Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуномодулирующие свойства полимеров межклеточного матрикса

¡> 1 I 'I '.. '

^ : -

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

ЗЛАТЕВА Дарена Стойкова

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ

СВОЙСТВА ПОЛИМЕРОВ МЕЖКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА

14.00.36 — Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 1991

Работа выполнена в Институте иммунологии Минздрава СССР

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор медицинских наук, профессор Р. М. Хаитов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских паук, профессор Л. П. Алексеев доктор медицинских наук А. А. Иванов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Второй Московский ордена Ленина государственный медицинский институт им. Н. И. Пирогова

заседании специализированного совета Д 074.09.01 при Институте иммунологии Минздрава СССР по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе 24/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии Минздрава СССР.

Автореферат разослан « » 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор биологических наук А. В. Колобов

Защита состоится

на

. f

....... ¡i

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ.

Актуальность проблемы.в последние годы большое внимание исследователи уделяют изучению влияния межклеточного матрикса на различные процессы в клетках.Было обнарунено, что полимеры межклеточного матрикса играют важную роль в регуляции метаболизма, а также в пролиферации и дифферениировке клеток. Однако при моделировании различных этапов иммунного ответа в системе ¿и. vitro из рассмотрения исследователей долгое время выпадал тот факт, что в организме иммунные реакции развертываются в окрухении межклеточного (экстраиеллюларно-го) матрикса.Он состоит из трех компонентов : коллагена, про-теогликанов и гликопротеидов. Основным его компонентом являются протеогликаны, содержание, сульфатированные молекулы глюкозаминогликанов: хондроитин-сульфат СХС), гепаран-сульфат (ГС), кератан-сульфат, гепарин и гиалуроновую кислоту. Многочисленными работами было показано (Петров Р.В., Хаитов P.M. 1981; Laura L.S, Pe£div(<»ivR. 1986), что искусственные полиэлектролиты (ПЭ), введенные в организм, влияют на разные стадии иммунного ответа.Вполне закономерно было предположить, что и эндогенные полиэлектролиты межклеточного матрикса также могут модифицировать реакции иммунокомпетентных клеток.В пользу такого предположения свидетельствуют также сообщения об активном влиянии полиионов матрикса на метаболизм, пролифераиию и дифферениировку нелимфоидных клеток (Levitt D. et ai Иоъссе J.K.Üaw» M. <<3W ) .Отправной

точкой наших исследований могли служить работы под руководством Р.В.Петрова и Р.М.Хаитова , по изучению иммуномоду-лирующих свойств водорастворимых ПЭ.

В качестве системы для определения механизма действия и основных клеточных эффектов ПЭ, была Еыбрана суспензия клеток селезенки мьшей и некоторые Оыстропролиферируюние линии клеток лимфом человека.

Остаются невыясненными молекулярные механизмы влияния ПЭ матрикса на плазматическую мембрану.Неизвестно, каким образом эти процессы елияют на синтез новых ПЭ в ходе иммунного отЕета.Эти проблемы затрагивают ключевые моменты ак-ваиии лимфоцитов (Ли) и их рекение поможет ответить на вопсос,

что обеспечивает иммуностимулирующую активность естесгьеных По матрикса.

Цель и задачи исследования.Целью работы было изучение иммуномодулирующего действия ПЭ межклеточного матрикса на ликфоидные клетки и на процессы взаимодействия между ними. Задачи исследовании.

I.Изучить влияние ПЭ межклеточного матрикса на самые ранние процессы активаиии лимфоцитов (синтез РНК , синтез ДЧК, экспрессия реиепторов для интерлейкина-2 СИд-2).

2.Определить интерлейкиногенные свойства ПЭ межклеточного матрикса.

3.Изучить влияние ПЭ на процессы дифферениировки лимфо-идньгх клеток (индукиия антителосекретирующих клеток, синтез иммуноглобулинов и ар).

4.Определить влияние ПЭ межклеточного матрикса на пролиферацию некоторых Оыстропролиферирующих лимфомных человеческих линий.

Научная новизна результатов исследования.

Впервые • проведено систематическое изучение ре-гуляторного действия полиэлектролитов межклеточного матрикса на клетки иммунной системы.Выявлена естественная регуляторная роль молекул клеточного микроокрунения и доказано, что микроокружение не является только инертным наполнителем межклеточных пространств, а выполняет функцию активного регулятора жизнедеятельности клеток помещенных в него.

