Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Иммунорегуляторные эффекты опиоидных пептидов у лиц различных возрастных групп

На правах рукописи

Гилёва Светлана Геннадьевна

ИММУНОРЕГУЛЯТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ ОПИОИДНЫХ ПЕПТИДОВ У ЛИЦ РАЗЛИЧНЫХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУПП

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 я НОЯ ЯИЗ

005539905

Работа выполнена в лаборатории биохимии развития микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН г. Пермь

Научный руководитель:

Гейн Сергей Владимирович, доктор медицинских наук, ИЭГМ УрО РАН, лаборатория биохимии развития микроорганизмов, профессор.

Официальные оппоненты:

Сашенков Сергей Львович, доктор медицинских наук, ГБОУ ВПО «ЮжноУральский государственный медицинский университет» Министерство здравоохранения Российской Федерации, кафедра нормальной физиологии, профессор.

Чистякова Гузель Нуховна, доктор медицинских наук, ФГБУ «Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества» Министерства здравоохранения Российской Федерации, научный отдел иммунологии и клинической микробиологии, руководитель, доцент.

Ведущая организация: Федеральное Государственное бюджетное учреждение «НИИ экспериментальной медицины» Северо-западного округа РАМН

Защита состоится «19» декабря 2013 г. в _часов на заседании

Диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Автореферат разослан «_»_2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук

Ю.С. Шишкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Опиоидные пептиды являются важными факторами регуляции целого ряда функций и систем организма (Bodnar, R.J. Endogenous opiates and behavior: 2010 / R.J. Bodnar // Peptides. 2011. V. 32. P. 2522-2552.; Verburg-van Kemenade, B.M.L. Neuroendocrine-immune interaction: Regulation of inflammation via G-protein coupled receptors / Verburg-van Kemenade B.M.L., L.M. Van der Aa, M. Chadzinska // General and Comparative Endocrinology. 2013. V. 188. P. 94-101.). Данное семейство биорегуляторов было впервые описано во второй половине 70-х годов XX века (Dalayeun, J.F. Physiology of P-endorphins. A close-up view and a review of the literature / J.F. Dalayeun, J.M. Nores, S. Bergal // Biomed & Pharmacorher. 1993. V. 47. P. 311-320.). Тогда были выделены и описаны три основных семейства эндогенных опиоидных пептидов: эндорфины, энкефалины и динорфины, образующиеся в результате расщепления крупных молекул-предшественников проопиомеланокортина, проэнкефалина и продинорфина соотвественно. Опиоидные пептиды реализуют свои эффекты через связывание с опиатными рецепторами трех основных типов (ц, 8, к), экспрессия которых на клетках иммунной системы доказана методами радиолигандного связывания и детекции соответствующей РНК (Bidlack, J. М. Detection and Funktion of Opioids Receptor on Cells from the Immune System / J. M. Bidlack // Clin. Diagnostic Lab. Immunol. 2000. V. 7. P. 719-723.). Опиоидные пептиды широко представлены как в ЦНС, так и на периферии. Первоначально продукты расщепления проопиомеланокортина, проэнкефалина и продинорфина были идентифицированы в центральной нервной системе, гипоталамусе, гипофизе, однако впоследствии они были обнаружены в эпидермальных клетках различного происхождения, периферических нервных окончаниях, желудочно-кишечном тракте, сердце, легких, щитовидной железе, половых железах, плаценте, в экстрактах тимуса, селезенки и костного мозга, а также в стимулированных и не стимулированных клетках иммунной системы (Madden, К. Experimental basis for neural-immune interactions / К. Madden, D. Felten // Physiol. Rev. 1995. V. 75. P. 77-105.; Pepe, S. Cross-talk of opioid peptide receptor and P-adrenergic receptor signalling in the heart / S. Pepe, O. van den Brinka, E.G. Lakattab et al. II Cardiovascular Research. 2004. Vol. 63. P. 414-422.; Salzet, M. Neuroimmunology of opioids from invertebrates to human / M. Salzet // Neuroendocrinol. Lett. 2001. V. 22. P. 467-474.). В очаге воспаления под воздействием антигена или высоких концентраций провоспалительных цитокинов опиоидные пептиды всех семейств продуцируются в непрогнозируемых соотношениях, обусловливая широкий спектр иммунорегуляторных эффектов, реализуемых по пара- и аутокринному механизму и купируя в очаге воспаления боль (Stein С. Peripheral mechanisms

of opioid analgesia / C. Stein, L.J. Lang // Current Opinion in Pharmacology. 2009. V. 9. P. 3-8.). Выделение эндогенных опиоидных пептидов в организме носит импульсный характер и наблюдается при различных стрессах, травмах, психоэмоциональных состояниях и физических нагрузках (Корнева, Е.А. Гормоны и иммунная система / Е.А. Корнева, Э.К. Шхинек. - Л.: Наука, 1988. 251 е.; Корнева, Е.А. Ведение в иммунофизиологию / Корнева, Е.А. - Элби-Санкт-Петербург, 2003. 48 е.; Корнева, Е.А. Взаимодействие нервной и иммунной систем. Молекулярно-клеточные аспекты / Е.А. Корнева, Н.С. Новикова, К.З. Шаинидзе, С.В. Перекрест. - Санкт-Петербург: «Наука», 2012. 173 е.; Абрамов, В.В. Взаимодействие иммунной и нервной систем / В.В.Абрамов - Новосибирск: Наука, 1988. - 163 е.; Абрамов, В.В. Интеграция иммунной и нервной систем / В.В.Абрамов -Новосибирск: Наука. Сибирское отделение, 1991. 166 е.; Besedovsky, Н.О. Immune-neuro-endocrine interactions: facts and hypotheses/ H.O. Besedovsky, A. Rey // Endocr. Rev. 1996. V. 17. P. 64-102.; Рыбакина, Е.Г. Интерлейкин-1 в молекулярных механизмах нейроиммунных взаимодействий / Е.Г. Рыбакина. Автореф. дис. д-ра биол. наук. СПб, 2001. 44 е.; McEwen, B.S. The role of adrenocorticoids as modulators of immune function in health and disease: neural, endocrine and immune interactionse / B.S. McEwen, C.A. Biron, K.W. Brunson et al. И Brain Research Reviews. 1997. V. 23. P. 79-133.; Elenkov, I.J. Stress hormones, Thl/Th2 patterns, pro/anti-inflammatory cytokines and susceptibility to disease / I.J. Elenkov, G.P. Chrousos // Trends Endocrinol. Metabol. 1999. V. 10. P. 359-368.; Elenkov, I.J. Systemic stress-induced Th2 shift and its clinical implications / I.J. Elenkov // Neurobiology of the Immune System (Series: International Review of Neurobiology). 2002. V. 52. P. 163-186.; Igarashi, H. Age and stage dependency of estrogen receptor expression by lymphocyte precursors / H. Igarashi, T. Kouro, T. Yokota et al. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 15131-15136.; Tracey, K.J. The inflammatory reflex / K.J. Tracey // Nature. 2002. V. 420. P. 853-859.). Одним из основных показателей стресса является повышение содержания бета-эндорфина в плазме крови (Hale K.D. Effects of rotational stress of different duration on NK cell activity, proinflammatory cytokines, and POMC-derived peptides in mice / K.D. Hale, V.K. Ghanta, D.K. Gauthier et al. // Neuroimmunomodul. -2001. V.9. P.34-40.; Iwai, K. Immobilization stress inhibits intimal fibromuscular proliferation in the process of arterial remodeling in rats / K. Iwai, T. Takahashi, T. Nakahashi el al. И Hypertens Res. 2008. V. 31. P. 977-986.). В настоящее время известно, что секреция бета-эндорфина, в частности, его продукция лимфоцитами в норме и при стрессе существенно изменяется в течение жизни, при этом изменений его концентрации в периферической крови с возрастом не отмечено (Dalayeun, J.F. Physiology of P-endorphins. A close-up view and a review of the literature / J.F. Dalayeun, J.M. Nores, S. Bergal // Biomed & Pharmacorher. 1993. V. 47. P. 311 -320.). У возрастных субъектов повышена концентрация бета-эндорфина в

