Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Влияние блокады μ-,δ-опиатных рецепторов на функции иммунной системы при различных вариантах стресса

ШАРАВЬЕВА Ирина Леонидовна

ВЛИЯНИЕ БЛОКАДЫ ц-, 6-ОПИАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ НА ФУНКЦИИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТАХ СТРЕССА

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 ' ГЗГ7

Екатеринбург - 2011

4841878

Работа выполнена в лаборатории биохимии развития микроорганизмов учреждения РАН Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, доцент Гейн Сергей Владимирович

доктор медицинских наук, профессор Зурочка Александр Владимирович доктор биологических наук Куклина Елена Михайловна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «_/£» ОмъуССи^ 2011 г. в часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д.004.027.01 при Учреждении РАН Институт иммунологии и физиологии УрО РАН (620049, г. Екатеринбург, ул. Первомайская, 106).

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке УрО РАН (620041, г. Екатеринбург, ул. С. Ковалевской-Академическая, 22/20), с авторефератом - на сайте Учреждения РАН ИИФ УрО РАН - http://www.iip.uran.ru

Автореферат разослан «_

// » Ы^сСср /п-Л^ 2011 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 004.027.01 при учреждении РАН ИИФ УрО РАН доктор медицинских наук, профессор р И.А. Тузанкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Опиоидные пептиды - большая группа физиологически активных биорегуляторных факторов, реализующая свои эффекты через взаимодействие с опиатными рецепторами (|д, 6, к). Опиоидные пептиды принимают участие в регуляции целого ряда жизненно важных функций в физиологических и экстремальных условиях (Корнева, Шхинек, 1988; Зозуля, Пшеничкин, 1990; Черешнев, Гейн, 2009; Pruett, 2003; Bodnar, Klein, 2006; Smith, 2008). Основными мишенями опиоидных пептидов являются клетки нервной и иммунной систем, что подтверждено детекцией опиатных рецепторов на поверхности клеток ЦНС и иммуноцитов лимфатических узлов, селезенки, костного мозга (Наволоцкая и соавт., 2004; Гейн, Горшкова, 2008; Plotnikoff et al, 1999; Kraus et al., 2006; Sharp, 2006; Stein, Lang, 2009). Эндорфины, энкефалины и динорфины вовлекаются в развитие и патогенез целого ряда неврологических и аутоиммунных расстройств, модулируют противомикробный и противовирусный ответ, поэтому изучение механизмов иммуномодулирующего действия данной группы соединений чрезвычайно актуально для многих областей медицины и биологии. Синтез и секреция опиоидных пептидов происходит в результате расщепления крупных молекул-предшественников в самых различных органах и тканях, однако преимущественно в ЦНС, в условиях воздействия на организм неблагоприятных факторов окружающей среды. При стрессах, травмах, психоэмоциональных состояниях и физических нагрузках опиоидные пептиды играют решающую роль в регуляции иммунных реакций как на местном, так и на системном уровнях (Гейн, 2010; Voccarino, Kastin, 2000). Несмотря на общий механизм патогенеза, различные виды наиболее часто встречающихся стрессорных воздействий (вращение, ограничение подвижности, переохлаждение и др.) могут значительно различаться по степени выраженности гормональных изменений и, как следствие, своему влиянию на иммунный ответ (Корнева, Шхинек, 1988; Bowers et al., 2008). В зависимости от тяжести и длительности воздействия направленность иммунных реакций может сильно варьировать, что обусловлено реципрокными эффектами различных

гормональных факторов. С этих позиций, роль эндогенных лигандов опиатных рецепторов в стрессорной перестройке иммунной системы, остаётся практически неисследованной областью науки, недостаточно изучен характер участия различных типов опиатных рецепторов в стрессорной перестройке иммунитета. Большой интерес представляет детальное исследование механизмов регуляции функций иммунной системы опиоидными пептидами in vivo, поскольку, являясь эндогенными биорегуляторами, пептиды данной группы могут представлять значительный интерес как потенциальные лекарственные средства.

Цель работы - исследовать влияние блокады ц,5-опиатных рецепторов на функции иммунной системы при различных вариантах стресса in vivo.

Основные задачи

1. Оценить влияние блокады ja-, 5-опиатных рецепторов при ротационном и иммобилизационном стрессе на антителогенез и выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа в условиях локального введения антигена у экспериментальных животных.

2. Исследовать влияние блокады |i-, 5-опиатных рецепторов при ротационном и иммобилизационном стрессе на антителогенез в условиях системного введения антигена у экспериментальных животных.

