Иммуномодулирующее и противовирусное действие растительных полиизопреноидов при экспериментальных вирусных инфекциях.

Кожевникова, Татьяна Николаевна

Диссертации по медицине → Аллергология и иммулология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуномодулирующее и противовирусное действие растительных полиизопреноидов при экспериментальных вирусных инфекциях.

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Иммуномодулирующее и противовирусное действие растительных полиизопреноидов при экспериментальных вирусных инфекциях. - тема автореферата по медицине

Кожевникова, Татьяна Николаевна Москва 2008 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.36

Автореферат диссертации по медицине на тему Иммуномодулирующее и противовирусное действие растительных полиизопреноидов при экспериментальных вирусных инфекциях.

Кожевникова Татьяна Николаевна

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ И ПРОТИВОВИРУСНОЕ ДЕЙСТВИЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ ПОЛИИЗОПРЕНОИДОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ

14.00.36 - аллергология и иммунология 03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2008

003447451

Работа выполнена в ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи РАМН и в ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН.

Научные руководители:

Д.б.н., проф. Санин Александр Владимирович Д.б.н. Ожерелков Сергей Викторович

Официальные оппоненты:

Д.м.н., проф. Земсков Владимир Михайлович

Д.м.н., проф. Дерябин Петр Григорьевич

Ведущая организация: ФГУН МНИИЭМ им.Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

Защита диссертации состоится" ^ " октября 2008 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 001.007.01 при ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН ( 123098 г. Москва, ул. Гамалеи 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан

сентября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета д.м.н., проф.

Кожевникова Татьяна Николаевна

14.00.36 - аллергология и иммунология 03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2008

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы:

Интенсивность противовирусного иммунитета определяется сложной системой межклеточных и медиаторных отношений, зависящей от иммунного статуса организма и особенностей конкретного возбудителя. Несмотря на то, что в настоящее время для лечения и профилактики социально значимых вирусных инфекций используется достаточно большое количество иммуномодуляторов и противовирусных препаратов (циклоферон, виферон, кагоцел, ридостин и др.), разработка и изучение новых препаратов (особенно - природного происхождения), обладающих противовирусными свойствами и повышающих резистентность к вирусным инфекциям, по-прежнему является актуальной задачей (Ершов Ф.И., 2006 г.).

Это связано с целым рядом обстоятельств, к важнейшим из которых следует отнести: недостаточную изученность механизмов действия многих известных препаратов на гуморальное и клеточное звено противовирусного иммунитета, на репродукцию и инфекционность вирусов, а также отсутствие у многих препаратов антивирусной активности непосредственно на этапах взаимодействия вирус-клетка. В частности, остается малоизученным влияние препаратов на основе растительных полиизопреноидов на синтез белков - иммуногенов вирусов.

В предыдущих исследованиях было показано, что фосфорилированные полиизопреноиды хвои сосны обладают противовирусной активностью в отношении вирусов иммунодефицита человека, гепатитаА, клещевого энцефалита (ВКЭ), чумы плотоядных, гриппа и др. (Санин А.В. и др., 1991 ; Sanin A.V. et al., 1992; Pronin A.V. et al., 1996; Danilov L.L. et al, 1997). Показана также способность природных полиизопреноидов подавлять размножение вирусов жёлтой лихорадки, инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ВИРТ КРС) в чувствительных культурах клеток (Ожерелков C.B., 2005). В настоящее время препараты фоспренил (ФП) и гамапрен (ГП), разработанные и внедренные в практику в ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН, широко и успешно используются для профилактики и лечения вирусных инфекций в ветеринарии. В то же время механизмы противовирусной активности этих препаратов остаются недостаточно изученными, в частности не изучено влияние препаратов на синтез основного иммуногена ВКЭ - белка Е.

Полиизопреноиды - интегральные компоненты прокариотических и эукариотических клеток; входя в филогенетически древнюю систему изопреноидов, они участвуют во многих важнейших процессах, происходящих в клетках (Наровлянский А.Н. и соавт., 2007). Препараты на основе фосфорилированных полиизопреноидов не являются ксенобиотиками, нетоксичны, нетератогенны (Деева А.В.и др., 2003). В то же время для внедрения таких препаратов в медицинскую практику

необходимо более детальное исследование механизмов их активности, в том числе в противовирусном иммунитете.

Известно, что формирование адекватного противовирусного иммунитета зависит от баланса иммунорегуляторных цитокинов (в частности, ИФН, ИЛ-4, ИН-12, фактора ингибирующего миграцию (МИФ), роль которых остается малоизученной (Носик Н.Н.,2000); недостаточно и данных о возможности применения иммуномодулирующих препаратов в качестве регуляторов продукции тех цитокинов, которые могут играть как защитную, так и повреждающую роль (развитие аутоиммунных, аллергических и других иммунопатологических реакций).

Инфекция, вызываемая ВКЭ, остаётся одной из социально значимых вирусных инфекций в России и ряде зарубежных стран. Несмотря на проводимую иммунопрофилактику (вакцинацию и введение иммуноглобулинов по эпидемическим показаниям), тенденция к увеличению заболеваемости клещевым энцефалитом (КЭ) по-прежнему сохраняется (Злобин В.И.,2007). При этом продолжается поиск и внедрение лечебно-профилактических препаратов против КЭ. Некоторые из них (йодантипирин, панавир) достаточно успешно зарекомендовали себя в медицинской практике (Ершов Ф.И.,2006). В то же время вышеуказанные препараты являются преимущественно интерфероногенами и применяются лишь для профилактики, но не лечения КЭ.

Вирус энцефаломиелита Тейлера (ВЭМТ) вызывает у мышей тяжёлую инфекцию, которая служит экспериментальной моделью рассеянного склероза за счет сходной патологии тканей ЦНС и вовлечения иммунной системы в развитие процесса демиелинизации (E.L.Oleszak, 2004). Поскольку ВЭМТ главным образом размножается в клетках макрофагального ряда (астроциты, клетки микроглии), изучение размножения ВЭМТ в клеточных макрофагальных культурах P388D1 представляет значительный интерес, как с точки зрения развития иммунного ответа, так и с точки зрения формирования персистенции вируса.

Вирус группы герпесвирусов ВИРТ КРС - является возбудителем распространённого и опасного заболевания КРС, для профилактики и лечения которого лекарственных средств до сих пор практически нет. (Белоусова Р.В. и др., 2000)

По-прежнему остаётся актуальной проблема поиска и внедрения высокоэффективных адъювантов для противовирусных вакцин и приготовления гипериммунных сывороток, используемых для диагностики социально значимых вирусных инфекций (Козлов В.Г. 2006 г).

Цель работы: изучение механизмов иммуномодулирующего и противовирусного действия полиизопреноидов растительного происхождения при экспериментальных вирусных инфекциях in vivo и in vitro, вызванных как безоболочечными ( ВЭМТ), так и оболочечными РНК-( ВКЭ) и ДНК-( ВИРТ)-содержащими вирусами.

Задачи исследования:

1. Исследовать влияние препаратов Фоспренил(ФП) и Гамапрен(ГП) на течение экспериментальных инфекций, для отработки оптимальной лечебно-профилактической схемы их применения.

2. Изучить механизмы противовирусного действия ФП и ГП на различных этапах взаимодействия вирус-клетка, включая созревание вирусных белков при экспериментальных инфекциях.

3. Изучить влияние ФП и ГП на синтез ряда иммунорегуляторных цитокинов in vivo и in vitro, как в норме, так и при экспериментальной вирусной инфекции.

4. Исследовать возможность применения ФП в качестве адыованта для вакцин и при изготовлении диагностических энтеровирусных сывороток.

Научная новизна

- Выявлена протективная активность исследуемых препаратов при экспериментальных инфекциях. ГП в два раза удлиняет показатель средней продолжительности жизни (СПЖ) у мышей, зараженных ВЭМТ (штамм GD VII), ФП вызывает защиту 60% животных от высокопатогенного ВКЭ (штамм Абсеттаров).

Установлено, что препараты ФП и ГП значительно снижают инфекционность вирусов ВКЭ и ВЭМТ в чувствительных культурах клеток P388D1 и ВНК-21, соответственно.

- Впервые показано, что ФП и ГП проявляют противовирусную активность на этапе созревания вирусных белков в клетке. Установлено, что ГП снижает эффективность синтеза структурного белка VP3 ВЭМТ на ранних стадиях репродукции в клетках ВНК-21 и P388D1. Получены данные о значительном снижении накопления структурных белков ВКЭ и ВИРТ КРС in vitro в присутствии ФП или ГП.

- Впервые исследована роль МИФ при экспериментальном КЭ в опытах in vivo и in vitro. Показано, что введение мышам, инфицированным ВКЭ, МИФ в дозе 40 нг/мышь приводит к значительному снижению показателя СПЖ. Введение антител к МИФ, напротив, защищает животных от высоколетального КЭ: показатель летальности у мышей, которым вводили AT к МИФ, был в 2 раза ниже, а показатель СПЖ - в 3 раза выше, чем у контрольных. Показано, что ФП подавляет вирусиндуцированную продукцию МИФ in vivo и in vitro.

- Установлено, что включение ФП в технологический цикл промышленного изготовления диагностических энтеровирусных сывороток, стимулирует продукцию специфических нейтрализующих антиген к вирусам полиомиелита, ECHO. При этом нейтрализующая активность сывороток к полиовирусу возрастала в 3 раза, а активность сывороток к вирусу ECHO 5 - в У раза Показано, что ФП при однократном введении совместно с инакшвированной коммерческой вакциной прошв клещевого энцефалита (производства ФГУП «ПИПВЭ им. МП.Чумакова» РАМН) увеличивает ее протекшвную активность.

Практическая значимость

Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования ФП в качестве высоэффективного адъюванта для вакцин и при промышленном получении диагностических энтеровирусных сывороток. Механизмы противовирусного и иммуномодулирующего действия ФП и ГП, изученные в ходе данной работы, не только значительно расширяют спектр их использования в ветеринарной практике, но и создают базу для создания лекарственных форм препаратов для лечения и профилактики некоторых вирусных инфекций, играющих важную роль в инфекционной патологии человека.

Внедрение полученных результатов

Подготовлены методические рекомендации « Использование фоспренила в качестве адъюванта при получении диагностических гипериммунных сывороток к некоторым энтеровирусам» , утвержденные на Совете по внедрению научных достижений в практику в ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН( протокол №3 от 7февраля 2008г).

Апробация работы:

Материалы исследований были доложены на: межлабораторном семинаре молодых ученых ГУ Научно-исследовательского института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН (Москва, 2006 г), в свободной сессии научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней Военно - медицинской академии им. С.М. Кирова (Санкт- Петербург 2006).

Апробация диссертации состоялась на научной конференции отдела иммунологии ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН 27 июня 2007 года.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (52 отечественных и 100 зарубежных источников). Работа изложена на 154 страницах, иллюстрирована 18 таблицами и 12 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирусы: 1.ВКЭ (штаммы Софьин и Абсеттаров). Штаммы ВКЭ были получены из коллекции штаммов ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им М.П.Чумакова РАМН 2.ВИРТ КРС. В работе использовали ВИРТ КРС (штамм 4016), полученный на кафедре ветеринарной вирусологии Биологического факультета Московской Государственной Академии Ветеринарной Медицины и Биотехнологии (МГАВМ и Б) им. К.И.Скрябина. 3. ВЭМТ (штамм ОБУЛ), полученный из лаборатории биохимии ГУ Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, титровали в культуре ВНК- 21.

Животные: В работе использованы: мыши линии BALB/c, массой 18-20 г и беспородные мыши массой 6 - 8 г обоих полов, получены из питомника «Столбовая» РАМН; кролики породы шиншилла массой 2,5-3 кг получены из питомника «Столбовая» РАМН.

