Автореферат и диссертация по медицине (14.00.32) на тему:Влияние клиностатирования на начальные стадии дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши in vitro

На правах рукописи

КОНСТАНТИНОВА НАТАЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ВЛИЯНИЕ КЛИНОСТАТИРОВАНИЯ НА НАЧАЛЬНЫЕ СТАДИИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК МЫШИ IN VITRO

14.00.32 - авиационная, космическая и морская медицина 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 ОКТ 2008

Москва-2008

003448310

Работа выполнена в Государственном научном центре Российской Федерации -Институте медико-биологических проблем Российской академии наук (ГНЦ РФ -ИМБП РАН) и Институте молекулярной генетики Российской академии наук (ИМГ РАН)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Буравкова Людмила Борисовна, доктор биологических наук, профессор Гривенников Игорь Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Гаврнлюк Борис Карпович доктор медицинских наук, профессор Ильин Евгений Александрович

Ведущая организация:

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук

Защита состоится « »_У/_2008 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 002.111.01 в Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской академии наук (ГНЦ РФ - ИМБП РАН) по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76-а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ - ИМБП РАН Автореферат разослан «_____»_2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Эволюционные процессы на Земле осуществляются при постоянном участии гравитационного поля. Гравитация определяет нормальное развитие, морфологию и функционирование всех живых организмов в мире. В течение длительного периода эволюции жизни на планете все организмы приспосабливались к гравитационным условиям, начиная от становления структуры и функции отдельных органов, тканей и кончая целым организмом.

Исследования влияния факторов космического полета, в том числе микрогравитации, на процессы развития, дифференцировки и регенерации живых организмов, проводившиеся с начала освоения космического пространства [Мелехова О.П. и др., 1976; Сушков Ф.В. и др., 1979; Оганесян С.С. и др., 1980; Мелешко Г.И., 1991; Гурьева Т.С. и др., 1993; Mitashov V.I. et al., 1996; Black S.B. et al., 1996; De Maziere A. et al, 1996; Grigoryan E., et al, 2006], не потеряли свою актуальность до настоящего времени, поскольку до сих пор не установлен вклад гравитационного фактора в механизмы становления живых систем.

Использование различных биологических моделей позволило выяснить ряд важных закономерностей, в том числе возможность нормального развития биообъектов при создании адекватных условий их существования в космическом полете [Сычев В.Н., 2000; Серова Л.В., 2002; Mitashov V.I. et al., 1996; Almeida E.A.C. et al, 2006; Grigoryan E., et al, 2006]. Однако исследования в космическом полете и при моделировании некоторых эффектов микрогравитации на Земле свидетельствуют о том, что нет живых систем, развитие которых бы не менялось в этих условиях. Однако изменения на клеточном уровне, происходящие в условиях как реальной, так и моделированной микрогравитации, не позволяют в настоящее время сформулировать общие закономерности этого воздействия. Поэтому вопрос о влиянии гравитации на клетку и механизмах развивающихся эффектов весьма актуален. Существует мнение, что чувствительность к изменению силы тяжести зависит от размеров биообъекта: чем он меньше, тем меньшее влияние гравитации стоит ожидать. Утверждается также, что на живые организмы оказывает влияние не сила тяжести, а среда, в которой находится организм, поэтому зачастую изменение силы тяжести существенно не влияет на

рост и морфологию клеток в культуре [Парфенов Г.П., 1988], однако встречаются и обратимые клеточные реакции на гравитационное возмущение.

Ранее было показано, что микрогравитация меняет морфо-функциональное состояние клеток in vitro, их пролиферативную активность, экспрессию генов и другие внутриклеточные процессы. Особенно выражены эти эффекты у механочувствительных дифференцированных клеток, таких как остеоциты, фибробласты, миоциты, эндотелиальные клетки [Таирбеков М.Г., 1997; 2000; Романов Ю.А., Буравкова Л.Б. и др., 2000, 2001;. Crawford-Young S.J., 2006]. В последнее время получены результаты, свидетельствующие о влиянии клиностатирования на мезенхимальные клетки-предшественники, выделенные из костного мозга человека, и предшественники остеобластов [Buravkova L.B. et al, 2004; Facer S. R, 2005; Meyers V.E. et al, 2004].

Вопрос о том, может ли гравитационный фактор влиять на клетки находящиеся на самых ранних этапах развития и дифференцировки, а именно на эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) млекопитающих, остается открытым. Эти клетки характеризуются несколькими весьма важными свойствами: неограниченной способностью к пролиферации при сохранении нормального кариотипа и возможностью дифференцироваться во все известные виды клеток организма [Evans M.J., 1981; Guan К. et al., 1998; Keller G., 2005]. Поэтому ЭСК и сформированные ими эмбриоидные тела (ЭТ) служат адекватной моделью для изучения механизмов, регулирующих начальные стадии как спонтанной, так и индуцированной различными воздействиями дифференцировки клеток.

Цель работы. Целью настоящей работы явилось исследование эффектов клиностатирования на начальные стадии дифференцировки эмбриональных стволовых клеток in vitro. Задачи исследований.

1. Отработать экспериментальную модель для клиностатирования культивируемых ЭСК мыши на различных субстратах.

2. Оценить динамику образования колоний ЭСК мыши при клиностатировании.

3. Исследовать жизнеспособность ЭСК мыши и их способность образовывать ЭТ после моделирования эффектов гипогравитации.

4. Изучить морфологические изменения ЭСК на начальной стадии дифференцировки (стадия ЭТ) при воздействии клиностатирования.

5. Оценить способность ЭСК к последующей спонтанной дифференцировке после воздействия клиностатирования.

Научная новизна. Впервые установлено, что in vitro ЭСК мыши могут сохранять свои морфо-функциональные свойства в условиях моделирования гравитационных изменений. Показано, что чувствительность ЭСК к клиностатированию возрастает в зависимости от стадий развития клеток: от колоний ЭСК до сформированных ЭТ. Впервые показано, что клиностатирование ЭТ приводит как к запаздыванию начала кардиомиоцитарной дифференцировки, так и к существенному уменьшению количества сокращающихся кардиомиоцитов. Продемонстрировано, что рандомизация вектора гравитации приводит к стимулированию образования клеток ранних стадий нейрональной дифференцировки и незначительному снижению их количества на поздних стадиях.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные вносят существенный вклад в понимание процессов роста и дифференцировки ЭСК в условиях моделирования эффектов гипогравитации. Создана и успешно апробирована экспериментальная модель, включающая как ЭСК, так и эмбриоидные тела, позволяющая исследовать влияние клиностатирования на начальные этапы эмбрионального развития млекопитающих in vitro. Положения, выносимые на защиту.

1. Оценка двух способов культивирования ЭСК мыши линии R1 в условиях клиностатирования выявила большую эффективность использования в качестве подложки эмбриональных фибробластов мыши, позволяющей осуществлять длительное моделирование эффектов гипогравитации.

2. Моделирование эффектов гипогравитации не выявило изменений колониеобразования, при сохранении последующей жизнеспособности и нормального образования ЭТ недифференцированными ЭСК мыши линии R1.

3. Клиностатирование эмбриоидных тел in vitro приводит к замедлению спонтанной дифференцировки в кардиомиоциты, при этом происходило существенное увеличение количества ß-III тубулин - положительных клеток и незначительное уменьшение количества МАР2-положительных клеток.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VI Международной конференции по молекулярной генетике соматических клеток (Звенигород, 2005); Конференциях молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2005, 2006, 2007 гг.); XIII Конференции по космической биологии и авиакосмической медицине (Москва, 2006 г.); 27-м, 28-м Международных симпозиумах по гравитационной физиологии (Осака, Япония, 2006 г; Сан-Антонио, Техас, США, 2007 г.); Школе-конференции для молодых ученых «Методы культивирования клеток» (С-Петербург, 2008 г.).

Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ -ИМБП РАН «Космическая биология и физиология» (протокол № 5 от 03.06.08 г).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследований с обсуждением, выводов, заключения, списка литературы. В диссертации приведены 8 таблиц и 38 рисунков. Список использованной литературы содержит 63 отечественных и 116 зарубежных источника.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы исследований

Клиностатирование культивируемых ЭСК мыши. Известно, что с помощью горизонтального клиностата можно моделировать некоторые клточные эффекты микрогравитации [Moore D., 1996; Jack J.W.A. van Loon, 2007; 2007а]. ЭСК на подложке из инактивированных митомицином С (5 мкл/мл) эмбриональных фибробластов подвергали действию клиностатирования (6 об/мин, 72 ч). Для постоянного перемешивания среды культивирования использовали горизонтальный шейкер (60 об/мин) - динамический контроль. Культивирование ЭСК (15-33 пассажи, 150-200 тыс. клеток) осуществляли в СОг-инкубаторе («Sanyo», Япония) при температуре 37° С и 5 % С02 на флаконах 25 см2 в среде а-

6

MEM («ICN», США), содержащей 15 % охарактеризованной фетальной сыворотки коровы (FBS) («Hyclon», США) и все необходимые добавки.

