Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Роль сосудистого эндотелиального фактора роста, инкорпорированного в поликапролактоновые графты, в формировании нового сосуда на месте имплантации

На правах рукописи

Севостьянова Виктория Владимировна

РОЛЬ СОСУДИСТОГО ЭНДОТЕЛИАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА, ИНКОРПОРИРОВАННОГО В ПОЛИКАПРОЛАКТОНОВЫЕ ГРАФТЫ, В ФОРМИРОВАНИИ НОВОГО СОСУДА НА МЕСТЕ ИМПЛАНТАЦИИ

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Кемерово-2015

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний»

Научные руководители: доктор медицинских наук Головкин Алексей Сергеевич

доктор медицинских наук, профессор Эльгудин Яков Львович

Официальные оппоненты: Салмина Алла Борисовна - доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В. Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра биологической химии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, заведующий

Майбородин Игорь Валентинович - доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» Сибирского отделения Российской академии наук, лаборатория стволовой клетки, главный научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера», г. Красноярск

Защита диссертации состоится «_»_2015 года в_часов на

заседании диссертационного совета Д 208.035.02 при ГБОУ ВПО КемГМА Минздрава России по адресу: 650029, г. Кемерово, ул. Ворошилова, 22а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КемГМА Минздрава России и на сайте www.kemsma.ru

Автореферат разослан «_»_

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор мед. наук, профессор

2014 г.

Разумов Александр Сергеевич

! РОССИЙСКАЯ

!ГОСУДАРСТВЕННАЯ 3

БИБЛИОТЕКА

---—-ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Артериальные реконструкции являются главным и наиболее действенным методом лечения заболеваний, связанных со значительным поражением коронарных и периферических кровеносных сосудов, но все же относятся к симптоматическим видам лечения и в большинстве случаев позволяют добиться лишь временного реваскуляризирующего эффекта (Бокерия Л.А., 2009). Кроме того, существует дефицит аутотрансплантатов, которые используются в качестве золотого стандарта для проведения шунтирующих операций (Seifu D.G., 2013). В связи с этим поиск альтернативного сосудистого имплантата привел к активному использованию для его создания подходов тканевой инженерии.

Основной целью сосудистой тканевой инженерии является создание полноценного кровеносного сосуда из клеток пациента in vitro - в биореакторе, имитирующем физиологические условия, или in situ - непосредственно в месте имплантации (Catto V., 2014). Практически во всех случаях в качестве основы для формирования сосудов выступает тканеинженерный пористый графт, изготовленный из биоматериалов природного или/и синтетического происхождения. Сосудистые графты имеют архитектуру, сходную с внеклеточным матриксом, и выполняют опорную и трофическую функции для клеток, что способствует формированию тканей (Has ana А., 2014). Многообещающие результаты по разработке и исследованию тканеинженерных графтов отражают высокий терапевтический потенциал данного подхода. Тем не менее прогрессу в данной области существенно мешают нежелательные особенности взаимодействия между клетками и биоматериалом, которые в ряде случаев приводят к хроническому воспалению, неконтролируемой клеточной пролиферации и фиброзу. Подобные реакции на биоматериал практически невозможно устранить с помощью лекарственных препаратов (Simionescu А., 2011). Однако решение данной проблемы может заключаться не в подавлении клеточного ответа на имплантат, а в направлении воспалительной реакции в сторону регенеративного процесса.

Степень разработанности темы исследования

В ряде исследований было показано, что процесс восстановления тканей можно регулировать с помощью биологически активных молекул (Schantz J.T.,

2007; Losi P., 2010; Thevenot P.T., 2010). Также было установлено, что среди биомолекул, которые могли бы способствовать формированию тканей кровеносного сосуда, наиболее перспективными являются ростовые факторы, стимулирующие ангиогенез (Guan J., 2007; Sharon J.L., 2008). Классическим представителем ангиогенных молекул является сосудистый эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial growth factor, VEGF), обладающий высокой специфичностью к эндотелиальным клеткам, стимулирующий их миграцию и пролиферацию, что может способствовать образованию эндотелиального слоя, который препятствует тромбообразованию, моделирует поток крови и сосудистое сопротивление, регулирует иммунные и воспалительные реакции (Lamalice L., 2007). Ранее была показана эффективность некоторых способов иммобилизацииVEGF на графтах для осуществления его локальной доставки, такие как ковалентное и электростатическое связывание с поверхностью (Zisch А.Н., 2001; Crombez М., 2005; Randone В., 2005). Однако до сих пор не разработаны сосудистые графты, обеспечивающие пролонгированный выход VEGF в место имплантации. В связи с этим отсутствует однозначное представление о роли этого ростового фактора в патогенезе воспалительной реакции на имплантируемый биоматериал и в формировании тканей кровеносного сосуда при имплантации графта в артериальное русло.

Цель исследования: оценить патогенетическую роль сосудистого эндотелиального фактора роста, инкорпорированного в графт из поликапролактона, в формировании нового кровеносного сосуда.

Задачи исследования:

1. Определить оптимальные физико-механические свойства и морфологию графта из поликапролактона с инкорпорированным сосудистым эндотелиальным фактором роста для создания структуры, максимально идентичной межклеточному матриксу.