Клеточные культуры В работе использовали перевиваемые линии клеток:

1.Клетки почек эмбрионов свиньи СПЭВ, коллекция лаборатории концентрации и очистки вирусных препаратов ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН.

2. Суспензионная перевиваемая культура клеток макрофагов мышей P388D1 получена из лаборатории биохимии ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН;

3. Перевиваемая линия клеток почек сирийского хомячка ВНК-21, получена из American Cell Culture Collection (США).

4. Культура клеток почек телёнка Таурус-1, получена на кафедре ветеринарной вирусологии МГАВМ и Б им. К.И. Скрябина.

Препараты

Фоспренил: использовали стандартный коммерческий препарат ФП производства ЗАО «Микро-плюс» при ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, г. Москва, содержащий 0,4 % полипренилфосфата натрия, выделенного из хвои.

Гамапрен: использовали , стандартный коммерческий препарат ГП, производства ООО «Гамаветфарм» при ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, г. Москва, содержащий 0,5% полипренилфосфата натрия, выделенного из листьев шелковицы.

МИФ: Человеческий рекомбинантный МИФ (фактор ингибирующий миграцию), получен из лаборатории медиаторов и эффекторов иммунитета ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Исходная концентрация МИФ составляла 20 ОООнг/мл. Первоначальный раствор МИФ разводили физиологическим раствором до получения рабочих доз. Рабочими дозами были 5, 20, 40 и 50 нг/мышь.

Основные методы: Определение противовирусной активности ФП в культурах клеток СПЭВ и P388D1

Выявление противовирусной активности ФП в отношении ВКЭ в опытах, in vitro проводили на перевиваемой линии клеток почек эмбрионов свиней (СПЭВ). Прямую противовирусную активность ФП изучали путём титрования по бляшкам суспензии мозга мышей линии BALB/c массой 12-14 г, заражённых ВКЭ (штамм Софьин), в присутствии ФП или раствора плацебо в культуре клеток СПЭВ. При этом ФП или плацебо добавляли на всех этапах титрования вируса, включая агаровое покрытие. Титры ВКЭ определяли методом подсчёта негативных колоний (бляшек) и выражали в БОЕ/мл. (Л.Б.Эльберт с соавт. 1998).

Определение количества белка Е ВКЭ в культуре клеток СГГЭВ методом ИФА.

Лошадиная сыворотка против ВКЭ и конъюгат с моноклональными антителами к белку Е были получены из отделения энцефалитной вакцины ГУ Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН. Культуральную жидкость проверяли в иммуноферментном анализе (ИФА) на наличие белка Е, основного иммуногена ВКЭ.

Расчёт количества белка Е в пробах проводился методом построения градуировочного графика (с измерением оптической плотности белка на спектрофотометре).

Исследование влияния ФП и ГП на накопление вирусных белков ВИРТ КРС, ВКЭ в культурах клеток.

Изучали динамику накопления белков ВИРТ КРС в культуре клеток Таурус-1, ВКЭ в клетках СПЭВ в присутствии МП или ФП в дозе 400 мкг/мл. Радиоактивно [14С]-меченные экстракты клеток, зараженных соответствующими вирусами, анализировали методом

радиоиммунопреципитации (РИП). ПротеинА-сефарозу инкубировали со смесью радиоактивно меченого экстракта клеток и сыворотки крови мышей (содержащей соответствующие антитела). После отмывки преципитат протеинА-сефарозы обрабатывали денатурирующим буфером. Супернатанты, содержащие иммунопреципитаты, анализировали методом денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле и радиоа^гографии. Изучение влияния ФП и ГП на синтез м-РНК МИФ в клетках P388D1, при инфицировании ВКЭ методом ОТ- ПЦР.

Использовали перевиваемую культуру клеток макрофагов мышей P388D1, Клетки выращивали в культуральных флаконах объёмом 100 мл (фирмы Costar) до образования монослоя. В дальнейшем выделяли м-РНК по стандартной методике с помощью набора фирмы Promega из клеток через 2, 4, 6 и 24 ч соответственно. Концентрация м-РНК во всех препаратах была около 100-200 мкг/мл. Было получено по 100 мкл РНК-содержащих препаратов. С каждым препаратом была проведена обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция со специфическими праймерами к МИФ. Определение влияния ФП и ГП на продукцию цитокинов в сыворотках крови мышей в норме и при инфицировании ВКЭ.

Влияние ФП и ГП на уровень ИЛ-4 , ИЛ-12 , ИФН-у, МИФ в организме мышей в норме и при экспериментальном КЭ проводили с помощью ИФА в сыворотках крови мышей линии BALB/c. Забор сывороток крови у животных вышеперечисленных групп проводили стандартным методом в следующие сроки: на 5-е, 6-е, 7-е, 8-е сутки после инфицирования и (или) введения ФП. Постановку реакции осуществляли согласно протоколу фирмы-производителя с помощью иммуноферментных наборов для определения соответствующих ЦТ производства фирмы «R&D systems» (США). Учет результатов проводили на спектрофотометре с длиной волны 450 нм.

Результаты выражали в пг/мл сыворотки крови. Статистическую обработку результатов исследования проводили по Фишеру.

Использование ФП в качестве адъюванта для вакцины против КЭ

Оценку возможности использования ФП в качестве адъюванта для вакцины против КЭ проводили при одновременном введении ФП в стимулирующей дозе 0,05 мл/кг веса (4 мкг/мышь), согласно инструкции по применению препарата. ФП вводили во время первой иммунизации мышей по 0,2 мл внутримышечно, вакцину в соответствующих разведениях вводили по стандартной схеме. Далее опыт проводился в соответствии со стандартной схемой оценки иммуногенности на лабораторных животных. Для разрешения использовали штамм Абсеттаров вируса КЭ, который вводили внутрибрюшинно (в дозе 300 ЛД50) через 8 дней после третьей иммунизации. За мышами наблюдали 14 суток, результаты обсчитывали по методу Рида и Менча и вычисляли следующие показатели протективности: разведение вакцины, обеспечивающее 50% защиты животных (ПР50); минимальную иммунизирующую дозу вакцины, обеспечивающую 50% защиты животных (МИД50) и коэффициент протективности вакцины (КП)

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку полученных данных проводили путем определения средних арифметических и средних геометрических значений с вычислением средних ошибок и доверительных интервалов. Достоверность полученных результатов оценивали с помощью критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Лечебно-профилактическое действие ФП и ГП при экспериментальном КЭ у мышей.

Целью данного раздела исследований была разработка оптимальной лечебно-профилактической схемы применения ФП и ГП в качестве противовирусного средства при экспериментальном КЭ у мышей. Ранее было показано, что препараты могут проявлять противовирусную активность в низких (0,1 и 0,2 мг/кг) и высоких дозах - 10-20 мг/кг (Годунов Р.С.,2006).Нами была экспериментально апробирована схема введения ФП, соответствующая утверждённой Инструкции по применению препарата. Было показано, что оптимальной дозой для предотвращения развития острого летального КЭ является 60 мкг/мышь (Змг/кг), вводимая дробно, трёхкратно, внутримышечно: 20 мкг/кг за 2 часа до инфицирования, 20 мкг/мышь одновременно с введением вируса, и через 1 час после введения. После заражения вирусом КЭ проводили ежедневное визуальное наблюдение за животными в течение 14 суток с целью выявления больных (парезы или параличи ) и павших животных. После этого в каждой группе рассчитывали показатели летальности (в %) и СПЖ (в сутках)

Табл. 1 .Протективное действие МП и ГП при экспериментальном КЭ у мышей.

№№ групп, Летальность СПЖ

(в%) (в сут.)

1 .ВКЭ+ 0,2 мл физ. р-ра 100 7,2

З.ВКЭ+ГП 40* 10,9*

4.ВКЭ+ ФП 45* 11,4*

* - разница между показателями летальности и СПЖ статистически достоверна (при р < 0,05) в группах 1 и 2; 1 и 3.

Эффективность профилактической схемы введения ФП и ГП оценивали по способности препарата защищать от вирусной инфекции не менее 40% животных или увеличению показателя СПЖ более чем на 2 суток по сравнению с контролем.

Данные, представленные в таблице 1, показывают, что оба препарата обладают достаточно выраженной противовирусной активностью при экспериментальных инфекциях, вызванных ВКЭ у мышей. Летальность в группах зараженных мышей при добавлении препаратов была ниже на 60%, чем в контрольной группе (летальность 100%), а показатель СПЖ был выше контрольного на 4,2 суток.

Лечебно-профилактическое действие ГП при экспериментальном ВЭМТ

В данном разделе исследований изучали возможность применения препарата ГП в качестве противовирусного средства при экспериментальной инфекции, вызываемой ВЭМТ in vivo. В дальнейшем аналогичные опыты будут проведены с использованием препарата ФП.

При инфицировании мышей ВЭМТ (штамм GDVII) была применена следующая лечебно-профилактическая схема. ГП вводили интрацеребрально беспородным мышам в дозе 4мг/кг за 8 суток до инокуляции ВЭМТ. Защита составила до 30% инфицированных животных, тогда как летальность в контроле составляла 100%. При этом в контрольной группе, заражённой ВЭМТ интрацеребрально, гибель мышей в 100% случаев наблюдалась в течение 7-14 суток после инфицирования. В то же время введение ГП одновременно с вирусом интрацеребрально или внутримышечно (в дозе 4 мг/кг), через 4 или 24 часа после заражения, не защищало животных от вирусной инфекции, однако регистрировалось увеличение показателя СПЖ более, чем в 2 раза.

Табл. 2. Протективное действие ГП при инфекции, вызванной ВЭМТ(штамм GDV1I),

№№Групп мышей: мышам вводили Летальность (в%) СПЖ (сут.)

ВЭМТ без ГП 100 6,8 ± 0,7*

ВЭМТ + ГП (4 мг/кг) 70 15± 1,2*

* разница между показателями СПЖ статистически достоверна (при р < 0,05)

в группах 1 и 2;

Таким образом, в опытах in vivo показана достаточно выраженная противовирусная активность ГП в отношении ВЭМТ у мышей. Исследование противовирусной активности ГП в отношении ВЭМТ в

культуре клеток ВНК-21.

Полученные в исследованиях in vivo результаты послужили основанием для исследования влияния ГП на инфекционность ВЭМТ in vitro, а также изучения механизмов противовирусного действия ГП на ВЭМТ. На первом этапе исследований было установлено, что ГП в концентрации 50 мкг/мл достоверно подавляет

бляшкообразующую активность

ВЭМТ(штамм GDV1Í) в клетках ВНК-2

Рис.1. Подавление бляшкообразующей активности ВЭМТ (штамм ООУП), в присутствии ГП в культуре клеток ВНК-21 на ранних сроках после инфицирования вирусом

Данные, представленные на рис.1, показывают, что значительное подавление бляшкообразования регистрировалось через 2,5 часа после инфицирования клеток ВЭМТ в присутствии ГП, через 5 часов этот эффект был менее выражен, а через 7, 5 часов - практически не выявлялся. Результаты свидетельствуют о том, что в случае инфекции, вызываемой данным представителем безоболочечных вирусов, препарат ГП эффективен преимущественно на ранних стадиях размножения вируса в клетках.

Изучение влияния ГП на созревание белков ВЭМТ(штамм СЮVII), в чувствительных культурах клеток ВНК-21.

Для дальнейшего изучения механизмов противовирусного действия препаратов на этапах взаимодействия вирус-клетка исследовали динамику накопления вирусных белков ВЭМТ методом радиоиммунопреципитации. Исследовали влияние ГП на цикл репродукции ВЭМТ в присутствии ГП на 0,2,4,6 , 8 и 14 часов после заражения клеток.

