Автореферат и диссертация по медицине (14.01.24) на тему:Сканирующая зондовая нанотомография для исследования 3D структуры матриксов для тканевой инженерии и регенеративной медицины

На правах рукописи

Агапова Ольга Игоревна

Сканирующая зондовая нанотомография для исследования 31) структуры матршссов для тканевой инженерии п регенеративной медицины

14.01.24 -трансплантология п искусственные органы

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

16 СЕН 2015

Москва-2015

005562373

005562373

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Доктор биологических паук, профессор

Севастьянов Виктор Иванович

Официальные оппоненты:

Белоусов Всеволод Вадимович - доктор биологических наук, старший научный сотрудник, руководитель группы биологии активных форм кислорода Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт бноорганнческой химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» Российской академии наук.

Федоров Алексеи Николаевич - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Федерального государственного учреждения «Федеральный исследовательский центр «Фундаментатьные основы биотехнологии» Российской академии наук».

Ведущая организации: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится «27» октября 2015 г. в 15— часов на заседании Диссертационного совета Д 208.055.01 при ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России по адресу: 123182, г. Москва, ул. Щукинская, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России и на сайте http://\v\vw.transpl.ru

Автореферат разослан « »

2015 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 208.055.01, к.в.н

Волкова Елена Алексеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Дефицит донорских органов в трансплантологии не позволяет обеспечить ими всех нуждающихся, поэтому разработка альтернативных методов восстановления поврежденных органов и тканей является актуальной и необходимой. На успешную имплантацию и регенерацию существенное влияние оказывает подбор адекватного материала для изготовления биоискусственных конструкций. В связи с этим важную роль играет изучение наноструктуры того или иного используемого биоматериала, ог которой в значительной степени зависит биологическая и функциональная активность изделия. Методика сканирующей зондовой нанотомографии, предполагающая использование сканирующего зондового микроскопа и ультрамнкротома и одном устройстве, позволяет изучать биологические объекты в трехмерном виде, с минимальными изменениями их природной структуры, характеристик и свойств, что является её преимуществом перед другими методами микроскопии. Использование замораживания в присутствии крпопрогекторов для анализа трехмерной структуры методом сканирующей зондовой нанотомографии в криогенных условиях позволяет получить уникальную информацию о пативной структуре клеток, тканей, искусственных гидрогелевых биоконструкций с папоразрешенпем.

Объектами настоящего исследования являются пористые биодеградируемые матриксы из фиброина шелка и рекомбипантиого спияронпа, а также альгинатные клеточные микроносители, поверхность которых модифицирована микрочастицами девнтализированного матрикса печени для повышения адгезии эукарпотических клеток. Наноструктура и ее влияние на биологические свойства этих матриксов и микроносителей ранее не были изучены, поэтому настоящее исследование посвящено сравнительному изучению наноструктуры каркасных и мелкодисперсных матриксов методом сканирующей зондовой нанотомографии как при комнатной температуре, так и в криогенных условиях.

Степень разработанности темы исследования

Проведенные в ФГБУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И. Шумакова» Минздрава России серии исследований по разработке метода сканирующей зондовой нанотомографии показали принципиальную возможность анализа трехмерной структуры биологических объектов при комнатной температуре. Были разработаны методические подходы к изучению микро- и наноструктуры биоматериалов и фиксированных тканей. Возможность разработки технологии СЗНТ в криогенных условиях оставалась под вопросом, что и послужило основанием для выполнения настоящей работы.

Цель работы

Целью работы является изучение ЗО микро- и наноструктуры пористых и мелкодисперсных матриксов, перспективных для тканевой инженерии п регенеративной

медицины, с помощью сканирующей зондовой нанотомографии для установления взаимосвязей между наносгруктурными и биологическими свойствами пмплантатов.

Задачи исследования

1. Разработать технологию сканирующей зондовой нанотомографии в криогенных условиях для анализа структурных свойств водосодержащнх материалов и тканей.

2. Разработать тканеспецифический мелкодисперсный магрикс из альгинатных микросфер, модифицированных микрочастицами девитализировапной ткани печени.

3. Исследовать микро- и наноструктуру трехмерных пористых бпоматриксон из фиброина шелка и рекомбипатного сипдроина методом сканирующей зондовой нанотомографии при комнатной температуре.

4. Исследовать микро- и наноструктуру мелкодисперсных альгинатных и тканеспецифических матриксов методом сканирующей зондовой нанотомографии в криогенных условиях.

5. Изучить влияние особенностей структуры биополпмерных матриксов на их биологические свойства in vitro и in vivo в экспериментальной модели травматического повреждения кости у крыс.

Научная новизна

1. Разработана технология сканирующей зондовой крионаиотомографии для выполнения наномасштабНых исследований водосодержащнх материалов н тканей.

2. Методом сканирующей зондовой нанотомографии при комнатной температуре установлены существенные различия в наноструктуре каркасных матриксов из рекомбипантного спидроина и фиброина шелка.

3. Установлено, что матриксы из рекомбипантного спидроина с более высокой нанопористостыо и взанмосвязанносгыо пор по сравнению с матрпкеами из фиброина шелка, обладают более высокой биологической активностью в экспериментах с восстановлением поврежденной бедренной кости у крыс.

4. Разработан тканеспецифический мелкодисперсный матрикс из альгинатных микросфер, модифицированных микрочастицами девитализировапной ткани печени.

5. Методом сканирующей зондовой нанотомографии в криогенных условиях установлена более высокая наноструктурированиость поверхности мелкодисперсного матрикса из альгинатных микросфер, модифицированных микрочастицами девпталпзнрованпой ткани печени, по сравнению с немодифицировапными поверхностями этого матрикса, что сопровождается более высокой адгезией клеток, на примере гепато.мы человека Hep G2.

Теоретическая н практическая значимость

Результаты предварительных исследований биологической активности пористых трехмерных матриксов из рекомбипантного спидроина и фиброина шелка, а также мелкодисперсного тканеспецпфического матрикса из альгинатных микросфер, поверхность

которых модифицирована фрагментами девитализированной ткани печени, позволяют рекомендовать данные изделия для проведения доклинических исследований с целью их использования в тканевой инженерии и регенеративной медицине.

Разработана и внедрена в практику ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России технология сканирующей зондовой нанотомографии в криогенных условиях для скрининга биоматериалов.

Методология и методы исследования

В ходе выполнения работы использован комплекс физико-химических и биологических методов исследования.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанная технология сканирующей зондовой нанотомографии в криогенных условиях пригодна для исследования трехмерной наноструктуры водосодержащих материалов и тканей.

2. Технология сканирующей зондовой нанотомографии позволяет проводить количественный анализ трехмерной наноструктуры биополимерных матриксов.

3. Степень и характер нанопористости матриксов из рекомбинантного спидроина и фиброина шелка, изготовленных методом выщелачивания, влияют на их биологическую активность при имплантации в поврежденую ткань бедренной кости крысы.

4. Модификация поверхности альгинатных микросфер фрагментами девитализированной ткани печени повышает их адгезивные свойства для клеток гепатомы человека Hep G2.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность результатов определяется репрезентативным объемом проведенных экспериментальных исследований, использованием современных методов исследования и методов статистической обработки.

Основные положение диссертационной работы были доложены и обсуждены на межинститутских семинарах ФГБУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И. Шумакова» Минздрава России (2013 г., 2014 г., 2015 г.), XXII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2015», Москва, 13-17 апреля 2015г, V Международной Конференции «ФизтехБио» МФТИ, 29-30 апреля 2015г., а также «Nanotech 2015», Washington, DC, USA, June 14-17, 2015.

