Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:ИММУНОРЕГУЛЯЦИЯ ЭМБРИОНАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ



РОССИЙСКАЯ АКАЛПМИЯ С ГЛЬСКОХОЗЯПСТВГННЫХ НАУК 1И ( РОССИЙСКИЙ НАУЧИО-ИСС.'П лшитг_1ьски(1 ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА

РАЛЧЕНКОВ В м к тор Петрович

ИЧМУНОРЕГУЛЯПИЯ ЭМБРИОНАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ.

03.00.13. - физиологи« человека и животные 14,00.36. - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологически* к

п. ЗУБРОН1ШЫ. МОСКОВСКОЙ ОЕЛАСТ11 - >»93 1.

Работа выпачнена вп Всероссийском научно ■ исследовательском инст)гт\тс животноводства РАОХН.

Официальные оппоненты

до к тор биологических наук, профессор Ю.Д. Клинскни доктор медицинских наук, профессор М.А. Туманян доктор ветеринарных наук, профессор М,А. Лучко

Велушее предприятие: Вссросснский научно-нсслед<>«;1тел1>ски11 институт

племенного дела.

Автореферат разослан 190Л г.

и - ущ&^рЛ

Зашита диссертации состоится " 10 " 1993 г.

в 10 часов, на заседании специализированного совета во Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства

(ВИЖ).

Адрес: 142012. Московская обл.. Подольский район, п. Дубровииы. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Ученый секретарь совета, к.б.н.

И.И. Шмыпш

)

ОВШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. В нарушении репродуктивной фу н кии и у млекопитающих, ло-прежнему. ведущее место занимают пренатальные потери. Многочисленным» исследованиями установлено, что у разных видоя, имеющих существенную разницу в строении плаценты и срока* беременности, пел и чипа прснатальнпи выживаемости (60-70%) и критические периоды эмбрионального развития сходн ы (Соколовская И.И-, Миловано» ft,К., 1981; Roche J.F., 1986; Lambert Е.М. -el. al., 1990.) Несмотря на длительный период изучении причин, вызывающих снижение лренлтллыюи пыжнплемости и разработки способов се повышения, решение данной проблемы еще далеко до полного завершения.

В последнее время значительный интерес был проявлен к изучению возможной роли материнской иммунной системы в нормальном и нарушенном пренатальном развитии В первую очередь это было обусловлено обнаружение 1 факта распознавания (независимо от типа плаценты) материнской иммунной системой антигенов зародыша отцовского гйллотилл. В настоящее время существует большое число иммунотроп-ных препаратов, способных осуществлять коррекцию иммунитета посредством изменения активности определенных звеньев иммунного ответа, что открывает новые перспективы как в изучении роли иммунной системы самки в нормальном и нарушенном пренатальном развитии, так и в разработке иммунологических способов повышения эмбриональной выживаемости. Другим важным аспектом в изучении роли иммунной системы самки в нарушении пренатального развития является выяснение возможного взаимоотношения вторичных иммунодефиците в и штаммов синегнонной палочки, конта минирующих семя производителей, в возникновении этой формы патологии. Решение данной проблемы имеет важное значение как зля разработки научно-обоснованных норм ветеринар»о-санитарного качества семени производителей, так и для разработки способов профилактики и лечения некоторых форм патологии репродуктивной функции у животных.

В настоящее время при изучении иммунных взаимоотношений в системе "самка-зародыш" наибольшее распространение получили исследования на экспериментальных моделях (Chaouat G et. al„ 1988, 1992; Clark D.A. et. al., 1989, 1992; Banwatt D. et. al., 1992), Возможность проведения этих исследований с использованием экспериментальных моделей на лабораторных животных обусловлена тем, что многократно было показано существование сходных иммунных взаимоотношений в системе "самка-зародыш" у животных независимо ни от строения пла-

ЦЕНТРАЛЬНАЯ НЛУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Моск. свльснохоэ. вкидамш

иенты. ни от сроков беременности.

Цель работы - определение взаимосвязи между активностью иммунной системы самки и нормальным прснатальным развитием, вы я сне-нис возможности коррекции эмбриональном выживаемости посредством изменения иммунологической реактивности материнского организма, а также изучение возможной взаимосвязи вторичных иммунодсфицитов и си негнойной палочки в возникновении пренлтальных потерь.

Задачи исследований: I. Определив влияние на эмбриональное развитие экспериментального угнетения иммунной системы у самок как с аллогенной, так и сингенной беременностью, 2. Исследовать роль иммунных реакций самки в снижении эмбриональной выживаемости, обусловленной действием глюкокортмкостероидов. 3. Разработать специфические (посредством иммунизации) способы предотвращения пренатальных потерь у самок (как адлогенно, так и сингенно спаренных) со вторичными и мму и о дефицитами. 4. Определить возможность использования иммуномодуляторов хтя коррекции эмбриональных потерь у самок с угнетенной иммунной системой. 5. Выяснить индукторы становления им-мунотрофи ческой функции материнской иммунной системы как при аллогенной. так и сингенной беременности. 5. Изучить биологические показатели, степень вирулентности и синтез факторов патогенности, а также устойчивость к антимикробным препаратам штаммов си не гной ной палочки, конта минирующих сперму бы ко в-производителей. 7, С использованием экспериментальных моделей выяснить возможную взаимосвязь угнетения иммунной системы у самок и синегнойной палочкой в снижении пренатальной выживаемости. 8. Исследовать влияние на биологические показатели сперматозоидов (как in viiro, так и ¡r> vivo) естественной и искусственной контаминации спермы бы ков-производителей штаммами Ps.aeruginosa с различной степенью вирулентности.

Научная новизна. Впервые на экспе и ментальных моделях установлено, что угнетение активности иммунной системы как у алло ген но-, так и сингенноспаренных самок вызывает снижение эмбриональной выживаемости. В условиях аллогенной беременности это снижение происходит в начальный период плацента пин, а при сингенной беременности п ре катальные потери происходят в предплаценгационный период. С использованием дополнительной специфической сенсибилизации выяснено, что данное снижение эмбриональной выживаемости обусловлено нарушением иммунных взаимоотношений в системе "сам ка-зародыш".

Впервые выяснено, что первичными индукторами становления . иммунных взаимоотношений в системе "самка-зародыш" являются при ал-логе иной беременности - антигены плазмы семени и живчиков, а при

сингенной - антигены живчиков.

Впервые показано, что обработка беременных (как сингенно, так it алло ic mini самок синтетическими имму »«модуляторами, способными отменять феномен иммунологической тате ранги ости (индуцированный активацией неспенифическвх клсток-сулрессоров, с которыми нередко связывают нормальное пренатальное развитие) не только не увеличивает величину п рената льных потерь, но предотвращает их у самок с угнетенной иммунной системой. Таким образом, установлено новое научное направление в разработке способов повышения пренатальной выживаемости у самок - посредством обработки их синтетическими иммуномоду-ляторами.

На основе этих впервые установленных фактов, сформулировано новое теоретическое положение о том, что для нормального лре-натального развития необходим иммунный ответ самки на антигены ранних эмбрионов.

Впервые показано, что ни искусственная, ни естественная контаминация спермы быков-производителей штаммами синегнойной пилочки, обладающими высокой степенью вирулентности, а также синтезирующими различные факторы патогенности, не оказывает отрицательного влияния на выживаемость сперматозоидов in vitro.

Впервые установлено отсутствие взаимосвязи в возникновении пренатальных потерь между вторичными иммунодефицита ми и штаммами синегнойной палочки (независимо от степени вирулентности и синтеза факторов патотенност»), к о нта минирующими семя производителей. На основе этих исследований сформулировано новое теоретическое положение о существовании у сперматозоидов и тканей половых путей коров и телок тканевоспецифического конституционального иммунитета по отношению к штаммам синегнойной палочки.

Практическая ценность работы. Разработаны экспериментальные модели угнетения и восстановления пренатальной выживаемости посредством изменения активности иммунной системы- самок (как при аллогеином, так и сингенном спаривании). Данные модели могут быть использованы при дальнейшем изучении как иммунных факторов, участвующих в нормальном пренатальном развитии, так и при определении возможного взаимодействия иммунодефиците в и микроорганизмов в нарушении эмбрионального развития. Экспериментально обосновано использование как специфической сенсибилизации (иммунизация лейкоцитами, либо плазмой спермы или сперматозоидами самцов доноров спермы), так и синтетических иммуномодуляторов для предотвращения пренатальных потерь у самок со сниженной активностью иммунной системы. Показано, что

при разработке системы мероприятий по профилактике нарушений репродуктивной функции необходимо учитывать, что факторы, вызывающие снижение резистентности увеличивают пренатальные потери, вслеаствни нарушения иммунотрофического действии организма самки на зародыш.

