК-клеток лейкинфероном и ЧЛИ била примерно равной: в 1,4 и 1,56 раза соответственно по ЦТИ и в 2,95 и 3,81 раза по числу ЛЕ. Однако дозы препаратов по антивирусной активности резко различались: лейкинферон применялся в дозе 40 тыс. единиц в сутки в течение 10 дней, а ЧЛИ в дозе 3 млн. единиц в сутки также с 10-дневным курсом, т.е. способность частично очищенного препарата в 75 раз превышает такую способность высокоочищенного. Увеличение среднего цитотокснческого индекса ЕК-клеток реафе;оном было в 1,35 раза у больных раком почки и в 1,32 раза у больных с другими опухолями. Число же литических единиц на I млн лимфоцитов крови при применении реаферона повышалось в 1,58 раза при раке почки и в 1,24 раза при других опухолях, что существенно меньше, чем лри применении обоих нативных препаратов.

При лечении каждым из препаратов в целом по группам больных достоверно уменьшалась пропорция больных со сниженной по сравнение с определенной для здоровых людей цитотоксической активностью ЕК-кле-ток. Рассматривая структуру этих изменений в таблице I,можно видеть, что среди леченных больных у 61,4-82,3$ активность ЕК-клеток повысилась, причем преимущественно за счет больных с исходно снизен-пнм этим показателем. Различия в эффективности между отдельными препаратами альфа-интерферона не были существенны с несколько Оолее выраженным эффектом у ЧЛИ: все восстанавливали или во всяком случае повышали цатотоксичность ЕК-клеток у 72,7-100? больных, у которых исходно она была ниже нормы. Снижение активности ЕК-клеток чаще всего встречалось у тех больных, у которых до лечения она превышала средние показатели у здоровых лиц - ЮТ более 40? при соотношении эффекторных клеток и клеток-мишеней разным 10:1.

При определении влияния ЧЛИ и реаферона на количественные показатели Т-лимфоци'±ов и их иммунорегуляторных субпопуляций не выявлено существенных изменений, хотя в среднем соотношение СД4 и СД8-по-зитивных клеток повышалось после лечения за счет некоторого увеличения пропорции СД4- и уменьшения пропорции СДв-позитивных клеток. Эти изменения не были статистически значимыми. Тем не менее и по этому показателю после применения обоих препаратов индекс СД4/СД8 повышался , главным образом, у тех больных, у которых до лечения он был снижен} напротив у больных с резко повышенным соотношением СД4/СД8 клеток оно снижалось в 83,3-100? случаев в различных группах (таблица 2).

Таблица I

Зависимость изменения активности ЕК-клеток у больных, получавших препараты d -интерферона,' от" исходного" уровня-•

»■ Препарат интерферона Исходный Уровень по ЦТИ больных Снизилась (Ж больных) Не изменилась {% больных)'-"' Повысилась (% больных

Лейкинферон 40х10^МЕ/день ниже нормы нормальный вше нормы ■ 44,1 4i,7 .-13,9.-. 1 6,25 3l3,30 ¿80,00 ' 6,25 ";33,30 ь-i -J о U Ol

■ :..... .100,0.. 119,4.. 116,7, ;63,9

4M 3-6x10%Е/день ниже нормы формальный йшзе нормы 41,2 3fe,3 ;.2р,5 "16,7 iöO.O ■j . 4 . » e 100,0 - 83,3 ;50,0

< • • /10р,0 ¡17,6 ; - . :82,3

Реаферон 8ихе нормы нормальный $ыше нормы 4 Г-40,3 з iill.I ^30,4 "■85,7 . 3,7 .'21,8 ; 85,2 -¡47,8 Jl4,3.

л И 1 • -ioo,o <28,1 iI0,5- 4 ; ,61,4

Иными словами, альфа-интерферон является по типу своего действЕ истинным иммуномодулятором, повытащим сниженну: и снижалцим чрезме но повышенную активность ЕК-клеток, и влиящим такш же образом на количество иммунорегуляторных Т-лиыфоцитов. Что каса-тся механизма иммуномо дулирупцего эффекта, то в отношении ЕК-клеток можно сказан что альфа интерферон скорее повышает цитолитические потенции клеток чем увеличивает их количество, что следует из отсутствия увеличена* пропорции Leu7 - позитивных клеток при существенном нарастании кс личества ЛЕ на I млн. лимфоцитов. Повышая соотношение иммунорегуля-торных СД4/СД8 Т-лимфоцитов, "льфа-интерферон, по-видимому, пр зо-дит к восстановлению поврежденной у больных раком почки функции СД4 клеток-Т-лим|оцитов хелперов/индукторов, а именно их способности к

Таблица 2

Влияние внсокоочшценного нативяого (ЧЛИ) и рекомбинантного препаратов ^-интерферона (реафероя) на соотношение гоядукорегу-лчторных субпощгляинй Т—лимфоцитов 0КТ4+/0КТ8+ (СД4/0Д8) у йнкологзпесках-больных'

Препарат интерферона - • Исходный •уровень' ■ ' больннх Снизилось ' Баз изменений- Повысилась''

ри ниже нормы нормальный ■ вше-- норйк' 82,3 21,4 ' ¿00"; 0' ' 14,3 :64,3

■ •> ■» ,35,3. ^11,8, я .52,9

Реаферон ниже нормы нормальный - вше нормы, 57,2 '21,4 --21,4-- ■■ 9,4 -41,7 :28,1 ;25,0 62,5 33,3 -.V 8,3,-

-ГСО^О,., .33,9 , =>21.4 < .. -.44,6.,

продукции интерлейкина-2, что показано на рис. 8.

В целом следует отметить, что лейкинферон-альфа-интерферон промежуточной степени очистки, обладает шлауномодулирумцимз сзойстзами в наибольшей степени; активность внсокоочшценного нативкого препарата ЧЛИ и рекомбинантного препарата реаферона в целом сходни. Последнее обстоятельство очень ваняо, так как ззвестно, 1то пршенеше рекомбинантного интерферона чаще, чем на тивного, приводит к формированию антиинтерфероновых антител, в том числе и нейтралкзувдих. В случае снижения лече"него и иммуномодулирушцего эффекта рекомбинантных препаратов в результате нейтрализации интерферона антителами полезной может быть замена их нативными препарата:.®.

3.5. Иммуномодулируадее действие нового синтетического препарата леакадин

В клинической иммунотерапии опухолей наряду с модификаторами иммунного ответа природного происхождения, в число которых входят и интерфероны, находят применение искусственно созданные синтетические

Г.4

ч 1,2

1 1.0

0.8

Ci 1 0.6

а ^ 0.4

g 0.2

rfl

Рас, 8. Продукция Ш-2 лимфоцитами больных раком почки, леченных

реафероном, при стимуляции in vitro ФГА.

1. ИЛ-2 з супернатантах стимулированных ФГА лимфоцитов здоровых доЕоров;

2. То же от больных до лечения;

3. То же от больных по окончании лечения реафероном.

имцуномодуляторы, обладающие сами по себе или не обладающие прямой противоопухолевой активностью. Среди них классические противоопухолевые препараты различных груш - противоопухолевые антибиотики блеэ-мицин, адриамицин, доксодубвдин и др., алкилируюдае агенты, антиметаболиты, растительные алкалоида, а также иммуномодулягоры Зез выраженных противоопухолевых (цитостатических) свойств, например, левамизол. С середины 70-х годов одновременно в СССР, ГДР и ФЕТ били начаты исследования по созданию нового типа противоопухолевых средств на основе азиридина, в результате чего появились новые имцуномодуляторы азиыексон, вмексон, циамексон и советский препарат леакадин. Последний отличался от остальных значительно меньшей токсичностью или

практически полным ее отсутствием и в то не время обладал выраженной противоопухолевой активностью в отношении ряда экспериментальных опухолей - карциносаркомы Уокера 256, саркомы 45, карциномы Герена, гепатом AH-I3 и AH-I30. Однако его цитотокснчеекие свойства проявлялись гораздо слабее, чем у циклофосфана или гаоТЭ5а - типичных алки-лирухщнх лекарств. К началу настоящего исследования появились первые данные, указывающие на то, что леакадин мояет оказаться хорошим имму-номод7лятором, как это ухе было выяснено по крайней мере в отношении азимексона.

В наших опытах с использованием экспериментальных опухолей мышей, таких как гепатома Н-2-73, лимфома EL4 , лимфосаркома ЛГ леакадин не проявил себя в качестве противоопухолевого лекарства. Противоопухолевые сво.' зтва в некоторой степени проявились лишь в отношении гепатош Н-2-73. Однако он достоверно увеличивал продолжительность жизни у мышей с индуцированной химиотерапией (араЦ + дЦ) ремисспей Т-клеточной лзмфомы EL4 при многократном его введении в дозах I и 10 мг/кг и не влиял на продолжительность яизни животных, у которых ремиссия з результате предшествующего лечения не была получена. Сходный эффект был достигнут при применении леакадина в дозах от I до 1000 мг/кг однократно во время индуцированной химиотерапией 5-фторурацилом ремиссии имцунобластной лимфосаркомы ЛГ, спонтанно возникшей, а затем используемой в качестве трансплантируемой опухоли у мышей с 5731/6 j. . Эффект леакадина в обоих случаях вряд ли связан с прямым противоопухолевым действием, т.к. в предварительных опытах было показано, что сам по себе леакадин не интцирует ремиссии ни лнмфомы BI4, ни лимфосаркомы ЛГ, и его противорецидиЕНое действие проявляется при применении у животных с ремиссией, полученной с помощью других лс :арств. Оказалось, что в дозе I и 10 мг/кг леакадин усиливает генерацию цитолитпчэских Т-лиифоцитов при введении его за 3 дня до иммунизация или в дозе I мг/кг положительно влиял как па генерацию ЦТЛ (введение в 1-3 дни после иммунизации), так и на щтто-токсичность уже сформировавшихся ЦТЛ при более позднем введении. Меньпая доза - 0,1 мг/кг была неэффективна, а большая - 100 мг/кг угнетала генерацию и действие ЦТЛ. Леакадин таюге усиливал цйтотоксяч-ность ЕК-клеток селезенки мышей против клеток yac-i , если был введен за 3 дня до тестирования. Этот его эффект мало зависел от дозы в использованном диапазоне доз - от 0,1 до 100 мг/кг, хотя эффект наз-

меньшей дозк выглядел наиболее значительным.

Иммуномодулпрупзие свойства лейкадика нашли свое отражение также в локальной реакции "трансплантат против хозяина". Интересно, что как истинный иммуномодулятор леакадин усиливал ее в опытах, где она была выражена в слабой степени и ослаблял в опытах с излишне интенсивной реакцией. Результаты, полученные по модификации леакадкном РТПХ, представляют особенный интерес в связи с просматривающимися перспективами применения леакадпна при аллогеяных трансплантациях костного мозга. 3 литературе по трансплантологии в настоящее Еремя широко обсуждается проблема регуляции интенсивности реакци* "трансплантат против хозяина" при аллотрансплантацлп костного мозга при лечении лейкозов ( R.Gale , 1990). В ряде обзоров авторы считают, что "еобходимо купирование острой РТПХ, но к полной отмене хронически:: РТПХ не следует стремиться, т.к. другая сторона реакция "трансплантат против хозяйка" - реакция "траксп.*"штат против лейкемии".

3 отделении клинической фармакологии 30Щ А.'.Ш СССР проводили 1-П фазы клинических испытаний леакадпна. В настоящей работе были изучены еммуномодулирупщае его свойства у 47 больных. Больные получали леакадин 10-дневными курсами по 6С0 мг/м^ в сутки внутривенно ежедневно. 3 периферической крови этих больных определяли цитоток-сическую активность ЕК-клеток, общее количество Т-лимфоцитов и соотношение GD1/G58 - позитивных клеток до начала и после окончания каждого цикла и всего курса лечения. По определению средних показателей по всей группе леакадин не влиял ни на интенсивность цитоток-спчесхого действия, определяемого по ЦТН при соотношении эффекторкых клеток в клеток-мишеней равным 10:1, ни на число литпческих единив в I млн лимфоцитов. 3 целом по группе повышение, снижение шш отсутствие изменений ЦТИ г гмечалось со сходной частотой - 29,8-36,2?. Однако повышение ЦП!, как и при лечении интерферонами, ьроисходало главным образом у тех больных, у которых он исходно был снижен - у 70? таких больных. Снижение цитотоксичности ЕК-клеток происходило у 53? больных с повышенным, а также у 36,4? с нормальным ее уровнем (таблица 3).

Леакадин не влиял на общее количество Т-лиыфоцитов, однако у подавляющего числа больших оно не иыло снижено, а у 3 из 5 больны^ со сниженной их пропорцией она нормализовалась после лечения. В среднем у леченных больных отмечалось статистически значимое увеличение ин-

Таблица 3

Зависимость изменения активности ЕК-клеток больных, леченных леакадином; от исходного уровня

Исходный уровень по ЦТИ (Я % больных Снизилось {% больных) Не изменилось (> больных)' Повысилась (% больных)

Ниже нормы 21,3 0 30,0 70,0

Нормальный 46,8 36,4 27,2 36,4

Выше нормы 31,9 53,33 33,^3 13,33

Итог: 100,0 34,0 29,8 36,2

декса СД4/СД8 за счет как некоторого повышения пропорц:.л СД4-пози-тивных, так и снижения пропорции СД8-позитивных клеток. Изучение зависимости этих изменений в зависимости от исходного состояния этого показателя до лечения (таблица 4) показало, что, если в целом повышение соотношения пропорции СД4/СД8 клеток отмечено у 54,3$ леченных больных, оно происходило исключительно за счет больных с исходно сниженным (у 64/5 таких больных) пли даже нормальным уровнем (из них у 60$) и не ошечено ни у одного больного с превышающим норму. Напротив у всех этих больных индекс СД4/СД8 в той или иной мере снизился.

Таблица 4

Зависимость изменения соотношения пропорций СД4 и СД8-позитив-ных Т-лиироцитов у больных,леченных леака диком, от исходного уровня

Исходный уровень % больных Снижение Без изменений Повышение

Сниженный 71,4 12,0 24,0 64,0

Нормальный 14,3 20,0 20,0 60,0

Повышенный 14,3 100,0 0 0

Итого: 100,0 25,7 20,0 . 54,3

Сравнение двух иммуномодуляторов - природного, альфа-интерферона, и синтетического, леакадина, при клиническом применении показало,

что шлмуномодулирупдая зх активность различается по основной направленности. Если интерферон главным образом повышает противоопухолевую цитотоксическую активность ЕК-клеток - эЗфекторных клеток сксте.'лы естественной противоопухолевой резистентности, и мало влияет на количественное соотношение иммунорегуляторных субпопуляций Т-лшфоци-тов, хотя и стимулирует функциональную активность Т-хелперов/индукто-ров (позыаая их способность к продукции интерлейкпна-2), то леакадин, напротив, слабо изменяя активность эффекторных ЕК-клеток, модулирует количественное соотношение иммунорегуляторных Т-лимфоцитов, приближая его к нормальному уровню как у тех больных, у которых он снижен (повышал), так и у тех, у которых он резко повышен (снижал). Комбинированное применение обоих тодуномодуляторов-рекомбинантного алвфа-ин-терферона - реаферона и леакадина позволило нормализовать и активности ЕК-клеток, и соотношение СД4/СД8.

Таким образом, приведенные результаты экспериментальных и клинических исследований действия нового отечественного синтетического кизкомолекулярного препарата леакадина позволили установить его выраженные иммуномодулирунцие свойства, а также определенную противоопухолевую и противорецидизкую активность в отношении экспериментальных опухолей. Полученные результаты вопли в материалы, представленные в Фармакологический Комитет министерства здравоохранения СССР, на основании которых было получено разрешение на лечебное применение леакадина в медицинской практике в качестве противоопухолевого ишу-номодулятора (Протокол И 13 заседания Фармакологического Комитета Управленм по внедрению новых лекарственных средств и медицинской техники Министерства здравоохранения СССР от 28 июля 1986 г.).

ВЫВОДЫ:

I. При росте слабоиммуногенной опухоли, контролир!„мой системой естественной противоопухолевой резистентности, роль Т-лкыфоцитов заключается в обратной регуляции этой системы: элиминация Т-лшфоци-тоз тимэктомией пли введением антитимоцитарной сыворотки, а также ех инактивация гамма-облучением или циклофосфамидом приводит к замедлению роста опухоли. Адоптивный перекос обработанным таким образом животным интактных сингенных спленоцитоз, содержащих Т-лимфоциты, восстанавливает опухолевый рост, а сплекоцитов, лишенных Т-лимфоцитов,

не восстанавливает. Угнетение Т-супрессоров гамма-облучением повышает цитотоксичность ЕК-клеток мышей с опухолью.

2. Ведущим компонентом в действии вакцины ЕЦК при росте слабоим-муногенной опухоли является не столько индукция противоопухолевых элементов системы естественной резистентности, сколько активация не-спецяфических Т-супрессоров для этой системы: применение вакцины ЕЦЕ вместе с антитимоцитарной сывороткой эффективнее, чем каждого воздействия отдельно в подавлении роста опухоли. Адоптивный перенос спленоцитов ог мьгшей, леченных БЦ2, эффективно угнетает рост опухоли у реципиентов только, если из переносимых клеток удалены Т-лимфоциты.

3. Иммунологический контроль высокоиммуногенной опухоли - лим$о-мы В1>4 во время ремиссии, индуцированной предаюотвущей хи?,«иотерапией, является двухфазным: в начале ремиссии, на фоне гммунодепрес-сии, вызванной химиотерапией, он осуществляется системой естественной противоопухолевой резистентности, а к концу второго ме :яца от начала ремиссии, после восстановления иммунокомпетентности, формируется зависящей ог Т-лимфоцитоэ противоопухолевый иммунитет.

В первой фазе Т-лимроциты, выполняя роль супрессоров, осуществляют обратную регуляцию системы естественной противоопухолевой резистентности: их инактивация циклофосфамидом или элиминация анти-Т-сывороткой приводит к увеличению продолжительности ремиссии липомы и жизни леченных животных, к повышению активности ЕК-клеток; во второй фазе Т-лимфоциты являются эффекторным звеном сформировавшегося иммунного ответа, я их элиминация отменяет в тесте |71ппа*а проти-ворецидавное действие спленоцитов мышей с индуцированной химиотерапией ремиссией лимфомы.

4. Одной наиболее ранних реакций при контакте ишунокошетент-ных клеток с клеточными антигенами, в том числе с антигенами опухолевых клеток, является продукция гамма-интерферона. Она начинается в первые чаек взаимодействия распознающих и распознаваемых клеток в . . смешанной культуре аллогекных лимфоцитов (СМ) и в смешанных культурах лимфоцитов и с ¡гигеиных опухолевых клеток и нарастает с пульсирующей кинетикой к концу первых суток культивирования. Это, по-видимому, обеспечивает мобилизацию клеточных механизмов "раннего" ответа - реакцию, а также регуляцию уровня активности системы естественной противоопухолевой резистентности и ее эффекторных клеток - ЕК-клеток.

5. Продувдия гамма-интерферона сенсибилизированными лимфоцитами - высокочувствительная реакция на присутствие клеток с даже слабыми антигенными отличиями: во вторичной С1СЛ сна обнаруживается при различиях реагирующих сенсибилизированных (отвечающих) и иммунизирующих клеток как по "сильным" антигенам гпстосовместимости I и П классов (кроме продуктов л района)-, $ак -и по "-слабым" антигенам-, -не являющихся продуктами ТКГ-.

6. Препараты интерферона как основного гуморального регулятора системы естественной противоопухолевой резистентности высокоэффективны :для коррекции дефектов активности ЕК-клеток у больных с солид--екгл опухолямг, в частности, больных с раком почки: применение их повшает активность ЕК-клеток у 88$ больных с исходно сниженным этку. показателе:.:, а среди больных с раком почки - в 93,72 случаев.

Способность препаратов альфа-интерферона усиливать цптотоксичес-кув актизнссть ЕК-клеток человека связана со структурными компонентами самой молекулы интерферона.

?. Применение препаратов интерферона нормализует сниженное соотношение СД4/СД8 клеток - основных норе гуля торных субпопудяций I—лимфоцитов более чем у половины леченных больных.

8. Обнаружена выраженная иммуномодулируЕЕая активность нового отечественного рекомбкнантного препарата альфа-пктерферона - реаферо-на. Стимуляцгл цптотоксической активности ЕК-клеток раьно эффективно происходит под влиянием как высокоочпценного, с высокой специфической активностью нативного препарата человеческого лейкоцитарного (альфа) интерферона (ЧЛИ), так и реаферона и они являются взаимозаменяемыми.

9. ГСлмунофарыакологическое изучение нового отечественного синте-тичесххго кпзкоколекулярного соединения - 2-карбамоил-азкркдиЕа (леа-кадина) показало, что он является высокоактивна* иммуйомодулятором: усиливает генерацию специфических Т-лкмфоцгтоз киллеров, в зависимости от исходного уровня модулирует интенсивность реакции "трансплантат против хозяина" и активность ЕК-клеток.

10. Леакадин осуществляет коррекцию соотношения иммунорегулятор-ных лимфоцитов (СД4/СД8 -клеток) у больных с солидными опухолями, но

мало влияет на активность их ЕК-клеток.

II. Для оптимального шядуномодулирувдего эффекта целесообразно комбинированное применение леакадпна с интерфероном (реафероном). При этом достигается одновременная коррекция активности ЕК-клеток и соотношения иммунорегуляторных Т-лимфоцитов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Славина Е.Г., Харкевич Д.Д., Суслов А.П., Лейпунская И.Л. Продукция интерферона и факторов, влияющих на миграцию макрофагов,в ранней фазе реакции в смешанной культуре лимфоцитов. Тез. 1У Мевду-нар. регион, сигш. соц.стран по интерферону. Львов, 1980, с. 37.

2. Харкевич Д.Д., Суслов А.П., Славина Е.Г., Лейпунская И.Л. Соотношение продукции интерферона и факторов, регулирующих миграцию макрофагов,в ранние сроки сметанкой культуры лимфоцитов. Иммунология, 1981, И 3, с. 85-87.

3. Суслов А.П., Харкевич Д.Д., Славина Е.Г., Лейпунская И.Л., Червонский A.B., Костров C.B. Сравнительное изучение кинетики продукции факторов, регулирующих миграцию макрофагов и пролиферацию лимфоцитов, а также интерферона,в смешанной культуре лшлфоцитов в системе Н-2. Тезисы докл.Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы иммунологии", Алма-Ата, 1981, с. 67-68.

4. Тимофеев И.В., Кузнецов В.П., Славина Е.Г., Мехедов Л.Н., Добрынин Я.В., Орлова Т.Г. К вопросу о разделении антивирусной и непротивовирусных активностей интерферона. Иммунология, 1982, JS 2,

с. 43-47.

5. Тимофеев И.В., Кузнецов В.П., Славина Е.Г., Тимофеева Т.П., Орлова Т.Г. Действие различных форм человеческого лейкоцитарного интерферона на естественную киллерную активность лимфоцитов человека. Антибиотики, 1982, Л 10, с. 782-784.

6. Тимофеев И.В., Кузнецов В.П., Славина Е.Г., Орлова Т.Г. Влияние гетерологичных препаратов интерферона ка спонтанную цитотоксич-НОСТЬ лимфоцитов человека. Interferon Scientific Memoranda, 1982, Uemo-I-A-1170/2, p. 8.

7. Славина Е.Г., Лейпунская И.Л., Бабадаанов A.C., Ленева Н.В. Усиление активности лимфоцитов - естественных киллеров (ЕК-клеток) в клинике и эксперименте. Цитология, 1982, т. ХНУ, № 9, с. III0.

8. Рябых Т.П., Суслов А.П., Славина Е.Г., Лейпунская И.Л. Зависимые от суток колебания активности системы естественной противоопухолевой резистентности при трансплантационном и химическом канцерогенезе. Цитология, 1982, т. ХХ1У, & 9, с. II07-II08.

9. Бабадаанов A.C., Славина Е.Г. Влияние предварительного введения циклофосфамида и претраксплантационного облучения га рост син-генной опухоли у мышей. Волл.экспер.биол. и мед., 1983, й I, с. 84-86.

10. Бабадаанов A.C., Славина Е.Г. Эффект совместного применения БЦЕ и антитимоцитарной сыворотки на рост сингенной опухоли у мышзй. Еюлл.экспер.биол. и мед., 1983, № 2, с. 6b-70.

11. Гарин A.M., Личиницер М.Р., Рубцов E.H., Тйлкндин С.А., Ленева Н.В., Скркин А.Б., Славина Е.Г. Первая фаза клинического изучения человеческого лейкоцитарного интерферона для инъекций. Терапевт, архив, 1983, J« 8, с. I33-I4I.

12. Харкевич Д.Д., Суслов А.П., Славина Е.Г., Лейпунская И.Л. Иммуногенетпческое исследование фактора усиления миграции макрофагов ($у;л) и интерферона (¡15) в системе Н-2. Тез.докл. Всесоюзного симпозиума "Медиаторы иммунного ответа в эксперименте и клинике". г.Горький, 1983, с. 168-169.

13. Славина Е.Г., Лейпунская И.Л., Ленева Н.В. Влияние различных препаратов интерферона на цитотоксичность лимфоцитов - естественных киллеров и моноцитов крови в эксперименте и клинике. Тез.докл. на Всесоюзном симпозиуме "Медгаторы пленного ответа в эксперименте и клинике", г.Горький, Москва, 1983, с. 145-146.

14. Тимофеев И.В., Славина Е.Г., Поквдышева Л.Н., Орлова Т.Г. Влияние гетерологичных препаратов интерферона на спонтанную цитотоксичность лимфоцитов человека. Иммунология, 1983, $ 5, с. 32-34.

15. Суслов А.П., Харкевич Д.Д., Бернова Н.П., Селедцов Е.И.,

Славина З.Г., Лейпунская И.Л., Червонский A.B., Бландова З.К., Брондз Б.Д. Система "ранних" и "поздних" Т-клеток-продуцентов л7.ш;о-киноз при трансплантационном иммунитете. Тез.докл. Всесогоного сикп. "Трансплантация костного мозга", Москва, 1984, с. 112—114.

16. Бухман В.М., Черткова А.И., Славина Е.Г., Лейпунская Ii.Л., Бархоткина М.О., Пименов A.A., Брондз Б.Д., Сыркин А.Б. Влияние гг.5-мунофармакологических агентов на продолжительное j ремиссии к некоторые иммунологические показатели при лимфоидных лейкозах у мыпей. Тез.докл. Всесоюзн.конф. "Роль иммунной системы в патогенезе лшлфо-пролиферативных заболеваний", Новосибирск, 1984, с. II2-II4.

17. Черткова А.И., Бухман В.М., Славина Е.Г., Лейпунская Ii.Л. Влияние циклофосфана и блзстолизина на факторы специфической и естественной противоопухолевой резистентности у мышей с индуцированной химиотерапией ремиссией лейкоза. Материалы Всесоюзной конференции "Иммунология и иммунотерапия лейкозов человека и животных", Ташкент, 1984, с. 82.

18. Агеенко А.И., Ерхов B.C., Славина Е.Г. Иммуностиглуляцкя роста опухоли. Глава П в книге "Новые подходы к вопросам ивд'ноло-гии рака", Томск, 1984, с. 30-46.

19. Славина Е.Г. Лимфоциты - естественные киллеры (ЕК-клетки) -эффекторные клетки естественной противоопухолевой резистентности. "Итоги науки и техники", ВИНИТИ, Онкология, т. 13, 1984, с. 98-141.

20. Славина З.Г., Ленева Н.В., Лейпунская И.Л. Иммуномодулпрую-■цее действие различных препаратов человеческого лейкоцитарного интерферона. Сб. "Интерферон-85". Материалы Всесоюзной конференции "Итоги и перспективы теоретических и практических (клинических) исследований по проблеме интерферона. Тбилиси, 1985, с. 97-98.

21. Черткова А.И., Бухман З..М., Славина Е.Г., Лейпу.:ская II.Л., Сыркин А.Б. Тезисы докладов 1У Всесоюзного съезда онкологов, Ленинград, 1986, с. 557.

22. Славина Е.Г. Иммунологический статус больных с лиггфомами при применении иммуномодуляторов. Сб. "Первично-локализованные опухоли приматов и пути их генерализации", Сухуми, 1986, с. II3-2I4.

23. Суслов А.П., Рябых Т.П., Касаткина H.H., Славина Е.Г., Лей-гзгнская И.Л., Киселева М.Г. Ультрадианные колебания естественной противоопухолевой резистентности мышей при трансплантационном и химическом канцерогенезе. Цитология," 1987, т. XXIX, № I, с. 20-23.

24. Сергеев A.B., Славина Е.Г. Дополнения к методическим материалам по экспериментальному фармакологическому и клиническому испытании иммуномодулирупцего действия фармакологических средств. Тез. докладов Всесоюзного симп. "Актуальные вопросы иммунотерапии опухолей", Рига, 1988, часть П, с. 91-92.

25. Славина Е.Г., Лейпунская И.Л., Ленева Н.В. Иммунологические эффект"-; леакадина и интерферона при злокачественных опухолях. Тез. докл.Всесоюзного симп. "Актуальные вопросы иммунотерапии опухолей", Рига, 1988, часть П, с. 89-90.

26. Славина Е.Г., Лейпунская И.Л., Ленева Н.В. Иммунологические эффекты интерферона у онкологических больных. Тез.докл. IX Международного симпозиума соц.стран по интерферону. Рига, 1988, с. 112.

27. Гарин A.M., Личиницер М.Р., Дмитриева Н.В., рубцов Б.И., Злавина Е.Г., Ленева Н.В., Еудько А.П., Левинская Е.Ю., Калвикьш ;'.Я. Биологические эффекты леакадина. Вопросы онкологии, 1988, т. ХХХГ-', Ü 2, с. 192-196.

26. Ленева К.В., Славпна Е.Г., Левинская Е.Ю., Сидорова Н.Ю. Влияние леакадина и спленэктомии на рост опухоли АКАТОЛ у мышей. Сб. "Экспериментальная и клиническая фармакотерапия", Рига, 1989, с. 37-38.

• 29. Гарин A.M., Личиницер М.Р., Дмитриева Н.В., 1Убцов Б.И., Ленева Н.В., Славина Е.Г., Лейпунская И.Л., Хлебков A.B. Применение леакадина при солидных злокачественных опухолях. Сб. "Экспериментальная и клиническая фармакотерапия", Рига, 1989, с. 50-52.

30. Славина Е.Г., Лейпунская И.Л., Ленева Н.В. Сравнительное изучение иммуномодулируюцнх свойств препаратов интерферона. Матер, ежегодного симпозиума Международного общества исследователей интерферона. J.Interferon Нее. 1999, 2, р. 224.

31. Славина Е.Г., Kaмлова-Полевая Е.Б., Грубова Е.А., Лейпунская И.Л., Ленева Н.В., Купин В.И. Иммуномодулирувдее действие леакадина

и элеутерококка в терапии солидных опухолей. Материалы ХУ Международного противоракового конгресса, J. of Canoer Rea. and Clin.Oncology, 1990, 116, part X, p. 193.

32. Орлова Т.Г., Соловьева M.H., Славина Е.Г. Роль гетерологичннх вспомогательных клеток в продукции [ -интерьере -а Т-лимфоцитами крови и лимфы человека. Вопр.вирусологии, 1990, 1 4, с. 335-337.

33. Кадагидзе З.Г., Купин В.И., Сергеев A.B., Славина Е.Г., Пименов A.A., Мусатов В.К., Полевая Е.Б., Иванов A.B., Грубова Е.А., Хван Д.Х. Методы определения биологических модификаторов противоопухолевого иммунитета ин витро и ин виво при клинических испытаниях (методические рекомендации). Москва, 1989.

МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ДОЛОЖЕНЫ НА:

1. U Международном симпозиуме соц.стран по интерферону, Львов, 1980.

2. Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы иммунологии", Алма-Ата, 1981.

3. Всесоюзном совещании "Молекулярные и клеточные основы канцерогенеза и ангиканцерогенеза, Ленинград, 1982.

4. Всесоюзном симпозиуме "Медиаторы иммунного ответа", Горький,

1983.

5. Всесоюзном симпозиуме "Трансплантация костного мозга", Москва,

1984.

6. Всесоюзной конференции "Роль иммунной системы в патогенезе лиифопролиферативных заболеваний", Новосибирск, 1984.

7. Всесоюзной конференции "Иммунология и иммунотерапия лейкозов человека и животных", Самарканд, 1984.

8. Всесоюзной конференции "Итоги и перспективы теоретических и практических (клинических) исследований по проблеме интерферона". Тбилиси, 1985.

Э. 17 Всесоюзном съезде онкологов. Ленинград, 1986.

10. Всесоюзном симпозиуме "Актуальные вопросы иммунотерапии опухолей", Юрмала, 1988.

11. IX Международном симпозиуме социалист.стран по интерферону. Срмала, 1988.

12. Ежегодной симпозиуме Международного общества исследователей интерферона, Италия, Флоренция, 1989.

13. 15 Международном противораковом конгрессе, ФРГ; Гамбург,1990.