Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуномодулирующая активность низкомолекулярной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из молок лососевых рыб

На правах рукописи

ФЕДЯНИНА ЛЮДМИЛА НИКОЛАЕВНА

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ (ДНК) ИЗ МОЛОК ЛОСОСЕВЫХ РЫБ (фундаментальные и прикладные аспекты)

14.00.36. — Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

ООЗ158254

Владивосток 2007 год

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии СО РАМН и Тихоокеанском государственном экономическом университете

Научный консультант: Беседнова Наталия Николаевна

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ

Официальные оппоненты:

Маркелова Елена Владимировна -

доктор медицинских наук, профессор Просекова Елена Викторовна -

доктор медицинских наук, профессор Воронкова Галина Марковна -

доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация: ФГУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии РАМН имени акад Н Ф Гамалеи (г Москва)

Защита состоится 2007 г в /Ж/ часов на заседании

Диссертационного совета Д 208 007 02 при ГОУ ВПО "Владивостокский государственный медицинский университет" Федерального агентства МЗ и CP РФ по адресу 690002, г Владивосток, ГСП, проспект Острякова, 2 (главный корпус)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО "Владивостокский государственный медицинский университет" по тому же адресу (корпус 3)

Автореферат разослан i

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук, доцент

/Диго Р Н /

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

В настоящее время препараты нуклеиновых кислот иммуномодулирую-щего действия, полученные из различных природных источников, достаточно широко применяются в практической медицине, причем как в виде офи-цинальных лекарств, так и в виде БАД к пище Известны фармакопейные препараты — нуклеинат натрия (РНК, полученная из дрожжей) (Земсков А М , Земсков В М , 1987), деринат (натриевая соль нативной ДНК, выделенная из молок осетровых рыб) (Вайнберг Ю П, Каплина Э Н, 1986), плацентекс-интегро (ДНК из молок форели) (Щегловитова О.Н с соавт, 2005) На основе ДНК из молок осетровых рыб создана БАД к пище "Биостим" (Каплина Э Н , 2005), НПО "Биомед" (Пермь) производит одноименную БАД ("Биостим") из семенников крупного рогатого скота

В настоящей работе представлены результаты исследования иммуномо-дулирующих свойств низкомолекулярной ДНК (нДНК) из молок лососевых рыб, полученной по оригинальной технологии учеными ТИНРО-центра г Владивостока (патент СССР № 915446 Заявлено 10 10 80, опубл 01 07 91 г') Она является основой биологически активной добавки к пище ДНКаС (нДНК + витамин С), разрешенной к применению, зарегистрированной в Федеральном реестре БАД РФ (регистрационное удостоверение № 004978 Р 643 10 2002), которая достаточно широко используется населением Дальнего Востока и ряда других регионов РФ

Единичные исследования иммуномодулирующей активности этой нДНК, проведенные ранее (Беседнова Н Н, Эпштейн Л М, 2002, Павли-нич С Н , 2006), позволили установить, что она регулирует показатели врожденного иммунитета Так, на моделях экспериментальных инфекций мышей, вызванных Escherichia coli, Yersinia pseudotuberculosis, а также Salmonella en-teritidis было установлено ее защитное действие (Беседнова Н Н. с соавт, 1999, Павлинич С Н, 2006) Низкомолекулярная ДНК усиливала гуморальный иммунный ответ на тимусзависимый антиген - эритроциты барана (Беседнова Н Н с соавт, 1999), снижала токсическое действие на организм мышей термостабильного псевдотуберкулезного токсина (Павлинич С Н , 2006) В экспериментах in vitro нДНК стимулировала фагоцитарную активность моноцитов крови по отношению к грамположительным и грамотрицательным микроорганизмам (Беседнова Н Н , Эпштейн JI М , 2002)

Однако эти немногочисленные исследования иммуномодулирующей активности нДНК определяли необходимость дальнейшего углубленного изучения этого биологически активного вещества (БAB) Изучение эффектов нДНК в соответствии с основами доказательной медицины позволит расширить спектр ее практического применения при различных заболеваниях и определит перспективы создания на ее основе лекарственных препаратов

Ранее считали, что ДНК позвоночных не оказывает на организм иммуностимулирующего и иммуномодулирующего действия, поскольку в ней отсутствуют CpG-мотивы, которые в ДНК прокариотов выполняют эту функ-

цию (Рыкова ЕЮ с соавт, 2001) Однако позднее было показано, что ДНК позвоночных также содержит небольшое количество потенциально иммуно-стимуляторных Срв мотивов, и, по-видимому, различия в действии ДНК про- и эукариотов связаны преимущественно с присутствием в геноме позвоночных иммунонейтрализующих последовательностей (Серебряная Н Б с соавт, 2001)

Что касается нДНК из молок лососевых рыб, то фактически неизученными остаются механизмы, определяющие ее действие на гуморальные и клеточные факторы врожденного и приобретенного иммунитета, а также типы отвечающих иммунокомпетентных клеток Не исследован цитокиновый профиль сыворотки крови в ответ на введение нДНК Не изучено ее радиопротекторное действие и влияние на кроветворение, как у интактных, так и у иммунодефицитных животных Все это определяет актуальность настоящих исследований, так как нДНК в виде БАД к пище уже применяется в практической медицине в комплексном лечении различных заболеваний (Беседнова Н Н , Эпштейн Л М , 2002), в то время как механизмы ее действия изучены недостаточно

Цель работы установить закономерности действия нДНК из молок лососевых рыб на иммунную систему и некоторые факторы врожденного и адаптивного иммунитета в экспериментах на иммунокомпетентных (контроль) и иммунокомпрометированных животных (инфекционное заболевание, лучевая болезнь, онкопатология), определить эффективность применения БАД к пище ДНКаС в качестве средства сопровождения лучевой терапии у больных раком молочной железы

Задачи исследования:

1 Дать характеристику действия нДНК на показатели клеточного и гуморального иммунитета у иммунокомпетентных животных

2 Установить влияние нДНК на спонтанную и митогениндуцированную продукцию цитокинов клетками крови здоровых доноров

3 Оценить действие нДНК на некоторые факторы врожденного иммунитета

4 Изучить действие нДНК на течение и исход экспериментального лис-териоза (модель вторичного иммунодефицита, обусловленного инфекционным агентом)

5 Исследовать профилактическое и лечебное действие нДНК при острой лучевой болезни (модель панцитопенического иммунодефицита)

6 Исследовать профилактическое и терапевтическое действие нДНК в эксперименте на модели перевиваемой опухоли (асцитной карциноме Эрлиха)

7 Оценить эффективность применения БАД на основе нДНК в качестве средства сопровождения лучевой болезни у больных раком молочной железы

Научная новизна и теоретическая значимость работы

• Теоретическая значимость работы определяется тем, что впервые на большом экспериментальном материале с использованием иммунокомпе-

тентных и иммунокомпрометированных животных проведена комплексная оценка действия оригинального препарата - нДНК из молок лососевых рыб на иммунную систему и некоторые факторы врожденного иммунитета организма, что позволило установить разносторонние эффекты нДНК и обосновать различные направления ее практического применения Широкий спектр биологических эффектов нДНК, включая действие на иммунную систему и гемопоэз, ресурсная обеспеченность и патентная защищенность препарата, являются обоснованием возможности использования этого биологически активного вещества для создания лекарственной формы

• Дана комплексная оценка изменения активности ферментных систем фагоцитов крови человека под влиянием нДНК из молок лососевых рыб, что расширяет представления о механизмах ее действия Показана способность нДНК повышать функциональную активность этих клеток, участвовать в регуляции антиоксидантного действия, что подтверждает значение экзогенных нуклеиновых кислот любого происхождения в поддержании гомеостаза и перспективность их применения в качестве иммунокорректоров при состояниях, сопровождающихся развитием вторичной иммунологической недостаточности.

• Установлено, что нДНК проявляет свойства индуктора цитокинов с избирательным регуляторным эффектом исходно низкая продукция цитокинов усиливается, исходно высокая ослабляется Изменения касаются, прежде всего, ранних гемопоэтических цитокинов группы 1Ь-3 и вМ-СБР Введение нДНК из молок лососевых рыб обусловливает повышение уровня цитокинов, вырабатываемых преимущественно ТЫ-клетками (П-Ыу), те способствует развитию клеточного иммунного ответа Полученные данные являются обоснованием для расширения спектра практического применения исследуемого препарата, в частности, при вторичных иммунодефицитах, сопровождающихся недостаточностью клеточной системы иммунитета

• На модели экспериментального листериоза установлены некоторые механизмы формирования резистентности организма под действием нДНК из молок лососевых рыб при инфекциях с внутриклеточным паразитированием возбудителя, что позволило рекомендовать БАДы на ее основе в комплексе лечения и профилактике листериоза

• Показано, что повышение устойчивости животных к эффекту радиации (профилактическое и терапевтическое действие нДНК) реализуется путем усиления образования эндогенных и экзогенных селезеночных колоний, более полного и раннего восстановления числа лейкоцитов, массы и клеточ-ности лимфоидных органов, костного мозга у облученных мышей, что обосновывает перспективность применения нДНК из молок лососевых рыб в комплексе лечения лучевой болезни и онкозаболеваний, в программу терапии которых входит лучевая терапия

• Установлено онкопротекторное действие нДНК в эксперименте и им-мунотропные механизмы его обеспечения, а также клиническая и иммуноло-

гическая эффективность в качестве средства сопровождения лучевой терапии у больных раком молочной железы

• Иммуномодулирующее действие нДНК на клеточные элементы врожденного иммунитета (моноциты/макрофаги и нейтрофилы) реализуется путем стимуляции адгезивной активности этих клеток, а также регуляции выделения ими во внеклеточное пространство низкомолекулярных медиаторов (метаболиты кислорода, оксида азота и катионные белки), участвующих в процессах сигнализации различных физиологических функций организма

Практическая значимость работы

С учетом особенностей механизмов действия нДНК (усиление фагоцитоза в нейтрофилах и макрофагах, изменение активности ферментных систем фагоцитов, повышение активности клеточных факторов иммунитета и пр), экспериментально обоснована и доказана целесообразность новых направлений применения используемых в медицине БАД к пище на основе нДНК из молок лососевых рыб

• на модели экспериментального листериоза подтверждена перспективность использования этого БАВ в комплексе лечения инфекционных болезней бактериальной этиологии с факультативным внутриклеточным паразити-рованием возбудителей,

• доказана целесообразность применения БАД к пище ДНКаС в качестве средства сопровождения лучевой терапии больных раком молочной железы для коррекции иммунной недостаточности и нарушений системы кроветворения, что позволяет провести полный курс базовой терапии этих больных

Материалы диссертации были использованы при подготовке:

• информационного письма "Применение БАД ДНКаС и ДНКаВИТ в комплексном лечении больных листериозом" авторов Е А Зайцевой, J1 Н Федяниной, В А Иванис, Н А Белоголовкиной, В М Воронок, Jl М Эп-штейна, Т К Каленик Утверждено руководителем Департамента здравоохранения Администрации Приморского края Владивосток - 2006.

• информационного письма "Применение биологически активной добавки к пище БАД ДНКаС в качестве средства сопровождения лучевой терапии у больных раком молочной железы" авторов JIН Федяниной, Т С Запорожец, С В Юдина, Jl М Эпштейна. Утверждено руководителем Департамента здравоохранения Администрации Приморского края Владивосток -2006

• информационного письма "Listeria monocytogenes - новый микробиологический показатель опасности пищевых продуктов" авторов Л Н Федяниной, Е А Зайцевой, Т К Каленик, В Б Светлова Утверждено руководителем ТУ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю Владивосток -2006

• пособия для практических врачей и фармацевтов "Биологически активные добавки к пище (БАД) Приморского края" авторов А К Гажа,

Н Н Беседновой, Т С Запорожец С П Крыжановского, Л Н Федяниной, Л М Эпштейна Владивосток - 2006

• патента 2230559 Российской Федерации МГЖ7 А 61 К 31/70 Способ стимулирования колониеобразования кроветворных клеток-предшественников в селезенке при облучении животных / Федянина Л Н , Потапова В В , Эпштейн Л М , Беседнова Н Н , Пивненко Т Н , Иванушко Л А , Каленик Т К / Заявитель и патентообладатель НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН Заявл 08 01 2003 Опубл 20 06 2004 Бюл № 17 Апробация материалов диссертационной работы. Основные положения диссертации были представлены на конгрессах и конференциях международного, российского и регионального уровня Всемирном конгрессе по клинической и иммунной патологии (Сингапур, 2002), IX Международном конгрессе по проблемам иммунореабилитации (Москва, 2003), IX Международном конгрессе по клинической патологии (Бангкок, Таиланд, 2003), Международной научно-практической конференции "Здоровье и образование" (Пермь, 2003,2004), Международном симпозиуме по морским лекарствам (Китай, 2004), Всероссийской конференции "Компенсаторно-приспособительные процессы,

фундаментальные, экологические и клинические аспекты", Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2003, 2004, 2005), II Дальневосточном конгрессе "Человек и лекарство" с международным участием (Владивосток, 2005), Объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004), IX Всероссийском форуме "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (2005), Региональной научной конференции "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" (Владивосток, 2004), VI Дальневосточной онкологической конференции "Вопросы диагностики и лечения злокачественных опухолей" (Владивосток, 2004), научной сессии Дальневосточного отделения РАН и Сибирского отделения РАМН (Владивосток, 2004), Всероссийском конгрессе "Оптимальное питание — здоровье нации" к 75-летию Государственного учреждения Научно-исследовательского института питания РАМН (Москва, 2005)

Публикации. Основные положения и результаты работы отражены в 38 научных работах, в том числе 5 - в международной печати, 8 - в журналах рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций, а также в 3 информационных письмах, 1 патенте на изобретение, 1 пособии для врачей и фармацевтов

Объем и структура работы Диссертация изложена на 299 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, главы "Материалы и методы исследования" 6 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, рекомендаций для внедрения результатов исследования в медицинскую науку и практическое здравоохранение, библиографического списка использованной литературы, включающего 444 источников Из них отечественных - 274, зарубежных - 170 Работа иллюстрирована 27 таблицами и 39 рисунками

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Оригинальный препарат нДНК из молок лососевых рыб обладает им-муномодулирующим действием в условиях экспериментальных вторичных иммунодефицитов, вызванных различными факторами (цитостатики, облучение, инфекционные агенты, злокачественный рост)

2 нДНК умеренно стимулирует клеточный и гуморальный иммунитет иммунокомпетентных животных, повышает функциональную активность фагоцитирующих клеток крови человека, повышает сниженные цитостатиком циклофосфаном показатели клеточного и гуморального иммунитета

3 Модуляция иммунного ответа под влиянием нДНК из молок лососевых рыб происходит с участием цитокинов, обеспечивающих развитие реакций гуморального и клеточного типа

4 Профилактическое и лечебное действие нДНК при экспериментальной острой лучевой болезни обусловлено ее влиянием на гемопоэтические цитокины, динамику клеточности и массы лимфоидных органов, стимуляцию пролиферации стволовых кроветворных клеток

5 Динамика цитокинового статуса и показателей периферической крови, больных раком молочной железы получающих лучевую терапию и в качестве средства сопровождения БАД ДНКаС, подтверждают возможность ее применения в комплексе лечения заболеваний, сопровождающихся развитием вторичных иммунодефицитов

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы исследования

Экспериментальные исследования проведены на базе лаборатории иммунологии ГУ НИИЭМ СО РАМН Отдельные разделы работы выполнены в комплексе с лабораторией биоиспытаний и механизма действия БАВ ТИБОХ ДВО РАН, лабораторией иммунологии ГУ НИИЭМ им. Н Ф Гамалеи РАМН, ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, лабораторией патоморфоло-гии и электронной микроскопии ГУ НИИЭМ СО РАМН, радиологическим отделением Приморского краевого онкологического диспансера

Все экспериментальные и клинические исследования проведены с разрешения Комитета по биомедицинской этике ГУ НИИЭМ СО РАМН (протокол № 2 от 06 07 04)

Исследуемое биологически активное вещество - объектом экспериментального изучения служила низкомолекулярная ДНК из молок лососевых рыб, полученная в лаборатории прикладной биохимии Тихоокеанского научно-исследовательского рыбохозяйственного центра по оригинальной технологии, защищенной патентом (Патент СССР № 915446)

Сырьем для получения нДНК являются мороженые молоки лососевых рыб - горбуши (ОпсогЬупскш когЬтсЪа) и кеты (ОпсогкупсЪт Ыа) - 3-4 стадии зрелости Метод выделения нДНК включает в себя солевую экстракцию с последующим осаждением конечного вещества из раствора этиловым спиртом и удалением влаги сушкой на воздухе при комнатной температуре

В состав нДНК входит 79,0% ДНК, 7,8% белка, 2,1% липидов и 10,7% воды Молекулярная масса нДНК составляет 270-500 кДа БАВ ДНК представляет собой аморфный порошок светло-кремового цвета, растворимый в воде при нагревании и не растворимый в органических растворителях Лабораторные животные.

