Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунопротективиые свойства бактериальных рибосом и их субьединиц

и б -

. А7 МП в®

1

Министерство здравоохранения и медицинской

промышленности Российской Федерации

(

Кубанская государственная медицинская академия

На правах рукописи Крылов /

Виталий Петрович

Иммунопротективные свойства бактериальных рибосом и их субьединиц

14.00.36 - Аллергология и иммунология 03.00.07 - Микробиология

Автореферат диссертации

I

на соискание учено» степени кандидата медицинских наук

Краснодар, 1996

выполнена в Кубанской государственной медицинской ака-

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.Г.Орлов.

Официальные оппоненты: действительный член Петровской академии наук и искусств, доктор медицинских наук, профессор В.М. Бондаренко доктор медицинских наук, профессор P.A. Ханферян

Ведущая организация: Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова

Защита состоится 996г. в _часов, на заседа

нии диссертационного совета К 084.06.03. в Кубанской государственно! медицинской академии (350063 г.Краснодар, ул.Седина,4).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке акаде

мни.

Работа демин.

Автореферат разослан 1996г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук Н.Г.Соболева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. К числ_у проблем современной вакцинологии относится возникновение неиммунных контингентов в популяции вакцинированного населения (Лямперт И.М., 1983; Покровский В.И., Болотов-ский В.М.. Литвинов С.К.. 1993; Покровский В.И., Литвинов С.К., Болотовский В.М.. 1990; Петров Р.В., Хаитов P.M., 1988; Hinman Alan R., Orenstein Walter A., 1990; Ruiz Contreras J., 1990 и др).

Неиммунные контингенты образуются под воздействием трех механизмов: иммунологического, который обусловлен гетерогенностью популяции по иммунному ответу; технологического, который связан с громоздкой системой прививочного дела, - и социального, в основе которого лежит негативное отношение определенной части населения к вакцинации.

Совершенно очевидно, что наиболее сложной является проблема гетерогенности популяции по иммунному ответу (Петров Р.В., Хаитов P.M., 1988; Медуницын Н.В., 1982; Медуницын Н.В., 1990). Отсюда следует, что развитие вакцинологии исключительно по пути совершенствования существующих технологий вакцинного дела, направленного на устранение остаточной реактогенности современных вакцин (Наркевич М.И. и др., 1990; Girard M., 1992) в целом малоперспективно.

Применяемые практическом здравоохранении современные вакцины являются достаточно эффективными (Ляшенко В.А., Воробьев A.A., 1982; Ляшенко В.А., 1991; Сохин A.A. и др., 1984), однако не следует забывать о том, что эта эффективность достигается за счет многократных ревакцинаций и достаточно часто сопровождается поствакциными осложнениями (Наркевич М.И. и др., 1990). Поэтому приоритетным направлением современной вакцинологии следует считать поиск новых, более эффективных и менее реактогенных иммуногенов (Мертвецов Н.П., 1987; Lüssow A.R. et al., 1990; Robbins А., 1990).

К таковым следует отнести бактериальные рибосомы, иммуногенные свойства которых являются объектом пристального изучения на протяжении последних 30 лет (Youmans A.S., Youraans G.P., 1965; Eisenstein Т.К. ™ et al., 1976; Dussourd d'Hinterland L. et al., 1980; Gregory R.L., 1986; Segal

Е.. 1989: Nicolaeva L.V.. Savel'ev E.P., 1991; Normier G. et al., 1992; Левен-coh В.И.. Хазанова В.В.. 1991 и др.).

Вакцинные препараты на основе бактериальных рибосом имеют ряд преимуществ -перед корпускулярными вакцинами:

1) они не обладают токсичностью и практически не реактогеины;

2) их иммуногенность значительно выше, чем у корпускулярных вакцин:

3) они способны создавать перекрестный иммунитет к различным серотипам возбудителей в пределах вида.

Создание рибосомных вакцин намечает новый путь к получению эффективных средств для специфической профилактики инфекционных болезней. Однако, механизмы иммунной протекции рибосомных вакцин окончательно не расшифрованы, что требует осуществления дополнительных исследований.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось выяснение роли 30S и. 50S субъединиц в обеспечении иммунопротективного эффекта 70S р'иб!осом бактерий, а также разработка рекомендаций по конструированию вакцинных препаратов на основе бактериальных рибосом.