нестимулированных мононуклеарах периферической крови, и в условиях стимуляции клеток лектинами, концентрация внутриклеточного бета-эндорфина у возрастных субъектов снижается более выраженно, нежели у молодых (Panerai, А.Е. Beta-endorphin in the immune system: A role at last / A.E. Panerai, P. Sacerdote // Trends Immunol. Today. 1997. V. 18. P. 317-319.). Помимо этого, в процессе старения организма наблюдаются нарушения механизмов адаптации к внешним воздействиям (Фрольксис, В.В. Старение и увеличение продолжительности жизни / В.В. Фрольксис. - Л: «Наука», 1988. 239 е.). Другим важным фактором, определяющим иммунологическую реактивность организма, является пол (Kovaiou, R.D. Age-associated changes within CD4+ T cells / R.D. Kovaiou, B. Grubeck-Loebenstein // Immunology Letters. 2006. V.107. P. 8-14.), что, в свою очередь, определяет возникновение и течение различных заболеваний (Drackmann, R. Female sex hormones, autoimmune diseases and immune Response / R. Drackmann // Gynecol. Endocrinol. 2001. V. 15. P. 69-76.), а также различную продолжительность жизни мужчин и женщин (Hall, J.E. Neuroendocrine changes with reproductive aging in women / J.E. Hall // Semin Reprod Med. Review. 2007. V. 25. P. 344-351.). Цель исследования

Исследовать влияние эндогенных опиоидных пептидов на отдельные функции клеток врожденного и адаптивного иммунитета у здоровых доноров - добровольцев мужского и женского пола различных возрастных групп. Задачи исследования

1. Исследовать влияние бета - эндорфина на пролиферативный ответ лимфоцитов периферической крови у лиц мужского и женского пола различных возрастных групп ш vitro.

2. Исследовать влияние мет- и лей-энкефалинов на пролиферативный ответ лимфоцитов периферической крови у лиц мужского и женского пола различных возрастных групп in vitro.

3. Исследовать влияние бета - эндорфина, мет- и лей-энкефалинов на фагоцитарную активность нейтрофилов и моноцитов периферической крови у лиц мужского и женского пола различных возрастных групп in vitro.

4. Исследовать влияние бета-эндорфина на продукцию активных форм кислорода фракцией лейкоцитов периферической крови доноров мужского и женского пола различных возрастных групп in vitro.

Методология и методы исследования

Работа выполнена в лаборатории биохимии развития микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН г. Пермь.

Объектом исследования в опытах in vitro служили лейкоциты периферической венозной крови, полученной от 82-х соматически здоровых людей - добровольцев 20-59 лет, при отсутствии клинических и лабораторных признаков острого воспаления или обострения хронического воспалительного процесса. У доноров-женщин 20-49 лет забор крови производился в первую фазу овуляторного цикла. Все исследования проводились в соответствии с этическими нормами, с согласия доноров-добровольцев после ознакомления их с условиями и задачами эксперимента.

Таблица 1 - Распределение доноров-добровольцев по возрасту и полу

Пол/возраст 20-29 лет 30-39 лет 40-49 лет 50-59 лет

Мужчины 22,1 (п=12) 35,3 (п=9) 45,8 (п= 12) 52,5 (п=8)

Женщины 22,8 (п=10) 33,9 (п=11) 44,1 (п=10) 53,9 (п=10)

Всего п=22 п=20 п=22 п=18

Фагоцитарную активность нейтрофильных лейкоцитов оценивали по результатам модифицированного метода Каплина. В микропробирках с антиадгезивным покрытием смешивали 25 мкл гепаринизированной крови и 25 мкл бета-эндорфина («Skytek laboratories», США), мет- и лей-энкефалины в концентрациях 10"7 - 10"'° М, пробы инкубировали в течение 1 ч при температуре 37°С. После инкубации к пробам добавляли 25 мкл суспензии формалинизированных эритроцитов барана (ФЭБ) (100х106/мл в среде 199 с добавлением 10 мМ HEPES и 2 мМ L-глутамина). В качестве объектов фагоцитоза ФЭБ были выбраны по следующим причинам: они имеют более крупные размеры в сравнении с бактериальными клетками, окрашиваются азур 2-эозином в отличие от собственных эритроцитов в синий цвет, что значительно повышает объективность микроскопического учета результатов в данном методе. Кроме того, фагоцитоз осуществляется при участии тех же молекул клеточной адгезии и опсонизирующих факторов плазмы, что и естественных объектов, а так же при использовании данной модификации используется цельная кровь, что позволяет избежать изменения функциональной активности фагоцитирующих клеток в процессе их выделения. Помимо этого, метод позволяет работать с микроколичествами крови (Шилов, Ю.И. Некоторые методические подходы к оценке показателей общего и дифференцированного фагоцитоза лейкоцитов периферической крови. Характеристика различий у здоровых людей / Ю.И. Шилов, В.П. Владыкина, А.Т. Атнагузина // Перм. мед. журн. 1998. Т. 15, № 2. С. 3-9.). Пробы инкубировали 20 минут при 37°С, после чего готовили мазки, которые после фиксации окрашивали по Романовскому. Активность фагоцитарной функции оценивали по фагоцитарному числу (количество объектов

фагоцитоза, которое в среднем приходится на 1 из 300 подсчитанных фагоцитов) и активности фагоцитоза (количество клеток, захвативших объекты фагоцитоза, из 100 подсчитанных фагоцитов), всего просчитано 1100 мазков. Дифференцированный подсчёт клеток проводился по морфологическим признакам биомикроскопическим методом.

Пролиферативную активность лимфоцитов оценивали по результатам РБТЛ. Гепаринизированную кровь перемешивали и помещали в термостат при температуре 37°С на 60-90 мин. После отстаивания верхний слой плазмы с лейкоцитами снимали и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 15 мин. После центрифугирования верхний слой плазмы снимали, а осадок ресуспендировали в 2 мл полной культуральной среды, которую готовили ex tempore, на основе питательной среды 199 с добавлением 2 мМ L-глутамина (Reanal, Венгрия), 10 мМ HEPES (Ы-2-гидроксиэтилпиперазин^'-2-этансульфоновая кислота, «Sigma»), 100 мкг/мл гентамицина сульфата. Использовали микрометод культивирования лимфоцитов в пластиковых круглодонных 96-луночных планшетах (завод «Медполимер», Санкт-Петербург). Каждая культура содержала 2*105 клеток в 0,2 мл полной культуральной среде, 10% ЭТС («Биолот», С-Петербург), фитогемагглютинин П (ФГА, «Sigma») в концентрациях 2,5 и 20 мкг/мл. Культивирование осуществляли во влажной атмосфере с 5% СО2 при 37°С в течение 72 часов. За 18 часов до окончания культивирования в каждую лунку вносили по 2 мкКи 3Н-метилтимидина в объеме 10 мкл. Радиоактивность проб определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике «Guardian» («Wallac», Финляндия). При подсчете использовали сцинтиляционную жидкость ЖС-107. В экспериментах in vitro использовали бета-эндорфин («Skytek laboratories», США) в концентрациях 10"7 - 10"'° М, мет-энкефалин и лей-энкефалин («Skytek laboratories», США) в тех же концентрациях.