Публикации

Результаты проведенных исследований отражены в 9 печатных работах.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, трех глав основного содержания, включая обзор литературы, методическую главу, результаты и их обсуждение, а также заключения, выводов. Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста, содержит 28 рисунков, 6 таблиц, список литературы из 317 наименований, из них 13 российских и 304 иностранных.

Часть работы выполнена в рамках проекта ФЦПИР 2014-2020 Минобрнауки России (Соглашение № 14.604.21.0001, уникальный идентификатор проекта RFMEFI60414X0001).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы

При изготовлении каркасных пористых матриксов из фиброина шелка были использованы коконы тутового шелкопряда Bombyx топ, которые были предоставлены нам директором Государственного научного учреждения Республиканская научно-исследовательская станция шелководства Российской академии сельскохозяйственных наук Богословским В.В. (Ставропольский край, г. Железноводск), а также очищенный и лиофилизированный рекомбинантный аналог спидроина 1 (rSl/9), предоставленный к.б.н. Богушем В.Г. (ФГУП ГосНИИгенетика, Москва РФ).

Экспериментальные животные

Крысы породы Wistar, самцы (возраст 1 год, вес 350 г), использовавшиеся в экспериментальной модели травматического повреждения бедренной кости (п=60) и для экспериментов по изготовлению микрочастиц децеллюляризованного матрикса печени (п=10), были получены из питомника лабораторных животных (филиал «Андреевка» ФГБУ «НЦБМТ» РАМН). Все манипуляции с животными проводили согласно правилам, принятым Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследований и других научных целей (European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and other Scientific Purposes (ETS 123) Strasbourg, 1986). Содержание животных осуществлялось в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 10993-2-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 2. Требования к условиям содержания животных».

Методы

Изготовление пористых матриксов из рекомбинантного спидроина и фиброина шелка методом выщелачивания. Навеска полимера весом 15 мг растворялась при 40°С в течение 30 минут в 50 мкл раствора 10% хлористого лития с 90%-ой муравьиной кислотой. Полученный раствор центрифугировали 10 минут при 11300 g, затем 50 мкл надосадочной жидкости смешивали со 110 мг хлорида натрия, размер частиц соли был от 200 до 400 мкм. После этого происходило формирование диска диаметром 10 мм и высотой 2 мм. При комнатной температуре (20-25 °С) диск высушивался, подвергался на протяжении 2 часов

обработке 96%-ым этанолом, после чего отмывался от частиц хлорида натрия дистиллированной водой. Полученные матриксы дегазировали и хранили в 70%-ном этаноле. Размеры пор составили от 200 до 400 мкм, пористость 85%.

Изготовление микрочастиц децеллюляризованного матрикса из печени. Крысам породы Wistar за 20 минут до проведения процедуры забора печени вводили 250 мкл гепарина внутрибрюшинно для снижения тромбообразования. Через 30 минут вводили 200 мкл трентала в качестве ангиопротекторного препарата. Для общего парентерального наркоза через 30 минут вводили 0,20 мл препарата Zoletil. Далее вскрывали брюшную полость, производя продольный разрез по средней линии, после чего мышечные лоскуты отворачивались в стороны. Затем портальную вену канюлировали и промывали от крови 200 мл натрий-фосфатного буфера (pH 7,4) со скоростью 150 мл/ч. Печень децеллюляризировали со скоростью 150 мл/ч последовательно 1) 500 мл натрий-фосфатного буфера, содержащего 0,1% додецилсульфата натрия и 1% Triton Х-100, 2) 500 мл натрий-фосфатного буфера с 0,1% додецилсульфата натрия и 2% Triton Х-100, 3) 500 мл натрий-фосфатного буфера с 0,1% додецилсульфата натрия и 3% Triton Х-100. После децеллюляризации печень отмывали от детергентов 200 мл натрий-фосфатного буфера со скоростью 150 мл/ч, извлекали из крысы, помещали в чашку Петри и измельчали с помощью хирургических ножниц. Измельченную печень перемещали в пробирку, доводили объем до 15 мл 15% раствором глицерина в натрий-фосфатном буфере, инкубировали 20 минут и центрифугировали 10 минут при 500 об/мин. Осадок измельчался в жидком азоте с помощью предварительно охлажденных пестика и ступки в течение 5 минут. Полученные частицы перемещались в чистую предварительно охлажденную пробирку, объем доводили до 25 мл 70% этанолом. Полученную суспензию центрифугировали 3 раза по 10 минут при 500 об/мин. После каждого центрифугирования 70% супернатанта отбиралось в отдельную пробирку с микрочастицами нужного размера. Полученная готовая суспензия микрочастиц переносилась в микропробирки на 1,5 мл типа «Эппендорф» (Eppendorf, Германия). Пробирки с микрочастицами герметично закрывались и хранились при +4°С в 70% этаноле.

Изготовление альгинатных сферических микроносителей. С помощью инкапсулятора В-390 (Buchi, Швейцария) производилось распыление 0,4% раствора альгината натрия через форсунку диаметром 120 мкм с параметрами: частота - 1000 Гц, напряжение -2500 В, нагрев - откл. Скорость подачи раствора из шприца равнялась 5 мл/мин. В качестве принимающего раствора был 100 мМ раствор хлорида кальция. Полученные микроносители имели диаметр от 200 до 300 мкм.

Подготовка образцов альгинатных микроносителей для криоСЗНТ. Образцы фиксировали с помощью раствора 2,5% глутарового альдегида в фосфатно-солевом буфере (pH 7,4). Инкубировали в течение 2-х часов в темноте при 4°С. Затем проводили 2 отмывки микроносителей фосфатно-солевым буфером по 15 минут каждая и ресуспендировали в 2,3 М растворе сахарозы. 50 мкл суспензии микроносителей переносили в микропробирку и инкубировали при 4°С в течение 12-ти часов.

Изучение структуры пористых матриксов методом сканирующей зондовой нанотомографии. Трехмерная структура матриксов изучалась с использованием комбинированной системы Ntegra Tomo (ЗАО «НТМДТ», Москва), представляющая собой атомно-силовой микроскоп и ультрамикротом Leica EM UC6NT (Leica Microsystems GmbH,

Austria) в одном устройстве. Образцы матриксов заливались в эпоксидную смолу, после чего выполнялась серия последовательных срезов ультрамикротомом с помощью алмазного ножа Diatome UltraAFM 45 с дальнейшим измерением топографии поверхности участка после каждого среза при помощи атомно-силового микроскопа. Измерения проводились в полуконтактном режиме с применением зондов - кремниевых кантилеверов NSG10 с резонансной частотой 240 кГц, радиус кривизны острия зонда составлял не более 10 нм. Далее изображения выравнивались в плоскости сканирования друг относительно друга, итоговые трехмерные структуры визуализировались и анализировались с помощью пакета программного обеспечения ImagePro AMS 6.0 (MediaCybernetics Inc., США), включающую опцию трехмерного реконструирования. Визуализация и статистический анализ объема пор, а также взаимосвязанных кластеров системы нанопор применялись, чтобы получить наиболее полную комплексную характеристику трехмерной структуры.

Экспериментальная модель травматического попрсждсппя бедренной кости. Травматическое повреждение бедренной кости у крыс породы Wistar проводили, чтобы оценить возможность использования каркасных полимерных матриксов для восстановления костной ткани. В опытных группах в зону повреждения была произведена имплантация матриксов из фиброина шелка (п=20) или спидроина (п=20), а в контрольной группе (п=20) заполнение матриксом зоны повреждения не осуществлялось. В проекции диафиза бедренной кости в передне-заднем направлении выполнялось сквозное отверстие диаметром 2 мм. Из полученных дисков-матриксов формировались цилиндры с диаметром 2 мм, длиной 5 мм, которыми производилось заполнение дефекта. Перед имплантацией матриксы промывали в стерильном физиологическом растворе. По окончании операции рана зашивалась и закрывалась повязкой. По 5 животных из каждой группы через 1, 2, 4, 8 недель после операции выводилось из эксперимента с помощью ингаляционной передозировки эфира. Путем экзартикуляции по суставам производилось извлечение бедренных костей с окружающими мягкими тканями, мягкие ткани удалялись, и кость помещалась в 10% нейтральный раствор формалина. Исследования костей проводились на 64-срезовом мультиспиральном компьютерном томографе (модель Light Speed VCT) компании General Electric (GE)). Параметры сканирования: 120 кВ, 80 мА, толщина реконструкции 0,6 мм. Полученные серии изображений обрабатывались на рабочей станции экспертного класса с многопрофильным просмотром изображений AW VoIumShare 4 по 3D («three-dimensional») и VR («virtual reality») протоколам. Количественная оценка проводилась по индексу костной мозоли (ИКМ) по шкале Хаунсфилда. С этой целью проводили динамические измерения денситометрических показателей интермедиарной зоны регенерированной ткани и интактного кортикального слоя с помощью спиральной компьютерной томографии, ИКМ вычисляли по формуле: ИКМ=ИР(НЦ)/КС(Ни)х100, где ИР - плотность интермедиарной зоны регенерированной ткани, КС - плотность интактного кортикального слоя прилежащего участка кости в единицах Хаунсфилда, HU. Единицы Хаунсфилда оценивают степень абсорбции рентгеновского излучения анатомическими структурами организма по отношению к воде. Степень абсорбции рентгеновского излучения водой в шкале Хаунсфилда принимается равной 0. Воздух и жир имеют отрицательные значения, костная ткань - положительные значения. На полученных

изображениях в интерактивном режиме выделяли область, в которой автоматически высчитывалась площадь и плотность зоны регенерации в единицах Хаунсфилда.

О клиническом состоягаш животных судили по уровню общего белка, аланинаминотрансферазы (AJIT), аспартатаминотрансферазы (ACT), а также креатинина, которые определяли на автоматическом биохимическом анализаторе проточного типа "Vemo" (производства Electa Lab., Италия). Щелочную фосфатазу определяли на биохимическом анализаторе "Sapphire 350" (Audit Diagnostics, Ирландия).

Формула крови была подсчитана на лабораторном микроскопе "Nikon Eclipse 50i" (Nikon Instruments, США) после окрашивания мазков крови по стандартной методике гематоксилин-эозином. Кровь забиралась у животных прижизненно из хвостовой вены.

Статистический анализ полученных результатов. Оценка полученных результатов проводилась с помощью методов вариационной статистики с использованием пакетов стандартных статистических программ Microsoft Excel ХР, а также с помощью программы Statistica for Windows Version 6,0 (StatSoft Inc., США). Определялось среднее значение (X), стандартное (среднеквадратичное) отклонение (SD) Используя t-критерий Стьюдента определяли достоверность различий (при р<0,05).

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка технологии сканирующей зондовой крионанотомографии

Создание аппаратного комплекса для проведения сканирующей зондовой нанотомографии в криогенных условиях (криоСЗНТ). В качестве методики для анализа наноструктуры поверхности биологических образцов предлагается метод сканирующей зондовой микроскопии, который является методом неразрушающего многопараметрического анализа поверхности с наноразмерным (вплоть до молекулярного и атомного) разрешением. Главной особенностью предлагаемой методики является возможность выполнять серии последовательных измерений поверхности после сверхтонких срезов исследуемого биологического объекта и восстанавливать его трехмерную наноструктуру с помощью нанотомографии. Был разработан дизайн нового прибора для выполнения томографических ианомасштабных исследований в криогенных условиях трехмерных наноразмерных структурных и морфологических свойств биологических объектов. Его применение позволяет получить новые визуализированные научные результаты относительно трехмерной организации внутриклеточных органелл и структур в клетках, кроме того расширяет существующие представления о наноструктурных особенностях биологических тканей и искусственных материалов, перспективных для применения в регенеративной медицине. Также предполагается, что этот прибор и технология позволит диагностировать ряд патологических изменений структуры тканей и органов перед трансплантацией.

Концепция разработки заключается в объединении методик и аппаратных решений сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ) и ультрамикротомии (УМТ) при низких температурах (криоУМТ) в рамках одной измерительной системы для обеспечения сканирующей зондовой нанотомографии, обладающей следующими базовыми характеристиками:

1) возможностью измерений основными методами СЗМ (топография, фазовый и амплитудный контраст) поверхности образцов клеточных макро- и микроносителей непосредственно после среза ультрамикротомом in situ в рамках рабочего цикла срезания УМТ;

2) согласованным функционированием СЗМ и ультрамикротома для возможности трехмерной реконструкции структуры образцов на основе последовательных измерений;

3) обеспечением достаточного разрешения и уровня шума СЗМ, необходимых для изучения ультраструктуры клеточных макро- и микроносителей - уровень шума по вертикали Z 0.05 нм RMS, латеральное разрешение в плоскости образца XY 5-10 нм.

Для проведения срезов используется серийный криоультрамикротом Leica Microsystems EM UC6/FC6 (Leica Microsystems GmbH, Австрия), что приводит к важнейшему основному конструктивному и техническому решению по разработке комплекса криоСЗНТ - встраиванию основных модулей системы (системы сканирования и измерительного модуля СЗМ) в криокамеру ультрамикротома, которая служит основой всего устройства. Внешний вид комплекса представлен на рисунке 1.

Криомодуль СЗНТ состоит из системы сканирования, держателя зонда и модуля подвода. Система сканирования образцов размещается в криокамере ультрамикротома и закрепляется вместо штатного держателя образца криоультрамикротома так, что ось пьезотрубок сканера совпадает с осью руки (подвижной консоли) криоультрамикротома. При этом сканирование образцов выполняется в вертикальной плоскости, совпадающей с плоскостью среза. Держатель зонда размещается на направляющих на основе системы сканирования и подводится горизонтально к поверхности образца для сканирования. Модуль подвода закрепляется на верхней крышке криокамеры вне охлаждаемой зоны и передвигает держатель зонда горизонтально к образцу или от образца при помощи толкателя, входящего во внутреннюю зону криокамеры. Сканер, двигатель подвода и зонд на базе кварцевого резонатора соединяются с блоком микропроцессорного управления для согласованного выполнения операций и измерений. Блок микропроцессорного управления, в свою очередь, соединяется при помощи интерфейса USB 2.0 с управляющим компьютером.

Описанная выше архитектура комплекса и его сборочных единиц позволяет обеспечить функционирование комплекса СЗМ/криоультрамикротом по следующей основной схеме. Образец на магнитном носителе закрепляется на сканере. Выполняется охлаждение криокамеры ультрамикротома до необходимой температуры и делается срез поверхности образца ножом криоультрамикротома. Затем выполняется подвод зонда СЗМ, закрепленного в держателе, к поверхности образца, сканирование поверхности зондом и измерение методами СЗМ. После выполнения измерений зонд СЗМ отводится от поверхности и производится следующий срез поверхности образца. Данная процедура может быть повторена в цикле, в результате чего будет получена серия послойных СЗМ изображений после последовательных сверхтонких срезов, на базе которой может быть воссоздана трехмерная структура изучаемого образца в объеме.