GDVII GDVIl/m

Ф ф

ф ф

Рис. 2. Угнетение синтеза структурного белка VP3 ВЭМТ (штамм GD VII) в присутствии ГП в клетках ВНК-21.

1 - накопление вирусного белка в присутствии ГП через 2часа; 2- через 4часа; 3- через 6 часов; 4- через 8 часов; 5- через 14 часов; 6-наконление вирусного белка без ГП через 2часа; 7- через 4 часа; 8- через 6 часов; 9- через 8 часов; 10- через 14 часов;

В первые 2-4 часа после внесения вируса в клетки в присутствии 100 мкг/мл ГП выявлялось выраженное угнетение синтеза вирусспецифических белков. В последующем (6-14 часов) влияние ГП на динамику синтеза вирусспецифических белков не обнаруживалось. Аналогичные результаты были получены на клетках линии P388D1 Таким образом, было показано, что препараты ГП и ФП эффективны на ранних стадиях созревания вирусных белков, что проявляется в подавлении инфекционности безоболочечного РНК-содержащего вируса Тейлера. Исследование противовирусной активности ФП и ГП в отношении ВКЭ в культуре клеток СПЭВ.

Известно, что фосфаты полиизопреноидов обладают выраженным противовирусным действием в отношении целого ряда ДНК - и РНК-содержащих вирусов. Ранее было достоверно показано подавление размножения ВКЭ (штамм Абсеттаров) в клеточной культуре СПЭВ в присутствии ФП (Ожерелков C.B., 2003). Были проведены повторные эксперименты при тех же условиях опыта в присутствии ФП и ГП в концентрациях 200 и 400 мкг/мл для сравнения их дозозависимой активности в отношении ВКЭ.

Табл.3. Противовирусная активность ФП и ГП в отношении ВКЭ на

культуре клеток СПЭВ

№№ групп Состав пробы Титры вируса lg БОЕ50/мл

1 Контроль ВКЭ 9,7±0,6

2 ВКЭ + плацебо 9,5+0,24

3 ВКЭ + ФП 200 мкг/мл 8,3±0,3

4 ВКЭ + ГП 200 мкг/мл 8,4±0,5

5 ВКЭ + ФП 400 мкг/мл 8,0+0,4

6 ВКЭ + ГП 400 мкг/мл 7,9+0,45

Данные таблицы 3 свидетельствуют, что ФП и ГП в концентрациях 200 и 400 мкг/мл подавляют размножение ВКЭ в культуре клеток СПЭВ. ФП в концентрации 200 мкг/мл снизил титр вируса на 1,4 а в концентрации 400 мкг/мл - на 1,7 ^ по сравнению с контрольным показателем - 9,7 ^(р<0,05) Снижение титров ВКЭ при добавлении ГП в концентрации 200 мкг/мл составило 1,3 а в концентрации 400 мкг/мл - 1,8 ^ в сравнении с контрольным показателем(р<0,05).

Таким образом, в результате проведённых исследований установлено, что наиболее активной противовирусной дозой препаратов ФП и ГП является -400 мкг/мл.

Исследование противовирусной активности ФП и ГП в отношепии ВКЭ в культурах клеток Р388Б1.

Имеются данные, что одной из основных мишеней для многих вирусов, в том числе и ВКЭ, являются моноциты-макрофаги (Семенов Б.Ф., 1989; СМэЮпе М.В.А., 1993). Мы исследовали возможность использования в качестве чувствительной культуры макрофагальную линию Р388Б1. Было показано, что ВКЭ (штамм Софьин) активно размножается в культуре клеток Р388Б1 (титры вируса в КЖ через 24 часа после инфицирования клеток достигают 7,0 ^ БОЕ/мл). Данные, представленные в Табл. 4, показывают, что заражение макрофагоподобных клеток Р338Б1 в присутствии ФП приводит к значительному снижению титров ВКЭ. Так, при добавлении ФП в концентрациях 200 и 400 мкг/мл, титры ВКЭ снижаются на 2,9 и 3,5 ^ БОЕ/ мл соответственно то сравнению с контрольным показателем. Таким образом, ФП в максимальной концентрации (400мкг/мл) обладает способностью снижать титры внеклеточного вируса КЭ, значительнее, чем ФП в дозе 200 мкг/мл.

Табл. 4. Снижение титров внеклеточного вируса КЭ, полученного при заражении перевиваемой культуры клеток макрофагов мышей Р-38801, в присутствии ФП

№№ Названия проб Титры ВКЭ (1й БОЕ/ мл)

1. Контроль вируса: титры ВКЭ 7,1±0,5*

2. ВКЭ + ФП 200 мкг/мл 4,2±0,4*

3. ВКЭ + ФП 400 мкг/мл 3,7±0,25*

4. Титр ВКЭ в культуре СПЭВ 9,6±0,7

*разница между показателями в группах 1и 2 , 1и 3 статистически достоверна (при р< 0,05)

Изучение механизмов противовирусной активности ФП и ГП на этапах взаимодействия вирус-клетка.

С целью подтверждения возможного противовирусного механизма действия изучаемых препаратов, методом ИФА мы изучили взаимосвязь между инфекционностью внеклеточного урожая ВКЭ и количеством структурного белка Е ВКЭ в культуре клеток СПЭВ.

Табл. 6. Влияние различных доз ФП и ГП на инфекционность внеклеточного ВКЭ в культуре клеток СПЭВ и на концентрацию белка Е ВКЭ в культуральной жидкости.___

№№ Концентрац Титр вируса в Содержание белка Е

Название проб ия ФП или КЖ в КЖ

ГП (^ БОЕ/мл) (мкг/мл)

( мкг/мл)

1 .Контроль вируса 8,5 (±0,6) 0, 69 (±0,21)

2.Вирус +ФП 200 6,2 (±0,7) 0,21 (±0,15)

3. Вирус + ФП 400 6,1 (±0,5) 0,15 (±0,09)

4.Вирус + ГП 200 6,4 (±0,8) 0,13 (±0,05)

5. Виру с + ГП 400 5,8 (±0,4) 0,07 (±0,02)

Показано, что в присутствии ФП или ГП титры вируса КЭ значительно (более чем в 100 раз) снижаются по сравнению с контролем. При этом ФП подавляет образование белка Е ВКЭ в КЖ в 2 и 2,9 раза по сравнению с контролем (Таблица 6, пробы №№ 2, 3 и 1, соответственно). Аналогичная картина наблюдается при использовании ГП: концентрация белка Е ВКЭ снижается в 3,3 - 6,2 раза по сравнению с контрольным показателем ( пробы №№ 4, 5 и 1 соответственно).

Далее методом радиоиммунопреципитации было изучено влияние ФП и ГП на созревание белка Е ВКЭ в культуре СПЭВ

Рис. 3. Влияние ФП и ГП на созревание белков ВКЭ в культуре клеток СПЭВ 1,2,3 дорожки - начальная точка, клетки СПЭВ; 4,5,6,7,8 дорожки- клетки СПЭВ+ВКЭ-2,4,6,8,24 часов после заражения; 9,10,11,12,13 дорожки - клетки СПЭВ+ВКЭ+ГП-2,4,6,8,24часов после заражения; 14,15,16,17,18дорожки - клетки СПЭВ+ВКЭ+ФП-2,4,6,8,24 часов после заражения;

Дорожки 7, 12 и 17 соответствуют 8 часам инкубирования зараженной ВКЭ (штамм Абсетгаров) культуры клеток СПЭВ без добавления полипренолов, с добавлением ГП и ФП в концентрации 400 мкг/мл соответственно. Стрелками указано положение полос, соответствующих белку Е, в этих дорожках.

Можно видеть, что интенсивность полосы белка Е в дорожке 7, соответствующей 8 часам инкубирования культуры клеток СПЭВ, зараженной ВКЭ, без добавления ФП выше (по визуальной оценке, в два раза), нежели интенсивность аналогичных полос в дорожках 12 и 17( 8 часов инкубирования клеток СПЭВ, зараженных ВКЭ, с добавлением ГП и ФП, соответственно, в концентрации 400 мкг/мл).

При этом интенсивность полосы белка Е в дорожке 8 (24 часа инкубирования клеток, зараженных ВКЭ, без добавления полипренолов) не отличается от интенсивности аналогичных полос в дорожках 13 и 18 (24 часа инкубирования клеток, зараженных ВКЭ, с добавлением ФП и ГП соответственно в концентрации 400 мкг/мл).

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что препараты ФП и ГП в концентрации 400 мкг/мл подавляют накопление оболочечного белка Е ВКЭ, в культуре клеток СПЭВ на сроке 8 часов после заражения. Однако после 24 часов инкубации с момента заражения количество белка Е ВКЭ в зараженных культурах, обработанных и необработанных ФП и ГП, выравнивается.

На более ранних сроках инкубации подавления накопления белка Е указанными выше препаратами не наблюдается.

Изучение влияния ФП и ГП на накопление вируса инфекционного рннотрахеита КРС в культуре клеток Таурус 1.

Ранее было показано, что препараты ГП и ФП снижают инфекционость урожая ВИРТ в культуре клеток Таурус 1 на 2-4 ]g ( Ожерелков C.B. 2002). Для проверки связи между подавлением инфекционности и синтезом вирусного белка монослойную культуру клеток Таурус-1 заражали ВИРТ КРС (штамм 4016), и метили 14С. Пробы лизированных клеток отбирали через 2,4, 6, 8 и 24 часа после начала инфекции.

3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16 17 18

Рис.4 Подавление созревания белков ВИРТ КРС при воздействии ФП и ГП. 1,2,3 дорожки - начальная точка, клетки Таурус; 4,5,6,7,8 дорожки клетки Таурус+ВИРТ-2,4,6,8,24 часов после заражения; 9,10,11,12,13 дорожки - клетки Таурус+ВИРТ+ГП-2,4,6,8.24часов после заражения; 14,15,16,17,18дорожки - клетки Таурус+ВИРТ +ФП-2,4,6,8,24 часов после заражения.

Дорожки 7, 12 и 17 соответствуют 8 часам инкубирования зараженной ВИРТ КРС культуры клеток Таурус-1 без добавления препаратов, с добавлением ГП и ФП в концентрации 400 мкг/мл соответственно. На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что препараты ГП и ФП в концентрации 400 мкг/мл подавляют накопление вирионов ВИРТ в культуре клеток Таурус-1 на сроках от 8 до 24 часов после заражения. Следует также отметить, что на более ранних сроках (до 8 часов) инкубации значимого подавления накопления вирионов ВИРТ указанными выше препаратами не наблюдается.

Таким образом препараты ФП и ГП могут снижать инфекционность и подавлять созревание вирусных белков в клетках как безоболочечных вирусов ( ВЭМТ) на ранних стадиях, так и оболочечных РНК-(ВКЭ) и ДНК-(ВИРТ) содержащих вирусов на поздних стадиях.

Влияние ФП на динамику накопления некоторых цитокинов в сыворотке крови мышей в норме и при заражении ВКЭ.

Регуляция иммунного ответа при КЭ остаётся малоизученной. Известно, что высокопатогенные штаммы ВКЭ стимулируют цитокины (ЦТ), регулирующие преимущественно гуморальный тип иммунного ответа (ИЛ-10, ИЛ-6), но подавляют на ранних сроках инфекции ЦТ, регулирующие развитие клеточного иммунного ответа. В то же время для развития адекватного противовирусного иммунитета необходима стимуляция сбалансированного ТЫ/ТЬ2 иммунного ответа. С целью изучения механизма действия ФП, обеспечивающего защиту от высоколетального ВКЭ, определяли влияние ФП на продукцию некоторых ключевых ЦТ в норме и при экспериментальном КЭ; были исследованы концентрации ИФН-у, ИЛ-4 и ИЛ-12, МИФ в сыворотках крови мышей методом ИФА.