Оценку кислородзависимой микробоцидной активности лейкоцитов осуществляли с использованием реакции люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ). В качестве индуктора ЛЗХЛ использовали опсонизированный зимозан в концентрации 15 мкг/мл и 150 мкг/мл. Агонист ц/5-опиатных рецепторов бета-эндорфин человека («Sigma», США) вносили в культуры одновременно с индуктором в концентрации 10"7 М. В качестве маркера выраженности реакции ЛХЗЛ использовался люминол (10 5 М). Регистрация результатов проводилась в течение часа с помощью многофункционального спектрофотометра TECAN (Австрия).

Полученные результаты были обработаны статистически с помощью однофакторного дисперсионного анализа для парных данных и LSD-критерия Фишера для межгруппового сравнения. Результаты, полученные в опытах с ЛЗХЛ, обрабатывали с помощью парного t-критерия Стьюдента.

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора

Вся экспериментальная работа проведена соискателем лично на всех этапах получения исходных данных, научных экспериментов, обработке и интерпретации полученных результатов. Подготовка основных публикаций по выполненной работе производилась автором при непосредственной консультативной помощи научного руководителя. Основные положения диссертационной работы представлены на X Молодежной научной конференции «Физиология человека и животных от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2011 г.), IX конференции иммунологов Урала (г. Челябинск, 2011г.), XI Молодежной научной конференции «Физиология человека и животных от эксперимента к клинической практике» (г. Сыктывкар, 2012 г.).

Положения, выносимые на защиту

1. Установлено, что модуляция пролиферативной активности лимфоцитов бета-эндорфином у доноров мужского пола наблюдается преимущественно в более молодом возрасте в группах 20-29 и 30-39 лет и с его увеличением снижается, фактически исчезая в группе доноров 50-59 лет. В то же время у женщин модулирующий эффект пептида на пролиферацию лимфоцитов сохраняется более длительное время. Мет- и лей-энкефалины модулировали пролиферативный ответ лимфоцитов преимущественно у доноров мужского пола только в возрастной группе 30-39 лет. Мет-энкефалин модулировал пролиферативный ответ у женщин в группе 50-59 лет.

2. У доноров мужского пола бета-эндорфин стимулирует поглотительную способность нейтрофилов в группе 20-29 лет и угнетает - в группе доноров 50-59 лет. У доноров женского пола во всех возрастных группах влияния бета-эндорфина на фагоцитарную активность нейтрофилов зарегистрировано не было. Лей- и мет-энкефалины в высоких концентрациях в группе доноров женского пола 30-39 лет угнетают фагоцитарную активность нейтрофилов. В то же время, на поглотительную активность моноцитов опиоидные пептиды не оказывают влияния во всех возрастных группах независимо от пола.

3. Продукцию активных форм кислорода лейкоцитами бета-эндорфин угнетает с различной выраженностью во всех исследуемых нами возрастных группах независимо от пола.

Научная новизна

В работе впервые проанализировано влияние опиоидных пептидов на реакции адаптивного и врождённого иммунитета в зависимости от пола и возраста. В работе установлено, что модуляция пролиферативной активности лимфоцитов бета-эндорфином у доноров мужского пола наблюдается преимущественно в молодом возрасте в группах 20-29 и 30-39 лет и с его увеличением снижается, фактически исчезая в группе доноров 50-60 лет. В то же время у женщин модулирующий эффект пептида на пролиферацию лимфоцитов

сохраняется более длительное время. Мет- и лей-энкефапины модулировали пролиферативный ответ лимфоцитов у доноров мужского пола только в возрастной группе 30-39 лет. В группах доноров женского пола модулирующих эффектов лей-энкефалина не зарегистрировано, а мет-энкефалин модулировал пролиферативный ответ у женщин в группе 50-59 лет.

У доноров мужского пола бета-эндорфин стимулирует поглотительную способность нейтрофилов в группе 20-29 лет и угнетает — в группе доноров 50-59 лет. У доноров женского пола во всех возрастных группах влияния бета-эндорфина на фагоцитарную активность нейтрофилов зарегистрировано не было. Продукцию активных форм кислорода бета-эндорфин угнетал во всех возрастных группах независимо от пола.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные результаты существенно расширяют существующие представления о роли эндогенной опиоидной системы в нейроэндокринной регуляции иммунных реакций. В работе доказано, что способность опиоидных пептидов модулировать пролиферативную активность лимфоцитов и фагоцитарную функцию гранулоцитов существенно зависит от пола и возраста. В то же время, регуляция микробоцидной активности лейкоцитов опиоидными пептидами от пола и возраста не зависит. Бета-эндорфин снижает продукцию активных форм кислорода у доноров обоих полов во всех возрастных группах.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета (специальные лекционные курсы «Экспериментальная иммунопатология и иммунотерапия», «Молекулярные механизмы межклеточных коммуникаций»).

Публикации

Соискатель имеет 9 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 9 научных работ, общим объёмом 1,34 печатных листов, в том числе 6 статей в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, а также 3 работы, опубликованные в виде тезисов в материалах Российских научно-практических конференций.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 116 страницах машинописного текста, содержит 21 рисунок, 14 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав собственных результатов исследований и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 267 источников, из них 30 отечественных и 237 зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Влияние бета-эндорфина и энкефалинов на пролиферативный ответ лимфоцитов мужчин и женщин различных возрастных групп

Несмотря на то, что продукция эндогенных опиоидных пептидов лимфоцитами в норме и при стрессе с увеличением возраста существенно изменяется, изменений концентрации пептидов в периферической крови не отмечено (Kovaiou, R.D. Age-associated changes within CD4+ T cells / R.D. Kovaiou, B. Grubeck-Loebenstein // Immunology Letters. 2006. V. 107. P. 8-14.). В то же время у возрастных субъектов повышена концентрация бета-эндорфина в нестимулированных мононуклеарах периферической крови, и в условиях стимуляции клеток лектинами, концентрация внутриклеточного бета-эндорфина у возрастных субъектов снижается более выражение, нежели у молодых (Panerai, А.Е. Beta-endorphin ¡n the ¡mmune system: A role at last / A.E. Panerai, P. Sacerdote // Trends Immunol. Today. 1997. V. 18. P. 317-319.). При анализе возрастных изменений интенсивности пролиферативного ответа в контрольных культурах у доноров мужского пола в группе 30-39 лет по сравнению с донорами 20-29 лет (рисунок 1) было выявлено усиление пролиферации в присутствии оптимальной концентрации ФГА (20 мкг/мл) и снижение в присутствии субоптимальной концентрации ФГА (2,5 мкг/мл) (Зозуля, А.А. Опиоиды и иммунитет / А.А. Зозуля, С.Ф. Пшеничкин // Итоги науки и техн. ВИНИТИ. Сер. Иммунология. 1990. Т. 25. С. 48-120.). В группе 40-49 лет показатели пролиферации не отличались от группы 20-29 лет, а в группе 50-59 лет наблюдалось усиление спонтанной пролиферации и снижение интенсивности пролиферативного ответа лимфоцитов в ответ на оптимальную концентрацию ФГА 20 мкг/мл. Таким образом, с увеличением возраста наблюдалось закономерное снижение функциональной активности лимфоцитов в ответ на митоген, а наиболее выраженный ответ на ФГА наблюдался у доноров 30-39 лет.