Объединение сканирующего зондового микроскопа и криокамеры ультрамикротома в одной конструкции дает возможность измерений поверхности блока образца непосредственно после среза при низкой температуре (до -190°С). Разработанный нанотехнологический комплекс и технология криоСЗНТ могут быть использованы для решения широкого класса задач. В частности, применение данной технологии позволит оценивать трехмерное

распределение наночастиц и их кластеров в биологических объектах и биоискусственных конструкциях, в том числе применяемых в средствах доставки лекарственных веществ, степень нанопористости и трехмерную структуру взаимосвязанных систем микро- и нанопор в биосовместимых матриксах, трехмерную организацию компартментов в клетках.

крнокамера ультрамикрото

Рисунок 1 - Внешний вид комплекса для криоСЗНТ. В верхней части рисунка - общий вид, в нижней - криомодуль СЗНТ в криокамере ультрамикротома

основа сканирую!

привоз подвн для образца

Основной областью применения данного комплекса является обеспечение нанотехнологических и материаловедческих исследований и разработок в области биоинженерии, создания и контроля качества новых фармацевтических препаратов и изделий медицинского назначения для регенеративной медицины, и анализа структур клеток и тканей для целей медицинской диагностики.

Сравнительный анализ трехмерной наноструктуры пористых биодеградируемых матриксов из рекомбинантного спидроина и фиброина шелка методом СЗНТ при

комнатной температуре

Методом выщелачивания были получены трехмерные пористые матриксы из рекомбинантного спидроина гБ1/9 и фиброина шелка. Внешний вид этих матриксов показан на рисунке 2.

Рисунок 2 - Макрофотографии пористых матриксов из рекомбинантного спидроина (а) и фиброина шелка Bombyx morí (б). Матриксы представляют собой пористые диски диаметром 10 мм и высотой 2 мм

По данным электронной микроскопии матриксы из фиброина шёлка и рекомбинантного спидроина имели видимые отличия в форме пор и их толщине. Стенки пор в матриксах из фиброина имели более однородную структуру с чешуйчатой шероховатой поверхностью, в то время как матриксы из спидроина обладали более рыхлой конструкцией с перфорированной поверхностью (рисунок 3). Размеры макропор задавались частицами хлорида натрия в процессе изготовления матриксов и составили 200-400 мкм.

Для получения представления о трехмерной наноструктуре матриксов нами были изучены двухмерные изображения их срезов методом сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ). На рисунке 4А приведено изображение (5x5 мкм2) поверхности образца, представленного в виде залитого в эпоксидную смолу матрикса на основе фиброина шелка, после среза ультрамикротомом. Анализ двухмерных изображений поверхностей срезов стенок макропор, полученных с использованием сканирующего зондового микроскопа показал, что

а)

размеры нанопор в стенках макропор составляют от 30 до 200 нм, со средним диаметром в 50 нм. Плотность (количество на единицу площади) нанопор и степень объемной нанопористости в трехмерных структурах из фиброина шелка составляют 2.4 ± 0.2 цм"2 и 0.5 ± 0.04% соответственно. Степень объемной нанопористости определялась при помощи программного пакета Image Analysis Nova 1.0.26.1443 (ЗАО «НТМДТ», Москва) как среднее отношение суммарной площади нанопор на СЗМ-изображениях к общей площади среза участка матрикса.

Рисунок 3 - Сканирующая электронная микроскопия пористых матриксов из рекомбинантного спидроина (А) и фиброина шелка (Б)

Рисунок 4 - Анализ наноструктуры матриксов из фиброина шелка. А) СЗМ-изображение топографии поверхности блока матрикса на основе фиброина шелка, размер скана 5Х5 мкм, размерный отрезок 1 мкм, диапазон вариации высоты 30 нм; Б) трехмерная реконструкция отдельных нанопор в стенке макропоры матрикса на основе фиброина шелка (6.36x3.18x1.0 мкм), размерный отрезок 1 мкм.

Для получения трехмерной реконструкции структуры матрикса в объеме была осуществлена серия из 12 СЗМ-изображений топографии поверхности стенки макропоры после

выполнения последовательных срезов ультрамикротомом толщиной в 150 нм. Изображение было получено путем совмещения всех полученных СЗМ-изображений серии и визуализации в заданном объеме, учитывая физические размеры вокселов, задаваемых толщиной срезов и разрешением исходных СЗМ-изображений. Конечная трехмерная структура была представлена и проанализирована с помощью программного пакета 3D Constructor Image Pro AMS 6.0 (MediaCybernetics Inc, США). Визуализация полученной трехмерной реконструкции приведена на рисунке 4Б.

Аналогичным образом были исследованы и матриксы из рекомбинантного спидроина rSl/9. Анализ двухмерных изображений поверхностей срезов стенок макропор в rSl/9 матриксах показал, что размеры нанопор в стенках макропор составляют от 30 до 180 нм, со средним диаметром 50 нм, что имеет сходство с размерами нанопор в фиброиновых матриксах. Однако плотность нанопор и степень пористости в трехмерных структурах из рекомбинантного спидроина rSl/9 гораздо выше и составляет 46 ± 5.0 цм"2 и 24 ± 2.6% соответственно. На рисунке 5А приведено СЗМ изображение (5Х5 мкм) поверхности блока залитого в эпоксидную смолу матрикса на основе рекомбинантного спидроина после среза ультрамикротомом.

Рисунок 5 - Анализ наноструктуры матриксов из рекомбинантного спидроина. А) СЗМ-изображение топографии поверхности блока матрикса на основе рекомбинантного спидроина, размер скана 5x5 мкм, диапазон вариации высоты 30 нм, размерный отрезок 1 мкм, размерный отрезок во вставке 200 нм; Б) трехмерная реконструкция кластеров взаимосвязанных нанопор в стенке макропоры матрикса на основе рекомбинантного спидроина гБ1/9 (7.54x3.28x1.0 мкм), размерный отрезок 1 мкм.

Одним из наиболее важных параметров матрикса является взаимосвязанность нанопор. Согласно теории перколяции, если значение объемной пористости выше стандартного объема порога перколяции для трехмерных систем, составляющего 16%, то существенная часть пор соединяется в перколяционные кластеры, которые могут быть больше размеров единичных пор. Таким образом, исходя из того, что для г51/9 матриксов средняя степень объемной

нанопористости составляет 24%, можно сделать вывод о высоком уровне взаимосвязанности пор в них, в отличие от пор в матриксах из фиброина шелка. Двухмерные СЗМ-изображения показывают, что заметная часть нанопор связана друг с другом наноканалами. Тем не менее, учитывая, что вышеуказанный порог перколяции для трехмерных систем намного меньше, чем для двухмерных (44%), только трехмерный анализ нанопористой структуры может дать адекватную оценку степени взапмосвязанности и перколяции нанопор.