Экспериментальные исследования выполнены на мышах - гибридах Fi (CBAxC57BL6) массой 18-20 г, мышах СВА массой 18-20 г, неинбредных мышах массой 18-20 г, полученных из питомника РАМН "Столбовая" Животные находились на стандартной диете в боксированных помещениях Работа выполнена с соблюдением всех правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах Разброс животных в группе по массе тела не превышал ±10% В каждой опытной группе было от 7 до 10 мышей Все эксперименты повторяли трижды Животные контрольных и опытных групп были одного пола, возраста, получены из питомника одновременно Живот' ных выводили из опыта с использованием эфирного наркоза

Клинический материал Клинические и лабораторные данные проанализированы у 55 больных женщин с гистологически верифицированным раком молочной железы (РМЖ) II и III степени тяжести заболевания, находившихся на лечении в радиологическом отделении Приморского краевого онкологического диспансера (главный врач - д м.н Юдин С В) в 2004-2005 гг Для иммунологических исследований использовали сыворотку крови, забор крови проводили в равных условиях (утром, натощак, в количестве 5-7 мл)

Было сформировано две группы больных раком молочной железы (основная группа и группа сравнения или контрольная группа) Больные основной группы (31 человек) наряду со стандартным лечением получали нДНК в виде БАД к пище ДНКаС (ДНК и витамин С) по 1 грамму (таблетки по 50 мг) в сутки в течение 30 дней Контрольные больные или группа сравнения (24 человека) получали только лучевую терапию, схемы которой были идентичными у обеих групп Забор крови у обследуемых больных проводили дважды до начала лечения (лучевой терапии) и после его окончания

Всех включенных в исследование больных рандомизировали методом случайной выборки (централизованный компьютерный метод) на однородные группы, сопоставимые по возрасту, диагнозу заболевания, клинической картине и степени его тяжести

В сыворотке крови больных РМЖ оценивали уровень и частоту встречаемости ранних гемопоэтических факторов (IL-3, GM-CSF), провоспали-тельного цитокина (TNFa) и маркерных цитокинов ТЫи Th2 ответа, (IFNy и IL-10 соответственно)

Для определения влияния нДНК на картину гемопоэза у этих же больных проводили анализ гемограмм (содержание лейкоцитов, эритроцитов, гемоглобина, тромбоцитов) Клинический анализ крови осуществляли в соответствии с общепринятой методикой на гематологическом анализаторе Cobas Mira "Roche" (Швейцария)

Функциональную активность лейкоцитов под действием нДНК определяли в периферической крови практически здоровых людей - первичных доноров, которую получали на Краевой станции переливания крови г Владивостока (главный врач Вакуленко А Г )

Микроорганизмы, используемые в работе

Микроорганизм Штамм Источник выделения LD50 для неинбред-ных мышей

Listeria monocytogenes №2531/2, "wide type" Курица (смыв с тушки) 6,31х102 КОЕ/мл

Listeria monocytogenes Типовой 4„ Получен из коллекции лаборатории патогенных бактерий ГУ НИИЭМ СО РАМН 6,31х106 КОЕ/мл

Исследования БАВ нДНК и БАД к пище на ее основе проводили с учетом методических указаний "Определение безопасности и эффективности биологически активных добавок к пище" (МУК 2 3 2 721-98) и рекомендуемых унифицированных экспериментальных моделей, адекватных вторичным иммунодефицитным состояниям человека Все направления, методы и объем проведенных исследований представлены в таблице 1

Таблица 1

Направления, методы и объем исследования

№ Направление Методы исследований Объем

исследования исследования

1 2 3 4

1 Исследование влия- 1 Определение АОК у мышей, им- 290 мышей

ния нДНК на гумо- мунизированных ЭБ (Jeme N, Nordin (CBAxC57BL6)

ральное и клеточное А, 1963) Р1

звено иммунного от- 2 Определение продукции антител- 250 мышей

вета гемагглютининов у мышей, иммунизированных ЭБ (Петров Р В с соав , 1995) 3 Исследование спонтанной и индуцированной митогенами пролиферации лимфоцитов периферической крови in vitro (РБТЛ) (Петров Р В с соав, 1995) 4 Исследование РГЗТ у мышей, иммунизированных ЭБ (Lagrange Р Н et al, 1974), 5 Определение массы и клеточности лимфоидных органов интактных мышей (Запорожец Т С , 1997) (CBAxC57BL6) Р1 250 мышей (СВАхС57ВЦ0 Р1 300 неинбред-ных мышей 300 неинбред-ных мышей

Оценка влияния нДНК на неспецифическую резистентность организма

I Получение фракции адгезирующих клеток крови

II Прижизненные тесты (Сомова Л М , Плехова Н Г с соавт, 2005) Определение функциональной активности клеток в нативном состоянии при их нагрузке Определение адгезивной активности клеток на пластик

Определение восстановления нитро-синего тетразолия фагоцитирующими клетками спектрофотометриче-ским методом

Определение продукции N0 фагоцитирующими клетками

III Определение ферментативной активности клеток

Определение активности миелопе-роксидазы (Гомори, 1978) Активность АТФ-азы и 5'-нуклеотидазы по методу Г Б Кирили-чевой и соавт, 1986 Определение количества неферментных катионных белков в фагоцитирующих клетках (В Е Пигаревский, 1978)

Активность цитохромоксидазы по методу А В 1*ктко1Т, Б ОоМПБсЬег в модификации Л М Сомовой, Н Г Плеховой с соавт (2005) Активность дегидрогеназ определяли по методу Ллойда (1965) в модификации Л М Сомовой, Н Г Плеховой с соавт (2005)

IV Определение цитотоксической активности препарата

V Элекгронномикроскопические исследования

20 образцов 120 проб 90 проб

180 проб 180 проб

180 проб 180 проб 180 проб 180 проб

180 проб

90 проб

180 проб

180 проб 5 проб

Исследование влияния нДНК на спонтанную и митогенин-дуцированную продукцию цитокинов клетками крови доноров

Определение продукции цитокинов в культурах клеток цельной крови (метод — сэндвич-варианта твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем "Протеиновый контур") (ILIO, IFNy, IL-3, GM-CSF) и "Цитокин" (TNFa) _ _

215 проб крови первичных доноров

4 Изучение эффективности действия нДНК на модели экспериментального листери-оза (иммунокомпро-метированные животные) Оценка влияния нДНК на антиинфекционную резистентность макроорганизма m vivo Оценка влияния БАВ нДНК на динамику численности листерий в органах зараженных животных 470 неибредных мышей 360 неибредных мышей

5 Исследование влияния нДНК на неспецифическую резистентность облученного организма (модель вторичного иммунодефицита - костномозговая стадия острой лучевой болезни) Радиобиологические методы 1 Определение выживаемости и средней продолжительности жизни (СПЖ) облученных мышей (Клем-парскаяНН, 1981) 2 Определение массы и клеточности лимфоидных органов облученных мышей (Клемпарская Н Н 1981) 3 Определение эндо- и экзоколоние-образования (Till J, McCulloch Е А , 1961), 4 Исследование динамики лейкоцитарной реакции мышей 300 неибредных мышей 300 неибредных мышей 300 неибредных мышей 260 неибредных мышей

6 Изучение действия нДНК на модели ас-цитной карциномы Эрлиха у мышей Получение клеток асцитной карциномы Эрлиха. Определение цитоток-сической активности препарата Исследование противоопухолевой активности препарата m vivo 50 неинбредных мышей 105 неибредных мышей

7 Клинические исследования эффективности нДНК Изучение уровня ци-токинов в сыворотках крови больных РМЖ, получавших и не получавших БАД в ком-пле-ксе лучевой терапии Исследование цитокинов методом сендвич-варианта твердофазного иммуноферментного анализа с помощью реактивов "RdD Diagnostics Inc" (США) согласно прилагаемой инструкции Изучение историй болезни, статистическая обработка данных гемограммы 550 проб 55 женщин больных РМЖ

8 Статистический анализ цифровых данных Статистическую обработку полученных результатов исследований проводили с учетом параметрического критерия Стьюдента, непараметрического Т-критерия Уилкоксона, коэффициента корреляции Спирмена на основе пакета прикладных программ "Statistica 6,0 for Windows 2000" Все цифровые данные

Результаты исследований

Влияние нДНК на гуморальный и клеточный иммунный ответ

Оценку влияния нДНК на гуморальный ответ проводили путем определения количества антителообразующих клеток (АОК) в суспензии клеток селезенки и титров антител - гемагглютининов (ГА) в сыворотках крови мышей гибридов Р1 (СВАхС57ВЬ6) а также, мышей линии СВА после иммунизации гетерологичным корпускулярным антигеном эритроцитами барана (ЭБ) (5x108) Такие же показатели определяли у мышей этих линий на фоне иммуносупрессии, вызванной циклофосфаном, а также у неинбредных старых мышей (12 месяцев) с возрастным иммунодефицитом

Влияние нДНК из молок лососевых рыб на число антителообразующих клеток селезенки и кинетику антител у мышей гибридов Р1 (СВАхС57ВЬ6)

При введении нДНК подкожно в индуктивную фазу антителообразова-ния при всех испытуемых дозах вещества (1 мг, 10 мг, 100мг/кг массы мыши) наблюдалось достоверное повышение количества АОК в селезенке (в 1,8, 2,6 и 2,5 раза соответственно) по сравнению с контролем Действие нДНК в продуктивную фазу антителообразования было менее выраженным при дозе 1 мг/кг индекс стимуляции (ИС) составил 1,7, при 10 мг/кг и 100 мг/кг- 1,9 (табл 2)

Таблица 2

Формирование АОК в селезенке мышей И! (СВАхС57ВЬ6) при подкожном введении нДНК в различных дозах

Доза Абсолютное число АОК

№ п/п нДНК мг/кг массы мыши Контроль (0,85% №01) Введение нДНК в индукт фазу АТ/образов Индекс стимуляции Введение нДНК в продукт фазу АТ/образов Индекс стимуляции

1 1 40868±1964*** 1,8 37710±1965*** 1,7

2 10 22602±2546 58574±2086*** 2,6 43234±1645*** 1,9

3 100 56967+1998*** 2,5 41900±1466*** 1,9

Примечание * значимость различий по сравнению с контрольными показателями - * р < 0,05 ** -

р < 0 01, *** - р < 0,001, индекс стимуляции рассчитан как отношение количества АОК в опытных и контрольных группах

При исследовании влияния подкожного введения нДНК на динамику ГА у мышей этой группы на 4, 7 и 14 сутки после иммунизации достоверное повышение показателей во все сроки наблюдения отмечалось только при дозе 10 мг/кг - 7,8+0,28 1о§2, р < 0,05 (в контроле (6,7+0,26 7,9+0,34 р < 0,05 (7,0±0,27 8,0±0,27 \о&, р < 0,01 (6,8±0,19 1о§2) При введении ДНК в других дозах ее действие было менее выраженным

Влияние нДНК при пероральном введении на гуморальный иммунный ответ исследовали у мышей с экспериментальным иммунодефицитом

(табл 3) Этот вариант экспериментов был обусловлен тем обстоятельством, что нДНК разрешена к применению в виде БАД к пище ДНКаС

Таблица 3

Количество АОК и титр антител у мышей Р1 (СВАхС57ВЬ)6 после перорального введения нДНК при первичном иммунном ответе к ЭБ на фоне иммуносупрессии, вызванной однократным введением ЦФ

Группа животных Доза, мг/кг АОКхЮ6 Число АОК на селезенку Титр гемагглютининов титра)

Контроль 1 92,7±16,9** 27200±5438" 9,25+0,16х*

Контроль 2 35,8±4,6 7205±1110 8,73±0,14

ДНК 1 48,3±14 7625+2001 8,02+0,12

ДНК 10 90,6+15" 19620+3600** 10,0+0,18"*

ДНК 100 94,7±18,6** 22653+2029" 10,6±0,18*"

Примечание контроль! - мыши, получавшие перорально 0,5 мл 0,85%-го раствора ЫаС1, контроль 2 - мыши, получавшие циклофосфамид и 0,5 мл 0,85%-го раствора ЫаС1 * - значимость различий между опытными группами и контрольной группой 2 - * р < 0,05 ** р < 0,01 *** -р< 0,001

Экспериментальный иммунодефицит моделировали внутрибрюшинным введением циклофосфамида однократно в дозе 100 мг/кг массы мыши Введение иммунодепрессанта мышам приводило к угнетению процесса накопления АОК в селезенке и уменьшению титров гемагглютининов к ЭБ по сравнению с показателями у мышей, которые получали только ЭБ Нивелирование при помощи нДНК (в дозе 10 и 100 мг/кг) супрессирующего действия ЦФ проявилось увеличением уровня АОК и титра ГА Однако ни в одном случае показатели мышей опытных групп не достигали уровня показателей контрольных мышей (табл 3) Таким образом, нДНК вносит коррективы в иммунодефицитное состояние, умеренно повышая уровень гуморального ответа на корпускулярный антиген