В отличие от мужчин в группах женщин выраженных отличий в возрастной динамике пролиферативного ответа выявить не удалось, за исключением усиления функциональной активности лимфоцитов в ответ на субоптимальную концентрацию митогена и аналогичную тенденцию в ответ на ФГА 20 мкг/мл в группе 30-39 лет по сравнению с группой 20-29 лет (рисунок 1). В отличие от мужчин, обращает на себя внимание отсутствие снижения выраженности пролиферации лимфоцитов в ответ на митоген у женщин 50-59 лет по сравнению с группой молодых женщин 20-29 лет. Таким образом, функциональная активность лимфоцитов у женщин в меньшей степени подвержена возрастным изменениям, нежели у мужчин.

Сравнительная оценка межполовых различий в функциональной активности лимфоцитов показала отсутствие различий между интенсивностью спонтанной и индуцированной пролиферации лимфоцитов у мужчин и женщин в возрасте 20-29 лет (рисунок 1). У доноров 30-39 лет пролиферация в присутствии субоптимальной концентрации ФГА 2,5 мкг/мл была выше у женщин (р<0,01). В группе доноров 40-49 лет был выявлен более выраженный пролиферативный ответ у мужчин в присутствии оптимальной концентрации ФГА 20 мкг/мл (р<0,05), а у мужчин 50-59 лет, по сравнению с женщинами соответствующего возраста, была повышена спонтанная пролиферативная активность (р<0,01).

А

ФГА 20 мкг/мл

Без митогена

ФГА 2,5 мкг/мл

70000

60000

50000

= 40000 £

£ 30000 X

20000 10000 о

гь;

12 3 4

12 3 4

т ^ ^

12 3 4

Б

Без митогена ФГА 211 мкг/мл ФГА 2,5 мкг/мл

70000

50000

40000 ¡1

1 *

1

10000 1 п 1 .шш,

1234 1234 1234

Рисунок 1 - Влияние возраста на ФГА-индуцированную пролиферативную активность лимфоцитов мужчин (А) и женщин (Б). 1 - доноры 20-29 лет, 2 - доноры 30-39 лет, 3 - доноры 40-49 лет, 5 - доноры 50-59 лет. Достоверность отличий * - р<0,05 по отношению к донорам 20-29 лет.

Установлено, что у доноров-мужчин в группе 20-29 лет (рисунок 2) бета-эндорфин в концентрации 10"7 М достоверно усиливал, а в концентрации 10"'° М - угнетал пролиферативный ответ лимфоцитов в присутствии субоптимальной концентрации митогена (Р=4,8; р=0,003). В присутствии оптимальной концентрации митогена бета-эндорфин достоверно угнетал пролиферацию лимфоцитов в концентрации 10"10 М (Р=2,8; р=0,04). В этой же группе доноров бета-эндорфин статстически достоверно усиливал спонтанную пролиферативную активность лимфоцитов в концентрациях 10"8 и 10"'° М (Р=2,8; р=0,039).

А

Вез митогена ФГА 2.5 мкг/мл ФГА 21) мкг/мл 4000(1 -I1 1 1 : 71 1...........................

35000

К -7 -8 -9 -10 К -7 -8 -9 -10 К -7 -8 -9 -10

, Рисунок 2 - Влияние бета-эндорфина на пролиферативный ответ лимфоцитов доноров-

мужчин в группе 20-29 (А, п=10) и 30-39 (Б, п=8) лет. По оси абсцисс - К-контроль; концентрация бета-эндорфина (log, М). Достоверность отличий - * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 по отношению к контролю.

Оценка динамики пролиферации лимфоцитов у доноров в группе 30-39 лет показала, что бета-эндорфин стимулировал пролиферативный ответ лимфоцитов в присутствии субоптимальной концентрации ФГА в концентрациях 10"8 и 10"9 М (Р=3.4; р=0,019). В тоже время, в присутствии оптимальной концентрации митогена, как и у доноров 20-29 лет, бета-эндорфин достоверно угнетал пролиферацию лимфоцитов в концентрациях Ю~10 М (Р=4,49; р=0,006). На спонтанную пролиферативную активность лимфоцитов в данной группе доноров пептид влияния не оказывал.

В группе доноров 40-49 лет (рисунок 3) бета-эндорфин также угнетал пролиферацию лимфоцитов в присутствии оптимальной концентрации ФГА (Р=4,1; р=0,008) и достоверно не влиял на интенсивность включения 3Н-тимидина в спонтанных культурах. В присутствии субоптимальной концентрации ФГА бета-эндорфин проявил лишь тенденцию к стимуляции пролиферации лимфоцитов в данной возрастной группе (Р=1,48; р=0,229).

В группе доноров от 50 до 59 лет (рисунок 3) бета-эндорфин пролиферативный ответ лимфоцитов в спонтанных и стимулированных ФГА 2,5 мкг/мл культурах не модулировал. В то же время пептид стимулировал пролиферативный ответ в культурах с ФГА 20 мкг/мл в концентрации 10"9 М (Р=4,4; р=0,007).

У лиц женского пола в возрасте 20-29 лет (таблица 2) бета-эндорфин пролиферативный ответ лимфоцитов не модулировал. В то же время у женщин в возрастном диапазоне 30-39 лет бета-эндорфин в концентрациях 10"8-Ю'10 М достоверно угнетал пролиферацию в присутствии субоптимальной концентрации ФГА (Р=2,8; р=0,037) и в концентрациях 10"9-Ю"10 М - в присутствии оптимальной концентрации митогена (Р=2,82; р=0,38). В группе доноров 40-49 лет бета-эндорфин статистически значимо угнетал пролиферацию в присутствии только оптимальной концентрации ФГА в концентрации Ю'10 М (Р=2,4; р=0,05). У женщин в группе от 50 до 59 лет пептид оказывал выраженное стимулирующее влияние на спонтанную пролиферацию в концентрациях 10"7, 10"8, 10'10 М (Р=3,7; р=0,014), индуцированную субоптимальной концентрацией ФГА - в концентрации 10"'° М (Р=2,75; р=0,048). Пролиферативный ответ в присутствии ФГА 20 мкг/мл бета-эндорфин достоверно снижал в концентрации Ю"10 М №=2,7; р=0,043).

Без митогена ФГА 2.5 мкг/мл ФГЛ 20 мкг/мл

К -7 -8 -9 -10 К -7 -8 -9 -10 К -7 -8 -9 -10

ФГЛ 2.5 мкг/мл ФГЛ 20 мкг/мл

К -7 -8 -9 -10 К -7 -8 -9 -10 К -7 -8 -9 -10

Рисунок 3 - Влияние бета-эндорфина на пролиферативный ответ лимфоцитов доноров-мужчин в группе 40-49 (А, п=10) и 50-59 (Б, п=8) лет. По оси абсцисс - К-контроль; концентрация бета-эндорфина (log, М). Достоверность отличий - * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 по отношению к контролю.