2. Изучить влияние высвобождаемого из структуры графта сосудистого эндотелиального фактора роста на процессы адгезии и пролиферации эндотелиальных и мезенхимальных стволовых клеток in vitro.

3. Изучить особенности воспалительной реакции и ангиогенеза в условиях пролонгированной доставки сосудистого эндотелиального фактора роста при перитонеальной имплантации графтов из поликапролактона.

4. Определить патогенетическую и саногенетическую значимость пролонгирование высвобождаемого из поликапролактонного графта сосудистого эндотелиального фактора роста при имплантации в инфраренальный отдел аорты крыс.

Научная новизна исследования

Показано, что инкорпорирование сосудистого эндотелиального фактора роста в структуру графта из поликапролатона по разработанной технологии сопровождается патогенетически незначимым изменением физико-механических свойств материала и сохранением морфологии, наиболее соответствующей межклеточному матриксу, что в совокупности обеспечивает необходимое физиологическое взаимодействие с клетками организма и способствует регенерации тканей.

Установлено, что сосудистый эндотелиальный фактор роста пролонгирование высвобождается из разработанных поликапролактонных графтов с сохранением биологической активности в течение нескольких месяцев и способствует адгезии и пролиферации клеток, участвующих в регенерации кровеносного сосуда, на поверхности матриксов.

Экспериментально установлена патогенетическая значимость длительной непрерывной доставки сосудистого эндотелиального фактора роста, заключающаяся в усилении ангиогенеза на поликапролактонных матриксах.

Доказана возможность использования графта из поликапролактона с инкорпорированным сосудистым эндотелиальным фактором роста в качестве временного протеза сосуда, который заселяется клетками, синтезирующими компоненты межклеточного вещества, и по мере деградации замещается тканями кровеносного сосуда.

Установлено, что при имплантации в кровеносное русло графта из поликапролактона инкорпорированный сосудистый эндотелиальный фактор роста стимулирует ангиогенез в стенке протеза и сохраняет его проходимость, снижая тромбообразование.

Теоретическая и практическая значимость работы

Определены оптимальные параметры графта из поликапролактона с инкорпорированными молекулами сосудистого эндотелиального фактора роста для выполнения роли временного межклеточного матрикса.

Доказана эффективность использования сосудистого эндотелиального фактора роста для усиления адгезии и пролиферации клеток на поверхности графтов из поликапролактона, стимуляции ангиогенеза в их стенках, снижения тромбообразования и улучшения проходимости.

Полученные результаты являются основой для разработки эффективных методов стимуляции ангиогенеза с использованием биодеградируемых графтов.

Методология и методы исследования

Для достижения цели исследования изготовлены сосудистые графты из поликапролактона методом электроспиннинга, а также графты, содержащие сосудистый эндотелиальный фактор роста, проведены их физико-механические испытания и сканирующая электронная микроскопия поверхности. Для оценки высвобождения сосудистого эндотелиального фактора роста, его биологической активности и влияния на регенерацию тканей проведены культуральные работы, имплантация графтов интраперитонеально и в брюшную часть аорты крыс, а также гистологические и гистохимические исследования эксплантированных образцов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Графты из поликапролактона обладают физико-механическими свойствами и морфологией, характерными для межклеточного матрикса. Инкорпорирование молекул сосудистого эндотелиального фактора роста в графт из поликаролактона приводит к незначительному снижению прочности и эластичности материала с сохранением пористой структуры. Пролонгированное высвобождение сосудистого эндотелиального фактора роста обеспечивает адгезию эндотелиальных и мезенхимальных стволовых клеток и стимулирует пролиферацию эндотелиальных клеток в условиях in vitro.

2. Графт из поликапролактона с инкорпорированным сосудистым фактором роста при перитонеальной имплантации вызывает воспалительную реакцию тканей, типичную для биосовместимых материалов. Выделяемый сосудистый эндотелиальный фактор роста стимулирует ангиогенез в пористом полимерном материале. Поликапролактонный графт с сосудистым эндотелиальным фактором роста, имплантированный в артериальное русло крысы, заселяется клетками, ростовой фактор обеспечивает васкуляризацию стенки графта и улучшение его проходимости.

Степень достоверности результатов

О достоверности результатов диссертационного исследования свидетельствуют достаточно представительный объем экспериментального материала, широкий спектр проведенных лабораторных исследований, неоднократно повторенные испытания in vitro, использование современных методов исследования и статистической обработки полученных результатов. Автор непосредственно участвовала в получении исходных данных.

Апробация материалов диссертации

Результаты настоящего исследования были доложены и обсуждены на Международном молодежном научном форуме «Ломоносов-2011» (11-15 апреля 2011, г. Москва), инновационном конвенте «Кузбасс: образование, наука, инновации» (19-20 ноября 2011, г. Кемерово), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы лабораторной диагностики и биотехнологии» (13-14 сентября 2012, г. Кемерово), инновационном конвенте «Кузбасс: образование, наука, инновации» (22 23 ноября 2012, г. Кемерово), 1-м Национальном конгрессе по регенеративной медицине (4-6 декабря 2013, г. Москва), научной школе молодых ученых «Современная биология и биотехнологии будущего» (26 января 1 февраля 2014, г. Москва), VII Всероссийском съезде трансплантологов (28-30 мая 2014, г. Москва).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 2 в изданиях, рекомендованных ВАК для опубликования материалов диссертаций на соискание ученой степени. Получен 1 патент.