3. Оценить влияние блокады ц-, 5-опиатных рецепторов при ротационном и иммобилизационном стрессе на пролиферативную и секреторную активность спленоцитов мышей in vivo.

Научная новизна. Впервые проведён анализ иммунорегуляторных эффектов различных вариантов стресса с оценкой роли эндогенной опиоидной системы. Впервые изучен характер участия ц-, 6-опиатных рецепторов в изменениях антителообразования, реакции гиперчувствительности замедленного типа, антигенспецифической пролиферативной активности лейкоцитов лимфатических узлов при остром 1-часовом ротационном и б-часовом иммобилизационном стрессе у мышей в условиях локальной и системной иммунизации в индуктивный и эффекторный период иммунного ответа. Показано, что блокада преимущественно ц-

опиатных рецепторов неселективным антагонистом этих рецепторов иалоксоном отменяла индуцированную ротацией активацию антителогенеза в условиях локальной и системной иммунизации. В условиях более тяжёлого иммобилизационного стресса наблюдалось угнетение антителогенеза, которое также нивелировалрось предварительным введением налоксона. В системе in vivo впервые установлено, что различные по своей тяжести стрессовые факторы могут приводить к разнонаправленным изменениям в пролиферативной и секреторной активности сплсноцитов. Блокада опиатных рецепторов налоксоном, но не селективным 5-антагонистом налтриндолом, отменяла стимулирующее влияние ротации и ингибирующее влияние иммобилизации на пролиферативный ответ спленоцитов и индуцированную ротационным стрессом спонтанную продукцию интерлейкина-1р (IL-lp). Впервые экспериментально доказано, что in vivo в зависимости от тяжести стресса эндогенная опиоидная система может участвовать как в активации, так и в депрессии иммунных реакций.

Теоретическая и практическая значимость. В теоретическом плане работа расширяет существующие представления о роли эндогенных опиоидных пептидов в развитии стрессорных изменений в иммунной системе. Доказано, что в зависимости от тяжести стрессорного воздействия эндогенные опиоиды могут разнонаправлено регулировать выраженность иммунных реакций. В условиях ротационного стресса через опиатные рецепторы опосредуется стимулирующее влияние на антитело генез, пролиферативную и секреторную функции спленоцитов, в то время как в условиях тяжёлого иммобилизационного стресса опиоидные механизмы ответственны за угнетение функций иммунной системы. В работе экспериментально обоснована ключевая роль стимуляции одновременно обоих типов опиатных рецепторов.

Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета (специальные лекционные курсы «Экспериментальная иммунопатология и иммунотерапия», «Молекулярные механизмы межклеточных коммуникаций»).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В условиях локального введения антигена ротационный стресс стимулировал антителогенез в регионарном лимфатическом узле и выраженность реакции гиперчувствителыюсти замедленного типа, предварительное введение животным налоксона отменяло стимулирующие эффекты ротации; иммобшгазационный стресс угнетал выраженность антителогенеза и не влиял на реакцию гиперчувствительности замедленного типа, эффект нивелируется 6-антагонистом налтриндолом.

2. В условиях системной иммунизации предварительное введение мышам несслск-тивного ц, 6-антагониста налоксона приводило к снижению выраженности стимулирующего и ингибирующего эффектов ротационного и иммобилизациошгого стресса на антителогенез, соответственно.

3. Ротационный и иммобилизационный стресс оказывали разнонаправленное влияние на спонтанную пролиферативную и секреторную активность спленоцитов, опосредуемую /л-, 5-опиатными рецепторами.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на VI Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды» (Пермь-Казань-Пермь, 2005); V конференции иммунологов Урала (Оренбург, 2006); I Всероссийской молодежной научной конференции «Молодежь и наука на Севере» (Сыктывкар, 2008); Всероссийской научной конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск, 2010); Всероссийской конференции «Иммунология Урала» (Сыктывкар, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 4 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 24 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 281 наименований, в том числе 76 отечественных и 205 зарубежных.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в лаборатории биохимии развития микроорганизмов в соответствии с планом НИР ИЭГМ УрО РАН и является частью исследований по теме «Исследование механизмов регуляции иммунитета, создание механизмов его контроля» (номер госрегистрации темы НИР 01.9.009927); в рамках Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология»; гранта РФФИ № 06-04-49001.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Эксперименты проведены на 628 беспородных мышах-самцах средней массой 20-25г. Животные содержались в условиях лабораторного вивария, двухразовом питании натуральным кормом в количестве, соответствующем суточным нормам, при неограниченном доступе к воде. Эксперименты проведены в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными, отраженными в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985). Выведение из эксперимента мышей проводили путем декапитации под эфирным наркозом. Каждая группа содержала от 9 до 13 животных.