Таблица 2 - Влияние бета-эндорфина на пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови женщин различных возрастных групп

Бета-эндорфин Показатель пролиферативной активности лимфоц итов (имп/мин)

(концентрация) 20-29 лет 30-39 лет 40-49 лет 50-59 лет

Контроль Без 1140,03 940,57 833,52 586,84

митогена ±745,37 ±271,8 ±258,3 ±94,31

ФГА 2,5 4330,61 14672,56 2469,17 2445,81

мкг/мл ±1016,0 ±4328,09 ±868,23 ±450,27

ФГА 20 21490,82 29943,75 11219,96 14887,69

мкг/мл +6063,79 ±7232,18 ±2499,34 ±2310,55

10'7М Без 1382,51 979,55 1618,39 1595,69

митогена ±468,47 ±122,83 ±337,04 ±353,8

ФГА 2,5 4484,56 10601,77 2741,02 2677,46

мкг/мл ±1406,94 ±2096,72 ±740,33 ±359,30

ФГА 20 21178,9 21050,55 10981,17 12187,69

мкг/мл ±7168,41 ±4684,35 ±3319,84 ±2334,06

10'8М Без 1285,31 1812,16 2265,23 1573,45

митогена ±241,99 ±635,39 ±1265,74 +339,24

ФГА 2,5 4962,26 7388,6 3335,09 3406,93

мкг/мл ±1095,44 ±1657,08 ±1310,49 ±424,45

ФГА 20 26685,66 24040,45 9499,57 12175,83

мкг/мл ±4965,36 ±4147,27 +3872,17 ±3323,37

ю-9м Без 1600,74 1046,18 1145,47 1389,61

митогена ±466,79 ±421,76 ±407,78 ±313,4

ФГА 2,5 5260,81 8012,32 2159,81 3633,82

мкг/мл ±1060,34 ±2309,91 ±799,04 ±568,21

ФГА 20 28159,36 18447,42 5648,96 15077,86

мкг/мл ±5633,28 ±4686,61 ±1787,48 ±3435.25

10"ШМ Без 1578,67 1061,38 2283,53 1994,48

митогена ±1320,51 ±376,33 ±1288,46 ±516,3

ФГА 2,5 4755,76 7753,23 2840,37+ 4683,4

мкг/мл ±859,02 ±2413,3 1029,51 ±1073,93

ФГА 20 15045,36 12410,46 4039,36 6026,91

мкг/мл ±4056,56 ±3063,06 ±2000,3 ±185,57

Примечание: жирным шрифтом выделены данные, где достоверность отличий р<0,05 по

отношению к контролю

В дальнейшем нами тестировалось влияние на пролиферативный ответ лимфоцитов энкефалинов. Установлено, что лей-энкефалин у доноров мужского пола модулировал пролиферативный ответ лимфоцитов только в возрастной группе 30-39 лет (рисунок 4). Пептид стимулировал пролиферацию в присутствии субоптимальной концентрации ФГА 2,5 мкг/мл в концентрациях 10"7, 10"8, 10"10 М (Р=3,5; р=0,017) , а в присутствии оптимальной концентрации ФГА 20 мкг/мл угнетал пролиферативный ответ лимфоцитов в концентрациях 10'7, 10~8, 10~9, ] 0"10 М (И=2,6; р=0,005). В остальных возрастных группах статистически значимо лей-энкефалин на спонтанную и митоген-индуцированную функциональную

активность лимфоцитов не влиял. В группах доноров женского пола модулирующих эффектов лей-энкефалина зарегистрировано не было ни в одной из возрастных групп.

ФГА 2,5 мкг/мл

ФГА 20 мкг/мл

К -7 -8 -9 -10 К -7 -8 -9 -10

Рисунок 4 - Влияние лей-энкефалина на пролиферативный ответ лимфоцитов доноров-мужчин в 30-39 (п=8) лет. По оси абсцисс - К-контроль; концентрация лей-энкефалина (log, М). Достоверность отличий - * - р<0,05 по отношению к контролю

Мет-энкефалин у доноров мужского пола, как и лей-энкефалин, модулировал пролиферативный ответ только в возрастной группе 30-39 лет (рисунок 5). Однако, в отличие от лей-энкефалина не проявил выраженного стимулирующего действия. Пептид угнетал пролиферацию лимфоцтов в присутствии оптимальной концентрации ФГА 20 мкг/мл в концентрациях 10"7, 10"8, 10"9, 10"'° М (F=3,5; р=0,019). В присутствии субоптимальной концентрации митогена пептид проявил лишь статистически не достоверную тенденцию к усилению захвата 3Н-тимидина клетками.

У лиц женского пола пептид оказывал единичные разрозненные эффекты. Мет-энкефалин у женщин 50-59 лет (рисунок 6) угнетал пролиферативный ответ лимфоцитов (F=2,9; р<0,034) в концентрациях 10"9, 10~'° М в присутствии ФГА 20 мкг/мл. В других возрастных группах женщин статистически значимых эффектов пептида не наблюдалось.

ФГА 2.5 м к г/мл

ФГЛ 20 м кг/мл

К -7 -8 -9 -10 К -7 -К -9 -10 К -7 -S -9 -10

Рисунок 5 - Влияние мет-энкефалина на пролиферативный ответ лимфоцитов доноров-мужчин в группе 30-39 (п=8) лет. По оси абсцисс - К-контроль; концентрация мет-энкефалина (log, М). Достоверность отличий - ** - р<0,01; *** - р<0,001 по отношению к контролю.

ФГЛ 2.5 мкг/мл

ФГА 20 мкг/мл

К -7 -8

Рисунок 6 - Влияние мет-энкефалина на пролиферативный ответ лимфоцитов доноров-женщин в группе 50-59 (п=8) лет. По оси абсцисс - К-контроль; концентрация мет-энкефалина (log, М). Достоверность отличий - * - pS0,05 по отношению к контролю.

Таким образом, модуляция пролиферативной активности лимфоцитов бета-эндорфином у доноров мужского пола наблюдается преимущественно в более молодом возрасте и с его увеличением снижается, фактически исчезая в группе доноров 50-60 лет, в то же время у женщин модулирующий эффект пептида сохраняется дольше. Энкефалины модулировали пролиферативный ответ лимфоцитов преимущественно у лиц мужского пола исключительно в одном возрастном диапазоне - 30-39 лет. У женщин лей-энкефалин пролиферацию не модулировал, а мет-энкефалин оказывал единичные эффекты в одной

возрастной группе 50-59 лет. Как видно из полученных данных, усиливающие пролиферацию эффекты бета-эндорфина имели место преимущественно в нестимулированных или слабо стимулированных (субоптимальной концентрацией ФГА) культурах. В культурах с оптимальной концентрацией ФГА пептид в самой низкой, близкой к физиологическим уровням, концентрации угнетал пролиферацию практически во всех группах у доноров обоих полов. Необходимо отметить, что у пожилых субъектов мужского пола в возрасте 50-59 лет незначительная, но статистически достоверная стимуляция бета-эндорфином пролиферативного ответа наблюдалась в культурах с оптимальной концентрацией ФГА. Подобный эффект может объясняться снижением с возрастом способности лимфоцитов отвечать на антигенные стимулы, и как следствие, изменением выраженности экспрессии опиатных рецепторов на поверхности лимфоцитов. Известно, что данный процесс зависит от интенсивности стимулирующего сигнала. На различных уровнях стимуляции на поверхности лимфоцитов может экспрессироваться различный спектр рецепторов к эндогенным опиоидам (Bidlack, J. M. Detection and Funktion of Opioids Receptor on Cells from the Immune System / J. M. Bidlack // Clin. Diagnostic Lab. Immunol. 2000. V. 7. P. 719-723.). Соответственно, для реализации эффекта той или иной направленности могут потребоваться различные концентрации бета-эндорфина, что чётко прослеживается во всех проведённых нами экспериментах. В реакции опиоидной системы при стрессе могут принимать участие и энкефалины, однако в отличие от бета-эндорфина их роль в стрессорной перестройке значительно скромнее (Owens, P.C. Opioid peptides in blood and cerebrospinal fluid during acute stress / P.C. Owens, R. Smith // Baillieres Clin Endocrinol Metab. 1987. V. 1. P. 415-437.). Подтверждением этого факта является полученная нами картина регуляции бега-эндорфином и энкефалинами пролиферативных процессов.