Объем и структура диссертации

Диссертация объемом 134 страницы печатного текста написана на русском языке, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 3 глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и практических рекомендаций. Диссертация содержит 2 таблицы, иллюстрирована 24 рисунками. Указатель использованной литературы содержит 5 работ отечественных и 219 работ иностранных авторов.

Личный вклад автора

Анализ литературы по теме диссертации, изготовление сосудистых графтов методом электроспиннинга, проведение исследований in vitro с

использованием культуральных методов, эксперименты на лабораторных животных, оценка результатов и статистическая обработка данных, написание диссертации и статей выполнены лично автором. Исследования физико-механических свойств и морфологии графтов, имплантация графтов в аорту крыс, а также гистологические анализы проведены совместно с сотрудниками НИИ КПССЗ: канд. биол. наук Т.В. Глушковой, канд. мед. наук Д.Е. Фи-липьевым, канд. мед. наук А.Ю. Бураго и мл. науч. сотр. Г.Ю. Васюковым.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования. Исследование проведено на самцах крыс популяции Wistar массой 250-300 г (п=60) при перитонеальной имплантации матриксов и 400-450 г (п=10) при имплантации графтов в инфраренальный отдел аорты. Животных содержали в условиях вивария на полном рационе питания. Опыты проводили, соблюдая принципы гуманного обращения с животными, регламентированные требованиями Европейской конвенции (Страсбург, 1986). Животных вводили в наркоз 3 % изофлураном. Во время операции все животные получали ингаляционный наркоз 1,5 % изофлурана. Эвтаназию осуществляли в камере с углекислым газом.

Сосудистые графты изготавливали из синтетического биодеградируемого полимера поликапролактона (polycaprolactone, PCL) с молекулярной массой 80000 (Sigma-Aldrich, США). В PCL графты инкорпорировали рекомбинантный сосудистый эндотелиальный фактор крысы-А (R&D Systems, США), лиофилизированный в фосфатно-солевом буфере (Gibco, США) до концентрации 1 мкг/мл.

Изучение морфологии и патогенеза воспаления при внутрибрюшной имплантации графтов, Матриксы (1><2 см2) вырезали из PCL и PCL с VEGF графтов диаметром 4 мм и имплантировали в брюшную полость крысам. Через 2, 3 и 4 месяца животных выводили из эксперимента. Матриксы выделяли с прилежащими тканями и проводили гистологическое исследование с окраской гематоксилином и эозином. Количество кровеносных сосудов определяли гистохимической окраской с антителами к CD31 крыс (Spring Bioscience, USA).

Графты из PCL и PCL с VEGF диаметром 2 мм и толщиной стенки -100 мкм имплантировали в инфраренальную часть аорты крыс. Контроль

проходимости графтов осуществляли ультразвуковым исследованием с доппле-рометрией каждые 2 месяца. Спустя 10 месяцев графты выделяли с прилежащими участками аорты. Образцы оценивали макроскопически и световой микроскопией с окраской гематоксилином и эозином и по Ван-Гизону.

Перед имплантацией сосудистых графтов определяли оптимальные режимы их изготовления, оценивали кинетику выхода ростового фактора, его биоактивность и способность оказывать влияние на клетки в условиях in vitro.

Изготовление сосудистых графтов. PCL графты диаметрами 2 и 4 мм изготавливали методом электроспиннинга на приборе Nanon-OIA (МЕСС СО, Япония) с использованием растворов полимера в хлороформе в концентрациях 10, 12, 14 и 16 % при напряжениях 15 и 25 кВ, скорости подачи раствора -1 мл/ч, расстояния до коллектора - 15 см, коллекторов-штифтов диаметром -2 и 4 мм. Для инкорпорирования молекул ростового фактора в полимерное волокно раствор PCL выбранной концентрации смешивали с раствором VEGF в соотношении 20:1 и проводили электроспиннинг при выбранном напряжении.

Определение физико-механических свойств сосудистых графтов. Данное исследование осуществляли с использованием универсальной испытательной машины «Zwick/roell» - 2.5Н (Германия) в соответствии с ГОСТ 270-75. Прочность оценивали по максимальному напряжению при растяжении, упругодеформативные свойства - по относительному удлинению до нарушения целостности образца и модулю упругости (Емод).

Исследование морфологии сосудистых графтов. Образцы PCL и PCL с VEGF графтов размером 0,5*0,5 см покрывали золотым токопроводящим напылением толщиной в 30 нм и далее изучали на сканирующем электронном микроскопе S3400N (Hitachi, Япония).

Определение кинетики выхода ростового фактора из PCL графтов. Из PCL графтов с VEGF диаметром 4 мм вырезали кусочки 1*2 см2 и обрабатывали 70 % этиловым спиртом, а затем фосфатно-солевым буфером. Каждый образец помещали в пробирки с объемом 1,5 мл и инкубировали при 37 °С и 5 % С02. Через 12, 24, 48 часов и далее через каждые 48 часов в течение 80 суток, из пробирок отбирали 200 мкл раствора и восстанавливали исходный объем свежим буфером. В собранных образцах определяли содержание ростового фактора с наборами для иммуноферментного анализа VEGF (R&D System, США).

