Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Исследование свойств экстрактов и компонентов эмбриональных тканей птиц раннего срока развития и получение на их основе ветеринарного препарата иммуностимулирующего действия

лп На правах рукописи

'4 с-

Сизов Александр Анатольевич

ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ ЭКСТРАКТОВ И КОМПОНЕНТОВ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ ПТИЦ РАННЕГО СРОКА РАЗВИТИЯ И ПОЛУЧЕНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ ВЕТЕРИНАРНОГО ПРЕПАРАТА ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология.

Автореферат диссертации на соискание•ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1996

Работа выполнена в Научно-исследовательском конструкторско технологическом институте- биологически активных веществ ГНЦ ВБ "Вектор".

Научные руководители:

Доктор биологических наук Масычева Валентина Ивановна; Кандидат биологических наук Хомов Виктор Васильевич.

Научный консультант:

Доктор ветеринарных наук, профессор, чл. -корр. Россельхозакадемии

Донченко Александр Семенович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор, акад. АЭН России

Незавитин Анатолий Григорьевич; Кандидат 'биологических: наук Кабанцев Александр Иванович.

Ведущая организация - Институт Ветеринарной Медицины Омского

циализированного совета Д0202301 при Институте Экспериментальной Ветеринарии Сибири и Дальнего Востока (633128, Новосибирская область, п.Краснообск, СО РАСХН, ИЭВСиДВ). С диссертацией можно ознакомиться В ЦНСХБ СО РАСХН.

Агроуниверситета.

Защита состоите^'

;Э96 г. в_часов на заседании спе-

Авгореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета доктор ветеринарных наук

А. А. Самоловов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.В последнее время повысился интерес к препаратам. обладающим способностью положительно воздействовать на иммунную систему человека и животных.

Весьма интересным объектом с данной точки зрения являются биологически активные вещества эмбрионального происхождения.Известно, что в процессе эмбриогенеза основная нагрузка ложится на регуляторные системы,ответственные за дифференцировку и пролиферацию тканей,за формирование органов и систем организма,в частности иммунной системы. Механизмы, обеспечивающие данные процессы в период эмбриогенеза,отличаются'большой консервативностью и максимальной функциональной активностью.Исходя из этого, представляется перспективным использовать биологически активные вещества эмбриональных тканей для модулирования защитных реакций взрослого организма.

Вышеуказанное объясняет интерес многих исследователей к исследованию эмбриональных тканей животных с целью получения из них субстанций, обладающих иммунотропной активностью.

Цель и задачи исследований. Целью работы было исследование физико-химических и биологических свойств экстрактов эмбриональных тканей кур Gallus domesticus и перепелов Coturnix coturnix раннего срока развития и разработка на этой основе препарата,обладающего стимулирующим действием на иммунную систему животных.

Исходя из этого ставились следующие задачи:

- разработка стандартного метода получения экстрактов эмбриональной ткани птиц;

- изучение биохимического состава эмбриональных тканей кур и перепелов раннего срока развития;

- изучение биологических свойств экстрактов и компонентов эмбриональных тканей птиц раннего срока развития, а также препаратов, получаемых на их основе;

- определение оптимального срока развития эмбрионов.при котором наблюдается наибольшая иммунотропная активность;

- получение иммунологически активных компонентов эмбриональных тканей в очищенном виде;

- разработка технологии получения ветеринарного препарата иммуностимулирующего действия и проведение его апробации на собаках.

Научная новизна.Разработан способ получения эмбриональных экстрактов и технология получения биологически активной фрак-

ния методов исследования, изложения полученных результатов,их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Библиография включает в себя 109 литературных источника. Работа иллюстрирована 19 рисунками и И таблицами.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.Получение цельного эмбрионального экстракта. В ходе экспериментов по экстрагированию отрабатывался метод, позволяющий максимально извлекать биологически-активные вещества эмбриональных тканей с сохранением их активности.Проверены следующие способы гомогенизации эмбриональных тканей: гомогенизация в механическом гомогенизаторе с охлаждением; гомогенизация в гомогенизаторе Пот-тера, гомогенизация с использованием глубокого замораживания, гомогенизация методом растирания эмбриональной ткани в фарфоровой ступке. Наиболее оптимальным оказался комбинированный метод,заключающийся в разрушении клеток способом глубокого замораживания с последующей гомогенизацией в гомогенизаторе Поттера.