Влияние опиоидных пептидов на фагоцитарную активность нейтрофилов и моноцитов у доноров мужского и женского пола различных возрастных групп

Установлено, что статистически значимых межполовых различий в уровнях фагоцитарной функции нейтрофилов периферической крови во всех возрастных группах выявлено не было. При анализе возрастной динамики фагоцитарной функции в группах мужчин было выявлено увеличение активности фагоцитоза в группах 40-49 и 50-59 лет (таблица 3) по сравнению с группой 20-29 лет. У женщин активность фагоцитоза увеличивалась в группе 30-39 лет, а в более старших группах не отличалась от показателей молодых женщин 20-29 лет. Таким образом, у мужчин с возрастом наблюдается постепенная активация активности фагоцитоза нейтрофилов периферической крови, в то время как у женщин повышение поглотительной активности имело место только в группе 30-39 лет, в

последствии возвращаясь к показателям группы 20-29 лет. Установлено, что статистически значимых межполовых различий в уровнях поглотительной активности нейтрофилов периферической крови во всех возрастных группах выявлено не было.

Таблица 3 - Зависимость фагоцитарной функции нейтрофилов периферической крови мужчин и женщин от возраста, при сравнении с группой 20-29 лет

Пол Показатели < >агоцитоза

20-29 лет (п=9) 30-39 лет (п=9) 40-49 лет (п=9) 50-59 лет (п=9)

фагоцит арное число актив ность фагоци тоза фагоцит арное число акти ность фагоци тоза фагоци тарное число актив ность фагоци тоза фагоци тарное число актив ность фагоци тоза

мужчины 1,38 +0,16 64,60 +5,20 1,61 +0,16 74,07 ±5,71 1,83 +0,16 80,70 ±4,42 1,62 +0,12 77,41 ±2,81

женщины 1,44 ±0,13 69,82 +3,58 1,76 ±0,14 83,66 ±3,03 1,48 +0,13 72,18 ±4,47 1,50 ±0,18 61,75 ±8,97

Примечание - Жирным шрифтом выделены значения, статистически значимо отличающиеся от групп 20-29 лет (р<0,05)

Оценка влияния бета-эндорфина на фагоцитарную функцию нейтрофилов доноров мужского пола (таблица 4) показала стимулирующее влияние пептида на фагоцитарное число и активность фагоцитоза нейтрофилов в группе 20-29 лет в концентрациях 10"7, 10"8 и Ю"10 М (Р=2,7; р=0,05). В группах доноров 30-39 и 40-49 лет пептид поглотительную способность нейтрофилов не модулировал, а в группе доноров 50-59 лет пептид выражено снижал поглотительную способность нейтрофилов по фагоцитарному числу и фагоцитарной активности в концентрациях 10"7и 10"8 М (Р=4,2; р=0,01).

У доноров женского пола во всех возрастных группах влияния бета-эндорфина на фагоцитарную функцию нейтрофилов зарегистрировано не было. Аналогичным образом не выявлено влияния пептида на фагоцитоз моноцитов у доноров обоих полов во всех исследуемых возрастных группах.

При анализе эффектов энкефалинов были получены следующие результаты. У доноров мужского пола во всех возрастных группах влияния лей- и мет-энкефалинов на активность фагоцитарной функции нейтрофилов не выявлено.

В группе доноров женского пола 30-39 лет лей-энкефалин во всём диапазоне исследуемых концентраций снижал фагоцитарное число (Р=2,7, р=0,044) и активность фагоцитоза (Р=3,0, р=0,03) (таблица 5).

Таблица 4 - Зависимость влияния бета-эндорфина на активность фагоцитарной функции нейтрофилов периферической крови мужчин от возраста

Пептид Показатели фагоцитоза

(концент 20-29 лет 30-39 лет 40-49 лет 50-59 лет

рация) Фагоци актив фагоци актив Фагоци актив Фагоци актив

тарное число ность фагоци тоза (%) тарное число ность фагоци тоза (%) тарное число ность фагоци тоза (%) тарное число ность фагоци тоза (%)

контроль 1,45 +0,20 70,00 ±6,22 1,61 ±0,16 74,07 ±5,71 1,79 ±0,17 79,66 ±4,81 1,62 ±0,12 77,41 ±2,81

ю-7м 1,7 79,47 1,49 71,72 1,80 80,40 1,29 66,26

±0,21 ±4,32 ±0,16 +5,62 ±0,14 ±3,45 ±0,09 ±3,29

10"8М Т72 78,18 1,72 80,98 1,76 80,90 1,33 67,72

±0,21 ±5,28 ±0,11 ±3,21 ±0,12 ±3,23 ±0,13 ±3,67

ю-'м 1,65 76,35 1,81 79,55 1,75 81,57 1,51 72,94

±0,16 ±4,14 ±0,13 +2,63 ±0,12 ±3,43 ±0,13 ±3,75

ю-10м 1,72 77,88 1,74 79,92 1,86 82,75 1,52 74,68

±0,17 +3,53 +0,12 ±2,89 ±0,14 ±3,24 ±0,17 ±4,56

Примечание - Жирным шрифтом выделены значения, статистически значимо отличающиеся

от контроля (р<0,05)

Мет-энкефалин в этой же возрастной группе у женщин угнетал фагоцитарную функцию нейтрофилов по фагоцитарному числу в концентрациях 10"7 и 10"8 М (Р=3,1, р=0,029), а по активности фагоцитоза - в концентрациях 10"7, 10"8 и 10 ю М (Р=3,1, р=0,028) (таблица 6). Влияния данных пептидов на активность фагоцитарной функции моноцитов у доноров обоих полов во всех исследуемых возрастных группах не зарегистрировано.

Таблица 5 - Зависимость влияния лей-энкефалина на активность фагоцитарной функции нейтрофилов периферической крови женщин от возраста

Пептид (концент рация) Показатели фагоцитоза

20-29 лет 30-39 лет 40-49 лет 50-59 лет

Фагоци тарное число актив ность фагоци тоза (%) фагоци тарное число актив ность фагоци тоза (%) Фагоци тарное число Актив ность фагоци тоза (%) Фагоци тарное число актив ность фагоци тоза (%)

контроль 1,44 ±0,12 72,85 ±3,50 1,95 ±0,13 86,63 ±2,80 1,48 +0,13 72,17 +4,47 1,39 ±0,19 67,53 ±5,15

10"7М 1,61 ±0,15 75,02 ±3,43 1,72 ±0,13 81,13 ±4,35 1,40 +0,11 69,89 ±3,32 1,47 ±0,18 74,00 ±5,14

ю-8м 1,59 ±0,14 74,31 ±4,40 1,69 ±0,11 82,23 ±3,80 1,45 +0,18 69,68 ±5,70 1,30 0±,10 65,89 ±2,61

ю-9м 1,50 ±0,10 72,43 ±3,22 1,75 ±0,13 82,44 ±4,78 1,59 +0,13 73,57 ±3,98 1,42 ±0,14 66,83 +3,24