Для достижения поставленной цели требовалось решить перечисленные ниже задачи. Используя две различные экспериментальные модели: стафилококковой и клебсиеллезной генерализованной инфекции,- необходимо было установить:

1) зависимость формирования протективного иммунитета от дозы - рибосом при однократной иммунизации и выбрать оптимальную

иммунопротективную дозу;

2) особенности иммунопротективных свойств бактериальных рибосом из различных субклеточных фракций;

3) различия в иммунопротективных свойствах рибосом, выделенных разными методами;

4) особенности иммунопротективных свойств 30s и 50s субъедини1 рибосом;

5) возможность приготовления-рибосомных аутовакцин и эффективность их применения.

Новизна результатов

Установлена зависимость формирования протективного иммунитета от дозы рибосом S.aureus 209-Р и К.pneumoniae Г-13 при однократной иммунизации/ Проведена комплексная оценка влияния способов выделения рибосом на их иммунопротективные свойства.

Впервые изучены иммунопротективные свойства рибосом К.pneumoniae Г-13 из различных субклеточных фракций, а также иммунопротективные свойства отдельных субъединиц рибосом S.aureus 209-Р и К.pneumoniae Г-13.

Разработаны принципы конструирования вакцинных препаратов на основе бактериальных рибосом, а также предложения по усовершенствованию технологии приготовления аутовакцин.

Впервые проведена рибосомная вакцинотерапия резидентных носителей патогенных стафилококков и показана эффективность этого способа лечения.

Сформулированы гипотеза, консервативных общих антигенов рибосомы и антигенно-амплифайерная гипотеза механизма действия рибосом-ных вакцин.

Научно-практическое значение работы

Полученные сведения о роли 30S и 50S субъединиц в обеспечении иммунопротективного эффекта 70S рибосом бактерий позволят более детально осмыслить природу протективных свойств бактериальных рибосом, а следовательно, создавать более иммуногенные и менее реактогенные вакцины. Это будет способствовать сокращению неиммунных контингентов в вакцинированной популяции.

Применение рибосомных аутовакцин позволит повысить эффективность аутовакцинотерапии и расширить показания для этого способа лечения больных с хроническими гнойно-воспалительными заболеваниями.

Полученные данные могут быть использованы также для лечения и реабилитации больных с различными иммунодефицитными состояниями, прежде всего по системе нейтрофильных гранулоцитов.

Апробация работы Материалы диссертации доложены на:

• I Международном конгрессе по иммунореабилитации (Сочи-Дагомыс, 7-10 июля 1994г.):

• Международной научной конференции студентов и молодых ученых по актуальным проблемам медицины (Бишкек, 19-21 апреля 1994г.);

• научно-практической конференции "Актуальные эколого-гигиенические проблемы Северного Кавказа" (Краснодар, 6 апреля 1995 г.);

• III Международном симпозиуме врачей "Адаптация организма при стрессовых ситуациях" (Геленджик, 11-14 октября 1995г.);

• 55 научной студенческой конференции с участием молодых ученых Кубанского медицинского института им.Красной Армии (Краснодар, 12 мая 1994г.);

• 56 научной конференции студентов и молодых ученых КГМА с международным участием (Краснодар, 18-19 мая 1995г).

Результаты исследования внедрены в лечебную работу Краснодарской краевой клинической больницы им.С.В.Очаповского, краснодарской межвузовской поликлиники, в работу бактериологической лаборатории Краснодарского краевого центра Госсанэпиднадзора, в учебные процессы кафедры микробиологии, иммунологии и вирусологии Кубанской медицинской академии и кафедры генетики и микробиологии Кубанского государственного университета.

По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Структура работы Диссертация изложена на 183 стр., состоит из введения; 2 глав литературного обзора; 7 глав собственных исследований, включая описание методов; заключения, выводов и списка литературы.

Процитировано 230 источников, из них 116 - отечественных и 114 - зарубежных.

Работа иллюстрирована 18 таблицами и 22 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основные экспериментальные подходы, применяемые для решения поставленных задач, заключались в:

■ выделении рибосомных фракций из исследуемых бактерий: Staphylococcus aureus 209-Р и Klebsiella pneumoniae Г-13;

■ разделении фракции 70S рибосом на 30S и 50S субъединцы;

■ получении спектрофотометрических, седиментационных и элек-трофоретических характеристик исследуемого рибосомного материала;

. ■ изучении способности 70S. 50S и 30S рибосом S.aureus 209-Р и К.pneumoniae Г-13 предотвращать развитие гомологичной генерализованной инфекции у мышей при однократном внутрибрю-шинном введении препарата;

■ изучении влияния однократного внутрибрюшинного введения рибосом и их субъединиц на синтез антирибосрмных антител и динамику содержания антителообразующих клеток селезенки к гетерологичному антигену;

■ изучении влияния рибосом и их субъединц in vitro на реакцию бактериального фагоцитоза.