Исследование биологической активности VEGF после выхода из графта. В 96-луночный культуральный планшет помещали эндотелиальные клетки человека перевиваемой линии ЕА.Ну 926, которая была любезно предоставлена Dr. Cora-Jean С. Edgell из Университета Северной Каролины, по 4000 на лунку и инкубировали 24 часа в питательной среде. После чего к клеткам добавляли по 150 мкл буферного раствора, инкубированного с графтом PCL с VEGF в течение 12, 24, 48 часов и далее каждые 48 часов до 80 суток. Пролиферацию эндотелиальных клеток оценивали через 72 часа с помощью МТТ-теста (Yang X., 2006).

Оценка способности сосудистых графтов адгезировать клетки. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) костного мозга крысы и эндотелиальные клетки человека линии ЕА.Ну 926 культивировали на плоских образцах PCL и PCL с VEGF (1,93 см2) в 24-луночном планшете. Количество клеток оценивали через 2, 4 и 6 суток при окрашивании флуоресцентным красителем РКН26 (Sigma-Aldrich, США) и изучении на инвертированном микроскопе Axio Observer ZI (Carl Ziess, Германия) с модулем АроТоше.

Статистические методы. Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ «STATISTICА 6.0» (StatSoft Inc., США). Нормальность распределения оценивали при помощи критерия Колмогорова - Смирнова. Достоверность различий определяли непараметрическими критериями Манна - Уитни и Краскела - Уоллиса. Различия считали статистически значимыми при р<0,01 и р<0,05. Данные представлены в виде среднее±стандартная ошибка среднего для данных, имеющих нормальное распределение, или как медиана и 25-й и 75-й про-центили (25 %<Ме<75 %) для распределения, отличного от нормального.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Зависимость свойств PCL графтов от параметров элекгроспиннинга.

Установлено, что наибольшей прочностью и эластичностью обладали графты из 14 и 16 % растворов PCL как при напряжении 15 кВ, так и 25 кВ (Таблица 1). Наименьшие прочность и эластичность имели графты из 10 % PCL.

Таблица 1 - Физико-механические свойства сосудистых графтов, изготовленных при различных концентрациях PCL

Концентрация полимера Напряжение, кВ Прочность, МПа Ме (25 %; 75 %) Относительное удлинение, % Ме (25 %; 75 %) Емод, Н/ммг Ме (25 %; 75 %)

PCL 10% (п-10) 15 0,34 (0,30; 0,40) 109,0 (109,0; 120,3) 0,74 (0,74; 1,05)

25 1,57 (1,49; 1,75) 249,9 (168,8; 262,9) 2,07 (1,74; 2,42)

PCL 12 % (п-10) 15 2,35 (2,15; 2,44) 478,5 (315,5; 739,4) 1,81 (1,42; 2,33)

25 1,96 (1,81:2,48) 305,0 (261,6; 345,3) 1,13 (0,94; 1,92)

PCL 14 % (п-10) 15 2,64* (2,40; 2,81) 669,2* (589,2; 849,1) 1,92 (1,41; 2,13)

25 3,09** (2,75; 3,49) 609,2** (588,3; 632,2) 1,65 (1,56; 1,95)

PCL 16% (п-10) 15 2,34* (3,23; 2,88) 564,7* (488,6; 632,7) 2,00 (1,90; 2,84)

25 3,41** (3,23; 3,42) 617,1** (604,6; 638,1) 2,01 (1,93; 2,51)

Ксенопротез (п-10) - 1,26*** (0,85; 1,42) 95,4*** (79,8; 100,6) 0,28*** (0,24; 0,34)

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с PCL 10 % при 15кВ

** - р<0,05 по сравнению с PCL 10 % и 12 % при 25кВ *** - р<0,05 сравнению с PCL 14 % и 16 % при 15 и 25 кВ

Разницы по упругости материала между всеми группами графтов из PCL не отмечали (р>0,05). Кроме того, значения упругодеформативных свойств PCL графтов, изготовленных из 14 и 16 % полимера, превышали данные показатели для сосудистых ксенопротезов из грудной артерии крупного рогатого скота, консервированных диглицидиловым эфиром этиленгликоля (р<0,05).

Изучение PCL графтов с помощью сканирующей электронной микроскопии показало, что средний диаметр волокон при напряжении 15 кВ составил 446 нм, 1,78 мкм, 2,01 мкм, 2,74 мкм и при 25 кВ - 840 нм, 1,12 мкм, 2,62 мкм, 2,68 мкм для концентраций 10, 12, 14 и 16 % соответственно. Полученные результаты свидетельствовали об увеличении диаметра волокна с возрастанием концентрации раствора PCL (Рисунок 1).