Влияние нДНК на количество антителообразующих клеток селезенки и кинетику антител у мышей СБА

При исследовании зависимости уровня ГА от дозы и способа введения нДНК у мышей линии СВА, было установлено, что оптимальный адъювант-ный эффект наблюдается при введении ее подкожно в дозе 10 мг/кг на 4-е, 7-е и 14-е сутки после иммунизации, при пероральном введении нДНК -только на 14-е сутки Оценивая в целом действие нДНК на антителообразо-вание, следует отметить умеренную стимуляцию ^М — антителообразования, титры антител у мышей, получавших нДНК, превышали контрольные на 1222% При этом более эффективным было подкожное введение нДНК

Значимое увеличение количества АОК наблюдалось при введении нДНК в индуктивную фазу антителообразования в дозе 10 и 100 мг/кг (табл 4)

Уменьшение супрессирующего действия ЦФ под влиянием нДНК (в разных дозах) проявилось увеличением уровня АОК и 1§М-антител, но ни в

одном случае показатели мышей опытных групп не достигали уровня показателей контрольных мышей (табл 5)

Таблица 4

Формирование АОК в селезенках мышей СВА к эритроцитам барана после подкожного введения нДНК из молок лососевых рыб в различных дозах

№ Доза нДНК, мг/мл Контроль (0,85% NaCl) Введение нДНК в ин-дукт фазу антитело-образования Введение нДНК в продукт фазуанти-телообразования

п/п АОК (хЮ6) Абсол число АОК АОК (хЮ6) Абсол число АОК АОК (хЮ6) Абсол число АОК

1 1 168± 22602±25 210+15,6 * 40868± 1964*** 195+18,5 37710+ 1965***

2 10 11,5 46 311+ 36,1** 58574+ 2086*** 254±19** 43234± 1645***

3 100 298+45* 56967± 1998*** 242+20** 41900+ 1466***

Примечание * - значимость различий между опытными и контрольными группами *р<0,05, **р <0 01,***-р<0,001

Таким образом, также как и в первом случае, нДНК вносит коррективы в иммунодефицитное состояние, умеренно повышая уровень гуморального ответа на корпускулярный антиген

Таблица 5

Количество АОК и титр антител у мышей СВА при первичном иммунном ответе на фоне иммуносупрессии, вызванной однократным введением циклофосфамида, при введении per os нДНК в различных дозах

№ п/п Группа АОК(хЮ6) Абсол число АОК Титр гемагглюти-нинов (Log2 титра)

1 Контроль 1 168111 27865±2656 9,25±0,17

2 Контроль 2 79+18,6 19365+1228 5,1±0,12

3 нДНК 1 мг/кг 110,8+9,6 21623±2115 8,6+0,14***

4 нДНК 10 мг/кг 128,4±9,9* 23511+3110 10,16+1,2**

5 нДНК 100 мг/кг 121,3+10,0 20050+4344 9,65+1,4**

Примечание контроль 1 - мыши, получавшие перорально 0,5 мл 0,85%-го раствора ЫаС1, контроль 2 - мыши получавшие циклофосфамид и 0,5 мл 0,85%-го раствора ЫаС1, * - значимость различий между опытными группами и контрольной группой 2 * р < 0,05, ** р < 0,01, ***-р <0,001

Влияние нДНК на число антителообразующих клеток селезенки и кинетику антител у неинбредных старых мышей

Препаратами низкомолекулярных нуклеиновых кислот рекомендуют обогащать рацион пожилых людей для замедления процессов старения (Караулов А В с соавт, 2002) В связи с этим, мы исследовали влияние нДНК на гуморальный иммунитет у старых мышей На рис 1 представлены результаты, демонстрирующие усиление антителообразования и увеличение числа АОК в селезенке как старых (12 месяцев), так и молодых мышей под действием введенной подкожно нДНК Пероральное введение нДНК увеличивало сниженные показатели гуморального ответа только в дозах 10 и 100 мг/кг При этом показатели у старых животных, получивших нДНК, не достигали уровня таковых у молодых животных, однако различия были статистически значимыми

Примечание * - р < 0 005 ** р < 0,01, *** - р < 0,001, контроль 1 - мыши молодые, контроль 2 -

мыши старые

Рис 1 Титр антител (столбики) в сыворотках крови и количество антителообразующих клеток (кривые) в селезенке неинбредных мышей в возрасте 12 месяцев при подкожном (1) и пероральном (2) введении нДНК

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что нДНК дозозависимо оказывает стимулирующее действие на гуморальный иммунитет, в большей степени выраженное при подкожном ее введении в индуктивную фазу антителообразования Преимущественное влияние нДНК на индуктивную фазу иммунного ответа может быть обусловлено ее влиянием на любой из процессов, протекающих в этот период, — активацию (выход клеток из фазы покоя в S-фазу клеточного цикла) или пролиферацию лимфоцитов Кроме того, возможно, что эффект нДНК опосредуется через действие на ТЬ2-клетки и выработку ими цитокинов, необходимых для развития этих процессов Некоторые аспекты, в частности, способность изучаемой нДНК влиять на синтез и продукцию цитокинов клетками крови первичных здоровых доноров, изучена нами и представлена в следующих разделах работы

Влияние исследуемой нДНК на клеточный иммунитет оценивали по изменению пролиферации лимфоцитов - in vitro в реакции бласттрансформа-ции лимфоцитов (РБТЛ) (спонтанной и индуцированной митогенами) (табл 6) и m vivo - в реакции гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ) (как на стадии сенсибилизации, так и разрешения) (табл 7)

Полученные результаты показали, что нДНК дозозависимо стимулирует реакцию бластгрансформации лимфоцитов При этом усиление пролиферации спленоцитов, вызванное внесением этого БАВ в культуру клеток, сопровождается и повышением пролиферативного ответа клеток на Т-клеточный митоген (табл 6)

Таблица 6

Влияние различных доз нДНК на спонтанную и митогениндуцированную пролиферацию лимфоцитов

Включение 3Н-тимидина, имп/мин

№ п/п Группа Спонтанная пролиферация лимфоцитов ИС Митогениндуциро-ванная пролиферация лимфоцитов ИС

1 Контроль 878±95 - 99951721 -

2 нДНК-1 мг/мл 12301125* 1,4 12350±750* 1,2

3 нДНК-10 мг/мл 1548+98*** 1,8 1552511230*** 1,55

4 нДНК-100 мг/мл 1590+102*** 1,8 18230+1150*** 1,8

Примечание * - значимость различий между опытными группами и контрольной группой * р < 0,05, ** р < 0,01, *** - р < 0,001, ИС - индекс стимуляции - рассчитан как отношение среднего значения пролиферации в импульсах в минуту в опытных и контрольных культурах " I. ' <--г ' ~

Таблица 7

Влияние различных доз нДНК на реакцию ГЗТ у мышей

№ п/п Срок введения нДНК Контроль -% прироста веса лапки (М±т) % прироста веса лапки (М±т) при введении нДНК в разных дозах, мг/кг

1 10 100

1 За 3 суток до сенсибилизации ЭБ 16,4±0,65 25,7+3,1** 29,4±3,0*** 22,5±4,1

2 За сутки до сенсибилизации ЭБ 18,9+0,95 23,4±2,9 31,7±3,9** 26,1±5,4

3 Одновременно с сенсибилизацией ЭБ 19,4+1,1 24,5±3,5 26,5±2,9* 18,4+2,7

4 Перед разрешающей дозой ЭБ 18,1+0,86 20,8±2,8 27,4+3,2* 24,4+1,8**

Примечание * - значимость различий между опытными группами и контрольной группой мышей * р <0,05, ** р <0,01 ***-р <0,001

Закономерность, выявленная in vitro, нашла отражение в модельной системе in vivo. Для оценки влияния нД11К на индуктивную и эффектсрную фазы клеточного иммунного ответа введение 1а А В осуществляли за 3-е суток, сутки и одновременно с сенсибилизирующей дозой, а также перед разрешающей дозой антигена - ЭБ. Результаты показали, что в группе мышей, получавших нДНК, только при введении этого БЛВ в дозе Ю мг/кг отмечался статистически значимый прирост массы лапки по сравнению с контролем (табл. 7).

В целом, результаты, представленные в этом разделе, показывают способность нДНК оказывать дозозависимый модулирующий эффект на реакции гуморального и клеточного иммунитета in vivo и in vitro.

Влияние пДМГС на функциональную активность фагоцитирующих клеток крови здоровых доноров

В течение первых часов после заражения организма большинство инфекционных агентов распознается и разрушается с помощью механизмов врожденного иммунитета. Составляющие его компоненты не являются анти-генспецмфическими и не требуют длительного периода дли индукции. К основным клеткам, реализующим ранний ответ, относятся фагоцитирующие клетки крови, представленные в основном иейтрофилами.

При исследовании показателей некроза фагоцитов под влиянием нДНК были установлен ft отсутствие ее ц итого к си ч с с ко го действия на клетки (рнс. 2). I la протяжении всего срока наблюдения при контакте клеток с мДНК показатель некроза фагоцитов статистически значимо не отличался от такового лля интактных клеток. Также нами не обнаружено проапоптоти чес кого действия нДНК на фагоциты.

■fr ■ ■

®

л*

Рис. 2. Жизнеспособные фагоциты (а) и отсутствие апоптоза клеток (б), после совместной инкубации с нДНК. Окраска акридиноным-оранжевым и по Хесту 36. Увеличение хЮОО

Отсутствие цитотокеического действия нДНК было подтверждено при исследовании активности дегндрогеназ митохондрий клеток. При внесении этого БАВ в низких концентрациях в начальные сроки контакта с ним клеток отмечалось повышение показателей активности фермента по сравнению с

интактиыми фагоцитами (рис. 3), что указывало на стимуляцию их функциональной активности. При контакте с фагоцитирующими клетками крови не было обнаружено цитотокс и ч е ско го действия нДНК, напротив отмечалось повышение показателей активности фермента су к цинатде гидрогена зы фагоцитирующих клеток, что указывает на стимуляцию их функциональной активности (рис. 3).

□ 1ч«1,5чЕ2чИ2,5чазч Примечен не: * - р< 0,05, »» - р < 0,0); *** р < 0.001

Рис. 3. Активность сукхщнатдегидрогеиазы митохондрий фагоцитирующих клеток кропи при их взаимодействии с нДНК, Здесь и далее ось абсцисс - количество внесенной нДНК (мг/мл), ось ординат - индекс с тимуляции <Т, %)

Влияние нДНК на адгезию фагоцитов № пластик и их функциональную активность

При исследовании адгезивной способности фагоцитирующих клеток крови под влиянием нДНК было установлено ее повышение (рис. 4). Так, максимальные показатели были отмечены через 3 часа контакта клеток с препаратом при всех взятых в опыт его концентрациях. Внесение нДНК п меньших концентрациях (0,0001 и 0,001 мг/мл) приводило к возрастанию адгезивной активности клеток в более короткий период, что указывало на ее дозозависимое действие.

М.А.Туманян и Г.Б.Кириличевой (1988) был предложен способ первичного отбора им му но модуляторов, перспективных в плане повышения устойчивости животных к инфекции, основанный на определении активности фермента плазматической мембраны перитонеальных макрофагов - 5'-нуклеотидазы.

Снижение уровня этого фермента, играющего важную роль в регуляции адснозинового обмена, рассматривается как проявление биохимических процессов, сопровождающих активацию макрофагов.

Нами установлено отчетливое снижение активности З'-нуклеотидазы плазматической мембраны фагоцитирующих клеток под влиянием нДНК. На рис. 5 представлены данные, отражающие снижение внутриклеточного со-

держания этого фермента, что указывает на активацию фагоцитов п ответ на введение нДНК.

□ 0.75 и £31 ч 01.5 ч 02 ч Й2.5 ч ЫЗч

Примечание. ■ р<0,05; ** - р<<Ш1;"* -р с 0,001

Рис. 4. Показатели адгезивной активности фйгоцжов крови после та контакта с нДНК

Известно, что при стимуляции клеток или повреждении целостности их мембран выявляется резкое увеличение концентрации различных ионов в цитоплазме, что приводит к активации ферментов Са' -АТФ-аэы и Иа7К'-АТФ-аз

ш! мл

я,о<да о,оо1 0.01 ол 1

О 1ч П2 ч НЗч

Примечание. * - р < 0,0 5, * * р < 0,0I, р< (1.001.

Рис. 5. Активность З'-муклеотилазы в фагоцитирующих клетках крови при их взаимодействий с нДНК через 1, 2, 3 часа к оптанта

Активность этого фермента также выявляется при усилении синтетической активности клеток, связанной со стимуляцией процесса транскрипции информации с нД| 1К, Нами установлено, что на протяжении всего срока наблюдения показатели активности АТФ-дзы были выше, чем значения для ин-тактиых клеток (рис. б). Наибольшая активность фермента отмечалась в период от двух часов и ДО конца срока наблюдения, показатели при этом составили от 14,8±1,2 до 21,4+1,6%. Вероятно, внесение нДНК опосредованно и дозонезависимо стимулирует этот процесс в фагоцитах крови, что подтвер-

ждается равномерным распределением показателей активности АТФ-азы фагоцитов. Эти данные способствуют пониманию механизма усиления процессов репарации пол влиянием мДНК при патологических процессах (Мукси-нова K.M. с соавт., 1971).

□ .001 О 01

a i.SvmZxBJt - |>t o,0l. - п с 0.001.

Примечание * p^O.OS;**

О 0001 к

Рис. Ь. Активность АТФ-а?м фагоцитов крови при вз&исодействии с «ДНК

Таким образом, показано, что под влиянием нДНК возрастает адгезивная способность фагоцитирующих клеток крови. При этом отмечается снижение активности эктофермсита плазматической мембраны 51 - ну клеотидазы, что указывает на стимулирующее воздействие этого препарата на клетки. Выявленное нами повышение активности АТФ-азы фагоцитов при внесении нДНК отражает изменение метаболизма клеток, в частности, свидетельствует о стимуляции процесса транскрипции в этих клетках, так как в преобразовании нуклеотидов определенное значение имеет активность этого фермента (Кириличева Г.К. с соавт., 1992).

Влияние нДНК на активность кисаородзавнашых ферментных систем к проекцию метаболитов оксида азота фагоцитирующих клеток крочи

Известно, что при различных патологических состояниях организма значительно увеличивается количество кислорода, потребляемого фагоцитирующими клетками, что ведет к образованию обширного ряда реактивных оксидаитов. Эти окислители используются для уничтожения поглощенных микроорганизмов, но при чрезмерной наработке могут вызывать множественное разрушение окружающих тканей (Droge W., 2002).