Штаммы

Были использованы 2 стандартных штамма, полученных из ГИСК им. Л.А.Тарасевича:

Klebsiella pneumoniae Г-13 = NCTC 9133 = SS 1470

Staphylococcus aureus 209-Р = АТСС 6538 - Р = NCTC 7447 = FDA

209Р = ССМ 2022 = ВНИИА 209-Р

Рибосомные аутовакцины готовились из 62 штаммов Staphylococcus aureus, выделенных от резидентных бактерионосителей.

Буферные системы

В работе использовались стерильные буферные водные растворы следующего состава:

буфер №1: трис НС1 - 10 мМ, рН=7,4 аммония хлорид - 0.5 М, магния ацетат - 10 мМ, поливинилсульфат - 100 мкг/мл; буфер №2: трис ™ НС1 - 10 мМ, рН=7,4, калия хлорид - 100 мМ, магния ацетат - 10 мМ, поливинилсульфат - 100 мкг/мл; буфер №3: трис НС1 - 10 мМ, рН=7,4,

калия хлорид - 100 мМ, магния ацетат - 1-иМ, поливинилсульфат - 100 мкг/мл; буфер №4: трис НС1 - 10 мМ, рН=7,4, аммония хлорид - 1М, магния ацетат - 10 мМ, поливинилсульфат - 100 мкг/мл; буфер №5: трис HCI - 10 мМ, рН=7,4, калия хлорид - 100 мМ, магния ацетат -10 мМ, по-ливинлсульфат - 1 мг/мл, 2-меркаптоэтанол - 6 мМ, тритон Х-100 - 1% (v/v): буфер №6: буфер №5 без тритона: буфер № 7: трис НС1 - 10 мМ, рН=7,4, калия хлорид - 100 мМ, магния ацетат -10 мМ, поливинлсульфат - 100 мкг/мл, сахароза - 0,44 М, натрия додецилсульфат

- 0,25% (m/v); буфер №8: калия фосфат однозамещенный безводный -1,5 г, натрия фосфат двузамещенный водный - 7,5 г., вода дистиллированная

- до I л, рН = 7,2; буфер №9: натрия хлорид 0,85%, натрия фосфат двузамещенный - 0,85%, рН=7,2; буфер №10: трис НС1 - 0,0625 М, рН=6,8, натрия додецилсульфат (m/v) - 2%, 2-меркаптоэтанол (v/v) 5%, сахароза (m/v) - 20%, бромфеноловый синий (m/v) - 0,05%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение и характеристика препаратов рибосом из клеток Staphylococcus aureus 209-Р и Klebsiella pneumoniae Г-13 для приготовления рибосомных вакцин

Рибосомной следует считать вакцину, в которой содержатся рибосомы с сохраненной структурной организацией.

Для выделения рибосом следует использовать биомассу синхронно растущих клеток экспотенциальной фазы роста культуры. При этом достигается максимальный выход рибосомного материала и его максимальная качественная однородность. На плотных питательных средах невозможно определить фазу роста культуры и синхронизировать ее рост, поэтому примененять биомассу с агаризованнык сред для получения рибосом нецелесообразно.

Протективные свойства препаратов рибосом зависят от способа дезинтеграции клеток. Мы сравнивали рибосомный материал Klebsiella pneumoniae, полученный в ходе баллистической дезинтеграции и лизо-цимного лизиса. Оказалось, что баллистическая дезинтеграция приводит к увеличению иммунопротективного эффекта рибосом на 30% по сравнению с лизоцимным лизисом.

Получение рибосомных фракций как с помощью дифференциального ультрацентрифугирования, так и альтернативными'способами, является тем критическим моментом, который определяет целостность структурной организации рибосомы и сохранность ее естественного антигенного репертуара. На качество конечного продукта влияют: активность рибонук-леаз, температурный режим и компоненты буферных систем, способствующие антигенной деконтаминации рибосомы.