10% PCL

12% PCL

14% PCL

:* ** *

□ 15 kB И 25 kB

16% PCL

* p<0,01 относительно 10 и 12 % PCL при 15 и 25 kB ** р<0,01 относительно 14 % PCL при 15 кВ

Рисунок 1 - Зависимость диаметра волокна от концентрации PCL при напряжении электроспиннинга 15 и 25 кВ

Изменение режимов электроспиннинга оказало влияние и на однородность полимерных волокон. Так, волокна из 10 % раствора PCL при напряжении 15 и 25 кВ имели большое количество утолщений. В свою очередь, в графтах из 12 % полимера дефекты волокна были менее выражены. А на образцах из 14 % и 16 % PCL утолщений и других нарушений структуры волокон выявлено не было. Среди образцов с оптимальной морфологией меньший диаметр волокна имели графты из 14 % PCL при 15 кВ (р<0,01).

Таким образом, достаточная прочность и эластичность, а также высокопористая структура PCL графтов, изготовленных из 14 и 16 % растворов PCL, делают их близкими по свойствам к межклеточному матриксу. PCL графт, изготовленный из 14 % раствора PCL при 15 кВ был выбран для дальнейшего исследования - инкорпорирования сосудистого эндотелиального фактора роста (vascular endothelial growth factor, VEGF).

Влияние инкорпорирования VEGF в PCL на структуру и прочностные свойства сосудистого графта. Введение в структуру полимерного волокна молекул VEGF привело к значительному изменению морфологии PCL графта. Волокна варьировались по диаметру от 0,142 до 10,714 мкм, при этом размер полимерных нитей в образцах из чистого PCL в среднем составлял 2,521±0,490 мкм. Однако волокна, содержащие ростовой фактор, имели ровную поверхность без выраженных деформаций и образовывали необходимую пористую структуру, имитирующую нативный внеклеточный матрикс.

Инкорпорирование VEGF в PCL привело к снижению показателей прочности, а также упругодеформативных свойств материала (Таблица 2). Так, показатель прочности уменьшался до 1,13 Мпа, эластичности - до 175,10 %, а модуль Юнга составил 1,40 Н/мм2. Тем не менее по своим физико-механическим свойствам PCL графты с VEGF не уступали используемым на сегодняшний день сосудистым ксенопротезам (р>0,05).

Таблица 2 - Физико-механические свойства сосудистых графтов

Графт Прочность, МПа Ме (25 %; 75 %) Относительное удлинение, % Ме (25 %; 75 %) Емод, Н/мм2 Ме (25 %; 75 %)

PCL (п=10) 2,64* (2,40; 2,81) 669,2* (589,2; 849,1) 1,92* (1,41;2,13)

PCL с VEGF (п=10) 1,13 (1,11; 1,24) 175,10 (154,62; 182,54) 1,40 (1,20; 1,49)

Ксенопротез (п=10) 1,26 (0,85; 1,42) 95,4 (79,8; 100,6) 0,28 (0,24; 0,34)

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с ксенопротезом

Таким образом, анализ результатов показал существенное влияние инкорпорирования молекул VEGF в структуру PCL на толщину волокна с сохранением высокопористой структуры материала. В то же время графты, полученные методом двухфазного электроспиннинга, имеют оптимальные физико-механические свойства, что сделало возможным их исследование в качестве временных матриксов для регенерации тканей кровеносного сосуда.

Выход молекул VEGF из PCL графтов и их биоактивность.

Установлено, что выделение VEGF из графта происходило на протяжении всего эксперимента, при этом за 80 дней из матрикса выделилось 531,88 пг ростового фактора (Рисунок 2). В первые четыре дня отмечали значительный выброс биологически активных молекул - около 207 пг. Далее выделение ростового фактора в раствор происходило равномерно — 30,08±2,82 пг в 4 дня.

пг

Рисунок 2 - Динамика накопления VEGF в буфере (80 суток)

Ростовой фактор, выделившийся из полимерного материала за первые двое суток, не оказывал выраженного влияния на пролиферацию эндотелиальных клеток по отношению к отрицательному контролю. Значительной биологической активностью (р<0,01) обладала инкубационная среда с раствором VEGF, вышедшим в течение 4 суток, по сравнению с контрольной средой, а также фосфатно-солевым буфером, взаимодействовавшим с графтом в течение 2 суток. Усиление митогенного действия на эндотелиальные клетки происходило с увеличением времени инкубации PCL графтов с VEGF в растворе. Наибольший уровень пролиферации клеток отмечался в среде с добавлением раствора, контактировавшего с образцом в течение 80 суток.

Таким образом, анализ полученных результатов показал, что PCL графты с VEGF способны обеспечить высвобождение ростового фактора в окружающую среду как минимум в течение первых 80 суток. Выход ростового фактора происходит из глубоких пор полимерного волокна и в процессе деградации PCL. После выхода ростовой фактор сохраняет биологическую активность, стимулируя пролиферацию эндотелиальных клеток.

Влияние VEGF на способность PCL графтов адгезировать клетки.

Результаты культивирования клеток на графтах показали адгезию МСК к образцам из PCL как чистым, так и с ростовым фактором. Однако число клеток на обоих видах полимерных материалов было меньше по сравнению с МСК на поверхности планшетов после 2 суток культивирования (Рисунок 3).