Показано, что у интактных (не инфицированных ВКЭ) мышей ФП стимулирует выработку ИЛ-12 на 1-е, 2-е, 3-е, 4-е и 5-е сутки после введения. При этом стимуляция продукции ИФН-у в сыворотках крови таких животных регистрируется на 3-й и 4-е сутки после введения ФП. Повышение концентрации ИЛ-4 в сыворотках крови мышей наблюдается на 2-е и 5-е сутки после введения ФП.

У мышей, которых заражали ВКЭ и вводили ФП значительная стимуляция ИФН-у и ИЛ-12 наблюдается на 3-й сутки после заражения ВКЭ и введения ФП (Таблица 4, пробы 1 и 3, соответственно). В этот период не регистрируется стимуляция продукции ИЛ-4. Во второй половине инкубационного периода и в период проявления клинических признаков КЭ, напротив, регистрируется повышение концентрации ИЛ-4 и снижение содержания ИФН-у и ИЛ-12 .

Табл.7. Влияние ФП на продукцию ИФН-у, ИЛ-4 и ИЛ-12 у мышей линии BALB/c, заражённых ВКЭ_

№№ проб/ Название ИЛ Сутки после введения препарата

1 2 3 4 5 6 17 8 9 10

Концентрация ЦТ в сыворотках крови (пг/мл)

1.ИФН-у <К* <К 128 84 50 59 40 36 <К <К

2.ИЛ-4 <к <К 18 29 38 75 138 156 120 26

З.ИЛ-12 <к 60 98 46 89 64 48 48 26 25

* Контроль ИФН у Юпг/мл, ИЛ-4-12 пг/мл, Ил-12- 20пг/мл

В таб.7 представлены средние значения уровней цитокинов, полученные в результате Зх независимых экспериментов.

Иная картина наблюдалась при заражении животных ВКЭ без введения ФП. На фоне развития острого КЭ происходит стимуляция продукции ИЛ-4 на 1 -е, 2-е и 3-й сутки. На 4-е и 5-е сутки продукция ИЛ-4 снижается, а синтез ИФН-у и ИЛ-12, напротив, возрастает. Значительная стимуляция продукции ИФН-у, ИЛ-4 и ИЛ-12 регистрируется на 7-е и 8-е сутки после введения патогена в период проявления клинических признаков КЭ

Полученные данные подтверждают результаты предыдущих исследований, в которых было установлено, что при экспериментальном КЭ ФП стимулирует продукцию в сыворотках крови мышей ИЛ-12 [Годунов P.C. 2006]. Кроме того, подтверждаются данные, что при остром КЭ в ранние сроки (с 1-х по 4-е сутки) после заражения вирусом регистрируется стимуляция Th2 иммунного ответа, что не приводит к защите животных от вирусной инфекции. Результаты экспериментов свидетельствуют, что ФП при введении в организм инфицированных животных реализует механизмы защиты от летальной вирусной инфекции, стимулируя на ранних стадиях инфекционного процесса Thl иммунный ответ, а на более поздних -сбалансированный Thl/Th2 иммунный ответ. В пользу данного предположения свидетельствует также тот факт, что в сыворотках крови животных, заражённых ВКЭ, при введении ФП регистрируется поочерёдное увеличение продукции ИЛ-12 и ИЛ-4, баланс которых играет важную роль при дифференцировке хелперов ThO в Thl и Th2, соответственно.

Фактор, ингибирующий миграцию макрофагов (МИФ), является одним из ключевых провоспалительных медиаторов, играющих важную регуляторную роль при инфекционной патологии.

Для выявления влияния МИФ на течение острого КЭ у мышей линии BALB/c был проведен следующий эксперимент: животных заражали внутрибрюшинно ВКЭ и одновременно вводили МИФ в различных дозах. После этого проводили ежедневное визуальное наблюдение за животными всех групп в течение 21 суток, выявляли больных и павших мышей и рассчитывали по каждой группе показатели протективной защиты- летальности (в %) и СПЖ (в сутках).

Табл.8. Влияние МИФ на течение КЭ у мышей линии Ва1Ь/с

№№ Группы Общее кол- Пало/общее Летально СПЖ (в

во мышей в кол-во сть (в %) сутках)

группе животных

1 .Отрицательный контроль. ВКЭ 8 8/8 100 9,0

2.ВКЭ + МИФ 5 нг/мышь 8 7/8 88 10,0*

З.ВКЭ + МИФ 20 нг/мышь 8 7/8 88 11,Г*

4.ВКЭ + МИФ 40нг/мышь 8 8/8 100 7,3

* - разница между соответствующими показателями в группах 1 и 3; 1 и 4 статистически достоверна (при р < 0,05);

* * - и не достоверна между группами 1 и 2; (при р > 0, 05)

Было установлено, что рабочие дозы МИФ - 40, 20 и 5 нг/мышь были не токсичны для животных: в течение первых 3-х суток после введения МИФ ни одно из животных в группах 2-5 не пало. При этом доза МИФ 5 нг/мышь не оказывала какого либо действия на течение острого КЭ, доза 20 нг/мышь достоверно увеличивала показатель СПЖ, а доза 40 нг/мышь, напротив, утяжеляла течение острого вирусного инфекционного процесса.

Следующим этапом работы была проверка нейтрализующего действия антител к МИФ на течение острого экспериментального КЭ у мышей. Антитела вводили двумя способами: внутримышечно и интрацеребрально. АТ к МИФ, введённые внутримышечно на 7-е сутки после заражения мышей ВКЭ, увеличивают показатель СПЖ (на 2,8 суток) по сравнению с контрольным. Введение АТ к МИФ одновременно с инфицированием животных ВКЭ приводит лишь к незначительному увеличению показателя СПЖ (на 1,4 суток) по сравнению с контролем. При этом показатели летальности в контрольной и опытных группах не отличались и составляли 100%.

Данные, представленные в таблице 9, показывают, что АТ к МИФ, введённые интрацеребрально на 5-е сутки после заражения мышей ВКЭ, вызывают достоверное снижение показателя летальности (на 30%) по сравнению с контрольным. При этом показатели СПЖ в контрольной и опытной группах достоверно не различались.

Табл.9. Результаты исследования влияния антител к МИФ на течение клинически выраженного энцефалита у мышей линии В АЬВ/с

№№ Группы Общее кол-во мышей в группе Пало/общее кол-во животных Летальность, (в%) СПЖ (в сутках)

1 .Отрицательный контроль: ВКЭ 17 13/17 76 9,8

2. ВКЭ + АТ к МИФ 15 7/15 46* 11,1"

* - разница между показателем летальности в группах 1 и 2 статистически достоверна (при р < 0,05);

* * - и не достоверна по показателю СТТЖ между группами 1 и 2 ( при р > 0, 05)

Изучение влияния препаратов ФП и ГП на синтез м-РНК МИФ в перевиваемой линии клеток макрофагов мышей Р388Б1, при инфицировании их ВКЭ

Изучали синтез мРНК МИФ клетками Р388Ш, зараженными ВКЭ и в клетках Р388Б1, инфицированных ВКЭ и одновременно обработанных ГП или ФП в дозе 200мкг/мл. Исследовалась также способность МП и ФП влиять на синтез мРНК МИФ в клетках, не инфицированных ВКЭ.

0 1 2 3 4 5 6 7 Рис 8. КТ-РСЯ-МИФ после 24 часовой инкубации

0 - без матрицы, 1 - клетки, 2 - клетки + ФП, 3 - клетки + ГП, 4 - клетки + ВКЭ, 5 - клетки + ВКЭ + ФП, 6 - клетки + ВКЭ + ГП, 7 - Маркеры

Полученные результаты свидетельствуют, что в течение первых 6 часов синтез м-РНК МИФ не претерпевает значительных изменений под воздействием ФП, ГП и ВКЭ. В то же время спустя 24 часа наблюдается подавление синтеза м-РНК МИФ под воздействием ФП (Рис.8). Заключительным этапом работы по исследованию продукции МИФ при ВКЭ было определение фактора методом ИФА в сыворотках крови мышей зараженных вирусом.

сутки после введения ВКЭ

Рис.9. Влияние ФП на продукцию МИФ у мышей зараженных ВКЭ

Показано, что введение ФП мышам зараженным ВКЭ существенно снижает уровень продукции МИФ по сравнению с контролем в первые - третьи сутки после заражения ( Рис 9).

Таким образом, впервые установлено, что на ранних этапах развития инфекции, вызываемой ВКЭ, регистрируется стимуляция продукции провоспалительного ЦТ - МИФ. На поздних сроках инфекции, в период развития воспалительного процесса в ЦНС, введение AT к МИФ вызывает защиту животных от КЭ. Полученные результаты, по нашему мнению, свидетельствуют в пользу того, что определение МИФ может быть прогностическим маркёром тяжести течения КЭ. ФП, напротив, в экспериментах in vitro и in vivo проявил себя как иммунокорректор, снижающий, как синтез мРНК МИФ, так и уровень МИФ в сыворотках крови мышей, зараженных ВКЭ.

Использование ФП в качестве адъюванта для вакцины против клещевого энцефалита и при получении диагностических гипериммунных сывороток к некоторым энтеровирусам.

Проблема поиска и внедрения новых высокоэффективных адъювантов для противовирусных вакцин по-прежнему актуальна. Ее решение позволит сократить число ревакцинаций, что не только снизит антигенную нагрузку на организм, но также значительно упростит и удешевит сам процесс вакцинации. К таким адъювантам предъявляются четкие требования: они должны значительно повышать иммуногенность вакцин и напряжённость иммунитета, не обладать токсичностью и аллергенностью. В предыдущих исследованиях было показано, что ФП значительно усиливает биологическую активность вакцин против бешенства (Ожерелков C.B. 2003).

Нами экспериментально исследованы возможности использования препарата ФП в качестве адъюванта вакцины против КЭ в стандартных тестах на животных.

Табл.10 Показатели увеличения протективной активности вакцины КЭ при однократном введении ФП.

Исследуемая вакцина Введение ФП МИД» (мл) КП

Вакцина серии № 954 - 0,007510,0001 1,6

Вакцина серии № 954 + 0,005+0,002 2,5

Полученные данные показывают, что введение ФП одномоментно с первой иммунизацией вакциной КЭ приводит к увеличению значения ПР5о (протективное разведение) в 1,5 раза. Соответственно, МИД50 (минимальная иммунизирующая доза) при использовании ФП была на 50% меньше, чем при использовании одной вакцины против КЭ. Кроме того, показатель

сравнительной иммуногенности вакцины КП в 1,56 раза выше при схеме вакцинации с использованием ФП.

Таким образом, полученные в данном эксперименте данные свидетельствуют о повышении иммуногенной активности вакцины КЭ при использовании стимулирующей концентрации ФП при первой иммунизации.

Известные в настоящее время способы получения лечебно-профилактических и диагностических иммунных сывороток имеют общие недостатки, заключающиеся в невысокой активности получаемых препаратов, трудоёмкости процесса их изготовления, низком выходе целевого продукта, обусловленного высокими отходами животных-продуцентов и т.д.