Получение рибосомных вакцин из нуклеазоположительных бактерий представляется сложной проблемой. Залогом получения качественного продукта является использование различных ингибиторов РНКаз. Также представляется перспективным отбор или создание специальных вакцинных штаммов бактерий, обладающих минимальной'экзонуклеазной активностью, или не обладающих таковой вообще. В условиях промышленного производства рибосомных вакцин наличие подобных штаммов должно быть строго обязательным. ;

О целостности рРНК можно судить спектрофотометрически по ха- . ^актеру спектрофотометрической кривой, полученной в результате наблюдения спектров поглощения ультрафиолетовых лучей в диапазоне 312,5-213 нм. Важно получить именно спектрограмму, а не ограничиваться выяснением значения экстинций при 260 и 280нм. С другой стороны, необходимо исследовать состояние рРНК электрофоретическим методом. При электрофорезе интактной 70S рибосомы в 3% ПААГ и последующей обработки геля водным раствором бромида этидия (0,5мкг/мл) в ультрафиолетовом свете визуализуются 2 полосы, соответствующие 23S и 16S РНК. При гидролизе рРНК количество полос увеличивается.

При получении рибосом S.aureus 209-Р и Klebsiella pneumoniae Г-13 мы использовали в качестве ингибиторов РНКаз ПВС (I мг/мл) и ß-меркаптоэтанол (6 мг/мл). Кроме того, все буферные растворы содержали базисную концентрацию ПВС 100мкг/мл.

Важным моментом является строжайшее соблюдение принципов, исключающих присутствие экзогенных РНКаз: стерильная посуда, предметы, реактивы, работа в стерильных резиновых перчатках и т.д.

Температурные условия существенно влияют на активность РНКаз и приводят к деградации рибосомного материала. Все операции с биомассой следует проводить строго на холоду.

Буферные растворы, используемые для выделения рибосом и приготовления рибосомных вакцин не должны содержать хлорид аммония, поскольку последний существенно упрощает антигенный репертуар рибосом. Аналогичную рекомендацию следует дать и в отношении БОЭ, который в

концентрации 0,25% используют практически все конструкторы рибосом/

ных вакцин.

Получаемые нами на изложенных выше основаниях препараты ри- • босом подвергались комплексному тестированию на качество. Тестирование включало в себя:

1. Аналитическое ультрацентрифугирование образцов в буферных системах, содержащих 1,0 мМ

2. Спектрофотометрическое исследование образцов в диапазоне 312,5-213нм.

3. Электрофоретическое исследование рРНК в 3% ПААГ.

4. Электрофоретическое исследование рибосомных белков в линейном 715% ПААТ-БОБ.

Указанные выше критерии мы использовали для проверки качества рибосомного материала, входящего в состав двух препаратов: коммерческой рибосомной вакцины "Рибомунил" и рибосомной фракции, полученной нами по оригинальной методике В.И.Левенсона и др., (1984).

Судя по спектрограмме, методика В.И.Левенсона не позволяет получить интак,тную фракцию рибосом. Главным образом, это связано с включением в состав лизирующего буфера БОБ. Полученные данные позволяют считать, что БОБ, видимо, способствует необратимому повреждению рРНК, которое приводит к полной деградации рибосом. Такой; неожиданный эффект БОБ на РНК требует отдельного детального изучения, однако в любом случае препараты с подобным состоянием рибосомного материала не следует называть рибосомной вакциной. Рибосомные фракции, находящиеся в составе рибомунила, напротив, имеют удовле-

творительные характеристики и отвечают нашим представлениям о рибо-сомных вакцинах.

В собственных экспериментах мы использовали свежевыделенные рибосомы. Однако, при разработке технологии производства рибосомных вакцин важным моментом является изыскание способа сохранения целости ности рибосомного материала на протяжении определенного, достаточно длительного срока. Данный вопрос в настоящее время еще совершенно не исследован. Наиболее стабильные воспроизводимые результаты дает лио-фильное высушивание материала с последующим хранением его при низких (-8-10°С) температурах. Особенно удовлетворительными результаты получаются в тех случаях, когда отсутствует РНКазная активность у рибосом. Но в условиях возможного действия РНКаз лиофилизация не предотвращает процесса деградации рибосом.

Перспективным следует признать использование для стабилизации рибосомных вакцин "сшивающих" агентов: глютарового или формолово-го альдегида.. Нами установлено, что глютаровый альдегид в концентрации 0,05 мг на 1 мг рибосом не влияет на спектрофотометрические характеристики рибосомного материала, тогда как передозировка сшивающего агента влечет за собой деградацию рРНК.

Иммунопротективные свойства рибосом Staphylococcus aureus 209-Р и Klebsiella pneumoniae Г-13 ,

При однократном внутрибрюшинном введении препарата без адъю-ванта эффективная для мышей иммунопротективная доза рибосом как стафилококка, так и клебсиеллы, находится в пределах 10-3-10-5 мкг на одну особь. При этом в случае стафилококковой модели достигается 100% защита, а в случае клебсиеллезной модели уровень протекции не превышает 80%. Напряженность иммунитета сохраняется в течение шести месяцев (срок наблюдения).