Впервые показано отличие естественных полиэлектролитов матрикса от обычных ионофоров и каналогенов, обеспечивающих перенос ионов путем взаимодействия непосредственно с липидами клеточной мембраны.Показано также и их отличие от действия В- и Т-клеточных митогенов -ЛПС и Кон А как на пролиферацию., так и на дифферениировку лимфоидных клеток.

Впервые доказано, что, не обладая собственой митогенной активностью , ' полиэлектролиты матрикса могут слукоть усилителями других эффекторов.В ч'ае'ГНОсти, вместе с суОоптимальными дозами митогена или совестно с? активаторами протеинкиназы С , полианионы матрикса могут йнвуиирошть бь:ход покоящихся лимфоцитов в G¿ фазу клеточного иикла

и экспрессию рецепторы к Ил-2..

Остановлено, что кроме участия в активаакл клбтсчгьГ делений ПЭ могут служить активаторами б дифферекиирогне Б-клеток сами по себе, так и в качестве ко-фактоооЕ совместно с активаторами протеинкиназы С и Ил-2. При этом гликопротеиды мембраны лимфоиитоЕ , служащие рецепторами для некоторых ¡.'/тогенов и самих иммуноглобулинов, остаются неповрежденными и доступными после воздействия ПЭ матрикса.

Доказано тормозящее влияние ПЭ на пролиферацию быстро-пролиферирующих линий человеческих клеток, что открывает возможностть поиска препаратов для подавления роста Властных клеток на основе естественых межклеточных ПЭ.

Практическая значимость работы.

Новые научные факты, представленные в диссертации, дополняют современные знания о тонких механизмах активации иммунитета естественными компонентами межклеточного катрикса (полианионы: хондроитин С (ХС), гепаран-сульфат (ГС), гепарин и дерматан-сульфат (ДО и показывают их идентичность во многих аспектах о синтетическим полиэлектролитом декстран-сулъфат. Исследование важных для физиологии клетки процессов после воздействия полиэлектролитами доказывает не только безвредность полиэлектролитов матрикса для клеток иммунной системы, но и их адъювантное влияние на многие клеточные процессы. Их воздействие на развитие Оластных клеток позволяет сделать вывод, что они являются активными регуляторами жизнедеятельности клеток.В связи с этим методические подходы, примененные в данной работе, могут быть использованы при изучении молекулярной фармакологии препарате? с иитотоксическим действием.

Публикация результатов исследовании и апробация счбсть:. По теме диссертаций опубликовано £ работ.Основное результаты доложены на международных конфеоенииях болгарски) ученых ( Москва 1959, 1990 и Пловпие, 1990

Объем и структура работи.Работа написана по оСгепричят'ч.'у плану , состоит из введения, обзора литеоатугь:, материале? и методов, результатов исследовании«, обсуждения с-ззулОтатс V. выводов.Список литературы включает 120 источников. «их'ЗС зарубежных авторов.Работа изложена на 92 сгп. вагнноп/т-т::

-? с;-;

t

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Е работе были исспользованннк лимфоциты селезенок мьшей (СЗАхС57 El)F4 , полученных из питомника "Столбовая "АМН СССР. Селезенки выделяли в асептических условиях , суспензии готовили по обсепринятым методикам.Для удаления эритроцитов и мертвых ядросодеряас/х клеток спленоииты подвергали кратковременно; (10 сек.) экспозиции в среде с низкой ионной силой, а затем фильтрировали сквозь стерильную хлопковую вату.

Культивирование осуществляли б полной среде RPMI- 1640 (Piow ЬоЛога.{.) и инкубировали в лунках специальной микропанели (rt&w при SV^C в атмосфере увлажненного воздуха с 5% С0А .

Результат перехода клеток в Q^ фазу исследовали по активации синтеза РНК.Оиенку скорости синтеза РНК проводили радиоиндикаторным методом по интенсивности включения ^Н- уридина и -*Н-тимидина, соответственно, для активации синтеза ДНК.Анализ радш активности осажденного на фильтрах (Hofwiltr Köiv ) материала проводили на ß - сиинтилляционном счетчике Marc III .