Для экспериментальной модели реакции стресс использовали модели ротационного и иммобилизационного стресса. Ротация мышей производилась в течение 60 мин по 10 мин с перерывами по 5 мин при 78 об/мин, иммобилизация мышей проводилась в течение 6 часов (фиксация в положении на спине). Антагонисты опиатных рецепторов налоксона гидрохлорид в дозе 0,2 мг/кг («Narcan», США) и налтриндола гидрохлорид («ICN», США) в дозе 0,1 мг/кг вводились подкожно за 20 мин до стресса. (Михайлова A.A. и др., 1992; Crook et а/., 1992).

Для моделирования локального иммунного ответа животных иммунизировали эритроцитами барана (108 клеток вводили подкожно в подошвенную поверхность правой стопы). На 4-е сутки вводили разрешающую дозу антигена (108 клеток). На

5-е сутки оценивали выраженность иммунного воспаления при реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) путём регистрации толщины (инженерным микрометром) и массы (на торсионных весах) опытной и контрольной стопы; количество ядросодержащих клеток (ЯСК); интенсивность антителогенсза методом локального гемолиза в геле агарозы (Jerne, Nordin, 1963). Для моделирования системного иммунного ответа животных иммунизировали эритроцитами барана внутрибрюшинно однократно (108). На 5-е сутки оценивали клеточность селезенки, количество антителообразующих клеток в селезенке, титр антиэритроцитарных антител в плазме крови с помощью реакции прямой гемагглютинации.

Одна половина животных получала экспериментальные воздействия перед введением сенсибилизирующей дозы антигена, что соответствовало периоду индукции иммунного ответа, а другая - по той же схеме перед введением разрешающей дозы антигена, что соответствовало эффекторному периоду иммунного ответа. Для оценки пролиферативной активности и секреции цитокинов спленоциты мышей (5х 105/мл) культивировали в среде RPMI - 1640 с добавлением 10% инактивированной фетальной сыворотки, 2 мМ глутамина и 100 мкг/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Пролиферативную активность оценивали по интенсивности включения 3Н-метилтимидина. Радиоактивность проб определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике Guardian (Wallac, Финляндия). Для определения концентрации IL-lß, в супернатантах культур клеток использовали спектрофотометр Униплан (Пикон, Россия) и иммуноферментные тест-системы («Bender Med Systems», Австрия).

Статистический анализ результатов проводили с использованием непарного t-критерия Стьюдента для межгруппового сравнения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние ротационного стресса на иммунный ответ. Роль опиатных рецепторов. Установлено, что ротационный стресс приводил к статистически достоверному увеличению относительного и абсолютного числа

антителобразующих клеток (АОК) в регионарном лимфатическом узле (рисунок 1), увеличению выраженности иммунного воспаления в сравнении с контрольной группой на 5-е сутки иммунного ответа. При стрессе на фоне блокады 5-опиатных рецепторов наблюдалось статистически значимое увеличение числа АОК в лимфатическом узле, как по сравнению с контрольной группой, так и по сравнению с группой животных, подвергнутых одному стрессу, тогда как введение налоксона стимулирующий эффект ротационного стресса на антителогенез отменяло. В условиях блокады опиатных рецепторов как налоксоном, так и налтриндолом усиление выраженности гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) на фоне стресса отменялось. Изолированное введение животным налтриндола или налоксона не влияло на абсолютное и на относительное количество АОК, а также на показатели выраженности ГЗТ и клеточность регионарного лимфатического узла в индуктивный период иммунного ответа.

В эффекторную стадию иммунного ответа ротационный стресс оказывал стимулирующее влияние на абсолютное и относительное количество АОК, выраженность иммунного воспаления в стопе (рисунок 2). Блокада опиатных рецептров 5-антагонистом налтриндолом и неселективным антагонистом налоксоном эффекты ротационного стресса на интенсивность антителогенеза и выраженность реакции ГЗТ не модифицировала. Изолированное введение животным налтриндола или налоксона на абсолютное, относительное количество АОК и на степень иммунного воспаления встопе влияния не оказывало. В эффекторный период иммунного ответа ротационный стресс не влиял на количество ядро содержащих клеток регионарного лимфатического узла.

