Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Опиоидные пептиды в регуляции функций эффекторов врождённого иммунитета

005012267

ГОРШКОВА Ксения Геннадьевна

ОПИОИДНЫЕ ПЕПТИДЫ В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ ЭФФЕКТОРОВ ВРОЖДЁННОГО ИММУНИТЕТА

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 мдр 2012

Екатеринбург - 2012

005012267

Работа выполнена в лаборатории биохимии и развития микроорганизме Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института экологи и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, доцент

Гейн Сергей Владимирович

Официальные оппоненты:

Гусев Евгений Юрьевич

доктор медицинских наук, доцент, зав. лаборатории иммунологии воспаления ФГБУН Института иммунологии и физиологии УрО РАН

доктор биологических наук,

Раев Михаил Борисович

ведущий научный сотрудник лаборатории экологической иммунологии ФГБУН Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Челябинская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития РФ

Защита состоится «_» _2012 г. в_часов на заседании

Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 004.027.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской академии наук (620049, г. Екатеринбург, ул. Первомайская, 106).

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке УрО РАН (620041, г. Екатеринбург, ул. С. Ковалевской-Академическая, 22/20).

Автореферат разослан «_»_2012 г.

Ученый секретарь совета по защите

докторских и кандидатских диссертаций Д 004.027.01

при ФГБУН ИИФ УрО РАН

доктор медицинских наук, профессор

И.А. Тузанкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эндогенная опиоидная система проявляет чрезвычайно широкий спектр биологической активности, представляя собой одну из важнейших систем регуляции гомсостаза [Корнева Е.Л.. Шхинек Э.К., 1988; Гейн C.B., 2010; Smith Е.М., 2008; Bocinar R.J., 2010]. Ее компоненты, способные действовать как нейромедиаторы, гормоны или модуляторы многих физиологических функций, обнаружены в различных тканях - в нервной системе, надпочечниках, пищеварительном тракте, а также в иммунокомпетентных клетках [Зозуля A.A., Пшеничкин С.Ф., 1990; Sharp В.М., 2006]. Опиоидные пептиды, и в частности наиболее полифункциональный пептидный гормон ß-эндорфина, участвуют в процессах нейроиммунных взаимодействий и обнаруживают выраженную иммуномодуляторную активность, реализуя свои многочисленные регуляторные эффекты через специфические опиатные сайты связывания трех основных классов ц, 6, к, экспрессия которых на клетках адаптивного и врождённого иммунитета доказана на транскрипционном и трансляционном уровнях [Наволоцкая Е.В. и соавт., 2004; Bidlack J.M., 2000; Stein С., Lang L.J., 2009].

Наиболее древним в филогенетическом плане звеном иммунной системы является врождённый иммунитет, отвечающий за распознавание, уничтожение и удаление чужеродных агентов из организма. В реализации функций врождённого иммунитета принимают участие ряд клеточных популяций миелоидного (гранулоциты, моноциты-макрофаги, дендритные клетки) и лимфоидного (NK, NKT, убТ-клетки) происхождения, а также ряд гуморальных факторов (комплемент, естественные антитела) [Мейл Д. и соавт., 2007; Delves P.J., Roitt I.M., 2000J. Помимо антимикробной функции, клетки врождённого иммунитета активно участвуют в регуляции адаптивного ответа против опухолевых и микробных антигенов, главными индукторами которого выступают CD4+клетки (хелперы) [Iwasaki A., Medzhitov R., 2010]. В настоящее время показана способность опиоидных пептидов модулировать функции клеток врождённого и адаптивного

иммунитета [Plotnikoff N.P. et al, 1999]. В то же время, ряд аспектов данной проблемы остаются мало исследованной областью науки. Достаточно противоречиво представлены в литературе данные о влиянии p-эндорфина на функции клеток врождённого иммунитета, в частности такие как продукция активных форм кислорода и секреция провоспалительных цитокинов. Недостаточно исследованными остаются молекулярные и клеточные механизмы иммунорегуляторного действия опиоидных пептидов, включающие в себя влияние на процессы пролиферации, кооперации и дифференцировки клеток адаптивного иммунитета, продукции ими ключевых цитокинов (y-lFN, IL-4, 1L-2, IL-ip), являющихся маркерными для регуляторных Т-лимфоцитов 1 и 2 типа (Thl/Th2) и определяющих выбор типа иммунного ответа [Van den Bergh Р. et al., 1994; Peterson P.K. et al., 1998; Sacerdote Р., 2003; Bodnar R.J., 2010].

Цель работы - исследовать роль p-эндорфина и синтетических агонистов опиатных рецепторов в регуляции функций эффекторных клеток врождённого иммунитета и процессов ТЬ1/ТЬ2-дифференцировки Т-лимфоцитов. Основные задачи:

1. Исследовать влияние p-эндорфина и синтетических агонистов |д-, 5-рецепторов на продукцию активных форм кислорода фракциями лейкоцитов и нейтрофилов периферической крови.

2. Оценить влияние P-эндорфина и селективных агонистов ц-, 5-опиатных рецепторов на продукцию провоспалительных цитокинов фракциями лейкоцитов, мононуклеаров и нейтрофилов.

3. Исследовать влияние p-эндорфина и селективных агонистов ц-, 5-опиатных рецепторов на продукцию IL-4, IL-2 и IFN-y лейкоцитами и С04+лимфоцитами, оценить зависимость эффекта от присутствия клеток врождённого иммунитета в культуре.

4. Исследовать влияние p-эндорфина на продукцию IFN-y С08+лимфоцитами и нейтрофилами, оценить роль продуктов циклооксигеназного цикла в опиоид-опосредованной регуляции синтеза IL-4.