Внедрение в практику. Обнаруженное нами отсутствие отрицательного влияния на воспроизводительную функцию у животных (даже с пониженной резистентностью > контаминации спермы бы ков-про из водителей штаммами синенной ной палочки (независимо от степени их вирулентности) было использовано при изменении ветери парно-санитар ной оценки качества спермы быков-производителей в изменении N 1 ГОСТ 26 030-83 "Сперма быков замороженная. Технические условия", а также к "Ветерннарно-санитарных правилах для племпредприятий (станций) и пунктов искусственного осеменение сельскохозяйственных животных" утвержденных ГУВ МСХ СССР от 29.12.90 года. Практическое использование на ряде пл ем предприятий в течение 5 лет новой оценки ветеринарно-елнитарного качества спермы бы ков-производителей с одной стороны подтвердило правильность теоретических положений, выдвинутых в диссертационной работе, с другой стороны увеличило выход спермы ценных в племенном отношении быков-улучшателей.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

В условиях внутривидовой беременности распознавания материнской иммунной системой антигенов зародыша отцовского гаплотипа приводит не к формированию реакций отторжения, а к становлению по отношению к зародышу иммунотрофической функции. Иммунотрофическое взаимодействие в системе "сам ка-зародыш" является необходимым звеном нормальною пренатального развития.

Существует несколько групп антигенов, осуществляющих индукцию иммунотрофн ческой функции иммунной системы самки. При сингенной беременности (не являющейся, согласно наиболее распространенной точке зрения, исключением из этой закономерности) к ним относятся ткане-воспешфические антигены живчиков, не имеющие общих детерминант с антигенами лейкоцитов. Индукторами становления иммунотрофического взаимодействия в системе "самка-зародыш" при аллогенной беременности, помимо тханевоспецифических антигенов живчиков, являются и антигены гвстосо вместимости, экспрессирующиеся как на зародышах, так и на лейкоцитах и в семени.

Критическим периодом становления иммунотрофической функции при нормальной беременности являются первые сутки после оплодотворения. Угнетение активности иммунной системы у самок в этот не-

риги приводит к резкому снижению эмбриональной выживаемости в прслплаиснтаиипикмй и плацентационный периоды.

Предупреждение снижения премиальной выживаемости у самок с иммуно.кфинптами, вызнанными эндо- или экзогенными причинами достигается либо дополнительно« сенсибилизацией самок антигенами, имеющими детерминанты с антигенами зародышей, либо обработкой и м м у н о мо лу л я то ра м и.

Непосредственной причиной увеличения пренатзльных потерь у самок со вторичными иммунодефицита ми, обусловленными неблагоприятными факторами внешней среды, является не контаминация семени производителей штаммами синегнойной палочки, а нарушение иммунот-рофического взаимодействия в системе "самка-зародыш".

Отсутствие отрицательного влияния естественной контаминации в семени бы нов-производителей штаммами синегнойной палочки (не зависимо ни от степени их вирулентности, ни от синтеза факторов па-тогенности) на процесс воспроизводства у крупного рогатого скота обусловлено существованием у живчиков и в тканях половых путей коров и телок тканевоспецнфического конституционального иммунитета по отношению к этому микроорганизму.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на 2 (Киото, 19$3), 3 (Торонто, 1986), 4 (Киль,

1989), S (Рим. 1992) Международных конгрессах по иммунологии репродукции, на 6, 7 Международных симпозиумах по иммунологии репродукции (Варна, 1985, 1988), на 1 Международном форуме по иммунологии воспроизведения (Магдебург, 1990), на 1 Всесоюзном иммунологическом съезде (Сочи, 1989), на 2, 3 и 4 Всесоюзных симпозиумах по иммунологии воспроизведения (Москва, 1979, Киев, 1987,

1990), на научной конференции "Морфологи - здравоохранению и медицине" (Москва, 1983), доложены на заседании секции общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов имени И.И. Мечникова (Москза, 1990), на заседании рабочей комиссии ОНК BET ВАСХНИЛ "Патология размножения, профилактика болезнен маточной железы и новорожденных животных" (Москва, 1989), а также представлены в комиссию (созданную приказом ГУВ МСХ СССР N 81 от 29.08.90г.) по разработке нового проекта ветерина рно-саянтарных правил ns плем-предприятий.

По материалам диссертации опубликовано 44 работы, из них 28 в отечественной и 16 в зарубежной печати.

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, пяти глав обзора литературы, пяти глав собственных исследований, вы-

водов, практических предложений и списка литературы, Диссертация изложена на 353 страницах маши ношеного текста и илл нитрирована 31 таблицей. 23 графиками и 8 фотографиями. Г>ибли о графин включает 474 источника,' из них 46 публикаций отечественных и 42К публикаций зарубежных авторов.

Материалы и методы исследований.

За период с 1980 по 1993 года в экспериментальной работе было использовано 1200 мышей СВА весом 18-20 трамм, кролика

калифорнийской породы. 219 бы ко в-производителен (принадлежавших ЦСИО с-х животных. Красноярскому и Дмитровскому пл ем предприятиям и окало 2 млн. коров и телок (в зоне деятельности ЦСИО с*х животных).

В качестве экспериментального вторичного угнетении иммунной системы у спаренных крольчих использовали - блокаду СМФ. конкуренцию антигенов и обработку синтетическим глюкокортикостерпидом-презнизолоиом.

Блокаду СМФ осуществляли в/в введением суспензии карбоно-вьсх частиц (доза на одно введение 4 мл 2.5"; суспензии) на вторые сутки после осеменения. Конкуренцию антигенов индуцировали посредством в/в иммунизации эритроцитами барана (в дозе 5 мл 50% суспензии) на вторые сутки сукрольностн. Обработку преднизоло-ном осуществляли в/м однократно либо на 2-ые, либо на 7-ые сутки посте спаривание. Доза презннзолона на одно введение составила 2 мг/кг массы тела.

Дополнительную сенсибилизацию крольчих к антигенам зародышей проводили за I - 2 часа до экспериментального угнетения иммунной системы путем в\в иммунизации лейкоцитами <5 ч 10 клеток в 2 мл 0,9% раствора хлористого натрия), либо живчиками (2 х 10 клеток) или плазмой семени (10 мг/кг массы тела).

Обработку иммуномодул «торами самок осуществляли через 1-2 часа после экспериментального угнетение иммунной системы. В качестве нммуномодуляторов использовали - полиакриловую кислоту (ПАК), сополимер акриловой кислоты и М-винилпирролидона (НА) (любезно пре* доставленные академиком РАН Р.В.Петровым н профессором Р.М.Хактовым) и левамизол в дозах на кг массы тела соответственно 10 мг, 15 мг и 50 мг.

Для экспериментального угнетения иммунитета у самок СВА. использовали активацию неспецифических клеток-супрессоров путем создания феномена конкуренции антигенов. Этот феномен индуцировали

Схема модельных экспериментов по изучению роли иммунной систем и самки в нормальном и нарушенном лллогенном п ре на га льном ра.шитни

R

одно-. либо трехкратной в/я иммунизацией jpwrpoiiittavtu барака в оптимальной иммуномодулируюшей дозе.

В работе использовали методы; I ) клеточнлй имунодошин - локальный гемолиз в теле агарозм, Кон-A индуинровлиную fvuic ттранс формацию лимфоцитов, спонтанное ро.четкообралояаине к реакцию торможение миграции макрофагов; 2> нммунохнмичеехие методы - и-ч-чуноблот, твердофазный иммуноферментпын анализ < кчт-снстечу ллн количественного определения кроличьего фиброиектинл готовили по Ермолину Г.А. с соавг.. (9861. ионообменную и аффинную хрпчотог-рафии: микробиологические методы (в работе использовали 314 идп-л я т о в сине гнойной палочки, выделенных из семени быков-производителей) • среды: N' 28. Кинг А и Кинг В и среда с ЦП Х- иитохромоксидазньш тест, серо пт нромине. определили - вирулентность в Л .1,50, протелзную и зластазнум актившчти. а также образование экзотоксина-А, При изучении влияния на результативность осеменения самок семенем tc искусственной контлмннаииеп вы с око вирулентным штаммом сикегнойной палочки использовали эталонный лк.зоток-син-А образующий штамм РА-103. полученный из ГМСК имени Тарасевича N(3 РФ.