Е работе были исследованы 5 полианионов, являющихся нормальными компонентами межклеточного матрикса разных тканей: Хондроитнн-сульфат тип А, натриевая соль(Х-4-С) с м.м.25 кД (Stikxi^akiu Мо^о )Дондроитин-сульфат тип В (ß- гепарин , дерматан-сульфат), Хондроитин-сульфат тип С, натриевая соль O'.-6-C)(Se-iкхи^оЛм ¡¿Ocfto) , Гепаран- сульфат, натриевая соль и гепарин, натриевая соль (Server) 166 ООО Ш/^.Кроме того, был исспользован синтетический полианион декстран сульфат (ДС) с ы.м. более 500 кД (PhosvvuuÄO,). Для исследования дифференшровки В-лимфоиитов исспользовали флуооесиентную микроскопию.Лимфоциты селезенок мышей ( СБА у С57 3L) Ру наносили на предметные стекла , обработанные 0.4л ратворок'. формвара (Pkixvm&ÜQ,, Швеция) в дихлорэтане, фиксировали формальдегидом в концентрации 3.5 % р-ра в течение 30 мин. В конце наносили каплю антииммуноглобулиновой сыворотки (rafebi-t ам.Ы mcwve), меченой флуоресиеин-изотиошанаток.В качестве положительного контроля служила мышиная гибридомная линия, продуцирующая иммуноглобулины.

Меченые клетки анализировали на фотомикроскопе OPTOW е

режиме фазового контраста и в режиме ультрафиолетовой флуоресценции при увеличении хЮОО.'Использовали среду Версена и 0.02 % ЭДА.В части опытов в мембране клеток делали "дырки" ацетоном.

Для исследования клеток на цитофлуориметре Ерil« к клеткам добавляли этидиум бромид с м.м. 394 в дозе 50 мг/мл., 0Л% цитрат натрия и O.Ï% TRITOVX-IOO и считали количество ядер в разных фазах клеточного цикла - &0/Gi, 5 и б^/М в спектре красной флуоресценции.

Для исследования клеток на апарате bRVCiBZк клеткам добавляли РЬ5с р 8.0 и 0.03% TRI ТО W Х-100 для приготовления агарозной подложки.Агарозу (тип I ¿0WEEÛ) готовили'на дисти-лированной воде в концентрации 3.3% и добавляли 40 мл. полной среды ZPMI-1640 до концентрации агарозной подложки 0.6% с добавлением ПЭ 80 мкг/мл.

Использовали клетки линий Uvafcet (2-5.10*) и К-562 (хронического миелоидного лейкоза"!, обладающих способностью муль-типотентного развития в эритроиитг>~, гранулоиито- и миелоии-тоидные недифференцированные клет<и.

Статистическая обработка результатов проведенр для установления границ приемлемости данных с использованием параметрического критерия Стьюдента.Был выбран доверительный уровень 90% (i 24).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Воздействие полиэлектролитов межклеточного матрикса на

ранние активаиионные процессы в мышиных селезеночных

клетках

В качестве тест-системы были выбраны мышиные селезеночные клетки, содержащие относительно одинаковые количество Т-и В-лимфоиитов.Активно действующая доза ПЭ состовляла 10 мкг/мл . (рис.1.)Эта доза сушествено не отличалась от дозы митогенов и была ниже доз.использованых на других клеточных субстратах . Последующее увеличение концентрации ПЭ в культурах приводило к установлении предельного их значения и постепенного снижения пролиферации.

;ю*ю

5

\ <0 400

В

400

10*10"

15

(О

|

-Й-Й Гй

Рис. 2.

:Уи.гк*4 £ I 5 __

Рис.4 .-Влияние-полианиоиов -матрикса-на-синтез-ДНК". Дсзсвая зависимость. А-48 ч.культивирования, Б-<:4ч. По оси абсцисс - дезы ПЭ. о Пс оси ординат - интенсивность включения °Н-тиыидина. 4. -ХС', О -НС,----ДС .

рис.2. .Влияние разных ПЭ на X 562 и клетки

Пс оси ординат-интекси.Еность включения* Н-тииидина(имп/мин)

I.ДС, 2.К, З.ХС, чао. куаЬТмвиРовм<и* .

АОу

Я

А

3 2

I

О

хю-

а

И)

нЁНр1

ю»

1с.Ъ .Активаиия синтеза РНК в культурах лимфоцитов из се-¡зенки мыши с помощью ПЭ и §МА.

) оси ординат-интенсивность включения *Н-уридина в РНК

1 мп-/мин.) а- клетки активировали:хондроитин-сулы$атом (4), (2), гепарином (3) и ДС (4) в сравнении с неактивирован-ми культурами (к1); б-клетки, активированные ВДА или ПЭ 'вместно с ФМА.Результаты сравнены с клетками (к!), активи-ванными ФМА и Са ионофором&23187.