Для отражения степени активации кислородзависимшо метаболизма фагоцитов используется гистохимический метод с нитросинмм то разили е.и (НСТ-тест). При исследовании фагоцитирующих клеток крови под воздействием нДНК в НСТ-тесте было установлено снижение активности кислород-зависимого метаболизма этих клеток (pite. 7). Гак, отмечалось статистически значимое снижение показателей относительно контрольных при внесении в суспензию клеток нДНК в низких концентрациях (0,0001; 0,001; 0,01 и 0,1 мг/мл) уже после 1,5 часа контакта. Отрицательные минимальные значения индекса стимуляции составили 10,4±0,9; 9,4±0,7; 9,4±0,8 и -18,5+1,3% соответственно через X часа Контакта. При добавлении нДНК в концентрации

! мг/мд индекс стимуляции быв положительным уже дасле 1,5 часа к составил 6,24±0,4 %.

т, % и

7

о -7 -м ■21

Примечание: *-р <0,05. " р < 0,0!, *** - р с 0,001

1'ис. 7. Влияние ДНК на показатели НСТ-теста в фагоцитируют^ клетках кроии

Дактатдегищрогеназа входит в ферментные системы к и ел ор од:) а в и с и м ого механизма фагоцитов и принимает активное участие в начальном преобразовании субстратов, которые используются клетками я дальнейшем ©бразо-пани и реактивных видов кислорода. Установлено, что в ответ на введение »ДНК активность лаюатдегидрогеназы в фагоцитах крови уменьшалась при действии нДНК при всех концентрациях, кроме 0,0001 мг/мл (рис, 8). Минимальные показатели при внесении препарата в концентрациях 0,001 и 0,01 мг/мл пыли отрицательными и составили -17,6x0,7% через 2,5 часа и при добавлении нДНК в концентрациях 0,1 и I мг/мл --19,6+1,1 и ¡3,7+1,2% соответственно, через 3 часа контакта.

Т.Ч. )

0-5-10-15. •20.

Приминание: * -р< 0,05;** р < 0,01, - р < 0,00]

Рис. 8. Активность Лактатдеги дроге низы в фагоцитирующих клетках крови при их взаимодействии с ¡¡ДНК

МГ/МЛ

С В 0,73 4 О 1 ч [12ч □ Зч

00001 0001 0.01 01 1

чг/нл

□ 0,75чВ1 п2ча2,5ч азч

Таким образом, обнаруженное нами под воздействием нДНК отчетливое уменьшение активности лактатдегидрогеназы в фагоцитирующих клетках указывает на снижение способности этих клеток к продукции реактивных видов кислорода

Цитохромоксидазу считают маркерным ферментом митохондриальной мембраны Этот фермент принимает участие в промежуточном этапе преобразования реактивных видов кислорода, и его активность может служить достоверным показателем уровня окислительного метаболизма в клетках (Кольман Я, 2000) Снижение активности цитохромоксидазы в фагоцитах крови было установлено при внесении нДНК в минимальной (0,0001 мг/мл) и средней (0,1 мг/мл) концентрациях При добавлении препарата в остальных концентрациях (0,001, 0,01 и 1 мг/мл) снижение активности фермента отмечалось только через 45 минут контакта, что свидетельствует о дозозависимом действии нДНК

При стимуляции фагоцитарных клеток включается система, катализирующая последовательную продукцию реактивных видов кислорода Активность данной системы в фагоцитах под влиянием нДНК была оценена нами с помощью НСТ-теста Одновременно в этих клетках было исследовано внутриклеточное содержание ферментов - лактатдегидрогеназы и цитохромоксидазы, которые отражают начальный и промежуточный этапы образования активных форм кислорода Установленное снижение показателей активности этих ферментов в фагоцитах крови под влиянием нДНК указывает на ее ре-гуляторный эффект в отношении продукции активных форм кислорода этими клетками

Миелопероксидаза - железосодержащий протеин, катализирующий преобразование перекиси водорода в гидроксильный радикал, который вступает в реакцию с кислородом и образует молекулу воды. Активность этого фермента, нейтрализующего активные формы кислорода, является показателем состояния антиоксидантной системы клеток

Установлено, что через 2,5 часа контакта после добавления нДНК к монослою фагоцитирующих клеток крови наблюдается увеличение активности миелопероксидазы (рис 9) Максимальные показатели отмечены после 3-х часов контакта при внесении препарата во всех используемых концентрациях В этот период времени для нДНК, взятых в концентрациях 0,0001, 0,001; 0,01, 0,1 и 1 мг/мл, они составили 12,89+0,7, 44,38±3,4, 29,4±1,7, 30,9±2,1 и 28,4+1,7% соответственно Таким образом, добавление нДНК к фагоцитам вызывает возрастание активности данного фермента на поздних сроках, что свидетельствует о стимулирующем эффекте на системы защиты клеток от реактивных форм кислорода, особенно при внесении БАВ в средних концентрациях -0,001; 0,01 и 0,1 мг/мл

Продукция фагоцитами реактивных видов кислорода при инфекционных заболеваниях играет положительную роль, так как они обладают выраженной бактерицидностью Тем не менее, при длительной и чрезмерной их продукции, которая отмечается в фагоцитах крови при некоторых хронических за-

болсвяннях, может проявляться их повреждающий эффект на окружающие клетки и ткани. Установленное в данной серии экспериментов ре гул я тор нос ангшо&^елнтельное действие и ДНК на изученную нами популяцию клеток является одним из молекулярных механизмов реализации позитивного эффекта этого ЕАВ.

У • * *

40- *** ш * + ■

25- р л

10-

5- х - ■

0.0001 0.001 0,01 0,1 1

4TJW.FI

ГС0,75 и Я 1,5 ч В2.5ч 03 ч П^имкчание * р с 0,СЬ. *' - р «г 1Ц)1, - р< 0,00?.

Рис. 9. Активность миело перо кии даты фагоцитов после их взаимодействия с нДНК

В литературе последних лет особое значение в ряде кислородзапискмых метаболитов, помимо активных форм кислорода, придается нитрооксядчым радикалам. При этом указывается на то, что уровень продукции активных форм N0 в этих клетках коррелирует с такими классическими критериями активации, как усиленная продукция активных форм кислорода и микроби-цидность.

Для исследования активности ннтроксидзааиснмой системы фагоцитирующих клеток крови при их взаимодействии с нДНК нами был использован метод косвенного выявления нитрит-аниона при применении реактива Грисса.

Установлено, что после внесения В ДНК в концентрациях от 0,0001 до 0,1 мр/мл в монослой фагоцитирующих клеток крови отмечается отчетливое Снижение количества метаболитов оксида азота йй протяжении 1,5 часов контакта (рис 10). Минимальные показатели составили при концентрации 0,01 мг/мл -21,211,4% через 45 минут и при 0,0001 мг/мл -28,3+1,6% через 1 час контакта.

При определении внутриклеточного содержания катионных белков в фагоцитирующих клетках крови после их контакта с нД11К выявлено его резкое увеличение уже после 45 минут контакта. Максимальные показатели отмечались через 1,5 часа после внесения препарата в концентрациях 0,0001; 0,00!; 0,01; 0,1; I мг/мл и составили 162,6+8,7; ¡67,5±8,9; 172,<?±7,9; 156,5+9,1 и 139,8±14,1% соответственно (табл. 8).

Тем не менее, в конце срока наблюдения обнаруживалось резкое снижение внутриклеточного содержания катионных белков до уровня интактных клеток, что указывало на вьщепенне фагоцитами этих веществ во внеклеточное пространство. Полученные нами данные указывают на отчетливое сти-

мулирующее действие нДНК на фагоциты в отношении образования катион-ных белков

Примечание *-р<005 **-р<001, *** -р<0001

Рис 10 Внутриклеточное содержание метаболитов оксида азота в фагоцитирующих клетках крови, после их контакта с нДНК

Таблица 8

Внутриклеточное содержание катионных белков в фагоцитирующих клетках крови после их контакта с нДНК

Концентрация нДНК мг/мл Индекс стимуляции, % М±ш

после 45 мин контакта*** после 1,5 ч контакта*** после 2 ч контакта** после 2,5 ч контакта*** после 3 ч контакта*

0,0001 100,0±2,15 162,6±1,8 52,0+2,2 145,0+8,9 0,5110,45

0,001 98,98±5,14 167,5+1,9 45,4±5,1 165,0±2,15 31,0214,23

0,01 103,6±4,66 172,96±2,26 78,6±4,66 139,8±8,98 6,511,67

0,1 124,0±4,98 156,512,26 65,3±4,64 128,6+4,64 9,2+0,47

1 174,5±1,5 139,8±3,6 69,4±2,15 187,712,15 5,112,6

Примечание * значимость различий между контролем (принят за 0) и опытом - * р < 0 05

**-р <0,01, ***-р <0,001

Известно, что система фагоцитов, являясь звеном быстрого реагирования, играет важнейшую роль не только в антибактериальной, но и в противоопухолевой защите организма, а также в аллергических реакциях немедленной гиперчувствительности и т п В настоящее время данную систему рассматривают как совокупность достаточно иммунокомпетентных и иммуноре-гуляторных клеток, участвующих в межклеточных контактах и взаимодействиях, формирующих иммунный гомеостаз От функциональной полноценности данных клеток во многом зависит генез, течение и исход многих патологических состояний [Нестерова И В , Колесникова Н В , 1999] Таким образом, установленная нами способность нДНК повышать адгезивную и функциональную активность фагоцитирующих клеток (моноцитов и нейтрофи-

лов) занимает существенное место в ее положительном влиянии на макроорганизм При отсутствии цитотоксического действия на клетки это БАВ оказывает на них выраженное дозозависимое стимулирующее действие, обладая при этом антиоксидантным эффектом Необходимо также отметить стимулирующее действие нДНК на выделение фагоцитами во внеклеточное пространство катионных белков, которые являются представителями низкомолекулярных межклеточных регуляторов, участвующих в процессах сигнализации различных физиологических функций организма

Влияние нДНК на спонтанную и митогениндуцированную продукцию цитокинов клетками крови здоровых доноров

В настоящее время показано активное участие нейтрофилов в афферентном звене иммунного ответа - модуляции клеточного и гуморального иммунитета через синтез и продукцию иммунорегуляторных цитокинов (Фрейд-лин И С , 2000)

В следующем разделе работы было исследовано действие нДНК на спонтанную и стимулированную митогеном секрецию цитокинов клетками крови здоровых доноров Определяли in vitro в культуре клеток цельной крови уровень ранних гемопоэтических факторов (IL-3, GM-CSF), провоспали-тельного цитокина TNFa и маркерных цитокинов Thl и Th2 ответа (IFNy, ILIO) под действием нДНК Выбор цитокинов - IL-3 и GM-CSF был обусловлен задачами работы, одной из которых явилось изучение радиозащитной активности нДНК Эти цитокины относятся к группе ранних гемопоэтических ростовых факторов и играют значительную роль в восстановлении кроветворения после воздействия ионизирующего излучения (Рогачева С А с соавт, 1970)

Принимая во внимание тот факт, что интенсивность продукции цитокинов, заметно отличается у разных доноров (Ким К Ф с соав , 2002), мы провели анализ значений показателей в группах лиц с исходно пониженным, средним и повышенным уровнем продукции цитокинов (Дьяконова В.А с соавт , 2002). Влияние нДНК исследовали также на клетках крови тех же доноров, стимулированных митогеном фитогемагглютинином (ФГА)

Результаты экспериментов позволили установить следующие закономерности исследуемая нДНК оказывает модулирующее влияние на продукцию цитокинов в зависимости от их исходного уровня В ее действии на покоящиеся клетки преобладает регуляторный эффект исходно низкая продукция цитокинов усиливается, исходно высокая ослабляется. Стимулированные митогеном клетки отвечают снижением продукции в культурах клеток крови с высоким уровнем цитокина после стимуляции и увеличением продукции при низких и средних концентрациях цитокинов

После внесения нДНК в культуру клеток доноров с исходно низкими показателями секреции исследуемых цитокинов во всех случаях наблюдалась статистически значимая их стимуляция

Как свидетельствуют данные рис 11 под влиянием нДНК усиливается синтез цитокинов, относящихся к гемопоэтическим факторам - вМ-СБР и 1Ь-3 Так, уровень вМ-ОБР повышался с 0,4+0,13пг/мл до 2,7+1,1, р<0,05 Секреция 1Ь-3 возрастала с 0,5+0,1 пг/мл до 2,2+0,6, р = 0,03

ТОТа

и-з

> йМ-СЭР

80

40

га-у

Рис 11 Влияние нДНК на продукцию цитокинов клетками крови группы доноров с исходно низкими показателями 1 - уровень цитокинов до внесения нДНК, 2 - уровень цитокинов после инкубирования с нДНК

Уровень 1РЫу возрастал с 8,8±1,3пг/мл до 29,4±7,0, р = 0,03 Что касается ТИРа, то его уровень в образцах крови с исходно наименьшими показателями повышался с 37,9±9,2 пг/мл до 95,9±18,3, р = 0,01 Незначительно (с 4,9±0,7 пг/мл до 7,3±1,3 пг/мл, р = 0,05) увеличивалось содержание в супер-натантах крови 1Ь-10

Установлено, что внесение нДНК в культуры клеток крови доноров с высоким уровнем цитокинов уменьшало синтез всех без исключения цитокинов (рис 12)

ТОТ а

1200 -г—-

800 -

400

1Р1Ч-у

Рис 12 Влияние нДНК на продукцию цитокинов клетками крови группы доноров с исходно высокими показателями 1 - уровень цитокинов до внесения нДНК, 2 - уровень цитокинов после инкубирования с нДНК

Наиболее чувствительными к действию нДНК оказались клетки крови доноров с повышенным уровнем ОМ-СБР, введение нДНК в 87,5% случаев инициировало снижение его концентрации в 2,6 раза

Как следует из материалов рис 12, концентрация ОМ-СвР под действием нДНК снижалась с 13,1±2,3 пг/мл до 5,0+2,1 пг/мл, р = 0,04, 1Ь-10 - с 146,2±14,8 пг/мл до 58,8+17,5 пг/мл, р = 0,03, 1Ь-3 - с 21,0+9,8 пг/мл до 11,1±10,0 пг/мл, р < 0,06, ТЫРа с 1045±297 пг/мл до 504,6±123,5 пг/мл, р = 0,03, №N-7- с 69,4+18,3 пг/мл до 40,2±12,3 пг/мл, р < 0,05

Под влиянием нДНК концентрация цитокинов в супернатантах культур клеток крови со средними значениями их показателей изменялась неоднозначно Так, концентрация 1Ь-3 статистически значимо снижалась с 2,9±0,3 пг/мл до 2,1+0,6 пг/мл, р = 0,03, концентрация ТЫР-а статистически значимо повышалась с 200,8±38,4 пг/мл до 283,3±61,2 пг/мл, р = 0,02 (рис 13) Концентрация остальных цитокинов осталась в этом случае без изменения (рис 13)

ТИР а

1Ь-3

О,-10

йБ СвР

300

200

100

— -

контроль внесение нДНК

1РЫт

Рис 13 Влияние нДНК на продукцию цитокинов клетками крови группы доноров с исходно средними показателями 1 - уровень цитокинов до внесения нДНК, 2 - уровень цитокинов после инкубирования с нДНК

Внесение в культуру клеток крови митогена (ФГА) по-разному индуцировало продукцию цитокинов В этом случае также имел значение исходный уровень цитокина

Влияние нДНК на секрецию цитокинов митогенстимулированными клетками крови доноров

Костимулирующий эффект нДНК у доноров с исходно низкой концентрацией цитокинов статистически значимо проявлялся в отношении ТОТа, его уровень возрастал с 95,5x25,1 пг/мл до 205,7±38,9 пг/мл, р = 0,01 (рис 14, а) Такой же эффект отмечен для 1Ь-10 (повышение с 7,7±1,7 пг/мл до

14,3±3,4 пг/мл, р < 0,046) и (увеличение уровня цитокина с;

24,313,9 пг/мл ДО 52,7+17,8 иг/мл, р < 0,05).