2.Изучение состава и Физико-химических свойств цельного эмбрионального экстракта. Эмбрионы кур и перепелов являются классическим объектом изучения закономерностей эмбриогенеза птиц,что обусловлено их доступностью и отработанными методами инкубаторного разведения данных видов. Однако до настоящего времени биохимический состав их тканей, а тем более динамика его изменения в зависимости от срока развития,практически не изучены. Наиболее интересным с данной точки зрения является срок развития эмбрионов кур с 4 до 7 суток, а также эмбрионов перепелов - с 4 до 6 суток (от стадии 24 до стадии 32 нормального развития цыпленка) , который соответствует середине и концу первого триместра эмбрионального развития (классификация стадий дана по В.Гамбургеру и Х.Гамильтону ).

Изучение состава экстракта из эмбрионов кур первой трети эмбрионального срока развития показало,что экстракт представляет собой сложную смесь белков, нуклеиновых кислот, липополисахаридов. Были идентифицированы макроглобулины, гемоглобин, оксигемоглобин, альбумин и белки альбуминового ряда, фетальные белки , ряд ростовых факторов.Выяснено, что содержание белков, и в частности, гемоглобина в эстрактах значительно повышается начиная с 7 суток развития эмбриона (стадия 32).

Нуклеиновые кислоты эмбрионального экстракта представлены фрагментами ДНК с широким спектром РНК .Интересным моментом является повышение относительного содержания нуклеиновых кислот в экстрактах эмбрионов с 5 суточным сроком развития (стадия 26 - 28) . Поскольку на данные стадии приходится закладка внутренних органов организма,можно с уверенностью утверждать,что такое повышение содержания нуклеиновых кислот (приблизительно в 2 раза) в данный период связано с началом органо- и гистогенеза. Косвенным доказательством этого служит то, что в эмбриональных экстрактах, начиная со срока развития 6 суток (стадия 29 - 30), обнаруживаются белки цитокинового ряда.В частности , удалось надежно идентифицировать интерлейкин-10 и ФНО-а в значительной концентрации (50 -60 нг/мл).Известно.что данные цитокины являются составной частью всех белковых комплексов, ассоциированных с беременностью.Они необходимы для протекания нормальной беременности и развития плода у млекопитающих, и обнаруживаются в крови плода в конце первого триместра развития .Кроме того у млекопитающих показано.что ИЛ-1 играет ключевую роль в становлении гуморального и клеточно-опос-редованного иммунитета.Однако у птиц данные цитокины обнаружены впервые. Как показали исследования,обнаруженные у кур цитокины имеют высокую степень гомологии с интерлейкином-1р и ФНО-а человека. В частности,моноклональные■ антитела к указанным цитокинам человека связываются с аналогичными цитокинами птиц в эквимоляр-ных количествах, что свидетельствует о гомологии функционально значимых структур данных белков.Этот факт говорит о том,что цито-киновая система организма имеет эволюционно очень древнее происхождение, поскольку таксономически птицы и млекопитающие отстоят друг от друга далеко,но имеют общее происхождение от рептилий.

3.Изучение биологических свойств цельного эмбрионального экстракта. Согласно данным С.Гилберта (1993) , дифференцировка клеток иммунной системы заканчивается к концу первого триместра эмбрионального развития,после чего наблюдается развитие органов иммунной системы путем пролиферации. Интересным моментом является то,что экспрессия генов основного комплекса гистосовместимости (МНС) начинается приблизительно с этого же момента.Из этого следует, что клетки и их компоненты,выделенные до этого периода не видоспецифичны, либо же имеют низкую видоспецифичность.Было сдела-

но предположение, что биологически активные вещества,выделенные из тканей эмбрионов конца первой трети развития, будут восприниматься организмом-реципиентом как свои, и при этом обладать выраженной иммунотропной активностью.

Как показали данные биологических испытаний, цельный экстракт из эмбрионов со сроком развития до 4 суток включительно,не оказывает заметного влияния на иммунную систему у подопытных животных. Экстракт из эмбрионов со сроком развития 6 суток обладает как стимулирующим влиянием на антителогенез, проявляющимся в дозе О,1 мг/ мл , так и показывает высокую фагоцитозстимулирующую активность, проявляющуюся в дозе 0,1 мг/кг (рис.1 - 2). Активация антителогенеза при введении экстракта из эмбрионов с 6-и суточным сроком развития сопровождается усилением синтеза белка. Особенностью протеинограмм крови является появление интенсивной полосы фракции (52-глобулинов после введения эмбрионального экстракта в дозе 10 мг/кг.

Увеличение фракции -глобулинов .наряду с повышением содержания и ^-глобулинов , может свидетельствовать об активации ретикуло-эндотелиальной системы, ответственной за неспецифическую резистентность организма к неблагоприятным условиям. Повышение уровня альбуминов крови указывает на воздействии эмбриональных экстрактов на белоксинтезирующую и транспортную функции печени.

Особый интерес представляют исследования влияния биологически активных веществ эмбрионального происхождения на иммунную систему при иммунодепрессиях и иммунодефицитах различной этиологии. Показано,что введение экстракта из 6-и суточных эмбрионов способствует восстановлению иммунореактивности иммунодепрессирован-ных рентгеновским излучением подопытных животных (табл.1).

Стимулирующее влияние экстракта на гуморальный иммунный ответ проявлялось также в условиях Т-клеточного иммунодефицита, вызванного предварительным введением гидрокортизона(табл.2). Установлено, что введение эмбрионального экстракта способствует восстановлению подавленного иммунитета при введении его в дозе 0,1 мг/кг.

Таким образом, установлено, что экстракты эмбриональных тканей кур и перепелов конца первого триместра развития обладают выраженным биологическим влиянием на макроорганизм.

%

2004

100-

К 0,1 1,0 к 0,1 1,0

Рис.1 Влияние экстракта эмбриональной ткани кур на антите-логенез у б/п мышей при одновременном введении с тест-антигеном (эритроциты барана).

1- Срок развития эмбрионов 4 суток;

2- Срок развития эмбрионов 6 суток;

* - различия с контролем достоверны (Р<0,05)

Функциональная активность макрофагов,%

Рис.2 Влияние экстракта эмбриональной ткани кур на фагоцитоз перитонеальных макрофагов.

1- Срок развития эмбрионов 4 суток;

2- Срок развития эмбрионов 6 суток;

* - различия с контролем достоверны (Р<0,05)

Таблица 1

Влияние биологически активных веществ из 6-и суточных эмбрионов кур на уровень гуморального иммунного ответа через 24 часа после введения антигена ОБ) у беспородных мышей, облученных в дозе 4 Гр.

Группа Доза препа- Гемолизины, све- % к облученному

животных рата, мг/кг топоглощение х 1000 контролю

Интактные, — 12,0 ± 0,6 —

контроль

Облученные, — 6,0 ± 0,6 100

контроль

Облученные 1,0 10,1 ± 0,9* 168,3

+ препарат

* - различия с облученным контролем достоверны (РС0.05)

Таблица 2

Влияние эмбрионального экстракта кур на развитие гуморального иммунного ответа через 24 часа после введения антигена (ЭБ) в условиях Т-клеточного иммунодефицита, вызванного введением гидрокортизона.

Группа Доза. Иммуноде- Гемолизины,

мг/кг прессйя (светопоглощение

х 100)

антиген (ЭБ) — - 26,0 ±2,0

антиген (ЭБ) — + 17,3 ± 2,3**

ЭБ + экстракт 0, 1 + 24,2 + 2,2*

ЭБ + экстракт 1.0 + 24,3 ± 2,5*

ЭБ + экстракт 10,0 + 20,9 ± 1,3*

* - достоверно к иммунизированному иммунодепрессивному контролю (Р<0,05)

" - Достоверно к иммунизированному неиммунодепрессивному контролю (Р<0,05)

4. Фракционирование эмбрионального экстракта. Для того,чтобы приблизительно оценить область,в которой находятся иммунологичес-ки активные компонеты проводили ряд хроматографий с использованием матриц, позволяющих фракционировать компоненты в диапазоне до 2 МБа включительно. Для оценки иммунологической активности фракций использовали метод определения активности фагоцитоза перито-неальных макрофагов мышей.Данные биоиспытаний полученных фракций показали,что основная масса иммунологически активных компонетов имеет вес менее 100 кБа. Поэтому для дальнейшего фракционирования использовали сефадексы.

Фракционирование на сефадексе С-100 позволило получить ряд отдельных фракций,однако данные биоиспытаний показали,что иммунологическая активность тестируется практически во всех фракциях. В ходе проведения дальнейших экспериментов выяснилось, что наиболее эффективное разделение фракций происходит при применении сефадек-са С-75 . Экстраполяция условий на препаративную гель-фильтрацию позволила получить три индивидуальных фракции с коэффициентом разделения, близком к к=1 (рис.3.)

Биологический анализ фракции 1 (компоненты с молекулярным весом более 45 кДа) показал, что ее иммуностимулирующая активность незначительна. Физико-химический анализ показал,что данная фракция содержит 90% белка и 10% небелковых соединений (нуклеиновые кислоты, полисахариды).Разделение фракции на составляющие позволило идентифицировать следующие компоненты: макроглобулины , гемоглобин, оксигемоглобин, альбумин и белки альбуминового ряда, фе-тальные белки , высокомолекулярные фрагменты нуклеиновых кислот, а так же ряд неидентефицированных белков. Суммарный материал данной фракции составляет около 60% от содержания всех компонентов эмбрионального экстрата.Существенным моментом в данном случае является то,что в состав указанной фракции вошли компоненты,отрицательно влияющие на организм животного - реципиента,т.е. компонен--ты.вызывающие провоспалительный и иммуносупрессорный эффект.

Биологический анализ фракции 2 (компоненты с молекулярным весом в диапазоне 15 - 45 кДа) показал, что иммуностимулирующая активность эмбрионального экстракта обусловлена веществами,содержащимися именно в ней. Особо следует отметить,что данная фракция не содержит компонентов,подавляющих иммунитет. Физико-химический анализ фракции показал,что она содержит 90% нуклеиновых кислот и

Рис.3 Хроматография цельного эмбрионального экстракта на

Сефарозе СЬ4В (1),Сефадексе й-ЮО (2),Сефадексе 6-75 (3)

- оптическая плотность;

*--*—* фагоцитозстимулирующая активность (процент прироста функциональной активности макрофагов).

10% белков, молекулярно-весовое распределение которых находится в области 15 - 45 кБа..Компоненты,содержащиеся в данной фракции, составляют около 16% от всего материала эмбрионального экстракта.

Фракция 3 (низкомолекулярные компоненты) также обладает иммуностимулирующим действием,однако данная активность выражена слабо. Судя по результатам физико-химического анализа, фракция содержит низкомолекулярные белки и низкомолекулярные фрагменты нуклеиновых кислот. Совокупный материал фракции составляет около 24% от содержания всех компонентов эмбрионального экстракта.

5.Изучение состава иммунологически активной Фракции и идентификация действующего начала.Для определения класса биологически активных веществ, содержащихся в иммунологически активной фракции, и оказывающих выраженное влияние на иммунную систему,представлялось целесообразным разделить компоненты фракции на отдельные группы,в частности на белки, РНК, поли(А)-РНК, поли(А)-рибонукле-опротеиды, ДНК, и провести анализ иммуностимулирующего действия каждой группы по отдельности и в сочетаниях.Как следует из экспериментов по хроматографическому разделению материала фракции на гидроксилаппатите (ГАИ) , основное количество материала фракции, около 80%, представлено спектром РНК . Белки составляют около 10%, и приблизительно столько же - фрагменты ДНК. В ходе фракционирования РНК на поли(У)-целлюлозе удалось получить в очищенном виде как поли(А)-РНК, так и комплексы поли(А)-РНК с ассоциированными с нею белками .Белковый анализ иммунологически активной фракции показал, что она содержит белки цитокинового ряда, содержащиеся в цельном экстракте ( интерлейкин-1Р и ФНО-а в концентрации 50 - 60 нг/мл),и ряд неидентифицированных белков,не обладающих биологической и ферментативной активностями,и несущими,очевидно, структурную функцию.

Для идентификации действующего начала проведены эксперименты по влиянию отдельных групп биологически активных веществ на фагоцитоз перитонеальных макрофагов. В частности исследованы белковая составляющая фракции, ДНК, РНК и группа, представленная молекулами РНК .содержащими поли(А)-концевые последовательности.В ходе проведенных экспериментов выяснилось,что практически вся иммуностимулирующая активность эмбрионального экстракта находится во

фракции, содержащей поли(А)-РНК.Данная фракция проявляла активность в дозе 500 нг/кг веса (5*10"4мг/кг) (табл.3,4). Для пот-верждения полученных данных экспериментальные образцы препарата были обработаны РНК-азой панкреатической. Как показали результаты биологического эксперимента, фагоцитарная активность макрофагов мышей после внутрибрюшинного введения такого препарата не отличалось от контроля .В то-же время, процедура депротеинизации с помощью фенола не приводила к потере биологического действия. Установлено, что фагоцитарная активность депротеинизированной и исходной фракции была однозначной (табл.5).

Из литературы известно (Кусмарцев С. А. .1994), что экзогенные РНК,вводимые в организм ,способны проникать в эукариотические клетки,на поверхности которых обнаружены белки, специфично связывающие РНК.Попав в клетку, молекулы РНК включаются в биохимические процессы клетки,м-РНК при этом образуют полисомы, тем самым запуская синтез кодированных ими белков . Можно предположить, что поли(А)-РНК эмбрионального происхождения , представляющие собой пул м-РНК,будучи введеннымив организм животного, проникают в клетки и запускают синтез белков и пептидов,обладающих регулятор-ными и стимулирующими функциями по отношению к клеткам иммунной системы.

6. Разработка технологии получения препарата иммуностимулирующего действия.Как было показано .иммуностимулирующая активность эмбриональных экстрактов определяется пулом поли(А)-мРНК.В связи с этим технология получения препарата иммуностимулирующего действия сводится к процедуре выделения данного класса молекул.

Разработка способа отделения суммарных РНК. Существует множество способов отделения нуклеиновых кислот из грубых клеточных экстрактов. В процессе работы мы остановились на способе отделения нуклеиновых кислот с использованием спиртового осаждения, как на наиболее технологичном.Эксперименты показали, что при добавлении этанола к эмбриональному экстракту до конечной концентрации 75% нуклеиновые кислоты эмбрионального экстракта полностью переходят в осадок . Однако при оса&дении нуклеиновых кислот таким способом наблюдалось соосаждение значительного количества балластных белков,в том числе фетальных гемоглобина и оксигемоглоби-на. Проведены эксперименты по изучению поведения фетального гемог-

Таблица 3

Биологическая активность различных классов биологически активных веществ иммунологически активной фракции эмбрионального экстракта.

Группа веществ Доза препарата мг/кг веса Показатели фагоцитоза

фагоцитарная активность % к контролю

Тотальная фракция белков 0,01 0,10 контроль 6,7 + 0,5 7,7 ± 1.8 6,9 + 0,9 97 111

Тотальная фракция ДНК 0,01 0,10 контроль 35.2 + 2,6 32.5 1 4,0 30,5 ± 3.4 112 108

Тотальная фракция РНК 0,01 0,10 контроль 35,6 ± 5,6* 32,8 ± 4,1* 12,4 + 0,1 231 264

* - различия с контролем достоверны (Р<0,05)

Таблица 4

Биологическая активность различных классов РНК иммунологически активной фракции эмбрионального экстракта.

Группа веществ Доза препарата мг/кг веса Показатели фагоцитоза

фагоцитарная активность % к контролю

Фрагменты РНК, т-РНК Ю"2 5*10"4 контроль 56.7 ± 4,5* 31,5 1 4,8 26,9 ±1,9 211 116

Поли(А)-мРНК 10"2 45,2 + 2,6* 221

5*10"4 42,5 ± 4,0* 207

контроль 20,5 ± 3,4 ---

* - различия с контролем достоверны (Р<0, 05)

лобина и суммарной белковой фракции в процессе спиртового осаждения. Эксперименты показали,что основные количества белков осаждаются при добавлении этанола к эмбриональному экстракту до конечной концентрации 50%.При этом в осадок переходит практически 90% содержащегося в экстрактах гемоглобина,в то время,как РНК остается в растворе .В связи с этим решено стадию спиртового осаждения сделать дробной, а именно: вначале удалить балластные белки и гемоглобин добавлением к экстракту этанола до концентрации 50%,а после удаления осадка центрифугированием выделить пул РНК добавлением этанола до конечной концентрации 75%.Как показали эксперименты, в ходе такой процедуры удается из цельного эмбрионального экстракта удалить значительное количество балластных белков .при этом примесь фетальных гемоглобина и оксигемоглобина в растворе суммарных РНК составляет около 10% от исходного.