Результаты исследований.

Модели с алогенным спариванием. Влияние блокады СМФ на пренатальиую выживаемость. В SG-ые годы наибольшее распространение получила "нммуносупрессивкая" теория прендгального развития (Faulk W.P., 1983. 1989; Pierre В., Chaouai G.. 1988), согласно которой необходимы it звеном нормального пренатального развития является угнетение иммунных реакций материнского организма на антигены зародыша отцовского гапдотипа.

Для проверки этой теории, а также для определения возможности использования в целях предупреждения эмбриональных потерь экспериментального изменения активности иммунной системы у самок была использована ■ разработанная ранее модель угнетения иммунитета посредством блокады СМФ кзрбоновыми частицами. Известно, что введение животным этих частиц нарушает функции антигенпрезставляюших клеток, следствием чего является резкое угнетение первичного иммунного ответа (Козлов В.А. и др., 1982; Василев ЧЛ„ 1986).

На первом этапе этих исследований было изучено влияние на эмбриональную выживаемость обработки самок (на 2-ые сутки после спариваний) карбоновымн частицами в дозах: 12,5 мг, 50 мг и 100 мг. Было обнаружено, что инъекции самкам этих частиц в дозах 12J

чг и 50 мг практически не повлияли на пренатальную выживаемость, определенную по числу нормальных и дегениркро ванных зародышей поете убоя самок на 13-ые сутки сукрольности. В тоже время вопреки иммносуггрсссивной теории обработка этими частицами в дозе 100 мг не только не уменьшила п ре катальные потери, но даже увеличила

IV.

их на статистически высокодостоверную величину <Р<0,001).

В следующем эксперименте определяли зависимость между первичным иммунным ответом и временем обработок самок суспензией карбоновых частиц в дозе 100 мг. Было установлено, что число

АОК/Ю7 спленоцитов составило у самок контрольной группы 686 ± 83, при иммунизации за несколько часов до блокады СМФ -586 г 104 и через 24, 72 и 144 часа соответственно 163 ± 45 (Р<0,01); 310 ± 82 <Р<0,05> и 430 ± 143. Таким образом, результаты этого эксперимента показали, что лишь в течении первых 3-х суток после введения карбоновых частиц <в дозе 100 мг) происходит резкое подавление первичного иммунного ответа.

В связи с этим на следующем этапе исследований, для определения времени критического периода становления иммунных взаимоотношений в системе "самка-зародыш" крольчих на разных этапах эмбрионального развития обрабатывали суспензией карбоновых частиц. Было выяснено, что только инъекции этих частиц на 2-ые. но не на 4-ые или 7-ые сутки посте спаривания вызывают увеличение пре-натальных потерь на статистически высокодостоверную величину (Р<0,001). Следовательно, критическим периодом становления необходимых для нормального эмбрионального развития иммунных взаимоотношений в системе "сам ка-зародыш" являются первые сутки после спаривания.

Известно, что снижение пре катальной выживаемости в естественных условиях нередко происходит в предплацентаиионный, плацентацион-ный и постплацентационный периоды. Так как в предыдущих экспериментах пренатальные потери определяли лишь на 13-ые сутки сукрольности, хота блокаду СМФ осуществляли на 2-ые сутки после спаривания, то в следующем опыте внутриутробную выживаемость определяли на разных этапах преиаталъного развития. Результаты этого эксперимента указаны в таблице 1.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, обработка карбоновыми частицами самок на 2-ые суттн после спаривания не вызвала гибели зародышей в донышшнтационный период. В тоже время у таких самок снижение п ре катальной выживаемости произошло в начальный период имплантации. К периоду завершения формирования плаценты, а также в постплацентацнониый период дальнейшего увелеченвя

предомысых потерь не произошло.

Таблица 1,

Преьатальная выживаемость на разных этапах рпзмтм зародите у самок с блокадой СМФ.

Время делеяш опре-пре- Обработки Число Число жел- Число зародышей или детенышей Пренатальная

катальной выживаемости самок тых тел Всего Из них нормальных выживаемость V /о

сутки физ. растрор 4 30 30 30 100.0

каоб. част. 5 32 32 32 100.0

физ. раствор 7 50 50 50 100.0

карб. част. 6 44 43 28 65.1±7.3*)

13 фнз. раствор 24 178 174 96-5 ± 1.4

каоб. част. 26 174 70.02 3.6

По данным окрола физ. раствор каоб. част. 36 35 267 187 100.0 71,бг 2,1 *>

- преяатальную выживаемость определяли по отношению к контролю; - Г <0.001

Таким образом, результаты этого эксперимента показали, что блокада СМФ у самок на ранних этапах беременности вызывает резкое снижение эмбриональной выживаемости. В тоже время не исключено, что в этих экспериментах увеличение п рената л ьных потерь произошло не в следствии снижения иммунологической реактивности организма самки, а в результате нарушения каких-либо иных важных для нормального эмбриогенеза физиологических процессов. В связи с этим для проверки данного предположения, а также для выяснения первичных индукторов становления иммунных взаимоотношений в системе "самка-зародыш" была использована дополнительная сенсибилизация (к аютгеаным зародышей) самок с блокадой СМФ..

Преяатальная выживаемость у самок с блокадой СМФ дополнительно сенсибилизированных антигенами, имеющими общие детерминанты с антигенами зародышей. Возможность использования данной сенсибилизации для этих целей обусловлено тем, что согласно результатам« представленным выше, при иммунизации животных до^ обработке инертными частицами первичный иммунный ответ не меняется, В таком случае, если пренаталыше потери у самок с блокадой СМФ обусловлены непосредственно нарушением распознавания материнской иммунной системой антиганов зародыша отцовского га пл отшив, то восставовленне этого процесса распознования посредством дополнительной (до

Габ/нша 2.

П ре на таль на я выживаемость у самок дополнительно сенсибилизированных (антигенами самцов и экстрактом эмбрионом) до блокады СМФ.

Обработки Число Число мест Жнных потомков

Антигенами Карбоновмми частицами самок имплантации Всего )мбрЛ10НОГ1______!___ | Всего Крольчат _ Н.1 самк\ к контролю

- - 6/ 10* 44 44 100.0 ! 74 7.4 100.0

- + 6 / 10 43 18 65.1 ^ 4.3*1 \ 49 4.4 66.2 ± 4.3*'

Лейкоциты самцов доноров спермы + 6/10 43 43 100.0 | 79 74 100.0

Лейкоциты посторонних самцов + 6/7 45 28 . 1 62.2 ± 7.3*' | 35 5.0 „ 67,6 ± 3.7 '

Плазма сперми самцов допоров спермы + 5/10 36 36 100.0 \ 1 73 7,3 98.6 ± 0.96

Плазма спермы посторонних самцов 5/10 34 26 1 66.7 ± 7.5* * ] 52 5,2 70.3 ± 4.1*'

Живчики самцов доноров спермы + 4/10 4/10 31 30 31 30 100.0 ! 100.0 ; 75 73 7.5 и 100.0 08.6 ± О.УО

Живчики посторонних самцов + 5/8 38 38 100.0 59 « 100.0

Экстракт эмбрионов + 5/10 5/ 10 39 36 39 35 юо.о 1 47.2 * 2.2 | 76 74 ?5 100.0 (00.0

- в числителе число самок, в .тамема гс.че число окрол ичшчск сачок Р < 0.001 **-('< 0.01

обработки карбоновыми частицами) специфической сенсибилизации самок, должно предупредить эмбриональные потерн. Ранее было показано, что антигены лейкоцитов, живчиков и собственно плазмы семени имеют общие детерминанты. В наших исследованиях с использованием иммуноблота у кроликов также была установлена общность детерминант между антигенами зародышей, плазмы семени и живчиков. В связи с этим в следующем эксперименте дополнительную сенсибилизацию (за 1 - 2 часа до блокады СМФ) осуществляли лейкоцитами, либо плазмой семени или живчиками как самиов доноров-семени, так и посторонних самцов. Результаты эксперимента представлении в таблице 2.