Поэтому в данной части работы изучали возможность применения ФП ( в качестве препарата сравнения был использован коммерческий препарат иммунофан (ИН) производство «Бионокс») для получения более высоких титров нейтрализующих антител в гипериммунных сыворотках и сокращения длительного цикла иммунизации кроликов некоторыми энтеровирусами. В образцах индивидуальных сывороток кроликов, получавших ФП, одна НЕ активности сывороток определялась в разведениях 1:4800 -1:6400 (ПОЛИО-2) и 1:3200-1:4800 (ECHO 5). После смешивания одноименных сывороток этот показатель составлял 1:6000 и 1:4000, соответственно. В образцах индивидуальных сывороток кроликов, получавших ИН, одна НЕ определялась в разведениях 1:3200-1:6400 (ПОЛИО-2) и 1:1200- 1:2400 (ECHO 5). В смесях сывороток этот показатель составлял 1:4800 и 1:1600, соответственно. В образцах индивидуальных контрольных сывороток одна НЕ определялась в разведениях 1:1600- 1:3200 (ПОЛИО-2) и 1:1200-3200 (ECHO 5), в одноименных смесях сывороток этот показатель составлял 1:2000 и 1:1600, соответственно.

В целом, нейтрализующая активность смеси гипериммунных сывороток, полученных при иммунизации кроликов полиовирусом типа 2 в присутствии ФП, в 3 раза превосходила нейтрализующую активность смеси сывороток контрольной группы. Стимуляция антителообразования отмечалась уже после 4-х иммунизаций, при этом у 2-х животных (50%) она достигала максимальных значений. Сходные результаты получены при иммунизации кроликов вирусом ECHO 5 в присутствии ФП: после 6-кратной иммунизации нейтрализующая активность смеси сывороток в 2,5 раза превосходила активность смеси сывороток контрольной группы. Эффективность воздействия ФП на антителообразование при иммунизации кроликов исследованными энтеровирусами сопоставима с действием препарата ИН. Аналогичная активация антителообразования была получена при исследовании сывороток кроликов иммунизированных вирусами ECHO 25 и ECHO 7.

Таким образом, определено, что включение ФП в технологический цикл промышленного изготовления диагностических энтеровирусных сывороток стимулирует продукцию специфических нейтрализующих антител. При этом

нейтрализующая активность сывороток к полиовирусу возрастала в 3 раза, а активность сывороток к вирусу ECHO 5 - в 2,5 раза. У некоторых животных максимальный уровень нейтрализующих антител определялся после 4-х иммунизаций вместо регламентированных 6-и, что по времени может сократить производственный цикл более чем в 2 раза.

ВЫВОДЫ

1. Исследовано защитное действие препаратов ФП и ГП при экспериментальных инфекциях, вызываемых ВКЭ и ВЭМТ у мышей. Отработана лечебно-профилактическая схема при которой введение ФП защищает до 60% животных. При введении ГП одновременно с ВЭМТ увеличивался показатель СПЖ инфицированных животных более, чем в 2 раза по сравнению с контролем.

2. Изучены механизмы противовирусного действия ФП и ГП на различных этапах взаимодействия вирус-клетка. Показано, что препараты ФП и ГП значительно подавляют инфекционность ВКЭ и ВЭМТ в культурах клеток и снижают количество структурного белка Е ВКЭ. Установлено, что ГП и ФП снижает синтез структурных белков ВКЭ, ВЭМТ, ВИРТ КРС в культурах клеток.

3. Изучена динамика накопления некоторых цитокинов в сыворотках крови мышей в норме и при экспериментальном КЭ под влиянием ФП и ГП. Установлено, что в сыворотках крови животных, заражённых ВКЭ, при введении ФП регистрируется поочерёдное увеличение продукции ИЛ-12 и ИЛ-4 , баланс которых играет важную роль при дифференцировке хелперов Th 0 в Th 1 и Th 2, соответственно.

4. Впервые исследована роль МИФ при экспериментальном КЭ в опытах in vivo и in vitro. Показано, что введение МИФ животным, инфицированным ВКЭ, приводит к утяжелению инфекционного процесса, тогда как введение антител к МИФ мышам, зараженным ВКЭ, увеличивает СПЖ и снижает показатели летальности. ФП подавляет вирус-индуцированную продукцию м-РНК МИФ в клетках P388D1 и снижает уровень МИФ в сыворотках крови мышей через 1-3 суток после инфицирования ВКЭ.

5. Показано, что ФП при однократном введении совместно с инактивированной коммерческой вакциной против клещевого энцефалита производства ГУ Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН, существенно повышает ее протективную активность. Установлено, что включение ФП в технологический цикл промышленного изготовления энтеровирусных сывороток стимулирует продукцию специфических нейтрализующих антител к вирусам полиомиелита и ECHO.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Ozherelkov S.V., Kozhevnikova T.N., Narovlyansky A.N., Pronin A.V., Sanin A.V. Polyprenyl phosphate augments biologic activity of vaccines against tick-born encephalitis and rabies m experimental mice.// Abst.Viral Vaccines 2003. The international Human and Animal Viral Vaccination Conference, Edinburgh, UK.-2003.

2. Ozherelkov S.V., Narovlyansky A.N., Pronin A.V., Kozhevnikova T.N., Sanin AV. Phosprenyl antiviral activity in the experimental munne tick-borne encephalitis model. Clinical Virology Symp. Tampa, Florida- Apr.27-30.- 2003.

3. Ozherelkov S.V., Godunov R.S., Kozhevnikova T N., Narovlyansky A.N , Pronin A.V., Sanm A.V. Polyprenols of plant origin augment specific biologic activity of tick-borne encephalitis and rabies vaccines.// Abst.ECCMID.- 2004 1-4 May.- 2004 Prague.

4. Ожсрелков С В., Санин А.В , Васильев И.К., Годунов P.C., Кожевникова Т.Н., Наровлянский А H, Третьякова Е.А., Пронин A.B. К вопросу о применении иммуномодулирующих препаратов при вирусных инфекциях.// Матер.ХП межд.Моск.конгресса по болезням мелких домашних животных. М.- 2004.- с.9-11.

5. Ожсрелков C.B., Аржаев А М., Кожевникова Т Н., Наровлянский А.Н., Пронин А В., Санин А В. Адыовантное действие фоспренила на иммуногенность антирабической вакцины.//Журн. Ветеринарная клиника.- 2004.- №8- С.9-10.

6. Sanm А V., Godunov R.S , Kozhevnikova T.N., Kuntz T., Ozherelkov S.V., Pronin A.V., and Narovlyansky A.N. Antiviral activity of phosphorylated derivatives of plant polyprenyls in different tick-born encephalitis models // Abst. 15th ЕССМШ Copenhagen, 2-5.04.2005.

7. Зайцева JIГ., Бехало В А, Васильев И.К, Годунов P.C., Киреева ИЗ, Кожевникова Т.Н., Нагурская Е.В,Наровля1Екий АН, Ожсрелков СВ., Пронин AB, Саши AB. Коррекция функциональной активности перитонеальных макрофагов мышей фоспренилом и гамавитом при введении высоких доз альфа-токсина Staphylococcus aureus. //ЖМЭИ 2005,- №6.- С. 51-57.

8. Годунов Р С., Ожсрелков С.В , Кожевникова Т.Н, Пронин А.В , А.В.Санин, Наровлянский А.Н. Иммуномодулирующее действие морапренилфосфатов в отношении ИЛ-10 и ИЛ-12 в норме и при экспериментальном клещевом энцефалите у мышей. //Материалы конференции «Инфекционные болезни, проблемы здравоохранения и военной медицины. Санкт-Петербург, 2006- с.77.

9. Кожевникова Т.Н. , Ворович M Ф, Козлов В Г. , Ожерелков C.B. , Наровлянский А.Н. , Пронин A.B., Санин A.B. Использование фоспренила в качестве адъюванта для вакцин и стимулятора продукции специфических антител при изготовлении гипериммунных сывороток.// Российский Ветеринарный журнал, 2006 -№2.- с 8

10. Кожевникова TH., Викторова Е.Г., Козлов В.Г., Наровлянский А.Н, Санин AB, Пронин А.В , Ожсрелков C.B. Морапренилфосфаты подавляют размножение вируса энцефаломиелита Тейлера и накопление вирусного белка VP3 в чувствительных культурах клеток ВНК-21 и P388D1 // ЖМЭИ,- 2007,- №3 - с. 26-30

11. Кожевникова Т.Н., Санин А.В, Меримская О.С., Санина В Ю., Ожерелков C.B., Куприянов В В Роль фактора, ингибирующего миграцию макрофагов при экспериментальном клещевом энцефалите.// Материалы 9 съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 2007.- с 182-183.

(ООО «ЛРИП» Зак № 64, 2008 г. Тираж 100 экз 121351, г Москва, Боженко ул , д 4, стр 1)

Оглавление диссертации Кожевникова, Татьяна Николаевна :: 2008 :: Москва

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 .Изменения в иммунной системе при некоторых вирусных инфекциях.

1.1.1 .Иммунология клещевого энцефалита.

1.1.2.0бщие представления о структурных белках флавивирусов.

1.1.3.Особенности иммунных реакций при клещевом энцефалите и проблема поиска высокоэффективных лечебно-профилактических препаратов для его лечения.

1.2.Полиизопреноиды растительного происхождения и их иммунобиологические свойства.

1.2.1.Особенности и механизмы противовирусной активности полиизопреноидов.

1.3.Цитокины и их роль при вирусных инфекциях.

1.3.1.Активность цитокинов при вирусных инфекциях.

1.3.2.Фактор ингибиции миграции и его роль в патогенезе инфекционного процесса различнойэтиологи.

1.3.3.Применение цитокинов и их индукторов при вирусных инфекциях.

1 ^.Использование адъювантов для противовирусных вакцин и при получении гипериммунных сывороток.

1.4.1 .Проблема усовершенствования современной вакцины против

1.4.2.Проблема получения гипериммунных диагностических сывороток и необходимость использования адъювантов при их получении.

Введение диссертации по теме "Аллергология и иммулология", Кожевникова, Татьяна Николаевна, автореферат

В предыдущих исследованиях было показано, что фосфорилированные полиизопреноиды хвои сосны обладают противовирусной активностью в отношении вирусов иммунодефицита человека, гепатита А, клещевого энцефалита (ВКЭ), чумы плотоядных, гриппа и др. /48,50,129,149/. Показана также способность природных полиизопреноидов подавлять размножение вирусов жёлтой лихорадки, диареи и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ВИРТ КРС) в чувствительных культурах клеток /68/ В настоящее время препараты фоспренил (ФП) и гамапрен (ГП), разработанные и внедренные в практику в НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН, широко и успешно используются для профилактики и лечения вирусных инфекций в ветеринарии. В то же время механизмы противовирусной активности этих препаратов остаются недостаточно изученными.

Полиизопреноиды - интегральные компоненты прокариотических и эукариотических клеток; входя в филогенетически древнюю систему изопреноидов, они участвуют во многих важнейших процессах, происходящих в клетках /48/. Препараты на основе фосфорилированных полиизопреноидов не являются ксенобиотиками, нетоксичны, нетератогенны. В то же время для внедрения таких препаратов в медицину необходимо более детальное исследование механизмов их активности, в том числе при противовирусном иммунитете.

Известно, что формирование адекватного противовирусного иммунитета зависит от баланса иммунорегуляторных цитокинов (в частности, ИФН, ИЛ-4,ИН-12, фактора ингибирующего миграцию (МИФ) роль которых остается малоизученной; недостаточно и данных о возможности применения иммуномодулирующих препаратов в качестве регуляторов продукции тех цитокинов, которые могут играть как защитную, так и повреждающую роль (развитие аутоиммунных, аллергических и других иммунопатологических реакций). /47/

Инфекция, вызываемая ВКЭ, остаётся одной из социально значимых вирусных инфекций в России и ряде зарубежных стран. Несмотря на проводимую вакцинопрофилактику, тенденция к увеличению заболеваемости клещевым энцефалитом (КЭ) в РФ по-прежнему сохраняется. При этом продолжается поиск и внедрение лечебно-профилактических препаратов против КЭ. Некоторые из них (йодантипирин, панавир) достаточно успешно зарекомендовали себя в медицинской практике. В то же время вышеуказанные препараты являются преимущественно интерфероногенами и применяются лишь для профилактики, но не лечения КЭ. /27,50/

Вирус энцефаломиелита Тейлера (ВЭМТ) вызывает у мышей тяжёлую инфекцию, которая служит экспериментальной моделью рассеянного склероза за счет сходной патологии тканей ЦНС и вовлечения иммунной системы в развитие процесса димиелинизации Поскольку основными клетками для размножения вируса являются клетки макрофагального ряда (астроциты, клетки микроглии), изучение размножения ВЭМТ в клеточных макрофагальных культурах(РЗ 8 8D1) представляет значительный интерес, как с точки зрения развития иммунного ответа, так и с точки зрения формирования персистенции./142/.