Разработка способа удаления фетального гемоглобина. Проблема удаления гемоглобина из тканевых экстрактов встает практически перед каждым исследователем, изучающим биологически активные вещества животного происхождения.В ходе экспериментов было решено использовать свойства гемоглобина связываться с высокой степенью сродства с карбоксигруппами. Поиск среди доступных сорбентов показал, что наиболее оптимальными характеристиками обладает карбок-симетилцеллюлоза. Ее использование позволило совместить ионобмен-ную хроматографию с аффинной.При отработке данного способа отдано предпочтение динамическому варианту хроматографии на карбоксиме-тилцеллюлозе отечественного производства, как на наиболее технологичном. Такой способ удаления гемоглобина показал себя достаточно эффективным, при этом высокая аффинность гема к карбокси-группам приводила к необратимой сорбции его на сорбенте. Кроме того,данная хроматография позволила освободиться также и от ряда иммуно-логически неактивных белков . Финишную очистку иммунологически активного материала проводили на поли(У)-целлюлозе. Очищенный таким образом экстракт представляет собой субстанцию, содержащую компоненты, обуславливающие иммуностимулирующую активность цельного эмбрионального экстракта в физиологически сбалансированных пропорциях. Данная субстанция свободна от глобулинов,гемоглобина, оксигемоглобина, и ряда других белков, обладает выраженной иммуностимулирующей активностью в дозе 0,01 мг/кг. Субстанция представляет собой фракцию РНК и поли(А)-мРНК.содержит примесь белков

Таблица 5

Изменение фагоцитозстимулирующей активности иммунологически активной фракции при депротеинизации и обработке панкреатической рибонуклеазой.

Фракция Фагоцитар- % К

ная актив- контролю

ность

Контроль 37,5+3,2 100

(физраствор);

Необработан- 64,1+5,8 171*

ная фракция;

Фракция после 59,0+5,4 160'

фенольной де-

протеинизации;

Фракция после 40,1+2,1 108

обработки РНК-

азой.

' - различия с контролем достоверны (Р<0,05)

Таблица 6

Результаты экспериментов по выделению иммунологически активной субстанции по разработанной технологии.

Этап очистки Объем Наимень- Содержа- Содержание Степень

фрак- шая эффе- ние белка. иммунологи- очистки

ции, ктивная мг/мл чески актив-

мл доза, мг/кг- ного материала. %

Цельный эм- 100 0,1 7+1 100 1

бриональный

экстракт;

Экстракт спи- 100 0,1 2,5+0, 5 100 4

ртового осад-

ка;

Хроматография 80 0,01 0.12+0,05 85 60

на КМ-целлю-

лозе;

Хроматография 10 5*10"4 0,03 10 200

на поли(У)-

целлюлозе.

цитокинового ряда в физиологической концентрации.По сравнению с цельным эмбриональным экстрактом степень очистки иммунологически активной субстанции по белкам составляет не менее, чем в 60 раз (табл.6).Поскольку содержащиеся в субстанции белки в данной концентрации отрицательного влияния на биологическую активность не оказывают, полученная субстанция была использована для наработки препарата иммуностимулирующего действия с вышеуказанным названием "Фагостим". На препарат оформлен проект Технических условий ( ТУ 9291-010-00479979-95).

7. Исследование биологических свойств ветеринарного препарата иммуностимулирующего действия и его апробация.При проведении исследований влияния разработанного препарата фагостим на иммунную систему плотоядных, в частности собак,выяснилось,что доза, расчитанная исходя из данных,полученных на лабораторных животных (мыши), требует уточнения.