Как видно из данных, представленных в таблице 2, пренаталь-ная выживаемость полностью восстановилась до уровня контроля у самок с блокадой СМФ дополнительно просеисибмлизнрованных антигенами самцов доноров-семени (лейкоцитами, живчиками и ::лазмой семени) и экстрактом эмбрионов. В отличие от дополнительной сенсибилизации антигенами самцов дон о ров-семени иммунизация самок с блокадой СМФ антигенами посторонних самцов дала неоднозначные результаты. Так. дополнительная сенсибилизация лейкоцитами как и плазмой семени в этом случае не оказала положительного влияния иа пренатальную выживаемость у самок, обработанных суспензией карбоновых частиц. Напротив. иммунизация живчиками посторонних самцов (также как и самцов доноров-семени) полностью восстановила до уровня контроля эмбриональную выживаемость. Это несовпадение эмбрнопротективного действия иммунизации лейкоцитами или плазмой семени с одной стороны и иммунизации живчиками с другой может быть обусловлено существованием у них различных антигенов, имеющих общие детерминанты с антигенами эмбрионов. По-видимому, на живчиках в отличие от лейкоцитов и плазмы семени представлены антигены (имеющие общие опнтопы с антигенами эмбрионов) с невысокой степенью полиморфизма.

Таким образом, результаты этого эксперимента показали, что специфическая дополнительная сенсибилизация самок (со вторичным иммунодефицитом) антигенами отцовского гаплотнпа оказывает положительное влияние на пренатальное развитие. Прн естественном спаривании непосредственным фактором, индуцирующим этот процесс сенсибилизации, ло-видимому, является антигены плазмы семени и живчиков. Вместе с тем положительный эффект сенсибилизации этими антигенами обусловлен либо феноменом 'усиления* (активацией специфических к неспецифических Т-супрессоров), либо функциональной активностью других звеньев иммунного ответа. Участие в этом процессе блокирующих антител маловероятно, , так как со времени иммунизации до критического периода

.(времени тбели эмбрионов у самок с блокадой СМФ) проходит всего лишь 4-5 суток.

Пренатальная выжиааемостч у самок, обработанных иммуномодуля-торами на фоне блокады СМФ. Известно, что многие и ммуномо дуля-торы посредством стимуляции иммунологической активности макрофагов способны усиливать иммунореактивность организма. В частности,,, этими свойствами обладают ПАК, NA, левамизол (Асквит П, 1983; Петров Р. В. и др., 3983). В тоже время эти иммуномодуляторы обладают способностью отменять феномен "усиления", иммунологическую толерантность, опосредованную активацией Т-клеточного супрессориого звена (Петров Р.В. и др., 1983; Тала Т.. 1988).

В связи с этим для дальнейшей экспериментальной проверки и м м у н осу п ресси вн си теории, а также для выяснения возможности использования иммуномодуляторов для предупреждения пренатальных потерь у самок с иммунодефицита ми крольчих через 1 - 2 часа после введения карбоновых частиц обрабатывали различными иммуномодуляторами. Результаты эксперимента представлены в таблице 3.

Как видно из данных, представленных в таблице 3, все использованные иммуномодуляторы (отменяющие феномен "усиления") независимо от их природы восстановили эмбриональную выживаемость у самок с блокадой СМФ до уровня контроля. В тоже время обработка иммуномодуляторами самок с интактной иммунной системой не вызвала у них снижения пренатальной выживаемости.

Таким образом, результаты этого эксперимента показали, что иммуномодуляторы, также как и специфическая иммунизация, могут быть использованы для предупреждения пренатальных потерь у самок с иммунодефицитамн. Эмбриопротективный эффект иммуномодуляторов в этом эксперименте связан не со стимуляцией феномена "усиления", а по-видимому, с восстановлением иммунотрофической функции (по отношению к зародышу) организма самки, индуцированной антигенами плазмы семени и живчиков.

Клеточные иммунные реакции у сам ох со сниженной и восстановленной эмбриональной выживаемостью. Ранее было показано, что у крольчих уже на начальных этапах беременности происходит изменение некоторых клеточных иммунных реакции (Бронская A.B. и др., 1980). В связи с этим нами было изучено изменение числа Е-РОК и КонА индуцированный блаеттрансформации лимфоцитов у самок с угнетенной и восстановленной эмбриональной выживаемостью. В этих исследованиях было установлено, что блокада СМФ снижает я периферической крови число Е-РОК на 3-н и 6-ые сутки после

Таблица 3.

Прснатальная выживаемость у самок, обработанных различными

иммуиомодуляторамн после блокады СМФ„* *

Обпаб 1ГТКН Число Число мест Живых потомков

Кярбоновые Имму комоду - самок имплантации Эмбрионов Коольчат

частицы л агоры Всего но| ыальных на %

Всего /о самку к контролю

- - 5/10* 36 36 36 100.0 7.4 100.0

+ левамнэол 7/10 49 49 47 95.9 ± 2.8 7.2 97, а 23

- левамиэол 13 - - - - 7.8 100.00

полиакриловая кислота 5/10 35 35 35 100.0 7.3 98.6 ± 1.0

сополимер акриловой кислоты и Ы-винил пиррол идола 4/10 32 32 32 100.0 7,7 100.0

* - в числителе число вскрытых самок, в знаменателе число окроднншихся самок

* * - исследования выполнены с Соколовской И.И. и 1>ронской А.В.

* обработки суспензией карбоновых частиц (Р<0,001). Инъекции таким самкам лева ми.юла или иммунизации их как лей к опятами самцов-доноров так и посторннх самцов полностью восстановила этот показатель клеточного иммунитета До уровня контроля. В тоже >ремя иммунизация лейкоцитами посторонних самцов в отличие от иммунизации лейкоцитами самцов до норов-семени, либо обработки иммуномодуляторами не предотвращает снижения пренатальной выживаемости у самок с экспериментально вызванным вторичным иммунодефицитом.

Следовательно, увеличение числа Е-РОК в периферической к рое и не всегда совпадает с течением нормального эмбриогенеза, то есть данный показатель не может быть использован в качестве способа определения нормальной и нарушенной беременности. Это несовпадение между увеличением числа Е-РОК и пренатальной выживаемостью, по-видимому, обусловлено тем, что для нормального эмбриогенеза необходима специфическая сенсибилизация материнского организма к антигенам зародыша отцовского га плоти па, что у самок, обработанных карбо новыми частицами, достигается либо иммунизацией лейкоцитами самцов до-норов-семени, либо обработкой иммуномодулвторами.

Как и в случзе со спонтанным розеткообразованнем блокада СМФ вызвала резкое снижение Кон-А индуцированный бласттрансформа-цни лимфоцитов периферической крови. Наибольшее угнетение этого показателя произошло через сутки после обработки карбоновыми частицами <р<0.001). Снижение синтеза ДНК сохранялось в течении 5 -7 суток после спаривания. Иммунизация самок с блокадой СМФ лейкоцитами самцов дон о ров-семе ни ие только не повысила у них индекс включения Н^ - тнмндина (индуцированного Кон-А) лимфоцитами периферической крови, но даже вызвала его дальнейшее снижение. Угнетение бласттрансформаиии лимфоцитов в отличие от восстановлен и в числа Е-РОК при аналогичной обработке, по-видимому, связано с суммой неспеиифических супрессивных факторов - специфической сенсибилизации (иммунизация лейкоцитами самцов) и блокадой СМФ. Известно, что иммунизация, как тимус-зависимыми, так и тимус-независимыми антигенами стимулирует появление в организме специфических и неспецифических клеток-супрессо ров, причем, как правило, количество неспецифических супрессоров во много раз превышает количество специфических Т-супрессоров (Брондз Б .Д.. 1987).

Эмбриональные потери к их предотвращение у самок с активированными клетками супресссрами. либо обработанных глюкокортикостеро-идом. Согласно "иммуносу п ресивной" теория важным звеном нормального эмбрионального развития валяются неспецнфяческне клетки-су црессоры

<№Ымл( е1. а!.. 1988). Известно, что они облегчают становление иммунологической толерантности (Тайа Т., 1988). В тоже в рем а установлено, что при хронических патологических процессах с высокой активностью этих клеток нередко бывают нарушения воспроизводительной функции. В связи с этим большой как теоретический, так и практический интерес представляет выяснение функции неспецифических меток-су прессоро в. В 70-е годы была разработана модель активации неспецифических клеток-су прессоров посредством создания "феномена" конкуренции антигенов. Позднее было показано, что этот "феномен" отменяется обработкой нммуномодуляторами (Петров р.В. и др., 1143). Также большой интерес представляют исследования по выяснению непосредственных причин снижения эмбриональной выживаемости часто сопровождающее стрессы. Известно, что иммунодепрессивное действие мюкокортикостероидое обусловлено, главным образом, угнетением синтеза ИЛ-2, которое отменяется введением экзогенного ИЛ-2 < Б ширен Е. е1. а1., 1990). Установлено, что иммуностимулирующее действие многих им-муногропных препаратов связано с усилением синтеза эндогенного ИЛ-2,

Результаты эксперимента по изучению влияния на п ре нахальную выживаемость конкуренции антигенов и ее разобщения, а также обработки синтетическим глюкокортикостероилом - преднизалоном, либо преднизолоном и левамнзолом представлены в таблице 4. Как видно из данных, представленных в таблице 4, вопреки "иммуно-супрессивной" теории активация кеспецифпческмх клеток -су прессоров снизила п ре катальную выживаемость на статистически достоверную величину. Обработка таких самок иммуномодуяяторами - ПАК и левамнзолом полностью восстановила эмбриональную выживаемость до уровня контроля. Эмбрио-токсическое действие преднизолона также отменялось обработкой левамнзолом. Эмбриональные потери при конкуренции антигенов и при введении преднизолона проходили как и при блокаде СМФ в ранний им плантационный период.