Для реконструкции и анализа трехмерной структуры нанопор в объеме матрикса была проведена серия in 13 СЗМ-изображешш топографии поверхности срезов стенки макропоры с областью сканирования 15.0 х 15.0 цм и разрешением 1024 х 1024 пикселя после выполнения последовательных срезов ультрамикротомом толщиной в 70 нм. Конечная трехмерная структура была проанализирована с помощью программного пакета 3D Constructor Image Pro AMS 6.0 (MediaCybemetics Inc., США). Статистический анализ трехмерной реконструкции пор показал, что общий объем пористости rSl/9 матриксов равен 23.8 ± 1.4%, и это соответствует значению, полученному в результате анализа отдельных двухмерных изображений. Обработка полученных данных позволила визуализировать и охарактеризовать кластеры сообщающихся нанопор и определить их параметры путем построения соответствующих изоповерхностей в трехмерном объеме. Оказалось, что значительная часть пор взаимосвязаны друг с другом и соединяются в перколяционные кластеры размерами от 1.5 до 6 мкм. На рисунке 5Б представлено изображение нескольких соседних кластеров нанопор в объеме стенки макропоры. Объемная доля сообщающихся пор в перколяционных кластерах в матриксах из рекомбинантного спидроина rSl/9 равна 35.3 ± 4.8% от всего объема пор, что составляет 8.4 ± 1.1% от общего объема матрикса.

При сравнении скорости адгезии и пролиферации фибробластов ЗТЗ на обоих видах матриксов методом конфокальной микроскопии в опытах in vitro было выявлено, что полная адгезия фибробластов наблюдалась через 2-3 часа инкубащт, а их морфология соответствовала данному типу клеток. На завершающем этапе культивирования в течение нескольких дней (с 3 по 14 день) на стенках макропор матриксов формировался монослой клеток, при этом происходило врастание некоторых клеток в стенки пор. Несмотря на разницу в структуре матриксов, изученную с помощью сканирующей электронной микроскопии и сканирующей зондовой нанотомографии, скорость адгезш! и пролиферации клеток была примерно одинакова для обоих видов трехмерных конструкций. Возможно, что для адгезии и пролиферации мышиных фибробластов обнаруженная нами разница в нанопористости матриксов из рекомбинантного спидроина и фиброина шелка не имеет существенного значения. При этом оба полимера в достаточно высокой степени обеспечивают адгезию фибробластов на поверхности изделий.

Эксперименты in vivo по имплантации каркасных матриксов в костную ткань крыс проводили совместно с Сибирским федеральным научным клиническим центром Федерального медико-биологического агентства (г. Томск). Результаты имплантации матриксов из рекомбинантного спидроина и фиброина шелка в дефект бедренной кости оценивали по изменению общего состояния организма с помощью биохимических исследований крови и по рентгенографическим признакам регенерации костной ткани в зоне имплантации в сроки 1, 2, 4, и 8 недель после операции. В послеоперационном периоде и у экспериментальных животных, и

в группе контроля, в течение первых двух суток отмечалась выраженная гиподинамическая реакция, отек прооперированной зоны. Затем, в период до 1 недели, указанные явления уменьшались, отмечалось сохранение умеренного отека мягких тканей бедра. Через 4 недели в послеоперационном периоде наступало полное клиническое восстановление. Увеличение уровня лейкоцитов, особенно смещение лейкоцитарной формулы в сторону увеличения содержания сегментоядерных нейтрофилов и моноцитов после операции, свидетельствует о возникновении воспалительного процесса, который постепенно уменьшается в течение 2 недель. Через 2 недели после введения материала содержание нейтрофилов не отличалось от физиологической нормы. Изменения в лейкоцитарной формуле, свидетельствующие о наличии аллергической реакции в течение раннего послеоперационного периода (эозинофилия), были более выражены в группе с имплантироваными фиброиновыми матриксами, по сравнению с группой, в которой были использованы спидроиновые матриксы, и группой контроля. Такая реакция постепенно затухала в динамике наблюдения и полностью исчезала через 2 недели после операции. Уровни содержания общего белка, аланинаминотрансферазы (AJIT), аспартатаминотрансферазы (ACT), а также креатинина на протяжении всего срока наблюдения оставались в пределах физиологической нормы во все сроки наблюдения, и это дает нам основание утверждать о нормальном функциональном состоянии печени и почек животных и об отсутствии токсического эффекта матриксов. Динамическое наблюдение за изменением содержания в сыворотке крови щелочной фосфатазы показало незначительный рост этого показателя к 14 дню при имплантации как спидроиновых, так и фиброиновых матриксов. Так как явления воспаления ко 2 неделе наблюдения затухают полностью, что доказано при анализе гематологических показателей, то можно утверждать, что повышенный уровень щелочной фосфатазы по сравнению с контролем, вероятно, отражает активацию остеобластов и, следовательно, активацию процессов регенерации костной ткани.

Об образовании костной мозоли можно судить по увеличению плотности искусственно сформированного отверстия в кости, что связано с процессом кальцификации и регенерацией костной ткани. Данные процессы были более выражены у животных опытных групп, особенно в группе с применением спидроина. Начиная со второй недели, более высокий индекс регенерации костной ткани у крыс наблюдался при заполнении дефекта исследуемыми материалами по сравнению с группой контроля. Преимущество спидроина по сравнению с фиброином и контролем выявлялось во все сроки наблюдения после операции (Таблица 1).

Введение матриксов из фиброина шелка и рекомбинантного спидроина создает условия для регенерации костной ткани в области оперативного вмешательства. При применении двух видов материалов обеспечивается интеграция костной ткани с имплантатом и последующее восстановление целостности кости. Использование спидроина при регенерации приводит к более быстрому восстановлению костной ткани в зоне дефекта по сравнению с фиброином шелка. Возможно, на такой результат могут влиять различия в аминокислотной последовательности и/или молекулярном весе биополимеров, а также особенности нано- и микроструктуры изготовленных матриксов.

Разница в нанопористости между фиброином шелка и rSl/9 может быть связана с их различной молекулярной организацией. Белки имеют различную аминокислотную последовательность (поли-А блоки и чередование гидрофобных и гидрофильных участков в

гБ1/9 и (ОАСАОЭ),, - в фиброине), а также разную молекулярную массу (94.3 кДа у гЭ 1 /9 и 350 кДа у тяжелой цепи фиброина, 26 кДа у легкой цепи фиброина). Такие различия могут быть причиной формирования разных пор в процессе изготовления матриксов и/или во время обработки этанолом. Разница в степени нанопористости также может быть связана с частичным гидролизом фиброина в процессе растворения его в муравьиной кислоте с 1лС1 и влиянием продуктов гидролиза на формирование матрикса. Таким образом, предполагается, что именно внутренняя нанопористая структура матрикса из рекомбинантиого спидроина объясняет его способность формировать более благоприятную микросреду для регенерации ткани в организме.

Таблица 1 - Данные рентгеновского исследования образцов бедренной кости с различными видами имплантированных матриксов в разные сроки наблюдения, X ± ЭЭ.

Материал матрикса Сроки наблюдения Плотность интермедиарной зоны регенерированной ткани в единицах Хаунсфилда Плотность интактного кортикального слоя в единицах Хаунсфилда Индекс регенерации

спидроин 1 неделя 290,7 ±21,0 953,1 ± 12,7 30,5 ±0,6

2 недели 451,9 ±9,2 1048,7 ± 19,4 43,1 ±0,7

4 недели 560 ± 12,2 1129,1 ±21,8 49,6 ± 0,9

8 недель 862,3 ± 10,3 1565,1 ±22,5 55,1 ±0,5

фиброин 1 неделя 268,1 ±0,8 921,4 ± 15,6 29,1 ±0,4

2 недели 292,7 ± 10,2 863,4 ± 16,1 33,9 ±0,6

4 недели 423,8 ± 0,9 990,3 ±19,1 42,8 ± 0,5

8 недель 731,5 ± 10,0 1364 ±20,2 47,5 ±0,7

контроль 1 неделя 431,2 ±13,2 1540 ± 12,1 28,0 ±0,8

2 недели 239,5 ± 10,3 753,0 ±0,89 31,8 ±0,7

4 недели 387,7 ± 0,95 964,5 ± 12,6 40,2 ± 0,4

8 недель 435,5 ± 11,5 983 ± 14,9 44.3 ± 0,6

Обнаружены достоверные различия между группой с имплантированными спидроиновыми матриксами и группой с фиброиновыми матриксами через 2, 4 и 8 недель после операции, а также между опытными группами и контролем через 2,4 и 8 недель после операции, р < 0,05

Разработка тканеспецнфнческого мелкодисперсного альгннатного матрикса и исследование его микро- н наноструктуры с помощью сканирующей зондовой

крнонанотомографин

В качестве объекта исследований методом криоСЗНТ в настоящем разделе работы были выбраны альгинатные микросферы, стабилизированные двухвалентными катионами, по причине их гелеобразной структуры, которая характерна для живых систем, а также по причине

широкой распространенности альгината в изделиях медицинского назначения. Такие гелевые микрочастицы хорошо подходят для замораживания с целью дальнейшего получения срезов ультрамикротомом. Были получены микроносители сферической или близкой к сферической формы с примерным диаметром 200 мкм. Такой размер обеспечивает возможность использования микроносителей в инъекционной форме. Технология децеллюляризации позволила получить межклеточный матрикс, не содержащий клеточных элементов, но при этом содержащий ряд гликопротеинов, протеогликанов, факторов роста и других соединений, необходимых для адгезии, пролиферации и миграции клеток. Микрочастицы межклеточного матрикса получали путем дробления децеллюляризрованной печени крысы породы Wistar в жидком азоте, микрочастицы имели размер, не превышающий 5 мкм.

Модификацию поверхности альгинатных микроносителей проводили путем ковалентной пришивки микрочастиц децеллюляризованного матрикса печени. В качестве модифицирующих агентов использовали N-гидроксисукцинимид (NHS) и гидрохлорид N-(3-диметиламинопропил)-М-этилкарбодиимида (EDC), так как эти вещества делают возможным образование ковалентной связи между карбоксильными группами, которые в большом количестве присутствуют в структуре альгината, и аминогруппами в составе компонентов межклеточного матрикса. EDC и NHS добавляли к суспензии альгинатных микроносителей до конечной концентрации 3 мМ и 10 мМ соответственно. Суспензию инкубировали с EDC при перемешивании в течение 1 часа при комнатной температуре, затем добавляли NHS и инкубировали в течение 1 часа в аналогичных условиях. Отмывку от модифицирующих агентов проводили путем центрифугирования в течение 5 минут при 900 g. Осадок альгинатных микроносителей ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере с рН 6,15 и добавляли суспензию микрочастиц децеллюляризованного матрикса печени до конечной концентрации 12 мг/мл. Полученную смесь инкубировали при перемешивании в течение 12-ти часов при комнатной температуре. Далее микроносители инкубировали в 100 мМ растворе глицина в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего центрифугировали в течение 5 минут при 900 g. Осадок модифицированных альгинатных микроносителей ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере с рН=7,4 с добавлением 100 мМ хлорида кальция и 30% этанола. Изображения микроносителей, полученных в результате модификации, представлены на рисунке 6.

Для визуализации микрочастиц межклеточного матрикса был использован краситель Кумасси бриллиантовый синий R-250, который связывается с белковыми компонентами в составе матрикса и не связывается с альгинатом. Модифицированный мелкодисперсный матрикс представлял собой суспензию микрочастиц сферической (или близкой к сферической) формы диаметром от 200 до 300 мкм. На поверхности модифицированных альгинатных микроносителей идентифицировались оптически плотные гранулы размером 1-5 мкм, окрашенные в темно-синий цвет, соответствующие микрочастицам децеллюляризованного внеклеточного матрикса печени крысы. У немодифицированных образцов окраска отсутствовала.

Крио-СЗМ-исследования образцов микроносителей, подготовленных по разработанной методике, были выполнены с применением разработанного в данной работе экспериментального комплекса для нанотомографии. Так как альгинатные микроносители

имеют гидрогелевую структуру и находятся в суспензии, то ультрамикротомирование и исследование данных объектов при помощи СЗМ возможно только в замороженном состоянии при низких температурах. Разработка методик исследования нативных структур подобных гидрогелевых биоматериалов при помощи сканирующей зондовой крионанотомографии является одной из основных задач данной работы. При этом одним из важнейших аспектов разработки методики пробоподготовки и предварительной характеризации альгинатных микроносителей являлся выбор способа криопротекции. При обычной заморозке, выполняемой, например, при помощи погружения образцов альгинатных микроносителей в жидкий азот, происходит кристаллизация воды, содержащейся в альгинатном гидрогеле и в суспензии. Образование кристаллов льда приводит к необратимому разрушению структуры микроносителей. Соответственно для выполнения эффективных исследований микроносителей необходим способ заморозки, при котором подобные кристаллы не будут образовываться (витрификация).

Рисунок 6 - Альгинатные микроносители, поверхность которых модифицирована микрочастицами межклеточного матрикса печени крысы породы \Vistar. Световая микроскопия. Окрашивание - Кумасси бриллиантовый синий 11-250, увеличение хЮО. Размер метки - 50 мкм.

Были выполнены эксперименты по заморозке и последующему криоультрамикротомированию образцов суспензии альгинатных гидрогелевых микроносителей с добавлением различных концентраций трех наиболее часто используемых криопротекторов -сахарозы, диметилсульфатоксида и глицерина. Эксперименты показали, что широко используемые в клеточной биологии криопротекторы ДМСО (5%, 10% и 20% р-р) и глицерин (5% и 10% раствор) не эффективны для решения поставленной задачи, так как образец при низких температурах (от -80 до -140°С) остается достаточно вязким, что не позволяет выполнять качественные сверхтонкие срезы криоультрамикротомом. В результате выполненных экспериментов с использованием различных концентраций сахарозы были сделаны выводы, что оптимальной является концентрация сахарозы в суспензии 2.3 М. В этом случае инспекция ультратонких криосрезов и поверхности образцов срезов при помощи оптической микроскопии демонстрирует, что качество поверхности является наиболее

предпочтительным для низкотемпературных СЗМ-исследований наноструктуры микроносителей. Поверхность после среза при анализе с помощью оптического микроскопа не содержит видимых неровностей при размерах области среза от 0.8 до 1,2 мм, при этом на поверхности среза идентифицируются отдельные микроносители. СЗМ-измерения поверхности замороженной суспензии микроносителей после сверхтонкого среза выполнялись при помощи зондов A-probe (Nanosensors, Германия). Резонансная частота использованных зондов составляла от 41 до 44 кГц, измерения проводились в полуконтактном режиме. Скорость растрового сканирования составляла 0.75 Гц (количество линий в секунду). На рисунке 7 приведено криоСЗМ изображение среза микрочастицы межклеточного матрикса децеллюляризованной печени крысы породы Wistar на поверхности альгинатного микроносителя.

•iiî ¿5 ' !. | ' i Ш; /' :

I , 5. *

микрочастица межклеточного матрикса

Рисунок 7 - КриоСЗМ-изображение среза микрочастицы межклеточного матрикса децеллюляризованной печени крысы породы \Vistar на поверхности альгинатного микроносителя, размер скана 5.0x4.0 мкм, вариация высоты 35 нм

СЗМ-изображение показывает, что микрочастица распластывается на поверхности микроносителя, ширина микрочастицы составляет порядка 5 мкм, в то время, как толщина -порядка 1 мкм. В объеме микроносителя наблюдается гранулярная микроструктура с размером наногранул 20-50 нм, в то время как наноструктура альгинатного микроносителя представляется более гомогенной. Предполагается, что в объеме микрочастиц наблюдается распределение белковых гранул матрикса. Последовательные криоСЗМ-измерения после проведения сверхтонких срезов образцов альгинатных микроносителей, модифицированных микрочастицами межклеточного матрикса децеллюляризованной печени крысы, и без

модификации, позволили реконструировать их трехмерные структуры. Для выполнения каждой трехмерной реконструкции была получена серия га 13 СЗМ-изображений топографии поверхности носителя после осуществления последовательных срезов криоультрамикротомом толщиной в 80 нм при температуре -120°С. Размер каждого изображения (скана) составлял 5.0x5.0 мкм с разрешением 400*400 пикселов соответственно.

На рисунке 8 представлены трехмерные реконструкции участка альгинатного микроносителя (а) и участка микрочастицы (б) на поверхности микроносителя в объеме 5.0x5.0x1.1 мкм, полученные с помощью программного пакета 3D Constructor Image Pro AMS 6.0 (MediaCybernetics, Inc.).

Для получения данного изображения было выполнено совмещение всех полученных СЗМ-изображений серии и визуализация в заданном объеме с учетом физических размеров вокселов (объемных пикселов), задаваемых, соответственно, толщиной срезов и разрешением исходных СЗМ-изображений. Данный метод позволяет реконструировать поверхности микроносителей и микрочастиц. Статистический анализ реконструированных поверхностей с помощью данного программного пакета позволяет определить и проанализировать наномасштабные трехмерные параметры этих поверхностей. Таким образом, выполненные реконструкция и математический анализ показывают заметные различия в шероховатости поверхности альгинатных микроносителей и микрочастиц. Вычисленная средняя шероховатость Ra поверхности микроносителя составляет 82.3 нм, в то время как средняя шероховатость поверхности микрочастиц, прикрепленных к микроносителю, составляет 212.4 нм. Помимо шероховатости, важным параметром, влияющим на биологические свойства поверхности, является эффективная площадь поверхности о, вычисляемая, как отношение площади поверхности к площади ее двумерной проекции на плоскость. Этот параметр определяет степень развитости поверхности.

Также для характеризащш наномасштабных трехмерных поверхностей используют параметр длины автокорреляции Li, интерпретируемый, как характерное расстояние, на котором формируется дисперсия измеряемых высот профиля трехмерного рельефа. Данный параметр может служить оценкой характерных латеральных размеров особенностей рельефа. Для реконструированных методом нанотомографии трехмерных поверхностей альгинатных микроносителей и микрочастиц, прикрепленных к микроносителю, вычисленные значения эффективной площади о составляют 1.103 и 1.205 соответственно, а вычисленные значения длины автокорреляции Li составляют 115 нм и 246 нм соответственно (таблица 2).

Оценка адгезионных свойств полученных микроносителей была проведена на примере культуры клеток гепатокарциномы человека Hep G2. Количественная оценка проводилась с помощью метода МТТ (рисунок 9).

На поверхности модифицированных альгинатных микроносителей было зарегистрировано примерно в 7 раз больше клеток, чем на поверхности немодифицированных, что свидетельствует о том, что модификация полученных изделий микрочастицами межклеточного матрикса приводит к значительному улучшению их адгезионных свойств. Альгинатные микроносители с иммобилизованными микрочастицами межклеточного матрикса имеют повышенные адгезионные свойства по сравнению с немодифицированными микроносителями за счет присутствия на их поверхности различных последовательностей,

определяющих адгезию клеток. Таким образом, обнаруженная более высокая адгезия клеток на поверхность модифицированных альгинатных микроносителей может объясняться не только особенностями молекулярного строения микрочастиц децеллюляризированного матрикса, но и повышенной шероховатостью поверхности носителей после модификации.

а)

б)

<

участок микрочастицы

альгинатный микроноситель

поверхность альпшатного м

альгпнзтыый микроноситель

Рисунок 8 - Трехмерные реконструкции участка альгинатного микроносителя (а) и участка микрочастицы (б) на поверхности микроносителя в объеме 5.0><5.0х 1.1 мкм

Таблица 2 - Сравнение шероховатости, удельной эффективной площади о и длины автокорреляции 1л поверхности микроносителя и поверхности микрочастицы межклеточного матрикса децеллюляризованной печени на микроносителе, измеренные методом криоСЗНТ. Указаны значения стандартного отклонения для 5 независимых измерений

Параметр Поверхность микроносителя Поверхность микрочастицы, прикрепленной к микроносителю

Шероховатость Яа, нм 82.3 ± 7.4 212.4 ±28.2

Удельная эффективная площадь а 1.103 ±0.01 1.205 ±0.025

длины автокорреляции 1л, нм 115 ±22 246 ± 38

Обнаружены достоверные различия между значениями для поверхности микроносителя и поверхности микрочастицы, прикрепленной к микроносителю (р<0.05)

1

0,9

S 0,8

X

о

•С

и 0,6

о

X

О 0,5 ц

с

гс 0,4 х

и ф

т 0,В

О 0,2 ОД 0

□ Немодифицированные альгинатные микроносители

□ Альгинатные микроносители, модифицированные микрочастицами девитализированного межклеточного матрикса печени крысы породы \№гаг

Рисунок 9 - Сравнительная оценка адгезии клеток гепатокарциномы человека Hep G2 на альгинатных микроносителях, модифицированных или немодифицированных микрочастицами межклеточного матрикса децеллюляризованной печени крысы породы Wistar. Представлены значения стандартного отклонения для 5-ти независимых измерений.

Разработанная технология криоСЗНТ позволила выявить такие характеристики исследуемого объекта, как шероховатость поверхности, эффективная площадь поверхности о, определяющая степень развитости поверхности и параметр длины автокорреляции Li,

интерпретируемый как характерное расстояние, на котором формируется дисперсия измеряемых высот профиля трехмерного рельефа. На основе полученных данных, можно сделать вывод, что изделия из альгината, модифицированные микрочастицами из децеллюляризованного матрикса, способны мимикрировать среду для клеток, что позволяет улучшить их адгезию на альгинатных микрочастицах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанная новая технология криоСЗНТ для анализа структуры водосодержащих материалов и тканей позволяет получить изображения морфологии наноразмерных структур на поверхности изучаемого объекта после каждого выполненного сверхтонкого среза, при низких температурах (до -190°С). Получив массив последовательных двумерных изображений наномасштабной морфологии срезов замороженных образцов, данные преобразовываются в визуализированные трехмерные представления морфологии наноразмерных структур в заданном объеме. С помощью методики СЗНТ были исследованы и визуализированы трехмерные наноструктуры, топология, а также характеристики системы макро- и нанопор каркасных матриксов из фиброина шёлка и рекомбинантного спидроина. Было установлено, что несмотря на получение матриксов с помощью одного и того же метода выщелачивания, имеются существенные различия в их наноструктуре, а именно в размере пор, их сообщаемости и объеме пористости в целом. Таким образом, технология нанотомографии позволяет проводить анализы нанопористых материалов с разрешением в несколько десятков нанометров во всех трех плоскостях, что позволяет, исходя из уникальных данных об их наноструктуре, объяснять их биологические свойства. Результаты наших исследований продемонстрировали, что скорость адгезии и пролиферации фибробластов ЗТЗ на матриксах из фиброина шёлка и рекомбинантного спидроина отличается несущественно, в то время как в экспериментах с животными in vivo процесс костной регенерации в ране, заполненной спидроиновым матриксом, протекает быстрее, чем с фиброиновым. Для эффективности регенерации, плотность распределения и взаимосвязанность (перколяция) микро- и нанопор в матриксах, очевидно, имеют решающее значение. Взаимосвязанность структур между собой является необходимым условием для равномерного клеточного распределения и эффективного прорастания ткани in vivo, так как способствует активному газообмену, доставке питательных веществ, а также адекватному метаболизму. Изучение размеров, плотности распределения и взаимосвязанности нанопор может помочь в изготовлении матриксов с улучшенными биологическими свойствами. Наши результаты по изучению структуры альгинатных микроносителей показали, что альгинатные микросферы, модифицированные микрочастицами децеллюляризованного матрикса, имеют более выраженную шероховатость и площадь поверхности, чем немодифицированные, что, в совокупности с биохимическим изменением поверхности, определяет более активную адгезию клеток. Такие модифицированные альгинатные микросферы могут применяться в регенеративной медицине и тканевой инженерии в качестве биодеградируемых клеточных носителей. Учитывая, что модифицировать поверхность микросфер можно любым девитализированным матриксом, такая технология носит универсальный характер и таким образом позволяет изготавливать тканеспецифические носители, в зависимости от задач тканевой инженерии и регенеративной