В условиях системной иммунизации у мышей, подвергнутых ротационному стрессу в период индукции иммунного ответа, наблюдалось статистически значимое усиление интенсивности образования АОК в абсолютном выражении (рисунок 3). На фоне блокады 5-опиатного рецептора стимулирующее действие стресса на абсолютное число АОК не модифицировалось, в то время как налоксон стимулирующее действие стресса на абсолютный антителогенез отменял и

контроль стресс

стресс+налтриндол стресс+налоксон налтриндол налоксон

Б)

контроль стресс

стресс+налтриндол стресс+налоксон налтриндол налоксон

В)

контроль стресс

стресс+иалтриндол стресс+налоксон налтриндол налоксон

I 2 3

^,0АОК/орг

+ *

т

1—1 *

-

ч-

0,5 1 1,5 г ц з ^10АОКУмлн

10 15 20 25 30 35

Рисунок 1 - Влияние ротационного стресса на фоне блокады опиатных рецепторов на абсолютное (А), относительное (Б) число АОК, показатели реакции ГЗТ (В) в индуктивный период иммунного ответа в условиях локальной иммунизации ЭБ. Примечание: * - р<0,05 к контролю; ■ - р<0,05 к стрессу.

и

контроль стресс

стресс+налтриндол стрссс+налоксон налтриндол палоксон

Б)

контроль стресс

стресс+налтриндол стрссс+налоксон налтриндол налоксон

В)

контроль стресс

стресс+налтриндол стресс+налоксон налтриндол налоксон

+ 1

и *

+!

—

1 з 4

510АОК/орг

О 0,5 1 2 2,5 3

^,0АОК/млн

0 5 И 15 20 25 30 35 40

%

Рисунок 2 - Влияние ротационного стресса на фоне блокады опиатных рецепторов на абсолютное (А), относительное (Б) число АОК и показатели реакции ГЗТ (В) в эффекторный период иммунного ответа в условиях локальной иммунизации ЭБ. Примечание: * - р<0,05 к контролю.

показатели данной группы не имели значимых отличий в сравнении с контрольной группой. Относительный показатель количества АОК на фоне ротационного стресса не изменялся. На фоне налтриндола стресс приводил к усилению относительного антителогенеза, на фоне налоксона данный показатель не отличался от такового у животных контрольной группы. При изолированном введении блокаторов опиатных рецепторов количество АОК также не отличалось от показателей контрольной группы. На клеточность селезенки мышей ротационный стресс и антагонисты опиатных рецепторов статистически значимого влияния не оказывали.

Установлено, что ротационный стресс в условиях системной иммунизации приводил к статистически значимому увеличению титра антител к нативным эритроцитам барана в плазме крови (рисунок 3). Стресс на фоне блокаторов, как и блокаторы, сами по себе, не изменяли титр антител в плазме крови.

В эффекторный период иммунного ответа под влиянием ротационного стресса было зафиксировано стастистически достоверное увеличение абсолютного числа АОК (рисунок 4). Данный показатель на фоне блокады опиатных рецепторов не модифицировался. Относительное число АОК статистчески значимо усиливалось только при стрессе на фоне опитных антагонистов. Изолированное введение налоксона и налтриндола значимого эффекта на количество АОК не оказывало.

Клеточность селезенки в эффекторный период иммунного ответа статистически достоверно не изменялась. Установлено, что ротационный стресс в условиях системной иммунизации приводил к статистически значимому увеличению титра антител к нативным эритроцитам барана в плазме крови (рисунок 4). Влияние стресса на фоне блокаторов не отменяло стимулирующего действия стресса, тогда как введение одних блокаторов на титр антител в плазме крови влияния не оказывало.

Влияние иммобилизационного стресса на иммунный ответ. Роль опиатных рецепторов. В условиях локального введения эритроцитов барана у мышей, подвергнутых иммобилизационному стрессу, наблюдалось статистически достоверное уменьшение абсолютного числа антителообразующих клеток в

Б)

В)

контроль стресс

стресс+налтриндол стресс+налоксон налтриндол налоксон

контроль стресс

стресс+налтриндол стресс+налоксон налтриндол налоксон

контроль стресс

стресс+налтриндол стресс+налоксон налтриндол налоксон

2 4

1оя,0АОК/орг

А)

03 I 1,5 2

1о§10АОК/млн

Б)

О 2 4 6 г 10

Уровень антител, \о$2 обратного титра

В)

Рисунок 3 - Влияние ротационного стресса на фоне блокады опиатных рецепторов на абсолютное (А), относительное (Б) число АОК селезенки, титр антител (В) к эритроцитам барана в индуктивный период иммунного ответа в условиях системной иммунизации ЭБ. Примечание: * - р<0,05 к контролю.