Научная новизна. Впервые показана зависимость влияния опиоидных пептидов на продукцию активных форм кислорода и секрецию провоспалительных цитокинов от клеточного состава культуры. Установлено, что в лейкоцитарной взвеси селективные 5- и ц-агонисты пептидной природы стимулировали спонтанную и угнетали индуцированную зимозаном реакцию люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) нейтрофилов. В очищенной фракции нейтрофилов Р-эндорфин и селективные 5- и ц-агонисты не влияли на спонтанную и угнетали активированную зимозаном ЛЗХЛ нейтрофилов. Впервые установлено, что [3-эндорфин оказывал разнонаправленное влияние на продукцию провоспалительных цитокинов, усиливая продукцию 1Ь-1(3 и угнетая синтез 11,-8 и ТЫР-а. Стимулирующий эффект не отменялся опиатными антагонистами, в то время как угнетение 1Ь-8 отменялось налоксоном и налтриндолом, а также зависело от присутствия липополисахарида (ЛПС). Все зарегистрированные эффекты ¡3-эндорфина, в частности, на продукцию 1Ь-1р проявлялись преимущественно в условиях кооперации различных клеточных популяций. Впервые установлено, что клетки естественного звена иммунитета играют ключевую роль в регуляции [5-эндорфином продукции 11,-2,1Ь-4 и ИТЫ-у СБ4+лимфоцитами, где решающая роль в процессе опиоид-опосредованной регуляции синтеза 1Ь-4 и, как следствие, поляризации хелперов в направлении ТЪ2-клсгок принадлежит продуктам циклооксигеназного цикла, преимущественно простагландину Е2.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты существенно расширяют существующие представления о роли эндогенной опиоидной системы в нейроэндокринной регуляции иммунных реакций. В работе доказано вовлечение опиатергических механизмов в регуляцию микробицидной и цитокинпродуцирующей активности эффекторных клеток врожденного иммунитета (моноцитов и нейтрофилов). В работе приведён возможный механизм влияния опиоидных пептидов на процессы ТЫ/ТЪ2-дифференцировки Т-лимфоцитов. В связи с широким использованием агонистов опиатных рецепторов в практической медицине, необходим учет последствий их применения.

Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета (специальные лекционные курсы «Экспериментальная иммунопатология и иммунотерапия», «Молекулярные механизмы межклеточных коммуникаций»).

Положения, выносимые па защиту:

1. В лейкоцитарной взвеси селективные 5- и ц-агонисты пептидной природы стимулируют спонтанную и угнетают индуцированную зимозаном реакцию JI3XJI нейтрофилов; в очищенной фракции нейтрофилов ß-эндорфин и селективные 5- и ц-агонисты не влияют на спонтанную и угнетают активированную зимозаном JI3XJ1 нейтрофилов.

2. ß-эндорфин стимулирует продукцию IL-lß и IL-lra и угнетает синтез IL-8 и TNF-a и различные типы опиатных рецепторов могут опосредовать регуляцию цитокинпродуцирующей функции эффекторов естественного иммунитета; эффекты ß-эндорфина обнаруживаются преимущественно в условиях кооперации различных клеточных популяций - нефракционированной лейкоцитарной суспензии и фракции мононуклеаров, но не в моноцитарных культурах.

3. Клетки естественного звена иммунитета играют ключевую роль в регуляции ß-эндорфином продукции IL-4 и IFN-y С04+лимфоцитами; продуктам циклооксигеназного цикла, преимущественно простагландину Е2, принадлежит решающая роль в процессе опиоид-опосредованной регуляции синтеза IL-4 и, как следствие, поляризации хелперов в направлении ТЬ2-клеток; продукцию IFN-y С08+лимфоцитами ß-эндорфин не изменяет, в то время как секреция IFN-y нейтрофилами под воздействие опиоидных пептидов может усиливаться.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на III региональной конференции молодых ученых с международным участием «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии» (Пермь, 2007); I Всероссийской молодежной научной конференции «Молодежь и наука на Севере» (Сыктывкар, 2008); VII Международной конференции «Загрязнение окружающей среды, адаптация и иммунитет» (Пермь-Н.Новгород-Пермь, 2008); 12-ой

Международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2008); VIII Молодежной научной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2009); II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009); VI международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 5 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 29 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 192 наименования, в том числе 28 отечественных и 164 зарубежных.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в лаборатории биохимии и развития микроорганизмов в соответствии с планом НИР ИЭГМ УрО РАН и является частью исследований по теме «Исследование механизмов регуляции иммунитета, создание механизмов его контроля» (номер госрегистрации темы НИР 01.9.009927); в рамках Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология»; грантами РФФИ № 06-04-49001,08-04-00424-а.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В качестве объекта исследования использовались лейкоциты периферической венозной крови здоровых мужчин-добровольцев в возрасте от 22 до 30 лет, а также отдельные фракции клеток, среди которых фракции мононуклеаров, нейтрофилов, моноцитов, CD4+ и С08+клеток.

Для получения нефракционированной лейкоцитарной суспензии гепаринизированную венозную кровь отстаивали в течение 2 часов при 37°С. Мононуклеарные клетки получали на градиенте плотности фиколл-верографин с

плотностью р=1,077. Фракцию моноцитов выделяли механическим способом, путем адгезии на чашках Петри. Выделение фракции нейтрофилов производили на градиенте плотности фиколл-верографин (р=1,077) наслаиванием плазмы крови с лейкоцитами. С04+клетки и CD8+клетки выделяли при помощи наборов магнитных бус Dynabeads М-450 CD4 и Dynabeads CD8 («Invitrogen», США) в соответствии с методикой, предложенной производителем. Моноциты получали методом адгезии на стенках лунки и культивировали совместно с CD4+wih С08+клетками.

Лейкоциты культивировали в полной питательной среде, которую готовили на основе RPMI 1640 (ICN, США) или среды 199 («Биолот», Россия) с добавлением 10 mM HEPES («Sigma», США), 2 тМ L-глутамина («Sigma», США), 100 мкг/мл гентамицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Биолот», Россия) во влажной атмосфере с 5% С02 при 37°С в присутствии липополисахарида (ЛПС, Escherichia coli 026:В6, «Sigma», США) в концентрации 0,1 мкг/мл или 2,5 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА, «Sigma», США). Каждая культура содержала 1 * 106 клеток (нефракционированная лейкоцитарная суспензия, мононуклеары, нейтрофилы, CD4+ и С08+клетки) или 5*105 клеток (моноциты) в 1 мл полной питательной среды. Агонист ц/б-опиатных рецепторов ß-эндорфин («Sigma», США) вносили в культуры одновременно с индуктором в концентрациях 10"7-10"пМ, ц-агонист опиатных рецепторов DAGO ([й-А1а2,"Ы-Ме-РЬе4,С1у5-о1]-эшсефалин, «Sigma», США) в концентрации 10'8М; 5-агонист опиатных рецепторов DADLE ([d-А1а2^-Ьеи5]-энкефалин, «Sigma», США) в концентрации 10'7М, высокоселективный б2-агониста Deltorphin II ([Tyr-d-A]a-Phe-Glu-Val-Val-Gly]-aMHH, «Sigma», США) в концентрации 10"7М; неселективный 5/ц-антагонист опиатных рецепторов налоксона гидрохлорид (Варшавский фармацевтический завод, Польша) и селективный антагонист 5-рецепторов налтриндола гидрохлорид (ICN, США) в концентрации 1(ГбМ, диклофенак натрия - 25 мкг/мл, антитела к акцессорному протеину рецептора IL-1 (анти-IL-lRACP, «Sigma», США) - 100 нг/мл.

Определение концентрации исследуемых цитокинов (IL-lß, TNF-a, IL-б, IL-8, IL-lra, IFN-y, IL-4, IL-2) в супернатантах клеточных культур производили методом

твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург, Россия) и ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия).

Оценку кислородзависимой микробицидной активности лейкоцитов осуществляли с использованием реакции люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ). В качестве индуктора JI3XJ1 использовали опсоиизированный зимозан («Sigma», США) в концентрации 15 и 150 мкг/мл. В качестве маркера выраженности реакции ЛЗХЛ использовался люминол 10"5М («Sigma», США).

Статистический анализ проводили с использованием двухфакторного дисперсионного анализа, LSD-критерия наименьшей значимой разницы для анализа зависимости доза-эффект и парного í-критерия Стьюдента для оценки эффектов ß-экдорфина, опиат пых антагонистов и агонистов. Все данные на рисунках и в таблицах представлены в виде средней и её стандартной ошибки (М±т).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние опиондных пептидов на кислородзависимую микробицидную активность лейкоцитов. В результате проведенных исследований установлено, что в нефракционированной лейкоцитарной суспензии ß-эндорфин не влиял на спонтанную продукцию активных форм кислорода

(рисунок 1). В культурах, стимулированных зимозаном в концентрации 15 мкг/мл, пептид угнетал ЛЗХЛ на 15-40-й и 60-й мин реакции. В присутствии высокой концентрации индуктора достоверных эффектов ß-эндорфина на динамику ЛЗХЛ выявлено не было. В то же время селективный 6-агонист DADLE проявил выраженное стимулирующее действие на спонтанную ЛЗХЛ практически на всем отрезке наблюдения и подавлял стимулированную зимозаном 15 мкг/мл ЛЗХЛ, начиная с 20-й мин реакции. Динамику ЛЗХЛ, индуцированную высокой концентрацией зимозана 150 мкг/кг, DADLE не изменял.

Как видно из рисунка 2, селективный агонист ц-рецспторов DAGO, подобно DADLE, усиливал спонтанную ЛЗХЛ, подавлял стимулированную зимозаном 15 мкг/мл ЛЗХЛ, начиная с 20-й мин реакции, и не влиял на продукцию активных форм кислорода лейкоцитами в присутствии высокой концентрации индуктора 150

мкг/мл. Высоко селективный §2-агонист опиатных рецепторов Бе^огрЫп II не влиял на спонтанную и индуцированную зимозаном 150 мкг/мл продукцию активных форм кислорода, однако статистически значимо стимулировал ЛЗХЛ, индуцированную зимозаном 15 мкг/кг только в одной тачке, а именно на 25-й мин реакции.

Во фракции очищенных нейтрофилов (данные не приводятся) была получена несколько иная картина: (3-эндорфин не влиял на спонтанную ЛЗХЛ нейтрофилов и выражено угнетал стимулированную ЛЗХЛ. Индуцированную зимозаном 15 мкг/мл

о 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

(В)

Рисунок 1 - Влияние p-эндорфина (левая колонка) и DADLE (правая колонка) на спонтанную (А) и индуцированную зимозаном 15 мкг/мл (Б) и 150 мкг/мл (В) ЛЗХЛ лейкоцитов (п=5). Примечание: Здесь и далее по оси абсцисс - время (мин); пептид, 0-контроль; * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю.

2 loo В

(А)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 время, мин.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

время, мин,

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 время, мин

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 время, мин.

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 время, мин.

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 время, лгин.

(В)

Рисунок 2 - Влияние DAGO (левая колонка) и Deltorphin II (правая колонка) на спонтанную (А) и индуцированную зимозаном 15 мкг/мл (Б) и 150 мкг/мл (В) ЛЗХЛ лейкоцитов (п=5). Примечание: Остальные обозначения - те же, что и на рисунке 1.

ЛЗХЛ пептид снижал на 10-25-й и 35-40-й мин реакции, а индуцированную зимозаном 150 мкг/мл - на 10-60-й мин реакции. Схожее действие на динамику ЛЗХЛ оказывал б-агонист DADLE. Пептид не влиял на спонтанную и выражено угнетал индуцированную обеими концентрациями зимозана ЛЗХЛ нейтрофилов во временном диапазоне, аналогичном тому, в каком действовал fS-эндорфин.

Селективный р-агонист DAGO статистически значимо не влиял на спонтанную и индуцированную 15 мкг/мл ЛЗХЛ, но выражено снижал зимозан-индуцированную (150 мкг/мл) ЛЗХЛ нейтрофилов с 10-й по 60-й мин эксперимента. D отношении б^-агониста опиатных рецепторов Deltorphin II в культурах очищенных нейтрофилов отмечены лишь единичные точки угнетающего действия.

Таким образом, направленность действия опиоидных пептидов на продукцию активных форм кислорода эффекторами врожденного иммунитета зависит как от селективности агониста и типа стимулируемого рецептора, так и от процессов межклеточной кооперации.

Влияние опиоидных пептидов на продукцию цнтокинов эффекторами врожденного иммунитета. Как видно из представленных данных (таблица 1), ЛПС незначительно усиливает продукцию IL-ip нефракционированиыми лейкоцитами и выражено стимулирует синтез IL-8.