клеток в поле

зрения 300

250

200 -

150 -

100 -

50 -0

2 суток

4 суток

6 суток

□ Без матрикса

□ PCL

я PCL с VEGF

* - р<0,01 относительно образцов, культивированных без матрикса 2 суток ** - р<0,01 относительно образцов, культивированных без матрикса 4 суток *** - р<0,01 относительно образцов, культивированных без матрикса 6 суток Рисунок 3 - Количество МСК на PCL графтах и на PCL графтах с VEGF через 2, 4 и 6 суток культивирования

При этом не было обнаружено достоверных различий между матриксами из PCL и PCL с VEGF (р>0,01). В течение всего исследования не наблюдали значительного роста клеточной культуры на обоих видах графтов по сравнению с контролем. К 6-м суткам количество клеток в контроле превышало число клеток на PCL в 7 раз и на PCL с VEGF - в 4,3 раза. При этом на PCL графтах без ростового фактора МСК располагались преимущественно на поверхности, а на графтах с VEGF клетки находились не только на поверхности, но и проникали в глубину матрикса между волокнами.

Эндотелиальные клетки адгезировались к PCL и PCL с VEGF графтам после двух суток культивирования. Разницы в количестве клеток между двумя видами материала не было обнаружено (Рисунок 4). Со 2-х до 4-х суток количество клеток на обоих полимерных образцах увеличивалось. На матриксах из PCL рост клеточной культуры был незначительным - со 183 до 297,5 клетки в поле зрения, а на PCL с VEGF наблюдали выраженную

пролиферацию с возрастанием числа ЕА.Ну 926 со 141,5 до 632,5 клетки в поле зрения. Через 4 дня их число на PCL графтах, содержащих VEGF, превышало данный показатель на чистых PCL матриксах в 2,1 раза. Такая же картина наблюдалась и через 6 суток. Среднее количество клеток на образцах с ростовым фактором составляло 1 384 клетки в поле зрения, что было в 2,2 больше данного показателя на этом же виде матрикса на 4-е сутки эксперимента. Кроме того, наличие VEGF в структуре PCL способствовало увеличению числа клеток на материале в 3,3 раза по сравнению с чистыми PCL образцами. На 6-е сутки клетки полностью покрывали матрикс с VEGF, а также инфильтрировали во внутренние слои.

клеток в поле

зрения 1600 1400 ■ 1200 1000 800 600 400 ■ 200 0

□ Без маггрикса

□ PCL

П PCL с VEGF

2 суток

4 суток

6 суток

* - р<0,01 относительно образцов, культивированных без матрикса 2 суток ** - р<0,01 относительно образцов, культивированных без матрикса и на PCL 4 суток *** - р<0,01 относительно образцов, культивированных без матрикса и на PCL 6 суток Рисунок 4 - Количество эндотелиальных клеток ЕА.Ну 926 на PCL графтах и на PCL графтах с VEGF через 2, 4 и 6 суток культивирования

В отличие от МСК, эндотелиапьные клетки проникали через поры в толщу матрикса не только на образцах с ростовым фактором, но также и из PCL, не содержащего биомолекул.

Таким образом, анализ полученных данных позволяет заключить, что графты из PCL способствуют слабой адгезии МСК и эндотелиальных клеток. Введение VEGF в структуру PCL графта обеспечивает быстрый рост культуры эндотелиальных клеток на его поверхности и приводит к увеличению волокон и пор материала, что, в свою очередь, способствует его инфильтрации как эндотелиальными клетками, так и более крупными МСК.

Морфология и патогенез воспалительной реакции на PCL графт после введения ростового фактора. Гистологическое исследование PCL и PCL с VEGF графтов, а также окружающих их тканей показало инфильтрацию всех образцов грануляционной тканью, содержащей гигантские многоядерные клетки, фибробласты, единичные макрофаги и внеклеточный матрикс, состоящий из коллагеновых и эластиновых волокон. Образование капсулы из соединительной ткани вокруг имплантатов происходило ко второму месяцу исследования. Фиброзная капсула вокруг полимерных образцов с ростовым фактором и без него имела небольшую толщину. Признаков острого воспаления не было отмечено ни в одном из случаев.

Оценка ангиогенных свойств показала, что ко второму месяцу на PCL графтах с ростовым фактором количество капилляров превышало аналогичный показатель на чистых PCL образцах (р<0,01) (Рисунок 5). К 3-му и 4-му месяцам исследования количество капилляров на PCL с VEGF достоверно увеличивалось (р<0,01). При этом через 3 месяца на графтах с ростовым фактором обнаружены кровеносные сосуды с диаметром, превышающим диаметр капилляра. Различий по количеству капилляров на матриксах без VEGF между 2, 3 и 4-м месяцами исследования не отмечали (р>0,05).

капилляров / мм2 150-,

100 ■

50 •

0 -

2 месяца 3 месяца 4 месяца

* - р<0,01 относительно PCL через 2 месяца имплантации ** -р<0,01 относительно PCL через 3 месяца имплантации *** - р<0,01 относительно PCL через 4 месяца имплантации Рисунок 5 - Количество капилляров на PCL и PCL с VEGF графтах через 2, 3 и 4 месяца после внутрибрюшной имплантации

Таким образом, анализ результатов показал, что PCL и PCL с VEGF графты вызывают ответную реакцию организма на инородное тело с образованием грануляционной ткани и последующим ее созреванием в фиброзную ткань, что является характерным для биосовместимых материалов.