А)

контроль стресс

стресс+налтриндол стресс+налоксон налтриндол налоксон

log10AOK^pг

Б)

контроль стресс

стресс+налтриндол стресс+налоксон налтриндол налоксон

^¡„АОК/млн

В) 1-ь—, ;

контроль _ |~| 1 I

стресс _"

стресс+налтриндол _'

стресс+налоксон _>——' '

налтриндол _1--' ;

налоксон _' |'

» з 6

Уровень антител, 1о§2 обратного титра

Рисунок 4 - Влияние ротационного стресса на фоне блокады опиатных рецепторов на абсолютное (А), относительное (Б) число АОК и титр антител (В) к эритроцитам барана в эффекторный период иммунного ответа в условиях системной иммунизации ЭБ. Примечание: * - р<0,05 к контролю.

лимфатическом узле по сравнению с животными контрольной группы. На фоне введения налтриндола наблюдалась отмена угнетающего влияния иммобилизационного стресса, тогда как введение налокеона на фоне иммобилизационного стресса данный показатель не модифицировало (рисунок 5). На относительные показатели антителогенеза, клеточиость регионарного лимфатического узла статистически достоверного влияния стресса и блокады опиатных рецепторов зафиксировано не было. Изолированное введение опиатных антагонистов на относительное и абсолютное количество АОК влияния не оказало.

Иммобилизационный стресс приводил к угнетению выраженности реакции гипсрчувствительности замедленного типа по сравнению с животными контрольной группы (рисунок 5). Введение животным как неселективного антагониста налокеона, так и 5-антагониста налтриндола приводило к отмене стресс-индуцированного угнетения выраженности реакции ГЗТ. Изолированное введение антагонистов опиатных рецепторов на выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа не влияло.

В эффекторный период иммунного ответа иммобилизационный стресс, как на относительные, так и на абсолютные показатели антителогенеза, не влиял. Статистически значимых эффектов блокады опиатных рецепторов на фоне стресса, а также изолированного введения опиатных антагонистов, на абсолютные и относительные показатели количества АОК выявлено не было. На выраженность реакции ГЗТ в данный период иммунного ответа статистически значимого влияния экспериментальных воздействий зафиксировано не было.

В условиях системной иммунизации у мышей, подвергнутых иммобилизационному стрессу, наблюдается статистически значимое угнетение интенсивности антителогенеза как по абсолютным, так и по относительным показателям АОК (рисунок 6). На фоне блокады б-опиатного рецептора угнетающее действие стресса на антителогенез не модифицировалось, в то время как налоксон угнетающее действие стресса на относительное и абсолютное число АОК отменял, и показатели животных 4-й группы статистически значимо не отличались от контроля.

контроль стресс

стресс+налтриндол стресс+налоксон налтриндол налоксон

Б)

контроль стресс стресс+налтриндол стресс+налоксон налтриндол

12 3 4

1о§10АОК/орг

А)

В)

контроль стресс

стресс+налтриндол стресс+налоксон налтриндол

1о§шАОК/млн

Б)

%

В)

Рисунок 5 - Влияние иммобилизационного стресса на фоне блокады опиатных рецепторов на абсолютное (А) и относительное число АОК (Б), показатели реакции ГЗТ (В) в индуктивный период иммунного ответа в условиях локальной иммунизации ЭБ. Примечание: * - р<0,05 к контролю.

Б)

контроль стресс

стресс+налтриндол стресс+налоксон налтриндол налоксон

контроль стресс

стресс+налтриндол стресс+налоксон налтриндол налоксон

12 3 4

1о£10АОК/орг

0,5 1 1,5 2

1о§|0АОК/млн

В)

контроль

стресс

стресс+налтриндол стресс+налоксон налтриндол

налоксон ТГ_;

О 3 < 9

Уровень антител, 1од2 обратного титра

Рисунок б - Влияние иммобшшзационного стресса на фоне блокады опиатных рецепторов на абсолютное (А), относительное (Б) число АОК селезёнки, титр антител к эритроцитам барана в периферической крови мышей (В) в индуктивный период иммунного ответа в условиях системной иммунизации ЭБ.

Примечание: * - р<0,05 к контролю.