Методика клиностатирования колоний ЭСК с добавлением фактора, ингибирующего лейкемию (LIF) была аналогична, но клетки помещались в условия клиностатирования спустя 24 ч после посева на флаконы (80 тыс. клеток на желатиновой подложке), экспозиция - 48 ч.

Анализ изображения. Для анализа образования колоний ЭСК в ходе клиностатирования (72 ч) осуществляли фотосъемку (каждые 24 ч) стационарных полей наблюдения (по 6 в каждом флаконе) на инвертированном микроскопе («Zeiss», Axiovert 25, Германия) с увеличением объектива х10 при помощи цифровой фотокамеры («Mintron», Тайвань). Количественный анализ сфотографированных колоний, а также их морфометрия (площадь, периметр, максимальный и минимальный диаметр) были проведены с помощью компьютерной программы SigmaScan Pro5 («Sigma», США).

Оценка жизнеспособности. Для оценки жизнеспособности и способности образовывать ЭТ клетки после клиностатирования высевали на чашки Петри (диаметр 35 мм, 80 тысяч клеток) в среде а-МЕМ с фактором, ингибирующем лейкемию (LIF) (20 мкл/мл) для последующего образования колоний и по 200 тысяч клеток в той же среде, но без добавления LIF - на чашки для определения количества образующихся ЭТ. Спустя 3-4 сутки после посева клеток производили подсчет колоний (7 произвольных полей зрения (хЮО) и образовавшихся ЭТ (суспензия 5 мкл, 5 полей).

Клиностатирование ЭТ. ЭТ культивировали в условиях клиностатирования (72 ч), пассируя 600 тел в культуральных флаконах 25 см2, в среде а-МЕМ («ICN», США), содержащей все необходимые добавки. Условия клиностатирования ЭТ не отличались от условий, которые были описаны для культивирования ЭСК на стадии колоний

Дифференцировка ЭСК. Исследование последующей дифференцировки клеток in vitro в кардиомиоциты проводили после 72 ч клиностатирования ЭТ методом регистрации появления сокращающихся кластеров. Подсчет образованных сокращающихся кластеров осуществляли каждые 24 ч при помощи микроскопа и цифровой видео камеры; делая видеозапись сокращений.

Исследование влияния клиностатирования на последующую нейрональную дифференцировку клеток in vitro производили следующим образом. ЭСК линии R1 (21-25 пассажи) в количестве 100-200 тыс. клеток пассировали на флакон (9,1 см2). Образованные ЭТ подвергались клиностатированию (48 ч) и впоследствии с каждого флакона (опыт, статический и динамический контроли) высевали на 4-х луночные планшеты (8 ЭТ на каждую лунку). Спустя 18 дней проводили иммуноцитохимическое окрашивание антителами против соответствующих нейрональных антигенов.

Анализ морфологии ЭТ. Влияние клиностатирования на морфологию ЭТ проводили с использованием полутонких срезов (толщина 1-2 мкм) ЭТ. Исследование срезов ЭТ было выполнено в Институте морфологии человека РАН совместно с к.м.н. Черниковым В.П. и на Факультете фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова совместно с д.м.н. Буравковым C.B. ЭТ фиксировали глутаровым альдегидом (2,5 %), осуществляли последовательные операции

центрифугирования и обезвоживания для получения клеточного осадка, из которого впоследствии при помощи ультрамикротома («Nova», LKB, Швеция) готовили полутонкие срезы. Полученные образцы помещались на предметное стекло и окрашивались метиленовым синим с азуром 2 + фуксином. Затем фотографии полутонких срезов анализировали и подсчитывали количество апоптотических клеток и площади образованных полостей.

Статистическая обработка результатов. Обработку результатов колониеобразования, образования сокращающихся кластеров кардиомиоцитов и нейронов, а также подсчет апоптотических клеток и полостей внутри ЭТ проводили на основе стандартного пакета статистических программ «Statistica 7.0» для WinXP с использованием непараметрических методов распределения сравнения данных (критерий Крускола-Уолисса и Данна), сравнение двух независимых между собой групп (критерий Манна-Уитни) и метода оценки достоверности сдвига в значениях исследуемого признака (критерий Фридмана).

Результаты и обсуждение

Влияние клиностатирования па образование колоний и морфологию эмбриональных стволовых клеток мыши линии R1, культивируемых на подложке из эмбриональных фибробластов мыши

Развитие технологии культивирования ЭСК in vitro позволяет использовать эту уникальную модель для анализа гравитационных эффектов на клеточные механизмы начальных стадий эмбрионального развития. Поскольку ЭСК обладают неограниченной пролиферативной активностью, находясь в недифференцированном состоянии [Evans M.J., 1981; Guan К. et al., 1998], было важно оценить пролиферацию, а также морфологию колоний при измененных условиях гравитационного стимула. Кроме того, необходимо было сравнить эффективность использования фидера или L1F при клиностатировании для поддержания клеток в недифференцированном состоянии.

Рис. 1. Культура ЭСК на подложке из эмбриональных фибробластов мыши через 72 ч клиностатирования (увелич. хЮО): А) сК-статический контроль; б) дК-динамический контроль; в) клиностат.

Было проведено 5 серий исследований по клиностатированию ЭСК в течение 72 ч на подложке из эмбриональных фибробластов. Анализ экспериментальных образцов показал, что ЭСК активно образовывали колонии вплоть до 72-х ч клиностатирования. Необходимо отметить, что в опыте колонии имели более четкие границы по сравнению с контролями (рис. 1).

Для оценки морфологических характеристик была проведена морфометрия площади, периметра, максимального и минимального диаметров колоний с использованием компьютерной программы SigmaScan Рго5. Затем колонии были разделены по размерам: малые - 400-1081 мкм2 (I группа), средние - 1082-2442 мкм2 (II группа), большие - 2443-5163 мкм2 (III группа). Выявлено, что в первые сутки клиностатирования колонии характеризовались меньшими размерами по сравнению с сК и дК, однако к концу эксперимента (72 ч) видимых различий по размерам колоний ЭСК во всех трех образцах не было обнаружено (рис. 2).

Некоторое отставание пролиферативной активности ЭСК в первые часы клиностатирования сменилось увеличением количества клеток в разных колониях после «адаптации» к измененным условиям культивирования. Возможно, здесь имело место увеличение времени цикла клеточного деления у ЭСК в условиях клиностатирования.

Количественный анализ числа колоний позволил установить, что наибольшая пролиферативная активность клеток всех образцов наблюдалась между первыми и вторыми сутками экспериментального воздействия (рис. 3). К 48-му ч клиностатирования образование колоний в опыте было снижено по сравнению с серией дК, но уже спустя сутки (к 72-му ч) количество колоний ЭСК в опыте приблизилось к серии дК, и почти в 2 раза было выше, чем в серии сК.

Постоянное перемешивание среды в данном случае также можно рассматривать, как дополнительный фактор воздействия на клетку. Видно, что в серии дК происходило увеличение колониеобразования по сравнению со статическим контролем, однако другие параметры колоний, их суммарные размеры в контролях существенно не отличались. Достоверных различий между экспериментальными сериями (клиностатируемые клетки, сК, дК) не выявлено (р<0,2, по критерию Крускала-Уоллиса).

сК опыт дК сК опыт дК сК опыт дК

Н 1 Р

т

время клиностатирования, ч

□ I группа (малые) ПН группа (средние) Hill группа (большие)

r£

_ПсК □опыт ВАК Ц

----- "

^fl

Время клиностатитрования

Рис. 2. Динамика распределения колонии ЭСК мыши по площадям при клиностатировании (72 ч).

Рис. 3. Образование колоний ЭСК в ходе клиностатирования (72 ч). Для каждого образца исследовано 6 полей зрения (1,5 мм").

Полученные нами результаты по оценке пролиферативной активности вполне согласуются с данными, описанными в литературе, где не было выявлено достоверных изменений пролиферации различных эмбриональных клеток [Жуков-Вережников и др., 1963; 1971; Montgomery РО'В, 1978; Lorenzi G. et. at., 1993; Gaubin Y. et. al., 1991]. Отсутствие влияния клиностатирования на пролиферацию культивируемых ЭСК мыши, возможно, объясняется тем, что клетки, находящиеся на самой ранней стадии развития, менее подвержены действию механического стресса. Однако стоит отметить, что нахождение ЭСК мыши под постоянным ламинарным потоком может влиять на состояние хроматина ЭСК и вызывать дифференцировку в предшественники кардиомиоцитов [Barbara I. et al, 2005].