Вирус группы герпесвирусов ВИРТ КРС является возбудителем распространённого и опасного заболевания КРС, для профилактики и лечения которого лекарственных средств до сих пор практически нет. /50/

По-прежнему остаётся актуальной проблема поиска и внедрения высокоэффективных адъювантов для противовирусных вакцин и для приготовления гипериммунных диагностических сывороток, используемых для диагностики высокоактуальных для человека вирусных инфекций, например, целого ряда энтеровирусов (полиомиелита, ECHO и др.)

Цель работы : изучение механизмов противовирусного действия полиизопреноидов растительного происхождения при экспериментальных вирусных инфекциях in vivo и in vitro, вызванных как безоболочечными ( ВЭМТ), так и оболочечными РНК-( ВКЭ) и ДНК-( ВИРТ)-содержащими вирусами.

Задачи исследования:

1. Исследовать влияние препаратов ФП и ГП на течение экспериментальных инфекций, для отработки оптимальной лечебно-профилактической схемы применения препаратов.

4. Исследовать возможность применения ФП в качестве адъюванта для вакцин и при изготовлении гипериммунных диагностических сывороток. Научная новизна

Выявлена протективная активность исследуемых препаратов при экспериментальных инфекциях. ГП в два раза удлиняет показатель средней продолжительности жизни (СПЖ) у мышей, зараженных ВЭМТ (штамм GD VII), ФП вызывает защиту 60% животных от высокопатогенного ВКЭ (штамм Абсеттаров).

Впервые показано, что ФП и ГП проявляют противовирусную активность на этапе созревания вирусных белков в клетке. Установлено, что ГП снижает эффективность синтеза структурного белка YP3 ВЭМТ на ранних стадиях репродукции в клетках ВНК-21 и P388D1. Получены данные о значительном снижении накопления структурных белков ВКЭ и ВИРТ КРС in vitro в присутствии ФП или ГП.

Впервые исследована роль МИФ при экспериментальном КЭ в опытах in vivo и in vitro. Показано, что введение мышам, инфицированным ВКЭ, МИФ в дозе 40 нг/мышь приводит к значительному снижению показателя СПЖ. Введение антител к МИФ, напротив, защищает животных от высоколетального КЭ: показатель летальности у мышей, которым вводили AT к МИФ, был в 2 раза ниже, а показатель СПЖ - в 3 раза выше, чем у контрольных. Показано, что ФП подавляет вирусиндуцированную продукцию МИФ in vivo и in vitro.

Установлено, что включение ФП в технологический цикл промышленного изготовления диагностических энтеровирусных сывороток, стимулирует продукцию специфических нейтрализующих антител к вирусам полиомиелита, ECHO. При этом нейтрализующая активность сывороток к полиовирусу возрастала в 3 раза, а активность сывороток к вирусу ECHO 5 — в 2,5 раза. Показано, что ФП при однократном введении совместно с инактивированной коммерческой вакциной против клещевого энцефалита (производства ФГУП «ПИПВЭ им. М.П.Чумакова» РАМН) увеличивает ее протективную активность. Практическая значимость

Внедрение полученных результатов

Подготовлены методические рекомендации « Использование фоспренила в качестве адъюванта при получении диагностических гипериммунных сывороток к некоторым энтеровирусам», утвержденные на Совете по внедрению научных достижений в практику в ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН( протокол №3 от 7февраля 2008г).

Апробация работы:

Заключение диссертационного исследования на тему "Иммуномодулирующее и противовирусное действие растительных полиизопреноидов при экспериментальных вирусных инфекциях."

ВЫВОДЫ

4. Впервые исследована роль МИФ при экспериментальном КЭ в опытах in vivo и in vitro. Показано, что введение МИФ животным, инфицированным ВКЭ, приводит к утяжелению инфекционного процесса, тогда как введение антител к МИФ мышам, зараженным ВКЭ, увеличивает СПЖ и снижает показатели летальности. ФП подавляет вирус-индуцированную продукцию м-РНК МИФ в клетках P388D1 и снижает уровень МИФ в сыворотках крови мышей через 24 часа после инфицирования ВКЭ.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2008 года, Кожевникова, Татьяна Николаевна

1. Анализ заболеваемости клещевым энцефалитом в Приморском Крае за период с 1990 по 2000 годы. Клещевой энцефалит (к 65-летию открытия). Павленко Е.В., Леонова Г.Н., Яковлев A.A., Борисова О.Н. Владивосток, 2002, стр. 15-25;

2. Анджапаридзе О.Г., Степанова Л.Г. Изучение изменчивости вируса клещевого энцефалита. Сообщение 3. Выделение из вирусных популяций клонов со сниженной нейропатогенностью. Вопр. вирусологии, 1967, № 5, стр. 604-607;

3. Анджапаридзе О.Г., Степанова Л.Г., Розина Э.Э. Изучение изменчивости вируса клещевого энцефалита. Сообщение 4. Патогенные свойства некоторых штаммов вирусов группы клещевого энцефалита и их вариантов. Вопр. вирусологии, 1967, № 6, стр. 691-697;

4. Анджапаридзе О.Г., Степанова Л.Г. Изучение изменчивости вируса клещевого энцефалита. Сообщение 5. Генетическая характеристика штаммов с разной вирулентностью. Вопр. вирусологии, 1969, № 6, стр. 687-691;

5. Баринский И.Ф. Иммуностимуляторы в лечении и профилактикеарбовирусных инфекций. В Сб.: Тез. докл. Международного Симпозиума «Арбовирусы и арбовирусные инфекции».- Москва.-3-4 октября.- 1989. С. 34-35;

6. Баркова Э.А., Иерусалимский А.П. Динамика накопления вируснейтрализующих антител у больных с различными клиническими формами клещевого энцефалита. Вопр. вирусологии, 1963, № 2, стр. 189-193;

7. Ван дер Ваден Б.Л. Математическая статистика. М. - I960 - С. 23-38;

8. Варгин В.В., Семенов Б.Ф. Изменение активности естественных киллеров у мышей разных линий на фоне острой и бессимптомной флавивирусной инфекции. Acta virol., 1986, № 30, стр. 303-308;

9. Вирусы комплекса клещевого энцефалита. Левкович E.H., Погодина В.В., Засухина Г.Д., Карпович Л.Г. Издательство Медицина, 1967, Ленинградское отделение;

10. Влияние индуктора ИФН амиксина на продукцию ИЛ-6 клетками периферической крови человека в системе in vitro. Паршина О.В., Гусева Т.С., Тазулахова Э.Б., Ершов Ф.И. - Мед.иммунол., 2000. - Т.2, № 2- С. 230;

11. Волкова Л.И., Образцова Р.Г. Клиническая картина острого клещевого энцефалита на Среднем Урале. Клещевой энцефалит (к 65-летию открытия), -Владивосток, 2002, стр. 88-98;

12. Волкова Л.И., Образцова Р.Г. Эпидемиологические особенности клещевого энцефалита в Свердловской области. В сб. «Эпидемиологическая обстановка и стратегия борьбы с клещевым энцефалитом на современном этапе». М, 2003, стр. 31-32;

13. Воробьёв A.A. Принципы классификации и стратегия применения иммуномодуляторов в медицине. ЖМЭИ. 2002. №4. С. 93-98;

14. Воробьева М.С. 2002. Современное состояние вакцинопрофилактики клещевого энцефалита. Клещевой энцефалит (к 65-летию открытия). -Владивосток, стр. 166-169;

15. Выгодчиков Г.В. Стафилококковые инфекции. Москва, 1963, с.155-157;

16. Грачёва JI.A. Цитокины в онкогематологии М., «Алтус», 1996. - 168 С;

17. Годунов P.C. Иммуномодулирующая и противовирусная активность полипренолов природного происхождения. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук . Москва, 2006;

18. Динамика уровня интерлейкина-6 у септических больных, получавших глюкокортикоиды. Лазанович В.А., Маркелова Е.В., Силич Е.В., Силаев A.A. -Мед. иммунол. 2000. - Т.2, № 2.- С. 224;

19. Дингл Дж. Лизосомы: Методы исследования. М., 1980. -С.332-333;

20. Дубов A.B., Ильенко В.И., Смородинцев A.A. В кн. «Актуальные проблемы вирусных инфекций», М., 1965, стр. 171-172;

21. Деева A.B., Ожерелков C.B., Жукова С.Л., Данилов Л.Л., Мальцев С.Д., Сосновская О.Ю., Санин A.B., Наровлянский А.Н., Пронин A.B. Фоспренил -противовирусный препарат широкого спектра действия. «Ветеринарная практика», 1998.-№1 (4).- С.12-22.

22. Ершов Ф.И. Изменение выработки интерлейкина-4 у больных рассеянным склерозом. Мед. иммунол — 2000 - Т.2, № 2.- С. 180-181;

23. Ершов Ф.И., Новохатский A.C. Интерферон и его индукторы. М., «Медицина», 1980 - 176 С;

24. Ершов Ф.И., Носик H.H. Использование индукторов интерферона для профилактики и лечения арбовирусных инфекций. В Сб.: Тез. докл. Международного Симпозиума «Арбовирусы и арбовирусные инфекции». -Москва, 3-4 октября, 1989, С. 33;

25. Ершов Ф.И., Чижов Н.П., Талазухова Н.Б. Противовирусные средства-Санкт-Петербург, 1993 176 С;

26. Ершов И.Ф., Наровлянский А.Н., Мезенцева М.В. Ранние цитокиновые реакции при вирусных инфекциях. — Журн. Цитокины и воспаление, том 3, №1, стр. 3-6, 2004;

27. Ершов Ф.И. В кн.: Антивирусные препараты, М., 2006, 188 с.