1010М 1,69 ±0,16 74,73 ±4,40 1,74 ±0,13 81,57 ±3,65 1,53 ±0,17 71,42 ±4,55 1,31 ±0,15 65,82 ±4,33

Примечание - Жирным шрифтом выделены значения, статистически значимо отличающиеся от контроля (р<0,05)

Таблица 6 - Зависимость влияния мет-энкефалина на активность фагоцитарной функции нейтрофилов периферической крови женщин от возраста

Пептид (концент рация) Показатели фагоцитоза

20-29 лет 30-39 лет 40-49 лет 50-59 лет

Фагоци тарное число актив ность фагоци тоза (%) фагоци тарное число актив ность фагоци тоза (%) Фагоци тарное число актив ность фагоци тоза (%) Фагоци тарное число актив ность фагоци тоза (%)

контроль 1,44 ±0,12 72,85 ±3,50 1,90 ±0,13 86,63 ±2,80 1,48 ±0,13 72,17 ±4,47 1,39 ±0,19 67,53 ±5,15

10"7М 1,66 ±0,11 75,40 ±3,44 1,63 ±0,14 81,13 ±3,52 1,31 ±0,16 65,88 ±5,12 1,40 ±0,15 67,64 ±4,21

ю-8м 1,62 ±0,16 74,61 ±3,68 1,63 ±0,17 79,34 ±5,22 1,57 ±0,18 71,46 ±5,67 1,41 ±0,11 69,68 ±2,61

ю-'м 1,66 ±0,14 75,73 ±5,36 1,83 ±0,15 82,94 ±3,92 1,45 ±0,11 71,06 ±3,53 1,49 ±0,16 70,94 ±3,86

ю-'°М 1,50 ±0,15 69,92 ±2,98 1,71 +0,15 82,04 ±3,59 1,57 ±0,13 73,52 ±2,53 1,48 +0,14 70,13 ±4,80

Примечание - Жирным шрифтом выделены значения, статистически значимо отличающиеся от контроля (р<0,05)

Таким образом, основной эффект опиоидные пептиды оказывают на фагоцитарную способность нейтрофилов. У доноров мужского пола бета-эндорфин стимулирует поглотительную способность нейтрофилов в группе 20-29 лет и угнетает - в группе доноров 50-59 лет. У доноров женского пола во всех возрастных группах влияния бета-эндорфина на активность фагоцитарной функции нейтрофилов зарегистрировано не было. В то же время, энкефалины проявили своё действие только у женщин в возрастной группе 30-39 лет, снижая поглотительную способность нейтрофильных гранулоцитов. В группах доноров мужского пола энкефалины значимых эффектов на интенсивность фагоцитоза нейтрофилов не оказали.

Оценивая полученные нами данные, необходимо обратить внимание на более выраженные (в отличие от пролиферации) половые различия в эффекте бета-эндорфина в отношении активности функции фагоцитоза нейтрофилов, единственной популяции клеток врождённого иммунитета, на которую нами были зарегистрированы эффекты опиоидных пептидов. Если мы сравним контрольные значения функциональной активности фагоцитоза женщин и мужчин, то мы обнаружим, что у мужчин в группах 40-49 и 50-59 лет с возрастом эти показатели по сравнению с группой 20-29 лет росли, а у женщин нет. Возможно, в данном случае бета-эндорфин проявил свои модулирующие эффекты, снижая повышенную фагоцитарную способность нейтрофилов. При анализе эффектов энкефалинов мы получили обратную картину - у доноров мужского пола модулирующих эффектов зарегистрировано не было, в то время как у женщин наблюдалось угнетение поглотительной способности нейтрофилов в возрастной группе 30-39 лет. Таким образом, можно сделать заключение, что

в данной возрастной группе модулирующие эффекты опиоидных пептидов проявляются наиболее ярко, а также предположить наличие некоторых особенностей в экспрессии опиатных рецепторов у лиц различного пола. Так у мужчин фагоцитоз модулировал бета-эндорфин, а у женщин энкефалины, поскольку все пептиды данного семейства связываются с рецепторами с разной степенью аффинности (Schwarzer, С. 30 years of dynorphins - New insights on their fonctions in neuropsychiatrie diseases / C. Schwarzer // Pharmacology & Therapeutics. 2009. V. 123. P. 353-370.).

Влияние бета-эидорфииа на кислородзависимый метаболизм лейкоцитов у доноров женского и мужского пола различных возрастных групп

В результате проведенных исследований было установлено, что в группе доноров мужского пола в возрасте 20-29 лет бета-эндорфин достоверно угнетал спонтанную продукцию активных форм кислорода на 10-й и 15 мин и стимулировал - на 55 и 60 мин. В присутствии зимозана в концентрации 150 мкг/мл пептид достоверно угнетал выраженность JI3XJI на 5, 10, 15, 20 мин эксперимента. В культурах стимулированных зимозаном 15 мкг/мл пептид снижал микробицидную активность клеток на 5, 10, 15 мин. У женщин данной возрастной группы угнетающий эффект бета-эндорфина отмечен в стимулированных зимозаном 15 мкг/мл культурах с 15-й по 40-ю, и на 60 мин реакции (рисунок 7). На спонтанную и стимулированную зимозаном 150 мкг/мл продукцию активных форм кислорода лейкоцитами влияния бета-эндорфина не зарегистрировано.

Среди доноров мужского пола 30-39 лет было зарегистрировано угнетающее влияние бета-эндорфина на спонтанную продукцию активных форм кислорода лейкоцитами на 5, 10 и 15 мин эксперимента. В присутствии зимозана в концентрации 150 мкг/мл бета-эндорфин снижал выраженность ЛЗХЛ с 5-й по 60-ю мин, а в присутствии зимозана в концентрации 15 мкг/мл с 5-й по 40-ю мин реакции (рисунок 7). В группе женщин 30-39 лет подавляющее ЛЗХЛ действие бета-эндорфина отмечено с 20 по 55 мин реакции в культурах, стимулированных зимозаном 15 мкг/мл (рисунок 7), и с 30 по 60 мин в культурах, стимулированных зимозаном в концентрации 150 мкг/мл. На спонтанную продукцию активных форм кислорода лейкоцитами в данной группе бета-эндорфин не влиял.

вР™"- мин Время. мин

Б Г

Время, МИН

Рисунок 7 - Влияние бета-эндорфина у мужчин 20-29 (А), 30-39 (Б) и женщин 20-29 (В), 30-39 (Г) на индуцированную зимозаном 15 мкг/мл ЛЗХЛ лейкоцитов (п=5). Достоверность отличий - * - р <0,05 к контролю.