Специальное внимание было уделено анализу вероятного существования различий в действии разных видов ПЭ, поскольку известно, что мембранотропные свойства водорастворимых ПЭ критически зависят от степени полимеризации их молекул.

Для сравнения действия естественных и синтетических ПЭ, мы исследовали синтетический ПЭ декстран-сульфат (рис.1,2).ПЭ демонстрировали идентичное действие.Они либо вызывали увели-ние, либо уменьшение пролиферации.Это относится и к их совместному действию с активаторами протеинкиназы С, с ионофорами, и с Ил-2.Аналогично они действовали и на субстратах человеческих быстропролиферирующих клетках линии ЗиЛоЛ и К 562 (рис.2).

По степени проявления эффекта были выявлении некоторые различия.ПЭ можно было объединить в 2 группы с более сильным и более слабым эффектом.К первой группе относился синтетический ПЭ дс,гепарин, ГС и в некоторых случаях ХС(В), ко второй группе ХС(а)и ХС(С).

Результаты перехода клеток от состояния покоя &0 в Ох^ фазу исследовали по активации синтеза РНК.Опенку скорости синтеза РНК проводили радиоиндикаторным методом.Аналогично по активации синтеза ДНК исследовали переход клеток в б фазу.

Внесение ПЭ в культуру лимфоидных клеток незначительно активировало синтезы РНК и ДНК в этих клетках.Этот факт не противоречит литературным данным, о том, что ДС считается слабым митогеном и без дополнительных эффектороЕ его действие раЕно двух-, трехкратной стимуляции пролиферативного ответа.

Установлено, что Т1Э существенно активируют синтез РНК при их совместном использовании с активатором протеинкиназы С форболмиристатаиетатом (ФМА).Если в культуральную среду вносили какой-либо из полианионов матрикса вместе с ФМА , то интенсивность включения Н уридина в РНК возрастала в 8-9 раз по сравнению с неактивированными клетками, (ряс 3).В этом случае синтез ДНК не еыявлялся.В качестве контроля использовали более полный комплекс активаторов трансмембранной передачи -ЬКА и ионофор А23187.Тройная комбинация увеличивает пролиферацию клеток более чем в 10 раз.Т1о сравнению с ними ПЭ, е.спггьзованный вместо ионофора, обладал е 2 раза меньшей активкогтясчВоздействия на синтез РНК не было зарегистрировано. Такик о£газок коенс заключить, что под воздействием ПЭ

16 12.

8

ШР1

Ш>

гь

4о

А

Рис.4 .Активация синтеза ДНК в культурах лимфоцитов,обработанных ПЭ, ФМА и Ил-2.По осям ординат-интенсивность включения^Н-тимиди-на в ДНК клеток,стимулированных1.ПЭ(а), ПЭ и $МА(<5) или ПЭ, 5МА и Ил-2(с).к?-интактные клетки, к2-клетки, активированные «А, кЗ-клеткк активированные ФКА и Ил-2.

10 16 а

«ю*

¿о а

I I з 4

4

1

4 19 4

.. ' Г

Рис.5".Иитексяе^сть синтеза ДНК в клетках , активированных ПЭ. По осям ординат- интенсивность рклииечия ¿Н-тимидина. а- результаты в культурах ликфоиитов е^леченки мыши, активированных: 1-ХС, 2-ГС, З-Геаарином. 4-ДС & сравнении с неактивиро-ванмыми интакгныни клегками-к1; б-результата адъх?вантного влияния на клетки активированные су0оптимальной дозой Кон А (0,05 мкг/мя1. в сравнении с клетками» активированиями только Кон А-к2.

ио»

1.10»

А

л

22:

С

ъ>

1 1 Ь 456?

Рис.б.Полиэлектролиты матрикса- конкурентное действие. По оси ординат- интенсивность включения *Н-тимидина. 1.ХС, 2.гепарин, З.ЛС, 4.2ЛС, 5.гепарин и ЛС, б.гепчгич и ХСб 7.ЛС и ХС.

■Í л

и SHA, клетки оставались в фазе, не переходя в фазу клеточного иикла.Однако под влиянием полианионов и ФКА, была обнаружена экспрессия реиепторов для интерлейкина 2.Клетки, предварительно активированные ПЭ и ФМА, приобретали способность пролиферировать в присутствии Ил 2.(рис.4в).

Сравнение активности полиионов межклеточного матрикса с сульфатом-декстрана показало их идентичность в тестах активаиии синтеза РНК или экспрессии рецепторов для интерлейкина 2. Эти данные доказывают адъювантную активность полиионов при их слабом митогенном действии.