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что культивирование ЭСК в условиях клиностатирования не приводило к выраженным изменениям колониеобразования ЭСК мыши in vitro, а постоянное перемешивание среды культивирование как дополнительный фактор воздействия, вызывал стимуляцию колониеобразования ЭСК мыши по сравнению со статическим контролем.

Влияние клиностатирования на образование колоний эмбриональных стволовых клеток мыши линии R1, культивируемых в присутствии фактора LIF.

Оценку образования колоний ЭСК в присутствии LIF в условиях

10

клиностатирования проводили аналогично экспериментам с использованием «фидера». При этом культивирование клеток осуществляли как на флаконах, так и на чашках Петри (на желатиновой подложке) в течение 48 ч. Показано, что через 24 ч клиностатирования количество колоний ЭСК, наблюдаемое в фиксированных полях зрения, снижалось по сравнению с контролем. Возможно, колонии ЭСК при наличии в среде культивирования ЫР в опыте откреплялись от поверхности из-за снижения адгезии (рис. 4). На протяжении всего эксперимента количество колоний ЭСК было достоверно ниже в опыте по сравнению с контролем (р<0,05 по критерию Манна-Уитни) (рис.5). Дополнительное использование желатиновой подложки на чашках Петри привело к увеличению размеров колоний в опыте, что не наблюдалось при клиностатировании ЭСК во флаконах на желатиновой подложке с добавлением ЬШ (рис. 6). При подсчете колоний клеток, посеянных на чашках Петри с добавлением ИР, показано статистически незначимое их снижение в опыте по сравнению с контролем (рис. 7). Таким образом, в условиях клиностатирования подложка из эмбриональных фибробластов мыши способствует пролиферации ЭСК, по-видимому, за счет выделяемых факторов роста, а также увеличения межклеточных контактов и адгезии двух типов культивируемых клеток. Полученные результаты показывают, что в экспериментах с клиностатированием ЭСК мыши предпочтительнее использовать «фидерную» подложку, а не ЫР, для сохранения не,

Рис.4.Колонии ЭСК, культивированные с добавлением ЫР (увелич. хЮО): а - контроль; б - опыт (клиностатирование 48 ч)

ю

Рис. 5. Число колоний ЭСК при культивировании па флаконах в присутствинЬШ

□ опыт При клиностатировании (48 ч). иск_ Исследовано 6 полей зрения

для каждого образца (1,5 мм2).

* - отличие между

опытом и контролем, р<0,05

24 ч

48 ч

срок клиностатировния, ч

(увелич. xlOO): а - контроль; б - опыт (48 ч) h (чашки Петри).

Рис. 6. Культура ЭСК, культивированная с добавлением LIF

Рис.7. Число колоний ЭСК при культивировании на чашках Петри в присутствии ЬШ в ходе клиностатирования (48 ч). Исследовано 6 полей зрения для каждого образца (1,5 мм2).

24 h

48 h

срок клиностатирования, ч

Оценка жизнеспособности клеток и образование эмбриоидных тел после действия клиностатирования.

Оценку жизнеспособности ЭСК и их способность образовывать ЭТ проводили в период после воздействия клиностатирования (72 ч) в последующих пассажах ЭСК (рис. 8, рис. 9, табл. 1). Образование ЭТ отражает вступление клеток на начальные стадии дифференцировки, которые могут изменяться под действием различных физических, химических и биологических факторов [Wobus A.M. et al. 1991; Strubing С. et al., 1995; Guan K. et al., 1999; Гордеева О.Ф. и др, 2003].

Колонии ЭСК были правильной формой во всех экспериментальных сериях. Количество клеток в одной колонии (р<0,05 по критериям Дана и Манна-Уитни) значимо превосходило в опыте по сравнению с динамическим и статическим контролями. Можно сказать, что клетки в периоде последействия, как и во время клиностатирования хорошо формировали колонии, которые характеризовались разными размерами (табл. 1).

Анализ общей жизнеспособности ЭСК мыши (образование колоний в следующем пассаже) не выявил достоверных отличий между опытом и контролями. Была показана лишь тенденция к увеличению этого показателя у ЭСК после клиностатирования (табл. 1).

Оценка жизнеспособности ЭСК мыши в периоде последействия в серии исследований при культивировании клеток с добавлением ЬШ в условиях клиностатирования не выявила отличий между опытом и контролями.

дК

Рис.8. Культура ЭСК после воздействия клиностатирования на желатиновой подложке с добавлением Ыр (увелич. хЮО): сК - статический контроль; дК - динамический контроль; опыт (72 ч клиностатирования).

Таблица 1.Число колоний ЭСК и ЭТ спустя 4 суток

Величина Клиностатирование сК дК

Кол-во колоний/ см2 208±42 160±8 15Ш6

Кол-во клеток в одной колонии 168±49*'& 60±8 57±20

Кол-во ЭТ/1 мл 6729±2318 8424±888 4025±2941

* отличия между опытом и сК;' отличия между опытом и дК, р<0,05.

Оценку начальных стадий дифференцировки ЭСК мыши после воздействия клиностатирования (72 ч) проводили методом подсчета образованных ЭТ во всех образцах (табл. 1). Визуально можно было отметить, что ЭТ в опыте отличались меньшими размерами по сравнению с контролями, а более крупные по размеру ЭТ наблюдали в серии дК (рис. 9).

сК дК опыт

-и. Л ).

Рис. 9. ЭТ, образуемые ЭСК после воздействия клиностатирования (увелич. хЮО): сК - статический контроль; дК - динамический контроль; опыт (72 ч клиностатирования).

Анализ полученных данных показал, что количество образованных ЭТ в

опыте имело тенденцию к уменьшению по сравнению с серией сК и тенденцию к увеличению по сравнению с серией дК (табл. 1). Следует отметить, что в серии дК встречались единичные ЭТ, имеющие больший размер и четко выраженную базапьную мембрану, что говорит о полностью сформированной их структуре.

На основании отсутствия изменений в образовании колоний ЭСК можно предположить, что недифференцированные клетки не реагируют на гравитационные изменения существенными сдвигами пролиферации. Однако, выявление некоторого запаздывания дифференцировки клеток в периоде последействия клиностатирования (уменьшение образования ЭТ) и повышение жизнеспособности может говорить об относительно небольшом влиянии измененной гравитации на последующее развитие клеток на данной стадии.

Исследование влияния клиностатирования эмбриоидных тел на последующую дифференцировку клеток in vitro.

Кардиомиоцитарная дифференцировка. Для изучения вклада гравитационного фактора в коммитирование ЭСК изучали их спонтанную дифференцировку в кардиомиоциты после клиностатирования (72 ч).

В ходе 5 серий экспериментов по влиянию клиностатирования на ЭТ (72 ч) in vitro было показано, что ЭТ в трех образцах (сК-статический контроль, дК-динамический контроль и клиностат) имели разную морфологию (рис. 10). Больше половины ЭТ при клиностатировании (72 ч) находились в суспензионном виде в течение всего эксперимента. В серии сК почти 80 % ЭТ прикреплялись ко дну флакона в первые сутки эксперимента, а в серии дК ЭТ находились как в суспензионном состоянии, так и в адгезивном. На момент окончания воздействия визуально было обнаружено, что клиностатируемые ЭТ отличались более ровной и округлой формой (рис. 10). Можно предположить, что отсутствие или снижение процессов седиментации, позволяющее ЭТ длительное время находиться во взвешенном состоянии, впоследствии приведет к замедлению миграции клеток из ЭТ и их спонтанной дифференцировки.

В периоде последействия проводили наблюдение за появлением сокращающихся кластеров кардиомиоцитов. Было отмечено, что в обеих контрольных сериях появление сокращающихся кластеров происходило на 3-ий

день после завершения эксперимента, в отличие от опыта, где была выявлена задержка на 2 дня. Таким образом, спонтанная дифференцировка в кардиомиоциты в условиях измененной гравитации начиналась с опозданием.

Время сокращений во всех трех группах продолжалось в течение 14 суток (рис. 11). Как видно из результатов, представленных на графике наибольшее число кластеров сокращающихся кардиомиоцитов (вплоть до 10-х суток после клиностатирования) было обнаружено в статическом контроле, а наименьшее в культурах после клиностатирования.

Рис. 10. Внешний вид ЭТ при клиностатировании (увелич. х200): сК - статический контроль, дК - динамический контроль, Кл - опыт.

Рис. 11. Динамика появления сокращающихся кластеров кардиомиоцитов в ЭТ после остановки клиностатирования: Кл - опыт, сК - статический контроль, дК- динамический контроль.