I I

□ PCL

■ PCL+VEGF

При этом выделение ростового фактора в месте имплантации не оказывает влияния на скорость протекания процессов воспаления и регенерации тканей. Однако инкорпорирование ростового фактора в PCL графты способствует усилению ангиогенеза на протяжении 4 месяцев.

Проходимость PCL графта с VEGF и формирование на его основе кровеносного сосуда. Сосудистые графты из PCL и PCL с VEGF с внутренним диаметром 2 мм были удобны в имплантации и прочно удерживали шовный материал. Результаты ультразвукового мониторинга с допплерометрией через 1, 3, 5, 7 и 10 месяцев после имплантации показали проходимость всех протезов. При макроскопическом исследовании эксплантированных графтов не было обнаружено кровотечений и видимых повреждений стенки. В обеих группах животных на продольном разрезе графтов отмечали образование внутренней выстилки, 1раница между имплантатом и нативной аортой в зоне анастомоза не визуализировалась.

Гистологический анализ образцов показал наличие пристеночного тромба в PCL графтах без ростового факгора, препятствующего току крови (Рисунок 6).

1 - PCL, окраска гематоксилином и эозином; 4 - PCL с VEGF, окраска по Ван-Гизон;

2 - PCL, окраска по Ван-Гизон; а - стенка графта;

3 - PCL с VEGF, окраска гематоксилином и б - тромб.

эозином;

Рисунок 6 - Сосудистые графты через 10 месяцев после имплантации в брюшную аорту крысы, увеличение х50

В свою очередь, в PCL графтах, содержащихVEGF, имелся пристеночный тромб в зоне анастомоза с сохранением просвета сосудистого протеза. Стенка графтов в обеих группах животных была полностью инфильтрирована макрофагами и миофибробластами. Клеточная инфильтрация сопровождалась деградацией полимера и накоплением межклеточного вещества (коллагена, эластина). В стенке сосудистых графтов с УЕОРотмечали большое количество кровеносных сосудов, заполненных эритроцитами. Ни в одном из образцов не было участков острого воспаления.

Таким образом, на основании анализа полученных данных можно заключить, что при имплантации в кровеносное русло сосудистые графты из поликапролактона и поликапролактона с сосудистым эндотелиальным фактором роста заселяются клетками, синтезирующими межклеточный матрикс, который замещает полимер в местах деградации и способствует поддержанию механических свойств имплантата. Пролонгированный выход сосудистого эндотелиапьного фактора роста, инкорпорированного в поликапролактон, стимулирует ангиогенез в стенке графта и сохраняет его проходимость.

ВЫВОДЫ

1. Сосудистые графты из поликапролактона, изготовленные методом электроспиннинга, характеризуются высокими показателями прочности, упругодеформативных свойств и морфологией, имитирующей межклеточный матрикс. Оптимальным режимом изготовления является использование 14 % раствора поликапролактона в хлороформе при напряжении 15 кВ. Введение в полимер сосудистого эндотелиального фактора роста приводит к патогенетически незначительному снижению прочности и эластичности материала с сохранением пористой структуры.

2. Сосудистый эндотелиальный фактор роста высвобождается из поликапролактона пролонгированно с сохранением биологической активности, что способствует усилению адгезии эндотелиальных и мезенхимальных стволовых клеток на поверхности графтов и стимулирует пролиферацию эндотелиальных клеток в условиях in vitro.

3. При перитонеальной имплантации графт из поликапролактона с инкорпорированным сосудистым эндотелиальным фактором роста развивается

воспалительная реакция, которая не отличается от таковой при имплантации биосовместимых материалов, а пролонгированно выделяемый ростовой фактор стимулирует ангиогенез в графте, что проявляется в значительном увеличении количества капилляров по сравнению с графтами без сосудистого эндоте-лиального фактора роста.

4. При пролонгированном высвобождении сосудистого эндотелиального фактора роста из поликапролактонного графта, имплантированного в инфраренальный отдел аорты крысы, происходит заселение клетками и стимуляция ангиогенеза в стенке графта, что обеспечивает формирование кровеносного сосуда и улучшение его проходимости по сравнению с графтом без ростового фактора.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для стимуляции регенерации кровеносного сосуда на основе полимерного биодеградируемого графта рекомендуется пролонгированная доставка сосудистого эндотелиального фактора роста в место имплантации, которая может быть обеспечена инкорпорированием ростового фактора в полимер.

Инкорпорирование молекул ростового фактора в графт для осуществления их пролонгированного высвобождения целесообразно проводить методом двухфазного электроспиннинга с использованием раствора поликапролактона, смешанного с раствором биологических молекул в фосфатно-солевом буфере в соотношении 20:1.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Работы, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК

1. Свойства тканеинженерных матриц из поликапролактона, импрегнированных ростовыми факторами VEGF и bFGF / B.B. Севостьянова, Y.L. Elgudin, G. Wnek и др. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2012. Т. 7, № 4. - С. 62-67. (0,5 п. л.)