Костимулирующего эффекта нДНК в отношении других цигокинов (1Ь-3 и ОМ-С5Р) отмечено не было.

Введение нДНК в культуру клеток крови доноров с исходно высоким уровнем исследуемых цигокинов приводит к снижению их концентраций (рис. 14, б). При этом уровень 1Ь-3 уменьшался с 40,5113,7 пг/мл до 19,0+11,4 пг/мл, р = 0,04; ОМ-СЯР с 71,2±11,8 пг/мл до 22,0+12,0 пг/мл, р <0,02 и ТКРа с 16921188,0 пг/мл до 419,0±119,0 пг/мл, р 0,03.

Рис. 14. Влияние нДНК на митоГениндуцированную продукцию цитокинов клетками кропи группы здоровых доноров с исходно низкими (а) и высокими (б) показателями. I — уровень цитокинов цнтаигных клеток, 2 Концентрация цитокинов в супернатантах клеток крови. инкубированных с ФГА и 3 - концентрация цитокинов и супернатантах клею к крови, инкубированных с ФГА после внесения нД! IK

Необходимо отметить, что в действии нДНК преобладает в большей степени провоспдлительный эффект, повышение TNFa установлено я 71,4=8,5% супернатантов крови доноров, хотя следует отметить, что примерно н половине супернатантов отмечено повышение концентрации и противоспалительного цитокина 1L-10 (48,119,6% доноров). Повышенная продукция провоспали* тельных цитокинов может быть механизмом, который вызывает аффекты нДНК, показанные нами: повышение функциональной активности фагоцитирующих клеток крови, влияние на клеточный и гуморальный иммунитет.

В целом, результаты, представленные в этом разделе, демонстрируют способность нДНК модулировать врожденные факторы иммунитета и оказывать влияние на формирование клеточного и гуморального иммунного ответа путем индукции ряда регуляторных цитокинов иммунокомпетентными клетками.

Влияние БАВ нДНК на выживаемость и среднюю продолжительность жизни мышей, зараженных Listeria monocytogenes

Одним из основных критериев биологической активности иммунокор-ректоров служит суммарный эффект, слагающийся из действия многочисленных факторов, обеспечивающих защиту организма от возбудителя инфекции, который выражается в способности противостоять развитию инфекционного процесса В связи с этим, на модели экспериментального листерио-за нами изучена способность нДНК из молок лососевых рыб повышать уровень иммунобиологической защиты организма

Одними из наиболее показательных критериев антиинфекционной защиты организма являются выживаемость и средняя продолжительность жизни (СПЖ) зараженных животных Мы изучили данные показатели зараженных листериями животных при введении им нДНК, без применения какой-либо этиотропной терапии

Действие БАВ исследовали в зависимости от схемы (лечебная и профилактическая), способа (подкожно или перорально), дозы (1 мг, 10 мг, 100 мг) и времени (при лечебной схеме - однократно через час после заражения, через 1, 2 и 3 суток) введения ДНК после заражения животных листериями в дозе (lLDioo) Эффективность действия нДНК оценивали по проценту выживших животных и показателю СПЖ животных контрольной и опытной групп

Суммарные данные этих показателей (по результатам всех экспериментов) представлены на рис 15. Так, процент выживаемости и СПЖ мышей зараженных L monocytogenes, получавших нДНК по лечебной схеме, значимо превышали (в 4,7 и в 2 раза) таковую мышей контрольной группы (не получавших исследуемый препарат) Причем наибольшие значения показателей отмечены у зараженных листериозом мышей получавших нДНК в дозе 10 мг/кг (рис 16, а) При профилактическом введении нДНК наблюдалась только подобная тенденция

%

35 -г

30

25

20

15

11 1

•■ 8

-• б

10 -■

-• 4

5

- 2

0

о

контроль

животные получившие ДНК

^^□выживаемость —•—СПЖ

Рис 15 Средняя продолжительность жизни (СПЖ, сутки) и количество (%) выживших животных, зараженных L monocytogenes (1LD100), получавших и не получавших нДНК

Способ введения нДНК не изменял результатов выживаемости и СПЖ, которые были примерно одинаковыми у мышей, получавших нДНК как пе-рорально, так и подкожно, но статистически значимо выше, чем у мышей контрольной группы (рис 16, б)

% 35

зо -25 -20 -15 10 -5 0

♦ 10,5

18,5

♦ 14,5

26,5

.7 3

контроль введение ДНК

профилактическая схема

14,6

33,3

10,5 ♦

т16

-- 14

-- 12 -- 10 s t о

-- 8 - 6 Эб с о_

-- 4

-• 2

-- 0

контроль ввдение ДНК

лечебная схема

а)

% 35 30 25 20 15 10 5 0

33,3

♦ 7,5 9 1

29,8

♦ 14

♦ 8,8 12,2

контроль I введение ДНК перорально

♦ 15

контроль ] введение ДНК подкожно

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

б)

* - р<0,05 **-р<0,01

-р <0,001

Рис 16 Средняя продолжительность жизни (СПЖ, точки, сутки) и количество выживших животных (столбики, %), зараженных L monocytogenes (lLDioo), в зависимости от схемы (а) и способа (б) введения нДНК

При введении нДНК по лечебной схеме в дозе 10 мг/кг в разное время после заражения: на протяжении 6 дней сразу после заражения - однократно в курсовой дозе через час, 1,2, 3 суток, после момента заражения, наиболее выраженные положительные результаты были получены при использовании нДНК через час после заражения и через двое суток (рис 17) Выживаемость мышей по сравнению с контролем увеличилась соответственно в 6,7 раза и 7,3 раза, а СПЖ в 2,4 раза и 2,7 раза соответственно после введения препарата через час и 2 суток после заражения мышей L monocytogenes (1 LD10o)

контроль

1 ч 1 сут 2 сут

время введения ДНК

3 сут

цвыживаемость

-СПЖ

Рис 17 Средняя продолжительность жизни (СПЖ, сутки) и количество (%) выживших животных, зараженных L monocytogenes (lLD|0o), в зависимости от времени введения нДНК (лечебная схема)

При пероральном введении нДНК таким же образом наиболее значимые результаты также зафиксированы через час и через 2 суток после заражения Однако они были несколько ниже, чем при подкожном введении препарата Выживаемость зараженных и получавших нДНК животных достигала 38,1±10,9% и 41,4±9,3% при выживаемости 9,1±6,3% в контрольной группе

Таким образом, нДНК из молок лососевых рыб оказывает дозозависи-мый, протективный и лечебный эффекты при экспериментальной листериоз-ной инфекции, причем лечебная схема введения препарата более эффективна, чем профилактическая.

Изучение действия нДНК на модели острой лучевой болезни мышей в эксперименте

Влияние нДНК на выживаемость и среднюю продолжительность жизни облученных животных

Выживание животного при воздействии на него ионизирующей радиации в костномозговом диапазоне доз создает четкую модель радиорезистентного состояния организма Поэтому, заключение о радиозащитном действии биологически активных веществ может быть сделано, в том числе, и на основании оценки его влияния на выживаемость и СПЖ животного при облучении в диапазоне доз, вызывающих костномозговой синдром острой лучевой болезни (Гончаренко Е Н с соавт, 1997, Мазурик В К с соавт, 1997) Влияние нДНК на выживаемость облученных животных В данной серии экспериментов исследовали влияние однократного введения нДНК в различных ее дозах, на выживаемость и СПЖ сублетально облученных мышей Полученные результаты этого фрагмента работы представлены на рис 18 Как показывают данные рисунка, профилактическое (за сутки до облучения), однократное введение нДНК во всех взятых дозах не

обеспечивало защитного эффекта: выживаемость мышей получивших нДНК по этой схеме не отличалась от таковой в контроле.

ш введение ДНК «

X

ю

¥ контроль

^ введение ДНК

* г

с 1--

Е Я

л:

& ксн-гроль

|

ЕЭ 1клг/кг □ Юмг/нг О 1 ^ М

Рис. 18 Влияние к ДНК, введенной и разных дозах, на выживаемость (%) облученных мышей (7 Гр.) при однократном профилактическом Й лечебном применении

Однократное введение нДНК в качестве лечебного средства при острой лучевой болезни мышей (через сутки после облучения) продемонстрировало лучшие результаты, причем наиболее эффективным было введение нДНК в дозе 10 мг/кг. В этом случае выживаемость животных более чем в 2 раза превышала Контрольный показатель - 35,0+10,9% (р < 0,01) и 15,0+8,2% соответственно.

Следующая серия экспериментов была направлена на изучение действия наиболее эффективной дозы нДНК (10 мг/кг) к зависимости от способа ее введения курсом на протяжении б дней - подкожно и перирально, но профилактической и лечебной схемам. Лучшие результаты также были зафиксированы при введении ДНК по лечебной схеме как подкожно, так и перорально, при этом выживаемость мышей увеличивалась по сравнению с контролем О5,0±8,2) в 3 раза (45,0±11,4%, р <0,001), при подкожном введении нДНК; и в 3,5 раза при ее пероральном введении (35,0+1019% в опыте и 10,0+8,1% в контроле р < 0,05).

При профилактическом подкожном Введении нДНК облученным животным наблюдались также статистически Значимое повышение их выживаемости по сравнению с контролем, но не столь выраженное, как в первом случае: (20,0±9,1% и 35,0+10,9% соответственно, р < 0,05), а при пероральном ее приеме только тенденния к повышению этого показателя.

Влияние и ДИК на Среднюю пр об олжител ь ность жизни облученных мышей

Изменение СПЖ у мышей опытных групп было подобно динамике уровня выживаемости. Однократное применение нД11К в качестве лечебного

средства обеспечивало статистически значимое увеличение СПЖ мышей, наблюдавшееся, однако, только при введении этого БАВ дозе !0 мг/кг -18,8+2,1 (в контроле 12,1+2,0, р =0,01).

Введение нДНК в дозе 10 мг/кг курсом 6 дней, подкожно, после облучения но лечебной схеме также способствовало выраженному увеличению СПЖ животных 21,5+1,9 в группах, получавших препарат, при 10,8+2,0 в контроле, р < 0,001. Профилактическое применение нДНК, при наличии определенной тендениии к повышению исследуемого показателя, статистически значимого различия гто сравнению с контролем не показало.

Применение нДНК в дозе 10 мг/кг при пероральном лечебном введении в большей степени способствовало увеличению СПЖ мышей, чем при профилактическом введении, хотя и в том и в друг ом случае разница по сравнению с контролем была достоверной 22,1+1,8, р < 0.001 и 20,6+2,2, р < 0,01 (в контроле - 10,0+1,8) соответственно (рис. 19).

рег 05

подкололо

0 5 10 15 20 25

период после облучения, СУ

Рис, 19. Средняя продолжительность жизни мышей после облучения (7 Гр) при подкожном и пероральном введении нДНК (10 мг/кг, лечебная схема)

Таким образом, применение нД1 ГК из молок лососевых рыб при костномозговой стадии острой лучевой болезни у мышей, повышает уровень их выживаемости и увеличивает их СПЖ, В большей степени выражен эффект нДНК при лечебной схеме ее введения.

Зависимость тяжести и исхода О ЛБ связана с характером лучевого поражения стволовых клеточных популяций критических тканей и систем организма. К таковЕ>ш относятся ткани костного мозга, кишечника, кожи, а так же иммунной системы. Ближайшим последствием радиационных повреждений является клеточное опустошение критических органов. Как показали полученные результаты, при одинаковой направленности изменений массы тела, тимуса и селезенки облученных мышей, как получавших, так и не получавших нД11К, в опытных группах животных наблюдалось более выраженное восстановление массы всех изученных органов.

Снижение показателей клеточности органов мышей, получавших и не получавших нДНК, не достигало минимальных величин наблюдаемых в контрольной группе, а процесс восстановления начинался раньше и был более полным, чем у контрольных животных.

Влияние нДНК на миграцию и пролиферацию стволовых клеток Тяжесть и исход лучевой болезни при костномозговом синдроме напрямую зависят от степени и характера поражения стволовых элементов клеточных популяций Эквивалентом стволовой кроветворной клетки (СКК) условно считают колониеобразующие единицы в селезенке (КОЕс) облученных мышей (Переверзев А Е , 1986) Для изучения влияния ДНК на КОЕс использовали методы эндо- и экзоколониеобразования (Till J , McCulloch Е А, 1963) Было установлено, что нДНК дозозависимо значительно стимулирует образование эндоколоний в селезенках облученных мышей, как при профилактической, так и при лечебной схеме ее введения, однако при использовании последней это действие было более выраженным (индекс стимуляции составил 2,2) (рис 20)

ь^а^нДНК контроль

Рис 20 Количество эндогенных колоний (КОЕс) в селезенке облученных мышей (7 Гр ) под влиянием различных доз нДНК

Взаимодействие нДНК с клетками костного мозга вызывает активацию стволовых клеток костного мозга (рис 21), обеспечивающую усиление процессов пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток - предшественников и является, по-видимому, одним из механизмов реализации радиозащитного и радиопротекторного действия этого биологически активного вещества

Под действием нДНК m vivo наблюдается значительная стимуляция в (9,2 раза) эритроидных клеток-предшественников (27,5±3,0 р < 0,001, в контроле - 3,0±2,4)

Таким образом, введение исследуемой ДНК вызывает активацию СКК, обеспечивающую усиление процессов пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток-предшественников Согласно данным литературы (Русинова Г Г и др , 1976) такое действие можно объяснить усвоением экзогенной ДНК тканями и клетками облученного организма и использованием

ее в процессе пострадиационного восстановлении в качестве предшественников для синтеза собственной ДНК клеток.