3 4 5 6 7

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

1Я сокращений после клиностатирования, с/тки

Максимальное число сокращений в ЭТ для статического и динамического контролей наблюдали на 7-е сутки после клиностатирования (5-й день сокращения), а для клиностатируемых ЭТ на 11-е (7-й день сокращения). Данные других исследователей, описывающие спонтанную дифференцировку ЭСК мыши в кардио-мышечном направлении, говорят о появлении первых сокращающихся кластеров на сроках 2-3 суток после прикрепления ЭТ к подложке [Guan et al., 1998; Wei H. et al., 2005], что согласуется с результатами, полученными нами в контроле.

Результаты статистической обработки показали достоверные различия по

времени, в течение которого сокращались кластеры кардиомиоцитов в исследуемых группах (рис. 11). Таким образом, после воздействия длительного клиностатирования ЭТ (72 ч) in vitro происходило существенное запаздывание по времени начала дифференцировки ЭСК в ЭТ (р<0,01, по критерию Фридмана).

При оценке суммарного количества сокращающихся кластеров в период их максимума было обнаружено, что достоверное отличие имелось как в опыте по сравнению с контрольными группами, так и в контролях между собой (р<0,01 по критерию Манна-Уитни). Полученные результаты дают основание полагать, что количество сокращений в ЭТ, культивированных в условиях клиностатирования (72 ч), снижено, а постоянное перемешивание среды также приводит к уменьшению числа сокращающихся кластеров.

Для подтверждения присутствия в ЭТ кардиомиоцитов было проведено иммуноцитохимическое окрашивание дифференцированных ЭСК антителами к тропонину I - клеточному маркеру, который, как известно, экспрессируется в дифференцированных кардиомиоцитах [Wei Н., et al., 2005]. Из рис. 12 (стрелками указаны окрашенные клетки) видно, что количество предшественников кардиомиоцитов на 18 сутки после клиностатирования больше в контроле, что подтверждает ослабление спонтанной дифференцировки в опыте.

Ранее было показано [Landis W.J. et al., 2000], что при использовании первичной культуры остеобластов, выделенных из черепной кости куриного эмбриона, в условиях микрогравитации происходит снижение дифференцировки этих клеток, сопровождающееся уменьшением синтеза внеклеточного матрикса (снижение экспрессии коллагена).

Подтверждением предположения о возможной задержке эмбрионального развития при снижении гравитационного стимула в условиях космического полета могут быть работы Л. В. Серовой, посвященные изучению развития эмбрионов крыс in vivo, а также других авторов, изучавших развитие эмбрионов перепелов [Серова Л. В.,1996; Мелешко и др, 1991, Гурьева и др, 1993].

Нейрональная дифференцировки. Известно, что одним из направлений дифференцировки ЭСК мыши in vitro является дифференцировка в клетки нервной системы [Guan et al, 1998]. Одной из задач данной работы являлось

исследование влияния клиностатирования на способность клеток к спонтанной дифференцировке в нейрональном направлении. Оценка степени нейрональной дифференцировки проводилась с помощью антител к специфическим белкам нервных клеток: МАР2 (MAP-microtubule associated proteins) и P-III тубулину. Ранее было показано, что спонтанная дифференцировка в нейрональные клетки происходит через 15-20 сут после прикрепления ЭТ [Striibing С. et al., 1995]. При этом максимальное количество МАР2-положительных нейронов, дифференцированных из ЭСК мыши in vitro, выявлялось примерно на 18-20 день культивирования [Fraichard A., et al, 1995]. В связи с вышеизложенным в нашем исследовании иммуноцитохимическое окрашивание ЭСК на два специфических белка (р-Ш тубулина и МАР2) осуществляли через 18 суток после начала культивирования ЭТ.

МАР2-положительные и Р-Ш тубулин-положительные клетки были обнаружены во всех вариантах исследования (опыт, статический контроль - сК и динамический контроль - дК) (рис. 13, 14). Морфологически они представляли клетки с короткими и длинными отростками. Количественный анализ полученных результатов показал, что число Р-Ш тубулин-положительных нейронов в опыте достоверно выше по сравнению с серией сК и ниже по сравнению с серией дК. Кроме того, обнаружены достоверные отличия числа P-III тубулин-положительных клеток в серии дК по сравнению с серией сК (р<0,05 по критерию Манн-Уитни) (табл. 2).

Таблица 2. Количество нейрональных клеток, выявленных на 18-е сутки _специфическими антителами к МАР2 и Р-Ш тубулин._

опыт сК дК

р-Ш тубулин-положительные нейроны (в расчете на лунку - 1,8 см2) 66±12* п—16 35±Ю п=8 211±21&д п—6

МАР2-положительные нейроны (в расчете на лунку- 1,8 см2) 24±7 п=12 31±11 п=12 28±12 п=12

* отличия между опытом и сК,& - между дК и опытом, * - между дК и сК, р<0,05;

п - количество лунок.

Количество МАР2-положительных клеток в клиностатируемых ЭТ было несколько меньше по сравнению с серией дК. Достоверных отличий от серии сК также не было найдено, была выявлена лишь тенденция к их снижению (табл.2).

Анализ экспрессии маркера нейрональной дифференцировки - МАР2 позволяет предположить, что постоянное перемешивание среды культивирования незначительно активировало, а условия клиностатирования (48 ч) снижали спонтанную дифференцировку клеток. По-видимому, в этих условиях из-за того, что ЭТ дольше находились в неприкрепленном состоянии, происходила задержка их последующего развития. Немаловажным здесь является то, что полученные данные в опыте и дК практически сопоставимы, это можно объяснить правильным подбором условий постоянного перемешивания культуральной среды как на горизонтальном шейкере, так и в условиях клиностата.

Таким образом, данные, показывающие снижение экспрессии маркеров поздних стадий нейрональной дифференцировки, согласуются с результатами, полученными при изучении спонтанной дифференцировки ЭСК в кардиомиоциты, где было показано уменьшение числа сокращающихся кластеров в ЭТ после культивирования в условиях измененной гравитации. Обнаружение в клиностатируемых культурах большого числа клеток, окрашенных на ¡5-111 тубулин (на 18 сутки) может быть связано с тем, что дифференцировка существенной части ЭСК останавливалась на стадии нейробластов, а терминальной стадии дифференцировки достигали значительно меньшие количество клеток. Предполагается, что клиностатирование создает условия для определенной задержки дифференцировки ЭСК в нейрональном направлении применительно к поздним стадиям этого процесса. К тому же нейрональные клетки являются производные эктодермы, а кардиомиоциты -производные мезодермы, что может влиять на различия в экспрессии двух исследуемых маркеров ((З-Ш тубулин и тропонин I) при моделировании эффектов гипогравитации.

Рис. 12. Иммуноцитохимическое окрашивание дифференцированных ЭСК антителами к тропонину I через 18 суток после клиностатирования: А-опыт (х200); Б-контроль (х200). Стрелкой указаны окрашенные клетки.

Рис. 13. Окраска дифференцированных клеток из ЭТ на специфический маркер МАР2 (х200): а - сК; б - опыт; в - дК.

Рис. 14. Окраска дифференцированных клеток из ЭТ на специфический маркер (3-Ш-тубулин ( х200): г — сК; д - опыт; е —дК.

Изучение морфологии эмбриоидных тел после действия клиностатирования.

Анализ полутонких срезов ЭТ (100 срезов) показал три стадии их созревания как в опыте, так и в контролях: сформированные ЭТ без базальной мембраны (а), ограничивающей внутренний слой клеток от внешних; с частично образованной мембраной (б) и полностью сформированные, созревшие ЭТ с четко выраженной мембраной (в) (представлены контрольные группы ЭТ) (рис.15). Так как с момента пассирования ЭСК для получения ЭТ до момента фиксации образцов прошло 7-8 суток, вполне возможно, что некоторые ЭТ уже достигли полной стадии созревания, а другие - нет, при этом аналогичная картина была обнаружено как в опыте, так и в контроле.

и

, . .

Рис. 15. Полутонкие срезы ЭТ. Три стадии созревания ЭТ (на примере контрольной группы): а -без базальной мембраны; б - с частично сформированной базальной мембраной; в - с полностью сформированной базальной мембраной (увелич. х400).

Рис. 16. Полутонкие срезы ЭТ (толщина 1-2 мкм). Окраска метиленовым синим-азуром-фуксином: а - контроль; б - опыт (увелич. х400). Толстые стрелки - пустоты и ядра апоптотических клеток. Тонкие стрелки - клетки внешнего слоя.

Рис. 17. Полутонкие срезы ЭТ (толщина 1-2 мкм). Окраска метиленовым синим-азуром-фуксином (увелич. х 400): а -контроль; б - опыт. Стрелки - полости кавитации.