медицины. Сканирующая зоидовая напотомография представляется одним из наиболее перспективных методов для исследования и визуализации трехмерных наноструктур, а также характеристики совокупности микро- и нанопор в биодеградируемых трехмерных конструкциях. Степень пористости, размер и взаимосвязанность пор, отношение площади их поверхности к занимаемому ими объему в подобных материалах могут оказывать заметное влияние на эффективность их использования для регенеративной медицины. Стоит отметить, что для эффективного применения методов СЗНТ и криоСЗНТ необходим подбор адекватных методик пробоподготовки и исследований для различных видов клеток и нативмых тканей, в связи с чем эту задачу можно назвать одной из важнейших, на которые необходимо обращать особое внимание при проведении подобных исследований.

ВЫВОДЫ

1. Разработан криогенный модуль для сканирующей зондовой нанотомографии для выполнения томографических исследований трехмерных наноразмерных структур водосодержащих материалов и тканей.

2. Технология сканирующей зондовой нанотомографии позволяет провести количественный наномасштабный анализ трехмерных параметров биоматриксов: размеры и степень объемной пористости и взаимосвязанности микро- и нанопор, а также шероховатость, длина авгокорелляции и эффективная площадь поверхностей.

3. Методом сканирующей зондовой нанотомографии обнаружены существенные различия в плотности и объеме нанопор каркасных матриксов: интегральная плотность нанопор и степень нанопористости составила для спидроина 46 рм~2 и 24%, для фиброина 2.4 рм"2 и 0.5%, соответственно.

4. Матрнксм из рекомбинантного спидроина с более высокой напопористостыо и взаимосвязанностыо пор, по сравнению с матриксами из фиброина шелка, обладают более высокой биологической активностью в экспериментах с восстановлением дефекта бедренной кости у крыс.

5. Разработан тканесиецифический мелкодисперсный матрикс из альгинатпых микросфер, поверхность которых модифицирована микрочастицами девитализированиой ткани печени.

6. Методом сканирующей зондовой нанотомографии в криогенных условиях установлено, что модификация поверхности альгинатных микросфер микрочастицами девитализированиой ткани печени сопровождается увеличением средних значений шероховатости, удельной эффективной площади и длины автокорреляции и составляет 212.4 нм, 1.205, и 246 нм соответственно. Модификация поверхности альгинатных микросфер повышает адгезию клеток гепатомы человека Нер 02 по сравнению с ^модифицированными микросферами.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При осуществлении пробоподготовки образцов водосодержащих материалов и тканей для сканирующей зондовой нанотомографии в криогенных условиях, в качестве крпопротектора рекомендуется использовать раствор сахарозы с концентрацией 2,3 М.

При создании новых биологических конструкций для тканевой инженерии и регенеративной медицины рекомендуется использовать технологии, повышающие наноструктурнроваппость изделий, что оказывает положительное влияние на адгезию клеток, а также на их биологическую активность in vivo.

Перспективы дальнейшей разработки темы Технология сканирующей зондовой нанотомографии как при комнатной температуре, так и в криогенных условиях, может быть использована для сравнительного анализа наноструктуры клеток и тканей в норме и при патологических состояниях, что позволит проводить углубленные клинико-диагностические исследования.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Efimov А.Е., Aganova О.1.. Agapov I.I. 3D nanostructiiral analysis of bioraaterials by scanning probe nanotomography. Advanced Materials: Techconnect Briefs 2015, P. 39-42.

2. Ефимов A.E., Агапова О.И.. Агапов И.И. Трехмерный структурный анализ биоматериалов при помощи сканирующей зондовой нанотомографии. Сборник тезисов V Международной Конференции «ФизтехБио» МФТИ. - 2015. - С. 29-30.

3. Teplenin A, Krasheninnikova A, Agladze N, Sidoruk К, Agapova О. Agapov I, Bogush V, Agladze К. Functional analysis of the engineered cardiac tissue grown on recombinant spidroin fiber meshes. PLoS One. 2015 Mar 23;10(3):e0121155. doi:10.1371/journal.pone.0121155. eCollection 2015. PubMed PMID: 25799394; PubMed Central PMCID: PMC4370870.

4. Агапова О.И.. Ефимов A.E., Мойсенович M.M., Богуш В.Г., Агапов И.И. Сравнительный анализ трехмерной наноструктуры пористых биодеградируемых матрнксов из рекомбипаптного спидроина и фиброина шелка для регенеративной медицины. Вестник трансплантологии. -2015.-№2.-С. 37-44.

5. Агапова О.И.. Дружинина Т.В., Трофимов К.В., Севастьянов В.И., Агапов И.И. Бподеградируемые пористые матриксы для регенерации костной ткани. Перспективные материалы. - 2015. - № 8. - С. 17-25.

6. Ефимов А.Е., Агапова О.И.. Агапов И.И. Сканирующий зондовый нанотомограф: особенности технических решений для анализа биомедицинскнх материалов при низких температурах. Медицинская техника. - 2015. - 3 (291). - С. 6-8.

7. Сафонова Л.А., Боброва М.М., Агапова О.И.. Котлярова М.С., Архипова А.Ю., Мойсенович М.М., Агапов И.И. Биологические свойства пленок из регенерированного фиброина шелка. Современные технологии в медицине. - 2015. - Том 7. - № 3. - С. 6-13.

8. Боброва М.М., Сафонова Л.А., Агапова О.И.. Крашенинников М.Е., Шагидулин М.Ю., Агапов И.И. Биологические и механические свойства децеллюляризованной ткани печени. Современные технологии в медицине. - 2015. - Том 7. - Ха 4. - С. 6-13.

9. Мойсенович М.М., Малюченко Н.В., Архипова А.Ю., Котлярова М.С., Гончаренко A.B., Агапова О.И.. Друцкая М.С., Васильева Т.В., Богуш В.Г., Агапов И.И., Кирпичников М.П. Новые ЗО-микроносители из рекомбинантного спидроина 119 для использования в регенеративной медицине. Доклады Академии наук. - 2015. - Том 463. - № 4. - С. 479-482.

Подписано в печать: 02.09.2015 Объём: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 шт. Заказ № 172 Отпечатано в типографии «Реглет» 125009, г. Москва, Страстной бульвар, д. 4 +7(495) 978-43-34; www.reglet.ru