В возрастном диапазоне 40-49 лет у мужчин отмечено единичное статистически значимое увеличение спонтанной продукции активных форм кислорода лейкоцитами под воздействием бета-эндорфина на 25 мин эксперимента. В присутствии зимозана в концентрации 150 мкг/мл бета-эндорфин угнетал ЛЗХЛ на 5 и 10-й мин. При низкой концентрации зимозана пептид стимулировал выраженность ЛЗХЛ с 45-й по 55-ю мин реакции (рисунок 8). У женщин угнетающее влияние пептида на спонтанную ЛЗХЛ выявлено на 55 и 60 мин. В присутствии зимозана в концентрации 150 мкг/мл отмечено подавление образования активных форм кислорода лейкоцитами на 5, 10 и 15 мин, а в культурах с зимозаном в концентрации 15 мкг/мл - с 5 - 20 мин и на 60 мин эксперимента (рисунок 8). У доноров мужского пола в группе 50-59 лет бета-эндорфин подавлял спонтанное образование активных форм кислорода лейкоцитами на 5 и 10 мин, не влиял на выраженность ЛЗХЛ в присутствии зимозана 150 мкг/мл, и угнетал выраженность ЛЗХЛ в

культурах с концентрацией зимозана 15 мкг/мл с 5 по 20 мин эксперимента (рисунок 8). У доноров женского пола данной возрастной группы влияния бета-эндорфина на спонтанную продукцию активных кислородных радикалов лейкоцитами не выявлено. В клеточных культурах, стимулированных зимозаном 150 мкг/мл отмечено статистически достоверное угнетение JI3XJI с 5 по 35 мин, в культурах, стимулированных зимозаном 15 мкг/мл, подавление выработки активных форм кислорода наблюдалось с 5 по 45 мин (рисунок 8).

А В

Б Г

Рисунок 8 - Влияние бета-эндорфина у мужчин 40-49 (А), 50-59 (Б) и женщин 40-49 (В), 50-59 (Г) на индуцированную зимозаном 15 мкг/мл ЛЗХЛ лейкоцитов (п=5). Достоверность отличий - * - р <0,05 к контролю.

Таким образом, бета-эндорфин оказывал угнетающее влияние на продукцию активных форм кислорода лейкоцитами у доноров обоих полов во всех исследованных нами возрастных группах. Зависимости эффектов бета-эндорфина от пола и возраста зарегистрировать не удалось.

25

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключении необходимо отметить, что опиоидные пептиды играют важную роль в регуляции функции иммунной системы в процессе старения. Полученные результаты могут иметь важное клиническое значение, так как могут указывать на возможные механизмы повышенной восприимчивости к инфекциям и развития тяжелых злокачественных заболеваний, связанных со старостью. Несмотря на то, что в общем функции иммунной системы снижаются с возрастом, одним из механизмов этого процесса может быть неспособность нейропептидов модулировать иммунные реакции. В экспериментальной системе in vitro доказано участие опиатергических механизмов в регуляции функций иммунокомпетентных и фагоцитирующих клеток у лиц различного пола и возраста. В результате полученных нами данных можно предположить, что у мужчин данный процесс носит более выраженный характер. У женщин модулирующая способность нейропептидов сохраняется дольше, что делает их организм более резистентным к воздействиям неблагоприятных факторов внешней среды.

ВЫВОДЫ

1. Модуляция пролиферативной активности лимфоцитов бета-эндорфином у доноров мужского пола наблюдается преимущественно в более молодом возрасте и с его увеличением снижается, фактически исчезая в группе доноров 50-60 лет, в то же время у женщин модулирующий эффект пептида сохраняется более длительно, преобладая в возрастных группах 30-39 лет и 50-59 лет.

2. Энкефалины модулируют пролиферативный ответ лимфоцитов преимущественно у лиц мужского пола исключительно в одном возрастном диапазоне - 30-39 лет. У женщин лей-энкефалин пролиферацию не модулирует, а мет-энкефалин оказывает единичные эффекты в одной возрастной группе - 50-59 лет.

3. У доноров мужского пола бета-эндорфин стимулирует поглотительную способность нейтрофилов в группе 20-29 лет и угнетает - в группе доноров 50-59 лет. У доноров женского пола во всех возрастных группах влияния бета-эндорфина на фагоцитарную активность нейтрофилов зарегистрировано не было. Энкефалины проявляют своё действие только у женщин в возрастной группе 30-39 лет, снижая поглотительную способность нейтрофильных гранулоцитов.

4. Бета-эндорфин оказывает угнетающее влияние на продукцию активных форм кислорода лейкоцитами, фиксируемых в реакции люминолзависимой хемилюминисценции у доноров обоих полов во всех исследованных нами возрастных группах. Зависимости эффектов пептида от пола и возраста не выявлено.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Гилева, С.Г. Роль бета-эндорфина в регуляции пролиферативного ответа лимфоцитов у мужчин различных возрастных групп / С.Г. Гилева, C.B. Гейн // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - № 2/1(35). - С. 24-25.

2. Гилева, С.Г. Влияние бета-эндорфина на пролиферативный ответ лимфоцитов у мужчин различных возрастных групп. / С.Г. Гилева, C.B. Гейн // Материалы X Молодежной научной конференции «Физиология человека и животных от эксперимента к клинической практике» - г. Сыктывкар, 19-21 апреля 2011 г. - С. 53-56.

3. Гилева, С.Г. Влияние бета-эндорфина на пролиферативный ответ лимфоцитов и фагоцитарную активность нейтрофилов у женщин различных возрастных групп / С.Г. Гилева, C.B. Гейн // Материалы XI Молодежной научной конференции «Физиология человека и животных от эксперимента к клинической практике» - г. Сыктывкар, 24-27 апреля 2012 г. - С. 61-64.

4. Гейн, C.B. Регуляция p-эндорфином пролиферативного ответа лимфоцитов у мужчин различных возрастных групп / C.B. Гейн, С.Г. Гилёва //Доклады академии наук. - 2012. - Т. 444, № 2 - С. 221-223.

5. Гилёва, С.Г. Влияние бета-эндорфина на пролиферативную и фагоцитарную активность клеток периферической крови у женщин различных возрастных групп / С.Г. Гилева, C.B. Гейн // Российский иммунологический журнал. - 2012. - Т. 6(14), №2(1).-С. 39-41.

6. Гилева, С.Г. Влияние бета-эндорфина на пролиферативную активность лимфоцитов у мужчин и женщин различных возрастных групп / С.Г. Гилева, C.B. Гейн // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2012. - № 4. - С. 24-25.

7. Гейн, C.B. Влияние энкефапинов на функциональную активность лимфоцитов периферической крови у мужчин различных возрастных групп. / C.B. Гейн, С.Г Гилева, И.Л. Шаравьева // Материалы II Всероссийской (XII) Молодежной научной конференции «Молодежь и наука на Севере» - г. Сыктывкар, 22-26 апреля 2013 г. - С. 171-172.

8. Гейн, C.B. Влияние бета-эндорфина на пролиферативную и фагоцитарную активность клеток периферической крови у мужчин и женщин различных возрастных групп / C.B. Гейн, С.Г. Гилёва // Физиология человека. - 2013. - Т. 39, № 3 - С. 96-103.

9. Гейн, C.B. Влияние лей- и мет-энкефалинов на пролиферативный ответ лимфоцитов у мужчин и женщин различных возрастных групп / C.B. Гейн, С.Г. Гилёва // Доклады академии наук. - 2013. - Т. 451, № 6. - С. 699-702.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЛЗХЛ - люминолзависимая хемилюминесценция

РБТЛ - реакция бласттрансформации лимфоцитов

ППС - полная питательная среда

ФГА - фитогемагглютинин

ФЭБ - формалинизированные эритроциты барана

HEPES - >)-2-гидроксиэтилпиперазин-М'-2-этансульфоновая кислота

(N-2- hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid)

На правах рукописи

Гилёва Светлана Геннадьевна

ИММУНОРЕГУЛЯТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ ОПИОИДНЫХ ПЕПТИДОВ У ЛИЦ РАЗЛИЧНЫХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУПП

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2013

Подписано в печать .... 2013. Формат 60x90/16. Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1,1 . Заказ №2. Набор компьютерный. Отпечатано в ФГБУН ИЭГМ УрО РАН 614081, Пермь, ул. Голева 13