Изолированное введение антагонистов опиатных рецепторов, как уже было неоднократно показано выше, какого-либо значимого влияния на динамику количества АОК как по относительным, так и по абсолютным показателям не оказывало.

На клеточность селезенки, динамику титра антител к нативным эритроцитам барана в плазме крови экспериментальных животных иммобилизационный стресс, как и другие экспериментальные воздействия статистически значимо не влияли.

В эффекторный период иммунного ответа в условиях системного введения эритроцитов барана статистически значимого действия 6-часовой иммобилизации на абсолютное и относительное количество АОК, а также на клеточность селезенки не зарегистрировано. Титр антител к нативным эритроцитам барана в плазме крови в условиях иммобилизационного стресса был статистически значимо выше контрольного и нивелировался введением селективного и неселективного опиатных антагонистов (данные не приводятся).

Влияние ротационного и иммобилгоационного стресса на функциональную активность спленоцитов в условиях блокады опиатных рецепторов. Установлено, что у мышей, подвергнутых ротации, увеличивалась спонтанная пролиферативная активность спленоцитов (рисунок 7). Введение налтриндола не отменяло стимулирующего действия ротационного стресса, в то время как введение налоксона (блокада 8, ц-рецепторов) приводило к отмене стресс-индуцированного усиления пролиферативного ответа спленоцитов. Изолированное введение бяокаторов на данный показатель влияния не оказывало. Внесение в культуры В-клеточного митогена липополисахарида (ЛПС) и поликлонального активатора конканавалина А (Кон А) приводило к выраженному усилению захвата 3Н-тимидина спленоцитами по сравнению с нестимулированными культурами. В то же время статистически значимого влияния стресса на пролиферацию зафиксировано не было.

Установлено, что иммобилизационный стресс уменьшал пролиферативную активность спленоцитов как в неактивированных культурах, так и в присутствии

A) -Ш j ; ] j

контроль ;' ¡ :

стресс : 1 : | "Г * I

стресс+налтриндол i i i' ' ll j ' *

стресс+налоксон I "t-1 i

налтриндол ; ■ г1

налоксон ; мГ i i ; i ——t-1-i-i-i-¡-¡

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

имп/мин

Б) -¡-г—^ | i

контроль _' г"

стресс : ' i 1 i ' i

стресс+налтриндол _i ' i I ' i

стресс+налоксон _; 1 • -p

налтриндол _i ' I ; ' i i

налоксон _; ' 1 :

i !-i-i

0 5000 10000 15000 20000

имп/мин

B) i-j

контроль 1 ; ';

стресс _: ' : I ; '

стресс+налтриндол _i i | 'I

стресс+налоксон ' i -';

налтриндол ' ' i

налоксон _' : Г

О 5000 10000 15000 20000

имп/мин

Рисунок 7 - Влияние ротационного стресса на фоне блокады опиатных рецепторов на спонтанную (А), ЛПС - (Б) и Кон А-индуцированную (В) пролиферацию спленоцитов. Примечание: * - р<0,05 к контролю.

ЛПС и Кон А (рисунок 8). Блокада б-рецепторов налтриндолом в спонтанных культурах не отменяла стимулирующего действия стресса, а в культурах с ЛПС и Кон А приводила к снижению интенсивности супрессорного действия стресса па пролиферацию клеток селезёнки. Блокада ц-рецепторов на фоне иммобилизационного стресса приводила к отмене угнетающего действия на спонтанный, ЛПС- и Кон А-стимулированный пролиферативный ответ спленоцитов. Изолированное введение блокаторов статистически значимо не изменяло динамику захвата радиоактивной метки спленоцитами.

Ротационный стресс оказывал выраженный стимулирующий эффект на продукцию (1Ь-1(5) в нестимулированных митогеном культурах (рисунок 9). Данный эффект нивелировался на фоне введения неселективного блокатора опиатных рецепторов налоксона. Изолированное введение налоксона на выработку 1Ь-1р спленоцитами влияния не оказывало. В культурах в присутствии Кон А отмечалось статистически достоверное увеличение продукции 11,-1(3 спленоцитами в группах мышей, которые подвергались действию как ротационного стресса, так и стресса на фоне блокады опиатных рецепторов налоксоном. Изолированное введение налоксона также увеличивало выброс 1ИР стимулированными лектином спленоцитами. В культурах, содержащих ЛПС, не было зарегистрировано влияния ротационного стресса и/или введения неселективного блокатора опиатных рецепторов на секрецию 1Ь-1Р клетками селезенки. У животных, подвергшихся действию иммобилизационного стресса, уровни продукции 1Ь-1р статистически значимо не отличались от контрольных, как в спонтанных, так и в Кон А или ЛПС стимулированных культурах, аналогичная картина наблюдалась при введении неселекивного антагониста налоксона, как на фоне стресса так и изолированно (рисунок 9).