Ркпмтрпг>. □ БВ^ЛПЛИП ^нк

**-р <0,0), **' - р <0,00!

Рис, 21-ФормйрованШ экзогенных селезеночных колоний иод влиянием иДНК in vitro (а) и in vivo (б). По оси ординат количество колон иеобразукэщих единиц (КОГс), 1 - К О Ее у летально облученных еингенных реципиентов. 2 -КОЕе, Предварительно обработанные митостатическим агентом ara С, 3 - КО Ее в 5-фазе клеточного цикла

Клинико-э кс пери ментальное обоснование применении САД к пище ДНКаС к качестве средства сопровождения лучевой терапии у больных раком молочной железы

При раке молочной железы в большинстве случаев проводится комплексное лечение, которое привадит к дапопнительным нарушениям функций исходно компрометированной иммунной системы. I lap а стающая в результате противоопухолевой терапии иммунодепрессия может способствовать развитию инфекционных осложнений и повышать риск рецидива и ме-тастазирования опухоли за счет ослабления функции иммунного надзора (Селихова Ю.Е. с соавт., 2006). В связи с этим актуальна проблема разработки методов и стандартов и ммуноео провождения базисной терапии онкоболь-ных, что позволит создать условия для полноценной реализации базисных Методов лечения (Чериепова Л .Ф. с соавт.2001).

В этом разделе работы в эксперимен те и клинике представлено обоснование целесообразности применения Б АД ДНКаС к лише в качестве средства сопровождения лучевой терапии у больных РМЖ.

Исследование цитот оке и ческой активности нДНК in vitro на модели перепиваемой опухоли Эрлиха

Ранее показано, что препараты НК, обладающие противоопухолевым действием, обеспечивают его преимущественно путем реализации своих им-муномодулирующих свойств (Вайнберг Ю.П. с соавт.. 1995.; Белоус A.M. с соавт., 1974), Однако противоопухолевая активность препаратов может быть обусловлена и цитотоксической активностью изучаемого вещества (ЦТА). В

связи с этим, была изучена ЦТА ДНК в экспериментах m vitro на штамме клеток мышиной асцитной карциномы Эрлиха Полученные результаты показали, что нДНК из молок лососевых рыб не обладает цитотоксической активностью в широком диапазоне концентраций 0,2-200 мкг/мл

Определение средней продолжительности жизни и выживаемости мышей с асцитной формой карциномы Эрлиха под действием нДНК

Противоопухолевую активность препарата in vivo исследовали на неин-бредных мышах с асцитной формой опухоли Эрлиха, путем определения влияния дозы нДНК, схем ее введения - лечебной и профилактической

Полученные результаты показали, что применение исследуемой нДНК дозозависимо увеличивает СПЖ мышей - опухоленосителей Максимальный и статистически значимый противоопухолевый эффект нДНК (увеличение СПЖ на 37,2%) наблюдался при ее введении по профилактической схеме в дозе 10 мг/кг При этом противоопухолевое действие препарата не связано с прямым токсическим эффектом нДНК, а обусловлено, вероятно, его имму-номодулирующими свойствами

Использование ДНКаС в комплексе лечения (лучевой терапии) у больных раком молочной железы

Выбор этой категории больных не случаен Больные РМЖ, поступающие в радиологическое отделение для проведения стандартного курса послеоперационной лучевой терапии, получили хирургическое и или химиотера-певтическое лечение 2-3 месяца назад, при поступлении в диспансер чувствовали себя удовлетворительно и имели практически нормальную картину периферической крови У больных, таким образом, минимизировано влияние опухольсоставляющего компонента и основное воздействие, под влиянием которого изменялись их иммунологические параметры - лучевая терапия и применение в качестве средства сопровождения — ДНКаС

Изучали уровень и динамику ранее выбранных цитокинов - IL-3, GM-CSF - ранних гемопоэтических цитокинов, TNFa - провоспалительного ци-токина, IFNy, IL-10 - маркерные цитокины Thl и Th2 ответа (соответственно)

Анализ динамики уровней цитокинов проводили в зависимости от начального их уровня с исходно низкими, с исходно высокими и исходно средними значениями

Прием ДНК значительно влиял на содержание в сыворотке крови гемо-поэтического цитокина GM-CSF У 66,7% больных женщин с исходно средними показателями этого цитокина он был повышен в 17 раз (рис 28) Колебания концентрации GM-CSF как в сторону увеличения, так и в сторону снижения были статистически значимы (рис 28)

У больных с исходно высокой концентрацией GM-CSF, в 75,0% случаев наблюдалось снижение в 2,7 раза его уровня То есть в данном случае имеет место модулирующий эффект ДНК

Рис. 2&. Индексы стимуляции (ИС) и ингнбиции (ИИ) нДНК уровня шпики-нов (иг/мл) в сыворатке кропи больных раком молочной железы

Уровень IPNy в крови больных с нормальной и средней его концентрацией под действием ДНКаС увеличивался в 81,3% случаен (с 1,2±0,4 пг/мл до 16,2+9,9 пг/мл, р < 0,05). 13 группе с исходно высокими показателями IFNy, в 80% случаев наблюдалась лишь тенденция к его снижению.

Под действием нДНК статистически значимо - с 18,3±3,7 пг/мл до 28.2+5,0 пг/мл, увеличилось содержание TNFa в сыворотках крови больных с исходно средними и нормальными показателями этого цитокина. Более чем у половины больных с исходно высокой концентрацией в сыворотке TNFa под действием нДНК уровень этого цитокина снижался с 57,1±П,1 nr/мл до 36,7+9,4, р > 0,05.

Таким образом, применение ДНКаС в качестве средства сопровождения лучевой терапии у больных РМЖ, оказывает модулирующее действие в отношении уровня всех исследуемых цитокинов(1Ь-3, GM-CSF, TNFa., IFN7, IL-10) в зависимости от их исходного уровня в сыворотке крови. Однако в большей степени и статистически значимо ДНКаС корригирует уровень ни-токи на GM-CSF. повышает концентрацию IFNy И TNFa. у больных с исходно низкими их показателями, снижает уровень IL-! 0 у больных с исходно высокими их концентрациями. Обращает на себя внимание одинаковая тенденция динамики показателей у обеих групп обследуемых РМЖ, но большая выраженность ее у пациенток, принимающих ДНКаС, что видимо, свидетельствует о его физиологическом действии.

ВЫВОДЫ

I. нДНК из молок лососевых рыб является ИМмуном одул ято ром и иммуностимулятором, Она проявляет умеренное стимулирующее влияние на iy-морапьний и клеточной иммунитет, а также факторы врожденного иммунитета организма ймму но компетентных животных, оказывает корригирующее

действие на измененные параметры иммунитета у животных с ВИД, обусловленными различными повреждающими факторами

2 нДНК оказывает умеренное стимулирующее действие на гуморальные факторы иммунитета у иммунокомпетентных и иммунокомпрометированных животных, увеличивая продукцию АОК в селезенке и титр 1§М-антител в сыворотках крови в ответ на иммунизацию эритроцитами барана Эффект зависит от дозы нДНК, схемы, времени, путей ее введения и фазы иммунного ответа

3 нДНК дозозависимо влияет на реакции клеточного иммунитета у иммунокомпетентных и иммунокомпрометированных животных, стимулирует спонтанную и индуцированную митогеном пролиферацию Т-лимфоцитов, усиливает реакцию ГЗТ в индуктивной фазе иммунного ответа

4 нДНК не оказывает цитотоксического и проапоптотического действия на фагоцитирующие клетки крови доноров При этом нДНК обладает дозоза-висимым антиоксидантным действием, регулирует кислородзависимую и нитроксидобразующую активность этих клеток Низкомолекулярная дезок-сирибонуклеиновая кислота стимулирует выработку фагоцитирующими клетками биологически активных веществ, что является одним из механизмов реализации ее способности повышать показатели врожденного иммунитета

5 нДНК проявляет свойства модулятора продукции цитокинов, обладающего регуляторным эффектом исходно низкая продукция цитокинов усиливается, исходно высокая - снижается Под действием нДНК в сыворотках крови больных и супернатантах крови доноров в основном изменяется уровень цитокина СМ-С8Р При низкой исходной концентрации 1Ь-3 и ШЫу нДНК статистически значимо увеличивает показатели концентрации этих цитокинов

В действии нДНК доминирует способность стимулировать продукцию провоспалительных цитокинов и цитокинов, обеспечивающих иммунный ответ по ТЫ клеточному типу, что обеспечивает повышение показателей врожденного иммунитета в изучаемых экспериментальных моделях

6 В условиях экспериментального вторичного иммунодефицита, вызванного сублетальным облучением (модель костномозговой стадии острой лучевой болезни у мышей), нДНК проявляет радиопротекторные и терапевтические свойства Она повышает уровень выживаемости облученных мышей и увеличивает среднюю продолжительность их жизни, причем в большей степени этот эффект выражен при терапевтической схеме ее введения, независимо от путей введения

7 нДНК повышает число лейкоцитов, массу тела, массу и кпеточность лимфоидных органов облученных мышей, стимулирует образование экзогенных и эндогенных колоний в селезенке, что свидетельствует об усилении процессов пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток-предшественников, и в конечном итоге повышает неспецифическую резистентность к эффекту радиации

8 На модели асцитной карциномы Эрлиха у мышей нДНК проявляет онкопротекторное действие, — достоверно увеличивает СПЖ больных животных при профилактическом применении При этом данный эффект не связан с прямым токсическим эффектом на опухолевые клетки, а обусловлен, по-видимому, его иммуномодулирующими свойствами

9 Применение ДНКаС в качестве средства сопровождения лучевой терапии у больных РМЖ, оказывает модулирующее действие на уровень цитокинов !Ь-3, вМ-СЭР, Т№а, ШЫу, 1Ь-10 в сыворотке крови больных Кроме того, нДНК положительно влияет на гематологические показатели периферической крови больных РМЖ получающих ее в комплексе послеоперационной терапии.

10 Хорошая переносимость нДНК, ее природное происхождение, возможность повторного применения в виде отдельных курсов, поливалентность действия, обуславливающего благоприятные изменения в организме, характеризующиеся повышением показателей врожденного иммунитета, подчеркивает целесообразность применения нДНК в виде Б АД пище

11 Широкий спектр биологических свойств исследуемого вещества, ресурсная обеспеченность, высокая патентная защищенность, являются предпосылками для создания лекарственных форм на основе нДНК

Рекомендации для внедрения результатов исследования:

- в науку

1 На основании результатов экспериментальных и клинических исследований проведена комплексная оценка действия нДНК из молок лососевых рыб на иммунную систему организма, что позволило обосновать возможность ее использования для создания лекарственной формы и новых БАД к пище

2 При разработке новых БАД и лекарственных препаратов на основе нДНК рекомендуется учитывать возможность получения разнонаправленных эффектов со стороны иммунной системы, зависящих от дозы используемого вещества, исходного состояния клеток (активация, покой, депрессия) и их внутренних потенций

- в медицинскую практику

1 Рекомендуется применять БАД ДНКаС по 1 грамму в сутки в течение 30 дней больным раком молочной железы, получающим лучевую терапию (Информационное письмо "Применение биологически активной добавки к пище БАД ДНКаС в качестве средства сопровождения лучевой терапии у больных раком молочной железы" авторов Л Н Федяниной, Т С Запорожец, С В Юдина, Л М Эпштейна) Утверждено руководителем Департамента здравоохранения Администрации Приморского края Владивосток, 2006

- Пособие для врачей и фармацевтов Биологически активные добавки к пище (БАД) Приморского края авторов Л Н Федяниной, А К Гажа, Н Н Беседновой, С П Крыжановского, Л М Эпштейна Владивосток, 2006

2 Рекомендуется применять БАД ДНКаС по 1 грамму в сутки в течение 15 дней больным листериозом (в комплексе базового лечения) (информационное письмо "Применение БАД ДНКаС и ДНКаВИТ в комплексном лечении больных листериозом" авторов Е А Зайцевой, Л Н Федяниной, В А Иванис, Н А Белоголовкиной, В М Воронок, Л М Эпштейна, Т К Каленик) Утверждено руководителем Департамента здравоохранения Администрации Приморского края Владивосток, 2006

3 Предприятиям, деятельность которых осуществляется в области обращения пищевой продукции, в том числе пищеблоков различных медицинских учреждений, рекомендуется усилить меры по профилактике листериоза (информационное письмо "Listeria monocytogenes - новый микробиологический показатель опасности пищевых продуктов" авторов Л Н Федяниной, Е А Зайцевой, Т К Каленик, В Б Светлова) Утверждено руководителем ТУ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю Владивосток, 2006

- в учебный процесс

Рекомендуется использовать в учебном процессе кафедр микробиологии, иммунологии, инфекционных болезней, гигиене питания медицинских вузов новые данные о механизмах действия нДНК из молок рыб, возможности практического применения БАД к пище на ее основе

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Адъювантная активность биологически активной добавки к пище ДНК из молок лососевых рыб / Л Н Федянина, Т К Каленик, В В Потапова, Л А Иванушко // Мат Междунар науч -практ конф "Здоровье и образование" тез докл - Пермь,2004 -С 276-277.

2 Биологически активные вещества из гидробионтов Тихого океана / Н Н.Беседнова, Т С Запорожец, Л Н Федянина II Междунар науч -практ конф "Здоровье и образование Здоровьесберегающие технологии в мед, образов , бизнесе" тез докл - Пермь, 2004 - С 32-36

3 Биологически активные добавки из морских гидробионтов Тихого океана - средства массовой профилактики последствий облучения человека / Л Н Федянина, В В Потапова, В П.Маслов // Здоровье Мед экол Наука Дальневост Мед науч - практ журн - 2002 - № 4-5 - С 54

4 Биологически активные добавки к пище (БАД) Приморского края / Л Н Федянина, А.К Гажа, Н Н.Беседнова, С П Крыжановский, Л М.Эпштейн // Пособие для врачей и фармацевтов, Владивосток, 2006 - 119 с

5 Влияние ДНК из молок лососевых рыб на среднюю продолжительность жизни и выживаемость мышей с острой лучевой болезнью в эксперименте / Л Н Федянина, В В Потапова, Л А Иванушко, Л М Эпштейн // X Российской национальный конгресс "Человек и лекарство" тез докл - Москва, 2003 -С 762.