Как видно из рис. 15, ЭТ без базальной мембраны состоят из однотипных клеток, плотно прилегающих друг к другу. В ЭТ, где была четко сформирована базальная мембрана, видны вакуолизированные области. Они представлены как во внутреннем, так и во внешнем слое, где, как известно, клетки более дифференцированы [Гордеева и др., 2002]. К тому же, в сформированных ЭТ во внутреннем пуле клеток, где были обнаруживали пустоты, встречались клетки с фрагментированными ядрами и с сильно конденсированным хроматином, расположенным зачастую по периферии ядер, что указывает на процессы апоптоза [Ярилин А.А., 1998; Самуилов В.Д и др., 2000]. Данные литературы свидетельствуют, что апоптотические клетки располагаются в основном в центре ЭТ [Мануйлова Е.С. и др., 2001; Гордеева О.Ф. и др., 2002] Однако в нашем исследовании их можно было встретить не только в центре, но и по всему пространству внутреннего слоя ЭТ.

Во внешнем слое были обнаружены клетки, имеющие отростки (рис. 16), что подтверждает данные других исследователей [Saitou M. et al., 1998; Мануйлова Е.С. и др., 2001], и говорит о начале процессов дифференцировки. Из рис. 16 видно также, что в опыте клетки внутреннего слоя расположены менее плотно, чем в контроле, и в них можно обнаружить фрагментированные ядра.

Xuepig Qu et al (2007) при исследовании морфологии ЭТ изучали процесс аутофагии, т.е. уничтожение здоровыми клетками мертвых клеток, при котором происходит образование полостей (процесс кавитации), с целью сохранения жизнеспособных свойств целого организма. Аутофагия может быть активирована in vivo как клеточный защитный механизм [Levine, 2005]. При эмбриональном развитии млекопитающих ранним сигналом процессов апоптоза является кавитация, т.е. когда часть клеток эмбриональной эктодермы, уходя в апоптоз, формируют впадину [Coucouvanis and Martin, 1995]. Этот процесс в условиях in vitro может быть воспроизведен при культивировании ЭСК без «фидерной» подложки и без добавления фактора LIF [Poirier et al., 1991]. В наших экспериментах, как можно видеть из рис. 17, в ЭТ контроле в центральной части располагались достаточно большие по размеру пустоты (показано стрелками) по сравнению с ЭТ опытом. Причем вокруг них можно было встретить клетки, по

морфологическим признакам напоминающие эпителий.

Показано (рис. 18) существенно меньшее количество апоптотических клеток, приходящихся на 1 мм2 площади среза ЭТ в опыте по сравнению с контролем (р<0,01; критерий Манна-Уитни; П]=24 (опыт), п2=67 (контроль)). При этом относительная площадь полостей в опыте достоверно ниже таковой в контроле (р<0,05; критерий Манна-Уитни; П1=24, Пз=70) (рис. 19).

Таким образом, возможно, что отсутствие больших полостей при клиностатировании может быть связано с замедлением процесса аутофагии и морфогенеза в ЭТ. Эти изменения могли быть причиной последующей задержки дифференцировки, обнаруженной нами после клиностатирования.

о 1500 " 1000

ШШ

в ШШ

-f

□ опыт

□ контроль

Рис, 18. Число ЭСК мыши, вступивших I апоптоз, в расчете на 1 мм2 площади полутонкого среза ЭТ.

0,09

Е 0.08

£ 0.03 8

* 0.02

* Р<0,05

□опыт □ контроль

ш ш я

ft »»

И Ш.М. Ш Я • ММ ;;;;; . ..

-

Рис. 19. Относительная площадь полостей на полутонком срезе ЭТ.

ВЫВОДЫ

1. Подобрана и успешно апробирована экспериментальная модель для исследования начальных этапов дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в условиях моделирования эффектов микрогравитации in vitro.

2. Клиностатирование (72 ч) эмбриональных стволовых клеток мыши на подложке из эмбриональных фибробластов не оказывало выраженного влияния на их образование колоний. Культивирование ЭСК при добавлении фактора LIF в тех же условиях на 80 % снижало этот процесс.

3. Выявлена тенденция к увеличению жизнеспособности эмбриональных стволовых клеток при их пассировании после клиностатирования, при этом образование эмбриоидных тел было снижено.

4. Показано, что при клиностатировании в эмбриоидных телах обнаруживалось меньшее число апоптотических клеток и существенно снижалась активность процессов аутофагии.

5. Клиностатирование эмбриоидных тел приводило к замедлению начала дифференцировки клеток в кардиомиоциты и к уменьшению количества спонтанно сокращающихся кластеров в 2 раза.

6. Клиностатирование эмбриоидных тел существенно увеличивало количество P-III тубулин-положительных клеток и незначительно снижало число МАР2-положительных клеток в ходе спонтанной нейрональной дифференцировки.

7. Показано, что эмбриоидные тела являются уникальной моделью для изучения начальных этапов дифференцировки в условиях моделирования эффектов микрогравитации in vitro.

РЕКОМЕНДАЦИИ

• Для моделирования эффектов микрогравитации в наземных условиях при использовании ЭСК на стадии колоний рекомендуется применять экспозиции от 24 до 72 ч и фидерную подложку для их культивирования.

• Клиностатирование культивируемых ЭСК мыши с малыми скоростями может быть использовано для поддержания недифференцированного состояния.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Константинова Н.А. Отработка экспериментальной модели для клиностатирования эмбриональных стволовых клеток мыши in vitro // Тезисы конференции молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященная Дню космонавтики. Москва, 2005. С. 25.

2. Константинова Н.А., Мануйлова Е.С., Гривенников И.А., Буравкова Л.Б. Изучение эффектов постоянного измененного вектора гравитации (клиностатирование) на эмбриональные стволовые клетки мыши in vitro // Тезисы VI Международной конференции по молекулярной генетике соматических клеток. Звенигород. 2005. С. 96.

3. Konstantinova N.A., Buravkova L.B., Manuilova E.S., Grivennikov I.A. The effects of gravity vector randomization on mouse embryonic stem cells in vitro // Journal of Gravitational Physiology. 2006. V. 13(1). P. 149-150.

4. Константинова H.A., Мануйлова E.C., Гривенников И.А., Буравкова Л.Б.. Изучение первичных эффектов длительного клиностатирования на эмбриональные стволовые клетки мыши in vitro // Авиакосмическая и экологическая медицина. 2006. Т. 40, № 5. С. 34-37.

5. Константинова Н.А., Буравкова Л.Б., Мануйлова Е.С., Арсеньев E.JI, Гривенников И.А. Клиностатирование как способ воздействия на последующее развитие эмбриональных стволовых клеток in vitro // Технологии живых систем. 2006. Т. 3. № 5-6. С. 4-8.

6. Константинова Н.А. Измененный гравитационный стимул (клиностатирование) как механический фактор воздействия на начальные стадии развития эмбриональных стволовых клеток мыши in vitro II Тезисы V конференции молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященная Дню космонавтики. Москва. 2006. С. 22.

7. Konstantinova N.A, Buravkova L.B., Manuilova E.S. and Grivennikov I.A. The effects of gravity vector randomization on mouse embryonic stem cells in vitro // Abstracts of 27th Annual International Gravitational Physiology Meeting. Japan. Осака. 2006. P 92.

8. Константинова H.A., Буравкова Л.Б., Мануйлова E.C., Гривенников И.А. Влияние измененного вектора гравитации (длительного клиностатирования) на последующее развитие эмбриональных стволовых клеток мыши in vitro // Тезисы XIII Конференции по космической биологии и авиакосмической медицине. Москва. 2006. С. 145-146.

9. Константинова Н. Клиностатирование как фактор, влияющий на дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши линии R1 in vitro II Тезисы VI конференции молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященная Дню космонавтики. Москва. 2006. С. 30.

10. Gershovich Yu.G., Konstantinova N.A., Gershovich P.M. and Buravkova L.B. The primary effects of prolonged gravity vector randomization (2D-clinorotation) on precursor's cells in vitro // Journal of Gravitational Physiology. 2007. V. 14. №. 1. P. 133-134.

11. Buravkova L.B., Romanov Yu.A., Konstantinova N.A., Buravkov S.V., Gershovich Yu.G, Grivennikov I.A. Cultured stem cells are sensitive to gravity changes // Acta Astronáutica 2008. V. 63. P. 603-608.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ ЭСК - эмбриональные стволовые клетки мыши линии R1 ЭТ - эмбриоидные тела сК - статический контроль дК - динамический контроль Кл - клиностат (опыт) LIF - фактор, ингибирующий лейкемию а-MEM - минимальная среда Игла (альфа модификация) FBS - эмбриональная сыворотка коровы

МАР2 - белки - поздний маркер нейрональной дифференцировки

Благодарности. Автор выражает особую благодарность своим научным руководителям: дм.н. проф. Буравковой Л.Б., д.бн проф. Гривенникову И. А., сотрудникам Института молекулярной генетики РАН лаборатории «Молекулярной генетики соматических клеток»: с.нс, K.6.H. Мануйловой Е.С., с.н.с. Арсеньееой ЕЛ. и другим сотрудникам лаборатории, а также кжн. Черникову В. П.- Институт морфологии человека РАН и дмн. Буравкову С. В -факультет фундаментальной медицины МГУ им. MB. Ломоносова.