A) ]-;-; ; ;

контроль _j_I'll Г"

стресс _i "Т4 * I

стресс+налтриндол _I "Г * |

стресс+налоксон _i '—у-1

налтриндол _I —I—'

налоксон _ ' ¡' '

--1-i—1-i-i—

О soil 1000 1500 2000

имп/мин

Б) 1-:-—^ :

контроль _j_' ; 1 ;

стресс ' М' *

стресс+налтриндол _' j

стресс+налоксон _; '-—г"

налтриндол _; '— ';

налоксон ; ' I ' ■

о soon юооо isooo

имп/мин

B) ]_:_:_;

контроль _|_| 1~| ' I

стресс _:' ' ' *

стресс+налтриндол _I_I ' '

стресс+налоксон _I_—. ;

налтриндол _I_|_;' —г"

налоксон _|_' Г j

t sm urn isooo 20000 имп/мин

Рисунок 8 - Влияние иммобилизационного стресса на фоне блокады опиатных рецепторов на спонтанную (А), ЛПС- (Б) и Кон А-индуцированную (В) пролиферацию спленоцитов. Примечание: * - р<0,05 к контролю.

А)

контроль стресс стресс+налоксон налоксон

Б)

контроль стресс стресс+налоксон

111 II) Л) Я)

гп7мл

10 211 пг/нл

В)

контроль стресс стресс+налоксон налоксон

Г)

контроль стресс стресс+налоксон

пг/мл

5 I» 15 20 25

пг/мл

Рисунок 9 - Влияние ротационного стресса на фоне блокады опиатных рецепторов на спонтанную (А), Кон А-индуцированную (Б) продукцию IL-ip спленоцитами. Влияние иммобилизационного стресса на фоне блокады опиатных рецепторов на спонтанную (В), Кон А - индуцированную (Г) продукцию IL-lp спленоцитами. Примечание: * - р<0,05 к контролю.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, хотелось бы обратить внимание на существующие различия в направленности иммунорегуляторного действия эндогенных опиоидных пептидов, зависящих от вида стрессорного воздействия, объекта исследования, времени воздействия и концентрации лиганда, типа экспрессируемых опиатных рецепторов. Опиоидные пептиды, в частности, ц-,б-лиганды преимущественно влияют на процессы иммуногенеза в фазу индукции иммунного ответа, и стимуляция преимущественно ц-рецептора является необходимым условием для реализации эффекта. В экспериментальной системе in vivo доказано участие опиатергических механизмов в разнонаправленной регуляции функций иммунокомпетентных клеток при различных вариантах стресса.

ВЫВОДЫ

1. Опиатэргические механизмы имеют разнонаправленное влияние на функции иммунной системы при различных вариантах стресса, что доказано в экспериментальной системе in vivo.

2. Ротационный стресс в условиях локальной и системной иммунизации приводил к усилению показателей гуморального и клеточноопосредованного иммунного ответа в индуктивную и эффекторную фазы; блокада ц-опиатных рецепторов отменяла, а блокада 8-рецепторов потенцировала стимулирующие эффекты ротации на антителогенез в индуктивную фазу иммунного ответа; усиление выраженности реакции гиперчевствительности замедленного типа при ротации отменялось как (I-, так и 6-антагонистами.

3. Иммобилизационный стресс в условиях локальной и системной иммунизации приводил к угнетению показателей гуморального и клеточноопосредованного иммунного ответа в индуктивную фазу; блокада ц-рецепторов нивелировала угнетающие эффекты иммобилизации на антителогенез при системном введении антигена, а блокада 5-рецепторов - при локальном; угнетение выраженности реакции гиперчевствительности замедленного типа при иммобилизации отменялось как ц-, так и 6-антагонистами.

4. Ротационный стресс усиливал спонтанную пролиферативпую активность спленоцитов, блокируемую неселективным антагонистом налоксоном; иммобилизационный стресс, напротив, угнетал как спонтанную, так и митоген-индуцированную пролиферацию спленоцитов; эффект нивелировался налоксоном, а в культурах с митогеном - и 5-антагонистом налтриндолом.