28. Защитное действие нового противовирусного препарата Фоспренил приэкспериментальном клещевом энцефалите. Ожерелков C.B., Тимофеев A.B., Новикова Г.П. и др. Вопр. Вирусол. - 2000. - Т.45. -№1. - С. 33-37;

29. Земсков A.M., Караулов A.B., Земсков В.М. Комбинированная иммунокоррекция. М., «Наука», 1994. - 260 С;

30. Игнатов П.Е. Очерки об инфекционных болезнях у собак. М., 1995.- С. 19-39,91-92;

31. Изучение вирусемии и динамики формирования иммунитета при клинически выраженных и инаппарантных формах клещевого энцефалита. Бычкова М.В., Сарманова Е.С., Мартсон М.А., Коваленко В.Н. 1964

32. Иммунологический статус людей, привитых различными типами инактивированной вакцины против клещевого энцефалита. Первиков Ю.В., Эльберт Л.Б., Крутянская Г.Л. и др. Вопр. вирусологии, 1982, № 6, стр. 56-61;

33. Исследование механизмов резистентности мышей к вирусу гриппа А/Аичи/2/68 при профилактическом введении полипренолов. Шишкина Л.Н., Сафатов A.C., Сергеев А.Н. и др. Antiviral Chem. and Chemiotherapy, 1991,V.ll, № 3.-P. 239-247;

34. Кетлинский C.A., Симбирцев A.C., Воробьев A.A. Эндогенные иммуномодуляторы. СПб., «Гиппократ», 1992. - 256 С;

35. Клиника двухволнового вирусного менингоэнцефалита. Нейровирусные инфекции. Давиденков С.Н., Кулькова Е.Ф., Покровская O.A., Штильбанс И.И.-Л., 1954, стр. 35-77;

36. Кондратенко И.В. и др. Интерлейкин-2 и его роль в развитии иммунодефицитов и других иммунопатологических состояний Иммунология - 1992-№1, стр. 6-10;

37. Кондратьева Я.Ю. Особенности экспериментальной инфекции, вызванной вариантами вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностью. Автореферат диссертации, 2005;

38. Корнева Е.А., Шхинек Э.К. Гормоны и иммунная система. Л., «Наука», 1988.-250 С;

39. Левина JI.C., Погодина В.В. Персистенция вируса клещевого энцефалита в вакцинированном организме. Вопр. вирусологии, 1988, №4,стр.485-490;

40. Левкович E.H. В кн. "Биология вирусов комплекса клещевого энцефалита". Прага, 1962, стр. 317;

41. Лезина М.Н., Воробьева М.С. Изучение штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных из различных эндемических очагов инфекции. В сб. "Этиология, эпидемиология и меры профилактики клещевого энцефалита на Дальнем Востоке". Хабаровск, 1978, стр. 61-64;

42. Леннета Э., Шмидта Н. Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний М., «Медицина», 1974 - С. 42-46;

43. Минаков С.Д., Хованова A.M., Козлов О.Ю. Взаимодействие вируса клещевого энцефалита с перитонеальными макрофагами. В сб. «Диагностика и профилактика вирусных инфекций», Свердловск, 1974, стр. 164-168;

44. Носик H.H. Цитокины при вирусных инфекциях. Вопр. вирусол., 2000 г.-№ 1.-С. 6-12;

45. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. М., 1987;

46. Ожерелков C.B. Роль естественных иммуномодулирующих факторов в патогенезе экспериментальных вирусных инфекций. Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук.1. Москва, 2003;

47. Онищенко Г.Г. Заболеваемость клещевым энцефалитом в Российской Федерации. В сб. «Эпидемиологическая обстановка и стратегия борьбы с клещевым энцефалитом на современном этапе», М, 2003, стр. 5;

48. О роли макрофагов в патогенезе экспериментальной инфекции, вызванной вирусом клещевого энцефалита. Козлов О.Ю., Минаков С.Д., Хованова A.M., Чукреев Е.Ф. ЖМЭИ, 1974, № 8, стр. 20-24;

49. Персистенция вируса и вирусной РНК у больных клещевым энцефалитом. В сб. «Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики клещевого энцефалита». Пиценко Н.Д., Кветкова Э.А., Илюшенко Л.П., Шаманин В.А. Иркутск, 1990, стр. 121-122;

50. Петров Р.В. и др. Иммунология. М., «Медицина», 1987. - 414 С;

51. Петров Р.В. Роль гормонов и медиаторов в функционировании иммунной системы. Вестник АМН СССР. - 1980. - №8. - С. 3-9;

52. Погодина В.В. Персистенция вируса клещевого энцефалита и её последствия. Вестник АМН СССР.- 1983 - № 5 - С.67-73;

53. Погодина В.В., Фролова М.П., Ерман Б.А. Хронический клещевой энцефалит. Новосибирск. «Наука», 1985 - С. 167-183;

54. Погодина B.B. Об устойчивости вируса клещевого энцефалита к действию желудочного сока. Вопр. вирусологии, 1958, №5, стр. 271-275;

55. Потапнев М.П. B-лимфоциты. Цитокинообразующая функция. Иммунология 1994 - №4, стр. 4-7;

56. Применение твёрдофазного иммуноферментного анализа для оценки иммунологической активности вакцины против клещевого энцефалита. Тимофеев A.B., Эльберт Л.Б., Терлецкая E.H. и др. Вопр. вирусол., 1987, № 9, С. 89-93;

57. Рашкес A.M. Докл. АН УзбССР, 1989, №5, с.54-55;

58. Регуляция функциональной активности нейтрофилов цитокинами. Щепеткин И.А. и др. Иммунология, 1994 - №1, стр.4-6;

59. Роль цитокинов в иммуномодулирующих эффектах фосфатов полипренолов противовирусных препаратов нового поколения. Пронин A.B., Ожерелков C.B., Наровлянский А.Н. и др. - Russian J. Immunol. 2000. С. 5, 2, 155-164;

60. Ожерелков C.B., Козлов В.В., Парфенова Т.М., Пронин A.B., Санин A.B., Изместьева A.B., Степанова Т.Н., Наровлянский А.Н.

61. Экспериментальное изучение противовирусной активности препарата гамапрен при инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 типа у мышей. Интерферону 50 лет. Сборник трудов, 19-20.11.2007. Москва, 2007. С. 192-201;

62. Роль эйкозаноидов в регуляции фагоцитарной функции макрофагов фактором активации тромбоцитов при эндотоксическом шоке. Зайцева Л.Г., Вайсбург М.Ю., Шапошникова Г.М. и др. Бюл. экспер. биол. мед. 2000, 9: 309-312;

63. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, изд. второе, Москва 2005, стр.553-554;

64. Садыков A.C., Ершов Ф.И., Новохатский A.C. Индукторы интерферона. — Ташкент: Фаню, 1978.-305 с;

65. Санин A.B. Применение иммуномодуляторов при вирусных заболеваниях мелких домашних животных. РВЖ, МЖД. №1 - 2005. С. 38-41;

66. Санин А., Липин А., Зинченко Е. Современные подходы к лечению вирусных заболеваний;

67. Санин A.B., Туманян М.А. Иммуномодуляторы и гемопоэз. Экспер. онкол., 1988, №10, С. 8-15;

68. Семёнов Б.Ф. Иммунология флавивирусных инфекций. В Сб.: Тез. докл. Международного Симпозиума «Арбовирусы и арбовирусные инфекции». — Москва.-3-4 октября 1989. С.33-34;

69. Семёнов Б.Ф., Варгин В.В. Иммуномодуляторы при вирусных инфекциях и вакцинации. Итоги науки и техники ВИНИТИ. Сер. Вирусология— М., 1989.-С. 1-48;

70. Сочетанное применение препаратов Фоспренил и Максидин для терапии вирусных инфекций мелких домашних животных. Санин A.B., Васильев И.К., Годунов P.C. и др. Вет. клиника, март, 2004, с.23-25;

71. Специфическая и неспецифическая иммунокоррекция. Земсков A.M., Земсков В.М., Золоедов В.И., Бжозовский Е. Успехи Соврем, биол. - 1997

72. Т. 117, Вып.З. С. 261-268;

73. Средство для профилактики и лечения инфекционных заболеваний и коррекции патологических состояний живого организма. Данилов Л.Л., Деева A.B., Мальцев С.Д. и др. Патент на изобретение № 2129867. 10 мая 1999, RU 2129867.-С1;

74. Судаков К.В. Психоэмоциональный стресс М., НИИ им. П.К. Анохина РАМН. - 1992. - 125 С;

75. Фоспренил противовирусный препарат широкого спектра действия. Деева A.B., Ожерелков С.В., Новиков А.Ю. и др. - Журн. Ветеринар. - 1998. -№3. - С. 15-21;

76. Хозинский В.В., Семенов Б.В. Защитное и повреждающее действие цитотоксических Т-лимфоцитов при экспериментальном клещевом энцефалите. ЖМЭИ, 1980, № 4, стр. 56-59;

77. Чекнев С.Б. Недостаточность системы интерферона как механизм развития иммунодефицита по естественным киллерам. Иммунология, 1993, №6, стр. 8-11;

78. Чумаков М.П., Кусов Ю.Ю., Рубин С,Г., Семашко И.В., Сальников Я.А., Рейнгольд В.Н., Прессман Е.К., Цехановская H.A. 1984. Вопр. вирусол., 6, 6957

79. Шаповал А.Н. Стертые формы клещевого энцефалита. В кн. "Клещевой энцефалит". Минск, 1965, стр. 322-328;

80. Экспериментальное обоснование применения Гамавита при дегельминтизации животных четырёххлористым углеродом. Санин A.B., Васильев И.К., Годунов P.C., Ожерелков C.B. Вет. мед. дом. жив., Сб. статей, Вып. 1, Казань, 2004 г., С. 27-30;

81. Экспериментальный клещевой энцефалит как модель для изучения эффективности новых химиопрепаратов. Баринский И.Ф., Попова О.М., Галегов Г.А., Ершов Ф.И. Антивирусные вещества, Рига, 1982. — С. 7-8;

82. Эльберт Л.Б., Ворович М.Ф., Тимофеев A.B. Сравнительный анализ тестов in vitro и in vivo количественной оценки иммуногенности вакцины клещевого энцефалита. Вопр. вирусол., 1998, Т.43, №5, С. 236-238;

83. Янко Я. Математико-статистические таблицы. — M., 1961, С. 1-34;

84. Ярилин А.А. Основы иммунологии: Учебник. — М.: Медицина, 1999. — 608 с. Balkwill F.R. Understanding and exploiting the cytokine network. Cytokines in cancer therapy. Oxford University Press, Oxford, 1989, p.207;

85. Bendtzen K. Cytokines and natural regulators of cytokines. Immunology letters, 1994, №43, pp. 111-123;

86. Bhakdi S, Tranum Jensen J. Alpha-toxin of Staphylococcus aureus. -Microbiol Rev 1991;55:733-51;

87. Bacher M., Eickmann M., Schrader J., Gemsa D., Heiske A. Human cytomegalovirus-mediated induction of MIF in fibroblasts. Virology. 2002;299:32-37;

88. Bernhagen J, Calandra T, Bucala R.Regulation of the immune response by macrophage migration inhibitory factor: biological and structural features. : J Mol Med. 1998 Mar;76(3-4):151-61;

89. Bucala R. MIF rediscovered: cytokine, pituitary hormone, and glucocorticoid-induced regulator of the immune response.FASEB J. 1996 Dec;10(14):1607-13

90. Cardosa MJ. Br Med Bull 1998;54;395-407.

91. Colonna M., Krug A., Cella M. Interferon-producing cells: on the front line in immune responses against pathogens. Curr. Opin. Immunol., 2002, 14, 373-379;

92. Chambers TJ, McCourt DW, Rice CM. Production of yellow fever virus proteins in infected cells: Identification of discrete polyprotein species and analysis of cleavage kinetics using region-specific polyclonal antisera. Virology 1990;177:159-174.

93. Cytokines regulate proteolysis in major histocompatibility complex class II-dependent antigen presentation by dendritic cells. Fierbiger E., Meraner P., Weber E. et. al. J. Exp. Med., 2001, 193 (8): 881-892;

94. Calandra T., Spiegel L.A., Metz C.N., Bucala R. Macrophage migration inhibitory factor is a critical mediator of the activation of immune cells by exotoxins of Gram-positive bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998;95:11383-11388;

95. Calandra T., et al. Protection from septic shock by neutralization of macrophage migration inhibitory factor. Nat. Med. 2000;6:164-170

96. Calandra T., Roger T. Macrophage migration inhibitory factor: a regulator of innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 2003;3:791-800

97. Chen L.C., et al. Correlation of serum levels of macrophage migration inhibitory factor with disease severity and clinical outcome in dengue patients. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2006;74:142-147

98. Cvetkovic I., et al. Critical role of macrophage migration inhibitory factor activity in experimental autoimmune diabetes. Endocrinology. 2005; 146:29422951.