Испытания препарата фагостим проводили на собаках различных пород в Омском Государственном ветеринарном институте и ветеринарной службой Общества любительского собаководства (БГОЛС) г.Бердска,Новосибирской области при лечении широкого спектра заболеваний. Было показано, что введение препарата в стандартную схему лечения острых инфекционных заболеваний, включающую антибио-тикотерапию, снижает длительность лечения в среднем на 50%, и на 90% возникновение рецидивов. При лечении препаратом фагостим животных с различными формами вторичных иммунодефицитов и иммуно-депрессий выяснилось, что препарат восстанавливает функционирование иммунной системы животного, что приводит к полному излечению 70% животных,и существенному улучшению состояния 25% больных животных.

Поскольку препараты на основе РНК (такие, как ридостин, вес-тин) являются индукторами интерферона, и , следовательно,проявляют противовирусную активность, были проведены эксперименты по изучению противовирусной активности фагостима. Эксперименты на лабораторных животных потвердили наличие выраженной противовирусной активности, в связи с чем были проведены эксперименты по модулированию защитных реакций у собак, имевшим контакт с особями, больными острыми инфекционными заболеваниями (чума плотоядных, парвови-роз,короновироз,аденовироз). Как показали испытания, ни одна из 50 собак,получивших фагостим в течение первых трех суток после кон-

такта,не заболела.В контрольной группе животных исследования показали следующие результаты. У собак, перенесших контакт с особями, больными чумой плотоядных, через 10 - 14 дней обнаружились признаки заболевания. При этом.у половины обследованных животных наблюдалась легкая форма, и у 15% особей - тяжелая форма заболевания. У собак,контактировавших с особями,больными парвовиро-зом,развитие болезни отмечалось у 65% животных - в легкой,и у 30%- в тяжелой форме соответственно.

Интересные данные были получены при лечении вторичных имму-нодефицитов,вызванных сменой климатического пояса у молодняка элитных собак, привезенных из ряда европейских стран.Известно,что естественная резистентность элитных пород животных снижена в связи с часто практикующимся близкородственным скрещиванием,что зачастую приводит к нарушению функций иммунной системы.

В экспериментах было показано,что после курса лечения препаратом фагостим (5 инъекций, через 48 часов каждая),у собак нормализуются гематологические показатели, в частности, приходит в норму содержание гемоглобина и количество эритроцитов,а также наблюдается улучшение показателей лейкоцитарной формулы периферической крови (табл.7). Наблюдаются улучшения ряда физиологических показателей собак, а именно,у животных исчезает вялость и появляется аппетит.Полученные данные позволяют предполагать наличие выраженных адаптогенных свойств вышеназванного препарата .У контрольных особей,не получавших фагостим, период адаптации растягивался до 2 месяцев.

Учитывая полученные в экспериментах на лабораторных животных данные о стимуляции белоксинтезирующей функции печени,было сделано предположение,что препарат должен обладать гепатопротекторной активностью, что и было обнаружено в процессе апробации препарата на служебных собаках. В частности, из 40 собак с диагнозом "пироплазмоз", получавших препарат при стандартном курсе лечения с использованием азидина.ни у одного животного не было отмечено осложнений на печень.

Поскольку препараты на основе нуклеиновых кислот проявляют адъювантную активность, были проведены эксперименты по стимуляции выработки антител на вводимую вакцину.Испытания проводили на собаках различных пород в возрасте до 4 месяцев,которых прививали против чумы плотоядных и парвовирусного энтерита на фоне введен-

Таблица 7

Гематологические показатели периферической крови у собак с вторичным иммунодефицитом после проведения курса лечения препаратом "Фагостим".

Наименование показателя Норма До лечения После лечения

СОЭ, мм/ч Гемоглобин, г/л Эритроциты, хю12/л Лейкоциты,х1о9/л 6 ± 1.10 115± 2.13 5,99+0,08 12,74+0,49 12+2 102+2,2 5,1+0,1 12,1+0,5 7,0+1* 116+3,1* 6,1+0,1* 12,2+0,3

Лейкоцитарная 14,14±1,89 42,41±1,01 2,7+0, 42 12,0510,94 6,34 ±0,47 28+5,6 43+1,0 5. 2+0, 5 11,5±1, 0 3,4 +0,5 13±2* 44+1,2 2, 9+0,3* 10,1+1,1 3, 4±0, 5

Формула

Палочкоядерные нейтрофилы,%; Сегментоядерные нейтрофилы, %; Зозинофилы, %: Лимфоциты, %: Моноциты, %;

'Показатели, вошедшие в норму.