При анализе влияния ¡3-эндорфина на продукцию IL-ip в нефракционированной лейкоцитарной суспензии (таблица 1) показано, что пептид в концентрациях 10"7-10"пМ активирует ЛПС-индуцированный синтез IL-ip (F=3,38; р=0,041), а также стимулирует спонтанную продукцию данного цитокина (F=3,3; р=0,044) в концентрациях 10'7, 10"9М. Одновременно отмечено угнетающее влияние пептида на ЛПС-индуцированный синтез IL-8 (F=14,98; р=0,001) в концентрациях 10'7и10"пМ.

Таким образом, оценка зависимости доза-эффект показала наиболее выраженное влияние Р-эндорфипа на цитокиновую продукцию в концентрации 10"7М, которая и была использована для дальнейшего исследования по оценке характера участия различных типов опиатных рецепторов.

Как видно из таблицы 2, неселективиый 5/|>антагонист налоксон и селективный 5-антагонист налтриндол стимулирующий эффект Р-эндорфина на продукцию IL-ip в течение 24 ч культивирования не отменяли. Помимо этого зарегистрирован самостоятельный стимулирующий эффект налтриндола на продукцию IL-ip, поэтому при совместном внесении в культуры Р-эндорфина и

налтриндола уровень 1Ир повышался достоверно не только по отношению к контролю, по и к р-эндорфину и к налгриндолу. Налоксон на синтез 11,-10 влияния не оказывал. Аналогичная картина наблюдалась и на 48 ч культивирования.

Оценка влияния р-эндорфина на фоне блокады опиатных рецепторов на продукцию другого провоспалительного фактора ТОР-а показала выраженное угнетение уровня цитокина при совместном внесении в культуры (3-эндорфина и антагонистов опиатных рецепторов налоксона и налтриндола в течение как 24 ч, так и 48 ч культивирования (таблица 2). Проведенный в дальнейшем факторный анализ выявил статистически значимое влияние р-эндорфина (Р=6,07; р=0,039), а также достоверный эффект налтриндола (Р=6,55; р=0,034) на продукцию ТЫГ-а в 24-часовых культурах. Через 48 ч культивирования достоверный эффект зарегистрирован только у налтриндола (Р=11,43; р=0,028).

Анализ влияния р-эндорфина на продукцию 1Ь-8 (таблица 2) показал статистически достоверный угнетающий эффект пептида как через 24 ч, так и через 48 ч культивирования, который отменялся как налоксоном, так и налтриндолом. При этом сами по себе антагонисты опиатных рецепторов влияния на динамику продукции 1Ь-8 не оказывали. Эффектов р-эндорфина и антагонистов опиатных

Таблица 1 - Влияние р-эндорфина на продукцию 1Ь-1р и 1Ь-8 в нефракционированной клеточной суспензии

Цитокин Экспериментальное Концентрация 3-эндорфина, М

воздействие контроль ю-' 10"9 10

пир, Без индуктора 134,69± 280,96+ 274,54+ 238,77±

пг/мл 51,16 89,96* 56,18* 58,19

(п=8) ЛПС 0,1 мкг/мл 192,45± 312,76± 319,63± 298,08±

62,43 56,50* 86,95* 68,40*

Без индуктора 1353,68+ 1340,28± 1664,63± 1313,30±

пг/мл 114,42 104,42 44,10 156,25

(п=4) ЛПС 0,1 мкг/мл 1699,20± 1278,40+ 1635,43+ 1364,28+

68,25" 31,34** 68,31 59,85**

Примечание: * - р < 0,05; ** - р < 0,01 к контролю; а- р <0,05 - к спонтанной продукции,

Таблица 2 - Влияние Р-эндорфина на продукцию 1Ь-1р, ЮТ-а, 1Ь-6, 1Ь-8 и 1Ь-1га в условиях блокады опиатных рецепторов в нефракцпонированной лейкоцитарной суспензии в присутствии ЛПС

Цитокин Время культивирования Экспериментальное воздействие

контроль р-эндорфин р-эндорфин+ налоксон Р-эндорфин+ налтриндол налоксон налтриндол

1Ь-1р, пг/мг (п=8) 24 ч 183,75+ 34,13 280,06± 37,18*** 310,10+ 46,12*** 355,46± 34,12*** 226,46+ 42,18 267,77± 28,09**

48 ч 7,58± 6,67 36,40± 12,15* 48,12+ 15,44* 61,05+ 16,79* 20,34± 13,40 28,12± 9,43*

ТОТ-а, пг/мл (п=8) 24 ч 276,57+ 26,75 252,53± 16,78 203,13± 19,51* 184,88± 20,48* 265,88+ 18,31 245,88± 19,26

48 ч 207,13± 14,89 198,21+ 21,36 149,53+ 29,38* 138,50± 23,71* 194,76+ 27,09 155,99+ 27,34

1Ь-6, пг/мл (п=8) 24 ч 577,86± 10,77 606,49+ 21,78 578,95± 12,05 609,25± 22,18 604,26± 23,19 595,85+ 10,99

48 ч 1106,39+ 40,32 1152,6+ 32,97 1194,22± 43,60 1272,86± 16,12* 1171,57+ 35,84 1187,48+ 36,82*

1Ь-8, пг/мл (п=8) 24 ч 949,87+ 90,61 884,51± 83,24* 918,2± 113,63 880,95+ 110,52 913,18± 105,65 924,14± 103,75

48 ч 1101,16+ 17,17 1037,17+ 21,67* 1094,18± 18,62 1081,72± 31,55 1093,66+ 14,65 1083,64± 19,1

1Ь-1га, пг/мл (п=8) 24 ч 1065,82+ 185,70 1397,54± 217,97** 1461,34± 221,38* 1368,52± 183,16* 1083,34± 191,75 1345,39± 184,66*

48 ч 1108,2+ 360,41 1311,03± 359,99* 1371,24± 323,90* 1432,3± 368,69* 1217,97+ 339,22 1282,34± 356,10*

Примечание: * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю.

рецепторов на уровень IL-6 на 1-е сутки культивирования выявлено не было. Однако через 48 ч культивирования зафиксирован самостоятельный стимулирующий эффект налтриндола, который проявлялся как при изолированном внесении антагониста в культурах, так и в условиях комбинации с Р-эндорфином.