5. Ротационный стресс усиливал спонтанную и конканавалин А стимулированную продукцию IL-lp спленоцитами; в условиях блокады ц-рецепторов спонтанное усиление продукции IL-lfS при ротации нивелировалось; иммобилизационный стресс на продукцию IL-1(3 спленоцитами значимого влияния не оказывал.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные данные по механизмам иммуномодулирующего действия эндогенных опиоидов следует учитывать при использовании препаратов этих групп в терапии аллергических и аутоиммунных состояний, а также состояний, развивающихся в результате экстремальных воздействий.

2. При разработке новых подходов к фармакологической коррекции стресс-индуцированных и посттравматических нарушений функций иммунной системы следует учитывать иммунотропное действие лигандов опиатных рецепторов.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Гейн C.B. Роль блокады различных типов опиатных рецепторов в регуляции иммуномодулирующих эффектов ротационного стресса / C.B. Гейн, И.Л. Шаравьёва, Т.А. Баева, С.П. Тендрякова И Вестн. Уральской медицинской академической науки. - 2005. - № 3. - С. 70-73.

2. Гейн C.B. Роль 5-опиатных рецепторов в регуляции гуморального и клеточноопосредованного иммунного ответа при ротационном стрессе / C.B. Гейн, И.Л. Шаравьёва, С.П. Тендрякова// Докл. Академии наук. - 2006. - Т. 407, № 1. - С. 127-129.

3. Гейн C.B. Эндогенная опиоидная система и гормоны стресса в сочетанной регуляции иммунных реакций при остром стрессе / C.B. Гейн, Т.А. Баева., Е.Г. Чижова, O.A. Кичанова, И. Л. Шаравьёва // Вестн. Уральской медицинской академической науки. - 2006. - № 3-1(14). - С. 3-40.

4. Гейн C.B. Анализ иммунорегуляторных эффектов ротационного и иммобилизационного стресса в условиях блокады опиатных рецепторов / C.B. Гейн, И.Л. Шаравьёва // Вестн. Уральской медицинской академической науки.-2010. -№2/1 (29).-С. 111-112.

Публикации в других сборниках ц журналах

5. Баева Т.А. Роль блокады различных типов опиатных рецепторов в регуляции иммуномодулирующих эффектов ротационного стресса / Т.А. Баева, C.B. Гейн, И.Л. Шаравьёва, С.П. Тендрякова. // Проблемы загрязнения окружающей среды-2005: материалы Межд. конф. -Пермь-Казань-Пермь, 2005. - С. 56.

6. Гейн C.B. Роль 5- и ц-опиатных рецепторов в постстрессорных изменениях некоторых иммунологических параметров при первичном и вторичном иммунном ответе / C.B. Гейн, И.Л. Шаравьёва, Т.А. Баева // Иммунология Урала: материалы V конф. иммунологов Урала. -Оренбург, 2006.-С. 8.

7. Гейн C.B. Роль блокады различных типов опиатных рецепторов в регуляции иммуномодулирующих эффектов ротационного стресса / C.B. Гейн, И.Л. Шаравьёва. // Молодежь и наука на Севере: материалы I Всерос. молод, науч. конф. - Сыктывкар, 2006. - С. 268.

8. Гейн C.B. Влияние ротационного стресса на антителогенез и пролиферативный ответ спленоцитов мыши / C.B. Гейн, И.Л. Шаравьёва. // Дни иммунологии в Сибири: материалы Всерос. науч. конф. - Красноярск, 2010. - С 84-85.

9. Гейн C.B. Сравнительный анализ иммунорегуляторного действия стресса различной степени тяжести в условиях блокады опиатных рецепторов / C.B. Гейн, И.Л. Шаравьёва. // Молекулярная медицина и биобезопасность: материалы VII Междунар. конф., - М„ 2010. - С.51 -52.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЦНС - центральная нервная система; IL-1 р-интерлейкин-lß;

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа;

АОК - антителообразующие клетки;

ЛПС - липополисахарид;

Кон А - конканавалин А;

ЭБ - эритроциты барана.

ШАРАВЬЕВА Ирина Леонидовна

ВЛИЯНИЕ БЛОКАДЫ ц-, 6-ОПИАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ НА ФУНКЦИИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТАХ СТРЕССА

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 10.03.11. Бумага офсетная. Формат 60x30 1/16. Гарнитура «Times New Копип». Печать ризография. Усл. печ. л. 1,75. Тираж 100 экз,

Печатный салон «На Дружбе». 614070, Пермь, ул. Дружбы, 34.