Вместе с митогенами, разные виды ПЭ также демонстрировали различие.При взаимодействии с ЛПС лучшие результаты пролиферации наблюдали с 50, а при взаимодействии с Кон А - с ГС и ДС. (рис.5).

Известно, что синтез собственых ХС стимулируется липопо-лисахаридом на В клетках, а Кон А- на Т клетках.Может быть им объясняется адъювантная роль ПЭ при действии митогенов.

Логично предположить, что ПЭ с одинаковым действием будут потенииировать свои эффекты (до определенной концентрации), другой возможный вариант взаимодействия предполагает их конкуренцию (рис.6).

ХС и гепарин потенииировали свое действие, ХС вместе с ДС вызывали пролиферацию даже меньшую, чем в контроле.Аналогичный эффект наблюдали для ДС и гепарина.Легко заметить, что ДС не потенииирует действие ни гепаринам, ни ХС.Вероятно, это связано с его синтетической природой, возможно из-за блокировки рецепторов.Если между гепарином и ХС имела место конкуренция за рецепторы, в ней победителем оказывался гепарин.

Влияние полиэлектролитов межклеточного матрикса на диферениировку В-лимфоиитов

Эти' исследования явились логическим продолжением работы по изучению влиянии ПЗ на пролиферативную активность мышиных селезеночных клеток.Используя флуоресцентную микроскопию определяли наличие или отсутствие связывания с флуоресцирующими лигандами, топографию и распределение связанного лиганда на поверхности клеток и скорость распределения комплексов е плос-

кости, мембраны.

Воздействие ПЭ на поверхностно-мембранные процессы можно обобщить следующих образом:

¡.Нефиксированные лимфоциты , предварительно обработанные ПЗ матрикса, связывали антитела подобно контрольным клеткам, т.е. агрегация мембранных белков экзогенными полионами не приводила к повреЕдению свойств белковых молекул в мембране лимфоцитов.

На нефиксированных клетках наблюдали ряд процессов от равномерного кольца по периметру клетки ("ринг") до процесса образования "папочки", что полностью коррелирует с предположением о рели трансмембранного сигнала, который в незрелых лимфоцитах блокирует синтез новых рецепторов, а е зрелых усиливает его.Для наблюдения за процессами происходящими в клетках, делали "дырки"в клеточной мембране путем последовательной обработки ацетоном.Как известно, иммуноглобулины (Иг) синтезируются в рибосомах эндоплазматического ретикулума и затем путем экзоиитозного пузырька выделяются во внешнюю среду.Аналогичным образом происходит и обратный процесс поглощения.

Главные различия наблюдали в экспериментах на фиксированных клетках (рис.7, 8).

2.Результаты опытных экспериментальных групп под воздействием ПЭ отличались от контрольных под воздействием ЛПС только процентным соотношением.Четко было видно их различие с неактивированными клетками ( отрицательный контроль).

3.Как и в опытах с добавлением ЛПС, так и под воздействием ПЗ наблюдаются клетки на разных атапах дифферениироЕКи. Существовали как полностью диффузно прокрашенные (морфологически это были бластные клетки),так слабо прокрашенные и "ринги".Количество рингов значительно снижено.

4.В синергично действукших комбинациях ПЗ и активаторы протеинкиназы С (ФМА), как и ПЭ, ФМА и Ил-2, на вторые третие сутки давали картину, подобную воздействии ЛПС. Значительно большее количество клеток светилось ярко диффузно С ОИС.Ь/.

Ь. Отмечалась способность клеток к агрегации, вызванная =огДйиг.ТБнем ХС. которая появлялась чеэер 48-60ч.Эта способ-

II и РИНГ СЛАБО Анч»<>. %БААСТЫ

- - — Юо

а. ?0 - . - — 30

1. о. Ц2. г - 3 2.0

3. Ъ. 8 30 60 2.

а. 13 чг. ч- (0 3

А. 5. 13 44 40 II 3

а. п !■* — 5- . 10

5. Г. 44 45" 6 10

а. АО 54 £ 12. * 5

С. ¿0 60 12. * г

а. г {Я * г.

5. и и ¿0 * 4

л. 1« 6о ¿0 1? + 2.

5. II 4* ¿я 34 * 2.

<Г. 55 35 4 11 3

ю. 1 и 2. 5

II. $. 53 — в 6

.Иммунофлуоресиениия.Средние показатели числа клеток з процентах на третие сутки культивирования. I.мышиные тимоииты, 2.свежевыделенные мышиные селезеночные клетки,З.гибридома, селезеночные клетки под воздействием: 4.ЛПС, 5. контрольные клетки, 6.ХС, 7.ХС и ФМА, 8.ХС, ФМА и Ил-2, 9.ФМА и Ил-2, 10.Ил-2, Н.ФМА.а)-клетки без дополнительного воздействия на мембрану, б)-клетки с нарушеной целостности мемОраны,*-агрегация клеток.

ность была сильно выражена в комбинации ПЭ, ФМА и Ил-2.Можно предположить, что таким образом демонстрируются процессы взаимодействия между клетками, специфически отражающиеся на способности В-клеток продуцировать Иг.

6.В условиях длительного культивирования обнаружено стиму-лирувдее влияние ПЭ на жизнеспособность клеток.Даже на пятые сутки комбинация ПЗ, ФМА и Ил-2 выявляла способность к агрегации, что, по-Еидимому, и поддерживало клетки в жизнеспособном со тоянии.Очевидно, наличие ПЭ позволяет в какой-то мере, наподобие естественых условий, создать необходимые предпосылки

для дифферениировки клеток.

7.Показана невозможность ФМА и Ил-2 самостоятельно индуцировать Б-клеточную дифференцировку ' , , .Для их воздействия нужны предварительно подготовленные клетки.Клетки, находящиеся под воздействием ПЭ, оказались для них хорошим субстратом.

Культивирование клеток под воздействием ПЭ на агарозной

подложке

VIиэ полиэлектролиты являются элементом межклеточного матрикса, который имеет гелеобразное состояние.Чтобы создать клеткам более естественые условия, культивировали селезеночные клетки на агарозной подложке: нейтральной и с добавлением полиэлектролитов ХС и ДС.

■ Результаты семи опытов представлены на рис.9.Сравнивали пролиферацию клеток, культивированных на'двух вариантах подложек. Из рис.9 и 10 видно, что клетки активнее пролиферируют на ходроитин-сульфатной подложке, чем на нейтральной.Полученные данные не являются результатом простого суммирования эффектов действия подложек и ХС.Наблюдается синергический эффект ПЗ подложкой .Этот факт отмечали через 24 - 72 часа по включе-ниюЗН-тимидина.

Действие ДС и ХС не отличалось между собой как при культивировании клеток Еместе с агарозой (хондроитиновая и декстра-новая подложка) ,так и сами по себе.Они оказывали слабый мито-геннсй эффект: вызывали повышение пролиферации б 2 раза.

г некстоэых опытах регистрировали снижение показателей по

а

равнению с. контрольными клетк.ами.По-видимому, это связано с ем, что в этих случаях часть клеток остается прилипшей к подожке. Количество клеток в контрольной группе (без подложки) аже после тщательного ресуспендирования было в 3-4 раза боль-е, чем в опытной группе с использованием подложки.

При условиях культивирования на подложке с Кон А в некото-ых случаях наблюдали низкую пролиферацию клеток.По-видимому, то также связано с их прилипанием к подложке.Опыты с инактива-ией Кон А позволяют предположить, что клетки прикрепляются к одложке именно в процессе активного развития и взаимодействия ежду собой.

Подобные результаты были получены и с клетками меченными Н-уридином через 24 час действия ПЭ. Более продолжительная нкубаиия агарозной подложки с ПЭ не выявила различий в резуль-атах.

Анализ фаз клеточного цикла под воздействием ПЭ межклеточного матрикса

Для анализа количества лиганда, связавшегося с каждой леткой, была применена цитофлуориметрия на лазерном флуорес-ентном иитометре СЕрИ«- йш%А>ъоиив и ().В

аждой суспенсии с мечеными клетками для Ю6 клеточных лементов получали гистограмму распределения клеток в зависи-ости от интенсивности их флуоресценции .

Использование этого метода позволило более точно проследить ктивацию лимфоцитов на самых ранних ее этапах.Полученные анные представлены на гистограммах.В отдельности представлены Зр/^фаза, коррелирукшая с двойным количеством ДНК (2с), 5 аза и (^/Мс (4с) набором ДНК.

Картина распределения ядер под влиянием ХС через 48 час. тличалась от контрольной группы.В нестимулированных клетках аблюдали низкий уровень вхождения их в цикл (рис.II).

То, что полиэлектролит выводит клетку из фазы 64-фазу е вызывает сомнения поскольку обнаружен процент клеток в сле-;ующей 5-фазе. Возможно ПЭ оказывали ускоряющее действие на пе-|еход клеток из вС^фазу.