В заключении мы оценивали влияние блокады опиатных рецепторов на р-эндорфин-опосредованный синтез рецепторного антагониста IL-ip IL-lra (таблица 2), который имел картину, схожую с полученной при анализе продукции IL-1р. Выявлен статистически достоверный стимулирующий эффект пептида на продукцию IL-lra через 24 ч культивирования. Налтриндол оказывал самостоятельное стимулирующее действие, а налоксон на синтез IL-lra не влиял. Комбинация пептида с опиатными антагонистами приводила к усилению продукции IL-lra, так что отмены стимулирующего влияния Р-эндорфина на фоне блокады опиатных рецепторов не отмечено. На 2-е сутки культивирования наблюдается аналогичная ситуация.

Таким образом, как следует из полученных данных, продукцию цитокинов семейства IL-1 нефракционированными лейкоцитами Р-эндорфин активирует, а продукцию TNF-a и IL-8 угнетает, таким образом, оказывая двоякое действие: с одной стороны, активируя процессы пролиферации и дифференцировки, а с другой - угнетая хемотаксис. При этом в отличие от IL-ip, депрессия IL-8 проявляется только в ЛПС-индуцированных культурах и нивелируется опиатными антагонистами, что указывает на вовлечённость различных рецепторных механизмов в регуляцию синтеза IL-ip, TNF-a и IL-8 Р-эндорфином.

Так как в нефракционированной лейкоцитарной суспензии кроме моноцитов -основных продуцентов провоспалительных цитокинов - присутствовали и гранулоциты, в частности нейтрофилы, способные синтезировать ряд про- и противовоспалительных факторов [Швыдченко И.Н. и соавт., 2005], то в дальнейшем проводилась оценка влияния p-эндорфина и селективных агонистов ц/6-опиатных рецепторов на продукцию IL-ip и IL-8, в отношении которых на 1-е сутки культивирования ранее был показан наиболее выраженный эффект пептида,

во фракции мононуклеаров и в очищенных фракциях нейтрофилов и моноцитов в 24-часовых культурах.

Данные, представленные на рисунке 3, демонстрируют выраженную стимуляцию синтеза IL-1(3 при внесении ЛПС во фракции мононуклеаров в отличие от нефракционированной лейкоцитарной суспензии. Р-эндорфин инициирует как спонтанную, так и ЛПС-индуцированную продукцию IL-1J3 мононуклеарами. Аналогичная картина наблюдается во фракции нейтрофилов. ЛПС статистически достоверно повышает уровень IL-lp по сравнению с контролем. Выявлен стимулирующий эффект Р-эндорфина на спонтанную и ЛПС-индуцированную продукцию IL-ip нейтрофилами. Во фракции моноцитов обнаружена выраженная стимуляция синтеза IL-ip под действием ЛПС, Р-эндорфин уровень данного цитокина не изменяет.

Оценка влияния Р-эндорфина на продукцию IL-8 (рисунок 3) показала угнетающий эффект пептида во фракции мононуклеаров в ЛПС-индуцированных культурах. Помимо этого, p-эндорфин снижает ЛПС-индуцированный синтез IL-8 нейтрофилами. Влияния Р-эндорфина на синтез IL-8 моноцитами не зафиксировано.

Поскольку Р-эндорфии является пептидом со смешанным спектром связывания опиатных рецепторов, а также было выявлено отсутствие отмены эффектов опиоидного пептида на фоне блокады ц-,8-опиатных рецепторов, в дальнейшем нами проводилось исследование продукции провоспалитсльных факторов с использованием селективных агонистов опиатных рецепторов.

Анализ влияния селективных агонистов на уровень IL-ip в культурах мононуклеаров (данные не приводятся) выявил стимулирующее влияние селективного б-агониста опиатных рецепторов DADLE на спонтанную и ЛПС-индуцированную продукцию IL-lp. В то же время селективный ц-агонист опиатных рецепторов DAGO и высокоселективный 5гагокист Deltorphin II влияния на синтез IL-1P во фракции мононуклеаров не оказывают.

Мононуклеары Нейтрофиль»

Моноциты

.. а... *

•к **

. Т

Л

rh

¿........л

rh

rh

(А)

К 1 2 3 К 1 2 3

Мононуклезр« Нейтрофил ы

К 1 2 3

Моноциты

1600 1400 1200 1000 800 600

fltoüQíd

iíi

ifi

К 1 2 3

К 1 2 3 К 1 2 3

(Б)

Рисунок 3 -Влияние ß-эндорфина на продукцию IL-lß (А) и IL-8 (Б) во фракциях моиануклеаров, нейгрофилов и моноцитов в течение 24 ч культивирования (п=9). Примечание: К - контроль, 1 - ß-эндорфин, 2 - ЛПС, 3 - ЛПС+р-эндорфнн; * - р < 0,05, ** - р < 0,01 к ко!пролю, а • р < 0,05 к ЛПС.

Во фракции нейтрофилов б-агоиист DADLE угнетает спонтанную и стимулирует ЛПС-индуцированную продукцию IL-lß, при этом 52-агонист Deltorphin II в присутствии ЛПС статистически достоверно снижает уровень IL-lß

по сравнению с контролем.

При оценке влияния селективных агонистов опиатных рецепторов на продукцию IL-8 (данные не приводятся) во фракции мононуклеаров выявлено угнетающее влияние 6-агониста DADLE на синтез исследуемого цитокина в культурах с ЛПС. Кроме того, 5-агонист DADLE и ц-агонист DAGO статистически

значимо снижают ЛПС-индуцированную продукцию IL-8 нейтрофилами. В культурах без ЛПС эффектов опиатных агонистов не зафиксировано.

Таким образом, селективные агонксты оказывали эффекты в общем схожие с эффектами fi-эндорфина, т.е. стимулировали продукцию IL-ip и снижали уровень IL-8 в ЛПС-индуцированных культурах, преимущественно в условиях активации 6-опиатных рецепторов. В то же время, использование в качестве 5-агониста Deltorphin II, пептида с более селективным спектром связывания, нежели DADLE, фактически не выявило влияния на продукцию исследуемых цитокинов, а во фракции нейтрофилов эффект Deltorphin II на продукцию IL-lp был противоположен эффекту DADLE.