6 Влияние ДНК из молок лососевых рыб на пролиферативную активность колониеобразующих единиц селезенки / Л Н Федянина, В В Потапова, В В Орловская, Л М Эпштейн // International Journal on Immunorehabilitation Выпуск "Физиология и патология иммунной системы" - 2004 - Т 6, № 1 -С 35

7 Влияние ферментативных гидролизатов морских гидробионтов на индукцию интерферона в культуре клеток / Л Н Федянина, В В Потапова, Т Г Орлова, Л М Эпштейн // Междунар науч -практ конф "Здоровье и образование" тез докл - Пермь, 2003 - С 284

8 Влияние биологически активных веществ из гидробионтов Тихого океана на кроветворение при острой лучевой болезни / Л Н Федянина, Т И Пивненко, Л А Иванушко, В В Потапова // Междунар науч -практ конф "Здоровье и образование" тез докл - Пермь, 2003 -С 281-283

9 Влияние ДНК из молок лососевых рыб на некоторые показатели гуморального иммунного ответа / Л Н Федянина, В В Потапова, Л М Эпштейн, Л,А Иванушко // XI Российской национальный конгресс "Человек и лекарство" тез докл - Москва, 2004 - С 845

10 Влияние ДНК из молок лососевых рыб на адгезивные свойства Listeria monocytogenes и выживаемость белых мышей при экспериментальном листериозе / Л Н Федянина, Е А Зайцева, В В Потапова, Л М Эпштейн // Журн мед эпидемиол микробиол -2006 -№3 -С 61-64

11 Влияние БАД ДНК из молок лососевых рыб на антиинфекционную резистентность макроорганизма in vivo / Л Н Федянина, В В Потапова, Е А Зайцева И International Journal on Immunorehabilitation Выпуск "Физиология и патология иммунной системы" -2005 — Т 6, № 12 — С 313

12 Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) из молок лососевых перспективы клинического использования / Л Н Федянина, Н Н Беседнова, Л М Эпштейн, В Н Суховей // Междунар науч -практ конф. "Здоровье и образование" тез докл - Пермь, 2003 - С. 28-31

13 Действие БАД на основе морских гидробионтов на функциональное состояние лимфоцитов крови человека / Л Н Федянина, С Н Радченко, И Б Ушаков, А К Гажа, Л М Эпштейн // Междунар науч -практ конф "Здоровье и образование Здоровьесберегающие технологии в мед , образов , бизнесе", тез докл - Пермь, 2004 -С 105-106

14 Иммуннокорригирующее действие дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из молок лососевых рыб в условиях модели острой лучевой болезни / Л Н Федянина, В В Потапова, Л.А Иванушко, Л М Эпштейн // X Рос национальный конгресс "Человек и лекарство" тез докл - Москва, 2003 -С 762

15 Иммуномодулирующее действие ДНК из молок лососевых рыб / Л Н Федянина, Т.К Каленик, В В Потапова, Н Н Беседнова, Л М Эпштейн, И А Орловская // Междунар науч - практ конф "Здоровье и образование" тез докл - Пермь, 2004 - С 277-297

16 Иммунотропное действие биологически активного вещества — ДНК из молок лососевых рыб в эксперименте / Л Н Федянина, Н Н Беседнова, Л М Эпштейн, Т К Каленик // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН - 2006 - № 5 -С 238-241

17 Влияние низкомолекулярной ДНК из молок лососевых рыб на кроветворение в эксперименте / Л Н Федянина, В В Потапова, Н Н Беседнова, Л М.Эпштейн, И А Орловская, Ю Г Блинов // Антибиотики и химиотерапия -2004 -Т 49,№4.-С 7-10

18 Влияние ДНК из молок лососевых рыб на уровень оксида азота в сыворотке крови больных раком молочной железы / Л Н Федянина, В В Потапова, В П Маслов // Всероссийский иммунологический форум тез докл -Екатеринбург, 2004 -С 293

19 Влияние дезоксирибонуклеиновой кислоты из молок лососевых рыб на продукцию фактора некроза опухоли клетками здоровых доноров / Л Н Федянина // XII Росс национальный конгресс "Человек и лекарство" тез докл - Москва,2005 -С 718

20 Влияние ДНК из молок лососевых рыб на Т-клеточный иммунитет в эксперименте / Л Н Федянина, Е А Зайцева, Л М Эпштейн, Н Н Беседнова, Г П Сомов//Антибиотики и химиотерапия -2005 - № 2-3 - С 14-17

21 Иммунотропные функции низкомолекулярной дезоксирибонуклеиновой кислоты из молок лососевых рыб / Л Н Федянина, В.В Потапова, Л М Эпштейн, А К Гажа // Дальневосточ науч конф "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" тез. докл - Владивосток, 2004 - С 67

22 Иммунокорригирующее действие ДНК в эксперименте / Л Н Федянина, В В Потапова, Л М Эпштейн, Л А Иванушко // Всерос конф "Компенсаторно-приспособительные процессы, фундаментальные, экологические и клинические аспекты" тез докл - Новосибирск, 2004 -С 416-417

23 Иммунотропные биологически активные добавки к пище на основе гидробионтов / Л Н Федянина, А К Гажа, Т Л Грицюк, Л М Эпштейн // Меж-дунар науч -практ конф "Здоровье и образование Здоровьесберегающие технологии в мед, образов, бизнесе"- тез докл - Пермь, 2004 - С 120-125

24 Изучение эффективности применения биологически активного вещества - ДНК из молок лососевых рыб - при экспериментальном листериозе / Л Н Федянина, Е А Зайцева, Т К Каленик // Журн микроб , эпидемиол , им-мунобиол -2006 — № 3 -С 65-68

25 Изучение противоопухолевой активности ДНК из молок лососевых рыб и некоторых ее механизмов в эксперименте / Л Н Федянина, Н Н Беседнова, Д Л Аминин, Л М Эпштейн, Т К Каленик //Дальневост мед журн -2006 -№ 3 -С 59-62

26 Модулирующее действие ДНК на животных, иммунизированных вакциной Энцепур - взрослой, против клещевого энцефалита / Н В Крылова, Л Н.Федянина, Н Н Беседнова, Г Н Леонова // Междунар науч -практ конф

"Здоровье и образование Здоровьесберегающие технологии в мед, образов , бизнесе": тез докл - Пермь, 2004 - С 66-67

27 Оценка профилактического и лечебного действия БАД из морских гидробионтов при экспериментальной острой лучевой болезни / J1 Н Федянина, В В Потапова, JT М Эпштейн // International Journal on Immunorehabilitation IX Междунар конгресс "Проблемы иммунореабилитации Физиология и патология иммунной системы" тез докл - Москва, 2003 -Т 5,№ 1 -С 43-44

28 Оценка иммунокорригирующей эффективности биологически активных добавок на основе гидробионтов / С Н Радченко, И Б Ушаков, А К Гажа, JI Н Федянина, JI М Эпштейн // Междунар науч -практ конф "Здоровье и образование Здоровьесберегающие технологии в мед, образов , бизнесе" тез докл - Пермь, 2004 - С 107-109

29 Первичный скрининг гидролизатов гидробионтов с радиопротектив-ным действием в эксперименте / Л Н Федянина, Л А Иванушко, В В Потапова, В П Маслов // International Journal on Immunorehabihtation Труды Всемир конгр по клинической и иммунной патологии тез докл Сингапур, 2002 -Т 4, №2 -С 337

30 Радиозащитное действие дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из молок лососевых рыб / Л Н Федянина, В В Потапова, В П Маслов, В Н Ржанникова // 6-я Дальневост онкологическая конф "Вопросы диагностики и лечения злокачественных опухолей" тез докл - Владивосток, 2004 -С 98-100

31 Патент 2230559 Российской Федерации МПК7 А 61 К 31/70 Способ стимулирования колониеобразования кроветворных клеток-предшественников в селезенке при облучении животных / Федянина Л Н , Потапова В В., Эпштейн Л М , Беседнова Н Н , Пивненко Т Н , Иванушко Л.А , Каленик Т К / Заявитель и патентообладатель НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН Заявл 08 01 2003 Опубл 20 06 2004 Бюл №17

32 Федянина, Л.Н Влияние дезоксирибонуклеиновой кислоты из молок лососевых рыб на продукцию интерферона гамма клетками здоровых доноров / Л Н Федянина // XII Росс национальный конгресс "Человек и лекарство" тез докл - Москва, 2005 -С 718-719

33 Федянина, Л Н Влияние БАД ДНК из молок лососевых рыб на антиинфекционную резистентность макроорганизма in vivo / Л Н Федянина, В В Потапова, Е А Зайцева // International Journal on Immunorehabihtation "Физиология и патология иммунной системы" -2005 -Т 6, № 12 -С 313

34 Федянина, Л Н Иммуноадьювантное действие БАД ДНК из молок лососевых рыб / Л Н Федянина // Дальневос мед журн - 2005 - № 4 -С 73-76

35 Федянина, Л Н Влияние ДНК из молок лососевых рыб на секрецию ИЛ-3 и ГМ КСФ клетками крови доноров / Л Н Федянина // Мед иммунология -2005 -Т. 7,№2-3 -С 270

36 Федянина, J1 Н Влияние дезоксирибонуклеиновой кислоты из молок лососевых рыб на секрецию цитокинов клетками крови здоровых доноров / Л Н Федянина//Мед иммунология -2005 -Т 7, №5-6 - С 617-619

37 Экспериментальное обоснование применения биологически активной добавки к пище, содержащей ДНК из молок лососевых рыб, в комплексном лечении листериозной инфекции / Л Н Федянина, Е А Зайцева, Т К Ка-леник // VIII Всерос конгр "Оптимальное питание - здоровье нации" к 75-летию Государственного учреждения Науч -исслед инст питания РАМН тез докл. - Москва, 2005 - С 97-98

38 Radioprotectiv Action Deoxyribonucleic Acid (DNA) From Salmons Milts / L N Fedjamna, V N Potapova, V P Maslov, L M Epshtein // Intern Sympsium on Marine Drugs (ISMD 2004), Qindao, China, 18-22 October, 2004 -P 119-120

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АОК - антителообразующие клетки

АФК - активные формы кислорода

БОЕ-Э - бурстообразующие единицы

ГА - гемагглютинины

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа

ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагапьный колониестимулирующий

фактор

ККМ - клетки костного мозга

КБ - катионные белки

КОЕ-ГМ - гранулоцитарно-макрофагальные колониеобразующие

единицы

КОЕ-ГЭММ - фанулоцитарно-макрофагально-эритроидно-мегакарио

цитарно-Т- клеточные колонии

КОЕс - колониеобразующая единица селезенки

КФ - кислая фосфатаза

мпо - миелопероксидаза

Мф - макрофаги

нет — нитросиний тетразолий

Нф - нейтрофилы

СКК - стволовые кроветворные клетки

РБТЛ - реакция бласттрансформации лимфоцитов

ФГА - фитогемагглютинин

ЭБ - эритроциты барана

ЯСК - ядросодержащие клетки

FcR - рецептор для Fc-фрагмента молекулы иммуноглобулина

IFNy — interferon у

IL - mterleukm

Ig - immunoglobulin

Th 1, 2-T-helper-1,2 - субпопуляции CD4 Т-лимфоцитов (хелперов)

TNF - tumor necrosis factor

Людмила Николаевна Федянина

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ (ДНК) ИЗ МОЛОК ЛОСОСЕВЫХ РЫБ (фундаментальные и прикладные аспекты)

Автореферат диссертации

Отпечатано по оригинал-макету

Подписано в печать 16 07 07 Формат 60x84/16 Уел -печ л 1,86 Уч -изд л 2,0 Тираж 150 экз Заказ № 450

Издательство Тихоокеанского государственного

экономического университета Участок оперативной полиграфии 690091, Владивосток, Океанский пр ,19 ® 40-66-35 E-mail pub_fesaem@mail ru

Актуальность проблемы

В настоящее время препараты нуклеиновых кислот иммуномодулирую-щего действия, полученные из различных природных источников, достаточно широко применяются в практической медицине, причем как в виде офици-нальных лекарств, так и в виде БАД к пище. Известны фармакопейные препараты - нуклеинат натрия (РНК, полученная из дрожжей) [153, 157, 194], дери-нат (натриевая соль нативной ДНК, выделенная из молок осетровых рыб) [2, 82, 83, 93, 142, 172], плацентекс-интегро (ДНК из молок форели) [39]. На основе ДНК из молок осетровых рыб создана БАД к пище «Биостим» [93], НПО «Биомед» (Пермь) производит одноименную БАД («Биостим») из семенников крупного рогатого скота [209].

В настоящей работе представлены результаты исследования иммуиомо-дулирующих свойств низкомолекулярной ДНК (нДНК) из молок лососевых рыб, полученной по оригинальной технологии учеными ТИНРО-центра г. Владивостока [173, 174]. Она является основой биологически активной добавки к пище ДНКаС (нДНК + витамин С), разрешенной к применению, зарегистрированной в Федеральном реестре БАД РФ (регистрационное удостоверение № 004978.Р.643.10.2002), которая достаточно широко используется населением Дальнего Востока и ряда других регионов РФ [18, 19, 173, 174, 183, 184].

Единичные исследования иммуномодулирующей активности этой нДНК, проведенные ранее, позволили установить, что она регулирует показатели врожденного иммунитета [18, 19, 43, 56]. Так, на моделях экспериментальных инфекций мышей, вызванных Escherichia coli; Yersinia pseudotuberculosis, a также Salmonella enteritidis было установлено ее защитное действие [81, 171]. Низкомолекулярная ДНК усиливала гуморальный иммунный ответ на тимус-зависимый антиген - эритроциты барана, снижала токсическое действие на организм мышей термостабильного псевдотуберкулезного токсина [18, 171].

В экспериментах in vitro нДНК стимулировала фагоцитарную активность моноцитов крови по отношению к грамположительным и грамотрицательным микроорганизмам токсина [18, 19, 81, 95].

Однако эти немногочисленные исследования иммуномодулирующей активности нДНК определяли необходимость дальнейшего углубленного изучения этого биологически активного вещества (БАВ). Изучение эффектов нДНК в соответствии с основами доказательной медицины позволит расширить спектр ее практического применения при различных заболеваниях и определит перспективы создания на ее основе лекарственных препаратов.

Ранее считали, что ДНК позвоночных не оказывает на организм иммуностимулирующего и иммуномодулирующего действия, поскольку в ней отсутствуют CpG-мотивы, которые в ДНК прокариотов выполняют эту функцию токсина [9, 18, 62, 207, 214, 215]. Однако позднее было показано, что ДНК позвоночных также содержит небольшое количество потенциально иммуности-муляторных CpG мотивов, и, по-видимому, различия в действии ДНК про - и эукариотов связаны преимущественно с присутствием в геноме позвоночных иммунонейтрализующих последовательностей токсина [214, 215].

Что касается нДНК из молок лососевых рыб, то фактически неизученными остаются механизмы, определяющие ее действие на гуморальные и клеточные факторы врожденного и приобретенного иммунитета, а также типы отвечающих иммунокомпетентных клеток. Не исследован цитокиновый профиль сыворотки крови в ответ на введение нДНК. Не изучено ее радиопротекторное действие и влияние на кроветворение, как у интактных, так и у имму-нодефицитных животных. Все это определяет актуальность настоящих исследований, так как нДНК в виде БАД к пище уже применяется в практической медицине в комплексном лечении различных заболеваний, в то время как механизмы ее действия изучены недостаточно [18, 19,43,171].

Цель работы: установить закономерности действия нДНК из молок лососевых рыб на иммунную систему и некоторые факторы врожденного и адаптивного иммунитета в экспериментах на иммунокомпетентных (контроль) и иммунокомпрометированных животных (инфекционное заболевание, лучевая болезнь, онкопатология); определить эффективность применения БАД к пище ДНКаС в качестве средства сопровождения лучевой терапии у больных раком молочной железы. Задачи исследования:

1. Дать характеристику действия нДНК на показатели клеточного и гуморального иммунитета у иммунокомпетентных животных.