Динамика изменения численности Е-РОК и Кон-А стимулированной бла-сгтрансформации лимфоцитов у самок с индуцированной и разобщенной конкуренцией антигенов, а также обработанных преднизолоном, либо преднизалоном и левамнзолом полностью совпадала с динамикой изменения аналогичных показателей клеточного иммунитета у самок с блокадой СМФ, 1 либо обработанных карболовыми частицами и левамиэолом.

Таким образом, результаты экспериментов, представленных в этой главе показали, что угнетение иммунной системы у аллогенноспаренных самок вызывает снижение эмбриональной выживаемости, которое может быть предотвращено обработкой самок иммуном одуляторамн, либо

Таблица -I.

(Т рената льна я выживемость у самок с индуцированной и разношенной конку реи цисй аннпенон, а также обработанных преднизолоном. либо нрсднизолоном и Л1* вам и.юл ом. "

Число Живых змориоион

Обработки Число мест Омбдиоиов _ Крольчат

самок им-

план- Всего Из них Всего ' на % к

тации нормальных к'амку контролю

- - 7/12 53 53 100.0 г 87 1 7.2 100.0

эритроциты барана < - 5/И 40 31 78.0± 6.4 61 : 5.6 ] 78.4 ±3.4

эритроциты барана ПАК 4/9 33 32 96.9+4.8 65 1 7.2 100.0

эритроциты барана лева ми зол 4/12 34 34 100.0 86 | 7.2 100.0

преднмзолон - 7/10 45 17 37.8*7.2*^ 32 ! 3.2 45.1 ±4.8 **>

преднизалон левамизол 5/10 40 40 100.0 ■ 71. | 7.1 98.6 ± (.0

** • исследования выполнены совместно с И.И. Соколовской и Л.П. Вронской. * - в числителе число вскрытых самок; в знаменателе - число окродивишься самок *) - Р < 0.01 ; **) - р < 0.001

ямолшпельноб сеясябктэацяе* аятнгенамм, имеющими общие детерминанты с амтгешиа эарадетей. Следовательно, распознавание материнской км-муняоД актешик мтикм» зародыша отцовского гаплотипа, приводящее к ствдемевто нммуногрофяческой функция являете* необходимым звеном ■орммьвого эмбртмсмэ*.

Модели с атташмм спариванием. Важным аргументом, противоречии»« "нммунотрофн ческой* теории считают сниженную беременность (Оаск О.А.. СЬаоиа! б, 1989). Известно, что при сингениой беременности, когза антигены гистосо»местамости у самца н самки практически полностью совпадают, увеличением эмбриональных потерь, как правило, не отмечается.

Таким образом, если действительно иммунотрофическое азах молей-стане в системе "самка-зародыш" является обязательным звеном нормального эмбриогенеза, то этот физиологический процесс должен существовать н при сингенной беременности.

В экспериментах по изучению роли иммунной системы самки в развитии сингениого зародыша использовали модель активации неспецифических клеток-су прессоров посредством создания феномена конкуренции антигенов. Данный феномен вызывали 3-х кратной иммунизацией эритроцитами барана. Степень активации этих клеток вычисляли путем определения величины подавления первичного иммунного ответа. Экспериментально было обнаружено, что иа вторые сутки после последней нммуннзапжш эритроцитами барана число АО К к эритроцитам

свинья (на 106 спленошстов) снизилось с 692 ± 82 <в контроле* до 28 ± 4 опыте), В тоже время инъекции левамизола (в дозе 15 мг/кг массы тела) полностью разобщила эту конкуренцию (число АОК. составлю 718 г 92).

Прн мучении влияния конкуренции антигенов и ее разобщения на аре катальную выживаемость было обнаружено, что активация неспе-цяфнческнх клеток-су врессоров вызывает снижение числа сингекнобере-меанык самок с 81.8 ± 11.6 % (в контроле) до 42.9 ± 13.2 % (в опыте. Р<0.05). Данное нарушение беременности не бкло обусловлено действием аитиэрнтроцитараых антител, т.к. введение спаренным,)- самкам мышиной антвсыворогьи к эрштроцжтам барана не повлияло та' число беременных самок в группе (которое составило 90.0 ± 9 5 %)., • Обработка самок с феноменом конкуренция антигенов нммуномодулятором. леяамнзолом восстановила число беременных самок в грунле до 833 * 10.8 V В тоже время при вскрытии самок (с активированными клетжама-супрессорамд) на 13-е суткя беременное« не было обнаружено р"ттпг"у ■ эмбрмовкльно* вниршич"* по сравнению с контролем

'(84.1 ± 5.5 в опыте и 83.3 ; 3.9 % в контроле*. Так как при вскрытии самок в этот период беременности можно определить лишь п ре на та льны с потери, проишедшие а «мплантанионный период, можно предположить, что снижение числа беременных сам ох в группе животных с активированными клетка ми -су прессорамл вызвано полной доимп-лаиташюнной гибелью зародышей у значительной части таких елмок. В связи с этим в следующем эксперименте у самок с индуцированной конкуренцией была изучена пренатальная выживаемость на стадии зиготы и морулы. Было обнаружено, что эта выживаемость у них на данных стадии* эмбриогенеза была практически одинаковой как в контроле. так и в опыте и соответственно составила 9) .6 ± 8.Я . 84.6 г 10.9 7„ и 90.0 ± 10.0 "/„. 81.8*9.6 Следовательно, сниже-

ние числа беременных в группе самок с активированными к леткам и-супрессорами обусловлена нарушением процесса имплаитаиии зародышей.

То. что нарушение процесса имплантации зародышей у синген-впберемемных самок с индуцированной конкуренцией антигенов связано с иммунными факторами, а не с нарушением каких-либо других физиологических механизмов было подтверждено и в адоптивном переносе. Так, перенос интактным спаренным самкам сплеиоиитов от интактных беременных, либо небеременных самок практически не повлиял на доим плантационную выживаемость зародышей, число беременных самок составило соответственно - &1.3± 9.7 % и 73,0 ± 7,2 % против 77.1 ±6,] % в контроле. В тоже время адоптивный перенос интактным спаренным самкам спленоинтов от животных с индуцированной конкуренцией антигенов вызвал снижение чиста беременных самок в группе до 33.0 г 7.3 % (Р<0-001). Также в адоптивном переносе было показано, что нарушение процесса имплантации у самок с активированными клеткам и-супрессорами обусловлено действием прилипающих к пластику спленоинтов. Перенос спаренным самкам с индуцированной конкуренцией антигенов спленоинтов от интактных беременных самок восстановил доимплантацнонную эмбриональную выживаемость (число беременных самок составило в контроле 85.0 з: 8.0 % и в опыте 70.6 2: 11.0 % при Р>0.05).

Известно, что и при сингекной беременности зародыш имеет антигены отличающиеся от антигенов материнского организма. В частности, на ранних зародышах экслрессированы антигены локуса Т, которые помимо эмбрионов представлены также на живчиках и на клетках некоторых опухолей. Следовательно, эти антигены всегда будут "чужеродны" для организма самки. Исходя из этого можно предположить, что антигены локуса Т, локализованные на живчиках, могут

быть индукторамн нммунотрофкческо^ функции гтри сингенной беремен-ности.