Перехода клеток из фазы 5 в Сг /И -фазу не удалось обнаружить.

на пролиферацию мышиных селезеночных клеток.По оси ординат-проиент клеток, по оси абсиисс - фазы цикла.Нейтральная под-лота:_ контроль, -- с добавлением Кон А,... С добавлением хс.хондроитиновая подложка: ЦП контроль, =5 с добавлением Кон А.

Рис-10-Гистограмма распределения клеток по фазам клеточного цикла (по оси аСсиисс).По оси ор^й+ит - процент клеток.

_ контроль, - - - клетки под воздействием хондроитин-

сульгата.--под воздействием Кон А,.....под воздейст-

вие»: .1":

1олученные результаты свидетельствуют о том, что каким-то обро-юм ПЭ способствуют переходу клеток в фазу.Вероятно, в наших сультурах зто были единичные бластные клетки.Количество таких слеток увеличивалось через 72 час культивирования.При этом зсобенно наглядно выявлялись различия по сравнению с контрольный показателями.

Влияние полиэлектролитов межклеточного матрикса на пролиферацию человеческих лимфобластов линии ТьигЬсЛ и клеток К-562.

По многим показателям бластные клетки отличаются от нормальных.Некоторые из них, такие как процесс деления, скорость протекания процессов в клетке, количество и вид клеточных рецепторов, наличие и число ионных каналов, являются исключительно важными для клеточных взаимодействий.В этой связи представлялось необходимым изучить влияние ПЭ на эти процессы.Мля этого использовали линию клеток человеческих Т-бластов ЗиЛа* и проэритробластоидную линию К 562.

Проведенные эксперименты выявляли снижение пролиферации клеток под влиянием ПЭ матрикса (рис.12).

Существуют данные об изменении содержания мембранных полиэлектролитов в сторону их уменьшения у трансформированных клеток, в частности, при их дифференаировке. Может быть, е этом случае, они осушествляют отрицательную обратную связь и ингибируют синтез РНК и ДНК путем связывания митогенов или медиаторов иммунного ответа.Аналогичные данные получены нами с использованием Кон А и, в слабой степени, с применением ЛПС .

Возможно, эффект ПЭ связан с большей чувствительностью клеточной мембраны у бластов. Таким образом, разрушить мембрану и проникнуть внутрь легче при действии на трансформированную., клетку, чем на нетрансформированную, Может быть эффект связан . с образованием специфичных клеточно/клеточных и клеточкс/суо-стратных контактов.В пользу такого предположения, свидетельствуют факты о наличии рецепторов к гепарину на опухолевых клетках.Установлена одинаковая тенденция в действии митсгено? и Пена угнетение деления.

Тройная комбинация ( ПЭ, ФМА и ИЛ-2 ) приводила к четкому

Рис.АХАдъювантное действие агарозной подложки с полиэлектролитами на пролиферацию лимфоцитов селезенки мыши. По оси ординат- интенсивность включения *Н-тимидина в ДНК (имп/иин.), по оси абсиисс- • нейтральная подлоика-контроль; л-ХС(ЛС) на нейтральной подлоге, о ХС поддохка-контроль,4 клетки под воздействием ЛПС и £ ЛПС на ХС подложке.

с» МЛ ИЛ<1

Рио.асИнгибирукщее влияние полиэлектролитов матрикса на пролиферацию клеток линий JurfeoLt.no оси ординат- накопление ЗН-тииипина в ДНК (иип/иин).

По оси абсцисс -время культивирования клеток с ПЭ:П -24час, И 43 час. В 72 час.

и

ижению пролиферации, наиболее сильно выраженному через 24 с.Б течение следующих суток до 72 час эффект полностью ис-зал. Для объяснения полученных результатов существует не нее двух предположений.Возможно, таким образом проявляется ксическое действие ПЭ.Можно также предположить о влиянии

на деление и дифферениировку клеток на более ранних этапах зревания (рис.12).

Первое предположение проверяли двумя способами.Определение аичества и жизнеспособности клеток метиленовым синим выявило Фмальное число клеток для этого периода культивирования, ¡состоятельность предположения о токсическом влиянии ПЭ на клет-I показала зависимость по времени.Наибольшая выраженость про-юса наблюдалось через 24ч., когда синтез Ил-2 максимально выра-ж.Можно утверждать, что в случае наличия токсического эффекта, ;ндениия была бы обратной.

Как ни странно, человеческая недифференцированная линия 562 реагировала на присутствие ПЭ снижением пролиферативной етивности.

Предположение о способности ПЭ вызывать снижение пролифе-шии подтвердилось результатами исследования на иитофлуо-шетре.Уже по фазам клеточного иикла был виден эффект ПЭ по эавнению с контрольными клетками.Выявлялись два пика - клет-1 в С»/&1 и (¡г/Мфазы иикла.

Под влиянием хонд: мтин-сульфата число клеток в £г/Мфазе ^еньшалось, частично за счет перехода в 8 фазу.Аналогичный ззультат получен для клеток линии .Клетки IС МЪ так-

з останавливались в б фазе.

Полученные данные о воздействии ПЭ на бластные клетки эррелируют с данными литературы.На клетках Р388 (мышиный лей-эиигарный лейкоз) доказано, что клетки находяшиеся в 5 фазе икла следует считать покоящимися, вне зависимости от повышения х числа.Факт подтвержден с использованием Ьн-уридиновой метки, летки не входили снова в цикл и не начинали синтезировать РНК-

ВЫВОДЫ

I .Полианионы межклеточного матрикса тканей не являются

инертным наполнителем межклеточных пространств, они могут выполнять функцию активного регулятора жизнедеятельности клеток, помешенных в данный матрикс.

2. Обладая очень слабой собственной митогенной активностьк, полиэлектролиты матрикса могут служить усилителями других акглватороь.В частности, вместе с активатором прогеинкинаэы С они могут индуцировать выход покоящихся лимфоцитов в 64 фазу клеточного цикла.5то проявляется и в приобретении клеткой способности (экспрессия рецепторов к интерлейкину 2) переходить в5-фазу цикла под влиянием ростового фактора.

3.Несмотря на обнаруженное "ионофороподобное " поведение полиэлектролитов , их действие отличается от действия обычных ионофоров и каналогенов.Они не обеспечивают перенос ионов путем непосредственого воздействия на мембрану и возможно активируют с помощью другого механизма протеинкиназу С.Их действие отличается и от действия ыитогенов, а при совместном воздействии они демонстрируют адъювантные свойства как по отношеник л синтезу РНК, так и ДНК.

4.Кроме участия в активации клеточных делений, ПЭ могут активировать дифферениировку В-лимфоиитов.Этот эффект также проявляется в большей степени в синергичных взаимодействиях в ходе иммунного ответа.В этих опытах обнаружена способность клеток к агрегации под воздействием ПЭ.

Ь.Обнаружено влияние ПЭ межклеточного матрикса на пролиферацию клеток на более ранних стадиях созревания и диффереь имровки.Оно выражалось в снижении пролиферации быстролролифе-рируюшей человеческой линии клеток "ЗьогЬох> и недифференцированной миелобластоидной линии К 562-

ЖСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ГО TEI.E ДИССЕРТАЦИИ

. Златева Д.С., Февралева И.О. - Влияние полиэлектролитов ыешиеточного ыатрикса на пролифератквнке процессы в лш-фоцетах. / Тезисы докладов XI научной конференции болгарски аспирантов с мевддароднш участием, VI, 1989, ЦИНТЙ НД 11, с.12958.

¡. Златева Д.С. - Полиэлектролиты ыатрикса и быстропролифери-рующие клетки линии rurkat и К559./ Тезисы докладов XII научной конференции болгарских аспирантов с международным участием, VI, 1990, ЦЙНЖ НД II с.1340.

3. Златева Д.С. - Влияние на полиелентролитиге на иеядуклетъч-ния ыатрикс върху диференциранего на В-лимфоцитите. Резшета на Обедшената научна сесия на студента и млади научни работници, ВШ-Пловдив /България/, 20.04.1990.

4. Златева Д.С., Февралева И.С., Атауллаханов Р.И.- Влияние полиэлектролитов мегошеточного ыатрикса на ранные активаци-онные процессы в лимфоцитах. / Ишунология, ' ™ '- . 19 3!,

t/ Ч , С ¡1 | - I 2. 3 " '

5- Ataullakhanov П.1., Zlateva D .S .-Со-activating influence

of tissue microenvxronement to cell division of immunocompetent cells. / Aachen, If.Germany, 9-12.09.1990. Abstract.

6. Zlateva D.S.- The effect of polyelectrolytes of the inter-cellulr matrix on differentiation of B-lymphocytes and synthesis of iramianoglobulins • / Folia raedica/Bulfj./, 1990, t. XXXII,fascЛ, in print.