Из трех внутриклеточных фракций рибосом: нуклеоидной, гиало-плазменной и мембранной, максимальный вклад в формирование протек-.i.; ции вносят мембраноассоциированные рибосомы. - . -

Защитные свойства рибосом стафилококка и клебсиеллы ассоциированы с ее большой, но не с малой субъединицей.

Очистка рибосом S.aureus и К.pneumoniae троекратным промыванием в буферном растворе, содержащим 1М NH4CI снижает иммунопротек-тивный эффект рибосомной фракции на 10%, но не отменяет его полностью.

• Некоторые иммуногенные эффекты рибосом Staphylococcus aureus 209-Р и Klebsiella pneumoniae Г-13 Изучение динамики образования антирибосомных антител у мышей после однократной внутрибрюшинной иммунизации рибосомными фракциями Staphylococcus aureus 209-Р и Klebsiella pneumoniae Г-13 с помощью двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони позволяет утверждать, что при однократной парентеральной иммунизации малыми дозами рибосом формируется протекция,' не связанная с образованием антител.

. Кроме того, рибосомы 70S золотистого стафилококка и клебсиеллы Фридлендера не влияют на динамику содержания AOK к эритроцитам барана в селезенке белых мышей.

Видовые различия в действии рибосом золотистого стафилококка и клебсиеллы Фридлендера на фагоцитарную активность нейтрофильных гранулоцитов отсутствуют.

Рибосома 70S, а также их большие и, в значительно меньшей мере, малые субъединицы усиливали как поглотительную, так и переваривающую способности нейтрофильных гранулоцитов. В присутствии рибосом (500мкг нА1 мл крови) активировалось через 15 и 120 минут 64 и 88% нейтрофильных гранулоцитов, тогда как в контроле 30% и 65% соответственно.

Максимальное фагоцитарное число наблюдалось при воздействии 70S рибосом, что в 1,33-2,10 раза больше контрольного показателя.

Фагоцитарный индекс и индекс переваривания нейтрофилов возрастал в 2,8 раза под воздействием 70S и 50S рибосом, но не их малых субъединиц. -

По данным НВТ-теста рибосомы значительно усиливают кислородза-висимые механизмы переваривающей активности нейтрофильных грану-лоцитов. В среднем опытные показатели превышают контроль на 32,5±11%. При этом действие больших субъединиц рибосом на 10,7±2,3D'o выше по сравнению с действием 70S частиц.

Влияние малых субъединиц рибосом на процесс восстановления НВТ резко отличается от эффекта 70S и 50S частиц. Так в спонтанном НВТ-тесте наблюдается некоторое угнетение (на 4,65±1.15%) процесса восстановления НВТ по сравнению с контролем. Однако стимуляция нейтрофильных гранулоцитов в присутствии 30S рибосом приводит к резкому возрастанию количества формазанпозитивных нейтрофилов до 98,5±1%. Это на 32,05+1,3% выше соответствующих показателей с 70S и 50S рибосомами и в 2,2 раза выше контрольных цифр.

Парадоксальный эффект 30S рибосом в НВТ-тесте позволяет утверждать, что их супрессивное воздействие на нейтрофилы связано скорее всего с блокированием поглотительной, но не переваривающей функции последних. Поскольку в условиях стимуляции нейтрофильных гранулоци-тов в присутствии 30S рибосом наблюдается резкое усиление образования активных радикалов кислорода, постольку можно предполагать, что 30S рибосомная субъеднница связывается с уникальным рецептором на поверхности нейтрофильных гранулоцитов, который ответственен за выключение акта поглощения и одновременную инициацию окислительного взрыва в нейтрофиле.

Большая субъединица, а также рибосома 70S действует иначе, инициируя поглотительную функцию полиморфноядерных лейкоцитов.

Рибосомные аутовакцины и эффективность рибосомной аутовакцинотерапии Были использованы два типа препаратов: 70S- и 50S рибосомы ау-тоштаммов, приготовленные по оригинальной технологии. Эффективность рибосомной аутовакцинотерапии сравнивали с действием стафилококкового лечебного бактериофага. Носители (124 человека) были разделены на 4 группы по 31 человеку в каждой. Две группы пациентов

получали рибосомную терапию, третья группа служила положительным, а четвертая - отрицательным контролем.