Подписано в печать 22.09.2008 г. Отпечатано 23.09.2008 г.

Отпечатано в типографии ООО «Дельфорг», ИНН 7705756857 г. Москва, ул. М.Каменщики, д. 16 Заказ №551

Бумага офсетная. Печать трафаретная ризографическая, цифровая. Усл. печ.л. 1,75. Тираж 100 экз.

Эволюционные процессы на Земле осуществляются при постоянном участии гравитационного поля. Гравитация определяет нормальное развитие, функционирование и морфологию всех живых организмов в мире. В течение длительного периода становления жизни на планете все организмы приспосабливались к гравитационным условиям, начиная от становления структуры и функции отдельных органов, тканей и кончая целым организмом.

Известно много физиологических изменений, которые происходят во время пилотируемых космических полетов и при действии невесомости на животных. Некоторые из этих изменений включают атрофию мышечной системы и нарушения костного аппарата, перераспределение жидких сред организма, изменения в иммунной системе и сердечно-сосудистой системе организма человека [Газенко О.Г., 1984; Серова Л.В., 1996; Григорьев А.И., Егоров А.Д., 1997; Оганов B.C. и Шнайдер B.C., 1997 и др.].

Исследования влияния факторов космического полета, в том числе микрогравитации, на процессы развития, дифференцировки и регенерации живых организмов (перепелов, тритонов и др.), проводившиеся с начала освоения космического пространства [Винников Я.А. и др., 1972; Мелехова О.П. и др., 1976; Сушков Ф.В., Руднева С.В., 1979; Оганесян С.С. и др., 1980; Мелешко Г.И., 1991; Гурьева Т.С. и др., 1993; Black S.B. et al., 1996; Mitashov V.I. et al, 1996; De Maziere A. et al., 1996; Almeida E.A. C. et al., 2006; Grigoryan E., et al, 2006], не потеряли свою актуальность до настоящего времени.

Использование различных биологических моделей позволило установить ряд важных закономерностей, в том числе возможность нормального развития живых систем при создании адекватных условий их существования в космическом полете [Сычев В.Н., 2000; Серова JI.B., 2002; Mitashov V.I. et al., 1996; Almeida E.A. C. et al, 2006; Grigoryan E., et al., 2006].

Однако исследования в космическом полете и при моделировании некоторых эффектов микрогравитации на Земле свидетельствуют о том, что нет живых систем, развитие которых бы не менялось в этих условиях. Изменения на клеточном уровне, происходящие в условиях как реальной, так и моделированной микрогравитации, не позволяют в настоящее время сформулировать общие закономерности этого воздействия. Поэтому вопрос о влиянии гравитации на клетку и механизмах развивающихся эффектов весьма актуален. Однако существует мнение, что чувствительность к изменению силы тяжести зависит от размеров биообъекта, чем он меньше, тем меньшее влияние стоит ожидать. По данным Парфенова Г.П. на исследуемые клетки действует не сила тяжести, а среда обитания биообъекта и только через нее последняя переходит на сами клетки [Парфенов Г.П., 1988]. В связи с этим необходимо наиболее тщательно подбирать условия исследования, дабы правильно интерпретировать полученные результаты.

Большое число экспериментальных данных, выполненных на различных типах клеток, свидетельствуют об их чувствительности к сдвигам гравитационной стимуляции, которые вызывают как структурные изменения, так и изменения функциональной активности клеток [Cogoli A. et al., 1988; 1989; Cogoli А., 1993, Cogoli М., 1992; Таирбеков М.Г., 1997; Романов Ю.А. и др., 2001; Буравкова Л.Б. и др., 2005].

Вопрос о механизмах влияния гравитационного фактора на организм на клеточном уровне крайне сложен и до сих пор остается открытым. Его решение позволит сформировать представления о процессах, которые служат основой перестроек живых организмов в условиях реальной и моделируемой микрогравитации и возможного использования результатов исследования в практике космической биологии и медицины.

Ввиду того, что смоделировать микрогравитацию в лабораторных условиях невозможно, широко используется клиностатирование, которое позволяет воспроизвести всего лишь некоторые эффекты мигрогравитации.

Но как модель, рандомизацию вектора гравитации можно использовать для изучения измененной гравитации [Moor D. et al., 1996]. Актуальность исследования.

Развитие клеточных технологий позволило получить убедительные доказательства того, что на рост и развитие клеток in vitro могут влиять не только широкий спектр биологически активных веществ, но и ряд механических факторов. Исследования проводились как на Земле при моделировании эффектов микрогравитации, так и в условиях мигрогравитации на борту биоспутников и космических станций. Показано, что микрогравитация меняет морфо-функциональное состояние клеток in vitro, их пролиферативную активность, экспрессию генов и др. Особенно выражены эти эффекты у механочувствительных дифференцированных клеток, таких как остеоциты, фибробласты, миоциты, эндотелиальные клетки. В последнее время проводятся исследования, результаты которых свидетельствуют о влиянии клиностатирования на клетки-предшественники, выделенные из костного мозга человека или предшественники остеобластов [Tschopp A. et al., 1984; Cogoli A. et al., 1993; Таирбеков М.Г., 2000; Buravkova L.B. et al., 2004; Facer S. R, 2005; Crawford-Young S.J., 2006].

Вопрос о том, может ли гравитационный фактор влиять на клетки, находящиеся на самых ранних этапах развития и дифференцировки, а именно на эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) млекопитающих, остается открытым. Эти клетки характеризуются несколькими весьма важными свойствами: неограниченной способностью к пролиферации при сохранении нормального кариотипа, и возможностью дифференцироваться во все известные виды клеток организма [Evans M.J., 1981; Guan К. et al., 1998; Keller G., 2005]. Поэтому ЭСК и сформированные ими в определенных условиях эмбриоидные тела (ЭТ) служат удобной моделью для изучения механизмов, регулирующих начальные стадии как спонтанной, так и индуцированной различными воздействиями дифференцировки клеток. К тому же известно, что развитие ЭТ in vitro является моделью эмбриогенеза in vivo. В связи с этим актуальность нашей работы становиться значительнее, в виду того, что никто еще не рассматривал начальные стадии развития на данной модели в условиях клиностатирования. Возможно, ответная реакция на возникновения изменения силы тяжести позволит более прояснить на какой стадии развития живой системы стоит задумываться об обнаруженных изменениях, и какой характер будут они носить.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось исследование эффектов клиностатирования на начальные стадии дифференцировки эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) in vitro.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Отработать экспериментальную модель для клиностатирования культивируемых ЭСК мыши на различных субстратах.

2. Оценить динамику образования колоний ЭСК мыши при клиностатировании.

3. Исследовать жизнеспособность ЭСК мыши и их способность образовывать ЭТ после моделирования эффектов гипогравитации.

4. Изучить морфологические изменения ЭСК на начальной стадии дифференцировки (стадия ЭТ) при воздействии клиностатирования.

5. Оценить способность ЭСК к последующей спонтанной дифференцировке после воздействия клиностатирования.

Научная новизна. Впервые установлено, что in vitro ЭСК мыши могут сохранять свои морфо-функциональные свойства в условиях моделирования гравитационных изменений. Показано, что чувствительность ЭСК к клиностатированию возрастает в зависимости от стадий развития клеток: от колоний ЭСК до сформированных ЭТ. Впервые показано, что клиностатирование ЭТ приводит как запаздыванию начала кардиомиоцитарной дифференцировки, так и к существенному уменьшению количества сокращающихся кардиомиоцитов. Продемонстрировано, что рандомизация вектора гравитации приводит к стимулированию образования клеток ранних стадий нейрональной дифференцировки и незначительному снижению их количества на поздних стадиях.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные вносят существенный вклад в понимание процессов роста и дифференцировки ЭСК в условиях моделирования эффектов гипогравитации. Создана и успешно апробирована экспериментальная модель, включающая как ЭСК, так и эмбриоидные тела, позволяющая исследовать влияние клиностатирования на начальные этапы эмбрионального развития млекопитающих in vitro.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VI Международной конференции по молекулярной генетике соматических клеток (Звенигород, 2005), Конференциях молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2005, 2006, 2007 гг.), XIII Конференции по космической биологии и авиакосмической медицине (Москва, 2006 г.), 27-м, 28-м Международных симпозиумах по гравитационной физиологии (Осака, Япония, 2006 г; Сан-Антонио, Техас, США, 2007 г.), Школе-конференции для молодых ученых «Методы культивирования клеток» (С-Петербург, 2008 г.).