3 емзк с этим в следующем эксперименте спаренным самкам адолтавно переносили спленоцнты от самок, иммунизированных живчика-мд, либо спленошгтами снигекных самцов. Восстановление донмплантаци-онной п ренат ал ьн ой выживаемости произошло лишь при переносе саченошггов от самок, иммунизированных живчиками (83.3 ±10.7 %), но не спленоштми (41.7 ± 13.2 %). Число беременных самок в кон-трате составило 85.0 ±8.0 %.

При определении индекса ингибицин миграции макрофагов * присутствии сингенных живчиков была также обнаружена прямая зависимость между этим показателем клеточного иммунитета и доимгыанта-цяонной эмбриональной выживаемостью у самок с сингенной беременностью. Так, у внргинных самок данный индекс составил 101.0 ± 7,7, т.е. сенсибилизация к антигенам сингенных живчихов у них практически отсутствовала. В тоже время у интактныч беременных самок появляется сильная сенсибилизация к этим антигенам (индекс 32,3 ± 2,9), у спаренных самок с активированными клетка ми-супрессорл-ми индекс ингибицин миграции макрофагов (93,9 ± 12.4) практически не отличался от контроля. Адоптивный перенос спаренным самкам с индуцированной конкуренцией антигенов спленоиитов от интактных беременных, либо небеременных животных, иммунизированным сниженными живчиками, восстановил не только доимплантаинонную эмбриональную выживаемость, но и этот вид клеточных иммунных реакций. Индекс ингибицин миграции макрофагов соответственно составил - 33.5 ± 3.5 и 34.6 ± 3-5 .

Таким образом, результаты, представленные в этой главе, показали что и при сингенной беременности распознавание материнской иммунной системой "чужеродных" антигенов зародыша является необходимым звеном нормального эмбриогенеза. Индукторами этого процесса, по-видимому, являются антигены живчиков, имеющие общие детерминанты с антигенами гародышей.

Оценка возможного значения в нарушениях воспроизводительной функции у крупного рогатого скота штаммов синегнойной палочки, контамннируюших семя быков-производителей

В отечественной литературе длительное время дискуссируется вопрос О возможном взаимодействии в возникновении пре нахальных потерь штаммов синегнойной палочки, контаминируюших семя быков-производи -тетей и снижения резистентности у самок. Исходя из этого в нормативные документы по ветеринарно-санитарной оценке качества

семени-прои.тодитслей был внесен (без достаточной экспериментальной проверки) пункт, предусматривающий выбраковку семени, контачиниргтан-кого ;>тими микроорганизмами. Так как. штаммы синепюйнои палом», и нередко присутствуют в семени быков-производителей, то выбраковка семени быкон-улучшатслей с высоким генетическим потенциалом намесит большой ушерб племенному делу.

Действительно многокатно показано, что при снижении резистентности организма синсгнойная палочка действительно может бита, причиной различных форм патологии, Исследования, проведенные нами показали, что при угнетении иммунной системы на ранних этана\ бе-рсменности резко увеличиваются эмбриональные потери. Следовательно, вполне можно предположить, что либо все они. либо значительная и* часть может быть вызвана действием штаммов синепюинои палочки, лопаны их в половые пути вместе с семенем производителей

В связи с этим быо изучено возможное взаимодействие в снижении нренатальной выживаемости вторичных иммунодефицитом у сами* и штаммов синегнойной палочки.

Вирулентность и синтез факторов патогенности штаммамг__

гнойной палочки, выделенных из семени производителей.

Ранее было показано, что как правило, отсутствует взаимосняаь между контаминацией семени быков-производителей штаммами синепти-ной палочки и какими-либо нарушениями репродуктивной функции у этих быков. Следовательно большой интерес представляет изучение степени вирулентности у синтеза факторов патогенности этими штаммами, то есть вполне вероятно, что они являются авирулентными.

При изучении вирулентности и синтеза факторов патогенности штаммами синегнойной палочки, выделенными из семени быков-производителей, было обнаружено, что несмотря на то, что эти штаммы были выделены из семени быков без каких-либо клинических проявлений нарушения репродуктивной функции, они нередко обладали высокой степенью вирулентности и синтезировали факторы патогенности. В частности, экзотоксин-Л и протеолитические ферменты синтезировали соответственно 30% и 60% от числа исследованных штаммов. Среди них было обнаружено - вирулентных (ЛДзд 40-100 млн) - 26,7% и слабовируленных (ЛДда более 200 млн) - 46,6%.

Таким образом, результаты этих исследований показали, что в семени быков-производителей нередко присутствуют штаммы синегнойной палочки обладающие высокой вирулентностью и синтезирующие факторы патогенности.

Изучение влияния штаммов синегнойной палочки на выживаемость

живчиков вне организма.

В связи с обнаружением в семени быков-производителей штаммов си негнойной палочки, синтезирующих факторы патогенности нами было изучено влияние на выживаемость живчиков вне организма естественной контаминации семени производителей данными штаммами. Результаты эксперимента представлены в таблице 5,

Как видно из данных, представленных в таблице естественная контаминация спермы быков как штаммами синегноннон палочки, так и штаммами Proteus sp. не оказывает отрицательного влияния на пс-реживаемость спермиеи вне организма.

Таблица 5.

Влияние естественной контаминации спермы быков условнопатпгенной микрофлорой на переживаемость спермиев в течение 5 часов при 38" С.

Контаминация Число Подвижность (в баллах*

исследованных серий Сразу после оттаивания Через 5 часов

Синегнойной палочкой 145 4.45 i O.OS 2,25 ± 0.07

Контроль (без контаминации) 195 4.38 ± 0.03 2.12 ± 0.08

Proteus sp. 50 4.53 ± 0.06 2.31 ± 0.13

Контроль <без контаминации) 50 4.45 ± 0.07 i 2.14 = 0.16

* - в контроле и опыте исследовали равное число проб от одних н тех же быков

Так как, штаммы синегнойной палочки сильно варьируют как - по величине продукции факторов патогенности, так и по степени вирулентности, нами было изучено влияние на показатель абсолютной живучести спермнев быка искусственной <1 * I05 микробных тел/мл разбавленной спермы) контаминации спермы штаммами синегнойной палочки, продуцирующими факторы патогенности и обладающими высокой вирулентностью in vivo. В качестве экзотоксин-А образующего штамма использовали эталлонный штамм РА-103, штаммы, обладающие высокой протеазной (1:32) и эластазной (1:16) активностью, а также имеющие

- -

* ДИ,вд соотпстственно - 44.51 в 115.8 млн были подучены нами

из семени быков-производите.**. Б ходе этих исследований также не $ило обнаружено как.ои-л*6о «ажясммпсти между показателем абсолютной жяиучести жк«чнкоэ а контаминации семени данными штаммами Ра. аеш^по». ^

Таким образом, результаты данных исследований показали, что контаминация семени бы к(ж-производи«*« штаммами си негной ной палочки независимо ни от степени вирулентности, ни от синтеза ими факторов патегенноои не оказывает отрицательного влияния ча выживаемость живчиков вне организма.

Определение возможного вдаижаействия вторичных иммуннодефици-тоа у самок И штаммов Га. аешб'т105а в возникновении пренатальных потерь.

Известно, что СМФ (и факторы ею синтезируемые) являются ведушей системой защиты организма от синешойной инфекции, помимо этого антигенпрезентируютие клетки (входящие в эту сисгему) являются ключевыми в индукции специфического иммунного ответа. В связи с этим в данных исследованиях использовали разработанную нами

модель блокады СМФ харбо новыми частицами у самок, осемененных семенем производителей искусственно к онта минированным штаммом РА-ЮЗ. Выбор этого штамма был обусловлен, во-первых тем, что он является су перп роду центом экзотоксина-А. Во-вторых, ею цитотоксическое действие связано с нарушением белкового синтеза, который крайне ограничен в семени и черезвычайно высок в эмбриогенезе. Следовательно, вполне вероятно, что штаммы, обрузующие экзотоксин-А, и не снижающие выживаемость живчиков вне организма, могут вызывать раннюю гибель зародышей. Результаты эшх исследований представлена в таблице б.

Как видно из данных, представленных в таблице 6, не произошло снижения пренатальиой выживаемости у самок (с нормальной активностью иммунной системы), осемененных спермой дополнительно контаминированной штаммом РА-ЮЗ. В тоже время экспериментально вызванный иммунодефицит вызвал практически одинаковое снижение пренатальиой выживаемости как у самок, осемененных спермой искусственно контаминированной синегнойной палочкой» так и без это! контаминации (Р < 0.01). Не установлено корреляции между эмбриональными потерями л количеством микробных гел в сперме самцов.