2. Установить влияние нДНК на спонтанную и митогениндуцированную продукцию цитокинов клетками крови здоровых доноров.

3. Оценить действие нДНК на некоторые факторы врожденного иммунитета.

4. Изучить действие нДНК на течение и исход экспериментального листе-риоза (модель вторичного иммунодефицита, обусловленного инфекционным агентом).

5. Исследовать профилактическое и лечебное действие нДНК при острой лучевой болезни (модель панцитопенического иммунодефицита).

6. Исследовать профилактическое и терапевтическое действие нДНК в эксперименте на модели перевиваемой опухоли (асцитной карциноме Эрли-ха).

7. Оценить эффективность применения БАД на основе нДНК в качестве средства сопровождения лучевой терапии у больных раком молочной железы.

Научная новизна:

• Дана комплексная оценка изменения активности ферментных систем фагоцитов крови человека под влиянием нДНК из молок лососевых рыб, что расширяет представления о механизмах ее действия. Показана способность нДНК повышать функциональную активность этих клеток, участвовать в регуляции антиоксидантного действия, что подтверждает значение экзогенных нуклеиновых кислот любого происхождения в поддержании гомеостаза и перспективность их применения в качестве иммунокорректоров при состояниях, сопровождающихся развитием вторичной иммунологической недостаточности.

Установлено, что нДНК проявляет свойства индуктора цитокинов с избирательным регуляторным эффектом: исходно низкая продукция цитокинов усиливается, исходно высокая ослабляется. Изменения касаются, прежде всего, ранних гемопоэтических цитокинов группы IL-3 и GM-CSF. Введение нДНК из молок лососевых рыб обусловливает повышение уровня цитокинов, вырабатываемых преимущественно Thl- клетками (IFNy), т.е. способствует развитию клеточного иммунного ответа. Полученные данные являются обоснованием для расширения спектра практического применения исследуемого препарата, в частности, при вторичных иммунодефици-тах, сопровождающихся недостаточностью клеточной системы иммунитета.

На модели экспериментального листериоза установлены некоторые механизмы формирования резистентности организма под действием нДНК из молок лососевых рыб при инфекциях с внутриклеточным паразитировани-ем возбудителя, что позволило рекомендовать БАДы на ее основе в комплексе лечения и профилактике листериоза.

Показано, что повышение устойчивости животных к эффекту радиации (профилактическое и терапевтическое действие нДНК) реализуется путем усиления образования эндогенных и экзогенных селезеночных колоний; более полного и раннего восстановления числа лейкоцитов, массы и кле-точности лимфоидных органов, костного мозга у облученных мышей, что обосновывает перспективность применения нДНК из молок лососевых рыб в комплексе лечения лучевой болезни и онкозаболеваний, в программу терапии которых входит лучевая терапия.

Установлено онкопротекторное действие нДНК в эксперименте и иммуно-тропные механизмы его обеспечения, а также клиническая и иммунологическая эффективность в качестве средства сопровождения лучевой терапии у больных раком молочной железы. • Иммуномодулирующее действие нДНК на клеточные элементы врожденного иммунитета (моноциты/макрофаги и нейтрофилы) реализуется путем стимуляции адгезивной активности этих клеток, а также регуляции выделения ими во внеклеточное пространство низкомолекулярных медиаторов (метаболиты кислорода, оксида азота и катионные белки), участвующих в процессах сигнализации различных физиологических функций организма. Теоретическая и практическая значимость работы:

Теоретическая значимость работы определяется тем, что впервые на большом экспериментальном материале с использованием иммунокомпетент-ных и иммунокомпрометированных животных проведена комплексная оценка действия оригинального препарата - нДНК из молок лососевых рыб на иммунную систему и некоторые факторы врожденного иммунитета организма, что позволило установить разносторонние эффекты нДНК и обосновать различные направления ее практического применения. Широкий спектр биологических эффектов нДНК, включая действие на иммунную систему и гемопо-эз, ресурсная обеспеченность и патентная защищенность препарата, являются обоснованием возможности использования этого биологически активного вещества для создания лекарственной формы.

С учетом особенностей механизмов действия нДНК (усиление фагоцитоза в нейтрофилах и макрофагах, изменение активности ферментных систем фагоцитов, повышение активности клеточных факторов иммунитета и пр.), экспериментально обоснована и доказана целесообразность новых направлений применения используемых в медицине БАД к пище на основе нДНК из молок лососевых рыб: на модели экспериментального листериоза подтверждена перспективность использования этого БАВ в комплексе лечения инфекционных болезней бактериальной этиологии с факультативным внутриклеточным паразитированием возбудителей; доказана целесообразность применения БАД к пище ДНКаС в качестве средства сопровождения лучевой терапии больных раком молочной железы для коррекции иммунной недостаточности и нарушений системы кроветворения, что позволяет провести полный курс базовой терапии этих больных. териалы диссертации были использованы при подготовке: информационного письма «Применение БАД ДНКаС и ДНКаВИТ в комплексном лечении больных листериозом» авторов Е.А. Зайцевой, J1.H. Федяниной, В.А. Иванис, Н.А. Белоголовкиной, В.М. Воронок, J1.M. Эпштейна, Т.К. Каленик. Утверждено руководителем Департамента здравоохранения Администрации Приморского края. Владивосток. -2006. информационного письма «Применение биологически активной добавки к пище БАД ДНКаС в качестве средства сопровождения лучевой терапии у больных раком молочной железы» авторов Л.Н.Федяниной, Т.С.Запорожец, С.В.Юдина, Л.М.Эпштейна. Утверждено руководителем Департамента здравоохранения Администрации Приморского края. Владивосток. - 2006. информационного письма «Listeria mono су to genes-новый микробиологический показатель опасности пищевых продуктов» авторов Л.Н.Федяниной, Е.А.Зайцевой, Т.К.Каленик, В.Б.Светлова. Утверждено руководителем ТУ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток.-.2006. пособия для практических врачей и фармацевтов «Биологически активные добавки к пище (БАД) Приморского края» авторов А.К. Гажа,

Н.Н.Беседновой, Т.С.Запорожец С.П. Крыжановского, Л.Н.Федяниной, Л.М.Эпштейна. Владивосток. -2006. о патента 2230559 Российской Федерации МПК7 А 61 К 31/70. Способ стимулирования колониеобразования кроветворных клеток- предшественников в селезенке при облучении животных / Федяпина Л.Н., Потапова В.В., Эпштейн Л.М., Беседнова Н.Н., Пивненко Т.Н., Иванушко Л.А., Каленик Т.К./. Заявитель и патентообладатель: НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 08.01.2003. 0публ.20.06.2004. Бюл. №17.

Апробация материалов диссертационной работы.

Основные положения диссертации были представлены на конгрессах и конференциях международного, российского и регионального уровня: Всемирном конгрессе по клинической и иммунной патологии (Сингапур, 2002), IX Международном конгрессе по проблемам иммунореабилитации (Москва,

2003), IX Международном конгрессе по клинической патологии (Бангкок, Таиланд, 2003), Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование» (Пермь, 2003, 2004), Международном симпозиуме по морским лекарствам (Китай, 2004), Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты», Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003, 2004, 2005), II Дальневосточном конгрессе «Человек и лекарство» с международным участием (Владивосток, 2005), Объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004), IX Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2005), Региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» (Владивосток, 2004), VI Дальневосточной онкологической конференции «Вопросы диагностики и лечения злокачественных опухолей» (Владивосток,

2004), научной сессии Дальневосточного отделения РАН и Сибирского отделения РАМН (Владивосток, 2004), Всероссийском конгрессе «Оптимальное питание-здоровье нации»: к 75-летию Государственного учреждения Научно-исследовательского института питания РАМН (Москва, 2005).

Публикации. Основные положения и результаты работы отражены в 38 научных работах, в том числе: 5 - в международной печати, 8 - в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций, а также в 3 информационных письмах, 1 патенте на изобретение, 1 пособии для врачей и фармацевтов.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 299 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования» 6 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, рекомендаций для внедрения результатов исследования в медицинскую науку и практическое здравоохранение, библиографического списка использованной литературы, включающего 456 источников. Из них отечественных - 283, зарубежных - 173. Работа иллюстрирована 27 таблицами и 39 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. нДНК из молок лососевых рыб является иммуиомодулятором и иммуностимулятором. Она проявляет умеренное стимулирующее влияние на гуморальный и клеточный иммунитет, а также факторы врожденного иммунитета организма иммунокомпетентных животных, оказывает корригирующее действие на измененные параметры иммунитета у животных с ВИД, обусловленными различными повреждающими факторами.

2. нДНК оказывает умеренное стимулирующее действие на гуморальные факторы иммунитета у иммунокомпетентных и иммунокомпрометированных животных, увеличивая продукцию АОК в селезенке и титр IgM-антител в сыворотках крови в ответ на иммунизацию эритроцитами барана. Эффект зависит от дозы нДНК, схемы, времени, путей ее введения и фазы иммунного ответа.

3. нДНК дозозависимо влияет на реакции клеточного иммунитета у иммунокомпетентных и иммунокомпрометированных животных, стимулирует спонтанную и индуцированную митогеном пролиферацию Т-лимфоцитов, усиливает реакцию ГЗТ в индуктивной фазе иммунного ответа.

4. нДНК не оказывает цитотоксического и проапоптотического действия на фагоцитирующие клетки крови доноров. При этом нДНК обладает дозоза-висимым антиоксидантным действием, регулирует кислородзависимую и нитроксидобразующую активность этих клеток. Низкомолекулярная дезок-сирибонуклеиновая кислота стимулирует выработку фагоцитирующими клетками биологически активных веществ, что является одним из механизмов реализации ее способности повышать показатели врожденного иммунитета.

5. нДНК проявляет свойства модулятора продукции цитокинов, обладающего регуляторным эффектом: исходно низкая продукция цитокинов усиливается, исходно высокая — снижается. Под действием нДНК в сыворотках крови больных и супернатантах крови доноров в основном изменяется уровень цитокина GM-CSF. При низкой исходной концентрации IL-3 и IFN- у нДНК статистически значимо увеличивает показатели концентрации этих цитокинов.

В действии нДНК доминирует способность стимулировать продукцию провоспалительных цитокинов и цитокинов, обеспечивающих иммунный ответ по Thl клеточному типу, что обеспечивает повышение показателей врожденного иммунитета в изучаемых экспериментальных моделях.

6. В условиях экспериментального вторичного иммунодефицита, вызванного сублетальным облучением (модель костномозговой стадии острой лучевой болезни у мышей), нДНК проявляет радиопротекторные и терапевтические свойства. Она повышает уровень выживаемости облученных мышей и увеличивает среднюю продолжительность их жизни, причем в большей степени этот эффект выражен при терапевтической схеме ее введения, независимо от путей введения.

7. нДНК повышает число лейкоцитов, массу тела, массу и клеточность лимфоидных органов облученных мышей, стимулирует образование экзогенных и эндогенных колоний в селезенке, что способствует усилению процессов пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток-предшественников, и в конечном итоге повышает неспецифическую резистентность к эффекту радиации.

8. На модели асцитной карциномы Эрлиха у мышей нДНК проявляет онко-протекторное действие, - достоверно увеличивает СПЖ больных животных при профилактическом применении. При этом данный эффект не связан с прямым токсическим эффектом на опухолевые клетки, а обусловлен, по - видимому, ее иммуномодулирующими свойствами.

9. Применение ДНКаС в качестве средства сопровождения лучевой терапии у больных РМЖ, оказывает модулирующее действие на уровень цитокинов IL-3, GM-CSF, TNFa, IFNy, IL-10 в сыворотке крови больных. Кроме того, нДНК положительно влияет на гематологические показатели периферической крови больных РМЖ получающих ее в комплексе послеоперационной терапии.

10. Хорошая переносимость нДНК, ее природное происхождение, возможность повторного применения в виде отдельных курсов, поливалентность действия, обуславливающего благоприятные изменения в организме, характеризующиеся повышением показателей врожденного иммунитета, подчеркивает целесообразность применения нДНК в виде БАД к пище.

11. Широкий спектр биологических свойств исследуемого вещества, ресурсная обеспеченность, высокая патентная защищенность, являются основой для создания лекарственных форм на основе нДНК.

Рекомендации для внедрения результатов исследования:

- в науку

1. На основании результатов экспериментальных и клинических исследований проведена комплексная оценка действия нДНК из молок лососевых рыб на иммунную систему организма, что позволило обосновать возможность ее использования для создания лекарственной формы и новых БАД к пище.

2. При разработке новых БАД и лекарственных препаратов на основе нДНК рекомендуется учитывать возможность получения разнонаправленных эффектов со стороны иммунной системы, зависящих от дозы используемого вещества, исходного состояния клеток (активация, покой, депрессия) и их внутренних потенций.

-в медицинскую практику

1. Рекомендуется применять БАД ДНКаС по 1 грамму в сутки в течение 30 дней больным раком молочной железы, получающим лучевую терапию (Информационное письмо «Применение биологически активной добавки к пище БАД ДНКаС в качестве средства сопровождения лучевой терапии у больных раком молочной железы» авторов JI.H. Федяниной, Т.С. Запорожец, С.В. Юдина, JT.M. Эпштейна). Утверждено руководителем Департамента здравоохранения Администрации Приморского края. Владивосток. -2006.

- Пособие для врачей и фармацевтов. Биологически активные добавки к пище (БАД) Приморского края авторов JI.H. Федяниной, А.К. Гажа, Н.Н. Беседновой, С.П. Крыжановского, JI.M. Эпштейна. Владивосток. 2006.

2. Рекомендуется применять БАД ДНКаС по 1 грамму в сутки в течение 15 дней больным листериозом (в комплексе базового лечения) (информационное письмо «Применение БАД ДНКаС и ДНКаВИТ в комплексном лечении больных листериозом» авторов Е.А. Зайцевой, JI.H. Федяниной, В.А. Иванис, Н.А. Белоголовкиной, В.М. Воронок, JLM. Эпштейна, Т.К. Кале-ник). Утверждено руководителем Департамента здравоохранения Администрации Приморского края. Владивосток. - 2006. 3. Предприятиям, деятельность которых осуществляется в области обращения пищевой продукции, в том числе пищеблоков различных медицинских учреждений, рекомендуется усилить меры по профилактике листериоза (информационное письмо ««Listeria rnonocytogenes-яовът микробиологический показатель опасности пищевых продуктов» авторов JI.H. Федяниной, Е.А. Зайцевой, Т.К. Каленик, В.Б. Светлова). Утверждено руководителем ТУ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток.-.2006.

- в учебный процесс:

Рекомендуется использовать в учебном процессе кафедр микробиологии, иммунологии, инфекционных болезней, гигиене питания медицинских вузов новые данные о механизмах действия нДНК из молок рыб, возможности практического применения БАД к пище на ее основе.