Аутовакцины и бактериофаг вводили во всех случаях однократно. Рибосомный материал - интраназально, а лечебный бактериофаг в количестве 20 мл - следующим образом: по-1 мл интраназально в каждый носовой ход, остальными 18 мл в течение 30-40 сек производилось самоорошение ротоглотки, после чего препарат проглатывался. Введению препаратов предшествовала обработка рото- и носоглотки 1% раствором NaHCOj.

Контрольные бакисследования, проведенные спустя 7-14 дней от момента введения препаратов, обнаружили четкий санирующий эффект. Фаготерапия была результативной в 64,5%, а рибосомная аутовакциноте-рапия - в 77% случаев.

При исследовании фагоцитарной активности нейтрофильных грану-лоцитов резидентных носителей установлено, что аутовакцинотерапия рибосомами способствует сенсибилизации ПМЯ-лейкоцитов и повышению их фоновой активности. Повторный контакт таких лейкоцитов с рибосомами 70S уже через 15 минут приводит к достижению ими максимальной активности. Нейтрофильные гранулоциты неиммунных носителей достигали аналогичного уровня только через 120 минут инкубации с рибосомами 70S.

Выявленный нами хороший санирующий эффект рибосомных ауто-вакцин был достигнут даже при однократном интраназальном введении этих препаратов. Но эти данные отражают только ближайшие результаты санации. Окончательный вывод возможен на основе изучения отдаленных результатов вакцинации с учетом оптимальной дозы, способа и кратности . введения вакцины.

Вероятные механизмы иммунопротективного эффекта бактериальных рибосом

Имеются многочисленные доказательства иммунологической природы протективного эффекта бактериальных рибосом. Их основными клеточными.мишенями являются нейтрофильные гранулоциты и макрофаги, а также, возможно, NK-клетки и Т-хелперы. Гуморальные иммунологиче-

ские реакции под воздействием бактериальных рибосом практически не развиваются. Основная роль в индукции иммунопротективного эффекта рибосом принадлежит 505-субчастицам.

Рибосомной РНК отводится роль адъюванта (Белкин З.П. и др., 1991), что может быть обусловлено индукцией эндогенного интерферона (Rober D. et al., 1979). Это обстоятельство объясняет противовирусную' активность рибосомных .вакцин (Popa L. et al., 1989; Fumarova D. et al., 1979). Мы обнаружили, что большая и малая субъединицы рибосом'дейст-вуют на нейтрофильные гранулоциты неодинаково. Если бы активация нейтрофилов была связана с действием рРНК самой по себе, то эффект действия большой и малой субъединицы был бы аналогичным. Однако мы наблюдали обратное. Вряд ли это зависит от структурных различий I6S-и 23S рРНК. Скорее всего, активация нейтрофильных гранулоцитов связана со специфическим лиганд-рецепторным взаимодействием, которое возможно только между 50S, но не 30S субчастицами рибосом. Отсюда понятно, что "чувствительные к РНКазам" рибосомные вакцины инакти-вирываются под воздействием РНКаз не в связи с разрушением рРНК как протективного фактора, а из-за нарушения конформации рибосомы, которое приводит к экранированию истинного протективного антигена.

Очищенные хлоридом аммония интактные рибосомы являются им-мунологически активными и способны индуцировать защиту от соответствующей инфекции. Контаминация рибосом посторонними антигенами при получении препаратов, несомненно, присутствует. Роль контаминации резко возрастает, если рибосомы конформационно повреждены. При этом протективные свойства таких препаратов напрямую зависят от степени контаминации посторонними антигенами.

В структуре 505-субчастиц имеются ассоциированные с большой субъединицей белки, обладающие антигенным сродством к определенным мембранным белкам. Обнаружение указанных белков стало возможным при использовании буферных растворов, не содержащих хлорид аммония. Белкам, ассоциированным с рибосомами, принадлежит существенная роль в удержании последних на поверхности мембраны в процессе секреции вновь синтезирующихся полипептидных цепей (Орлов В.Г., 1992). Мы ус-

тановили, что процесс троекратного отмывания рибосомной фракции буферным раствором с 1М NH-iCI, который способствует удалению белков, ассоциированных с рибосомами, приводит к снижению протективных свойств данной рибосомной фракции на 10%. При изучении особенностей иммунопротективных свойств рибосом из различных субклеточных фракций мы обнаружили, что максимальный уровень протекции обусловлен мембраносвязанными рибосомами. Последние в отличие от рибосом гиа-

лоплазменной и нуклеоидной фракции содержат в своем составе ассоции-

! . ■

рованные белки (Орлов В.Г.,1992). Эти факты позволили нам ' предположить, что иммунопротективный эффект рибосомных вакцин обусловлен естественным наличием в структуре бактериальных рибосом особых антигенов, достаточно консервативных и обеспечивающих за счет этого не только протекцию в пределах вида, но и иммунитет расширенной специфичности.' Роль подобных антигенов могут выполнять белки, ассоциированные с'бОБ-субъединицами рибосом и иммунологически родственные тем мембранным белкам, которые принадлежат семейству Sec-белков.