В заключении можно сказать, что опиоидиые пептиды модулируют продукцию провоспапительных факторов эффекторами врожденного иммунитета, стимулируя синтез цитокинов семейства IL-1 и угнетая продукцию IL-8 и TNF-a.

Влияние опиондных пептидов на продукцию ТМ/ТМ-цитокинов и роль клеток врожденного иммунитета в регуляции этих процессов. Установлено, что добавление в культуры ФГА (рисунок 4) оказывает незначительное влияние на синтез IL-4 и IL-2 в нефракционированной лейкоцитарной суспензии, Напротив, продукция IFN-y в присутствии ФГА значительно усиливается.

Оценка влияния fi-эндорфина на синтез IL-4 (рисунок 4) выявила стимулирующий эффект исследуемого пептида в культурах лейкоцитов с ФГА в концентрациях 10"7-10"8М (F=3,089; р<0,05), который отсутствует в случае спонтанной продукции данного цитокина (F=2,4; р=0,072). Кроме того, не выявлено эффекта p-эндорфина на спонтанную и ФГА-индуцированную продукцию IFN-y и IL-2 в нефракционированной лейкоцитарной суспензии.

Как видно из таблицы 3, {5-эндорфин, усиливая продукцию IL-4 в нефракционированной лейкоцитарной суспензии, не влияет на его уровень в культуре С04+клеток. Добавление к С04+лимфоцитам моноцитов приводит к стимуляции продукции IL-4 под воздействием Р-эндорфина до уровня нефракционированных культур. Уровень продукции IFN-y очищенными

!СВ4+лимфоцитами в присутствии (З-эндорфина не изменяется. Однако при добавлении к С04+лимфоцитам моноцитов р-эндорфин статистически значимо

'снижает синтез ЕТО-у- В то же время пептид не оказывает влияния на продукцию 1Ь-

)

2 в культурах очищенных СБ4тклеток.

ФГА2.5 мкг/мл А АЛ

(А)

К -7 -8 -9 -10 К -7 -8 -9 -10

Концентрация пептида, 1ов№ М

ФГА 2,5 МКГ/МЛ

Г^,ГН ГЛ.ГП гП

ё

(Б)

К -7 -8 -9 -10 К -7 -8 -9 -10

Концентрация пептида, К^ю М

гТТт

гЫт

+1

гЬ

гЬ

Г+1

(+1

(В)

К -7 -8 -9 -10 К -7

Кощрктращы пегггяда, Ь^ш М

Рисунок 4 - Влияние Р-эндорфина на спонтанную и ФГА-индуцированную продукцию 1Ъ-4 (А), ШЫ-у (Б) и 1Ь-2 (В) в нефракционированной лейкоцитарной суспензии (п=8). Примечание. * - р < 0,05, ** - р <0,01, *** -р <0,001 к контролю.

Таблица 3 - Влияние ß-эндорфина на ФГА-индуцированную продукцию IL-4, IL-2 и IFN-y СР4+лимфоцитами_

Клеточная фракция Экспериментальное воздействие Концентрация цитокина, пг/мл

IL-4 (п=9) IFN-y (п=9) IL-2 (п=9)

С04+лимфоциты Контроль ß-эндорфин 5,10±1 ДО 5,88+1,61 66,24±1б,51 59,33+11,38 31,2515,46 21,59±1,85

С04+лимфоциты и моноциты Контроль ß-эндорфин 6,02±1,06 9,42±1,76* 168,72±27,60 131,36±20,30* 23,38±3,49 20,26+1,56

Примечание.: * - р < 0,05к контролю.

Анализ эффектов селективных агонистов на уровень IL-4 (данные не приводятся) выявил стимуляцию селективным 5-агонистом опиатных рецепторов DADLE ФГА-индуцированной продукции IL-4 и в нефракционированной лейкоцитарной лейкоцитарной суспензии, и в системе «CD41 лимфоциты-моноциты», что не наблюдается во фракции очищенных С04+лимфоцитов. Одновременно селективный ц-агонист DAGO и высокоселективный б2-агонист Deltorphin II не оказывают влияния на синтез IL-4. В отношении IL-2 влияние селективных агонистов опиатных рецепторов обнаружить не удалось.

Синтез IFN-y аналогично результатам, полученным для ß-эндорфина, в присутствии опиатных агонистов очищенными С134+лимфоцитами не изменяется.

Но при добавлении к С04+лимфоцитам моноцитов проявляется хорошо выраженный угнетающий эффект селективного ц-агониста опиатных рецепторов DAGO, а также высокоселективного 5г-агониста Deltorphin II. В то же время в нефракционированной лейкоцитарной суспензии в присутствии селективного 5-агониста DADLE наблюдается угнетение продукции IFN-y в отличие от стимулирующего влияния селективного ц-агониста опиатных рецепторов DAGO.

Наблюдаемое угнетение уровня IFN-y в системе «С04+лимфоциты-моноциты», но не в нефракционированной лейкоцитарной суспензии может объясняться рядом причин. Поскольку присутствующие в лейкоцитарной фракции С08+лимфоциты и нейтрофилы в определенных условиях способны оказаться продуцентами IFN-y [Yamada М. et al., 2011], впоследствии проводилось

определение действия опиоидпых пептидов на синтез данного цитокина С08+лимфоцитами и нейтрофилами периферической крови.

Выявлен четко выраженный стимулирующий эффект как ß-эндорфина, так и селективного р-агониста опиатных рецепторов DAGO в ЛПС-индуцированных культурах нейтрофилов (рисунок 5). При этом селективный 5-агонист DADLE не оказывал влияние на синтез IFN-y. В отсутствии ЛПС уровень IFN-y под действием селективных агонистов опиатных рецепторов не изменялся. Напротив, показано отсутствие эффекта ß-эндорфина на синтез IFN-y как в ФГА-индуцировашшх культурах изолированных С08+лимфоцитов, так и в присутствии моноцитов. Аналогичная картина отмечена и для селективного 5-агониста опиатных рецепторов DADLE.