Выводы:

1. Подобрана и успешно апробирована экспериментальные условия для исследования начальных стадий дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в условиях моделирования эффектов микрогравитации in vitro.

2. Клиностатирование (72 ч) эмбриональных стволовых клеток мыши на подложке из эмбриональных фибробластов не оказывало выраженного влияния на образование колоний. Культивирование ЭСК при добавлении фактора LIF в тех же условиях на 80 % снижало этот процесс.

3. Выявлена тенденция к увеличению жизнеспособности эмбриональных стволовых клеток при их пассировании после клиностатирования, при этом образование эмбриоидных тел, было снижено.

4. Показано, что при клиностатировании в эмбриоидных телах существенно снижаются процессы аутофагии и обнаруживается меньшее число апоптотических клеток.

5. Клиностатирование эмбриоидных тел приводило к замедлению начала дифференцировки клеток в кардиомиоциты и к уменьшению количества спонтанно сокращающихся кластеров в 2 раза.

6. Клиностатирование эмбриоидных тел существенно увеличивало количество (3-III тубулин-положительных клеток и незначительно снижало число МАР2-положительных клеток в ходе спонтанной нейрональной дифференцировки.

7. Показано, что эмбриоидные тела являются уникальной моделью для изучения начальных этапов дифференцировки в условиях моделирования эффектов микрогравитации in vitro.

Рекомендации:

• Для моделирования эффектов микрогравитации в наземных условиях при использовании ЭСК на стадии колоний рекомендуется применять экспозиции от 24 до 72 ч и фидерную подложку для их культивирования.

• Клиностатирование культивируемых ЭСК мыши с малыми скоростями может быть использовано для поддержания недифференцированного состояния.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Многочисленные исследования свидетельствуют о различных серьезных изменениях живых систем как в условиях микрогравитации в космическом полете, так и при моделировании ее эффектов в наземных условиях (клиностатирование). Безусловно, клетка воспринимает гравитационный стимул и воспроизводит механизм ответных реакций, в результате которого запускается сложный комплекс изменений. Несмотря на то, что число публикаций о влиянии микрогравитации на морфофункциональные характеристики различных типов клеток растет, механизмы выявленных эффектов до сих пор остаются неизвестными. Поскольку ряд изменений на клеточном уровне под влиянием микрогравитации (реальной или моделированной) зачастую одинаков, то это дает нам основание предполагать схожесть механизмов ответа клеткой. Но в то же время ряд ответных реакций разных типов клеток отличен друг от друга, и тем самым это говорит о разной чувствительности клетки к гравитационному стимулу.

Исследование ЭСК, служащих удобной моделью для изучения механизмов, регулирующих начальные стадии как спонтанной, так и индуцированной дифференцировки клеток, является важным для понимания процессов, происходящих на начальной стадии развития клеточных популяций.

Эмбриональные фибробласты мыши, использующиеся в качестве подложки для культивирования ЭСК в недифференцированном состоянии, имеют, как было, показано свои ответные реакции на влияние гравитационного стимула. Обнаруженная стимуляция пролиферативной активности интактных эмбриональных фибробластов в условиях клиностатирования (144 ч), говорит о положительном влиянии изменения • гравитации на этот тип клеток. Однако полученные результаты, отличаются от данных ряда авторов, показавших, что пролиферативная активность таких клеток, как фибробласты человека, эндотелиальные, мезенхимальные клетки, остеобласты в культуре снижалась при аналогичных условиях клиностатирования [Таирбеков М. Г, 1999; Романов Ю. А. и др, 2001; Буравкова JI. Б. и др, 2004 и др.]. Возможно, подобная ответная реакция интактных эмбриональных фибробластов мыши связана с принадлежностью клеток к тому или иному типу. К примеру, известно, что некоторые низкодифференцированные клетки, такие, как эмбриональные клетки почек хомяка, эмбриональные фибробласты легких человека и эмбриональные клетки почек человека, в ответ на изменение гравитационного стимула реагировали по-разному: либо увеличением пролиферации, либо отсутствием изменений этого параметра [Zhukov-Verezhnikov N.N. et al, 1971; Gaubin Y. et al, 1991; Montgomery PO'B, 1978; Lorenzi G. et at, 1993]. Нельзя исключить, что активация пролиферации в ответ на микрогравитацию характерна только для определенного типа эмбриональных клеток. Безусловно, различия в пролиферативных свойствах фибробластов, по сравнению с другими типами клеток можно объяснить разной схемой5 экспериментов (сроками клиностатирования, скорость вращения и типом использованного устройства - 2Д, ЗД-воздействие).

Следует отметить, что исследования, осуществляемые как в космическом полете, так и при имитировании условий микрогравитации на земле говорят об изменении структуры цитоскелета [Gruener R, Hoeger G, 1990; 1993; Harris S.A. et al, 2000; Guignandon A. et al, 2001; Vassy J. et al, 2001]. Наши данные, полученные при исследовании инактивированных эмбриональных фибробластов мыши в условия длительного клиностатирования (72 ч), показали реорганизацию актиновых филаментов. При этом пролиферативная активность и морфологические свойства ЭСК, которые культивировались на данной подложке, не подверглись существенному изменению.

Несущественное изменение образования колоний ЭСК, полученное при клиностатировании (72 ч), согласуется с данными, описанными в литературе, когда достоверных изменений пролиферации не выявлялось, либо имелась тенденция к ее увеличению [Zhukov-Yerezhnikov N.N. et al., 1971; Gaubin Y. et al., 1991; Montgomery PO'B, 1978; Lorenzi G. et at., 1993]. Причина отсутствия влияния клиностатирования на колониеобразование ЭСК мыши связана, скорее всего, с принадлежностью клеток к ранней стадии развития. Они менее подвержены действию клиностатирования. По-видимому, культивирование ЭСК на стадии колоний создает условия клеткам для устойчивости к механическому стимулу.

В отличие от полученных результатов образования колоний при культивировании ЭСК в условиях клиностатирования на подложке из эмбриональных фибробластов мыши, культивирование клеток с добавлением в среду фактора LIF выявило некоторые изменения пролиферации этих клеток. Напомним, что исследования колониеобразования ЭСК в условиях клиностатирования с добавлением в среду культивирования фактора LIF, было осуществлено в двух вариантах: на чашках Петри и флаконах.

Культивирование ЭСК на флаконах на желатиновой подложке с добавление LIF в условиях клиностатирования показало достоверное снижение образования колоний и отсутствие значимых морфологических изменений при сравнении с контролем. При этом образование колоний при культивировании их на чашках Петри в условиях клиностатирования (48 ч) не привело к достоверному изменению пролиферации, зафиксирована лишь тенденция к ее уменьшению. Динамика образования колоний в контрольных образцах была противоположна в двух этих экспериментах.

Можно предположить, что способы культивирования ЭСК на разной культуральной посуде (флакон, чашка Петри) неодинаково влияли на адгезивные свойства клеток к пластику, обработанному желатином, помимо фактора LIF. При этом можно отметить, что на чашках Петри, несколько снижается открепление колоний в условиях клиностатирования, в отличие от флаконов. Этот факт подтверждался недостоверным снижением пролиферации клеток, что можно объяснить, скорее всего, только частичным влиянием клиностатирования на клетки, а, возможно, в большей степени использованием фактора LIF и разной культуральной посуды. Таким образом, подложка из эмбриональных фибробластов мыши способствует лучшему сохранению адгезии клеток к пластику и увеличению пролиферации ЭСК в условиях клиностатирования по сравнению со статическим контролем (изменения носят характер тенденции), в отличие от фактора, ингибирующего лейкемию.

Таким образом, в экспериментах с клиностатированием ЭСК для сохранения их недифференцированного состояния предпочтительнее использовать «фидерную» подложку, а не добавлять LIF.

Условия моделирования эффектов гипогравитации в некоторой степени влияли на жизнеспособность клеток в периоде последействия клиностатирования и способности их образовывать ЭТ, т.е. вступать на начальный путь дифференцировки.

В результате проведенных исследований в периоде последействия нами была выявлена тенденция к увеличению жизнеспособности клеток в последующих пассажах после воздействия изменения гравитации по сравнению с контролями. Обнаружено существенное увеличение размеров колоний (в 2 раза) в опытной серии по сравнению с дополнительным динамическим и статическим контролями. Процент жизнеспособных колоний в периоде последействия клиностатирования был одинаков и соответствовал норме: 3% для серий исследований по культивированию клеток в условиях измененной гравитации на «фидере» и с добавлением LIF. Количество жизнеспособных клеток, выявленных методом проточной цитофлуориметрии в серии исследований по клиностатированию клеток с добавлением фактора LIF, достоверно ниже в варианте, который подвергался клиностатированию, по сравнению со статическим контролем. Показано, что клетки в периоде последействия клиностатирования преимущественно гибнут по пути некроза.