Подтверждением этому является обнаружение общего белка энтеро-бактерий в составе соответствующих рибосом (Acker G. et al., 1986).

Гипотеза консервативных рибосомных антигенов может объяснить только причины расширения специфичности иммунного ответа, но не раскрывает механизма протективного эффекта рибосомных вакцин в целом.

1' с ■ \

Для понимания общего механизма действия рибосомных вакцин необходимо принять во внимание следующие факты:

1. Протекция обусловлена большими 508-субъединицами рибосом.

2. Непосредственной мишенью SOS-рибосом являются нейтрофиль-ные гранулоциты и макрофаги.

3. SOS-рибосомы активизируют поглотительную функцию нейтро-фильных гранулоцитов и, в меньшей степени, их переваривающую способность.

4. Рибосомы способны индуцировать выработку эндогенного интерферона (Robert D. et al., 1979; Рора L.M. et al., 1989).

5. Рибосомы индуцируют выработку интерлейкина-1 (Белкин З.П. и др., 1991).

6. Рибосомы индуцируют выработку комплемента (Гаврилов А.Ф. и др.. 1985).

Тот факт, что в наших экспериментах in vitro рибосомы золотистого стафилококка и клебсиеллы Фридлендера одинаковым образом активировали реакцию бактериального фагоцитоза, позволяет утверждать: усиление фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов и активности макрофагов носит общий (неспецифический) .характер. В этом проявляется амплифайерная функция рибосом. Следствием активации нейтрофилов и макрофагов является повышение уровня а-, у-интерферонов, комплемента и интерлейкина-1 в организме.

Другим важным моментом является наше предположение о том, что любой антиген, присутствующий на рибосоме, представляется иммунной системе как Т-зависимый. Видимо, именно с этим связана высокая имму-ногенность бактериальных рибосом.

Таким образом, складывается представление об антигенно-амплифайерном механизме действия рибосомных вакцин, где 50S субчастицы рибосом одновременно участвуют в трех процессах:

1) активируют нейтрофильные гранулоциты, усиливая их поглотительную функцию и выработку а-интерферона;

2) активируют макрофаги, усиливая их поглотительную функцию, выработку a-интерферона, комплемента и интерлейкина-1;

3) взаимодействуют с макрофагами, презентирующими Т-зависимые антигены, предлагая их вниманию свой антигенный репертуар.

За счет параллельного развития трех указанных процессов происходит формирование как быстрой защиты (тахифилаксия), так и долгосрочного иммунного ответа на представленные антигены.

выводы

1. В основе процесса приготовления рибосамных вакцин должен лежать принцип интактности рибосомы. Для контроля качества рибосомного материала необходимо использовать следующие подходы: 1) аналитическое ультрацентрифугирование образцов в буферах с 1,0 мМ Mg ^ 2) спектрометрическое исследование образцов в диапазоне 312,5-213 нм; 3) электрофоретическое исследование рРНК в 3% ПААГ; 4) электрофоре-тическое исследование рибосомных белков в линейном 7-15% ПААГ -SDS.

2. При однократном внутрибрюшинном введении препаратов без адъю-ванта, эффективная для мышей иммунопротективная доза рибосом как Staphylococcus aureus 209-Р, так и Klebsiella pneumoniae Г-13, находится . в пределах 10 -J - 10 5 мкг на одну особь. В случае стафилококковой мо-, дели достигается 100% защита, а в случае клебсиеллезной модели уровень протекции не превышает 80%. Напряженность иммунитета сохраняется в течение 6 месяцев (срок наблюдения).

3. Очистка рибосом S.aureus 209-Р и К.pneumoniae Г-13 троекратным промыванием в буфере, содержащем 1М NHjCI снижает иммунопротек-тивный эффект рибосомной фракции на 10%, но не отменяет его полностью.

4. Иммунопротективные свойства 70S рибосом S.aureus 209-Р и К.pneumoniae Г-13 ассоциированы с их большой 50S, но не с малой 30S

субъединицей.