- Из смывов маток крольчих контрольной и опытной групп, а также и» «сгенерированных зародышей в мест их имплантации микроорганизмы (в том числе и конта минировавшие сперму) не были выделены. .

Таблица 6.

Эмбриональные потери и их предотвращение у самок с экспериментально вызванным иммунодефицитом и осемененных семенем, контамиккрованным штаммом РА-103.

Введено ми- Число Иммуноиодул [ЦИЯ Мест Живых потомков

кровных тел самок Блокада Иммуниза- Обработка им- Эмбрионов Кот ьчат

(мл семени) СМФ ция лейкоцитами левамизолом плантации Всего % Всего на самку %. к контролю

Контроль (без контаминации) 4/6*^ _ _ _ 29 28 96.6 ±3.4 43 7.2 100.0

Контроль (без контамншцин) 4/5 + - — 35 24 68.7 ± 9.7 * 19 4.8 66.6 ± (0.6*

1 • I05 4/5 - - - 33 33 100.0 37 7.4 100.0

1 *Ю5 4/5 + - - 28 19 67.9 ± 8.8 * 23 4.6 63.8 ± 10.0 *

1 • 10J 4/6 + + - 28 28 100.0 43 7.2 100.0

1 * 10* 5/5 - - - 30 30 100.0 35 7.0 97.2 ± 2,8 *

1 »10* 4/5 + - - 29 19 65.5 ± 8,8 * 21 4.2 58.3 ± 10.7**

1 »106 4/7 + + - 30 30 100.0 51 7.2 100.0

I *106 5/5 + - + 34 34 100.0 35 7.0 97.2 ± 2.8

- в числителе число вскрытых самок, в знаменателе число окролившихся самок; * - Р < 0.01; " - Р < 0.05

< )ñp,¡*nji к;; с^мок с блокадой СМФ К мчу иостн чу.i s тороч - леиамитточ > либо имчутшпив и* лейкоцитами самцов доноров спермы полностью шччгтан^пнлл iipeis.na.'iMiy)" выживаемость до уровня контроля.

T.ikum o(íp.¡:to4, эти результат м показали, что у самок с ;>хс-иерчмешально cw мелирован им мн иммунодефицита ми и осемененных сяир-Míiit «си уестпенmi к он та ми н и роил иной вирулентными штаммами (.-икс! помнет ма.ючкн снижение премиальной »мживаемпет» обусловлено иенифеинжчпшчн причинами. Так как восстановление эмбриональном пи-хшшемедт» 11|>он.1о1нло и результате иммунизации самок антигенам и. иж'юштщ oTiimic дечерчинантм с антигенами пчбрнонов, можно c.ie.uns, пы!юл. что ;>то снижение премиальной выживаемости у самок с «ч-\|унолеф»11Чтами произошло ^следствии нарушения иммунных взаимоотношении в системе "само-зародыш", а именно в редельтате подавлен ия имму нотрофического деистння материнской иммунной системы.

Полученный в .»том модельном эксперименте вывод об отсутствии отрицательного влияния на результативность осемснени-я самок семенем, кпнтлминнрованным штаммами сине гной ной на.точки, был изучен нами в . научно-производственном эксперименте, проведенном к зоне деятельности ЦСИО сельскохозяйственных животных. Для этик исследовании были отобраны данные за 1988 год по результативности осеменения коров и телок спермой быков с контаминацией се услон-нопатогениыми микроорганизмами. За контроль была взята результативность осеменения этими же быками в 1987 году (когда сперму конта минированную условнопатогеннымн микроорганизмами полностью выбраковывали). Результаты анализа представлены в таблице 7

Как видно из данных, представленных в таблице 7, естественная контаминация спермы быков как штаммами Сикегнойной палочки, так и Proieus 5р., а также их ассоциация не только не оказала отрицательного влияния на результативность осеменение крупного рогатого скота, но лаже повысила ее на статистически недостоверную величину, ко близкую к критической.

Не было обнаружено также никакой зависимости между результативностью осеменения коров и телок и естественной контаминацией семени производителей штаммами синегнойной палочки, с различной сте пению вирулентности и синтезом факторов патогенности. Отсутствие такой зависимости было установлено нами и в другом эксперименте с осеменением крупного рогатого скота семенем, искусственно контамини-рованным штаммом РА-103 (суперпрояуиентом экзотоксина-л ). Всего в этом опыте было использовано 224 животных. Стельность от первого осеменение н доля абортированных животных в контроле и опыте со-

ставила соответственно 75.7 * 4.1 2.7 V

■1.5

56

и 78.8 * 3.9 V Тлол»на 7

Результативность осеменения крупнот рогатого скота спермой с естественной контамииапнеп ее штаммы у слов копатогснных мик роорган и з мов.

; Чисто ; быков (

Контаминация

; Осеменение ¡животных

См и стопном палочкой Без контаминации

78 Протеем

Без контаминации

27 ;Протеем и синегной-'ной папочкой ¡Без контаминации

1

47 Без контаминации \ (1988 г.) Без контаминации (1987 г.)

Число повтор- ¡Рслультатив-гны\ осеменсии и ость оссмс-нения в пер-в\мч о\оп'

123484 174462

184433 :о8<ш

62535 77683

86914

113052

42631 60836

62225 70757

21607 27858

28795 37259

бь.2 - 1.0 63 .6 г 1.3

65.8 ± 1.0

62.9 ± 1.3

67. ( ± 1.7 62.Ь ± 2.2

65.1 г 1.0 64.3 * 1.3

Таким образом, результаты научно-производственных экспериментов также показали, что ни естественная, ни искусственная контаминация семени быков-производителей штаммами синегнойной палочки (независимо от степени вирулентности или синтеза факторов патогенно-стн) не оказывает отрицательного влияния на результативность осеменения коров и телок.

Вывозы

1. Сформулировано новое теоретическое положение о том, что для нормального пре катального развития необходим иммунный ответ самки на антигены эмбриона отцовского гаплотипа, проявляющийся не в формировании реакций отторжения, а в становлении иммунотрофи ческой функция по отношению к зародышу.

2. Экспериментальное угнетение иммунной системы самки посредством блокады СМФ, либо конкуренции антигенов или обработки пред-визолоном на ранних стадиях аллогенной беременности вызывает

снижение -t4t*pmMi;i.n>m»i выживаемости в период имплантации,

3. )чЛрношлм1ме потери, вызванные введением синтетического глткокортиьостертш - пред низа! о на, обусловлены не прямым эмбрио-тксичоским действием этого гормона, а нарушением иммунотрпфическот в.шимодействи« . в системе "самка-зародыш".

4. Восстановление прснаталмюй выживаемости у аллогенно-*. - беременных самок с экспериментальным нарушением имму нот рофи ческой функции достигается доцол нителыюй сенсибилизацией их не только лейкоцитами сям поп доноров - спермы, но и иммунизацией' их как собственно снсрмиямн, так и плазмой спермы.

5. При сингепшш беремепости также существует иммунотрофичс-ское взаимодействие в системе "сам ка-зародыш", поскольку, несмотря i;a совпадение TLX антигенов у самца и самки при сингенном их спаривании экспериментальное угнетение иммунной системы у самок в первые сутки после оплодотворения снижает пренатальную выживаемость в прели мплантационный период.

6. Адоптивный перенос сингенно-беременным самкам с индуцированной конкуренцией антигенов спеленоцитов от ннтактнык беременных самок, либо самок, иммунизированных спермиями сингенных самцов, предупреждает снижение эмбриональной выживаемости.

7. Критическим периодом становления иммунных взва и moot hoi леи ни в "системе самка" зародыш, как у аллогенно-, так и си н ген нос паренных самок, являются первые сутки после оплодотворения, так как этот период пренатального развития наиболее чувствителен к иммуно-депрессивному действию.

8. Антигены ранних эмбрионов являются вторичными индукторами становления необходимой для нормального пренатального развития имму-нотрофической функции организма самки. Первичными' индукторами этого процесса являются антигены спермиев, имеющие общие детерминанты с антигенами зародышей.

9. Установлено новое научное направление в разработке способов повышения пренатальной выживаемости у самок посредством обработки их иммуномодул вторами.

10. Иммуномодуляторы, вызывающие отмену иммунологической толерантности, обусловленную активацией клеток-супрессоров. не только не оказывают отрицательного влияния на эмбриогенез у самок с кнтакт-ной иммунной системой, но и предупреждают пренатальные потери у самок с угнетенной иммунотрофической функцией.

11. Установлено новое' теоретическое положение о наличие у спермнев быков-производителей н в тканях половых путей коров н

телок тканевоспеиифического конституционального иммунитета по отношению к штаммам с и негнои ной палочки.

12. У самок с угнетенной иммунном системой снижение эмбриональной выживаемости обусловлено не действием штаммов синегнойной палочки, контаминнруюших сперму быков-производителей а нарушением иммунных взаимоотношений в системе "сам ка-за род htm".

13. Среди быков-производителен наиболее распространены пнопио-нинобразующие штаммы си негной нон палочки 03 серотппа. обладающие высокой степенью вирулентностн в ЛД;о и синтезирующие факторы па-тогенности: экзотокспн-А, протеазу и эластазу. Эти штаммы также обладают высокой резистентностью к антимикробным препаратам, используемым как для санации спермы, так и для лечения животных.

14. Контаминация спермы быков-пронзводнтелен штаммами Ps, aeruginosa не зависимо от степени их вирулентности н наличия у них факторов патогениости: экзотксина А. протеазы и оластазы не оказывают отрицательного влияния на биологические пока.кнели слермиев как in vivo, так и in vitro.

Практические предложения.

Материалы диссертации были использованы при разработке стеду-юших нормативных документов; 1, Изменения N I ГОСТ 26030-83 "Сперма быков замороженная. Технические условия", введенное и действие 01.11.87 г.: 2. Изменение N 1 ГОСТ 23745-79 "Сперма быков неразбавленная, свежеполученная" и Изменение N 2 ГОСТ 26030-83 'Сперма быков замороженная.'' Технические условия", согласованных 09.04,91 >. с Госплем инспекцией Главного управления государственных инспекций и ГУВ Государственной комиссии по продовольствию и закупкам при Совмине СССР. 3. "Ветеринарно -санитарных правил для племпредпрнвтнй (станций) и пунктов искусственного осеменения сельскохозяйственных животных*, утвержденных ГУВ Государственной комиссии по продовольствию и закупкам при Совмине СССР 29.12.90г.

Разработаны -экспериментальные модели для изучения роли иммунной системы самки в нормальном и нарушенном пренатальном развитии, а также модели для выяснения возможного взаимодействия вторичных иммунодефиците и штаммов условяолатогенных и патогенных микроорганизмов в возникновении эмбриональных потерь, которые вошли в "Методические рекомендации по иммунологии воспроизведения", утвержденные и рекомендованные к изданию Ученым советом ВИЖа от 04.11.83г., Дубровины, 1985г.

Перечень основных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Соколовская И.И., Бронская А. В., Радченков В.П. Эмбриональная выживаемость в связи с изменением иммунных реакций.// Доклады ВАСХНИЛ, 1983, N 4, с. 29-31.

2. Radchenkov V.P., Sokolovskaya I.I., Bronskaya A.V. The prenatal liviaWlity at the females treatment with mate's inmuno^en in combination wiih MPS bloking.// J. Reprod. Immunol., 1983, v, Suppl., p, 73.

3. Соколовская И.И., Радченков В.П., Бронская А'.В. Зависимость пренатальной выживаемости от состояния иммунной системы самки.//Вестник с.-х. науки, 1984, N 2, с. 87-91.

4. Соколовская И.И., Радченков В,П., Бронская А.В, Активация иммунной системы самки как фактор предотвращения эмбриональной смертности.//Доклады ВАСХНИЛ, 1984, N 7. с. 22-23.

5. Radchenkov V.P.. Sokolovskaya 1.1., Bronskaya A.V. Influence of aniigen competition on prenatal liviability.// AJRIM, 1985, v, 7, p.79.

6. Radchenkov V.P., Sokolovskaya 1.1., Bronskaya A.V. Influence of aniigen competiiion on prenanal liviability.// AJRIM, 1985, v,7, p.79.

7. Радченков В. П., Бронская А.В.,' Соколовская И.И. Повышение пренатальной выживаемости путем разобщения конкуренции антигенов,// Доклады ВАСХНИЛ. 1986, N. 11, с. 31-32.

8. Радченков В.П., Мороз А.Ф., Радкевич С.А., Веткова Л.Г. Стоянов В.К. Биологические особенности штаммов Ps. aeruginosa, выделенных из спермы быков-производителей.// С.-х биология, 1986, N 11, с. 81-83.

9. Радченков В.П., Радкевич С.А., Литвинов Н.С., Мороз А.Ф. Оценка эти атонической роли си негной ной палочки в пренатальных потерях у крупного рогатого скота,// С.-х. биология, N 1, с. 91 -96.

10. Радченков В.П., Бронская А.В. Зависимость пренатальной выживаемости от активности неспецифических клеток-угнетателей. // Тезисы 3-его Всесоюз. симп. по иммунол. репрод. с междунар. участием, Киев, 1987, с. 64.

11. Sokolovskaya I.I., Radchenkov V.P., Bronskaya A.V, The prevention of prenatal losses arising after prednisolon injection.// AJRIM, 1988, v. 16, N 2, p. 79.

12. Radchenkov V.P., Sokolovskaya I.I., Bronskaya A.V. The restabllshment of prenatal liviability after MFS-inhibition in rabbit pregnancy.// AJRIM, 1988, v. 16, N 2, p. 72.

13. Радченков В.П., Радкевич СЛ., Мороз Л.Ф. Влияние услов-

f

копатогенной микрофлоры на воспроизводительную функцию животных.// Зоотехния, 1988. N 11, с. 55-57.

.14. Соколовская И.И., Вронская Л,В., Радченков В.П. Предотвращение пренатальной смертности, вызванной глюкокортикостерондом, у самок при введении левамизола.// Доклады В AC X НИ Л, N 4, с. 33-35.

15. Bronskaya A.V., Radchenkov V.P.. Sokolovskaya 1.1. Е-RFC number at noma! and disturbed pregnancy.// AJRIM, v, 16. p. 77.

16. Sokolovskaya 1.1., Radchenkov V.P,, Bronskaya A.V., Machorskaya l.V. Prevention by leva mi sol inhibition of E-RFC aciiviiv and increasing of embryos death provoked with prednisolon injection.// J, Reprod. Immunol.. 1989. v. Suppl., p. 246.

17. Radchenkov V.P. Non- specific suppressor cells as the cause of the syngeneic pregnancy abortion.// Abst. First. Inter. Fonim fc^prod. Immunol., Magdeburg. 1990, p. 35.

18. - Bronskaya A.V., Radchenkov V.P., Ропота re vn l.V. Immune regulation embrios liviability,// Abst. First Fomm Reprod. Immunol.. Magdeburg. 1990. p. 35.

19. Радчеиков В.П., Радкевич С.А., Вегкова Л.Г., Мороз А.Ф. Иммунодефицит и контаминация спермы синегнойной палочки в прена-тальных потерях.// Вестник с.-х. науки, 1990, N2, с 97-99.

20. Листунов А.Д., Радченков В.П., Радкевич С.А., Александров А.Д., Мороз А.Ф. Использование спермы бы ков-производителей, контами-ниро ванной условнопатогенными микроорганизмами.// Зоотехния, 1990. N 9, с. 61-64.

21. Вронская А.В.. Радченков В.П., Пономарева И,В., Соколовская И.И Эмбриогенез при угнетении материнской иммунной систе-мьг.//Тезисы 4-го Всесоюз. симп. по . иммунол. репрод. с межднар. участием, Киев, 1990, с. 236.

22. Радченков В. П. Неспецифические супрессоры как причина нарушения сннгениой беременности.//Тезисы 4-го Всесоюзн. симп. по иммунол. репрод. с между на р. участием, Киев, 1990, с. 190.

23. Радченков В. П. Роль антигенов плазмы спермы в нормальном и нарушенном пренатальном развитии.// Доклады ВАСХНИЛ, 1991, N 10, с. 49-50

24. Радченков В. П., Литвинов Н.С. Угнетение иммунной системы самок как причина нарушения имплантации скнгенного зародыша.// С,-х. биология, 1991, N 6, с. 134-138.

25. Radchenkov V.P. Spermatozoa as inductors of immunotrophical action of maternal immune system at syngeneic pregnancy.// J. Immunol., Immunophannacol1992, v. 12, N 12, p. 131.

ГТмпвсан» к печати I9.II.I99Ï г. Заказ SI4,

Тярмс 75 экз. Обг«|г 1,2 уч.-изд. я.

ГШП ВИТа