Таблица 8

Эффективность вакцинирования собак к чуме плотоядных и парвови-русному энтериту с использованием препарата "Фагостим" в качестве адъюванта.

Вид вакцинации Количество животных Эффективность вакцинации, %

в группе не заболели в период вспышки заболевания перенесли заболевание

в легкой форме в тяжелой форме

"Вакчум" по схеме 25 13 9 3 52

"Парвовак" по схеме 25 10 10 5 40

"Вакчум" на фоне Фаго-стима 25 23 2 0 96

"Парвовак" фоне Фаго-стима 25 22 3 0 94

ного препарата.В процессе экспериментов тестировали уровень специфических антител в сыворотке крови животных. Кроме того,об эффективности вакцинации судили по количеству заболевших животных при наблюдении в течение года. Выяснилось,что эффективность вакцинации на фоне введения фагостима существенно превышает вакцинацию по традиционной схеме (табл .8),что свидетельствует о высокой адъювантной активности фагостима.

Проведенные испытания убедительно показывают, что препарат на основе биологически активных веществ эмбриональной ткани кур и перепелов с 6-и суточным сроком развития оказывает выраженное положительное влияние не только на иммунную систему животных,но также на кроветворную и белоксинтезирующую функции организма животных.

ВЫВОДЫ

1. Биологически активные вещества эмбриональных тканей птиц, выделенные по предлагаемой оригинальной методике, обладают фагоцитозстимулирующей,антителогенезстимулирующей.и радиопротек-тивной активностью.

2.К концу первого триместра эмбрионального развития у птиц тестируются белки цитокинового ряда, в частности интерлейкин-1|5 и ФНО-а , которые связывается с моноклональными антителами на соответствующие цитокины человека.

3. Иммунотропные эффекты экстрактов эмбриональных тканей зависят от содержащихся в них поли(А)-мРНК с молекулярно-весовым распределением 15 - 40 М)а.

4. На основе иммунологически активных веществ эмбриональных тканей кур и перепелов разработан ветеринарный препарат иммуностимулирующего действия фагостим, эффективная доза которых составляет 0,01 мг/кг веса. Препарат нетоксичен, непирогенен, обладает выраженным терапевтическим эффектом.

5.Введение фагостима в стандартную схему лечения острых инфекционных заболеваний (чума плотоядных, парвовироз, коронови-роз.аденовироз) в среднем на 50% снижает длительность лечения,на 90% возникновение рецидивов. Использование фагостима по схеме животным с нарушениями иммунной системы приводит к полному излечению 70% животных,и существенному улучшению состояния 25% больных животных.

тт.// Сб. науч. трудов научно-исследовательского конструкторс-ко-технологического института биологически активных веществ, Вердск, 1996, С. 104 - 110.

4. Масычева В.И., Хомов В.В.,Сизов A.A..Фадина В.А. .Барановская Г.А.,Сизова Л.Ю, Иммуностимулирующие и адаптогенные свойства препарата "Фагостим".// Сб. науч. трудов научно-исследовательского конструкторско-технологического института биологически активных веществ, Бердск, 1996, С.185 - 189.

5. Масычева В.И., Хомов В.В.,Сизов A.A., Разворотнев В.А,Федосова J1. К. .Барановская Г. А. .Бубенина Л. А. Влияние биологически активных веществ эмбриональной ткани птиц на иммунную систему животных. // 7я межгосуд.межвуз.науч.-практ. конф. "Новые фармакологические средства в ветеринарии":Тез. докл. -г.Санкт-Петербург.1995, С.47.

6.Хомов В.В. .Сизов А. А..Масычева В.И..Разворотнев В. А.,Фадина В.А. Технология получения препарата неспецифической резистентности организма "Фагостим".// Междунар.науч.-практ. конф."Перспективы развития производства биопрепаратов для медицины и сельского хозяйства":Тез.докл.- г.Степногорск.1995,4.1, С.133.

7.Заявка на патент " Способ получения нуклеопротеидных комплексов из эмбрионов птиц,обладающих иммунотропной и радиопротек-тивной активностью". Хомов В. В., Сизов А. А.,Масычева В.И.,Разворотнев В.А. ,Фадиг " ' ------ """'11312 от 30.06.95.