99. Depot-form of phosphopolyprenols as protective remedy for influenza. Pronin A.V., Sanin A.V., Deyeva A.V. et al. Conf. Cairns, North Queensland, Australia 4-9 May 1996. - P. 1-11;

100. Distribution, metabolism and faction of dolicchol and polyprenils. Rip J.V., Rupar C.A., Ravi K., Caroll K.K. Prog. Lipid Res., 1985, V.24, P. 269-309;

101. Fas (CD 95) Fas ligand interactions are responsible for monocyte apoptosis occurring as a result of phagocitosis and killing of Staphylococcus aureus. Baran J., Weglarczyk K., Mysiak M. et. al. - Infect. Immun. 2001, 69 (3): 1287-1297;

102. Emonts M., et al. Association between high levels of blood macrophage migration inhibitory factor, inappropriate adrenal response, and early death in patients with severe sepsis. Clin. Infect. Dis. 2007;44:1321-1328

103. Growth of canine distemper virus in cultured satrocytes: relationship in vivo persistance and disease. Pearce-Kelling S., Mitchel W.J., Summers V.A., Appel M.J.G. Microbial Pathogenesis, 1990, V.8, P. 71-82;

104. Heinz FX. Epitope mapping of flavivirus glycoproteins. Adv Virus Res 1986;31:103-168.

105. Halstead S.B. Immune inhancement of viral infection. -Progr. Allerg., 1982, V.31.-P. 301-364;

106. Heterogeneity of infection enhancement of dengue 2 strains by monoclonal antibodies. Halstead S.B., Venkateshaan C.N., Gentry M.K., Larsen L.K. J. Immunol., 1984, V.132.-P. 1539-1532;

107. Holscher C. The power of combinatorial immunology: IL-12 and IL-12-related dimeric cytokines in infectious diseases. Med. Microbiol. Immunol., 2004, 193, 1-17;

108. Iglesias G., Pijoan C., Molitor T. Arch. Virol.-1989-V.104.-P.107-115;

109. Interleukin-10. Moore K.N. et. al. Annu. Rev. Immunol., 1993, vol.11,pp. 165-190;

110. Interleukin-10 inhibits lipopolysaccharide-induced survival and cytokine production by human peripheral blood eosinophils. Takanashi S. et. al. J. Of Exp. Med. - 1994-vol. 180, #2, pp.711 -718;

111. IL-12/T-cell stimulating factor, a cytokine with multiple effects on T helper type 1 (Thl) but not on Th2 cells. Germann T. et. al. Eur. J. Immunol., 1993, vol.23, №8, pp.1762-1770;

112. Jakowski WJ. Uptake and metabolism of exogenous polyprenols by animal cells. Chemica Scripta, 1987, V.27.-P. 5-9;

113. Jankovic D. Liu Z., Gause W.C. Thl- and Th2-cell commitment during infectious disease: asymmetry in divergent pathway. Trends in Immunol., 2001, 22, 8, 1,450-457;

114. Juttner S., et al. Migration inhibitory factor induces killing of Leishmania major by macrophages: dependence on reactive nitrogen intermediates and endogenous TNF-alpha. J. Immunol. 1998;161:2383-2390

115. Kishimoto T. Studies on interleukin-6 (IL-6). Asian. Med. J., 1992, vol.35, №2, pp.61-69;

116. Kimura K., et al. Role of macrophage migration inhibitory factor in hepatitis B virus-specific cytotoxic-T-lymphocyte-induced liver injury. Clin. Vaccine Immunol. 2006;13:415^19.

117. Kopf M., Bachmann M.F. IL-4 and IL-10 antagonize IL-12 -mediated protection against acute vaccinia virus infection. In: Basel Institute for Immunology. Annnual Report, 1999, N 122.- P. 84-85;

118. Kopf M., Scmitz N. The role of type 1 and type 2 cytokines during pulmonary influenza virus infection. In: Basel Institute for Immunology. Annual Report, 1999, N 122.-P. 87-90;

119. Kunz C., Heinz F.X., Hoffman H. 1980. J. Med. Virol., 6, 103-109.1.ibl H, Tomasits R, Eibl MM, Mannhalter JW. Adjuvant/carrier activity of inactivated tick-borne encephalitis virus. Vaccine. 1998 Feb;16(4):340-5.

120. Lyons R.M., Moses H.L. Eur. J. Biochem., 187, №3, p.467-473, 1990;

121. Leibi H, Toraasits R, Brühl P, Kerschbaum A, Eibl MM, Mannhalter JW. Humoral and cellular immunity induced by antigens adjuvanted with colloidal iron hydroxide. Vaccine. 1999 Mar 5;17(9-10):1017-23.

122. Macrophage migration inhibitory factor is a critical mediator of the activation of immune cells by exotoxins of Gram-positive bacteria. Calandra T., Spiegel L.A., Metz C.N., BucalaR. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1998, 95: 11383-11388;

123. Mathew A, Kurane I, Rothman AL, Zeng LL, Brinton MA, Ennis FA. J Clin Invest 1996;98; 1684-1691.

124. Mason PW. Maturation of Japanese encephalitis virus glycoproteins produced by infected mammalian and mosquito cells. Virology 1989;169:354-364.

125. Membrane insertion: the strategies of toxins. Lesieur C, Vecsey Semjen B, Abrami L et al. Mol. Membr. Biol., 1997;14:45-64;

126. Mogensen T.H., Palludan S.K. Molecular Pathways in Virus-Induced Cytokine Production. Microbiol, and Mollec. Biol. Rew., 2000, Vol.65, N 1. - P. 131-150;

127. Moody D.B. Polyisoprenyl glycolipids as targets of CDl-mediated T-cell responses. Cell. Mol. Life Sei., 2001, V.58, P. 1461-1474;

128. Muotial A., Makela P.H. The role of IFN-7 in murine Salmonella typhimutium infection. Microbial Pathogenesis, 1989, V.8, P. 11-12;

129. Mizue Y., et al. Role for macrophage migration inhibitory factor in asthma. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 2005;102:14410-14415.

130. New immunomodulators of natural origin for therapy of acute viral infections. Sanin A.V., Danilov L.L., Maltsev S.D. et al. Abstr. International Immunol. Congr., Budapest, Hungary, 1992. - P. 214;

131. Oldstone M.B.A., Rail I.B. Intervirology. -1993.-V.35.-P.116-121;

132. Oleszak E L., J. Robert Chang et al. Theiler's Virus Infection: a Model for Multiple Sclerosis. Clin Microbiol Rev. 2004 January; 17(1): 174-207.

133. Ollinger K. Inhibition of cathepsin D prevents free-radical-induced apoptosisin rat cardiomyocytes. Arch. Biochem. Biophys. 2000, 373 (2): 346-351;

134. Parant F., Navernier J. Comparative activity of human and murine tumor necrosis factor in toxicity and anti-infectious assays in mice. Macrobiol. Pathogenesis, 1990, V.8, P. 143-149;

135. Pakozdi A., et al. Macrophage migration inhibitory factor: a mediator of matrix metalloproteinase-2 production in rheumatoid arthritis. Arthritis Res. Ther. 2006;8:R132.

136. Peiris J.S.M., Porterfield J.S. Antibody-dependent enhancement of plaque formation on cell lines of macrophage origin a sensitive assay for antiviral antibody. - J. Gen. Virol., 1981, V.57, P. 119-155;

137. Peiris J.S.M., Porterfield J.S. Antibody-dependent plaque enhancement : its antigenic specificity in relation to Togaviridae. J. Gen. Virol., 1982, V.58, P. 291-296;

138. Phillipots R.J., Stephenson J.R., Porterfield J.S. Antibody-dependent enhancement of tick—borne encephalitis virus infectivity. J. Gen. Virol., 1985, V. 1831-1837;

139. Phosprenyl : A Novel Drug with Antiviral and Immunomodulatory Activity. Danilov L.L., Maltsev S.D., Deeva A.V. et al. Arch. Immunol. Ther. Exp., 1997, Vol.44.-p.395-400;

140. Polyprenols as a possible factors that determine an instructive role of the innate immunity in the acquired immune response. Pronin A.V., Grigorieva E.A., Sanin A.V. et al. Russ. J. Immunol., 2002, V.7, № 2, P. 135-142;

141. Prophylactic activity of dihydroheptaprenol, a synthetic polyprenol derivate, against Sendai virus infection in mice. Iida J., Ishihara C, Mizukoshi N. et al. -Vaccine, 1990 -Vol. 8, N 4.- P. 376-380;

142. Protection from septic shock by neutralization of macrophage migration inhibitory factor. Calandra T., Echtenacher B., Le Roy D., et al. Nature Medicine. 2000,6(2): 164-170;

143. Regulation of a novel pathway for cell death by lysosomal aspartic,and cysteineproteinases. Isahara K., Ohsama Y., Kanamori S. et.al. Neuroscience. 1999,91(1): 233-249;

144. Role of cytokines in immunomodulating effects of polyprenol phosphate, new generation of antiviral drugs. Pronin A.V., Ozherelkov S.V., Narovlyansky A.N. et al. Russ. J. Immunol, 2000, 5. P. 156-164;

145. Radstake T.R., et al. Correlation of rheumatoid arthritis severity with the genetic functional variants and circulating levels of macrophage migration inhibitory factor. Arthritis Rheum. 2005;52:3020-3029.

146. Rice CM, Aebersold R, Teplow DB, et al. Partial N-terminal amino acid sequences of three nonstructural proteins of two flaviviruses. Virology 1986; 151:19.

147. Stephenson JR, Lee JM, Bailey N, Shepherd AG, Meiling J. Adjuvant effect of human growth hormone with an inactivated flavivirus vaccine. J Infect Dis. 1991 Jul; 164(1): 188-91.

148. Study of phosphorilated isoprenoids as novel anti HIV—1 compounds with potent antiviral activity. Sanin A.V., Danilov L.L., Maltsev S.D. et al. Abstr. IX International Conference on AIDS, Berlin, June 1993;

149. Suzuki T., et al. Japanese encephalitis virus up-regulates expression of macrophage migration inhibitory factor (MIF) mRNA in the mouse brain. Biochim. Biophys. Acta. 2000;1517:100-10

150. Timofeev AV, Ozherelkov SV, Pronin AV, et al. Immunological basis for protection in a murine model of tick-borne encephalitis by a recombinant adenovirus carrying the gene encoding the NS1 non-structural protein. J Gen Virol 1998;79:689-695.

151. The medicine for prevention and treatment of infectious diseases and correction of pathologic conditions of living organism. Danilov L.L., Deeva A.V., Maltsev S.D. et al. Russ. Pat. Appl., 1997 - RU 2129867 CI;

152. The role of IL-10 in human B-cell activation, proliferation and différenciation. Itoh K. et. al. The j. of Immunology, 1995, vol.154, №9, p.4341;

153. Tick-borne encephalitis in primates, pathology, immune response and efficasy of vaccination. Hableton P., Stephenson J.R., Baskerville A., Wiblin C.N. -Infect. Immun., 1983, V.40 P. 995-1003;

154. Winkler G, Heinz FX, Kunz C. Studies on the glycosylation of flavivirus E proteins and the role of carbohydrate in antigenic structure. Virology 1987; 159:237243.

155. Wu HC, Huang YL, Chao TT, Jan JT, Huang JL, Chiang HY, King CC, Shaio MF. Identification of B-cell epitope of dengue virus type 1 and its application in diagnosis of patients. J Clin Microbiol. 2001 Mar;39(3):977-82.

Оглавление диссертации Кожевникова, Татьяна Николаевна :: 2008 :: Москва

Введение диссертации по теме "Аллергология и иммулология", Кожевникова, Татьяна Николаевна, автореферат

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2008 года, Кожевникова, Татьяна Николаевна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций