Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуномодулирующие и радиозащитные свойства биологически активных веществ из морских гидробионтов

На правах рукописи

ПОТАПОВА ВЕРА ВЛАДИМИРОВНА

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ И РАДИОЗАЩИТНЫЕ СВОЙСТВА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ МОРСКИХ ГИДРОБИОНТОВ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Владивосток - 2005 год

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН.

Научный руководитель:

академик РАМН, доктор медицинских наук Беседнова Наталия Николаевна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Маркелова Елена Владимировна кандидат медицинских наук, доцент Шаркова Валентина Александровна

Ведущее учреждение: НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (г. Москва).

часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.007.02 при ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет» МЗ и СР РФ по адресу: 690990, г. Владивосток, проспект Острякова, 2 (главный корпус).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет» (корпус 3).

Автореферат разослан « » ОЛХХЛ. 2005 года

г. в «

Ученый секретарь Диссертационного Сов кандидат медицинских наук, доцент

Р.Н. Диго

№<3509

3

Актуальность темы.

Повсеместное распространение ядерных технологий влечет за собой неизбежное расширение круга лиц, подвергающихся неблагоприятному воздействию радиационных факторов. К группам высокого радиационного риска относят персонал ремонтных подразделений атомных электростанций, рабочих урановых рудников и предприятий по переработке урановых руд, врачей-рентгенологов, радиологов и т.д. Также необходимо упомянуть группу, подвергающуюся облучению в различном диапазоне доз, которую составляют больные с онкологической патологией.

Особое место занимают ситуации, связанные с авариями на предприятиях, применяющих радиационно-опасные технологии, к которым в первую очередь относятся атомные электростанции. Разгерметизация реактора может послужить причиной радиоактивного заражения огромных площадей и облучения десятков, а порой и тысяч людей (Смирнов B.C. и др., 1992). Крупнейшей подобной катастрофой можно считать Чернобыльскую (1986). Ей предшествовали аварии на реке Тече (1949-1952 гг.), комбинате «Маяк» (1957), авария на атомной подводной лодке ТОФ в б. Чажма Приморского края (1985). По данным литературы за истекшие 50 лет в России произошло 175 радиационных аварий и инцидентов локального характера (Троян JI.B. 2000, Ильин ЛЛ., 2002).

С точки зрения современной иммунологии острая лучевая болезнь (ОЛБ) представляет собой вторичный иммунодефицит панцитопенического типа. Исходя из роли системы иммунитета в механизме развития лучевого поражения организма, разработаны принципы профилактики и лечения ОЛБ с помощью иммуномодулирующих лекарственных препаратов и неспецифических иммуномодуляторов природного происхождения - биологически активных добавок (БАД) к пище (Иванов А.А. и др., 1999). К первой группе относят нуклеиновые кислоты, и, в том числе, ДНК, обладающие противолучевой активностью в широком диапазоне доз облучения. Начиная с 60-х годов прошлого столетия, было проведено множество экспериментов по изучению

гомо- и гетерологичной ДНК, в основном высокополимерной (Федорова Т.А., 1972; Белоус A.M., 1974). При этом радиозащитное действие ранее объясняли только ее непосредственным влиянием на стволовые клетки костного мозга и гемопоэз, возможность иммуноопосредованного действия ранее не рассматривалась.

В настоящее время в качестве лекарственного препарата разрешен к применению деринат - натриевая соль нативной ДНК, полученной из молок осетровых рыб (Техномедсервис, г. Москва). Он оказывает радиозащитное и иммуномодулирующее действие и рекомендован при ОЛБ 2-4 степени тяжести, и, в том числе, у онкологических больных, в период прохождения ими Ч

радиотерапии (Каплина Э.Н., 2000).

По многочисленным данным российских и зарубежных авторов, морские гидробионты являются перспективными источниками многообразных и высокоэффективных биологически активных веществ (БАВ) разнонаправленного действия (Вайнберг Ю.П. и др., 1982; Новикова М.В. и др., 1998; Касьяненко Ю.И и др., 1999; Левингтон Ж.Б. и др. 1999; Mayer A.M. et al., 1999-2004).

В настоящей работе исследовались радиозащитные и иммуномодулирующие свойства БАВ из молок морских гидробионтов, содержащих низкомолекулярную ДНК - ДНК из молок лосося (нДНК) и гидролизата из гонад гребешка (ГГТ), полученных в лаборатории прикладной биохимии Тихоокеанского научного рыбохозяйственного центра. i

нДНК является основным действующим веществом таких БАД к пище как ДНКаС и ДНКаВИТ (производитель - ООО «Биополимеры», г. Партизанск), разрешенных к использованию и широко применяемых населением. В частности, прием этих БАД был рекомендован (по аналогии с деринатом) онкологическим больным, получающим лучевую терапию. Однако радиозащитные свойства нДНК не были изучены ранее, что и послужило причиной включения ее в это исследование.

ГГТ, выделенный методом ферментативного гидролиза, - новое, ранее неизученное вещество, биологическая активность которого была установлена нами при проведении скринингового исследования различных БАВ морского происхождения.

Цель исследования.

Целью настоящей работы явилось изучение радиозащитных и иммуномодулиругощих свойств ДНК из молок лососевых рыб и гидролизата из гонад гребешка для обоснования перспективности их применения при вторичных иммунодефицитах, в том числе и радиационного генеза и возможного создания на их основе лекарственных препаратов. Задачи исследования:

1. Определить эффективность различных доз и схем введения нДНК и ГТТ при костно-мозговом синдроме острой лучевой болезни.

2. Исследовать влияние нДНК и ГТТ на кроветворение в интактном и облученном организме.

3. Изучить действие различных доз нДНК и ГТТ на иммунные реакции гуморального и клеточного типа.

4. Оценить воздействие нДНК и ГТТ на продукцию цитокинов (ИЛ-3, ГМ-КСФ, ФНО-а, ИФН-у и ИЛ-10) клетками крови здоровых доноров.

Научная новизна.

Впервые исследованы радиозащитные свойства нДНК и ГГТ. Доказана способность БАВ при их введении после воздействия ионизирующей радиации в дозах, вызывающих развитие костно-мозгового синдрома, стимулировать репаративные процессы в кроветворной системе. Установлено, что нДНК и ГТТ при лечебной схеме введения обладают свойством увеличивать выживаемость и среднюю продолжительность жизни облученных животных.

Впервые па обширном экспериментальном материале показана иммуномодулирующая активность нДНК и ГГТ. Выявлено, что БАВ оказывают выраженное влияние па гуморальный и клеточный иммунитет - обеспечивают увеличение числа антителообразующих клеток (АОК) в селезенке интактных

мышей, изменяют интенсивность реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), индуцированную у животных введением эритроцитов барана (ЭБ). В реакции бласттрансформации (РБТЛ) установлено, что под действием БАВ происходит стимуляция спонтанной и митогениндуцированной пролиферации Т-лимфоцитов.

Впервые установлено модулирующее действие нДНК и ГГТ на продукцию цитокинов (ИЛ-3, ГМ-КСФ, ФНО-а, ИФН-7 и ИЛ-10) клетками крови здоровых доноров.

На основании полученных данных сделано предположение, что стимулирующее влияние ДНК-содержащих БАВ на систему кроветворения в \

облученном организме реализуется через иммунную систему.

Новизна результатов подтверждена получением патентов на изобретения

(2).

Практическая значимость работы.

Дана характеристика и раскрыты некоторые механизмы радиозащитного и иммунотропного действия ГГТ и нДНК. Последняя является основным действующим веществом таких широко применяемых населением БАД к пище как ДНКаС и ДНКаВИТ, однако, механизмы воздействия нДНК до сих пор были изучены недостаточно полно. Дано обоснование использования ДНК-содержащих БАД в комплексе лечения вторичных иммунодефицитов, в том числе, радиационного генеза. Проработана экспериментальная база для возможного создания на основе БАВ из гонад гребешка биологически активной добавки к пище. Полученные результаты дают стимул к дальнейшему изучению нДНК и ГТГ с целью создания в будущем на их основе лекарственных препаратов.

Апробация материалов диссертации проведена на различных научных форумах международного, российского, регионального уровней. Материалы диссертации представлены на Международной научно-практической конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет» (Санкт-Петербург, 2002 г.), IV Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых

ученых с международным участием (Владивосток, 2003 г.), IV всемирном конгрессе по астме, IX международном конгрессе по клинической патологии (Бангкок, Таиланд, 2003), X и XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003 и 2004 г.), Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование» (Пермь, 2003 и 2004 г.), Объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004 г.), Региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» (Владивосток, 2004 г.), VI Дальневосточной онкологической конференции «Вопросы диагностики и лечения злокачественных опухолей» (Владивосток, 2004 г.), научной сессии Дальневосточного отделения РАН и Сибирского отделения РАМН (Владивосток, 2004 г.). Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 19 работ - 4 статьи и 15 тезисов. Получены 2 патента на изобретение.

Объем и структура диссертации. Материал диссертации изложен на 155 страницах машинописного текста, проиллюстрирован И таблицами и 19 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения, общих выводов, рекомендаций практическому здравоохранению, указателя литературы (130 отечественных и 125 иностранных источников).

Основные положения, выносимые иа защиту.

1. нДНК и ГТГ в эксперименте снижают летальность облученных животных и увеличивают продолжительность их жизни;

2. Эффект нДНК и ГГГ при экспериментальной ОЛБ обусловлен восстановлением кроветворения, а также иммуномодулирующими свойствами этих БАВ;

3. нДНК и 111 оказывают иммуностимулирующее действие на гуморальные и клеточные факторы специфического иммунитета;

4. нДНК и ГТТ оказывают модулирующее действие на продукцию ИЛ-3, ГМ-КСФ, ФНО-а, ИФН-у и ИЛ-10 клетками крови здоровых доноров, повышая

исходно низкий, не штияя на средний и снижая исходно высокий уровень этих цитокинов.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы исследования.

Эксперименты проводили на 540 неинбредных мышах, массой 18-20 г и 1160 мышах гибридах (CBAxC57BL) F, массой 20-22 г, полученных из питомника РАМН "Столбовая". Содержание и уход за животными осуществляли согласно международным рекомендациям Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для опытных и других научных целей (1986). Исследования проводили в соответствии с Ч

правилами, установленными приказом №755 МЗ СССР от 12.08.77. Для изучения влияния БАВ на продукцию цитокинов использовали кровь доноров (28 проб).

Объектами экспериментального изучения являлись низкомолекулярная ДНК из молок лососевых рыб и гидролизат из гонад гребешка.

В качестве сырья для получения нДНК используют мороженые молоки лососевых рыб - горбуши (Oncorhynchus gorbuscha), кеты (Oncorhynchus keta) -3-4 стадии зрелости. Ее выделяют методом солевой экстракции с последующим осаждением конечного вещества из раствора этиловым спиртом и удалением жира и влаги сушкой на воздухе при комнатной температуре. В состав БАВ нДНК входит 79,0% ДНК, 7,8% белка, 2,1% липидов и 10,7% воды. Молекулярная масса ДНК составляет 270-500 кДа, гиперхромный эффект - не i

менее 37%. Содержание нуклеиновых кислот достигает 70-80%. нДНК представляет собой аморфный порошок светло-кремового цвета, растворимый в воде при нагревании и не растворимый в органических растворителях (Касьяненко Ю.И. и др., 1999).

БАВ ГТГ получают из гонад приморского гребешка (Patinopecten yessoensis) методом ферментативного гидролиза (Пивненко Т.Н. и др., 1997). В состав БАВ входит 35,2% ДНК, 54,4% белка, 0,4% липидов и 10,0% воды. Молекулярная масса ДНК составляет 300-500 кДа. БАВ представляет собой

аморфный порошок светло-кремового цвета, растворимый в воде при нагревании и не растворимый в органических растворителях (Позднякова Ю.М. и др., 2003).

Радиозащитные свойства БАВ оценивали с помощью методов эндо- и экзоколониеобразования, определения клеточности костного мозга, тимуса, селезенки и массы лимфоидных органов, 30-дневной выживаемости и средней продолжительности жизни облученных животных.

Определение влияния БАВ на количество КОЕс проводили в соответствии с методом эндо- и экзоколониеобразования (Till J., McCulloch, 1961, 1963, 1964) на селезенке сублеталыю (6,5 Гр на аппарате РОКУС-М при мощности дозы 0,9 Гр/мин) и летально (9,5 Гр Гр на аппарате РУМ-25 при мощности дозы 0,5 Гр/мин) облученных мышей.

Влияние БАВ на количество лейкоцитов, массу и клеточность лимфоидных органов интактных и облученных (6,5 Гр на аппарате РОКУС-М при мощности дозы 0,9 Гр/мин) мышей исследовали на 1, 3, 9, 14 и 23 сутки (Запорожец Т.С., 1986). Селезенку и тимус извлекали, взвешивали на весах, затем гомогенизировали, фильтровали через капроновый фильтр. Вычленяли бедренную кость, срезали диафизы, с помощью шприца вымывали костный мозг в определенный объем 5% раствора уксусной кислоты и гомогенизировали. Количество ядросодержащих клеток (ЯСК) тимуса, селезенки и костного мозга подсчитывали в камере Горяева (хЮ6).

Влияние БАВ на течение острой лучевой болезни оценивали по 30-дневной выживаемости и средней продолжительности жизни (СПЖ) сублетально облученных (7 Гр на аппарате РОКУС-М при мощности дозы 0,9 Гр/мин) мышей (Игнатенко JI.A., 1986).

Иммунотропные свойства БАВ оценивали по их влиянию на гуморальное (подсчет АОК в селезенке и определение титра гемагглютининов в сыворотке крови), клеточное звено (РБТЛ и ГЗТ) иммунитета интактных мышей и продукцию цитокинов клетками крови доноров.

Определение влияния БАВ на количество антителообразующих клеток

в селезенке интактных мышей (Yerne N.K., Nordin F.N., 1963) проводили на 4-е сутки после иммунизации тимусзависимым антигеном - ЭБ (1х108).

Исследование влияния БАВ на титр гемагглютининов в сыворотке крови интактных мышей проводили на 4, 7 и 14 сутки после иммунизации ЭБ (Хаитов P.M. и др., 1995).

С помощыо реакции бласттрансформации оценивали спонтанную и митогениндуцированную (Кон А) пролиферативную активность Т-лимфоцитов (Хаитов P.M. и др., 1995).

Влияние БАВ на интенсивность реакции ГЗТ исследовали по методу Р.Н. Lagrange et al. (1974).

Изучение влияния БАВ на продукцию цитокинов (ИЛ-3, ГМ-КСФ, ФНО-а, ИФН-7, ИЛ-10) проводили в супернатантах крови доноров (Исаченко Е.Г. и др., 1998). Определение уровня цитокинов осуществляли с помощью специфических реактивов фирмы «R&D. Diagnostics. Inc» (США) методом сендвич-варианта твердофазного иммуноферментного анализа, согласно прилагаемой инструкции. Учет результатов производили на иммуноферментном анализаторе «Multiscan» (Финляндия). Расчеты уровня ИЛ-3, ГМ-КСФ, ФНО-а, ИФН-7 и ИЛ-10 (пг/мл) выполняли путем построения калибровочной кривой с помощью специальной компьютерной программы.

Статистический анализ полученных данных проводили с применением параметрических и непараметрических методов - t-критерия Стьюдента и рангового Т-критерия Уилкоксона для попарно связанных вариант (Лакин Г.Ф., 1990). Для обработки результатов исследований также использовалась программа Biostat.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В экспериментах установлено, что нДНК и ГТТ индуцируют образование эндогенных и экзогенных колоний на селезенке облученных мышей.

Изучение действия различных доз 1, 10, 50, 100 мг/кг БЛВ показало, что наиболее эффективной является доза 10 мг/кг, индекс стимуляции (ИС) при применении нДНК составил 2,2, 111 - 2,1 (рис. 1). Эта доза и была использована в дальнейшем.

^ЭнДНК ШШ ПТ контроль

Рис. 1. Влияние различных доз нДНК и ГГГ на количество эндогенных колоний в селезенке облученных мышей (6,5 Гр), КОЕс.

При сравнении различных схем было обнаружено, что стимулирующее действие БАВ в большей степени проявляется при лечебном, нежели при профилактическом введении. Также установлено, что нДНК и 111 обладают способностью выводить стволовые кроветворные клетки (СКК) из фазы покоя в S-фазу клеточного цикла с последующей их репликацией.

Исследование влияния БАВ на способность клеток костного мозга (ККМ) формировать гранулоцитарно-макрофагальные колониеобразующие единицы (КОЕ-ГМ), бурстообразующие единицы (БОЕ-Э) и гранулоцитарно-макрофагально-эритроидно-мегакариоцитарно Т-клеточные колонии (КОЕ-ГЭММ) показало, что нДНК в 8,7 раз стимулирует образование эритроидных клеток-предшественников. При введении 111 в 2,9 раза достоверно повышалось количество КОЕ-ГЭММ и также отмечалась некоторая тенденция к увеличению содержания БОЕ-Э (рис. 2).

□ КОЕ-ГЭММ 11КОЕ-ГМ ■ БОЕ-Э

Рис. 2. Влияние нДНК и ГГГ на колониеобразующую активность клеток

костного мозга.

Таким образом, введение исследуемых БАВ вызывает активацию СКК, обеспечивающую усиление процессов пролиферации и дифференцировки гемопттических клеток-предшественников. Согласно данным литературы (Русинова Г.Г. и др., 1976) такое действие можно объяснить усвоением экзогенной ДНК тканями и клетками облученного организма и использованием ее в процессе пострадиационного восстановления в качестве предшественников для синтеза собственной ДНК клеток.

Воздействие БАВ на процессы восстановления на тканевом уровне (регенерацию) оценивали по их влиянию на количество лейкоцитов, массу лимфоидных органов, клеточность костного мозга, тимуса, селезенки, являющихся критическими структурами при костно-мозговом синдроме ОЛБ. Изучение динамики этих показателей на 1, 3, 9, 14 и 23 сутки после облучения (6,5 Гр), позволило установить, что у животных, получавших БАВ, падение исследуемых величин на 1-3 сутки не достигало контрольного минимума, а процесс восстановления начинался раньше и был более полным.

Выживание животного при воздействии на него ионизирующей радиации в костно-мозговом диапазоне доз создает четкую модель радиорезистентного

состояния организма. При использовании БАВ в дозах - 1, 10 и 100 мг/кг - до и после облучения, наибольшая эффективность наблюдалась при лечебной схеме и дозе 10 мг/кг. Сравнение различных способов введения БАВ (при этой дозе и схеме применения) показало, что ГГТ и нДНК при подкожном введении повышают выживаемость облученных животных на 25-30% соответственно, при введении per os на 20-25% соответственно. Продолжительность жизни облученных мышей при лечебном применении БАВ, вне зависимости от способа введения - парентерального или перорального, увеличивалась в среднем в 2 раза.

Можно предположить, что подобное влияние БАВ на выживаемость и среднюю продолжительность жизни облученных животных, слагается из их стимулирующего действия на процессы репарации на клеточном и регенерации на тканевом уровне.

В эксперименте обнаружено, что БАВ оказывают дозозависимое стимулирующее действие (наиболее выраженное при дозе 10 мг/кг) на формирование АОК в селезенке интактных мышей. При применении нДНК в большей степени количество АОК повышалось в индуктивную фазу (ИС =2,6) (рис. 3). Введение ГГТ вызывало практически равное увеличение АОК как в индуктивную (в 2,0 раза), так и в пролиферативную (в 1,8 раза) фазу иммунного ответа.

индуктивная

пролифератив контроль нДНК контроль ГГТ жя фаза 1 2

Рис. 3. Влияние нДНК и 111 на формирование АОК в селезенке мышей.

Исследование титра гемагглютинов иа 4, 7 и 14 сутки после иммунизации мышей ЭБ показало, что БАВ вызывают незначительное повышение уровня сывороточных антител.

Преимущественное влияние БАВ на индуктивную фазу иммунного ответа может быть обусловлено их влиянием на любой из процессов, протекающих в этот период - активацию (выход клеток из фазы покоя в Я-фазу клеточного цикла) или пролиферацию лимфоцитов. Кроме того, эффект БАВ может опосредоваться через стимуляцию Тх2 к выработке ими цитокинов, 1

необходимых для развития этих процессов.

В РБТЛ было установлено, что нДНК и ПТ обладают способностью *

дозозависимо активировать спонтанную и митогениндуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов. Наиболее выраженное действие наблюдалось при их введении в дозах 10 и 100 мг/мл (табл. 1). нДНК практически одинаково увеличивала как спонтанную (ИС=1,8), так и митогениндуцированную пролиферативную (1,6-1,8) активность лимфоцитов. 111 в большей степени повышал уровень спонтанной (ИС=2,0-1,9) и в меньшей степени (ИС=1,5-1,6) митогениндуцированной пролиферации лимфоидных клеток.

Таблица 1.

Влияние различных доз нДНК и ГГТ на пролиферацию лимфоцитов.

№ п/п Группа Включение 3Н-тимидина, имп/мин

Спонтанная пролиферация лимфоцитов ИС Митогениндуци рованная (Кон А) пролиферация лимфоцитов ИС

1 Контроль 1 878±95 - 9995±721 -

2 нДНК-1 мг/мл 1230±125* 1,4 12350±750* 1,2

3 нДНК-10 мг/мл 1548±98*** 1,8 15525±1230*** 1,55

4 нДНК-100 мг/мл 1590±102*** 1,8 18230±1150*** 1,8

5 Контроль 2 953±156 - 10637±690 -

6 ГГГ- 1 мг/мл 1121±51 1,2 13486±586** 1,3

7 ГГГ-10 мг/мл 1938±110*** 2,0 16377±460*** 1,5

8 ГГГ-100 мг/мл 1765±121*** 1,9 17230±382*** 1,6

*- р<0,05; ** - р<0,01; **♦ - р<0,001

В реакции ГЗТ наиболее эффективной являлась доза 10 мг/кг. нДНК оказывала более выраженное влияние на индуктивную фазу этой реакции, при введении за 3-е суток (ИС=1,8) и за сутки (ИС=1,7) до сенсибилизирующей дозы ЭБ (табл. 2).

Таблица 2.

Влияние различных доз нДНК на реакцию ГЗТ.

№ Срок введения Прирост массы лапки, %

п/п 1 мг/кг 10 мг/кг 100 мг/кг Контроль

1 За 3 суток до сенсибилизации ЭБ 25,7±3,1** 29,4±3,0*** 22,5±4,1 16,4±0,65

2 За сутки до сенсибилизации ЭБ 23,4±2,9 31,7±3,9** 26,1±5,4 18,9±0,95

3 Одновременно с сенсибилизацией ЭБ 24,5±3,5 26,5±2,9* 18,4±2,7 19,4±1,1

4 Перед разрешающей дозой ЭБ 20,8±2,8 27,4±3,2* 24,4±1,8** 18,1±0,86

* - р<0,05; ** -р<0,01;

Применение 111 обеспечивало значительный прирост массы лапки у мышей как при введении одновременно с сенсибилизирующей дозой ЭБ (ИС=1,8), так и перед введением разрешающей дозы ЭБ (ИС=1,6), то есть и в индуктивную и эффекторную фазы (табл. 3).

Таблица 3.

Влияние различных доз 11 'Г на реакцию ГЗТ.

№ Срок введения Прирост массы лапки, %

п/п 1 мг/кг 10 мг/кг 100 мг/кг Контроль

1 За 3 суток до сенсибилизации ЭБ 27,4±4,2 25,0±4,6 22,6±4,7 18,8±2,1

2 За сутки до сенсибилизации ЭБ 20,8±4,6 22,4±2,1 20,0±3,4 15,8±3,1

3 Одновременно с сенсибилизацией ЭБ 32,1±5,1* 34,4±3,2** 25,2±2,8 18,9±3,2

4 Перед разрешающей дозой ЭБ 31,Ш:4,2 35,7±4,1* 28,1±3,2 21,8±3,8

* - р<0,05; ** - р<0,01;

Усиление реакции ГЗТ, наблюдаемое в 1-ю фазу клеточного иммунного ответа, может быть обусловлено стимулирующим влиянием БАВ на процессы

активации С04+-Т-клеток и дифференцировки их в Txl. В свою очередь, действие ГТТ на эффскторную фазу ГЗТ, может опосредоваться через стимуляцию Txl к выработке цитокинов и индуцирование процесса активации макрофагов.

Стимулирующее воздействие БАВ на гуморальное и клеточное звено иммунитета коррелировало с их влиянием на массу и клеточность лимфоидных органов интактных мышей.

Изучение влияния БАВ на продукцию цитокинов проводили в супернатантах крови здоровых доноров. Основываясь на данных литературы (Чекановская, Генералов, 2001), для интерпретации результатов всех доноров условно делили на 3 группы (ориентируясь на исходный уровень секреции цитокинов): с исходно низкими, со средними и с исходно высокими показателями.

В работе исследовали воздействия нДНК и ГГТ на продукцию ранних гемопоэтических ростовых факторов (ИЛ-3, ГМ-КСФ и ФНО-а), входящих в cociaB гемопоэзипдуцирутощсго микроокружения (Рогачева С.А. и др., 1998, Гольдберг Е.Д. и др., 2001), оценивали влияние БАВ на содержание цитокинов, вырабатываемых преимущественно Тх1/Тх2, а также про- и противовоспалительных цитокинов (ФНО-а, ИФН-у, ИЛ-10) (Ярилин A.A. и др., 1999).

Полученные результаты показали, что БАВ оказывают модулирующее действие на продукцию всех исследованных цитокинов клетками крови здоровых доноров, повышая исходно низкую их концентрацию, снижая исходно высокую и не оказывая существенного влияния при среднем уровне их выработки. В группах с исходно низкими показателями они проявляли стимулирующее, но не равнозначное по интенсивности действие на продукцию различных цитокинов. Применение нДНК и, в особенности ГТГ вызывало значительное повышение продукции ГМ-КСФ в 5,8 раза и в 9,7 раза (рис. 7) соответственно. В меньшей степени БАВ влияли на выработку клетками крови доноров ИЛ-3 - в 4,4 раза при введении ДНК из молок лосося, в 3,2 раза при

Рис. 7. Влияние нДНК и 111 на продукцию ИЛ-3 и ГМ-КСФ клетками крови здоровых доноров, пк/мл.

введении ГТТ, - и ФНО-а - в 2,5 и 3,3 раза (рис. 8) соответственно. Под действием нДИК наблюдалось более выраженное, по сравнению с ИЛ-10 (ИС=1,9), повышение уровня ИФН-у (ИС= 3,3). Добавление к клеткам ГТТ способствовало практически равной стимуляции продукции как ИЛ-10, так и ИФН-у (ИС=2,6-2,7).

Рис. 8. Влияние нДНК и ГГГ на продукцию ФНО-а, ИФН-у и ИЛ-10 клетками крови здоровых доноров, пк/мл.

Эти результаты свидетельствуют о том, что БАВ оказывают более выраженное стимулирующее действие на продукцию провоспалительных (ФНО-а), нежели противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10). Введение нДНК обуславливает повышение уровня цитокинов, вырабатываемых преимущественно хелперами 1-го типа (ИФН-у), т.е. может способствовать развитию клеточного иммунного ответа. В свою очередь, ПТ оказывает практически равнозначное действие на выработку цитокинов Тх1 и Тх2. Подобный эффект можно объяснить его влиянием не на дифференцировку лимфоцитов, а лишь на синтез соответствующих цитокинов.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что нДНК и ГГГ обладают радиозащитными и иммуномодулирующими свойствами.

Противолучевое действие БАВ реализуется через непосредственное участие в репаративных процессах поврежденных радиацией клеток, и, в первую очередь, стволовых кроветворных клеток костного мозга. Тем самым, они укорачивают период митотического блока, способствуя более раннему выходу клеток из фазы G0 в S-фазу клеточного цикла, и стимулируют их дальнейшую пролиферацию и дифференцировку. Результатом является более быстрая регенерация тканей критических органов - костного мозга, тимуса и селезенки, восстановление нормального функционирования гемопоэтической и иммунной систем и, как следствие повышение выживаемости и средней продолжительности жизни облученных мышей. Однако, помимо перечисленного, по нашему мнению, механизм радиозащитного действия БАВ может опосредоваться и через иммунную систему. Экспериментально установлено индуцирующее влияние нДНК и 111 на В- и Т-лимфоциты, которые согласно P.M. Хаитову (1979), участвуют в регуляции гемопоэза. Важную роль в восстановлении кроветворения облученного организма играют гуморальные факторы, выделяемые тимусом (Семина, 1980), вероятность участия которых при применении БАВ подтверждает тот факт, что у облученных животных опытных групп наблюдается более значительное, по

сравнению с контролем, увеличение массы и клеточности тимуса. Кроме того, радиозащитный эффект нДНК и ГГГ может реализовываться посредством активации гемопоэзиндуцирующего микроокружения, и в частности, через стимуляцию продукции ранних гемопоэтических ростовых факторов, к которым относятся ИЛ-3, ГМ-КСФ и ФНО-а.

Иммуномодулирующее действие обусловлено влиянием исследуемых БАВ на развитие процессов гуморального и клеточного иммунного ответа и продукцию внутри- и межсистемных регуляторных факторов - цитокинов.

Все вышеизложенное свидетельствует о сложности и многогранности механизма действия нДНК и ГГТ.

ВЫВОДЫ

1. Применение низкомолекулярной ДНК из молок лососевых рыб и гидролизата из гонад гребешка вызывает усиление образования эндогенных и экзогенных селезеночных колоний, что проявляется как в профилактической так и в лечебной схеме введения БАВ, однако, при использовании последней это действие более выражено. Наиболее значимый эффект получен при дозе 10 мг/кг.

2. Введение низкомолекулярной ДНК из молок лососевых рыб и гидролизата из гонад гребешка мышам через час после облучения способствует более полному и раннему восстановлению числа лейкоцитов, а также массы и

» клеточности лимфоидных органов - тимуса и селезенки и клеточности костного

мозга.

ь 3. Низкомолекулярная ДНК из молок лососевых рыб и гидролизат из гонад

гребешка повышают уровень выживаемости и увеличивают среднюю продолжительность жизни облученных мышей. Это действие является более выраженным при лечебной схеме применения БАВ в дозе 10 мг/кг. Полученный эффект практически равнозначен как при подкожном, так и при пероральном введении нДНК и ГГТ.

4. Низкомолекулярная ДНК из молок лососевых рыб и гидролизат из гонад гребешка оказывают иммуностимулирующее дозозависимое действие на гуморальное звено иммунного ответа. Наиболее значительное повышение количества АОК по сравнению с контролем наблюдалось при введении БАВ в индуктивную фазу антителообразования, при дозах 10 и 100 мг/кг. Низкомолскулярная ДНК из молок лососевых рыб и гидролизат из гонад гребешка вызывали незначительное повышение титра сывороточных антител, дозозависимого эффекта при этом практически не отмечалось.

5. Низкомолекулярная ДНК из молок лососевых рыб и гидролизат из гонад гребешка оказывают выраженное дозозависимое влияние на клеточный иммунитет, стимулируя развитие реакции ГЗТ. При этом наибольшая эффективность наблюдалась при введении БАВ в дозе 10 мг/кг - нДНК только в индуктивную, а 111 в индуктивную и в эффекторную фазы иммунного ответа. С помощью РБТЛ установлено, что БАВ способствуют активации процесса пролиферации лимфоцитов.

6. Низкомолекулярная ДНК из молок лососевых рыб и гидролизат из гонад гребешка оказывают модулирующее действие на секрецию ИЛ-3, ГМ-КСФ, ФНО-а, ИФН-у и ИЛ-10 клетками крови здоровых доноров, повышая исходно низкую их концентрацию, снижая исходно высокую и не оказывая существенного влияния при среднем уровне их секреции. Исследуемые БАВ оказывают более выраженное стимулирующее действие на продукцию провоспалительных (ФНО-а), нежели противовоспалительных циюкинов (ИЛ-10).

7. Введение низкомолекулярной ДНК из молок лососевых рыб обуславливает повышение уровня цитокинов, вырабатываемых преимущественно Тх1-клетками (ИФН-у), т.е. может способствовать развитию клеточного иммунного ответа. Напротив, гидролизат из гонад гребешка оказывает равнозначное действие на выработку цитокинов Тх1 и Тх2.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В МЕДИЦИНСКУЮ НАУКУ И ПРАКТИКУ.

1. Разработаны дополнения к инструкциям по применению БАД, созданных на основе низкомолекулярной ДНК из молок лососевых рыб. ДНКаС и ДНКаВИТ рекомендуется применять в следующих случаях:

• При радиационных иммунодефицитах (при облучении в дозах не превышающих костно-мозговой диапазон); в группах радиационного риска (персонал ремонтных подразделений атомных электростанций, рабочие урановых рудников и предприятий по переработке урановых руд, врачи рентгенологи, радиологи и т.д.), в том числе, у онкологических больных, получающих радиотерапию;

• При вторичных иммунодефицитах, протекающих без клинических проявлений и регистрируемых только по изменениям в иммунологических тестах. Лица с такими нарушениями иммунной системы относятся по классификации Хаитова и др. (1996) к группе, которой не показано назначение иммуномодулирующей терапии с использованием лекарственных препаратов.

2. Получены 2 патента на изобретение - №2230559 «Способ стимулирования колониеобразования кроветворных клеток-предшественников в селезенке при облучении животных» (ДНК из молок лососевых рыб) и №2236456 «Способ стимулирования колониеобразования кроветворных клеток-предшественников

' в селезенке при облучении животных» (гидролизат из гонад гребешка).

3. Советом экономической безопасности на основании инвентаризации принадлежащего нам патента №2230559 «Способ стимулирования колониеобразования кроветворных клеток-предшественников в селезенке при облучении животных» установлена фактическая возможность его использования для внедрения или инвестирования (письмо №Д-25 от 28.12.2004).

4. В ООО «Биополимеры» (г. Партизанск) направлено письмо, в котором рекомендовано расширить область применения БАД на основе низкомолекулярной ДНК из молок лососевых рыб (ДНКаС и ДНКаВИТ).

5. В ТИНРО-центр направлено письмо, в котором рекомендовано продолжить исследование свойств гидролизата из гонад гребешка для возможного создания на его основе биологически активной добавки к пище.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Адьювантная активность биологически активной добавки к пище ДНК из молок лососевых рыб / JI.H. Фсдянина, Т.К. Каленик, В.В. Потапова, JI.A. Ипанушко // Материалы международ, научн.-практич. конф. «Здоровье и образование: Медико-социальные и экономические проблемы», Пермь, 2-9 мая 2004. - Пермь, 2004. - С. 276-277.

2. Влияние БАД из тканей и органов морских гидробионтов на кроветворение при острой лучевой болезни / В.В. Потапова, JT.A. Иванушко, H.H. Бессднова, Ю.М. Позднякова, В.В. Давидович, Т.Н. Пивненко, J1.M. Эпштейн // Известия ТИНРО-центра. - 2004. - Т. 139. - С. 418-425.

3. Влияние биологически активных веществ из гидробионтов Тихого океана на кроветворение при острой лучевой болезни / JI.I1. Федянина, Л.А. Иванушко, Т.Н. Пивненко, В.В. Потапова, И.А. Орловская II Материалы международ, научн.-практич. конф. «Здоровье и образование», Пермь, 19-25 мая 2003. -Пермь, 2003. - С. 281-283.

4. Влияние ДНК из молок лососевых рыб на некоторые показатели гуморального иммунного ответа / Л.Н. Федянина, В.В. Потапова, Л.А. Иванушко, Л.М. Эпштейн, В.Н. Ржанникова, В.П. Маслов // Человек и лекарство: XI Российский национальный конгресс, Москва, 19-23 апреля 2004: Тез. докл. - М., 2004. - С. 845.

5. Влияние ДНК из молок лососевых рыб на пролиферативную активность колониеобразугощих единиц селезенки / Л.Н. Федянина, В.В. Потапова, Л.М.

Эпштейн, И.Л. Орловская // Intonation. J. Immunorehabilitation - 2003. - Т. 6., №1. - С. 35.

6. Влияние ДНК из молок лососевых рыб на среднюю продолжительность жизни и выживаемость мышей с острой лучевой болезнью в эксперименте / Л.Н. Федянина, В.В. Потапова, JI.A. Иванушко, JI.M. Эпштейн // Человек и лекарство: X Российский национальный конгресс, Москва, 7-11 апреля 2003: Тез. докл. - М„ 2003. - С. 762.

7. Влияние ДНК из молок лососевых рыб на уровень оксида азота в сыворотке крови больных раком молочной железы / Л.Н. Федянина, В.В. Потапова, В.Н. Ржанникова, В.П. Маслов // Объединенный иммунологический форум Екатеринбург, 31 мая-4 июня 2004: Тез. докл. - Екатеринбург, 2004 - С. 293.

8. Влияние низкомолекулярной ДНК из молок лососевых рыб на кроветворение в эксперименте / Л.Н. Федянина, В.В. Потапова, Л.А. Иванушко, H.H. Беседнова, Л.М. Эпштейн, И.А. Орловская, Б.Г. Блинов //Антибиотики и химиотерапия. - 2004. - Т. 49, №4. - С. 7-10.

9. Влияние ферментативного гидролизата из гонад гребешка на некоторые показатели гуморального иммунного ответа / В.В. Потапова, Л.А. Иванушко, Л.М. Эпштейн, В.Н. Ржанникова, В.П. Маслов // Человек и лекарство: XI Российский национальный конгресс, Москва, 19-23 апреля 2004: Тез. докл. -М., 2004. - С. 824.

г 10. Влияние ферментативных гидролизатов из морских гидробионтов на

индукцию интерферона в культуре клеток / Л.Н. Федянина, В.В. Потапова, Т.Г. Орлова, Л.М. Эпштейн // Материалы международ, научн.-практич. конф. «Здоровье и образование», Пермь, 19-25 мая 2003. - Пермь, 2003. - С. 284. 11. Иммунокорригирующее действие ДНК из молок лососевых рыб в условиях модели острой лучевой болезни / Л.Н. Федянина, В.В. Потапова, Л.Л. Иванушко, Л.М. Эпштейн // Человек и лекарство: X Российский национальный конгресс, Москва, 7-11 апреля 2003: Тез. докл. - М., 2003. - С. 762.

12. Иммуномодулирующее действие ДНК из молок лососевых рыб / Л.Н. Фсдянина, Т.К. Каленик, В.В. Потапова, H.H. Беседнова, Л.М. Эпштейн, И.А. Орловская // Материалы международ, науч.-практич. конф. «Здоровье и образование: Медико-социальные и экономические проблемы», Пермь, 2-9 мая 2004. - Пермь, 2004. - С. 277-279.

13. Иммунотропные функции низкомолекулярной дезоксирибонуклеиновой кислоты из молок лососевых рыб / Л.Н. Федянина, В.В. Потапова, А.К. Гажа, Л.М. Эпштейн // Регион, научн. конф. «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии», Владивосток, 16-18 ноября 2004:Тез. докл. - Владивосток, ДВО РАН, 2004. - С. 67.

14. Оценка профилактического и лечебного действия БАД из морских гидробионтов при экспериментальной острой лучевой болезни / Л.Н. Федянина, В.В. Потапова, Л.М. Эпштейн, Ю.П. Недобыльская, Ю.В. Майстровская // Internation. J. Immunorehabilitation. - 2003. - Т. 5, №1. - С. 43-44.

15. Патент 2230559 Российская Федерация, МПК7 А 61 К 31/70, А 61 Р 7/06 7/00 Способ стимулирования колониеобразования кроветворных клеток-предшественников в селезенке при облучении животных (ДНК из молок лососевых рыб) / Л.Н. Федянина, В.В. Потапова, Л.М. Эпштейн, H.H. Беседнова, Т.Н. Пивненко, Л.А. Иванушко, Т.К. Каленик; заявитель и патентообладатель Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. - №2003100581/14 (00035); Заявл. 08.01.2003; Опубл, 20.06.2004, Бюл. №17. -10 с.

16. Патент 2236456 Российская Федерация, МПК7 С 12 N 5/06, А 61 К 35/36 Способ стимулирования колониеобразования кроветворных клеток-предшественников в селезенке при облучении животных (гидролизат из гонад гребешка) / В.В. Потапова, Л.Н. Федянина, Л.М. Эпштейн, H.H. Беседнова, Т.Н. Пивненко, Л.А. Иванушко, Ю.М. Позднякова; заявитель и патентообладатель Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. - №2003101953/13 (002079); Заявл. 24.01.2003; Опубл. 20.09.2004, Бюл. №26.-12 с.

17. Первичный скрининг гидролизатов гидробионтов с радиопротективным действием / JI.H. Федянина, JI.A. Иванушко, В.В. Потапова, В.П. Маслов // Internation. J. Immunorehabilitation. - 2002. - Т. 4, №2. - С. 337.

18. Потапова, В.В. Биологически активные добавки из морских гидробионтов Тихого океана - средства массовой профилактики последствий облучения человека / В.В. Потапова // Здоровье. Медицинская экология. Наука.- 2002. -№4-5 (8-9).-С. 54.

19. Потапова, В.В. Иммунокорригирующее и радиозащитное действие гидролизатов из морских гидробионтов в условиях воздействия ионизирующей радиации / В.В. Потапова // IV Тихоокеан. научн.-практич. конф. студентов и молодых ученых с международ, участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины», Владивосток, 24 апреля 2003: Тез. докл. - Владивосток, 2003. - С. 38.

20. Радиозащитное действие ДНК из молок лососевых рыб / В.П. Маслов, В.Н. Ржанникова, JI.H. Федянина, В.В. Потапова // Шестая Дальневост. онколог, конф. «Вопросы диагностики и лечения злокачественных опухолей», Владивосток, 23-24 сентября 2004: Тез. докл. - Владивосток: Изд-во Дальневост. ун-та, 2004. - С. 98-100.

21. Radioprotective Action Deoxyribonucleic Acid (DNA) From Salmon Milts / L.N. Fedjanina, V.V. Potapova, V.P. Maslov, L.M. Epshtein // International Symposium on Marine Drags, Qingdao, China 18-22 October, 2004. - Qingdao, 2004

f -P. 119-120.

Список сокращений

АОК - антитслообразующие клетки

БАВ - биологически активное вещество

БАД - биологически активная добавка

БОЕ-Э - бурстообразующие единицы

ГТГ - гидролизат из гонад гребешка

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа

ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

ИЛ - интерлейкин

ИНФ - интерферон

ИС - индекс стимуляции

ККМ - клетки костного мозга

КОЕ-ГМ - гранулоцитарно-макрофагальные колониеобразующие единицы КОЕ-ГЭММ - гранулоцитарно-макрофагально-эритроидно-мегакариоцитарно-Т-клеточные колонии

КОЕс - колониеобразующая единица селезенки Кон А — конканавалин А

нДНК - низкомолекулярная дезоксирибонуклеиновая кислота

ОЛБ - острая лучевая болезнь

СКК - стволовые кроветворные клетки

РБТЛ - реакция бласттрансформации лимфоцитов

СПЖ - средняя продолжительность жизни

Тх - Т-хелперы

ЭБ - эритроциты барана

ЯСК - ядросодсржащие клетки

ПОТАПОВА ВЕРА ВЛАДИМИРОВНА

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ И РАДИОЗАЩИТНЫЕ СВОЙСТВА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ МОРСКИХ ГИДРОБИОНТОВ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 14.05 2005 Формат 60 х 84/16

Уч. изд. л. 1,0 Уел печ л. 1,5 Тираж 100 экз. Заказ № 532

Отпечатано в типографии ИПК МГУ им адм. Г И Невельского 690059 г Владивосток, ул Верхнепортовая, 50а

»13619

РНБ Русский фонд

2006-4 9743

г

Актуальность исследования.

С иммунобиологических позиций состояние здоровья современного человека и человечества в целом характеризуется двумя особенностями: снижением иммунной реактивности населения и, как следствие, повышением уровня острых и хронических заболеваний [103, 124]. Этим обусловлен растущий интерес врачей практически всех специальностей к проблеме иммунотерапии. Препараты, оказывающие действие на иммунитет, начинают широко применяться в клинической практике при самых разнообразных заболеваниях. Коррекция вторичных имму но дефицитов является в настоящее время актуальным, интенсивно развивающимся направлением терапии [61].

С точки зрения современной иммунологии острая лучевая болезнь (ОЛБ) также представляет собой вторичный иммунодефицит [14, 35, 104]. Исходя из роли системы иммунитета в механизме развития лучевого поражения организма, разработаны принципы профилактики и лечения ОЛБ с помощью иммунотропных лекарственных средств [35].

Среди иммуномодуляторов противолучевым действием в широком диапазоне доз облучения обладают нуклеиновые кислоты и, в том числе, препараты, содержащие дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) [24]. Исследования их радиозащитных свойств проводились, начиная еще с 60-х годов прошлого столетия, когда было обнаружено, что профилактическое и лечебное введение препаратов преимущественно высокополимерной гомо- и гетерологичной ДНК способствует повышению радиорезистентности облученных животных [7, 118]. Изучение действия ДНК на иммунную систему началось сравнительно недавно, что связанно с существовавшим ранее мнением об иммунологической инертности нуклеиновых кислот [106,

109, 249]. Известны также лейкостимулирующий, противоопухолевый, ранозаживляющий, противовирусный эффекты ДНК [84].

В настоящее время перспективным считается использование природных соединений в качестве сырья для создания лекарственных препаратов [72] и биологически активных добавок (БАД) к пище [117]. Поэтому все большее развитие получают исследования свойств биологически активных субстанций, выделенных из различных трав, семян, морских беспозвоночных, рыб, водорослей, грибов, наземных животных, микроорганизмов и т.д. [39, 88, 157, 172, 194, 226, 240].

По многочисленным литературным данным, морские гидробионты содержат уникальные биологически активные вещества (БАВ) разнонаправленного действия [10, 27, 64, 73, 82, 88, 92, 111]. Как природные источники, они характеризуются широкой и успешно воспроизводимой сырьевой базой, своим разнообразием и высокой эффективностью содержащихся в них БАВ, которые зачастую лишены отрицательных свойств, присущих веществам, полученным из традиционных источников [4].

В течение многих лет сотрудниками лаборатории иммунологии НИИЭМ СО РАМН совместно с Тихоокеанским институтом биоорганической химии ДВО РАН и Тихоокеанским научным рыбохозяйственным центром (ТИНРО-центр) проводится поиск соединений, обладающих иммуномодулирующей, радиозащитной, противоопухолевой, детоксицирующей активностью. Некоторые из этих веществ явились основой для создания БАД (тинростим, зостерин).

Известно, что при внедрении БАД не проходят ту жесткую всестороннюю экспертизу, которой подвергаются лекарственные препараты. В то же время, именно они чаще всего бесконтрольно и широко применяются населением. В связи с этим одним из направлений деятельности лаборатории иммунологии НИИЭМ СО РАМН становится изучение механизмов действия

Б АД широко применяемых как на Дальнем Востоке, так и в других регионах России.

В настоящей работе были исследованы радиозащитные и иммуномодулирующие свойства БАВ из молок морских гидробионтов, содержащих низкомолекулярную ДНК - ДНК из молок лосося (нДНК) и гидролизата из гонад гребешка (ГГГ).

БАВ нДНК является основным действующим веществом БАД к пище ДНКаС и ДНКаВИТ, разрешенных к использованию [97, 98, 116] и широко применяемых населением. Однако свойства нДНК изучены недостаточно полно, что и послужило причиной включения ее в это исследование.

ГГГ, полученный в лаборатории прикладной биохимии ТИНРО-центра методом ферментативного гидролиза, - новое, ранее неизученное вещество, биологическая активность которого была установлена при проведении скриннингового исследования различных БАВ морского происхождения. Преимуществом ферментативного гидролиза, в сравнении с другими видами - кислотным, щелочным, - является его простота, непродолжительность (около 5 часов), экономичность (используемый в реакции фермент пилорин получают из отходов лососевых рыб).

Таким образом, актуальность настоящей работы определяется тем, что в ней исследованы свойства нового БАВ, полученного из гонад гребешка, проработана экспериментальная база для возможного создания на его основе биологически активной добавки к пище, обоснована целесообразность использования ДНК-содержащих БАД в комплексе лечения вторичных иммунодефицитов, в том числе, радиационного генеза и дальнейшего изучения свойств нДНК и ГГГ с целью возможного создания на их основе в будущем лекарственных препаратов.

Цель работы:

Целью настоящей работы явилось изучение радиозащитных и иммуномодулирующих свойств ДНК из молок лососевых рыб и гидролизата из гонад гребешка для обоснования перспективности их применения при вторичных иммунодефицитах, в том числе и радиационного генеза и возможного создания на их основе лекарственных препаратов.

Основные задачи исследования:

1. Изучить действие различных доз нДНК и ГГГ на иммунные реакции гуморального и клеточного типа.

2. Исследовать влияние нДНК и ГГГ на кроветворение в интактном и облученном организме.

3. Определить эффективность различных доз и схем введения нДНК и ГГГ при костно-мозговом синдроме острой лучевой болезни.

4. Оценить воздействие нДНК и ГГГ на продукцию цитокинов (ИЛ-3, ГМ-КСФ, ФНО-а, ИФН-у и ИЛ-10) клетками крови здоровых доноров.

Научная новизна и теоретическая ценность работы:

Новизна работы заключается в том, что впервые на обширном экспериментальном материале показана иммуномодулирующая активность нДНК и ГТГ. Установлено, что БАВ оказывают выраженное влияние на гуморальный и клеточный иммунитет - обеспечивают увеличение числа антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей, изменяют интенсивность реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), индуцированную у мышей введением эритроцитов барана (ЭБ). В реакции бласттрансформации (РБТЛ) выявлено, что под действием БАВ происходив стимуляция спонтанной и митогениндуцированной пролиферации Т-лимфоцитов.

Впервые исследованы радиозащитные свойства нДНК и ГГГ. Доказана их способность при введении после воздействия ионизирующей радиации в дозах, вызывающих развитие костно-мозгового синдрома^ стимулировать репаративные процессы в кроветворной системе. Выявлено, что нДНК и ГГГ при: лечебной схеме введения обладают свойством увеличивать выживаемость и среднюю продолжительность жизни f (СПЖ) облученных животных.

Впервые установлено модулирующее действие нДНК и ГГГ на продукцию цитокинов (ИЛ-3, ГМ-КСФ, ФНО-а, ИФН-у и ИЛ-10) клетками крови здоровых доноров.

На основании полученных данных^ сделано: предположение, что стимулирующее действие ДНК-содержащих БАВ на систему кроветворения в облученном организме реализуется через иммунную систему.

Новизна результатов, подтверждена получением патентов на изобретения (2).

В результате проведенных исследований раскрыты некоторые механизмы- иммунотропного, и радиозащитного действия. ГГГ и нДНК Последняя: является основным действующим веществом таких широко применяемых населением биологически активных добавок к пище как ДНКаС и ДНКаВИТ, однако, механизмы действия нДНК до. сих пор, были мало изучены.

Практическая значимость.

На основании: результатов экспериментов разработаны дополнения к инструкции по: применению БАД, созданных на основе ДНК из молок лососевых рыб. ДНКаС и ДНКаВИТ рекомендуется применять в следующих случаях:

• При радиационных: иммунодефицитах (при облучении в дозах не превышающих костно-мозговой диапазон); в группах радиационного риска (персонал ремонтных подразделений атомных электростанций, рабочие урановых рудников и предприятий по переработке урановых руд, врачи рентгенологи, радиологи и т.д.), в том числе, у онкологических больных, получающих радиотерапию; • При вторичных иммунодефицитах, протекающих без клинических проявлений и регистрируемых только по изменениям в иммунологических тестах. Лица с такими нарушениями иммунной системы относятся по классификации P.M. Хаитова и др. [124] к группе, которой не показано назначение иммуномодулирующей терапии с использованием лекарственных препаратов.

Внедрение результатов исследования в медицинскую науку и практику.

1. Получены 2 патента на изобретение - №2230559 «Способ стимулирования колониеобразования кроветворных клеток-предшественников в селезенке при облучении животных» (ДНК из молок лососевых рыб) и №2236456 «Способ стимулирования колониеобразования кроветворных клеток-предшественников в селезенке при облучении животных» (гидролизат из гонад гребешка).

2. Советом экономической безопасности на основании инвентаризации принадлежащего нам патента №2230559 «Способ стимулирования колониеобразования кроветворных клеток-предшественников d селезенке при облучении животных» установлена фактическая возможность его использования для внедрения или инвестирования (письмо №Д-25 от 28.12.2004).

3. В ООО «Биополимеры» (г. Партизанск) направлено письмо, в котором рекомендовано расширить область применения БАД на основе низкомолекулярной ДНК из молок лососевых рыб (ДНКаС и ДНКаВИТ).

4. В ТИНРО-центр направлено письмо, в котором рекомендовано продолжить исследование свойств гидролизата из гонад гребешка для возможного создания на его основе биологически активной добавки к пище.

Апробация результатов диссертационной работы:

Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (Владивосток, 2005).

Материалы диссертации представлены на IV Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием (Владивосток, 2003 г.), Международной научно-практической конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет» (Санкт-Петербург, 2002 г.), IV всемирном конгрессе по астме, IX международном конгрессе по клинической патологии, X и XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Пермь, 2003 и 2004 г.), Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование» (Пермь, 2003 и 2004 г.), Объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004 г.), Региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» (Владивосток, 2004 г.), VI Дальневосточной онкологической конференции «Вопросы диагностики и лечения злокачественных опухолей» (Владивосток, 2004 г.), научной сессии Дальневосточного отделения РАН и Сибирского отделения РАМН (Владивосток, 2004 г.).

По материалам диссертации опубликована 21 работа - 4 статьи и 15 тезисов, получены 2 патента на изобретение.

Объем и структура диссертации. Ма териал диссертации изложен на 158 страницах машинописного текста, проиллюстрирован 11 таблицами и 19 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения, общих выводов, рекомендаций практическому здравоохранению, указателя литературы (138 отечественных и 125 иностранных источников).

127 ВЫВОДЫ:

1. Применение низкомолекулярной ДНК из молок лососевых рыб и гидролизата из гонад гребешка вызывает усиление образования эндогенных и экзогенных селезеночных колоний, что проявляется как при профилактической так и при лечебной схеме введения БАВ, однако, при использовании последней это действие более выражено. Наиболее значимый эффект получен при дозе 10 мг/кг.

2. Введение низкомолекулярной ДНК из молок лососевых рыб и гидролизата из гонад гребешка мышам через час после облучения способствует более полному и раннему восстановлению числа лейкоцитов, а также массы и клеточности лимфоидных органов - тимуса и селезенки и клеточности костного мозга.

3. Низкомолекулярная ДНК из молок лососевых рыб и гидролизат из гонад гребешка повышают уровень выживаемости и увеличивают среднюю продолжительность жизни облученных мышей. Это действие является более выраженным при лечебной схеме применения БАВ в дозе 10 мг/кг. Полученный эффект практически равнозначен как при подкожном, так и при пероральном введении нДНК и ГГГ.

4. Низкомолекулярная ДНК из молок лососевых рыб и гидролизат из гонад гребешка оказывают иммуностимулирующее дозозависимое действие на гуморальное звено иммунного ответа. Наиболее значительное повышение количества АОК по сравнению с контролем наблюдалось при введении БАВ в индуктивную фазу антителообразования, при дозах 10 и 100 мг/кг. Низкомолекулярная ДНК из молок лососевых рыб и гидролизат из гонад гребешка вызывали незначительное повышение титра сывороточных антител, дозозависимого эффекта при этом практически не отмечалось.

5. Низкомолекулярная ДНК из молок лососевых рыб и гидролизат из гонад гребешка оказывают выраженное дозозависимое влияние на клеточный иммунитет, стимулируя развитие реакции ГЗТ. При этом наибольшая эффективность наблюдалась при введении БАВ в дозе 10 мг/кг - нДНК только в индуктивную, а ГТТ в индуктивную и в эффекторную фазы иммунного ответа. С помощью РБТЛ установлено, что БАВ способствуют активации процесса пролиферации лимфоцитов.

6. Низкомолекулярная ДНК из молок лососевых рыб и гидролизат из гонад гребешка оказывают модулирующее действие на секрецию ИЛ-3, ГМ-КСФ, ФНО-а, ИФН-у и ИЛ-10 клетками крови здоровых доноров, повышая исходно низкую их концентрацию, снижая исходно высокую и не оказывая существенного влияния при среднем уровне их секреции. Исследуемые БАВ оказывают более выраженное стимулирующее действие на продукцию провоспалительных (ФНО-а), нежели противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10).

7. Введение низкомолекулярной ДНК из молок лососевых рыб обуславливает повышение уровня цитокинов, вырабатываемых преимущественно Txl-клетками (ИФН-у), т.е. может способствовать развитию клеточного иммунного ответа. Напротив, гидролизат из гонад гребешка оказывает равнозначное действие на выработку цитокинов Txl и Тх2.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ВНЕДРЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В МЕДИЦИНСКУЮ НАУКУ И ПРАКТИКУ.

1. Разработаны дополнения к инструкциям по применению Б АД, созданных на основе низкомолекулярной ДНК из молок лососевых рыб.

ДНКаС и ДНКаВИТ рекомендуется применять в следующих случаях:

• При радиационных иммунодефицитах (при облучении в дозах не превышающих костно-мозговой диапазон); в группах радиационного риска (персонал ремонтных подразделений атомных электростанций, рабочие урановых рудников и предприятий по переработке урановых руд, врачи рентгенологи, радиологи и т.д.), в том числе, у онкологических больных, получающих радиотерапию;

• При вторичных иммунодефицитах, протекающих без клинических проявлений и регистрируемых только по изменениям в иммунологических тестах. Лица с такими нарушениями иммунной системы относятся по классификации Р.М Хаитова и др. [124] к группе, которой не показано назначение иммуномодулирующей терапии с использованием лекарственных препаратов.

• Для профилактики различных заболеваний, и, в частности, в периоды сезонного повышения заболеваемости ОРВИ, в целях укрепления общей резистентности организма и повышения его сопротивляемости к инфекции;

• На этапах выздоровления, для устранения астенического синдрома и повышения адаптационных механизмов организма.

130

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Конец XX - начало XXI столетия характеризуется значительным ростом заболеваний, обусловленных нарушениями в системе иммунитета [61, 103]. Развивающийся на фоне дисфункции иммунной системы вторичный иммунодефицит (ВИД) не только осложняет клиническое течение, но и прогноз в клинике внутренних болезней [103].

Формированию ВИД могут способствовать многочисленные факторы инфекционной и неинфекционной природы, загрязнение окружающей человека внешней среды, острые и хронические стрессы, нарушение питания, длительное применение медикаментов, обладающих иммунодепрессивными и иммуносупрессивными свойствами, физические и психоэмоциональные травмы и многое другое [52, 122, 125].

Нарушение нормального функционирования иммунной системы определяет более тяжелое, затяжное течение любых болезней, способствует генерализации воспалительных процессов, развитию осложнений, снижению и/или отсутствию клинического эффекта на проведение базисной терапии.

С этим связан необычайно большой интерес врачей практически всех специальностей к проблеме иммунотерапии. Препараты, оказывающие действие на иммунитет, начинают широко применяться в клинической практике при самых разнообразных заболеваниях [61, 103].

Согласно В.М. Манько и др. [72], большинство современных иммуномодуляторов оказывают выраженное побочное действие, вследствие чего, немногие из них используются в широкой клинической практике. Это требует разработки новых средств для регуляции нарушенных функций иммунной системы.

В последние годы все большее развитие получают исследования, направленные на выделение из различных трав, семян, морских водорослей, грибов, животных биологически активных субстанций, характеризующихся иммуномодулирующим действием [39, 88, 147, 172, 194, 226, 240], созданием на их основе фармакологических препаратов [72] и биологически активных добавок к пище [117].

По многочисленным литературным данным морские гидробионты содержат уникальные БАВ разнонаправленного действия [10, 27, 64, 73, 82, 88, 92, 111]. Это связанно с условиями их существования в водной среде, характеризующейся высоким содержанием соли, низким освещением или полным его отсутствием, высоким давлением и необычно высокими или низкими температурами. Подобные условия жизни обеспечивают отличие морских организмов и их метаболитов, от организмов с земной биологией [170, 204]. Как природные источники они характеризуются не только разнообразием и высокой эффективностью содержащихся в них БАВ, которые зачастую лишены отрицательных свойств, присущих веществам, полученным из традиционных источников, но и широкой и успешно воспроизводимой сырьевой базой [4]. Последнее обстоятельство может оказаться важным при необходимости получения каких-либо определенных химических веществ (белков, полисахаридов, нуклеиновых кислот и т.д.) в промышленном масштабе.

Известно, что нуклеиновые кислоты и, в частности ДНК, обладают иммуностимулирующими свойствами [123]. На сегодняшний день иммунотропное действие обнаружено у ДНК из молок осетровых рыб (деринат) и бактериальной ДНК.

В данной работе исследовались иммуномодулирующие и радиозащитные свойства ДНК-содержащих БАВ из морских гидробионтов -нДНК и ГГГ. В состав нДНК входит 79,0% ДНК, 7,8% белка, 2,1% липидов и 10,7% воды; ГГГ - 35,2% ДНК, 54,4% белка, 0,4% липидов и 10,0% воды [42, 10]. Различное содержание ДНК, преобладание в составе ГГГ белка могут обуславливать отличие в степени выраженности эффектов вызываемых исследуемыми веществами.

Необходимо отметить, что существует некоторое сходство между нДНК и деринатом: молекулярная масса составляющей их ДНК, высокий процент ее содержания [5, 42]. нДНК получают из молок лососевых рыб. Она является основным действующим веществом БАД к пище ДНКаС и ДНКаВИТ, разрешенных к использованию [97-98, 116] и широко применяемых населением. Однако механизм действия БАВ нДНК изучен недостаточно полно, что и послужило причиной включения ее в это исследование.

ГГГ, выделяют из гонад гребешка, он получен в лаборатории прикладной биохимии ТИНРО-центра и является новым, не изученным ранее веществом, биологическая активность которого была установлена при проведении скриннингового исследования различных БАВ морского происхождения.

В задачи данного исследования входило изучение влияние нДНК и ГГГ на реакции специфического иммунного ответа. Действие БАВ на гуморальное звено иммунитета оценивалось путем подсчета АОК в селезенке и определения титра гемагглютининов в сыворотке крови интактных мышей.

В результате проведенных экспериментов было установлено, что наиболее значительное повышение количества АОК по сравнению с контролем наблюдалось при введении БАВ в индуктивную фазу гуморального иммунного ответа в дозах 10 и 100 мг/кг. Индекс стимуляции при применении нДНК составил 2,6-2,5. ГГГ оказывал менее выраженное, по сравнению с нДНК, и также преимущественное воздействие на индуктивную (ИС=2,0-1,9) фазу образования АОК. Исследуемые БАВ вызывали незначительное повышение титра сывороточных антител, дозозависимого эффекта при этом практически не отмечалось.

Преимущественное влияние БАВ на индуктивную фазу иммунного ответа может быть обусловлено их влиянием на любой из процессов, протекающих в этот период - активацию (выход клеток из фазы покоя в Sфазу клеточного цикла) или пролиферацию лимфоцитов. Также, представляется возможным, что эффект нДНК и ГГГ опосредуется через действие на Тх2-клетки и выработку ими цитокинов, необходимых для развития этих процессов.

Изучение влияния БАВ на клеточное звено иммунитета проводилось с помощью РБТЛ и реакции ГЗТ. Известно, что активация (бласттрансформация) лимфоцитов является наиболее ранней реакцией лимфоидной ткани на поступление в организм антигена. Эта реакция представляет собой начальный этап иммунного ответа и имеет большое значение для его развития, так как изначально число клеток, составляющих клоны лимфоцитов, невелико [138].

С помощью РБТЛ было установлено, что нДНК и ГГГ обладают способностью стимулировать спонтанную и митогениндуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов. Этот эффект БАВ является дозозависимым -наиболее выраженное действие наблюдалось при их введении в дозе 10 и 100 мг/кг. нДНК практически одинаково увеличивала как спонтанную (ИС=1,8), так и митогениндуцированную пролиферативную (1,6-1,8) активность лимфоцитов. ГГГ в большей степени повышал уровень спонтанной (ИС=2,0-1,9) и в меньшей степени (ИС=1,5-1,6) митогениндуцированнои пролиферации лимфоидных клеток.

В основе реакции ГЗТ лежит иммунное воспаление, в развитии которого основную роль играют активированные макрофаги. Сенсибилизированные С04+-Т-клетки осуществляют вовлечение макрофагов в реакцию путем их активации. Известно, что реакция ГЗТ протекает в 2 фазы - индуктивную и эффекторную, которые развиваются в результате введения сенсибилизирующей и разрешающей доз антигена [138].

Наибольшая эффективность при введении БАВ наблюдалась при дозе 10 мг/кг. нДНК оказывала более выраженное действие на индуктивную фазу ГЗТ, при введении за 3-е суток (ИС=1,8) и за сутки (ИС=1,7) до сенсибилизирующей дозы тимусзависимого антигена (ЭБ). Применение ГГГ обеспечивало наибольший прирост массы лапки у мышей как при введении одновременно с сенсибилизирующей дозой ЭБ (ИС=1,8), так и перед введением разрешающей дозы ЭБ (ИС=1,6), то есть и в индуктивную и в эффекторную фазу.

Усиление реакции ГЗТ, наблюдаемое в 1-ю фазу клеточного иммунного ответа может быть обусловлено влиянием БАВ на процессы активации СБ4+-Т-клеток и дифференцировки их в Txl. В свою очередь, действие ГГГ на эффекторную фазу ГЗТ, может опосредоваться через стимуляцию Txl к выработке цитокинов и индуцирование процесса активации макрофагов.

Стимулирующее воздействие БАВ' на гуморальное и клеточное звено иммунитета коррелировало с их влиянием на массу и клеточность лимфоидных органов, вызывая повышение этих показателей у интактных мышей, что может быть обусловлено стимуляцией под действием' БАВ процессов пролиферации и дифференцировки В- и Т-лимфоцитов.

С точки зрения современной иммунологии острая лучевая болезнь (ОЛБ) также представляет собой вторичный иммунодефицит панцитопенического типа. Для н§го характерны: массовая гибель лимфоцитов (в большей степени В-клеток); повреждение СКК костного мозга и связанное с этим медленное восстановление клеточного пула; поражение гуморального звена иммунитета, развитие дисфункции тимуса и дисбаланс Тх1/Тх2, в результате чего первоначально развивается нарушение антибактериальной защиты, а в более поздние сроки противоопухолевой и противовирусной резистентности [14, 35, 104].

Исходя из роли системы иммунитета в механизме развития лучевого поражения организма, разработаны принципы профилактики и лечения ОЛБ с помощью иммунотропных лекарственных средств [35]. Еще в 60-х годах прошлого столетия было обнаружено, что нуклеиновые кислоты, в том числе

ДНК, обладают противолучевым действием и эффективны в широком диапазоне доз облучения [7, 24, 118]. Было проведено множество экспериментов, посвященных изучению радиозащитных свойств ДНК, которые связывали только с ее непосредственным влиянием на стволовые клетки костного мозга и гемопоэз, возможность иммуноопосредованного действия не рассматривалась. Первоначально в экспериментах в основном о о применялась высокополимерная (1,2x10 -2x10 кДа) ДНК и именно с молекулярной массой исследователи связывали ее радиозащитный эффект. Однако, как было показано Н.И. Рябченко и др. [112] и Е.Е. Чеботаревым и др. [127], низкомолекулярная (2х105-5х105 кДа) ДНК также обладает терапевтической эффективностью.

Согласно Ю.И. Касьяненко и др. [93], высокомолекулярная ДНК -дорогое вещество, технология ее выделения многостадийна, трудоемка и требует дорогостоящего оборудования и реактивов. В связи с этим у нас я стране и за рубежом она производится в незначительном количестве, как правило, для химико-аналитических целей. В свою очередь, из-за упрощенного технологического процесса выделения, разработанного ученными ТИНРО-центра, низкомолекулярная ДНК является значительно более дешевой и доступной. Кроме того, существует мнение, что для наилучшего проникновения ДНК в клетку ее масса не должна превышать 500 кДа (цитируется по 42).

Радиозащитные свойства нДНК и ГГГ оценивались по их действию на массу и клеточность лимфоидных органов, СКК (метод эндо- и экзоколониеобразования), выживаемость и среднюю продолжительность жизни у животных, облученных в костно-мозговом диапазоне доз.

По степени угрозы для жизнедеятельности всего организма радиационные повреждения отдельных его тканей и систем не равнозначны. Костный мозг и органы иммунной системы, в первую очередь тимус, являются критическими органами при тотальном облучении организма в костно-мозговом диапазоне доз (1-10 Гр) [14].

Изучение влияния нДНК и ГГГ на кроветворение, массу лимфоидных органов и клеточность костного мозга, тимуса, селезенки и на 1, 3, 9, 14 и 23 сутки после облучения (6,5 Гр) показало, что введение исследуемых БАР способствует более раннему и полному восстановлению этих показателей у животных опытных групп, получавших БАВ.

Усиление регенераторных процессов на тканевом уровне является результатом репаративных процессов на клеточном и субклеточном уровне, непосредственно связанных с генетическим аппаратом клетки, а именно с ДНК.

Эволюционно у живых организмов сформировалась устойчивость к действию повреждающих факторов внешней среды. Одним из ведущих механизмов резистентности к модифицирующему влиянию повреждающих агентов на уровне биологического вида является репарация ДНК. Она обеспечивает защиту генома от генотоксического и мутагенного действия факторов химической и биологической природы [42]. При повреждении структуры ДНК и/или процессов ее репарации развиваются патологические процессы, влияющие на нормальное функционирование органов и систем организма. Так, по мнению Е.Ю. Москалевой и др. [89], причиной развития вторичных иммунодефицитов являются структурные нарушения ДНК лимфоцитов, возникающие под действием различных повреждающих факторов. К таким факторам относится и радиация.

Особенность биологического действия ионизирующей радиации состоит в том, что оно реализуется через образование радиационноиндуцируемых радикалов кислорода и воды, главными мишенями которых являются ДНК, хромосомы, мембраны [14, 69]. Наиболее радиопоражаемыми являются клетки, находящиеся в фазе митотического цикла.

Радиационные дефекты ДНК инициируются многочисленными радиационно-химическими реакциями по механизму прямого и косвенного действия излучения, а также токсическим действием высокореакционных продуктов хиноидной природы [14, 60]. Такие повреждения ДНК проявляются в виде изменений азотистых оснований, одно- и двунитевых разрывов ДНК, щелочнолабильных сайтов, сшивок ДНК-белок и меж- и внутримолекулярных сшивок [14].

Репаративный синтез ДНК - одно из фундаментальных явлений в поддержании клеточных популяций. Клетки в S-фазе клеточного цикла, особенно в ее начале, наиболее чувствительны к действию ионизирующей радиации по показателю задержки деления [190, 246]. Другое последствие радиационного нарушения репликации ДНК - так называемый неполный ее биосинтез [190] непосредственно связан с остановкой деления клеток в фазе g2 и их гибелью [184].

Тяжесть и исход лучевой болезни при костно-мозговом синдроме ОЛБ напрямую зависят от степени и характера поражения стволовых элементов клеточных популяций. Эквивалентом СКК условно, так как тождественность их не установлена, считают колониеобразующие единицы в селезенке (КОЕс) облученных мышей [85].

В данной работе для изучения влияния БАВ на КОЕс использовались методы эндо- и экзоколониеобразования [250-252]. Было установлено, что нДНК и ГГГ значительно стимулируют образование колоний в селезенках облученных мышей, что наблюдалось как при профилактической, так и при лечебной схеме введения, однако при использовании последней это действие было более выраженным. Оно имело дозозависимый характер и в большей степени проявлялось при введении нДНК (ИС=2,2) и ГГГ (ИС=2,1) в дозе 10 мг/кг. Также было установлено, что БАВ обладают способностью выводить СКК из фазы покоя в S-фазу клеточного цикла с последующей клеточной репликацией. При исследовании влияния биополимеров на способность ККМ формировать КОЕ-ГМ, БОЕ-Э и КОЕ-ГЭММ-колонии было установлено, что под действием нДНК наблюдается стимуляция (ИС=8,7) преимущественно эритроидных клеток-предшественников. Под действием в 2,9 раза ГГГ повышалось количество КОЕ-ГЭММ.

Таким образом, введение исследуемых БАВ вызывает активацию СКК, обеспечивающую усиление процессов пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток-предшественников. Согласно данным литературы такое действие можно объяснить возможным усвоением экзогенной ДНК тканями и клетками облученного организма и использованием ее в процессе пострадиационного восстановления [46, 74, 105] в качестве предшественников для синтеза собственной ДНК клеток [46]. Тем самым ДНК-содержащие БАВ оказывают стимулирующее действие на репродуктивную функцию клеток, сокращая период митотического блока, и способствуют более ранней и быстрой регенерации повреждений тканевых структур. Не исключено, что одним из механизмов радиозащитного действия исследуемых БАВ является связывание радиотоксинов хиноидной природы и предотвращение тем самым их повреждающего действия на геном клеток критических органов [78].

Выживание животного при воздействии на него ионизирующей радиации в костно-мозговом диапазоне доз создает четкую модель радиорезистентного состояния организма [69]. Поэтому, заключение о радиозащитном действии БАВ можно сделать на основании его влияния на выживаемость и среднюю продолжительность жизни животных [40].

При введении различных доз БАВ до и после облучения, наибольшая эффективность наблюдалась при лечебной схеме применения и дозе 10 мг/кг. Установлено, что ГГГ и нДНК при подкожном введении повышали выживаемость облученных животных на 25-30%, при введении per os на 2025% соответственно. Продолжительность жизни облученных мышей при лечебном применении, вне зависимости от способа введения парентерального или перорального, увеличивалась в среднем в 2 раза.

По-видимому, повышение этих показателей под действием БАВ является следствием стимуляции ими репаративных процессов на клеточном и субклеточном уровнях, регенеративных на тканевом уровне, в результате чего в более ранние сроки происходит восстановление массы и клеточности тимуса, селезенки, костного мозга, количества лейкоцитов крови и нормализуются нарушенные функции иммунной и кроветворной систем. То есть, влияние нДНК и ГГГ на основной интегральный показатель радиорезистентности - выживаемость животных в костно-мозговом диапазоне доз - является результатом суммирования различных путей реализации этого механизма.

Известно, что рост и развитие наименее дифференцированных клеток-предшественниц, из которых происходит восстановление кроветворения при облучении в дозах, вызывающих костно-мозговую форму ОЛБ [102], контролируется гемопоэзиндуцирующим микроокружением [29, 131, 188, 259]. Согласно современным представлениям, в формировании ГИМ принимают участие различные клеточные элементы и продукты их жизнедеятельности, входящие в состав как стромы, так и паренхимы кроветворных органов. Контроль над процессами кроветворения элементы ГИМ осуществляют посредством прямых контактов с гемопоэтическими клетками и через продукцию цитокинов [30, 241].

К ранним гемопоэтическим ростовым факторам относят ИЛ-3, ГМ-КСФ, ФНО-а [101]. ИЛ-3 является ростовым и дифференцировочным фактором, регулирующим гемопоэз на уровне стволовых и наиболее ранних предшественников кроветворных клеток. Он представляет собой преимущественно экстренный регулятор кроветворения, проявляющий свое действие при стрессе [44, 138, 198, 202]. ГМ-КСФ поддерживает пролиферацию несколько более дифференцированных, хотя также юных клеток [101, 191, 224]. Точками приложения ГМ-КСФ, как и ИЛ-3, являются мультипотентный предшественник КОЕ-ГЭММ, а также БОЕ-Э [ 142, 191, 224, 248]; ФНО-а на фоне подавленного кроветворения индуцирует выход СКК из фазы Go в S-фазу клеточного цикла [101, 154, 228, 233].

Для интерпретации результатов; всех доноров условно делили на 3 группы (ориентируясь на, исходный уровень продукции цитокинов): с исходногнизкими, со средними и с исходно высокими показателями.

Полученные результаты показали, что нДНК и ГГГ оказывают модулирующее действие на? выработку всех исследованных цитокинов клетками крови здоровых доноров, повышая исходно низкое их содержание, снижая1 исходно высокую и не оказывая существенного влияния при среднем уровне: их концентрации. В группах с исходно низкими показателями БАВ проявляют стимулирующее, но не равнозначное по интенсивности действие на продукцию цитокинов. нДНК и ГГГ вызывают выраженную секрецию ГМ-КСФ (ИС=5,8-9,7) и в меньшей степени; влияют на продукцию клетками крови доноров ИЛ-3 (ИС=4,4-3,2) и ФНО-а (ИС=2,5-3,3). Под действием нДНК наблюдается; более значительное, по сравнению с ШЫО (ИС=Т,9), повышение уровня ИФН-у (ИС=3,3). Добавление к культуре клеток ГГГ способствует практически равной стимуляции продукции как ИЛ-10, так и ИФН-у (ИС=2,6-2,7).

Эти результаты свидетельствуют о том, что БАВ оказывают более выраженное стимулирующее действие - на продукцию провоспалительных (ФНО-а), нежели противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10). Введение нДНК обуславливает повышение уровня цитокинов, вырабатываемых преимущественно Txl-клетками (ИФН-у), т.е. может способствовать развитию клеточного иммунного ответа. Напротив, ГГГ оказывает равнозначное действие на выработку цитокинов Txl и Тх2. Аналогично мнению К.Ф. Ким с соав. [17] подобный эффект можно объяснить действием ГГГ не на дифференцировку, а лишь на синтез соответствующих цитокинов.

Сопоставление иммуностимулирующего' действия БАВ: и бактериальной ДНК, позволяет: определить некоторое сходство. Однако, по данным литературы, иммуностимулирующее действие бактериальной ДНК обусловлено наличием ^ в ее структуре неметилированных CpG-динуклеотидов в- составе определенных последовательностей [205, 234]; Подобные GpG-динуклеотиды не обнаружены в ДНК позвоночных, в которой; напротив, присутствуют иммуно-нейтрализующие/иммуносупрессивные мотивы [109]. Исходя; из' этого, можно сделать предположение, что либо иммуностимулирующий эффект бактериальной ДНК обусловлен не только GpG-динуклеотидами, либо в молекуле ДНК позвоночных существуют свои собственные структуры, ответственные за ее активирующее влияние на иммунную систему. Это делает перспективным' дальнейшее изучение нДНК и 111, их структуры и механизма действия.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что нДНК и ГГГ обладают иммуномодулирующими и радиозащитными свойствами.

Механизм иммуномодулирующего действия обусловлен влиянием исследуемых БАВ на развитие процессов гуморального и клеточного иммунного ответа и продукцию внутри- и межсистемных регуляторных факторов - цитокинов.

Противолучевое действие нДНК и ГГГ реализуется через непосредственное участие в репаративных процессах поврежденных радиацией клеток, и, в первую очередь, гемопоэтических стволовых клеток костного мозга. Тем самым, БАВ укорачивают период митотического блока и способствуют более раннему выходу СКК из фазы Go в S-фазу клеточного цикла и стимулируют их дальнейшую пролиферацию и дифференцировку: Результатом является: более быстрая регенерация тканей критических органов - костного мозга и лимфоидных органов и восстановление нормального функционирования гемопоэтической и иммунной систем. Подобный вывод согласуется с данными литературы [7, 118]. Однако, по нашему мнению, механизм радиозащитного действия БАВ помимо непосредственного влияния на пораженные радиацией клетки, может опосредоваться и через иммунную систему - В- и Т-лимфоциты, которые участвуют в регуляции гемопоэза [87]. Важную роль в восстановлении кроветворения облученного организма играют гуморальные факторы, выделяемые тимусом, вероятность участия которых при применении БАВ подтверждает тот факт, [18, 126], что у облученных животных опытных групп наблюдается более значительное, по сравнению с контролем, увеличение массы и клеточности тимуса. Кроме того, радиозащитное действие БАВ может реализовываться и через активацию гемопоэзиндуцирующего микроокружения, и в частности, через стимуляцию продукции ранних гемопоэтических ростовых факторов (ИЛ-3, ГМ-КСФ и ФНО-а). Все это свидетельствует о сложности и многогранности механизма противолучевого действия исследуемых БАВ.

Полученные результаты изучения свойств нДНК позволяют частично раскрыть механизм иммуностимулирующего действия БАД, созданных на ее основе, и расширить область их применения.

Согласно P.M. Хаитову и др. [124], установление иммунодефицита еще не является основанием для назначения иммуномодуляторов. Для обоснованного проведения иммунотерапии необходимо провести клинико-иммунологическое исследование. По его результатам авторы выделяют 3 группы людей: в первую входят лица, имеющие клинические признаки нарушения иммунитета и изменения иммунологических показателей; во вторую - лица с клиническими признаками нарушений иммунной системы при отсутствии изменений иммунологических показателей; в третью - лица, имеющие только изменения иммунологических показателей без клинических признаков недостаточности иммунной системы. И, если назначение иммуномодулирующей терапии однозначно показано в первых 2-х группах, то третьей рекомендован только иммунологический мониторинг. Представляется возможным, что применение ДНК-содержащих БАД у этой группы лиц, особенно при нарушении клеточного звена иммунитета, будет способствовать восстановлению нарушенных иммунологических показателей и предотвратит дальнейшее развитие иммунодефицита.

Экспериментально установлено, что нДНК не только оказывает радиозащитное действие, но и обладает способностью стимулировать развитие преимущественно клеточного иммунного ответа, что может предотвратить возникновение дефицита Тх1 в поздние сроки после облучения [128]. Это позволяет рекомендовать ДНК-содержащие БАД при радиационном поражении (не превышающем костно-мозговой диапазон доз); у групп радиационного риска (персонал ремонтных подразделений атомных электростанций, рабочие урановых рудников и предприятий по переработке урановых руд, врачи рентгенологи, радиологи и т.д.); и обосновывает их применение у онкологических больных, получающих радиотерапию.

Кроме того, ДНК-содержащие БАД могут быть использованы: о для профилактики различных заболеваний, и, в частности, в периоды сезонного повышения заболеваемости ОРВИ, в целях укрепления общей резистентности организма и повышения его сопротивляемости к инфекции; о на этапах выздоровления, для устранения астенического синдрома и повышения адаптационных механизмов организма.