Образование эмбриоидных тел, указывающих на начало процессов дифференцировки эмбриональных стволовых клеток, имело тенденцию к снижению после воздействия длительного клиностатирования при культивировании клеток на «фидере».

Al-Ajmi N. et al, напротив, показали, что при клиностатировании 8 об/мин крысиных эмбриональных остеобластов двух линий (17/2.8 ROS линия и клетки кости плода крысы) происходит уменьшение числа клеток и их деления, и к тому же увеличивается дифференцировка этих клеток, в виду снижения экспрессии эндогенной щелочной фосфатазы [Al-Ajmi N et al, 1996].

Если на стадии колоний влияние измененной гравитации было не существенным, то на следующих этапах развития ЭСК, на стадии ЭТ, мы наблюдали разнообразные изменения, которые касались не только стадий дифференцировки, но и внешней и внутренней морфологии ЭТ.

Исследования влияния клиностатирования (72 ч) на ЭТ показало, что происходит последующее запаздывание начала спонтанной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в кардиомиоциты (р<0,01). И, как следствие, количество кластеров в ЭТ в максимальный период их появления была достоверно ниже (в 2 раза) в группе после действия измененной гравитации по сравнению с контролями. Однако сокращения в одном ЭТ в опытной группе незначимо отличались от контроля, наблюдалась лишь тенденция к уменьшению. Постоянное перемешивание среды культивирование как дополнительный фактор воздействия достоверно снижало возникновение количества этих сокращений по сравнению с контролем. Можно предположить, что на самом раннем этапе развития клеток, изменения в дифференцировке и скорости их развития, могут иметь место и быть существенными для дальнейшего развития клеток.

В литературе развитие ЭТ от ЭСК до полного его формирования (3-5 день) часто сравнивают с развитием эмбриона от бластоцисты (3,5 день) до стадии гаструляции (7,5 дней) [Desbaillets I., et al., 2000; Keller G., 2006]. В связи с этим, часто сопоставляют эмбриогенез в организме in vivo и создание in vitro условий эмбрионального развития. Поэтому подтверждением предположения о возможной задержке эмбрионального развития, обнаруженного нами, могут быть работы, описывающие исследования измененной гравитации на раннее развитие различных млекопитающих и позвоночных in vivo [Серова JI. В., 1996; Мелешко Г.И. и др, 1991; Гурьева Т.С. идр, 1993].

Мы также рассматривали появление спонтанной нейрональной дифференцировки в периоде последействия клиностатирования ЭТ (48 ч). Было показано, что в условиях клиностатирования ЭТ происходило существенное увеличение количества $-111 тубулин-положительных нейронов (на 50 %) и уменьшение количества МАР2-положительных нейронов (на 22 %) по сравнению с контролем. Постоянное перемешивание среды культивирования усиливало степень нейрональной дифференцировки ранних и поздних стадий. Таким образом, при определении маркера поздних стадий нейрональной дифференцировки мы повторяем ответную реакцию клеток при кардиомышечной дифференцировки, и как следствие, подтверждаем факт задержки эмбрионального развития. Однако повышенная экспрессия маркера нейрональной дифференцировки ранних стадий в культурах после клиностатирования, выявленная на сроке 18 суток культивирования ЭТ дала обратную картину. По-видимому, дифференцировка существенной части ЭСК на стадии нейробластов просто останавливалась, и соответственно своей терминальной стадии дифференцировки клетки достигали в значительно меньшем количестве. В связи с вышеизложенным, мы вправе предположить, что клиностатирование создает условия для определенной задержки дифференцировки ЭСК в нейрональном направлении применительно к поздним стадиям этого процесса.

Безусловно, процессы спонтанной дифференцировки ЭСК реагируют на условия культивирования, а также на эффекты таких механовоздействий, как клиностатирование и постоянное перемешивание среды.

Как было уже сказано выше, эмбриональное развитие животных в условиях измененной силы тяжести является весьма актуальной проблемой. Наша модель начальных стадий эмбрионального развития показала зачастую схожие ответные реакции на изменение силы тяжести, которое многими авторами изучалось как в условиях реальной, так и моделированной микрогравитации в лаборатории.

Рядом авторов было показано увеличение регенерации и скорости пролиферации разных органов у низших позвоночных (тритон) в условиях космического полета и после него, при снижении дифференцировки клеток [Mitashov V.I. et al., 1996; Almeida E.A.C. et al, 2007; Grigoryan E., et al, 2006].

Интересные данные получены на тритонах и амфибиях. Так показано, что развитие эмбрионов лягушки из оплодотворенного яйца в условиях микрогравитации происходит нормально. Формирование глаз, уха, хвоста лягушки не отличается от земных условий. Однако были обнаружены некоторые отклонения, связанные с развитием эмбриона внутри яйца: слегка раннее кортикальное сужение, более вегетативная локализация бластоцеле, и тенденция к формированию более толстой верхней части бластоцеле (большее количество клеток) [De Maziere A. et al, 1996].

В работах Сычева В.Н. и коллег также обнаружено, что, несмотря на возникающие аномалии эмбриона японского перепела, микрогравитация не оказывает существенных, необратимых изменений [Сычев В.Н., 2000].

Таким образом, самые видимые, отличимые от контроля изменения могут происходить на самых ранних стадиях развития эмбрионов (до формирования бластоцисты). Безусловно, сравнение эмбрионегеза в организме и на стадии развития ЭТ носит условный характер, в виду того, что дифференцировка клеток из ЭТ всего лишь модель. Поэтому в полной мере сравнивать наши результаты по влиянию измененной гравитации с результатами, полученными на различных видах реплилий и млекопитающих, будет некорректно. Можно говорить только о некоей аналогии.

После клиностатирования ЭТ обнаружено достоверно значимое снижение количества эмбриональных стволовых клеток, вступивших в процессы апоптоза, в эмбриоидных телах, подвергавшихся клиностатированию, а также наблюдалось отсутствие существенное снижение относительной площади пустот в клиностатируемых эмбриоидных телах по сравнению с контрольными ЭТ. Возможно, что отсутствие кавитационных полостей при клиностатировании может быть связано с замедлением процесса аутофагии и морфогенеза в ЭТ. Эти изменения могли быть причиной последующей задержки дифференцировки, обнаруженной нами после клиностатирования.

Суммируя результаты исследований, можно говорить об относительной чувствительности изучаемого объекта на снижения гравитационных возмущений. К тому же существенным является стадия развития эмбриона, на каком сроке подвергается он действию как клиностатирования, так и микрогравитации. По-видимому, чем раньше при эволюции живой организм оказывается в условиях измененной гравитации, тем ощутимее эмбриональные аномалии, которые, однако, на последующих стадиях эмбриогенеза не выявляются. Но, безусловно, ответом на вопрос о влиянии имитированной или реальной микрогравитации является то, что изменения имеют место, и развитие носит характер задержки, которая в последствии нивелируется.

Из утверждения Парфенова Г.П. о том, что измененная сила тяжести на клетки губительно не влияет, но встречаются некоторые смещения клеточных параметров, можно сделать вывод о чувствительности клеток к гравитационному возмущению, что может быть обратимо [Парфенов Г.П., 1988]. К тому же в исследованиях того времени отсутствовала возможность контролировать внешние параметры среды окружения, например, температурные изменения, что возможно, сказывалось на незначительных ответных реакциях клеток на микрогравитацию [Сушков Ф.В., Руднева С.В, 1979]. Процессы развития идут в измененных условиях нормально, что показано и в нашей работе, характер задержки развития не оказывает губительных отличий от контроля.

Таким образом, эффект клиностатирования проявляется в основном на последующих стадиях развития ЭСК. Если на стадии колоний практически нет изменений, можно говорить только о тенденции, то на стадии ЭТ и при спонтанной дифференцировки клеток в кардиомышечном и нейрональном направлениях выявлялись весьма существенные изменения.

Подводя итог полученным результатам, можно сказать, что нами была к разработана модель, которую можно использовать для исследования начальных стадий дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши в условиях моделирования эффектов гипогравитации.

Положения, выносимые на защиту.

1. Оценка двух способов культивирования ЭСК мыши линии R1 в условиях клиностатирования выявила большую эффективность использования в качестве подложки эмбриональных фибробластов мыши, позволяющей осуществлять длительное моделирование эффектов гипогравитации.

2. Изменение гравитационного фактора не оказывает влияния на пролиферацию, а также на последующую жизнеспособность и образование ЭТ недифференцированными ЭСК мыши линии R1.

3. На начальных стадиях дифференцировки ЭСК in vitro происходило замедление начала спонтанной дифференцировки в кардиомиоциты, существенное увеличение количества (В-Ш тубулин положительных нейронов и уменьшение количества МАР2-положительных нейронов.