Таким образом, эффекты опиоидпых пептидов на ФГА-индуцированную продукцию IL-4 и IFN-y С04+лимфоцитами зависят от присутствия фракции моноцитов в культурах, которая определяет ТЬ2-поляризирующую направленность влияния ß-эндорфина. В то же время, нейгрофильные гранулоциты способны вносить определённый вклад в регуляцию продукции IFN-y, оказывая, может быть не значительное, но влияние на баланс основных ТЫ/ТЬ2-поляризующих факторов IL-4 и IFN-y.

Без индуктора

С08+-лимсро1^ты __ С08+-лимфоциты и

моноциты

(А)

(Б)

Рисунок 5 - Влияние ß-эцдорфина и селективных агонистов опиатных рецепторов на ЛПС-индуцированную продукцию IFN-y нейтрофилами (А) и ФГА-индуцированную продукцию IFN-y С08+лимфоцитами (Б) (п=9).

Примечание: К - контроль, 1 - ß-эндорфин, 2 - DADLE, 3 - DAGO; * - р < 0,05, ** - р < 0,01 к контролю.

*** *

..........................Í..........1ГГ"

Z □ 3 • —Í— 1 [—Í— Г-¡-П Г-Н..

К I 2 3 4 S

Рисунок 6 - Влияние p-эндорфина на ФГА-индуцированную продукцию IL-4 на фоне анти-IL-1RACP и блокады синтеза простогландинов диклофенаком натрия во фракции лейкоцитов (п=7). Примечание: К - контроль, 1 - р-эндорфин, 2 - Р-эндорфин + анти-IL-lRACP, 3 - анти-IL-lRACP, 4 - Р-эндорфин + диклофенак натрия, 5 - диклофснак натрия; * - р < 0,05, ** - р < 0,0), *** - р < 0,001 к контролю.

Из большого количества факторов, продуцируемых моноцитами, в поляризации Т-хелперов в сторону ТЬ2-клеток наибольшее значение играют IL-ip и производные арахидоновой кислоты, в частности простагландины [Fox B.S., Li Т.К., 1993]. Продукция обоих факторов стимулируется под воздействием р-эндорфина [Andjelkov N. et al., 2005]. В дальнейшем мы оценивали роль IL-ip и простагландинов в регуляции продукции IL-4 СГ)4+лимфоцитами в присутствии р-эпдорфина в нефракционированной лейкоцитарной суспензии.

Показано, что блокада рецептора IL-1 не отменяет стимулирующего влияния Р-эндорфина на ФГА-индуцированную продукцию IL-4 (рисунок 6), в то же время на фоне блокады синтеза простагландинов диклофенаком натрия стимуляция продукции IL-4 нивелируется. Самостоятельного эффекта антител против рецептора IL-1 и диклофенака натрия зафиксировано не было. То есть ключевая роль в регуляции продукции IL-4 принадлежит продуктам циклооксигеназного цикла, преимущественно простагландину Ег, секретируемому моноцитами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исходя из всего вышеизложенного, можно отметить, что опиоидные пептиды являются важными факторами обеспечения внутреннего гомеостаза и обладают выраженным иммуномодулирующим действием, регулируя микробицидную и секреторную активность клеток-эффекторов врожденного иммунитета, а также

Нейтрофил

СР4'-лимфоцит

ц ?

Т1'СЕ;

н/о (1 8 Моноцит/макрофаг

Ц 5

V

¡ш-г

fa-4

Т1ь-б

^¡р

/ : %

Т1ЫР * Т|о,

|П--8

рисунок 7 - Возможный механизм влияния р-эндорфина на функциональную активность (Эффекторов врожденного иммунитета и ТМ/Т1т2-иоляризацию лимфоцитов. (,Примечание: | - стимулирующий эффект, 1 - ингибирующий эффект.

|ТЬ1/ТЬ2 баланс лимфоцитов (рисунок 7). При этом проявляется разнонаправленный ¡характер влияния 3-эндорфина и синтетических аналогов энкефалинов с 'селективным спектром связывания на продукцию активных форм кислорода и 'провоспалительных факторов, зависящий от соотношения клеточных фракций в жультуре. Также выявлена важная роль клеток врождённого иммунитета в опиоид-|опосредованной регуляции процессов ТЫПЪ2-поляризации лимфоцитов, где 'ключевым фактором выступают простагландины, секретируемые моноцитами. ВЫВОДЫ

1. Направленность действия опиоидных пептидов на продукцию активных

I

форм кислорода зависит как от селективности агониста, так и от типа стимулируемого рецептора; в лейкоцитарной взвеси селективные 5- и ц-агонисты стимулировали спонтанную и угнетали стимулированную реакцию люминолзависимой хемилюминесценции; в очищенной фракции нейтрофилов (3-эндорфин и 5-, ц-агонисты не влияли на спонтанную и угнетали активированную зимозаном люминолзависимую хемилюминесценцию нейтрофилов.

2. р-эндорфин оказывает модулирующее действие на цитокинпродуцирующую функцию эффекторов врождённого иммунитета, усиливая продукцию 1Ь-1[} и угнетая синтез 1Ь-8; в условиях блокады ц, 5-опиатных

рецепторов отмены стимулирующего влияния p-эндорфина на продукцию IL-ip не наблюдается, при этом угнетение продукции IL-8 опиатными антагонистами нивелируется.

3. Р-эндорфин стимулирует продукцию IL-4 лейкоцитами и не влияет на продукцию IL-2 и IFN-y; стимулирующий эффект пептида на синтез IL-4 С134+;шмфоцитами зависит от присутствия моноцитов и реализуется преимущественно через стимуляцию 5-рецепторов; продукция IFN-y С04+лимфоцитами в присутствии моноцитов под воздействием опиоидных пептидов снижается.

4. p-эндорфин не влияет на продукцию IFN-y CD8+лимфоцитами, в то же время стимулирует секрецию IFN-y нейтрофилами; решающая роль в процессе опиоид-опосредованной регуляции синтеза IL-4 и, как следствие, поляризации хелперов в направлении ТЬ2-кпеток, принадлежит продуктам циклооксигеназного цикла, преимущественно простагландину Ег.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Горшкова К.Г. Роль бега-эндорфина в регуляции продукции IL-lp и IL-8 моноцитами и нейтрофилами периферической крови / К.Г. Горшкова, C.B. Гейн, С.П. Тендрякова // Вестник Уральской медицинской академической науки. -2006. 3-1(14). - С. 46-47.