5. Из трех внутриклеточных фракций рибосом К.pneumoniae Г-13: нук-леоидной, гиалоплазменной и мембранной, - максимальный вклад в формирование протекции вносят мембраноассоциированные рибосомы.

6. Протекция, возникающая при введении эффективной иммунопротектив-ной дозы рибосом S.aureus 209-Р или К.pneumoniae Г-13 без адъюванта • мышам, не связана с продукцией сывороточных антител к рибосомному материалу й не влияет на динамику содержания АОК к гетерологичному антигену (эритроцитам барана) в селезенке белых мышей.

7. Видовые различия в действии рибосом S.aureus 209-Р и К.pneumoniae Г-13 на реакцию бактериального фагоцитоза отсутствуют. Рибосомы 70S,

а также их большие 50S субъединицы активируют реакцию бактериального фагоцитоза за счет усиления поглотительной функции нейтрофи-лов. Рибосомы 30S блокируют поглотительную функцию нейтрофильных гранулоцитов, но резко усиливают кислородзависимые механизмы их переваривающей способности по данным НВТ-теста.

8. Рибосомные стафилококковые аутовакцины при однократном интрана-зальном введении резидентным носителям патогенных стафилококков в 77,4% случаев оказывают санирующий эффект, который сопровождается увеличением фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов носителей.

РАБОТЫ АВТОРА, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Крылов В.П., Качанова O.A. Особенности иммунопротективных свойств рибосом из различных. субклеточных фракций у клебсиеллы Фридлендера // Материалы 57 научной конференции студентов и молодых ученых. - Краснодар, 1996. - Часть 2. - С.8-9.

2.Крылов В.П., Орлов В.Г. Влияние бактериальных рибосом на фагоцитарную активность нейтрофильных гранулоцитов // Int.Jörn.of Im-munorehabil.- 1996,-№2.-р. 174.

3.Крылов В.П., Лишенко H.H., Орлов В.Г. Рибосомы как иммуно-генный компонент стафилококковой вакцины (аутовакцины) // Актуальные эколого-гигиенические проблемы Северного Кавказа.-Краснодар, 1995,-С.136-137.

4.Крылов В.П., Орлов В.Г., Щербина Л.И. Эффективность применения некоторых биопрепаратов для специфической санации носителей патогенных стафилококков. // Адаптация организма при стрессовых ситуациях. - Тез.докл.III Междун. симп. врачей.- Анапа, 1995,- С.191-193.

5.Крылов В.П., Славов С.А. Альтернативный способ эпидемиологического типирования патогенных стафилококков //Материалы 56 конфе-

ренции'СНО с участием молодых ученых, посвященной 75-летию Кубанской государственной мед.академии. - Краснодар, 1995,- С.168-169.

6.Крылов В.П. Сравнение иммунопротективных свойств различных антигенных комплексов- золотистого стафилококка. //Материалы международной конференции студентов и молодых ученых по актуальным вопросам медицины,- Бишкек. 1994.- С.70-71.

7.Крылов В.П. Анализ зависимости ммунопротективного эффекта от дозы рибосом клебсиеллы Фридлендера. // Материалы 55-й науч. студ. конф. с участием молодых ученых.- Краснодар, 1994.- С.84-85.

8.Крылов В.П. Бактериальные рибосомы как эффективные иммуно-гены. //Тезисы докл.54-й науч.студ.конф.-Краснодар, 1993.- С.39.

9.Орлов В.Г., Лищенко Н.Н., Крылов В.П. Рибосомные вакцины -новая тенденция в современной вакцинологии. //Куб. науч. мед. вестн. -1995,- №5-6.- С.71-73.

lO.Krilov V.P., Lischenko N.N. Autovaccinotherapy as immunorehabilitation metod //Int.Jorn.of Immunorehabil.- 1994.- №1,- Suppl.- p.190-191.

ll.Orlov V.G., Krylov V.P. Pathogenic staphylococci carriers immunotherapy with ribosoms preparations obtained from auto-strains. //Eur.J.Allergy a.Clin.Immunol.- 1995.- V.50.- №26.- p.404. Suppl.Abstracts XVI European congress of Allergology and Clinical Immunology, Madrid, Spain, 25-30 June 1995.

12,Orlov V.G., Krilov V.P. Some méthodologie principles of immuno-protective and immunomodulating features of bacterial ribosomes. //Intern.J.Immunorehabilitation.-'1994.- V.I.- p.261-262.