2. Выбор оптимальных параметров электроспиннинга для изготовления сосудистого графта малого диаметра из поликапролактона / В.В. Севостьянова, A.C. Головкин, Д.Е. Филипьев и др. // Фундаментальные исследования. 2014. №10. С. 180- 184. (0,42 п. л.)

Работы, опубликованные в рецензируемых журналах

3. Стимуляция ангиогенеза матрицами из поликапролактона, содержащими VEGF / B.B. Севостьянова, Г.Ю. Васюков, В.В. Борисов и др. // Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. - 2013. - № 4. -С. 28-34. (0,58 п. л.)

Патент

4. Тканеинженерный сосудистый графт малого диаметра и способ его изготовления: пат. 2496526 Рос. Федерация: МПК51 А 61 L 27/58, А 61 L 33/06, А61 F 2/06 / JI.C. Барбараш, Я.Л. Эльгудин, В.В. Севостьянова, A.C. Головкин; заявитель и патентообладатель ФГБУ «НИИ комплексных проблем сердечнососудистых заболеваний» СО РАМН. - № 2012113439/15; заявл. 06.04.2012; опубл. 27.10.2013, Бюл. № 30. - 5 с.

Материалы конференций

5. Испытание тканеинженерного биодеградирующего графта в качестве протеза кровеносного сосуда in vivo / В.В. Севостьянова, Y.L. Elgudin, G. Wnek и др. // Стволовые клетки и регенеративная медицина: сборник тезисов Всероссийской научной школы конференции. - М., 2010. - С. 67-68. (0,17 п. л.)

6. Севостьянова, В.В. Создание биодеградирующей полимерной матрицы с инкорпорированными ростовыми факторами методом двухфазного элеюроспиннинга [Электронный ресурс] / В.В. Севостьянова // XVIII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» : материалы конф. - М., 2011. - С. 32-33. (0,17 п. л.)

7. Двухфазный электроспиннинг для создания тканеинженерных матриц на основе поликапролактона / В.В. Севостьянова, Y.L. Elgudin, G. Wnek и др. // Инновационный конвент «Кузбасс: образование, наука, инновации» : материалы конвента. - Кемерово, 2011. - Т. 2. - С. 79-82. (0,33 п. л.)

8. Оценка возможности применения графта из поликапролактона в качестве протеза кровеносного сосуда / В.В. Севостьянова, Т.В. Глушкова, Y.L. Elgudin и др. // Актуальные проблемы лабораторной диагностики и биотехнологий : материалы Всероссийской науч.-практ. конф. - Кемерово, 2012.-С. 89-90. (0,17 п. л.)

9. Свойства тканеинженерного сосудистого графта малого диаметра из поликапролактона / В.В. Севостьянова, Т.В. Глушкова, Ю.А. Кудрявцева и др. // Инновационный конвент «Кузбасс: образование, наука, инновации» : материалы конвента. - Кемерово, 2012. - Т. 2. - С. 91-93. (0,25 п. л.)

10. Экспериментальная оценка новых биодеградируемых сосудистых протезов из поликапролактона / Д.Е. Филипьев, В.В. Севостьянова, A.C. Головкин и др. // XXVIII Международная конференция «Ангиология и сосудистая хирургия» : материалы конф. - Новосибирск, 2013. - Т. 19. - Прил. - С. 385386. (0,17 п. л.)

11. Биодеградируемые тканеинженерные матрицы для контролируемой доставки VEGF / В.В. Севостьянова, Г.Ю. Васюков, В.В. Борисов и др. // Инновационный конвент «Кузбасс: образование, наука, инновации» : материалы конвента. - Кемерово, 2013. - Т. 2. - С. 301-303. (0,25 п. л.)

12. Оценка свойств сосудистого графта из поликапролактона, содержащего VEGF / В.В. Севостьянова, Г.Ю. Васюков, В.В. Борисов и др. // 1-й Национальный конгресс по регенеративной медицине: материалы конгр. - М., 2013. -С. 230. (0,08 п. л.)

13. Биодеградируемые протезы малого диаметра, экспериментальное исследование / Д.Е. Филипьев, В.В. Севостьянова, A.C. Головкин и др. // Сердечно-сосудистые заболевания. Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН : материалы Всероссийского съезда. - М., 2013. - Т. 14, № 6. - Прил. -С. 250. (0,08 п. л.)

14. Биодеградируемые графты для регенерации кровеносного сосуда, содержащие молекулы VEGF и bFGF / В.В. Севостьянова, A.C. Головкин, Д.Е. Филипьев и др. // Вестник трансплантологии и искусственных органов : материалы Всероссийского съезда. - М., 2014. - Прил. - С. 275. (0,08 п. л.)

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

PCL - polycaprolactone, поликапролактон VEGF - vascular endothelial growth factor,

сосудистый эндотелиальный фактор роста MCK - мезенхимальные стволовые клетки

Подписано в печать 16.12.2014. Формат 60*84'/|б. Бумага офсетная № 1. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,2. Тираж 100 экз. Заказ № 371

Адрес издательства и типографии «АИ Кузбассвузиздат»: 650099, г. Кемерово, пр. Советский, 60Б. Тел. 8 (3842) 58-29-34, т/факс 36-83-77. E-mail: 58293469@mail.ru, vuzizdat@gmail.coni

1Ъ

20142501

75

2014250175