2. Гейн C.B. Роль p-эндорфина в регуляции продукции провоспалительных цитокинов моноцитами периферической крови in vitro / C.B. Гейн, К.Г. Горшкова, С.П. Тендрякова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2007. - Т. 143, № 2. - С. 175-178.

3. Гейн C.B. Регуляция продукции интерлейкина-ip и интерлейкина-8 агонистами ц, 6-огогатных рецепторов in vitro I C.B. Гейн, К.Г. Горшкова, С.П. Тендрякова II Российский физиологический журнал. - 2008. - Вып.94, № 7. - С. 814-821.

4. Гейн С,В. Оценка влияния P-эндорфина на продукцию ИЛ-4 и у-ЙФН CD4(-лимфоцитами / C.B. Гейн, К.Г. Горшкова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Т. 146, № 10. - С. 427-430.

5. Гейн C.B. Регуляция опиоидными пептидами продукции IFN-y in vitro / C.B. Гейн, К.Г. Горшкова // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2009. - №2/1(24). -С. 26 - 27.

Публикации в других изданиях

6. Гейн C.B. Влияние p-эндорфина на продукцию IL-ip, TNF-a, 1L-6 моноцитами периферической крови / C.B. Гейн, К.Г. Горшкова // Иммунология Урала; материалы V конф. иммунологов Урала - Оренбург, 2006. - № 1. - С. 6-7.

7. Гейн C.B. Роль p-эндорфина в регуляции продукции IL-ip и IL-8 I C.B. Гейн, К.Г. Горшкова // Медицинская иммунология. - 2007. - Т. 9, № 2-3: Дни иммунологии в Санкг-

Петербурге: материалы X Вссрос. науч. Форума с междунар. участием им. акад. В.И. Иоффе. -С. 130.

8. Gein S.V. р-endorphin-induced modulation of cytokine production by peripheral blood leukocytes / S.V. Gein, K..G. Gorshkova, T.A. Baeva// Interaction of the nervous and immune systems in health and disease: International symposium. - Saint-Petersburg, 2007. - P. 26-27.

9. Гейн C.B. Роль IL-ip и гтростагландинов в регуляции функциональной активности лимфоцитов в присутствии опиоидных пептидов / С.В. Гейн, К.Г. Горшкова, О.Н. Гейн, С.П. Тендрякова // Вестник Пермского университета. - 2007. - Вып.5(10). - С. 186-189.

10. Горшкова К.Г. Влияние опиоидных пептидов на продукцию IL-4 С04+лимфоцитами / К.Г. Горшкова, С.В. Гейн // Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии: материалы III региональной конференции молодых ученых с международным участием. - Пермь, 2007.-С. 139-140.

П.Горшкова К.Г. Опиоидные пептиды - регуляторы цитокиновой продукции клеток естественного и адаптивного иммунитета / К.Г. Горшкова, С.В. Гейн // Молодежь и наука на севере: материалы I Всероссийской молодежной научной конференции. - Сыктывкар, 2008. - Т. II. - С. 208-209.

12. Гейн С.В. Оценка роли опиоидных пептидов в регуляции цитокинпродукцирующей функции С04+лимфоцитов / С.В. Гейн, К.Г. Горшкова // Загрязнение окружающей среды, адаптация и иммунитет: материалы VII Междунар. конф. - Пермь; Н.Новгород, 2008. - С. 67.

13. Горшкова К.Г. Оценка участия p-эндорфина в регуляции цитокинпродуцирующей функции Си4*лимфоцитов / К.Г. Горшкова, С.В. Гейн // Биология - наука XXI века: сб.тез. 12-ой Междунар. Пущинской школы-копф. молодых ученых. - Пущино, 2008. - С. 125.

14. Горшкова К.Г. Регуляция продукции интерферона-у, опосредованная опиоидными пептидами / К.Г. Горшкова, С.В. Гейн // Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике: тез. докл. VIII Молодеж. науч. конф. Института физиологии Коми НЦ УрО РАН. - Сыктывкар, 2009. - С. 54-57.

15. Горшкова К.Г. Лиганды (лУб-опиатпых рецепторов модулируют продукцию у-интерферона/ КГ. Горшкова, С.В. Гейн // Симбиоз Россия 2009: материалы II Всерос. с междунар. участием конгресса студентов и аспирантов-биологов. - Пермь, 2009. - С. 283-285.

16. Gein S.V. р-endorphin and p-,S-receptor agonist in regulation ofIFN-у production in vitro and in vivo / S.V. Gein, T.A. Baeva, K.G. Gorshkova // Interaction of the nervous and immune systems in heailh and disease: International symposium. - Saint-Petersburg, 2009. - P. 20-21.

17. Гейн С.В. p-эндорфин в регуляции функций иммунной системы in vivo и in vitro / С.В. Гейн, T.A. Баева, К.Г. Горшкова // Молекулярная медицина и биобезопасность: материалы VI междунар. конф. - М., 2009 - С.60-61,

18. Gein S.V. Regulation of interlukin-ip and interleukin-8 production by agonists of p and 6 opiate receptors in vitro / S.V. Gein, K.G. Gorshkova, S.P. Tendryakova // Neuroscience and Behavioral Physiology. - 2009. - Vol. 39, No. 6. - P. 591-595.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЛПС - липополисахарид

ЛЗХЛ - люминолзависимая хемилюминесценция

TNF - фактор некроза опухолей (tumor necrosis factor)

IL - интерлейкин (interleukin)

IFN-y - интерферон-у (interfcron-y)

CD - кластер дифференцировки (cluster of differentiation)

ФГА- фитогемагглютинин

Th - Т-хелперы (T-helper)

PG - простагландин

Подписано в печать 21.02.12. Бумага офсетная. Формат 60x90 1/16. Гарнитура «Times New Roman». Печать ризография. Усл. печ. л. 1,75. Тираж 120 экз.

Печатный салон «На Дружбе». 614070, Пермь, ул. Дружбы, 34.